Ｄ−アミノ酸の製造のための突然変異株
本発明は、Ｄ−アミノ酸の合成のために使用できる特定のＥ．コリ突然変異株、及びそのような方法に関する。この突然変異株は、特にＤ−アミノ酸を分解する酵素の欠損を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造方法に関する。特にこれらを、組換え微生物を使用し、いわゆるヒダントイナーゼ経路を介して酵素的に得る。本発明は更に、このように改変された微生物に関する。
【０００２】
Ｄ−アミノ酸は、薬理学的に有効な化合物の製造のために有機合成において中間体としてしばしば利用される化合物である。
【０００３】
５−置換ヒダントインを酵素的に加水分解してＮ−カルバモイル−アミノ酸を得て、これらを更に反応させてエナンチオマー富化された相応のアミノ酸を得ることは、有機化学分野においては標準的方法である（“有機合成における酵素触媒作用”編：ドローズ，ヴァルトマン ＶＣＨ社、第１版及び第２版（"Enzyme Catalysis in Organic Synthesis",eds.:Drauz,Waldmann,VCH1st and 2nd ed.））。鏡像体区別は、ここではヒダントイナーゼによるヒダントインの加水分解の段階か、又は場合によりエナンチオ選択性カルバモイラーゼによるＮ−カルバモイルアミノ酸の開裂の間の何れにおいても実施することができる。それぞれの場合における酵素は、相応の化合物の光学対掌体の一方を変換するにすぎないので、混合物中で（現場で）その他方をラセミ化し、処理が容易なラセミ体ヒダントインを相応のエナンチオマー富化されたアミノ酸に完全に変換するのを保証する試みがなされている。このラセミ化は、ここではヒダントインの段階で化学的方法（塩基、酸、高温）又は酵素的方法の何れにおいても実施することができ、又は例えばアセチルアミノ酸ラセマーゼによるＮ−カルバモイルアミノ酸の段階で進行させることができる（ＤＥ１００５０１２４号）。当然後者の変法は、エナンチオ選択性カルバモイラーゼを利用する場合に限り首尾良く機能する。以下の反応式はこの事象の様子を説明するものである。
【０００４】
【化１】
【０００５】
ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びラセマーゼ活性を有する組換え微生物を、種々のＤ−アミノ酸の製造のために使用することは問題をもたらすことが判明している。図１は、アルトロバクター・クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼについて形質転換されたＥ．コリＪＭ１０９を用いたヒドロキシメチルヒダントイン及びエチルヒダントインの変換を示す（特許出願ＤＥ１０１１４９９９．９号及びＤＥ１０１３０１６９．３号による）。反応条件は実施例１により選択される。
【０００６】
図１が例示するように、種々の５−一置換ヒダントインの変換においては、形成されたＤ−アミノ酸の顕著な分解が起きる。このことは、達成できる収率を減少させ、かつこの製造物の後処理を困難にする。
【０００７】
当業者は、種々の酵素、例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ１．４．３．３］、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．４．９９．１］、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ［ＥＣ２．６．１．２１］、Ｄ−アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．３６］、Ｄ−ヒドロキシアミノ酸デヒドラターゼ［ＥＣ４．２．１．１４］及びＤ−アミノ酸ラセマーゼ［ＥＣ５．１．１．１０］がＤ−アミノ酸の分解に関与しうることを理解している。またこれらの遺伝子を、標的法又は更に非標的法により不活化させる種々の方法が当業者には知られている［遺伝子ノックアウトのための広宿主域で可動の自殺ベクターのｐＫＮＯＣＫ群と標的ＤＮＡのグラム陰性菌の染色体への挿入 アレックスアイフ，ミカエル Ｆ．著 生物工学技術（１９９９年）２６号（５）、８２４〜８２８頁［The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of Gram-negative bacteria. Alexeyev,Mikhail F.BioTechniques(1999),26(5),824-828］；ＰＣＲ産物を使用するエシェリキア・コリＫ−１２の染色体遺伝子の一段階の不活化 ダツセンコ，キリル Ａ．及びワンナー，バリイ Ｌ．著 ＰＮＡＳ（２０００年）９７号（１２）、６６４０〜６６４５頁［One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products,Datsenko,Kirill A.and Wanner,Barry L.PNAS(2000),97(12),6640-6645］；エシェリキア・コリＫ１２Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ：酵素活性及び構造遺伝子局在についての欠陥突然変異株のポジティブセレクション ワイルド，ヤドヴィーガ及びクロポトスキー，Ｔ．著 分子遺伝学及び一般遺伝学（１９８１年）１８１号（３）、３７３〜３７８頁［D-amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12:positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene,Wild,Jadwiga and Klopotowski,T.Mol.Gen.Genet.(1981),181(3),373-378.］］。
【０００８】
しかしながら、不運にも、種々の酵素が不活化された場合の細胞増殖について予期できる影響は不明であり、かつ予想できない。また、特定のＤ−アミノ酸の分解を所望の程度まで減少させるために、どの酵素を不活化すべきか又は種々の酵素の組合せ物を不活化すべきかを予測することもできない。
【０００９】
従って本発明の課題は、カルバモイラーゼ／ヒダントイナーゼ経路を介してＤ−アミノ酸を生成することが可能であり、かつ生成されたＤ−アミノ酸の高い収率の実現に寄与する微生物を提供することであった。この微生物を、工業的規模で経済的側面及び環境的側面において有利に利用できることが望ましい。特に該微生物は、経済的に好適な通常の条件下で極めて良好な増殖特性、及び十分な遺伝的かつ物理的安定性並びに十分に速いヒダントインの変換速度を有することが望ましい。
【００１０】
前記課題は、本請求項により解決される。請求項１から５は、このように改変された特定の微生物に関するものであり、請求項６及び７は、Ｄ−アミノ酸の製造方法を保護するものである。
【００１１】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸又は５−一置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の製造のための組換え微生物であって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子及び／又はＤ−セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子が突然変異誘発により不活化された微生物を提供することにより、前記課題は驚くべきことであるが有利に解決される。特に、組換え方法により製造され、本発明にかかる遺伝子プロファイルを有する微生物が、実際に安定しており、かつ工業的オーダーに十分な程度のＤ−アミノ酸を生成することが可能であるということは、驚くべきことと考えられる。
【００１２】
使用できる、組換え体の実施態様のための微生物は、原則的に当業者にとってこの目的のために考えられる全種の生物、例えば真菌類、例えばアスペルギルスの種、ストレプトマイセスの種、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はサッカロミセス・セレビジエ、若しくは更に原核生物、例えばＥ．コリ又はバチルスの種である。エシェリキア・コリ属の微生物は、本発明にかかる好ましい微生物とみなすことができる。以下のものが、極めて特に好ましい：Ｅ．コリ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＢＬ２１、Ｗ３１１０、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０−又はＨＢ１０１。このように改変された生物は、当業者に公知の方法により製造できる。このことは、増殖させ、かつ十分な量の組換え酵素を生産させるのに役に立つ。このための方法は当業者に十分に知られている（サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York））。例えば、前記核酸配列を宿主生物内でプラスミド又はベクターを用いて公知の方法によりクローニングし、かつこのように発現させたポリペプチドを好適なスクリーニング方法を用いて検出できる。形成された分子について考えられる全ての検出反応は、原則的にこの検出に好適である。特に、原則的に好適な検出反応は、アンモニア及びアンモニウムイオンについて考えられる全ての検出反応、例えばネスラー試薬法（フォーゲル，Ａ．，Ｉ．著（１９８９年）フォーゲル定量的化学分析教本 ジョン ワイリー＆サン社、第５版、６７９〜６９８頁、ニューヨーク（Vogel,A.,I.,(1989) Vogel's textbook of quantitative chemical analysis,John Wiley & Sons,Inc.,5ｔｈed.,679-698,New York））、ベルトロー反応とも呼ばれるインドフェノール反応（ヴァンガー，Ｒ．著（１９６９年）水の化学における窒素分析についての新たなる局面 水について ＶＣＨ出版、第３６巻、２６３〜３１８頁（Wanger,R.,(1969)Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie,Vom Wasser,VCH-Verlag,vol.36,263-318,Weinheim））、特にグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素的定量（ベルクメイヤー，Ｈ．，Ｕ．，及びブートラー，Ｈ．−Ｏ．著（１９８５年）アンモニア：酵素的分析方法 ＶＣＨ出版、第３版、第８巻：４５４〜４６１頁、ヴァインハイム（Bergmeyer,H.,U.,and Beutler,H.-O.(1985)Ammonia,in:Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3ｒｄ edition,vol.8:454-461,Weinheim））又は更にアンモニウム感受性電極を用いる検出である。更に、ＨＰＬＣ法がアミノ酸の検出のために使用され、例えばｏ−フタルジアルデヒド及びＮ−イソブチリル−システインに基づく誘導体法がアミノ酸のエナンチオマー分離のために使用される（ブレックナー，Ｈ．，ヴィットナー Ｒ．，及びゴーデル Ｈ．著（１９９１年）ｏ−フタルジアルデヒド及びＮ−イソプロピル−システインを用いて誘導体化されたＤＬ−アミノ酸の完全自動化高速液体クロマトグラフィーによる分離 食品サンプルへの応用 生物化学分析１４４号、２０４〜２０６頁（Brueckner,H.,Wittner R.,and Godel H.,(1991),Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine.Application to food samples,Anal.Biochem.144,204-206））。考えられるプラスミド又はベクターは、原則的に当業者にとってこの目的のために利用可能な全ての実施態様となる。そのようなプラスミド及びベクターは、例えばスチュディエ（Studier）ら（スチュディエ，Ｗ．Ｆ．；ローゼンバーク Ａ．Ｈ．；ダン Ｊ．Ｊ．；デュベンドロフ Ｊ．Ｗ．著（１９９０年）クローニングされた遺伝子の直接的発現のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用 酵素学的研究法１８５号、６１〜８９頁（Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol.185,61-89））又はＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社の冊子に見出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは：グローヴァー，Ｄ．Ｍ．著（１９８５年）ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ 第１〜３巻、ＩＲＬ出版社、オックスフォード（Glover,D.M.(1985),DNA cloning: A Practical Approach,vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford）；ロドリゲス，Ｒ．Ｌ．及びデンハルト，Ｄ．Ｔ（編）（１９８８年）ベクター：分子クローニングベクターとその使用に関する研究 １７９〜２０４頁、バターワース社、ストーンハム（Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1988),Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham）；ゲッデル，Ｄ．Ｖ．著（１９９０年）異種遺伝子発現系 酵素学的研究法１８５号、３〜７頁（Goeddel,D.V.(1990),Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3-7）；サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning: a laboratory manual,2ｎｄ ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）に見出すことができる。Ｅ．コリ中での特に好ましいＤ−カルバモイラーゼのクローニングベクターは、例えば発現制御のための構成的かつ更に誘導的なプロモーターを有するｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８又はｐＳＣ１０１の誘導体である。特に好ましいプロモーターは、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ７、ｒｈａＢＡＤ、ａｒａＢＡＤ、λｐＬ又はｐｈｏＡプロモーターであり、これらは当業者に十分知られている［エシェリキア・コリ内での遺伝子の高レベル発現達成への戦略 マクライズ Ｓ．Ｃ．著 微生物学誌６０号（３）、５１２〜５３８頁［Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli,Makrides S.C.Microbiol.Rev.60(3),512-538］］。これらの生物のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ｄａｄＡ）又はＤ−セリンデヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）の不活化は、ここでは当業者に知られている上記の方法により実施する。Ｄ−カルバモイラーゼ活性を有する、Ｄ−セリンデヒドラターゼ欠損株又はＤ−アミノ酸オキシダーゼ欠損株の組換え体の実施態様の製造については、例えば基本的な分子生物学的方法が当業者に知られている（サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York））。更に、種々のＤ−カルバモイラーゼ、例えば好ましく使用されるアグロバクテリウムの種、アルトロバクターの種又はバチルスの種若しくはラルストニア・ピッケッチイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）由来のものの遺伝子配列が知られている（特にＵＳ５８５８７５９号、ＵＳ５８０７７１０号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号から）。同様の方法は、付加的にヒダントイナーゼを含有し、場合によりヒダントインラセマーゼ又はカルバモイルラセマーゼを含有する生物の製造のためにも使用できる。ここで利用されるのが望ましい好ましいヒダントイナーゼは、テルムスの種、バチルスの種、マイコバクテリウムの種、コリネバクテリウムの種、アグロバクテリウムの種、Ｅ．コリ、バークホルデリアの種、シュードモナスの種、又はアルトロバクターの種由来のものである。ヒダントインラセマーゼは、好ましくはシュードモナスの種、アルトロバクターの種、又はアグロバクテリウム種から使用することができ、場合により補助物質、例えば金属イオン、例えばＭｎ２＋を添加する。
【００１３】
このように、好結果の突然変異株エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８１及びエシェリキア・コリＤＳＭ１５１８２を製造することができた。従ってこれらは、これらから誘導されうる更なる突然変異株と共に、本発明の次の対象となる。
【００１４】
更に本発明にかかる方法においては、例えばヒダントインを前記細胞又は細胞構成成分を用いて好適な溶剤、例えば水中で、６．０〜１１、好ましくは７〜１０のｐＨ値で、かつ１０〜１００℃、好ましくは３０〜７０℃、特に好ましくは３７〜６０℃で変換し、その際、該溶剤に更なる水溶性又は非水溶性の有機溶剤を添加してよい。また、当該酵素をその使用のために遊離形態で使用することもできる。更にこの酵素は、インタクトな寄生生物の構成成分として、又は任意の所望の程度まで精製された宿主生物の破砕された細胞塊と組み合わせて利用することもできる。組換え細胞を、凝集、架橋又は固定化形態で、例えば寒天、アガロース、カラギナン、アルギン酸塩、ペクチン、キトサン、ポリアクリルアミド又は他の合成担体を用いて使用することもできる（生物工学技術における固定化系の化学的局面 ナブラティル，マリアン；スターディック，アーネスト著 化学新聞（２０００年）９４号（６）、３８０〜３８８頁（Chemical aspects of immobilized systems in biotechnologies.Navratil,Marian;Sturdik,Ernest.Chemicke Listy(2000),94(6),380-388）；固定化生物触媒と生体材料の工業的応用 チバタ，イチロー著 分子細胞生物学の発展（１９９６年）１５Ａ（生物化学技術）１５１〜１６０頁（Industrial applications of immobilized biocatalysts and biomaterials.Chibata,Ichiro.Advances in Molecular and Cell Biology (1996),15A(Biochemical Technology),151-160）；遺伝的に改変された細胞の固定化：高安定性への新たなる戦略 クマー，Ｐ．Ｋ．Ｒ．；シュウゲール，Ｋ．著 生物工学誌（１９９０年）１４号（３〜４）、２５５〜２７２頁（Immobilization of genetically engineered cells:a new strategy for higher stability.Kumer,P.K.R.;Schuegerl,K.Journal of Biotechnology (1990), 14(3-4),255-72.））。
【００１５】
従って、本発明にかかる微生物を用いるＤ−アミノ酸の製造方法は、本発明の次の対象となる。好ましくは、Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン又はＤ−フェニルアラニンを製造する。好ましくは、細胞がＤ−カルバモイラーゼ活性及びヒダントイナーゼ活性を有し、かつｄａｄＡ及び／又はｄｓｄＡが不活化された生物を、このＤ−アミノ酸の製造方法に使用する。ここでは、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−カルバモイルアミノ酸と、十分に公知のヒダントイナーゼを介して相応のカルバモイルアミノ酸に変換できる５−一置換ヒダントインの両方が、出発物として適することが挙げられるのが望ましい（“有機合成における酵素触媒作用”編：ドローズ、ヴァルトマン ＶＣＨ社、第１版及び第２版（"Enzyme Catalysis in Organic Synthesis",eds.:Drauz,Waldmann,VCH,1ｓｔ and 2ｎｄ ed.））。ここでは、使用するｄａｄＡ及び／又はｄｓｄＡ欠損株は、カルバモイラーゼとヒダントイナーゼとを同時発現させることができ、場合により更にヒダントインラセマーゼ又はカルバモイルアミノ酸ラセマーゼを同時発現させることができ、かつ遊離形態又は固定化形態の何れにおいても利用することができる（上記参照のこと）。
【００１６】
現在判明しているように、種々の酵素の不活化は、種々のＤ−アミノ酸の分解を十分な程度（＞１０時間の範囲で、＜１０％の分解率）まで減少させるために必要である（図２を参照のこと）。Ｄ−セリンの分解については、驚くべきことに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ｄａｄＡ）の遺伝子の不活化はその分解を効率的に減少させるのに十分ではないことが判明した。このアミノ酸の分解を効率的に減少させるために、Ｄ−セリンヒドラターゼを付加的に不活化するのが望ましい。それに対して、ｄａｄＡの不活化によりセリンが＞３倍で減少する分解がもたらされることが文献に報告されている［エシェリキア・コリＫ１２のＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ：酵素活性及び構造遺伝子局在についての欠陥突然変異株のポジティブセレクション ワイルド，Ｊ．；クロポトスキー，Ｔ．著 分子遺伝学及び一般遺伝学（１９８１年）１８１号（３）、３７３〜３７８頁［D-Amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12:positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene. Wild,J.;Klopotowski,T.Mol.Gen.Genet.(1981),181(3),373-378］］。更に該文献に記載されている結果に対して、驚くべきことにＤ−セリンは、例えばＤ−メチオニンと比較して極めて速く分解されることが判明した。
【００１７】
芳香族又は脂肪族Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−又はＤ−アミノ酪酸の分解については、セリンとは対照的に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの不活化により十分に解決される。しかしながら驚くべきことに、Ｄ−フェニルアラニンについては両方の欠失（ΔｄｓｄＡとΔｄａｄＡ）が肯定的な効果を示す一方で、Ｄ−メチオニンについてはｄｓｄＡの欠失が付加的な効果を示さない。これらの結果を図２にまとめる（Ｅ．コリＢＷ２５１１３の種々の突然変異株を用いた種々のアミノ酸の分解。Ｅ．コリＥＴ３は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを欠失している（ΔｄａｄＡ）；Ｅ．コリＥＴ４は、付加的にＤ−セリンデヒドラターゼを欠失している（ΔｄｓｄＡ）。反応条件については、実施例３を参照のこと）。
【００１８】
本明細書中に引用した参考文献はまた、開示に含まれるものとみなす。
【００１９】
生物ＤＳＭ１５１８１（ＥＴ３）及びＤＳＭ１５１８２（ＥＴ４）は、Ｄｅｇｕｓｓａ ＡＧ社により２００２年４月９日付でＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ［ドイツ微生物及び細胞培養物保存機関］、マッシェロダー通り１ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュヴァイク（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ-３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。
【実施例】
【００２０】
実施例１：組換えＥ．コリ細胞を用いたＤ−アミノ酸の製造
化学処理コンピテントＥ．コリＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、ｐＪＡＶＩ１６（図３参照）を用いて形質転換した。このプラスミドは、アルトロバクター・クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼを有する。Ｄ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼの配列を、配列番号１及び３に示す（更にＤＥ１０１１４９９９．９号及びＤＥ１０１３０１６９．３号を参照のこと）。
【００２１】
ｐＪＡＶＩＥＲ１６を用いて形質転換したＥ．コリ細胞を、個々にＬＢアンピシリンプレート（アンピシリン濃度：１００μｇ／ｍｌ）上に播いた。個々のコロニーを、１ｍＭのＺｎＣｌ２を有する２．５ｍｌのＬＢアンピシリン培地に植菌し、かつ３０時間にわたり３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。この培養物を、１ｍＭのＺｎＣｌ２及び２ｇ／ｌのラムノースを有する１００ｍｌのＬＢアンピリシン培地中で１：５０に希釈し、かつ１８時間にわたり３０℃でインキュベートした。この培養物を１０分間にわたり１００００ｇで遠心分離し、この上清を捨て、かつ菌体を秤量した。ｐＨ７．５の種々のヒダントイン誘導体、例えば１００ｍＭのＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントイン又はＤＬ−エチルヒダントインをこの菌体に、１リットルにつき湿潤菌体４０ｇの菌体濃度になるように添加した。この反応溶液を３７℃でインキュベートした。種々の時間の後に、試料を採り出し、かつ遠心分離し、形成されたアミノ酸をＨＰＬＣを用いて定量した。
【００２２】
実施例２：ＤｓｄＡ及びＤａｄＡ欠損Ｅ．コリ株の製造
Ｅ．コリＢＷ２５１１３（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３６の番号下で寄託）において、ＤａｄＡをダツセンコ及びワンナーにより記載されている方法により欠失させた。（ＰＣＲ産物を使用するエシェリキア・コリＫ−１２の染色体遺伝子の一段階の不活化 ダツセンコ，キリル Ａ及びワンナー，バリイ Ｌ．著 ＰＮＡＳ（２０００年）９７号（１２巻）、６６４０〜６６４５頁（One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products,Datsenko,Kirill A.and Wanner,Barry L.PNAS(2000),97(12),6640-6645））。このために、以下のプライマーをｐＫＤ１３（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３３の番号下で寄託）からのクロラムフェニコール耐性部分の増幅のために使用した：
５’＿ＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＧＣＧＡＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ＿３’：配列番号５
５’＿ＡＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’：配列番号６
【００２３】
増幅産物によるＥ．コリＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３０の番号下で寄託）の形質転換及びカナマイシン耐性クローンの選択により、Ｅ．コリＥＴ２の単離を実現した。クロラムフェニコール耐性部分をダツセンコ及びワンナーのプロトコールにより抜いた後に、菌株Ｅ．コリＥＴ３を単離することができた。Ｅ．コリＥＴ３のｄｓｄＡの欠失のために、ｐＫＤ１３からのクロラムフェニコール耐性部分を、同様に以下のプライマーを用いて増幅した：
５’＿ＧＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ＿３’：配列番号７
５’＿ＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＴＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ＿３’：配列番号８
【００２４】
この増幅産物によるＥ．コリＥＴ３（ｐＫＤ４６）の形質転換及びカナマイシン耐性クローンの選択により、ｄａｄＡ及びｄｓｄＡの両方が欠失したＥ．コリＥＴ４の単離を実現した。
【００２５】
実施例３ Ｄ−アミノ酸の分解についての調査
２．５ｍｌのＬＢ培地にＥ．コリＢＷ２５１１３、Ｅ．コリＥＴ３及びＥ．コリＥＴ４の個々のコロニーを植菌し、かつ１８時間にわたり３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物を、１００ｍｌのＬＢ培地中で１：５０に希釈し、かつ１８時間にわたり３７℃でインキュベートした。この培養物を１０分間にわたり１００００ｇで遠心分離し、上清を捨て、かつ菌体を秤量した。ｐＨ７．５の１００ｍＭの種々のＤ−アミノ酸溶液（例えば、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン）を菌体に、１リットルにつき湿潤菌体１００ｇの菌体濃度になるように添加した。これらの反応溶液を３７℃でインキュベートし、その１０時間後に遠心分離した。澄明な上清を、残留しているアミノ酸の濃度についてＨＰＬＣを用いて分析した。記載した％分解率は、出発濃度と、１０時間にわたるインキュベーションの後の最終濃度との比から算出した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アルトロバクター・クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼを用いて形質転換したＥ．コリＪＭ１０９を用いたヒドロキシメチルヒダントイン及びエチルヒダントインの変換を示す。
【図２】Ｅ．コリＢＷ２５１１３の種々の突然変異株を用いた種々のアミノ酸の分解を示す。
【図３】ｐＪＡＶＩＥＲＩ１６を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造方法に関する。特にこれらを、組換え微生物を使用し、いわゆるヒダントイナーゼ経路を介して酵素的に得る。本発明は更に、このように改変された微生物に関する。
【０００２】
Ｄ−アミノ酸は、薬理学的に有効な化合物の製造のために有機合成において中間体としてしばしば利用される化合物である。
【０００３】
５−置換ヒダントインを酵素的に加水分解してＮ−カルバモイル−アミノ酸を得て、これらを更に反応させてエナンチオマー富化された相応のアミノ酸を得ることは、有機化学分野においては標準的方法である（“有機合成における酵素触媒作用”編：ドローズ，ヴァルトマン ＶＣＨ社、第１版及び第２版（"Enzyme Catalysis in Organic Synthesis",eds.:Drauz,Waldmann,VCH1st and 2nd ed.））。鏡像体区別は、ここではヒダントイナーゼによるヒダントインの加水分解の段階か、又は場合によりエナンチオ選択性カルバモイラーゼによるＮ−カルバモイルアミノ酸の開裂の間の何れにおいても実施することができる。それぞれの場合における酵素は、相応の化合物の光学対掌体の一方を変換するにすぎないので、混合物中で（現場で）その他方をラセミ化し、処理が容易なラセミ体ヒダントインを相応のエナンチオマー富化されたアミノ酸に完全に変換するのを保証する試みがなされている。このラセミ化は、ここではヒダントインの段階で化学的方法（塩基、酸、高温）又は酵素的方法の何れにおいても実施することができ、又は例えばアセチルアミノ酸ラセマーゼによるＮ−カルバモイルアミノ酸の段階で進行させることができる（ＤＥ１００５０１２４号）。当然後者の変法は、エナンチオ選択性カルバモイラーゼを利用する場合に限り首尾良く機能する。以下の反応式はこの事象の様子を説明するものである。
【０００４】
【化１】
【０００５】
ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びラセマーゼ活性を有する組換え微生物を、種々のＤ−アミノ酸の製造のために使用することは問題をもたらすことが判明している。図１は、アルトロバクター・クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼについて形質転換されたＥ．コリＪＭ１０９を用いたヒドロキシメチルヒダントイン及びエチルヒダントインの変換を示す（特許出願ＤＥ１０１１４９９９．９号及びＤＥ１０１３０１６９．３号による）。反応条件は実施例１により選択される。
【０００６】
図１が例示するように、種々の５−一置換ヒダントインの変換においては、形成されたＤ−アミノ酸の顕著な分解が起きる。このことは、達成できる収率を減少させ、かつこの製造物の後処理を困難にする。
【０００７】
当業者は、種々の酵素、例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ［ＥＣ１．４．３．３］、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．４．９９．１］、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ［ＥＣ２．６．１．２１］、Ｄ−アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．３６］、Ｄ−ヒドロキシアミノ酸デヒドラターゼ［ＥＣ４．２．１．１４］及びＤ−アミノ酸ラセマーゼ［ＥＣ５．１．１．１０］がＤ−アミノ酸の分解に関与しうることを理解している。またこれらの遺伝子を、標的法又は更に非標的法により不活化させる種々の方法が当業者には知られている［遺伝子ノックアウトのための広宿主域で可動の自殺ベクターのｐＫＮＯＣＫ群と標的ＤＮＡのグラム陰性菌の染色体への挿入 アレックスアイフ，ミカエル Ｆ．著 生物工学技術（１９９９年）２６号（５）、８２４〜８２８頁［The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of Gram-negative bacteria. Alexeyev,Mikhail F.BioTechniques(1999),26(5),824-828］；ＰＣＲ産物を使用するエシェリキア・コリＫ−１２の染色体遺伝子の一段階の不活化 ダツセンコ，キリル Ａ．及びワンナー，バリイ Ｌ．著 ＰＮＡＳ（２０００年）９７号（１２）、６６４０〜６６４５頁［One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products,Datsenko,Kirill A.and Wanner,Barry L.PNAS(2000),97(12),6640-6645］；エシェリキア・コリＫ１２Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ：酵素活性及び構造遺伝子局在についての欠陥突然変異株のポジティブセレクション ワイルド，ヤドヴィーガ及びクロポトスキー，Ｔ．著 分子遺伝学及び一般遺伝学（１９８１年）１８１号（３）、３７３〜３７８頁［D-amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12:positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene,Wild,Jadwiga and Klopotowski,T.Mol.Gen.Genet.(1981),181(3),373-378.］］。
【０００８】
しかしながら、不運にも、種々の酵素が不活化された場合の細胞増殖について予期できる影響は不明であり、かつ予想できない。また、特定のＤ−アミノ酸の分解を所望の程度まで減少させるために、どの酵素を不活化すべきか又は種々の酵素の組合せ物を不活化すべきかを予測することもできない。
【０００９】
従って本発明の課題は、カルバモイラーゼ／ヒダントイナーゼ経路を介してＤ−アミノ酸を生成することが可能であり、かつ生成されたＤ−アミノ酸の高い収率の実現に寄与する微生物を提供することであった。この微生物を、工業的規模で経済的側面及び環境的側面において有利に利用できることが望ましい。特に該微生物は、経済的に好適な通常の条件下で極めて良好な増殖特性、及び十分な遺伝的かつ物理的安定性並びに十分に速いヒダントインの変換速度を有することが望ましい。
【００１０】
前記課題は、本請求項により解決される。請求項１から５は、このように改変された特定の微生物に関するものであり、請求項６及び７は、Ｄ−アミノ酸の製造方法を保護するものである。
【００１１】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸又は５−一置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の製造のための組換え微生物であって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子及び／又はＤ−セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子が突然変異誘発により不活化された微生物を提供することにより、前記課題は驚くべきことであるが有利に解決される。特に、組換え方法により製造され、本発明にかかる遺伝子プロファイルを有する微生物が、実際に安定しており、かつ工業的オーダーに十分な程度のＤ−アミノ酸を生成することが可能であるということは、驚くべきことと考えられる。
【００１２】
使用できる、組換え体の実施態様のための微生物は、原則的に当業者にとってこの目的のために考えられる全種の生物、例えば真菌類、例えばアスペルギルスの種、ストレプトマイセスの種、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はサッカロミセス・セレビジエ、若しくは更に原核生物、例えばＥ．コリ又はバチルスの種である。エシェリキア・コリ属の微生物は、本発明にかかる好ましい微生物とみなすことができる。以下のものが、極めて特に好ましい：Ｅ．コリ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＢＬ２１、Ｗ３１１０、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０−又はＨＢ１０１。このように改変された生物は、当業者に公知の方法により製造できる。このことは、増殖させ、かつ十分な量の組換え酵素を生産させるのに役に立つ。このための方法は当業者に十分に知られている（サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York））。例えば、前記核酸配列を宿主生物内でプラスミド又はベクターを用いて公知の方法によりクローニングし、かつこのように発現させたポリペプチドを好適なスクリーニング方法を用いて検出できる。形成された分子について考えられる全ての検出反応は、原則的にこの検出に好適である。特に、原則的に好適な検出反応は、アンモニア及びアンモニウムイオンについて考えられる全ての検出反応、例えばネスラー試薬法（フォーゲル，Ａ．，Ｉ．著（１９８９年）フォーゲル定量的化学分析教本 ジョン ワイリー＆サン社、第５版、６７９〜６９８頁、ニューヨーク（Vogel,A.,I.,(1989) Vogel's textbook of quantitative chemical analysis,John Wiley & Sons,Inc.,5ｔｈed.,679-698,New York））、ベルトロー反応とも呼ばれるインドフェノール反応（ヴァンガー，Ｒ．著（１９６９年）水の化学における窒素分析についての新たなる局面 水について ＶＣＨ出版、第３６巻、２６３〜３１８頁（Wanger,R.,(1969)Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie,Vom Wasser,VCH-Verlag,vol.36,263-318,Weinheim））、特にグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素的定量（ベルクメイヤー，Ｈ．，Ｕ．，及びブートラー，Ｈ．−Ｏ．著（１９８５年）アンモニア：酵素的分析方法 ＶＣＨ出版、第３版、第８巻：４５４〜４６１頁、ヴァインハイム（Bergmeyer,H.,U.,and Beutler,H.-O.(1985)Ammonia,in:Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3ｒｄ edition,vol.8:454-461,Weinheim））又は更にアンモニウム感受性電極を用いる検出である。更に、ＨＰＬＣ法がアミノ酸の検出のために使用され、例えばｏ−フタルジアルデヒド及びＮ−イソブチリル−システインに基づく誘導体法がアミノ酸のエナンチオマー分離のために使用される（ブレックナー，Ｈ．，ヴィットナー Ｒ．，及びゴーデル Ｈ．著（１９９１年）ｏ−フタルジアルデヒド及びＮ−イソプロピル−システインを用いて誘導体化されたＤＬ−アミノ酸の完全自動化高速液体クロマトグラフィーによる分離 食品サンプルへの応用 生物化学分析１４４号、２０４〜２０６頁（Brueckner,H.,Wittner R.,and Godel H.,(1991),Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine.Application to food samples,Anal.Biochem.144,204-206））。考えられるプラスミド又はベクターは、原則的に当業者にとってこの目的のために利用可能な全ての実施態様となる。そのようなプラスミド及びベクターは、例えばスチュディエ（Studier）ら（スチュディエ，Ｗ．Ｆ．；ローゼンバーク Ａ．Ｈ．；ダン Ｊ．Ｊ．；デュベンドロフ Ｊ．Ｗ．著（１９９０年）クローニングされた遺伝子の直接的発現のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用 酵素学的研究法１８５号、６１〜８９頁（Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol.185,61-89））又はＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社の冊子に見出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは：グローヴァー，Ｄ．Ｍ．著（１９８５年）ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ 第１〜３巻、ＩＲＬ出版社、オックスフォード（Glover,D.M.(1985),DNA cloning: A Practical Approach,vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford）；ロドリゲス，Ｒ．Ｌ．及びデンハルト，Ｄ．Ｔ（編）（１９８８年）ベクター：分子クローニングベクターとその使用に関する研究 １７９〜２０４頁、バターワース社、ストーンハム（Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1988),Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham）；ゲッデル，Ｄ．Ｖ．著（１９９０年）異種遺伝子発現系 酵素学的研究法１８５号、３〜７頁（Goeddel,D.V.(1990),Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3-7）；サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning: a laboratory manual,2ｎｄ ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）に見出すことができる。Ｅ．コリ中での特に好ましいＤ−カルバモイラーゼのクローニングベクターは、例えば発現制御のための構成的かつ更に誘導的なプロモーターを有するｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８又はｐＳＣ１０１の誘導体である。特に好ましいプロモーターは、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ７、ｒｈａＢＡＤ、ａｒａＢＡＤ、λｐＬ又はｐｈｏＡプロモーターであり、これらは当業者に十分知られている［エシェリキア・コリ内での遺伝子の高レベル発現達成への戦略 マクライズ Ｓ．Ｃ．著 微生物学誌６０号（３）、５１２〜５３８頁［Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli,Makrides S.C.Microbiol.Rev.60(3),512-538］］。これらの生物のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ｄａｄＡ）又はＤ−セリンデヒドラターゼ（ｄｓｄＡ）の不活化は、ここでは当業者に知られている上記の方法により実施する。Ｄ−カルバモイラーゼ活性を有する、Ｄ−セリンデヒドラターゼ欠損株又はＤ−アミノ酸オキシダーゼ欠損株の組換え体の実施態様の製造については、例えば基本的な分子生物学的方法が当業者に知られている（サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）分子クローニング：実験室用取扱説明書 第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York））。更に、種々のＤ−カルバモイラーゼ、例えば好ましく使用されるアグロバクテリウムの種、アルトロバクターの種又はバチルスの種若しくはラルストニア・ピッケッチイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）由来のものの遺伝子配列が知られている（特にＵＳ５８５８７５９号、ＵＳ５８０７７１０号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号、ＵＳ６０８３７５２号から）。同様の方法は、付加的にヒダントイナーゼを含有し、場合によりヒダントインラセマーゼ又はカルバモイルラセマーゼを含有する生物の製造のためにも使用できる。ここで利用されるのが望ましい好ましいヒダントイナーゼは、テルムスの種、バチルスの種、マイコバクテリウムの種、コリネバクテリウムの種、アグロバクテリウムの種、Ｅ．コリ、バークホルデリアの種、シュードモナスの種、又はアルトロバクターの種由来のものである。ヒダントインラセマーゼは、好ましくはシュードモナスの種、アルトロバクターの種、又はアグロバクテリウム種から使用することができ、場合により補助物質、例えば金属イオン、例えばＭｎ２＋を添加する。
【００１３】
このように、好結果の突然変異株エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８１及びエシェリキア・コリＤＳＭ１５１８２を製造することができた。従ってこれらは、これらから誘導されうる更なる突然変異株と共に、本発明の次の対象となる。
【００１４】
更に本発明にかかる方法においては、例えばヒダントインを前記細胞又は細胞構成成分を用いて好適な溶剤、例えば水中で、６．０〜１１、好ましくは７〜１０のｐＨ値で、かつ１０〜１００℃、好ましくは３０〜７０℃、特に好ましくは３７〜６０℃で変換し、その際、該溶剤に更なる水溶性又は非水溶性の有機溶剤を添加してよい。また、当該酵素をその使用のために遊離形態で使用することもできる。更にこの酵素は、インタクトな寄生生物の構成成分として、又は任意の所望の程度まで精製された宿主生物の破砕された細胞塊と組み合わせて利用することもできる。組換え細胞を、凝集、架橋又は固定化形態で、例えば寒天、アガロース、カラギナン、アルギン酸塩、ペクチン、キトサン、ポリアクリルアミド又は他の合成担体を用いて使用することもできる（生物工学技術における固定化系の化学的局面 ナブラティル，マリアン；スターディック，アーネスト著 化学新聞（２０００年）９４号（６）、３８０〜３８８頁（Chemical aspects of immobilized systems in biotechnologies.Navratil,Marian;Sturdik,Ernest.Chemicke Listy(2000),94(6),380-388）；固定化生物触媒と生体材料の工業的応用 チバタ，イチロー著 分子細胞生物学の発展（１９９６年）１５Ａ（生物化学技術）１５１〜１６０頁（Industrial applications of immobilized biocatalysts and biomaterials.Chibata,Ichiro.Advances in Molecular and Cell Biology (1996),15A(Biochemical Technology),151-160）；遺伝的に改変された細胞の固定化：高安定性への新たなる戦略 クマー，Ｐ．Ｋ．Ｒ．；シュウゲール，Ｋ．著 生物工学誌（１９９０年）１４号（３〜４）、２５５〜２７２頁（Immobilization of genetically engineered cells:a new strategy for higher stability.Kumer,P.K.R.;Schuegerl,K.Journal of Biotechnology (1990), 14(3-4),255-72.））。
【００１５】
従って、本発明にかかる微生物を用いるＤ−アミノ酸の製造方法は、本発明の次の対象となる。好ましくは、Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン又はＤ−フェニルアラニンを製造する。好ましくは、細胞がＤ−カルバモイラーゼ活性及びヒダントイナーゼ活性を有し、かつｄａｄＡ及び／又はｄｓｄＡが不活化された生物を、このＤ−アミノ酸の製造方法に使用する。ここでは、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−カルバモイルアミノ酸と、十分に公知のヒダントイナーゼを介して相応のカルバモイルアミノ酸に変換できる５−一置換ヒダントインの両方が、出発物として適することが挙げられるのが望ましい（“有機合成における酵素触媒作用”編：ドローズ、ヴァルトマン ＶＣＨ社、第１版及び第２版（"Enzyme Catalysis in Organic Synthesis",eds.:Drauz,Waldmann,VCH,1ｓｔ and 2ｎｄ ed.））。ここでは、使用するｄａｄＡ及び／又はｄｓｄＡ欠損株は、カルバモイラーゼとヒダントイナーゼとを同時発現させることができ、場合により更にヒダントインラセマーゼ又はカルバモイルアミノ酸ラセマーゼを同時発現させることができ、かつ遊離形態又は固定化形態の何れにおいても利用することができる（上記参照のこと）。
【００１６】
現在判明しているように、種々の酵素の不活化は、種々のＤ−アミノ酸の分解を十分な程度（＞１０時間の範囲で、＜１０％の分解率）まで減少させるために必要である（図２を参照のこと）。Ｄ−セリンの分解については、驚くべきことに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ｄａｄＡ）の遺伝子の不活化はその分解を効率的に減少させるのに十分ではないことが判明した。このアミノ酸の分解を効率的に減少させるために、Ｄ−セリンヒドラターゼを付加的に不活化するのが望ましい。それに対して、ｄａｄＡの不活化によりセリンが＞３倍で減少する分解がもたらされることが文献に報告されている［エシェリキア・コリＫ１２のＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ：酵素活性及び構造遺伝子局在についての欠陥突然変異株のポジティブセレクション ワイルド，Ｊ．；クロポトスキー，Ｔ．著 分子遺伝学及び一般遺伝学（１９８１年）１８１号（３）、３７３〜３７８頁［D-Amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12:positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene. Wild,J.;Klopotowski,T.Mol.Gen.Genet.(1981),181(3),373-378］］。更に該文献に記載されている結果に対して、驚くべきことにＤ−セリンは、例えばＤ−メチオニンと比較して極めて速く分解されることが判明した。
【００１７】
芳香族又は脂肪族Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−又はＤ−アミノ酪酸の分解については、セリンとは対照的に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの不活化により十分に解決される。しかしながら驚くべきことに、Ｄ−フェニルアラニンについては両方の欠失（ΔｄｓｄＡとΔｄａｄＡ）が肯定的な効果を示す一方で、Ｄ−メチオニンについてはｄｓｄＡの欠失が付加的な効果を示さない。これらの結果を図２にまとめる（Ｅ．コリＢＷ２５１１３の種々の突然変異株を用いた種々のアミノ酸の分解。Ｅ．コリＥＴ３は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを欠失している（ΔｄａｄＡ）；Ｅ．コリＥＴ４は、付加的にＤ−セリンデヒドラターゼを欠失している（ΔｄｓｄＡ）。反応条件については、実施例３を参照のこと）。
【００１８】
本明細書中に引用した参考文献はまた、開示に含まれるものとみなす。
【００１９】
生物ＤＳＭ１５１８１（ＥＴ３）及びＤＳＭ１５１８２（ＥＴ４）は、Ｄｅｇｕｓｓａ ＡＧ社により２００２年４月９日付でＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ［ドイツ微生物及び細胞培養物保存機関］、マッシェロダー通り１ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュヴァイク（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ-３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。
【実施例】
【００２０】
実施例１：組換えＥ．コリ細胞を用いたＤ−アミノ酸の製造
化学処理コンピテントＥ．コリＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、ｐＪＡＶＩ１６（図３参照）を用いて形質転換した。このプラスミドは、アルトロバクター・クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼを有する。Ｄ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼの配列を、配列番号１及び３に示す（更にＤＥ１０１１４９９９．９号及びＤＥ１０１３０１６９．３号を参照のこと）。
【００２１】
ｐＪＡＶＩＥＲ１６を用いて形質転換したＥ．コリ細胞を、個々にＬＢアンピシリンプレート（アンピシリン濃度：１００μｇ／ｍｌ）上に播いた。個々のコロニーを、１ｍＭのＺｎＣｌ２を有する２．５ｍｌのＬＢアンピシリン培地に植菌し、かつ３０時間にわたり３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。この培養物を、１ｍＭのＺｎＣｌ２及び２ｇ／ｌのラムノースを有する１００ｍｌのＬＢアンピリシン培地中で１：５０に希釈し、かつ１８時間にわたり３０℃でインキュベートした。この培養物を１０分間にわたり１００００ｇで遠心分離し、この上清を捨て、かつ菌体を秤量した。ｐＨ７．５の種々のヒダントイン誘導体、例えば１００ｍＭのＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントイン又はＤＬ−エチルヒダントインをこの菌体に、１リットルにつき湿潤菌体４０ｇの菌体濃度になるように添加した。この反応溶液を３７℃でインキュベートした。種々の時間の後に、試料を採り出し、かつ遠心分離し、形成されたアミノ酸をＨＰＬＣを用いて定量した。
【００２２】
実施例２：ＤｓｄＡ及びＤａｄＡ欠損Ｅ．コリ株の製造
Ｅ．コリＢＷ２５１１３（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３６の番号下で寄託）において、ＤａｄＡをダツセンコ及びワンナーにより記載されている方法により欠失させた。（ＰＣＲ産物を使用するエシェリキア・コリＫ−１２の染色体遺伝子の一段階の不活化 ダツセンコ，キリル Ａ及びワンナー，バリイ Ｌ．著 ＰＮＡＳ（２０００年）９７号（１２巻）、６６４０〜６６４５頁（One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products,Datsenko,Kirill A.and Wanner,Barry L.PNAS(2000),97(12),6640-6645））。このために、以下のプライマーをｐＫＤ１３（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３３の番号下で寄託）からのクロラムフェニコール耐性部分の増幅のために使用した：
５’＿ＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＧＣＧＡＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ＿３’：配列番号５
５’＿ＡＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’：配列番号６
【００２３】
増幅産物によるＥ．コリＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）（ＣＧＳＣにＣＧＳＣ７６３０の番号下で寄託）の形質転換及びカナマイシン耐性クローンの選択により、Ｅ．コリＥＴ２の単離を実現した。クロラムフェニコール耐性部分をダツセンコ及びワンナーのプロトコールにより抜いた後に、菌株Ｅ．コリＥＴ３を単離することができた。Ｅ．コリＥＴ３のｄｓｄＡの欠失のために、ｐＫＤ１３からのクロラムフェニコール耐性部分を、同様に以下のプライマーを用いて増幅した：
５’＿ＧＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ＿３’：配列番号７
５’＿ＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＴＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ＿３’：配列番号８
【００２４】
この増幅産物によるＥ．コリＥＴ３（ｐＫＤ４６）の形質転換及びカナマイシン耐性クローンの選択により、ｄａｄＡ及びｄｓｄＡの両方が欠失したＥ．コリＥＴ４の単離を実現した。
【００２５】
実施例３ Ｄ−アミノ酸の分解についての調査
２．５ｍｌのＬＢ培地にＥ．コリＢＷ２５１１３、Ｅ．コリＥＴ３及びＥ．コリＥＴ４の個々のコロニーを植菌し、かつ１８時間にわたり３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物を、１００ｍｌのＬＢ培地中で１：５０に希釈し、かつ１８時間にわたり３７℃でインキュベートした。この培養物を１０分間にわたり１００００ｇで遠心分離し、上清を捨て、かつ菌体を秤量した。ｐＨ７．５の１００ｍＭの種々のＤ−アミノ酸溶液（例えば、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン）を菌体に、１リットルにつき湿潤菌体１００ｇの菌体濃度になるように添加した。これらの反応溶液を３７℃でインキュベートし、その１０時間後に遠心分離した。澄明な上清を、残留しているアミノ酸の濃度についてＨＰＬＣを用いて分析した。記載した％分解率は、出発濃度と、１０時間にわたるインキュベーションの後の最終濃度との比から算出した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アルトロバクター・クリスタロポイエテスＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼを用いて形質転換したＥ．コリＪＭ１０９を用いたヒドロキシメチルヒダントイン及びエチルヒダントインの変換を示す。
【図２】Ｅ．コリＢＷ２５１１３の種々の突然変異株を用いた種々のアミノ酸の分解を示す。
【図３】ｐＪＡＶＩＥＲＩ１６を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸又は５−一置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の製造のための組換え微生物であって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子及び／又はＤ−セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子が突然変異誘発により不活化された微生物。
【請求項２】
エシェリキア・コリ属の生物であることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
アグロバクテリウムの種、アルトロバクターの種又はバチルスの種由来のＤ−カルバモイラーゼの遺伝子を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８１又はこれから誘導される突然変異株。
【請求項５】
エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８２又はこれから誘導される突然変異株。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の微生物を用いるＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン又はＤ−フェニルアラニンを製造することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸又は５−一置換ヒダントインから出発するＤ−アミノ酸の製造のための組換え微生物であって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子及び／又はＤ−セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子が突然変異誘発により不活化された微生物。
【請求項２】
エシェリキア・コリ属の生物であることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
アグロバクテリウムの種、アルトロバクターの種又はバチルスの種由来のＤ−カルバモイラーゼの遺伝子を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８１又はこれから誘導される突然変異株。
【請求項５】
エシェリキア・コリＤＳＭ１５１８２又はこれから誘導される突然変異株。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の微生物を用いるＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｄ−アミノ酪酸、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン又はＤ−フェニルアラニンを製造することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５０４４２８（Ｐ２００６−５０４４２８Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８７４７（Ｐ２００４−５４８７４７）
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４２０４７
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０１０７３８６２）デグサ アクチエンゲゼルシャフト (837)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４２０４７
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０１０７３８６２）デグサ アクチエンゲゼルシャフト (837)
【Ｆターム（参考）】
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