Ｄ−ペプチドを有する抗−アミロイドβ−ペプチド抗体を製造するための組成物
本発明は、治療薬としての使用のため及び／又は疾病の予防のためのＤペプチド又は抗体を含有する組成物に関し、その際、ａ）Ｄペプチドは、アミロイドペプチドと相互に作用し、かつｂ）抗体はａ）からのＤペプチドと結合し、かつさらにａ）からのアミロイドペプチドと結合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常なタンパク質凝集又はタンパク質多量化に基づく疾病の治療の際に、治療薬として使用するための、Ｄ−ペプチド又は抗体を含有する組成物に関する。さらに本発明は、当該組成物を製造するための方法並びにその使用に関する。
【０００２】
タンパク凝集性疾患並びにアミロイド変性は、共通の基準を含む臨床的状態の異なる群であり、この共通の基準は、多くの場合においてしかしながらこれに限定されるものではないが、β−プリーツ構造の規則的なコンフォメーションにおけるそれぞれ特異的なタンパク質の細胞外（全身又は局所的）沈着である。このタンパク質凝集性疾患又はタンパク質ミスフォールディング疾患（Proteinfehlfaltungserkrankungen）の群には、アルツハイマー氏病も含まれる。アルツハイマー氏病（ラテン名Morbus Alzheimer）は、神経変性疾患として６５歳以上のヒトにおいて最も頻繁な形で生じる。病因論は、認知能力の低下により特徴付けられ、これは大抵、日常活動の減少、挙動不審及び神経精神的症状を伴う。患者は、進行した段階において古くからの知識を忘れ、もはや近親者についても認識しない。アルツハイマー診断後の平均余命は、統計学的には平均して約７年〜１０年である。
【０００３】
Ferriらは、２００５年に約２千４百万人のヒトが痴呆を患い、そのうち約６０％がアルツハイマー氏病に帰するものであると示した（Ferriら、Lancet 366, Nr. 9503, 2005, S. 2112-7）。現在においてアルツハイマー氏病は最もよくみられる痴呆性疾患であり、今日に至るまで（Oktober 2008）因果関係の明確な治療法は確立されていない。
【０００４】
最初の臨床的特徴前に早くも測定可能なアルツハイマー氏病の病理学的特徴は、プラークである（いわゆるアルツハイマーのフィブリル形成）。このタンパク質凝塊は、大部分がミスフォールドされたアミロイドβ−ペプチド（Ａβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドとも呼称する）から構成され、かつ、アルツハイマー氏病患者の脳に沈着し（Walsh und Selkoe; 2007, Journal of Neurochemistry 101:1172-1184）、その結果、脳中のアミロイドβ−ペプチドの高められた蓄積が生じる。もっとも、アミロイドβ−ペプチドフィブリル形成はこのプロセスの最終段階を示すに過ぎず、これは、ＡＰＰ（アミロイド前駆タンパク質）からのアミロイドβ−ペプチドモノマーの分離により開始され、その後に、神経毒性アミロイドβ−ペプチドオリゴマーを形成し、かつその後のアミロイドβ−ペプチドフィブリル形成でようやく終了する。
【０００５】
アミロイドβ−ペプチドによる蓄積を回避するために、試験的治療法として、アミロイドβ−ペプチドフラグメントを免疫原として用いる能動免疫及び受動免疫がおこなわれている。
【０００６】
試験的治療法は、アミロイドβ−ペプチド凝集のin vitro モデル、アミロイドβ−タンパク質産生細胞モデル、並びに脳中にアミロイドβ−ペプチド凝塊が形成されたトランスジェニックマウスモデルにおいて実施する。特に、能動免疫及び受動免疫は、アミロイドβ−ペプチド凝集のトランスジェニックマウスモデルにおける治療として実施する（Schenkら, Nature, 1999; Bardら. 2003）。能動免疫の最初の記載では、免疫原として完全長Ｌ−アミロイドβ−ペプチドを使用し、かつアルツハイマー氏病のマウスモデル中で免疫の範囲内で、プラークのクリアランスをおこなった（Schenkら, Nature, 1999）。同様のマウスモデルにおいて、さらに受動免疫を成功させた。これに関して、アミロイドβ−ペプチド１−１１の範囲内におけるＮ−末端エピトープは、特に、アミロイドβ−ペプチドフィブリル形成の脳性クリアランスを効率よくおこなうと示されている（Bardら.; 2003, PNAS 100(4):2023-2028）。現在のところ、受動免疫、すなわち、抗体／抗体フラグメントを用いての２種の研究が、アルツハイマー氏病患者において実施されている（Brody及びHoltzman; 2008, Annual Reviews in Neuroscience 31: 175-193）。
【０００７】
免疫は、動物試験において成功しているが、しかしながら、ヒトの場合の能動免疫は、Ｔ−細胞介在型自己免疫応答又は自己免疫障害を招き、その際、患者の脳における生体特有の免疫系は、髄膜脳炎（Meningoenzephalitis）を発症させる（Brody及びHoltzman; 2008, Annual Reviews in Neuroscience 31:175-193）。したがって、アミロイドβ−ペプチドフラグメントでの能動免疫は、現在のところ、ほとんど成功しないものと評価されている。
【０００８】
受動免疫治療のためのアミロイドβ−ペプチドに対する抗体は、Bardら（PNAS 100(4):2023-2028）、Dodelら（2002; Ann Neurol 52:253-256） 及び2007年のGardbergら（PNAS 104(40):15659-15664）より、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜８に対するものが記載されている。
【０００９】
完全な（１〜４２）線維性アミロイドβ−ペプチドを用いる老いたビーグル犬の免疫は、例えばＨｅａｄらによっても記載されている（2008; The Journal of Neuroscience 28(14): 35555-3566）。しかしながら、免疫原としてのアミロイドβ−ペプチドの使用に関して犬とヒトとの間の決定的な違いが存在し、それというのも、ヒトとくらべて犬においては障害となる自己免疫応答が生じないためである。
【００１０】
Cribbsら（1997; The Journal of Biological Chemistry 272(11): 7431-7436）は、アミロイドβ−ペプチドのメカニズムを研究し、かつこれに関して完全なアミロイドβ−ペプチド並びにその短い形（アミノ酸１〜４２又は２５〜３５）のＤ−及びＬ−異性体を使用した。同様に立体特異性は、Eslerらにより試験された。Oserらは、変化したコンフォメーションを有するタンパク質／プリオンの検出を、検出される標的−タンパク質に応じた配列を使用して示した（US 2008/0171341 A1）。
【００１１】
Willboldら（WO 02/081505 A2）は、Ａｓｓ−ペプチドと結合するアミノ酸配列を同定するためのファージディスプレイの実施を示す。Findeisら（US 6,689,752 B2）は、アミロイドβ−ペプチドの凝集における３〜５個のアミノ酸から成る配列の影響を試験した。Cribbsらは、その結果から、神経毒性が立体異性特異的ではないことを推論した。しかしながらここでは免疫応答に関して試験されず、Ｄ−異性体のわずかな免疫性が示された。
【００１２】
Geylisらは、健康なヒトから獲得した細胞系を記載し、この細胞系は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜１６と結合する抗体を産生するものであって、かつ受動免疫の際の使用が議論された。Leeら（2005; American Neurological Association 58:430-435）により、この抗体とヒト血清について、これは、アミロイドβ−ペプチド免疫後に、髄膜脳炎にかかり、かつかかっていないことを比較した。この試験結果は、抗体が主にアミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜８に対するものであることを示す。
【００１３】
したがって本発明の課題は、タンパク質凝集性／ミスフォールディング疾患の予防的処置又は治療の際の治療薬として使用するための組成物を提供することである。この組成物は、アルツハイマー氏病及び他のタンパク質凝集性疾患に対する能動免疫のための方法において使用することができる。これに関して、Ｔ−細胞応答を回避しながらＢ−細胞免疫応答の選択的誘発を達成することができる。
【００１４】
この課題は、本発明によれば、治療薬として使用するため、及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチド又は抗体を含有する組成物によって解決され、この際、ａ）Ｄ−ペプチドはアミロイドβ−ペプチドと相互に作用し、かつ、ｂ）抗体はａ）からのＤ−ペプチド及び付加的にａ）からのアミロイドβ−ペプチドと結合する。
【００１５】
したがってこの組成物は、免疫原としてＤ−ペプチドを含有し、この場合、これは、アミロイドβ−ペプチドと相互に作用し、かつ抗アミロイドβ−ペプチド抗体の抗体形成を生じさせる。さらにこの組成物は、アミロイドβ−ペプチドと相互に作用した抗体を含有していてもよく、この際、この抗体は、前記Ｄ−ペプチドと結合し、かつ付加的にアミロイドβ−ペプチドと結合している。Ｄ−ペプチドとアミロイド−β−ペプチドとの間の「相互作用」とは、タンパク質−タンパク質間相互作用である。
【００１６】
本発明による「組成物」とは、例えば、ワクチン、医薬品（例えば錠剤形）、注射液、栄養剤又は栄養補助食品であってもよい。本発明による組成物は、Ｄ−ペプチドのみ又は抗体のみから構成されてもよく、それぞれの適用に対して必要な助剤、例えば塩、例えばアルミニウム塩、緩衝液又は溶剤と一緒に組み合わせることができる。
【００１７】
技術水準に対してもたらされる他の利点は以下のとおりである：
− 免疫原の少ない分子量
− Ｔ−細胞応答（細胞性自己免疫）の不在及びそれに伴い顕著に少ない副作用、
− 免疫原が遅れて分解されることにより、わずかな量の組成物の使用で十分であること、
− 免疫原を改質化又は組合せることが容易であること。
【００１８】
本発明による組成物によって、Ｄ−ペプチドでの免疫後に、アミロイドβ−ペプチド特異的抗体を製造することができる。Ｄ−ペプチドによるアミロイドβ−ペプチド−固有のものではない（−fremden）免疫原での免疫は、アミロイドβ−ペプチド免疫原に優るものであり、それというのも、アミロイドβ−ペプチドに対する抗体応答が、同時の副作用を伴う抗−アミロイドβ−ペプチドＴ−細胞応答なしで誘発されるためである。
【００１９】
「免疫」とは、特定の抗原に対する免疫応答を、この抗原を排除し、中和し及び／又はその他生体に関して危険のないようにする目的で生じさせることであると理解される。能動免疫：内因性免疫応答を生じさせる抗原（大抵はペプチド配列）の導入を意味し、これにより、抗原及び特に関連する抗原が排除される。
【００２０】
「受動免疫」とは、非経口的な抗体の導入であると理解され、これにより抗原が排除される。
【００２１】
本発明による組成物を用いて、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインにおける抗体形成によって、アミロイド−β−ペプチド多量体の形成を阻害することができ、その際、この抗体は、Ｄ−ペプチドでの免疫によって形成する。
【００２２】
「アミロイドβ−ペプチド多量体」は、本発明の意味において、新規機能の獲得を含む（機能の獲得）複数のアミロイドβ−ペプチド分子の安定した組合せ物を意味する。
【００２３】
用語「多量化ドメイン」とは、アミロイドβ−ペプチドの相互作用を互いに生じるほかならぬアミロイドβ−ペプチドのドメインを定義する。一の変法において、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１０〜２４がこの機能を満たす。
【００２４】
他の適応範囲は、アルツハイマー氏病、真性糖尿病及び他のアミロイド性疾患、並びに一のタンパク質由来のホモ多量化が明確な疾患、例えばパーキンソン氏病、前頭側頭骨痴呆、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、てんかんの特定の型の治療における使用である。
【００２５】
本発明の他の対象は組成物であり、この場合、これは、組成物中のＤ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドの部分フラグメントのレトロインベルソ（retro-inverse）型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドを含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドは、部分的にＬ−アミノ酸を含んでいるか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有する、
ことを特徴とする。
【００２６】
「Ｄ−ペプチド」は、一の変法において、アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド部分フラグメントに対するレトロインベルソ型配列から構成され、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成される。
【００２７】
「部分フラグメント」は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸配列に対して相同な３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又はそれ以上のアミノ酸から構成される。
【００２８】
他の変法において、本発明によるＤ−ペプチドは、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合する。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含有し、かつ、完全にＤ−アミノ酸から構成される。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ部分的にＬ−アミノ酸を含む。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２と相同な配列を示す。「Ｄ−ペプチド」とは、Ｄ−型のアミノ酸を組み合わせたペプチドであると理解される。
【００２９】
「部分的に」Ｌ−アミノ酸を含む場合には、Ｄ−アミノ酸から構成されるＤ−ペプチドのアミノ酸配列と相同な１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、それぞれ同一のアミノ酸によってＬ−配置で置換されることによるものを意味する。
【００３０】
「相同な配列」とは、本発明の意味においてアミノ酸が、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、とりわけ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を示すことを意味する。Ｄ−アミノ酸から構成される本発明による配列と相同な配列は、さらに部分的にＬ−アミノ酸を含有していてもよい。本明細書中において、用語「同一性」に代えて用語「相同」又は「相同性」を同様の意味で使用する。２種の核酸配列又はポリペプチド配列との間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S（Adv. Appl. Math. 2482-489 (1981)）のアルゴリズムをベースとするプログラムBESTFITを用いて比較することによって、アミノ酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップエクステンションペナルティー：２及び核酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップエクステンションペナルティー：３の調整下で算定した。好ましくは、２種の核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、それぞれ全配列長に亘る核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定められ、これは、例えば、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D.（J.Mol. Biol. 48 443-453）のアルゴリズムをベースとするプログラムＧＡＰを用いて比較することによって、アミノ酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップエクステンションペナルティー：２及び、以下の核酸ギャップクリエーションペナルティ：５０及びギャップエクステンションペナルティ：３の調整下で算定した。
【００３１】
この相同なＤ−ペプチドは、アミロイドβ−ペプチド及び／又はアミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合する。これは、アミロイドβ−ペプチドから誘導することができ（ホモログ）、かつ機能的に、すなわち、少なくともアミロイドβ−ペプチドと同一な免疫応答を誘導する能力を定めることができる。しかしながら、これはアミロイドβ−ペプチド自体ではなく、かつアミロイドβ−ペプチド及び／又はアミロイドβ−ペプチド多量体に対してマウスにおける抗体応答を生じさせるものである。
【００３２】
本発明による用語「レトロインベルソ型（retro-inverse）ペプチド」とは、Ｄ−型のアミノ酸から構成され（インベルソ：Ｌ−型に対するα炭素原子のキラリティ）、その際、付加的に配列順序を本来のペプチドとは逆にした（レトロ；逆方向；Regenmortel及びMuller, 1998; Current Opinion in Biotechnology 9: 377-382も参照せよ）ペプチドを呼称する。
【００３３】
本発明の他の対象は抗体を含む組成物であり、この際、抗体は、アミロイドペプチド又はアミロイドβ−ペプチドと結合し、かつ、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分プラグメントのレトロ-
インベルソ型配列と結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２の配列又はこれと相同な配列と結合する。
【００３４】
有利には、抗体は、アミロイドβ−ペプチド自体の性質を示し、かつ、アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインに結合する抗体産生ペプチドに対して使用する場合には、アミロイドβ−ペプチドの多量化と競合する。
【００３５】
本発明の他の対象は、本発明による組成物を製造するための方法であり、この際、動物又は動物細胞の免疫によって、動物細胞とミエローマ細胞との融合によって、かつ引き続いての抗体産生雑種細胞の選択及び培養によって達成され、かつ抗体は単離され、かつ精製される。
【００３６】
抗体産生雑種細胞の免疫、融合、選択、培養及び抗体単離又は抗体精製は、例えば、"Monoclonal antibodies"（Heddy ZolaSpringer Verlag, New York 2000）中で示されており、かつ同業者に公知の方法で実施することができる。他の方法、特に抗体産生細胞のスクリーニングのための他の方法は、Korthら, 1999, in Methods in Enzymology 309:106中で示されている。
【００３７】
免疫のために、動物（又は動物細胞）、例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等、抗体製造のために通常使用される動物を使用することができる。本発明による組成物を用いて免疫するためにマウスを選択する場合には、免疫ストラテジーは以下のとおりである：これに関して組成物は、皮下注射することができる（例えば３回、０日目：完全フロイントアジュバンド、２１及び２２日目：不完全フロイントアジュバンド；、３１日目における採血量は約１００μｌ）。本発明による組成物を用いてのブースター注射後に、マウスを、例えば５１日目で麻酔をかけ、首をはね、かつその脾臓を取り出す。このようにして取り出された脾臓細胞（脾細胞）は、マウス−ミエローマ細胞と１：５の割合で混合し、かつ５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加して（８分、室温）融合させた。その後に、細胞を洗浄し、かつ一晩に亘って培養した。抗体−産生ハイブリドーマ細胞の選択は、例えばＨＡＴ培地及び９６穴プレート上で実施し、かつＥＬＩＳＡ酵素試験をおこなってもよい。
【００３８】
本発明の他の対象は、アミロイド−β−ペプチド−多量体を排除するための本発明による組成物の使用である。これに関して、Ｄ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合する抗体を使用することができる。
【００３９】
本発明による一の変法において、組成物は１０〜１０００μｇの免疫原を含有する。他の一の変法において、組成物は２０〜９００、２５〜７５０、３０〜６００、４０〜５００、５０〜４００、５０〜３００又は５０〜２５０μｇの免疫原を含有する。さらに組成物は１０μｇを下回るか、あるいは、１０００μｇを上回る免疫原を含有することも可能である。
【００４０】
好ましくは、「免疫原」とは、免疫性を導く抗原であると理解される。免疫原は、免疫応答を引き起こす物質である。免疫原は、抗原が抗体により識別され、それにより、いかなる免疫応答でも引き起こすことができるものではない点で、抗原とは異なる。
【００４１】
好ましくは「免疫"Immunitaet"」とは、免疫処理によってもたらされ、かつ特異的抗体及び／又は細胞の出現によって特徴付けられる、抗原（例えばウイルス、細菌又は外来タンパク質）に対して変化した免疫系の反応の準備（Reaktionbereitschaft）であると理解される。
【００４２】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療における本発明による組成物の使用である。したがって、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するＤ−ペプチドは、アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療のための医薬を製造するのに役立つ。
【００４３】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防のための、Ｄ−ペプチドを含む本発明による組成物の使用であり、この際、このＤ−ペプチドは、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ぺプチド−部分フラグメントに対するレトロインベルソ型配列を含み、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２の配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含み、この際、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２を示す配列と一緒に部分的にＬ−アミノ酸を含み、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２に対して相同な配列を含有する。
【００４４】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防又は診断のために、抗体を含有する本発明による組成物の使用であり、この際、この抗体は、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２であるか、あるいはこれらと相同な配列と結合する。
【００４５】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の診断のため、バイオマーカーの検出又は定量化のため、あるいは、組織、細胞又は特別な細胞型の認識の際に含まれるバイオマーカーの局在化のための、抗体を含む組成物の使用であり、この際、この抗体は、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する。
【００４６】
これに関して、本発明の意味におけるバイオマーカーの検出又は定量化とは、抗原−抗体反応による基質の測定であると理解される（例えばイムノアッセイ）。
【００４７】
これに関して、本発明の意味における組織又は細胞中であるか、あるいは特別な細胞型の認識の際のバイオマーカーの局在化とは、例えば、組織免疫的又は細胞免疫化学的な抗体の利用であると理解される。
【００４８】
本発明の利点は、これに関して使用されたＤ−ペプチドをＴ−細胞から調製することなしに、治療的抗体応答を誘発することである。
【００４９】
したがって、簡単な方法で、タンパク質凝集性疾患又はタンパク質コンフォメーション障害（Proteinkonformationserkrankungen）に対する免疫ストラテジーを開発することができる方法が見出された。これは、アルツハイマー氏病の治療と関連する一の方法で、この際、アミロイドβ−ペプチドと組み合わされたＤ−ペプチドを用いて免疫し、その個体におけるアミロイドβ−ペプチド−毒性が中和するか、及び／又はアミロイドβ−ペプチドクリアランスをおこなった体液性免疫が達成される。さらに、アルツハイマー氏病とは異なる疾患において、この際、タンパク質の凝集又は多量化が同様に疾患の原因であり、多量化面に結合するＤ−ペプチドを使用する方法を開発することができる（ＺＮＳのタンパク質高次構造障害、糖尿病等）。
【００５０】
好ましくは本発明の「クリアランス（"Clearing""Clearance"又は"clearend"）」とは、器官（例えば腎クリアランス）、細胞性コンパートメント（例えばマクロファージ、マイクログリア）又は亜細胞性コンパートメント（例えばプロテオソーム）の特殊な性能として、組織から特定の外因性又は内因性物質を除去することであると理解される。
【００５１】
本発明の他の利点は、付加的に、アミロイドβ−ペプチドのエピトプラム（エピトープ領域）を除去することであり、これは、基本的に高い自己寛容で体液性免疫応答を制限することができる。アミロイドβ−ペプチド結合Ｄ−ペプチドの本発明による使用の際に、さらにＴ−細胞応答が抑止され、それというのもこのペプチドが分解されず、かつ、及び提示され得ないためである。
【００５２】
さらに本発明の対象は、アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインに対して向けられ、かつアミロイドβ−ペプチドの多量化を阻害する抗体である。したがって、抗体で標識化することによって、アミロイドβ−ペプチド又はこれが一緒になったアミロイドβ−ペプチド−堆積物を生体特有の免疫系によって分解することができる。さらに本発明による抗体は、アミロイドβ−ペプチドに対して共通に向けられるものであり、かつ多量化ドメインに対して特別に向けられるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】９Ａ６抗体及びＩＣ１６抗体を用いてのウエスタンブロットを示す図
【図２】９Ａ６抗体及びＩＣ１６抗体を用いてのウエスタンブロットを示す図
【図３】９Ａ６抗体での免疫組織化学的染色を示す図
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例及び添付図面に基づいて詳細に記載する。
【００５５】
図１は、合成アミロイドβ−ペプチド（１）及びＡＰＰでトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞（３）；無関係のコントロール群（２）のウエスタンブロット図を示す。このウエスタンブロットは、９Ａ６が、ウエスタンブロット上でＡＰＰ又はアミロイドβ−ペプチドを認識しないことを示す（左側）一方、汎用性の抗−アミロイドβ−ペプチド抗体ＩＣ１６がこれを認識できることを示す（右側）。
【００５６】
図２は、アミロイド−β−ペプチドを分泌する、持続的にＡＰＰトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上澄み液からの、ＩＣ１６（右側）及び９Ａ６（右側）の免疫沈降反応のウエスタンブロットを示す。これは、９Ａ６が、アミロイドβ−ペプチドオリゴマーを認識するものと判断される。
【００５７】
図３は、アルツハイマー氏病患者の皮質試料の９Ａ６での免疫組織化学的染色を示す。これは、９Ａ６抗体が、弱いアミロイドβ−ペプチドプラークを認識するものと判断される。
【００５８】
例１（Ｄ３ペプチドを用いてのマウスの免疫化）
マウスは、Ｄ−ペプチドを用いて免疫した。これには、Ｄ３−ペプチド及びアミロイドβ−ペプチドのレトロインベルソ型ペプチドを使用する（ｒｉＡβ１−１６;レトロインベルソ型Ａβ（１−１６））。複数回のブースター注射（補充ワクチン投与、ブースター効果）後に、標準的な方法によってモノクローナル抗体を得るための融合を実施した。モノクローナル抗体を単離することができ、これは、Ｄ３、ｒｉＡβ１−１６及びアミロイドβ−ペプチドと結合する。したがって、前記Ｄ−ペプチドを用いての免疫は、アミロイドβ−ペプチドに対する保護免疫応答を導く。
【００５９】
好ましくは、「ブースター効果（ブースター注射又は補充ワクチン投与によって達成される）」とは、抗体との反復接触による免疫学的副反応又は強化された免疫応答であると理解される。
【００６０】
免疫のために使用されたペプチドは以下の配列を有する：
「Ｄ３」−ペプチド：ｒｐｒｔｒ Ｉｈｔｈｒ ｎｒ（配列番号１）
レトロインベルソ型−Ａβ（１−１６）：ｋｑｈｈｖ ｅｙｇｓｄ ｈｒｆｅａ ｄ（配列番号２）
【００６１】
Ｄ３は、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）と共有結合させ（架橋）、かつ標準的方法でマウスを免疫した。これはその後に、標準的プロトコールによって、マウスミエローマ細胞と融合させた。生じるハイブリドーマ細胞の細胞培養上清を、Ｄ３ペプチド及びアミロイドβ−ペプチドの認識により、標準的なＥＬＩＳＡで試験した。
【００６２】
以下のクローンは、Ｄ３のみを認識する（アミロイドβ−ペプチドではない）：
４Ｇ１１、１３Ｈ１１、３２Ａ１１、４０Ｂ７。
【００６３】
以下のクローンは、Ｄ３のみならずアミロイドβ−ペプチドを認識する：
９Ａ６、１４Ｂ５、３９Ｂ１２。
【００６４】
この試験は以下のことを示す；
１．Ｄ３を用いての免疫は結果として、アミロイドβ−ペプチドに対する抗体応答を生じ、かつ、
２．特定の抗体についての結合部位を提供し、これは、アミロイドβ−ペプチドのみならずさらにＤ３も認識することができる。
【００６５】
抗Ｄ３／抗アミロイドβ−ペプチド抗体９Ａ６の典型的な試験は、図１、図２及び図３に示すアッセイ中で試験した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常なタンパク質凝集又はタンパク質多量化に基づく疾病の治療の際に、治療薬として使用するための、Ｄ−ペプチド又は抗体を含有する組成物に関する。さらに本発明は、当該組成物を製造するための方法並びにその使用に関する。
【０００２】
タンパク凝集性疾患並びにアミロイド変性は、共通の基準を含む臨床的状態の異なる群であり、この共通の基準は、多くの場合においてしかしながらこれに限定されるものではないが、β−プリーツ構造の規則的なコンフォメーションにおけるそれぞれ特異的なタンパク質の細胞外（全身又は局所的）沈着である。このタンパク質凝集性疾患又はタンパク質ミスフォールディング疾患（Proteinfehlfaltungserkrankungen）の群には、アルツハイマー氏病も含まれる。アルツハイマー氏病（ラテン名Morbus Alzheimer）は、神経変性疾患として６５歳以上のヒトにおいて最も頻繁な形で生じる。病因論は、認知能力の低下により特徴付けられ、これは大抵、日常活動の減少、挙動不審及び神経精神的症状を伴う。患者は、進行した段階において古くからの知識を忘れ、もはや近親者についても認識しない。アルツハイマー診断後の平均余命は、統計学的には平均して約７年〜１０年である。
【０００３】
Ferriらは、２００５年に約２千４百万人のヒトが痴呆を患い、そのうち約６０％がアルツハイマー氏病に帰するものであると示した（Ferriら、Lancet 366, Nr. 9503, 2005, S. 2112-7）。現在においてアルツハイマー氏病は最もよくみられる痴呆性疾患であり、今日に至るまで（Oktober 2008）因果関係の明確な治療法は確立されていない。
【０００４】
最初の臨床的特徴前に早くも測定可能なアルツハイマー氏病の病理学的特徴は、プラークである（いわゆるアルツハイマーのフィブリル形成）。このタンパク質凝塊は、大部分がミスフォールドされたアミロイドβ−ペプチド（Ａβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドとも呼称する）から構成され、かつ、アルツハイマー氏病患者の脳に沈着し（Walsh und Selkoe; 2007, Journal of Neurochemistry 101:1172-1184）、その結果、脳中のアミロイドβ−ペプチドの高められた蓄積が生じる。もっとも、アミロイドβ−ペプチドフィブリル形成はこのプロセスの最終段階を示すに過ぎず、これは、ＡＰＰ（アミロイド前駆タンパク質）からのアミロイドβ−ペプチドモノマーの分離により開始され、その後に、神経毒性アミロイドβ−ペプチドオリゴマーを形成し、かつその後のアミロイドβ−ペプチドフィブリル形成でようやく終了する。
【０００５】
アミロイドβ−ペプチドによる蓄積を回避するために、試験的治療法として、アミロイドβ−ペプチドフラグメントを免疫原として用いる能動免疫及び受動免疫がおこなわれている。
【０００６】
試験的治療法は、アミロイドβ−ペプチド凝集のin vitro モデル、アミロイドβ−タンパク質産生細胞モデル、並びに脳中にアミロイドβ−ペプチド凝塊が形成されたトランスジェニックマウスモデルにおいて実施する。特に、能動免疫及び受動免疫は、アミロイドβ−ペプチド凝集のトランスジェニックマウスモデルにおける治療として実施する（Schenkら, Nature, 1999; Bardら. 2003）。能動免疫の最初の記載では、免疫原として完全長Ｌ−アミロイドβ−ペプチドを使用し、かつアルツハイマー氏病のマウスモデル中で免疫の範囲内で、プラークのクリアランスをおこなった（Schenkら, Nature, 1999）。同様のマウスモデルにおいて、さらに受動免疫を成功させた。これに関して、アミロイドβ−ペプチド１−１１の範囲内におけるＮ−末端エピトープは、特に、アミロイドβ−ペプチドフィブリル形成の脳性クリアランスを効率よくおこなうと示されている（Bardら.; 2003, PNAS 100(4):2023-2028）。現在のところ、受動免疫、すなわち、抗体／抗体フラグメントを用いての２種の研究が、アルツハイマー氏病患者において実施されている（Brody及びHoltzman; 2008, Annual Reviews in Neuroscience 31: 175-193）。
【０００７】
免疫は、動物試験において成功しているが、しかしながら、ヒトの場合の能動免疫は、Ｔ−細胞介在型自己免疫応答又は自己免疫障害を招き、その際、患者の脳における生体特有の免疫系は、髄膜脳炎（Meningoenzephalitis）を発症させる（Brody及びHoltzman; 2008, Annual Reviews in Neuroscience 31:175-193）。したがって、アミロイドβ−ペプチドフラグメントでの能動免疫は、現在のところ、ほとんど成功しないものと評価されている。
【０００８】
受動免疫治療のためのアミロイドβ−ペプチドに対する抗体は、Bardら（PNAS 100(4):2023-2028）、Dodelら（2002; Ann Neurol 52:253-256） 及び2007年のGardbergら（PNAS 104(40):15659-15664）より、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜８に対するものが記載されている。
【０００９】
完全な（１〜４２）線維性アミロイドβ−ペプチドを用いる老いたビーグル犬の免疫は、例えばＨｅａｄらによっても記載されている（2008; The Journal of Neuroscience 28(14): 35555-3566）。しかしながら、免疫原としてのアミロイドβ−ペプチドの使用に関して犬とヒトとの間の決定的な違いが存在し、それというのも、ヒトとくらべて犬においては障害となる自己免疫応答が生じないためである。
【００１０】
Cribbsら（1997; The Journal of Biological Chemistry 272(11): 7431-7436）は、アミロイドβ−ペプチドのメカニズムを研究し、かつこれに関して完全なアミロイドβ−ペプチド並びにその短い形（アミノ酸１〜４２又は２５〜３５）のＤ−及びＬ−異性体を使用した。同様に立体特異性は、Eslerらにより試験された。Oserらは、変化したコンフォメーションを有するタンパク質／プリオンの検出を、検出される標的−タンパク質に応じた配列を使用して示した（US 2008/0171341 A1）。
【００１１】
Willboldら（WO 02/081505 A2）は、Ａｓｓ−ペプチドと結合するアミノ酸配列を同定するためのファージディスプレイの実施を示す。Findeisら（US 6,689,752 B2）は、アミロイドβ−ペプチドの凝集における３〜５個のアミノ酸から成る配列の影響を試験した。Cribbsらは、その結果から、神経毒性が立体異性特異的ではないことを推論した。しかしながらここでは免疫応答に関して試験されず、Ｄ−異性体のわずかな免疫性が示された。
【００１２】
Geylisらは、健康なヒトから獲得した細胞系を記載し、この細胞系は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜１６と結合する抗体を産生するものであって、かつ受動免疫の際の使用が議論された。Leeら（2005; American Neurological Association 58:430-435）により、この抗体とヒト血清について、これは、アミロイドβ−ペプチド免疫後に、髄膜脳炎にかかり、かつかかっていないことを比較した。この試験結果は、抗体が主にアミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１〜８に対するものであることを示す。
【００１３】
したがって本発明の課題は、タンパク質凝集性／ミスフォールディング疾患の予防的処置又は治療の際の治療薬として使用するための組成物を提供することである。この組成物は、アルツハイマー氏病及び他のタンパク質凝集性疾患に対する能動免疫のための方法において使用することができる。これに関して、Ｔ−細胞応答を回避しながらＢ−細胞免疫応答の選択的誘発を達成することができる。
【００１４】
この課題は、本発明によれば、治療薬として使用するため、及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチド又は抗体を含有する組成物によって解決され、この際、ａ）Ｄ−ペプチドはアミロイドβ−ペプチドと相互に作用し、かつ、ｂ）抗体はａ）からのＤ−ペプチド及び付加的にａ）からのアミロイドβ−ペプチドと結合する。
【００１５】
したがってこの組成物は、免疫原としてＤ−ペプチドを含有し、この場合、これは、アミロイドβ−ペプチドと相互に作用し、かつ抗アミロイドβ−ペプチド抗体の抗体形成を生じさせる。さらにこの組成物は、アミロイドβ−ペプチドと相互に作用した抗体を含有していてもよく、この際、この抗体は、前記Ｄ−ペプチドと結合し、かつ付加的にアミロイドβ−ペプチドと結合している。Ｄ−ペプチドとアミロイド−β−ペプチドとの間の「相互作用」とは、タンパク質−タンパク質間相互作用である。
【００１６】
本発明による「組成物」とは、例えば、ワクチン、医薬品（例えば錠剤形）、注射液、栄養剤又は栄養補助食品であってもよい。本発明による組成物は、Ｄ−ペプチドのみ又は抗体のみから構成されてもよく、それぞれの適用に対して必要な助剤、例えば塩、例えばアルミニウム塩、緩衝液又は溶剤と一緒に組み合わせることができる。
【００１７】
技術水準に対してもたらされる他の利点は以下のとおりである：
− 免疫原の少ない分子量
− Ｔ−細胞応答（細胞性自己免疫）の不在及びそれに伴い顕著に少ない副作用、
− 免疫原が遅れて分解されることにより、わずかな量の組成物の使用で十分であること、
− 免疫原を改質化又は組合せることが容易であること。
【００１８】
本発明による組成物によって、Ｄ−ペプチドでの免疫後に、アミロイドβ−ペプチド特異的抗体を製造することができる。Ｄ−ペプチドによるアミロイドβ−ペプチド−固有のものではない（−fremden）免疫原での免疫は、アミロイドβ−ペプチド免疫原に優るものであり、それというのも、アミロイドβ−ペプチドに対する抗体応答が、同時の副作用を伴う抗−アミロイドβ−ペプチドＴ−細胞応答なしで誘発されるためである。
【００１９】
「免疫」とは、特定の抗原に対する免疫応答を、この抗原を排除し、中和し及び／又はその他生体に関して危険のないようにする目的で生じさせることであると理解される。能動免疫：内因性免疫応答を生じさせる抗原（大抵はペプチド配列）の導入を意味し、これにより、抗原及び特に関連する抗原が排除される。
【００２０】
「受動免疫」とは、非経口的な抗体の導入であると理解され、これにより抗原が排除される。
【００２１】
本発明による組成物を用いて、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインにおける抗体形成によって、アミロイド−β−ペプチド多量体の形成を阻害することができ、その際、この抗体は、Ｄ−ペプチドでの免疫によって形成する。
【００２２】
「アミロイドβ−ペプチド多量体」は、本発明の意味において、新規機能の獲得を含む（機能の獲得）複数のアミロイドβ−ペプチド分子の安定した組合せ物を意味する。
【００２３】
用語「多量化ドメイン」とは、アミロイドβ−ペプチドの相互作用を互いに生じるほかならぬアミロイドβ−ペプチドのドメインを定義する。一の変法において、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸１０〜２４がこの機能を満たす。
【００２４】
他の適応範囲は、アルツハイマー氏病、真性糖尿病及び他のアミロイド性疾患、並びに一のタンパク質由来のホモ多量化が明確な疾患、例えばパーキンソン氏病、前頭側頭骨痴呆、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、てんかんの特定の型の治療における使用である。
【００２５】
本発明の他の対象は組成物であり、この場合、これは、組成物中のＤ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドの部分フラグメントのレトロインベルソ（retro-inverse）型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドを含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドは、部分的にＬ−アミノ酸を含んでいるか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有する、
ことを特徴とする。
【００２６】
「Ｄ−ペプチド」は、一の変法において、アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド部分フラグメントに対するレトロインベルソ型配列から構成され、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成される。
【００２７】
「部分フラグメント」は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸配列に対して相同な３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又はそれ以上のアミノ酸から構成される。
【００２８】
他の変法において、本発明によるＤ−ペプチドは、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合する。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含有し、かつ、完全にＤ−アミノ酸から構成される。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ部分的にＬ−アミノ酸を含む。一の他の変法において、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２と相同な配列を示す。「Ｄ−ペプチド」とは、Ｄ−型のアミノ酸を組み合わせたペプチドであると理解される。
【００２９】
「部分的に」Ｌ−アミノ酸を含む場合には、Ｄ−アミノ酸から構成されるＤ−ペプチドのアミノ酸配列と相同な１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、それぞれ同一のアミノ酸によってＬ−配置で置換されることによるものを意味する。
【００３０】
「相同な配列」とは、本発明の意味においてアミノ酸が、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、とりわけ９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を示すことを意味する。Ｄ−アミノ酸から構成される本発明による配列と相同な配列は、さらに部分的にＬ−アミノ酸を含有していてもよい。本明細書中において、用語「同一性」に代えて用語「相同」又は「相同性」を同様の意味で使用する。２種の核酸配列又はポリペプチド配列との間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S（Adv. Appl. Math. 2482-489 (1981)）のアルゴリズムをベースとするプログラムBESTFITを用いて比較することによって、アミノ酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップエクステンションペナルティー：２及び核酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップエクステンションペナルティー：３の調整下で算定した。好ましくは、２種の核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、それぞれ全配列長に亘る核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定められ、これは、例えば、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D.（J.Mol. Biol. 48 443-453）のアルゴリズムをベースとするプログラムＧＡＰを用いて比較することによって、アミノ酸に関する以下のパラメータ：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップエクステンションペナルティー：２及び、以下の核酸ギャップクリエーションペナルティ：５０及びギャップエクステンションペナルティ：３の調整下で算定した。
【００３１】
この相同なＤ−ペプチドは、アミロイドβ−ペプチド及び／又はアミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合する。これは、アミロイドβ−ペプチドから誘導することができ（ホモログ）、かつ機能的に、すなわち、少なくともアミロイドβ−ペプチドと同一な免疫応答を誘導する能力を定めることができる。しかしながら、これはアミロイドβ−ペプチド自体ではなく、かつアミロイドβ−ペプチド及び／又はアミロイドβ−ペプチド多量体に対してマウスにおける抗体応答を生じさせるものである。
【００３２】
本発明による用語「レトロインベルソ型（retro-inverse）ペプチド」とは、Ｄ−型のアミノ酸から構成され（インベルソ：Ｌ−型に対するα炭素原子のキラリティ）、その際、付加的に配列順序を本来のペプチドとは逆にした（レトロ；逆方向；Regenmortel及びMuller, 1998; Current Opinion in Biotechnology 9: 377-382も参照せよ）ペプチドを呼称する。
【００３３】
本発明の他の対象は抗体を含む組成物であり、この際、抗体は、アミロイドペプチド又はアミロイドβ−ペプチドと結合し、かつ、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分プラグメントのレトロ-
インベルソ型配列と結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２の配列又はこれと相同な配列と結合する。
【００３４】
有利には、抗体は、アミロイドβ−ペプチド自体の性質を示し、かつ、アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインに結合する抗体産生ペプチドに対して使用する場合には、アミロイドβ−ペプチドの多量化と競合する。
【００３５】
本発明の他の対象は、本発明による組成物を製造するための方法であり、この際、動物又は動物細胞の免疫によって、動物細胞とミエローマ細胞との融合によって、かつ引き続いての抗体産生雑種細胞の選択及び培養によって達成され、かつ抗体は単離され、かつ精製される。
【００３６】
抗体産生雑種細胞の免疫、融合、選択、培養及び抗体単離又は抗体精製は、例えば、"Monoclonal antibodies"（Heddy ZolaSpringer Verlag, New York 2000）中で示されており、かつ同業者に公知の方法で実施することができる。他の方法、特に抗体産生細胞のスクリーニングのための他の方法は、Korthら, 1999, in Methods in Enzymology 309:106中で示されている。
【００３７】
免疫のために、動物（又は動物細胞）、例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等、抗体製造のために通常使用される動物を使用することができる。本発明による組成物を用いて免疫するためにマウスを選択する場合には、免疫ストラテジーは以下のとおりである：これに関して組成物は、皮下注射することができる（例えば３回、０日目：完全フロイントアジュバンド、２１及び２２日目：不完全フロイントアジュバンド；、３１日目における採血量は約１００μｌ）。本発明による組成物を用いてのブースター注射後に、マウスを、例えば５１日目で麻酔をかけ、首をはね、かつその脾臓を取り出す。このようにして取り出された脾臓細胞（脾細胞）は、マウス−ミエローマ細胞と１：５の割合で混合し、かつ５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加して（８分、室温）融合させた。その後に、細胞を洗浄し、かつ一晩に亘って培養した。抗体−産生ハイブリドーマ細胞の選択は、例えばＨＡＴ培地及び９６穴プレート上で実施し、かつＥＬＩＳＡ酵素試験をおこなってもよい。
【００３８】
本発明の他の対象は、アミロイド−β−ペプチド−多量体を排除するための本発明による組成物の使用である。これに関して、Ｄ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合する抗体を使用することができる。
【００３９】
本発明による一の変法において、組成物は１０〜１０００μｇの免疫原を含有する。他の一の変法において、組成物は２０〜９００、２５〜７５０、３０〜６００、４０〜５００、５０〜４００、５０〜３００又は５０〜２５０μｇの免疫原を含有する。さらに組成物は１０μｇを下回るか、あるいは、１０００μｇを上回る免疫原を含有することも可能である。
【００４０】
好ましくは、「免疫原」とは、免疫性を導く抗原であると理解される。免疫原は、免疫応答を引き起こす物質である。免疫原は、抗原が抗体により識別され、それにより、いかなる免疫応答でも引き起こすことができるものではない点で、抗原とは異なる。
【００４１】
好ましくは「免疫"Immunitaet"」とは、免疫処理によってもたらされ、かつ特異的抗体及び／又は細胞の出現によって特徴付けられる、抗原（例えばウイルス、細菌又は外来タンパク質）に対して変化した免疫系の反応の準備（Reaktionbereitschaft）であると理解される。
【００４２】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療における本発明による組成物の使用である。したがって、アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するＤ−ペプチドは、アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療のための医薬を製造するのに役立つ。
【００４３】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防のための、Ｄ−ペプチドを含む本発明による組成物の使用であり、この際、このＤ−ペプチドは、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ぺプチド−部分フラグメントに対するレトロインベルソ型配列を含み、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２の配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含み、この際、Ｄ−ペプチドは、配列番号１又は配列番号２を示す配列と一緒に部分的にＬ−アミノ酸を含み、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２に対して相同な配列を含有する。
【００４４】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防又は診断のために、抗体を含有する本発明による組成物の使用であり、この際、この抗体は、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２であるか、あるいはこれらと相同な配列と結合する。
【００４５】
本発明の他の対象は、アルツハイマー氏病の診断のため、バイオマーカーの検出又は定量化のため、あるいは、組織、細胞又は特別な細胞型の認識の際に含まれるバイオマーカーの局在化のための、抗体を含む組成物の使用であり、この際、この抗体は、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する。
【００４６】
これに関して、本発明の意味におけるバイオマーカーの検出又は定量化とは、抗原−抗体反応による基質の測定であると理解される（例えばイムノアッセイ）。
【００４７】
これに関して、本発明の意味における組織又は細胞中であるか、あるいは特別な細胞型の認識の際のバイオマーカーの局在化とは、例えば、組織免疫的又は細胞免疫化学的な抗体の利用であると理解される。
【００４８】
本発明の利点は、これに関して使用されたＤ−ペプチドをＴ−細胞から調製することなしに、治療的抗体応答を誘発することである。
【００４９】
したがって、簡単な方法で、タンパク質凝集性疾患又はタンパク質コンフォメーション障害（Proteinkonformationserkrankungen）に対する免疫ストラテジーを開発することができる方法が見出された。これは、アルツハイマー氏病の治療と関連する一の方法で、この際、アミロイドβ−ペプチドと組み合わされたＤ−ペプチドを用いて免疫し、その個体におけるアミロイドβ−ペプチド−毒性が中和するか、及び／又はアミロイドβ−ペプチドクリアランスをおこなった体液性免疫が達成される。さらに、アルツハイマー氏病とは異なる疾患において、この際、タンパク質の凝集又は多量化が同様に疾患の原因であり、多量化面に結合するＤ−ペプチドを使用する方法を開発することができる（ＺＮＳのタンパク質高次構造障害、糖尿病等）。
【００５０】
好ましくは本発明の「クリアランス（"Clearing""Clearance"又は"clearend"）」とは、器官（例えば腎クリアランス）、細胞性コンパートメント（例えばマクロファージ、マイクログリア）又は亜細胞性コンパートメント（例えばプロテオソーム）の特殊な性能として、組織から特定の外因性又は内因性物質を除去することであると理解される。
【００５１】
本発明の他の利点は、付加的に、アミロイドβ−ペプチドのエピトプラム（エピトープ領域）を除去することであり、これは、基本的に高い自己寛容で体液性免疫応答を制限することができる。アミロイドβ−ペプチド結合Ｄ−ペプチドの本発明による使用の際に、さらにＴ−細胞応答が抑止され、それというのもこのペプチドが分解されず、かつ、及び提示され得ないためである。
【００５２】
さらに本発明の対象は、アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインに対して向けられ、かつアミロイドβ−ペプチドの多量化を阻害する抗体である。したがって、抗体で標識化することによって、アミロイドβ−ペプチド又はこれが一緒になったアミロイドβ−ペプチド−堆積物を生体特有の免疫系によって分解することができる。さらに本発明による抗体は、アミロイドβ−ペプチドに対して共通に向けられるものであり、かつ多量化ドメインに対して特別に向けられるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】９Ａ６抗体及びＩＣ１６抗体を用いてのウエスタンブロットを示す図
【図２】９Ａ６抗体及びＩＣ１６抗体を用いてのウエスタンブロットを示す図
【図３】９Ａ６抗体での免疫組織化学的染色を示す図
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例及び添付図面に基づいて詳細に記載する。
【００５５】
図１は、合成アミロイドβ−ペプチド（１）及びＡＰＰでトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞（３）；無関係のコントロール群（２）のウエスタンブロット図を示す。このウエスタンブロットは、９Ａ６が、ウエスタンブロット上でＡＰＰ又はアミロイドβ−ペプチドを認識しないことを示す（左側）一方、汎用性の抗−アミロイドβ−ペプチド抗体ＩＣ１６がこれを認識できることを示す（右側）。
【００５６】
図２は、アミロイド−β−ペプチドを分泌する、持続的にＡＰＰトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上澄み液からの、ＩＣ１６（右側）及び９Ａ６（右側）の免疫沈降反応のウエスタンブロットを示す。これは、９Ａ６が、アミロイドβ−ペプチドオリゴマーを認識するものと判断される。
【００５７】
図３は、アルツハイマー氏病患者の皮質試料の９Ａ６での免疫組織化学的染色を示す。これは、９Ａ６抗体が、弱いアミロイドβ−ペプチドプラークを認識するものと判断される。
【００５８】
例１（Ｄ３ペプチドを用いてのマウスの免疫化）
マウスは、Ｄ−ペプチドを用いて免疫した。これには、Ｄ３−ペプチド及びアミロイドβ−ペプチドのレトロインベルソ型ペプチドを使用する（ｒｉＡβ１−１６;レトロインベルソ型Ａβ（１−１６））。複数回のブースター注射（補充ワクチン投与、ブースター効果）後に、標準的な方法によってモノクローナル抗体を得るための融合を実施した。モノクローナル抗体を単離することができ、これは、Ｄ３、ｒｉＡβ１−１６及びアミロイドβ−ペプチドと結合する。したがって、前記Ｄ−ペプチドを用いての免疫は、アミロイドβ−ペプチドに対する保護免疫応答を導く。
【００５９】
好ましくは、「ブースター効果（ブースター注射又は補充ワクチン投与によって達成される）」とは、抗体との反復接触による免疫学的副反応又は強化された免疫応答であると理解される。
【００６０】
免疫のために使用されたペプチドは以下の配列を有する：
「Ｄ３」−ペプチド：ｒｐｒｔｒ Ｉｈｔｈｒ ｎｒ（配列番号１）
レトロインベルソ型−Ａβ（１−１６）：ｋｑｈｈｖ ｅｙｇｓｄ ｈｒｆｅａ ｄ（配列番号２）
【００６１】
Ｄ３は、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）と共有結合させ（架橋）、かつ標準的方法でマウスを免疫した。これはその後に、標準的プロトコールによって、マウスミエローマ細胞と融合させた。生じるハイブリドーマ細胞の細胞培養上清を、Ｄ３ペプチド及びアミロイドβ−ペプチドの認識により、標準的なＥＬＩＳＡで試験した。
【００６２】
以下のクローンは、Ｄ３のみを認識する（アミロイドβ−ペプチドではない）：
４Ｇ１１、１３Ｈ１１、３２Ａ１１、４０Ｂ７。
【００６３】
以下のクローンは、Ｄ３のみならずアミロイドβ−ペプチドを認識する：
９Ａ６、１４Ｂ５、３９Ｂ１２。
【００６４】
この試験は以下のことを示す；
１．Ｄ３を用いての免疫は結果として、アミロイドβ−ペプチドに対する抗体応答を生じ、かつ、
２．特定の抗体についての結合部位を提供し、これは、アミロイドβ−ペプチドのみならずさらにＤ３も認識することができる。
【００６５】
抗Ｄ３／抗アミロイドβ−ペプチド抗体９Ａ６の典型的な試験は、図１、図２及び図３に示すアッセイ中で試験した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬として使用するため及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチド又は抗体を含有する組成物において、
ａ）Ｄ−ペプチドが、アミロイドペプチドと相互に作用し、かつ、
ｂ）抗体が、ａ）からのＤ−ペプチド及び付加的にａ）からのアミロイドペプチドと結合することを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
Ｄ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドを含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドは、部分的にＬ−アミノ酸を含有しているか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列と結合し、かつアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
動物又は動物細胞の免疫、動物細胞とミエローマ細胞との融合及び引き続いての抗体産生雑種細胞の選択及び培養によって得られ、かつ抗体を単離及び精製する、請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項５】
アミロイドβ−ペプチド多量体を阻害するための、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項６】
アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療における、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項７】
アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物の使用において、Ｄ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有するＤ−ペプチドが部分的にＬ−アミノ酸を含有しているか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有している、
ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項８】
アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防又は診断のための抗体を含有する請求項１に記載の組成物の使用において、抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項９】
アルツハイマー氏病の診断のため、バイオマーカーの検査又は定量化のため、あるいは、組織中、細胞中又は特別な細胞型を認識する際に含まれるバイオマーカーの局在化のための抗体を含有する、請求項１に記載の組成物の使用において、抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１】
治療薬として使用するため及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチド又は抗体を含有する組成物において、
ａ）Ｄ−ペプチドが、アミロイドペプチドと相互に作用し、かつ、
ｂ）抗体が、ａ）からのＤ−ペプチド及び付加的にａ）からのアミロイドペプチドと結合することを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
Ｄ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドを含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を有するＤ−ペプチドは、部分的にＬ−アミノ酸を含有しているか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列と結合し、かつアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
動物又は動物細胞の免疫、動物細胞とミエローマ細胞との融合及び引き続いての抗体産生雑種細胞の選択及び培養によって得られ、かつ抗体を単離及び精製する、請求項１に記載の組成物を製造する方法。
【請求項５】
アミロイドβ−ペプチド多量体を阻害するための、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項６】
アルツハイマー氏病の予防及び／又は治療における、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項７】
アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防のためのＤ−ペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物の使用において、Ｄ−ペプチドが、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチド多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から構成されているか、及び／又は
ｄ）配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有し、その際、配列番号１又は配列番号２を示す配列を含有するＤ−ペプチドが部分的にＬ−アミノ酸を含有しているか、及び／又は
ｅ）配列番号１又は配列番号２と相同な配列を含有している、
ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項８】
アルツハイマー氏病の治療薬として及び／又は疾病予防又は診断のための抗体を含有する請求項１に記載の組成物の使用において、抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項９】
アルツハイマー氏病の診断のため、バイオマーカーの検査又は定量化のため、あるいは、組織中、細胞中又は特別な細胞型を認識する際に含まれるバイオマーカーの局在化のための抗体を含有する、請求項１に記載の組成物の使用において、抗体が、
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分フラグメントのレトロインベルソ型配列と結合し、かつさらにアミロイドβ−ペプチドと結合するか、及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量化ドメインと結合するか、及び／又は
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示す配列であるか、あるいはこれらと相同な配列及びさらにアミロイドβ−ペプチドと結合する、請求項１に記載の組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５０９２９５（Ｐ２０１２−５０９２９５Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６８４３（Ｐ２０１１−５３６８４３）
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５３０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７８８２
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｊｕｅｌｉｃｈ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｗｉｌｈｅｌｍ−Ｊｏｈｎｅｎ−Ｓｔｒａｓｓｅ， Ｄ−５２４２８ Ｊｕｅｌｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１７日（２００９．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５３０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７８８２
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｊｕｅｌｉｃｈ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｗｉｌｈｅｌｍ−Ｊｏｈｎｅｎ−Ｓｔｒａｓｓｅ， Ｄ−５２４２８ Ｊｕｅｌｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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