ＤＮＡメチル化測定方法

【課題】生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供する。
【解決手段】生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する第一工程、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチド、を混合することによりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記のオリゴヌクレオチドとの複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する第二工程等を有するメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法等を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する第一工程、
（２）(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチド、を混合することによりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記のオリゴヌクレオチドとの複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する第二工程、及び、
（３）分離された複合体に含まれる前記のメチル化ＤＮＡ抗体、又は、前記のオリゴヌクレオチドを、当該メチル化ＤＮＡ抗体又は当該オリゴヌクレオチドが有する検出に利用し得る識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、生物由来検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第二工程で混合される、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとして、２種類以上のオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
第二工程で形成される複合体、又は、第二工程の複合体を形成させる過程において生じる第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとの結合体、を二価陽イオンを含有する反応系中で形成させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に結合させる工程を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項６】
第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれる前記のオリゴヌクレオチドを支持体に結合させる工程を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項７】
第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項８】
第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、及び、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素の認識配列をその一部として有するマスキング用オリゴヌクレオチド、を混合する工程、及び、(ii)前工程により得られた混合物（の中に存在する目的とするＤＮＡ領域においてＤＮＡがメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ）を前記のメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１２】
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１３】
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１４】
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１５】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１４のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１６】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１７】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、特定マスキング用オリゴヌクレオチドを添加した後に、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項２０】
ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が認識する切断部位を有するＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項２１】
第一工程でゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜２０のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項２２】
第一工程におけるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からの一本鎖ＤＮＡの取得が、二価陽イオンあるいはマグネシウムイオンを含有する反応系中で行われる請求項１〜２０のいずれかの請求項記載の方法。

【図１】