ＤＮＡ配列の検出方法
【課題】 生体由来の検体に対して信頼性高く且つ高速に検体のＤＮＡを識別できるＤＮＡ配列の検出方法を提供すること。
【解決手段】 リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及びＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、（ｃ）検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、（ｄ）ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、を含むＤＮＡ配列の検出方法。
【解決手段】 リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及びＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、（ｃ）検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、（ｄ）ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、を含むＤＮＡ配列の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来検体中のＤＮＡ鎖の検出を行なうＤＮＡ配列の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サルモネラ菌等の細菌の検出・同定は、細菌を培養することで細菌を増殖させ、糖の資化性検査等の生化学検査を行なうことにより主として行なわれている。例えば、サルモネラ菌の検出・同定 には増菌、分離培養、生化学性状による確認培養、Ｏ（菌体）抗原、Ｋ(Ｖｉ莢膜)抗原、Ｈ（鞭毛）抗原による血清型別が行なわれ、各検査の総合的判断が必要とされている。しかしながら、この方法は時間と手間が掛かる上に、例外的な性状が判断を困難にする場合等があった。資化性検査用の簡便なキットも市販され広く用いられてきているが、通常１検体につき１キットが必要であり、かつ使い捨てであるため、大量の検体の検査を行なうと膨大な医療廃棄物が発生してしまうという問題も残されていた。
【０００３】
また、細菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ法）により特定のＤＮＡ 断片の増幅の有無から細菌種を特定する方法が開発されている。しかしながら、微生物の多様性によりプライマーの伸長反応部分に変異が起こると、偽陰性の危険性を含んでいた。ＰＣＲは数百万モノＤＮＡコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型ＤＮＡから反応を開始する場合、前に行なった反応の生成物（生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、ＰＣＲ等の核酸増幅を用いる場合には、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であるという問題も持ち合わせていた。
【０００４】
一方、最近、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップとよばれる、配列の異なる多数のＤＮＡ断片を基板のそれぞれ異なる箇所に固定したものに、遺伝子の発現状態を調べたい細胞から取り出したメッセンジャーＲＮＡの逆転写物（蛍光標識あるいはラジオアイソトープ標識をしたもの）をふりかけ、ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの配列のＤＮＡ断片固定箇所にどの程度逆転写物がハイブリダイズしたかを調べ、試料細胞中の遺伝子発現を調べる方法が注目されている。この方法を利用して、細菌種特有なメッセンジャーＲＮＡを検出することで、細菌検体の細菌種を識別する方法も開発されてきている。しかし、細菌の場合には、通常アレイの解析に必要な１０マイクログラム以上の十分なRNAが取れないことから実用的には大いに問題が残されている。また、逆転写反応には高価な逆転写酵素が必要であることから低コスト化が困難であるという問題もある。
また、特定の細菌種に特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを、複数種類の細菌種に対して１枚のスライドガラス上に固定してアレイを作製しておき、細菌検体のゲノムＤＮＡ の特定の塩基配列部位をＰＣＲ法を用いて増幅し、増幅と同時にあるいは増幅後に常法により標識化したcＤＮＡ をアレイにかけてハイブリダイゼーションさせ、アレイ上に結合した標識を検出することで、細菌種を同定する方法も提案されている。この方法では、ＰＣＲ法を用いるため高価な酵素が不可欠であり、低コスト化が難しい。また、１検体の検査に１アレイ必要であるため、アレイ作製費用、ハイブリダイゼーションに必要な試薬費用、検出にかかわる費用等を勘案すると非常にコストが高くなってしまうという問題があった。
【０００５】
非特許文献１には、ガラス基板の表面に細菌由来の２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖を増幅するプライマーＤＮＡを固定化し、２３ＳリボゾームＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ様環境化でプライマーを伸長させ、細菌の検出を行なう方法が記載されている。この方法は、遺伝子の増幅とＤＮＡマイクロアレイによる検出を同時に行なうのに近い操作となっており、操作の簡便化が図れかつ、迅速に菌の検出が出来ることが期待できるが、実際には感度が悪く、予めＰＣＲによりかなり増幅した検体溶液を基板表面に供給し、基板上でのＤＮＡ伸長反応を行なう必要がある。
【０００６】
また特許文献１には、基板表面に所定の高分子物質を配した基板を用いると、再現性よくプライマーが伸長し菌の検出感度が向上できることが記載されている。しかしながら、この例でも実際には予めＰＣＲにより増幅した検体溶液を用意し、基板上でのＤＮＡ伸長反応を行なう必要がある。
【非特許文献１】Georg Mitterer, et al, "Microarray-Based Identification in Clinical Samples by Solid-Phase PCR Amplification of 23S Ribosomal DNA Sequences of poly", Journal of Clinical Microbiology, 2004, Vol. 42, No.3 p1048-1057
【特許文献１】特願２００５−２１４５０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生体由来の検体に対して信頼性高く且つ高速に検体のＤＮＡを識別できるＤＮＡ配列の検出方法を提供することにある。また、ＤＮＡアレイのように数多くの検体について、検出を並列的に行なうことにより、非常に高速かつ低コストで検体の同定を行なうことが可能なＤＮＡ配列同定方法を提供することを目的になされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
（１）リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、
（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＰＣＲ用プライマーが検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、
（ｄ）（ｃ）の工程で増幅された検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、基体表面に固定化されているＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（２）（１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
生体サンプル由来ＤＮＡ鎖が、細菌の１６Ｓ又は２３ＳリボゾームＤＮＡであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（３）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記（ｃ）および（ｄ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより、同時に行なわれることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（４）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（５）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（６）（１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（７）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（８）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＰＣＲ用プライマーが、前記記載の高分子物質と共有結合していないことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（９）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１０）（１）又（９）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１１）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１２）（１）又は（１１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
（ａ）の工程を経た基体を、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れて、前記チューブ内で（ｂ）〜（ｄ）の工程を行ななうことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１３）（３）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１４）（３）又は（１３）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１５）（１３）又は（１４）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１６）（５）記載のＤＮＡ配列の検出方法において
標識が蛍光色素であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１７）（５）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
更に(ｅ)ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【０００９】
本発明に係るＤＮＡ配列の検出方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、ＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡ鎖を固定化させ、所望するＤＮＡ断片鎖を鋳型にして、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、ＰＣＲ用プライマー、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された液相系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、ＤＮＡ伸長温度を保つことにより、鋳型ＤＮＡ鎖を増幅し、基体上に固定化されたＤＮＡ鎖の伸長反応を行ない、かつ全処理を同一の液相系で行なうことを特徴としている。
【００１０】
また、基体をＰＣＲ用マイクロチューブに入れられる構造とし、基体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡ鎖を固定化し（マイクロチップ）、前記記載の反応をＰＣＲ用マイクロチューブ内で行なうことを特徴としている。
【００１１】
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基体上に非特異的に吸着するＤＮＡ鎖がないこと、およびＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効機能すると考えられ、伸長反応の前に基体の洗浄処理が不要になる。
【００１２】
このＤＮＡ鎖伸長方法において、基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基体の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基体表面で起こるＤＮＡ鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行なうことが可能になり、酵素反応効率が高く、ＤＮＡ鎖伸長を、よりマイルドな条件でより高効率に行なうことが可能になる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、基体上にプライマーＤＮＡ鎖を固定化し、液相中のＰＣＲ用プライマーによる鋳型ＤＮＡ鎖の増幅させ、プライマーＤＮＡ鎖の伸長反応によりＤＮＡ配列を検出する方法であって、予めＰＣＲによる遺伝子の増幅をする必要がなく、高感度にＤＮＡ配列の検出が可能となる。また、ＰＣＲ用マイクロチューブ内ですべての反応が行なえるため、反応操作も簡略化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明に使用される基体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１５】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基体の表面に固定化される。
【００１６】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１７】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基体表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１８】
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリンを下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
【００１９】
【化１】
【００２０】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００２１】
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００２２】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２３】
【化２】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００２４】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２５】
【化３】
【００２６】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２７】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２８】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化４】
【００２９】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００３０】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００３１】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３２】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３３】
表面にプライマーが固定化される基体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３４】
また、本実施形態の基体のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３５】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３６】
【化５】
【００３７】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３８】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基体上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基体上に導入することができる。
【００３９】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行なうことができる。
【００４０】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００４１】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４２】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行なうことができる。
【００４３】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４４】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４５】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４６】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４７】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４８】
また、基体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４９】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基体の材料として好ましく用いられる。
【００５０】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００５１】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５２】
なお、基体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基体を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基体は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５３】
また、プラスチック基体の形状を、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れることができる構造、サイズにすることもできる。この場合、本発明による反応工程をＰＣＲ用マイクロチューブ内ですべて行なうことができる。このようなプラスチック基体としては、たとえば、幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍの平板状のものを用いることができる。
【００５４】
本発明における (ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程は、例えば、（ｉ）基体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーＤＮＡ鎖とを反応させて共有結合を形成させることにより、基体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを基体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５５】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーＤＮＡ鎖を基体上に固定化する際には、プライマーＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００５６】
このプライマーＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００５７】
また、点着後、基体表面に固定化されなかったプライマーＤＮＡ鎖を除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５８】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーＤＮＡ鎖を固定化した以外のプラスチック基体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行なう。
【００５９】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００６０】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００６１】
また、基体に固定化するプライマーＤＮＡ鎖には、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーＤＮＡ鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行なうことができるという観点からは、好ましい。
【００６２】
以上により、プライマーＤＮＡ鎖が表面に固定化された基体が得られる。
【００６３】
本発明における（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程では、例えば、上記のように作製された基体をＰＣＲ用マイクロチューブに入れ、チューブ内に生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖である鋳型ＤＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、鋳型ＤＮＡ断片に特異的配列のＰＣＲ用プライマー、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入する。
【００６４】
この導入された試料からなる反応系としては、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するバッファを用いることができる。
【００６５】
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性ＤＮＡ配列に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることもできる。
【００６６】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行なうことができるようになる。
【００６７】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００６８】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したり、アルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
【００６９】
試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００７０】
続いて、反応系の温度を鋳型ＤＮＡ断片とＰＣＲ用プライマーとがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するＰＣＲ用プライマーと、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行なわずにそのままＤＮＡ増幅反応に進める。
【００７１】
前記熱変性とアニールの熱サイクルを少なくとも１回以上行なうことにより、鋳型ＤＮＡ断片が増幅される。
【００７２】
増幅されたＤＮＡ断片はさらなる熱サイクルにより、さらなるＰＣＲ反応による増幅を受けるが、一部のＤＮＡ断片は固定化されたプライマー鎖と二本鎖となり、ＤＮＡ伸長反応を受ける。
【００７３】
ここでは、鋳型ＤＮＡ断片に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた例を示したが、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。
【００７４】
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いてもＤＮＡ鎖伸長反応を行なうことができるため、ＤＮＡ鎖増幅を行なうことが可能である。
【００７５】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍの基体上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーＤＮＡ鎖を固定化したＤＮＡマイクロアレイを用いることが好ましい。
【００７６】
また、基体の表面に固定化させるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖の長さを検出対象に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００７７】
ＤＮＡ伸長反応の後に、反応液を除去して、上記記載のＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００７８】
以下に、本発明の実施形態の一つである菌の検出方法の流れについて記載する。
【００７９】
基体表面へ固定化するプライマーＤＮＡの選択は、１６Ｓあるいは２３ＳリボゾームＤＮＡ配列から、各菌種特異的な配列をもとに設計する、プライマーＤＮＡの長さは、２０〜３０塩基がＤＮＡの伸長反応のし易さから好適である。
【００８０】
設計されたプライマーＤＮＡ鎖は末端にアミノ修飾がなされ、基体表面の活性エステル基と反応し基体上への強固に固定化される。
【００８１】
反応溶液中に加えるＰＣＲ用プライマーの選択は、１６Ｓあるいは２３ＳリボゾームＤＮＡ配列から、各菌種特異的な配列をもとに設計する。プライマーのＴｍは、上記基体表面へ固定化するプライマーとＴｍと合わせることが好ましく、±２℃にすることがより好ましい。
【００８２】
本発明を用いた、菌の検出方法の例を、水中に存在する菌の検出の場合を例に記載する。ただし本記載例に限定したものではない。
【００８３】
検体中の菌数が非常に少ないと思われる場合、寒天培地上にサンプルを注ぎ、培養を行ない、菌のコロニーが出現するまで培養を行なう。コロニーが出現したら、菌のコロニーを採取し、菌をＰＢＳ（−）等中に分散させる。菌の分散液中に市販のＤＮＡ抽出溶液等によりＤＮＡを抽出する。現在はＤＮＡ抽出用のキットが多数販売されており、これら抽出キットを用いるのが、簡便かつ確実と思われる。
【００８４】
次に、前記工程で抽出したＤＮＡ、伸長用プライマーＤＮＡ鎖が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ（ミニチップ：幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍ）、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長酵素、およびＰＣＲ用プライマーを、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れ、ＰＣＲ装置にセットし所定のヒートサイクルにより加熱を行ないＤＮＡ鎖の増幅・伸長反応を行なう。
【００８５】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、Ｃｙ３などの蛍光色素を標識しておけば、蛍光スキャナーによりスポットの確認が可能である。
【００８６】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、ビオチン標識をしておき、ＤＮＡ伸長反応の後、アルカリホスファターゼを標識したアビジンを反応させることにより、伸長したＤＮＡにアルカリフォスファターゼ標識が行なえ、さらにその後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴなどの発色試薬を作用させることにより、ＤＮＡが伸長したスポットの可視化が可能となる。可視化されたスポットは、目視での認識が可能である他、デジカメやＯＡスキャナーで画像を認識し、画像処理ソフトなどを使ってスポットの強度の解析も可能となる。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例を記載する。
【００８８】
（実験例１）
以下の手法にて、各菌特異２３ＳリボゾームＤＮＡ配列よりなるプライマーＤＮＡ鎖を、本実施形態に対応するプラスチックおよびガラス基体、および従来の基体に対応するアルデヒド基体の各基体の表面に固定化して、各基体上でＤＮＡ鎖増幅反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖増幅反応を検出し、菌の検出能の評価を行った。
【００８９】
（プラスチック基体の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００９０】
（ガラス基板の製造）
通常のガラス基板を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、ガラス基板を得た。
【００９１】
（アルデヒド基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス形状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板が得られた。
【００９２】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌特異２３ＳリボゾームＤＮＡ配列よりなるオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、５００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板およびガラス基板、およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜浸して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
各菌種の２３ＳリボゾームＤＮＡ検出プライマーＤＮＡ鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：CTAAGGGCGTTGAAGCATGATCGTA（配列番号１） ＳＡ−１
AGTAGGATAGGCGAAGCGTGCGATT（配列番号２） ＳＡ−２
大腸菌： CCCGGTTTAAGCGTGTAGGCTGGT（配列番号３） ＥＣＯ−１
AGTCGCTTCACCTACATATCAGCGTGC（配列番号４）ＥＣＯ−２
CTGATATGTAGGTGAAGCGACTTGCTCG（配列番号５） ＥＣＯ−４
緑濃菌： GTTAATCGACGCAGGGTTAGTCGGTT（配列番号６） ＰＡ−１
サルモネラ菌： TGTGTGTTCCAGGTAAATCCGGTTC（配列番号７） ＳＡＬ−１
ポジティブコントロール：GACAGCCAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGC（配列番号８）ＰＯＳ
【００９３】
（菌の培養）
以下に掲げる菌株の培養を行った。
使用した菌株名
黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus ATCC 25923
大腸菌：Escherichia coli ATCC 25922
緑膿菌：Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
サルモネラ菌：
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis IID 604
寒天培地を用い、37℃、一昼夜(14-18時間)行なった。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに1.6%の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００９４】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
【００９５】
（基板上でのＤＮＡの増幅反応、伸長反応）
ＰＣＲバッファー２５μＬ中に、上記ＤＮＡ抽出液を２μｌ、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙｅ３標識ｄＵＴＰを各２．５μＬ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）、１００μＭの下記ＰＣＲ用プライマーを各０．５μＬ溶解させ試料溶液とした。
ＰＣＲ用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス ：５‘−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ（配列番号８）
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ（配列番号９）
５‘−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ（配列番号１０）
【００９６】
この試料溶液および、幅２ｍｍ、長さ１５ｍｍ、厚み１ｍｍの基板（ミニチップ）をＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れ蓋をして、ＰＣＲサーモサイクラーにセットし、熱変性処理、アニール処理、増幅反応・伸長反応をそれぞれ９５℃５分（熱変性）、５５℃３分(アニールと増幅・伸長反応は同一温度)、サイクル数は１５回でＤＮＡ鎖増幅・伸長反応を行なった。
【００９７】
ＤＮＡの増幅・伸長反応の後、基板を０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了した。
スライド用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙパーキンエルマー社製）によりスポットの蛍光強度を測定した。
各々の菌から抽出したＤＮＡ溶液について、基板上に固定した上記プライマー各々のスポットの蛍光強度について、各基板での比較をおこなった。スポットの蛍光強度の比較を表１〜表３に示す。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
本実施形態に対応するプラスチック基板およびガラス基板では、基板上でのＤＮＡ鎖伸長増幅により、各々の菌の検出ができ、従来の基板であるアルデヒド基板ではＤＮＡ鎖伸長せず菌由来のスポットは検出されていないと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来検体中のＤＮＡ鎖の検出を行なうＤＮＡ配列の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サルモネラ菌等の細菌の検出・同定は、細菌を培養することで細菌を増殖させ、糖の資化性検査等の生化学検査を行なうことにより主として行なわれている。例えば、サルモネラ菌の検出・同定 には増菌、分離培養、生化学性状による確認培養、Ｏ（菌体）抗原、Ｋ(Ｖｉ莢膜)抗原、Ｈ（鞭毛）抗原による血清型別が行なわれ、各検査の総合的判断が必要とされている。しかしながら、この方法は時間と手間が掛かる上に、例外的な性状が判断を困難にする場合等があった。資化性検査用の簡便なキットも市販され広く用いられてきているが、通常１検体につき１キットが必要であり、かつ使い捨てであるため、大量の検体の検査を行なうと膨大な医療廃棄物が発生してしまうという問題も残されていた。
【０００３】
また、細菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ法）により特定のＤＮＡ 断片の増幅の有無から細菌種を特定する方法が開発されている。しかしながら、微生物の多様性によりプライマーの伸長反応部分に変異が起こると、偽陰性の危険性を含んでいた。ＰＣＲは数百万モノＤＮＡコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型ＤＮＡから反応を開始する場合、前に行なった反応の生成物（生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、ＰＣＲ等の核酸増幅を用いる場合には、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であるという問題も持ち合わせていた。
【０００４】
一方、最近、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップとよばれる、配列の異なる多数のＤＮＡ断片を基板のそれぞれ異なる箇所に固定したものに、遺伝子の発現状態を調べたい細胞から取り出したメッセンジャーＲＮＡの逆転写物（蛍光標識あるいはラジオアイソトープ標識をしたもの）をふりかけ、ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの配列のＤＮＡ断片固定箇所にどの程度逆転写物がハイブリダイズしたかを調べ、試料細胞中の遺伝子発現を調べる方法が注目されている。この方法を利用して、細菌種特有なメッセンジャーＲＮＡを検出することで、細菌検体の細菌種を識別する方法も開発されてきている。しかし、細菌の場合には、通常アレイの解析に必要な１０マイクログラム以上の十分なRNAが取れないことから実用的には大いに問題が残されている。また、逆転写反応には高価な逆転写酵素が必要であることから低コスト化が困難であるという問題もある。
また、特定の細菌種に特異的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを、複数種類の細菌種に対して１枚のスライドガラス上に固定してアレイを作製しておき、細菌検体のゲノムＤＮＡ の特定の塩基配列部位をＰＣＲ法を用いて増幅し、増幅と同時にあるいは増幅後に常法により標識化したcＤＮＡ をアレイにかけてハイブリダイゼーションさせ、アレイ上に結合した標識を検出することで、細菌種を同定する方法も提案されている。この方法では、ＰＣＲ法を用いるため高価な酵素が不可欠であり、低コスト化が難しい。また、１検体の検査に１アレイ必要であるため、アレイ作製費用、ハイブリダイゼーションに必要な試薬費用、検出にかかわる費用等を勘案すると非常にコストが高くなってしまうという問題があった。
【０００５】
非特許文献１には、ガラス基板の表面に細菌由来の２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖を増幅するプライマーＤＮＡを固定化し、２３ＳリボゾームＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ様環境化でプライマーを伸長させ、細菌の検出を行なう方法が記載されている。この方法は、遺伝子の増幅とＤＮＡマイクロアレイによる検出を同時に行なうのに近い操作となっており、操作の簡便化が図れかつ、迅速に菌の検出が出来ることが期待できるが、実際には感度が悪く、予めＰＣＲによりかなり増幅した検体溶液を基板表面に供給し、基板上でのＤＮＡ伸長反応を行なう必要がある。
【０００６】
また特許文献１には、基板表面に所定の高分子物質を配した基板を用いると、再現性よくプライマーが伸長し菌の検出感度が向上できることが記載されている。しかしながら、この例でも実際には予めＰＣＲにより増幅した検体溶液を用意し、基板上でのＤＮＡ伸長反応を行なう必要がある。
【非特許文献１】Georg Mitterer, et al, "Microarray-Based Identification in Clinical Samples by Solid-Phase PCR Amplification of 23S Ribosomal DNA Sequences of poly", Journal of Clinical Microbiology, 2004, Vol. 42, No.3 p1048-1057
【特許文献１】特願２００５−２１４５０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生体由来の検体に対して信頼性高く且つ高速に検体のＤＮＡを識別できるＤＮＡ配列の検出方法を提供することにある。また、ＤＮＡアレイのように数多くの検体について、検出を並列的に行なうことにより、非常に高速かつ低コストで検体の同定を行なうことが可能なＤＮＡ配列同定方法を提供することを目的になされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
（１）リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、
（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＰＣＲ用プライマーが検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、
（ｄ）（ｃ）の工程で増幅された検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、基体表面に固定化されているＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（２）（１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
生体サンプル由来ＤＮＡ鎖が、細菌の１６Ｓ又は２３ＳリボゾームＤＮＡであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（３）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記（ｃ）および（ｄ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより、同時に行なわれることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（４）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（５）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（６）（１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（７）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（８）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＰＣＲ用プライマーが、前記記載の高分子物質と共有結合していないことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（９）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１０）（１）又（９）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１１）（１）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１２）（１）又は（１１）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
（ａ）の工程を経た基体を、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れて、前記チューブ内で（ｂ）〜（ｄ）の工程を行ななうことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１３）（３）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１４）（３）又は（１３）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１５）（１３）又は（１４）に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１６）（５）記載のＤＮＡ配列の検出方法において
標識が蛍光色素であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
（１７）（５）記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
更に(ｅ)ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【０００９】
本発明に係るＤＮＡ配列の検出方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、ＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡ鎖を固定化させ、所望するＤＮＡ断片鎖を鋳型にして、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、ＰＣＲ用プライマー、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された液相系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、ＤＮＡ伸長温度を保つことにより、鋳型ＤＮＡ鎖を増幅し、基体上に固定化されたＤＮＡ鎖の伸長反応を行ない、かつ全処理を同一の液相系で行なうことを特徴としている。
【００１０】
また、基体をＰＣＲ用マイクロチューブに入れられる構造とし、基体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡ鎖を固定化し（マイクロチップ）、前記記載の反応をＰＣＲ用マイクロチューブ内で行なうことを特徴としている。
【００１１】
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基体上に非特異的に吸着するＤＮＡ鎖がないこと、およびＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効機能すると考えられ、伸長反応の前に基体の洗浄処理が不要になる。
【００１２】
このＤＮＡ鎖伸長方法において、基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基体の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基体表面で起こるＤＮＡ鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行なうことが可能になり、酵素反応効率が高く、ＤＮＡ鎖伸長を、よりマイルドな条件でより高効率に行なうことが可能になる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、基体上にプライマーＤＮＡ鎖を固定化し、液相中のＰＣＲ用プライマーによる鋳型ＤＮＡ鎖の増幅させ、プライマーＤＮＡ鎖の伸長反応によりＤＮＡ配列を検出する方法であって、予めＰＣＲによる遺伝子の増幅をする必要がなく、高感度にＤＮＡ配列の検出が可能となる。また、ＰＣＲ用マイクロチューブ内ですべての反応が行なえるため、反応操作も簡略化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明に使用される基体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１５】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基体の表面に固定化される。
【００１６】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１７】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基体表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１８】
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリンを下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
【００１９】
【化１】
【００２０】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００２１】
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００２２】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２３】
【化２】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００２４】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２５】
【化３】
【００２６】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２７】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２８】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化４】
【００２９】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００３０】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００３１】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３２】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３３】
表面にプライマーが固定化される基体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３４】
また、本実施形態の基体のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３５】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３６】
【化５】
【００３７】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３８】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基体上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基体上に導入することができる。
【００３９】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行なうことができる。
【００４０】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００４１】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４２】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行なうことができる。
【００４３】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４４】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４５】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４６】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４７】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４８】
また、基体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４９】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基体の材料として好ましく用いられる。
【００５０】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００５１】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５２】
なお、基体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基体を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基体は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５３】
また、プラスチック基体の形状を、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れることができる構造、サイズにすることもできる。この場合、本発明による反応工程をＰＣＲ用マイクロチューブ内ですべて行なうことができる。このようなプラスチック基体としては、たとえば、幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍの平板状のものを用いることができる。
【００５４】
本発明における (ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程は、例えば、（ｉ）基体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーＤＮＡ鎖とを反応させて共有結合を形成させることにより、基体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを基体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５５】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーＤＮＡ鎖を基体上に固定化する際には、プライマーＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００５６】
このプライマーＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００５７】
また、点着後、基体表面に固定化されなかったプライマーＤＮＡ鎖を除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５８】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーＤＮＡ鎖を固定化した以外のプラスチック基体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行なう。
【００５９】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００６０】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００６１】
また、基体に固定化するプライマーＤＮＡ鎖には、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーＤＮＡ鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行なうことができるという観点からは、好ましい。
【００６２】
以上により、プライマーＤＮＡ鎖が表面に固定化された基体が得られる。
【００６３】
本発明における（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程では、例えば、上記のように作製された基体をＰＣＲ用マイクロチューブに入れ、チューブ内に生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖である鋳型ＤＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、鋳型ＤＮＡ断片に特異的配列のＰＣＲ用プライマー、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入する。
【００６４】
この導入された試料からなる反応系としては、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するバッファを用いることができる。
【００６５】
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性ＤＮＡ配列に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることもできる。
【００６６】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行なうことができるようになる。
【００６７】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００６８】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したり、アルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
【００６９】
試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００７０】
続いて、反応系の温度を鋳型ＤＮＡ断片とＰＣＲ用プライマーとがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するＰＣＲ用プライマーと、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行なわずにそのままＤＮＡ増幅反応に進める。
【００７１】
前記熱変性とアニールの熱サイクルを少なくとも１回以上行なうことにより、鋳型ＤＮＡ断片が増幅される。
【００７２】
増幅されたＤＮＡ断片はさらなる熱サイクルにより、さらなるＰＣＲ反応による増幅を受けるが、一部のＤＮＡ断片は固定化されたプライマー鎖と二本鎖となり、ＤＮＡ伸長反応を受ける。
【００７３】
ここでは、鋳型ＤＮＡ断片に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた例を示したが、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。
【００７４】
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いてもＤＮＡ鎖伸長反応を行なうことができるため、ＤＮＡ鎖増幅を行なうことが可能である。
【００７５】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍの基体上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーＤＮＡ鎖を固定化したＤＮＡマイクロアレイを用いることが好ましい。
【００７６】
また、基体の表面に固定化させるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖の長さを検出対象に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００７７】
ＤＮＡ伸長反応の後に、反応液を除去して、上記記載のＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００７８】
以下に、本発明の実施形態の一つである菌の検出方法の流れについて記載する。
【００７９】
基体表面へ固定化するプライマーＤＮＡの選択は、１６Ｓあるいは２３ＳリボゾームＤＮＡ配列から、各菌種特異的な配列をもとに設計する、プライマーＤＮＡの長さは、２０〜３０塩基がＤＮＡの伸長反応のし易さから好適である。
【００８０】
設計されたプライマーＤＮＡ鎖は末端にアミノ修飾がなされ、基体表面の活性エステル基と反応し基体上への強固に固定化される。
【００８１】
反応溶液中に加えるＰＣＲ用プライマーの選択は、１６Ｓあるいは２３ＳリボゾームＤＮＡ配列から、各菌種特異的な配列をもとに設計する。プライマーのＴｍは、上記基体表面へ固定化するプライマーとＴｍと合わせることが好ましく、±２℃にすることがより好ましい。
【００８２】
本発明を用いた、菌の検出方法の例を、水中に存在する菌の検出の場合を例に記載する。ただし本記載例に限定したものではない。
【００８３】
検体中の菌数が非常に少ないと思われる場合、寒天培地上にサンプルを注ぎ、培養を行ない、菌のコロニーが出現するまで培養を行なう。コロニーが出現したら、菌のコロニーを採取し、菌をＰＢＳ（−）等中に分散させる。菌の分散液中に市販のＤＮＡ抽出溶液等によりＤＮＡを抽出する。現在はＤＮＡ抽出用のキットが多数販売されており、これら抽出キットを用いるのが、簡便かつ確実と思われる。
【００８４】
次に、前記工程で抽出したＤＮＡ、伸長用プライマーＤＮＡ鎖が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ（ミニチップ：幅１〜３ｍｍ、長さ１０〜２０ｍｍ、厚み０．５〜２ｍｍ）、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長酵素、およびＰＣＲ用プライマーを、ＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れ、ＰＣＲ装置にセットし所定のヒートサイクルにより加熱を行ないＤＮＡ鎖の増幅・伸長反応を行なう。
【００８５】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、Ｃｙ３などの蛍光色素を標識しておけば、蛍光スキャナーによりスポットの確認が可能である。
【００８６】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、ビオチン標識をしておき、ＤＮＡ伸長反応の後、アルカリホスファターゼを標識したアビジンを反応させることにより、伸長したＤＮＡにアルカリフォスファターゼ標識が行なえ、さらにその後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴなどの発色試薬を作用させることにより、ＤＮＡが伸長したスポットの可視化が可能となる。可視化されたスポットは、目視での認識が可能である他、デジカメやＯＡスキャナーで画像を認識し、画像処理ソフトなどを使ってスポットの強度の解析も可能となる。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例を記載する。
【００８８】
（実験例１）
以下の手法にて、各菌特異２３ＳリボゾームＤＮＡ配列よりなるプライマーＤＮＡ鎖を、本実施形態に対応するプラスチックおよびガラス基体、および従来の基体に対応するアルデヒド基体の各基体の表面に固定化して、各基体上でＤＮＡ鎖増幅反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖増幅反応を検出し、菌の検出能の評価を行った。
【００８９】
（プラスチック基体の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００９０】
（ガラス基板の製造）
通常のガラス基板を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、ガラス基板を得た。
【００９１】
（アルデヒド基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス形状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板が得られた。
【００９２】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌特異２３ＳリボゾームＤＮＡ配列よりなるオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、５００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板およびガラス基板、およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜浸して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
各菌種の２３ＳリボゾームＤＮＡ検出プライマーＤＮＡ鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：CTAAGGGCGTTGAAGCATGATCGTA（配列番号１） ＳＡ−１
AGTAGGATAGGCGAAGCGTGCGATT（配列番号２） ＳＡ−２
大腸菌： CCCGGTTTAAGCGTGTAGGCTGGT（配列番号３） ＥＣＯ−１
AGTCGCTTCACCTACATATCAGCGTGC（配列番号４）ＥＣＯ−２
CTGATATGTAGGTGAAGCGACTTGCTCG（配列番号５） ＥＣＯ−４
緑濃菌： GTTAATCGACGCAGGGTTAGTCGGTT（配列番号６） ＰＡ−１
サルモネラ菌： TGTGTGTTCCAGGTAAATCCGGTTC（配列番号７） ＳＡＬ−１
ポジティブコントロール：GACAGCCAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGC（配列番号８）ＰＯＳ
【００９３】
（菌の培養）
以下に掲げる菌株の培養を行った。
使用した菌株名
黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus ATCC 25923
大腸菌：Escherichia coli ATCC 25922
緑膿菌：Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
サルモネラ菌：
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis IID 604
寒天培地を用い、37℃、一昼夜(14-18時間)行なった。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに1.6%の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００９４】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
【００９５】
（基板上でのＤＮＡの増幅反応、伸長反応）
ＰＣＲバッファー２５μＬ中に、上記ＤＮＡ抽出液を２μｌ、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙｅ３標識ｄＵＴＰを各２．５μＬ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）、１００μＭの下記ＰＣＲ用プライマーを各０．５μＬ溶解させ試料溶液とした。
ＰＣＲ用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス ：５‘−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ（配列番号８）
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ（配列番号９）
５‘−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ（配列番号１０）
【００９６】
この試料溶液および、幅２ｍｍ、長さ１５ｍｍ、厚み１ｍｍの基板（ミニチップ）をＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れ蓋をして、ＰＣＲサーモサイクラーにセットし、熱変性処理、アニール処理、増幅反応・伸長反応をそれぞれ９５℃５分（熱変性）、５５℃３分(アニールと増幅・伸長反応は同一温度)、サイクル数は１５回でＤＮＡ鎖増幅・伸長反応を行なった。
【００９７】
ＤＮＡの増幅・伸長反応の後、基板を０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了した。
スライド用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙパーキンエルマー社製）によりスポットの蛍光強度を測定した。
各々の菌から抽出したＤＮＡ溶液について、基板上に固定した上記プライマー各々のスポットの蛍光強度について、各基板での比較をおこなった。スポットの蛍光強度の比較を表１〜表３に示す。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
本実施形態に対応するプラスチック基板およびガラス基板では、基板上でのＤＮＡ鎖伸長増幅により、各々の菌の検出ができ、従来の基板であるアルデヒド基板ではＤＮＡ鎖伸長せず菌由来のスポットは検出されていないと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、
（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＰＣＲ用プライマーが検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、
（ｄ）（ｃ）の工程で増幅された検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、基体表面に固定化されているＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
生体サンプル由来のＤＮＡ鎖が、細菌の１６Ｓ又は２３ＳリボゾームＤＮＡであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記（ｃ）および（ｄ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより、同時に行なわれることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項６】
請求項１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＰＣＲ用プライマーが、前記記載の高分子物質と共有結合していないことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１０】
請求項１又は９に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１２】
請求項１又は１１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
（ａ）の工程を経た基体をＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れて、前記チューブ内で（ｂ）〜（ｄ）の工程を行なうことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１３】
請求項３に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１４】
請求項３又は１３記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１６】
請求項５記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
標識が蛍光色素であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１７】
請求項５記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
更に(ｅ)ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１】
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
(ａ)検出の対象となる生体サンプル由来のＤＮＡ鎖の塩基配列と相同する塩基配列の一部よりなるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を基体表面に固定する工程、
（ｂ）生体由来サンプルより調製したＤＮＡ鎖、ヌクレオチドモノマー、ＤＮＡ伸長用酵素、及び検出対象のＤＮＡ鎖について特異的配列を含むＤＮＡ鎖の一部を増幅させるＰＣＲ用プライマー、を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＰＣＲ用プライマーが検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、検出対象のＤＮＡ鎖の特定部位を増幅する工程、
（ｄ）（ｃ）の工程で増幅された検出対象のＤＮＡ鎖を鋳型にして、基体表面に固定化されているＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖を伸長させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
生体サンプル由来のＤＮＡ鎖が、細菌の１６Ｓ又は２３ＳリボゾームＤＮＡであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記（ｃ）および（ｄ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより、同時に行なわれることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項６】
請求項１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ＰＣＲ用プライマーが、前記記載の高分子物質と共有結合していないことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１０】
請求項１又は９に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１２】
請求項１又は１１記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
（ａ）の工程を経た基体をＰＣＲ用マイクロチューブ内に入れて、前記チューブ内で（ｂ）〜（ｄ）の工程を行なうことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１３】
請求項３に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１４】
請求項３又は１３記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１６】
請求項５記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
標識が蛍光色素であることを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【請求項１７】
請求項５記載のＤＮＡ配列の検出方法において、
更に(ｅ)ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の検出方法。
【公開番号】特開２００８−６１５１５（Ｐ２００８−６１５１５Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３９９１２（Ｐ２００６−２３９９１２）
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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