ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の高感度検出方法
【課題】パラフィン包埋検体のような検体（核酸、特にはｍＲＮＡ）に損傷があるような微量の試料において、肺癌マーカーとなりうるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を高感度且つ高精度に検出する方法、該方法に使用するプライマーおよびキットを提供する。
【解決手段】検出方法は、（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程を含む。
【解決手段】検出方法は、（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の高感度な検出方法、検出用プライマー、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、第２染色体上のＥＭＬ４（echinoderm microtubule associated protein like 4）のＮ末端とＡＬＫ（anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase）のＣ末端が融合した産物である。ＡＬＫは受容体型チロシンキナーゼであるが、ＥＭＬ４との融合により活性体となり癌化能を示す（特許文献１、特許文献２）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子発現細胞ではＡＬＫの活性化が認められ、その細胞増殖抑制にＡＬＫ阻害剤が有効であることが明らかとなっている。すなわち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子はＡＬＫ阻害剤の感受性規定因子であるといえる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、肺癌腫瘍における発現が認められており、その発現頻度は約５％といわれている。
【０００３】
現在、癌組織からのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出には、凍結検体に対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法による定量法が報告されている（非特許文献１）が、この方法はＥＭＬ４とＡＬＫの融合点を含んだ約２００ｂｐ〜約１３００ｂｐを増幅する必要があるため、核酸が分解あるいは劣化したようなパラフィン包埋検体での測定には適応できていない。しかし、肺癌においては、生体組織の採取は困難であり、比較的入手可能なパラフィン包埋検体を用いた解析が望ましい。パラフィン包埋検体に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出法としては、免疫組織染色法や蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法が用いられている。しかしこれらの方法では、検出感度が低いこと、融合点が近いバリアントを検出する場合には判別が難しいことなどから、パラフィン包埋検体を用いた、更に高感度且つ高精度な、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出法の構築が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２９５４４４号公報
【特許文献２】特開２０１０−５０１１７５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；１４：６６１８−２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、パラフィン包埋検体のような検体（核酸、特にはｍＲＮＡ）に損傷があるような微量の試料において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を高感度且つ高精度に検出する方法、該方法に使用するプライマーおよびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記に挙げるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を含む約１００ｂｐ以下の領域を増幅可能なプライマーを使用し、例えば、一塩基伸長反応を利用する質量分析法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）によって、該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無を検出可能であることを見出した。すなわち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の各々について、ＥＭＬ４とＡＬＫ遺伝子の各融合点を含む約１００ｂｐ以下の領域を増幅可能な増幅用プライマーを用いて該融合点を増幅することによって、パラフィン包埋切片において該融合遺伝子の全てを検出することを可能にした。更に、その増幅産物を鋳型として、該融合点にハイブリダイズ可能な相補的なプライマーを使用する一塩基伸長反応を行うことによって、高感度且つ高精度に全ての該融合遺伝子の存在を検出することを可能にした。
【０００８】
本発明は、
［１］（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、
（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法；
［２］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法；
［３］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法；
［４］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法；
［５］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法；
［６］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法；
［７］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法；
［８］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法；
［９］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法；
［１０］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法；
［１１］（ａ）融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
（ｂ）前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法；
［１２］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１３及び／又は配列番号１６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法；
［１３］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１９及び／又は配列番号２２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法；
［１４］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号２５及び／又は配列番号２８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法；
［１５］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３１及び／又は配列番号３４であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法；
［１６］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３７及び／又は配列番号４０であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法；
［１７］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４３及び／又は配列番号４６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法；
［１８］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４９であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法；
［１９］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法；
［２０］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５５及び／又は配列番号５８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法；
［２１］配列番号１１と１２の組合せ、配列番号１４と１５の組合せ、配列番号１７と１８の組合せ、配列番号２０と２１の組合せ、配列番号２３と２４の組合せ、配列番号２６と２７の組合せ、配列番号２９と３０の組合せ、配列番号３２と３３の組合せ、配列番号３５と３６の組合せ、配列番号３８と３９の組合せ、配列番号４１と４２の組合せ、配列番号４４と４５の組合せ、配列番号４７と４８の組合せ、配列番号５０と５１の組合せ、配列番号５３と５４の組合せ、配列番号５６と５７の組合せから選択される、プライマーセット；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、高感度且つ高精度に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の存在を検出することを可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラスミドを用いた各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの検出結果を示すマススペクトルである。
【図２】図１に示すマススペクトルの内、ALK(1)を用いた場合（検出塩基がＴ）の結果を示すマススペクトルである。
【図３】図１に示すマススペクトルの内、Variant1(1)を用いた場合（検出塩基がＧ）の結果を示すマススペクトルである。
【図４】図１に示すマススペクトルの内、Variant3a(1)を用いた場合（検出塩基がＣ）の結果を示すマススペクトルである。
【図５】図１に示すマススペクトルの内、Variant1(2)を用いた場合（検出塩基がＡ）の結果を示すマススペクトルである。
【図６】細胞株を用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果の一例〔Variant3a(2)；ＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ遺伝子発現株）〕を示すマススペクトルである。
【図７】検出感度を比較するために（図８参照）、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＰＣＲ増幅法によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示す電気泳動パターンである。
【図８】図７で実施したＰＣＲ増幅法における検出感度と比較するために、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示すマススペクトルである。
【図９】図７で使用したサンプルの１／１０量を使用して、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＰＣＲ増幅法によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示す電気泳動パターンである。
【図１０】図８で使用したサンプルの１／１０量を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示すマススペクトルである。
【図１１】各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの構造を模式的に示す説明図である。
【図１２】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号１）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー、伸長用プライマー。以下、同じ）の標的配列を示す説明図である。
【図１３】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号２）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１４】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号３）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１５】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号４）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１６】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号５）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１７】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号６）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１８】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号７）と、表４に示すプライマーセット１に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１９】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号８）と、表４に示すプライマーセット１に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図２０】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号９）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図２１】野生型ＡＬＫ遺伝子の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号１０）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、遺伝子発現、コード、相補、鋳型、プライマー、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１２】
本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能である。
【００１３】
本明細書において、核酸とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００１４】
本明細書において「野生型遺伝子」とは、融合を生じる前の遺伝子を言う。具体的には、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒで示す、ＮＭ＿０１９０６３．３のＥＭＬ４遺伝子、ＮＭ＿００４３０４．３のＡＬＫ遺伝子である。
【００１５】
本明細書において「ＥＭＬ４-ＡＬＫ融合遺伝子」とは、ＥＭＬ４遺伝子の一部とＡＬＫ遺伝子の一部が融合し、腫瘍形成能を有するようになった遺伝子である（図１１）。具体的には、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒで示す、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１３とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１」（ＡＢ２７４７２２．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２０とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２」（ＡＢ２７５８８９．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−６とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａ」（ＡＢ３７４３６１．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−６とクリプティックエクソン（Additional cryptic exon）とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂ」（ＡＢ３７４３６２．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１４と未知配列とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が逆の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４」（ＡＢ３７４３６３．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａ」（ＡＢ３７４３６４．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の一部とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂ」（ＡＢ３７４３６５．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１３と未知配列とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６」（ＡＢ４６２４１１．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１４とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７」（ＡＢ４６２４１２．１：図１１）
が含まれる。
【００１６】
本明細書における「融合点」とは、前記ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の連結した部位を示す。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１２）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１３）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間にクリプティックエクソンが挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子とクリプティックエクソンの接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子とクリプティックエクソンの接する部位であり（図１５）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間に未知配列が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子と未知配列の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子と未知配列の接する部位であり（図１６）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１７）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間にＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の一部が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の接する部位であり（図１８）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間に未知配列が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子と未知配列の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子と未知配列の接する部位であり（図１９）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位である（図２０）。
【００１７】
前記融合遺伝子の調製方法としては、例えば、特開２００８−２９５４４４号公報を参照して行うことができる。前記融合遺伝子を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒト肺癌患者由来肺組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することができる。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、前記融合遺伝子を得ることができる。また、本発明の実施例１に示すように、既にクローニングされているベクターから目的の領域を増幅し連結して融合遺伝子を作製することもできる。
【００１８】
本発明で使用可能な生体試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能な限り、限定されないが、病理検体（生検・細胞診・手術標本・胸水）および喀痰における凍結組織検体、パラフィン包埋検体などが使用できる。パラフィン包埋検体は、アルコール固定したものやホルマリン固定したものが含まれる。特に本発明の方法では、微量な組織のパラフィン包埋検体でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能であるので好ましい。
【００１９】
前記生体試料としては、体細胞が含まれていればよい。個体から単離された組織または液体の試料を使用することができ、たとえば血液、腫瘍生検、髄液、胸腔内液、呼吸器、唾液、細胞（血液細胞を含むが、これらに限定されるわけではない）、腫瘍、器官、さらにはインビトロ細胞培養成分の試料を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）。好ましくは、侵襲性の腫瘍生検による組織が簡便に使用できるので良い。
【００２０】
前記試料から核酸分子を調製する方法としては、当技術分野において周知の任意の多くの手順を使用することができる。
【００２１】
本発明で対象となる疾患は、ＥＭＬ４遺伝子の一部とＡＬＫ遺伝子の一部が融合して生成した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子」と腫瘍形成に相関が認められる疾患であれば限定されないが、特に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７と相関が認められる疾患として肺癌が挙げられる。
【００２２】
このような疾患には、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害活性を有する阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）が治療薬として使用することができる。ＡＬＫ阻害剤としては、ＰＦ−０２３４１０６６、ＴＡＥ６８４などが挙げられる。薬効を示す物質としては、低分子化合物でも良いし、タンパク質（特には抗体）でも良い。本発明によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法を利用して該遺伝子の有無を判定することにより、前記ＡＬＫ阻害剤の利用方針を決定することができる。
【００２３】
「プローブ」という用語は、構造が異なる標的分子間を検出可能に区別することができる分子をいう。検出は、使用するプローブの型および標的分子の型に応じて、種々の異なる方法で達成することができる。したがって、たとえば、検出は、標的分子の活性レベルの識別に基づいてもよいが、好ましくは特異的結合の検出に基づく。このような特異的結合の例として、核酸プローブ・ハイブリダイゼーションを含む。
【００２４】
本明細書に使用される「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドに対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に配置されたときに、相補鎖に沿ってポリヌクレオチド合成の開始位置として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。このような条件は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシド類似体と、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素などの重合のための１つまたは複数の薬剤とが、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換分を含む。）中に、かつ適切な温度にて存在することを含む。プライマーは、ポリメラーゼのための薬剤の存在下においても伸張産物の合成をプライムするほど十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、少なくとも約５ヌクレオチドの長さの、標的配列に対して実質的に相補的な配列を含むが、いくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、より長いプライマーを使用してもよい。
【００２５】
プライマーは、増幅される特異的配列である標的配列に対して実質的に相補的な配列であって、プライマーがアニールすることができる配列を常に含む。プライマーは、任意に、付加配列を含んでいてもよい。付加配列は、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでの測定に必要な分析用の配列や、その他、測定に必要な配列を適宜付加することができる。これらのプライマーの設計は、公知のプライマー設計ソフト（例えば、Primer3：ＮＣＢＩ提供）を使用し、測定法に合わせて適宜行うことができる。
【００２６】
本発明では、損傷の激しい生体試料から、目的の遺伝子領域を増幅可能な増幅用プライマーを使用する。また、高感度に目的の遺伝子を検出するため、該増幅用プライマーで増幅された増幅産物を鋳型として、伸長用プライマーを使用することができる。本発明の伸長用プライマーは、プローブとしても使用することができる。
【００２７】
本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無の検出には、多数の公知の解析手順を使用することができる。一般に、融合遺伝子の有無の検出は、増幅反応および所望によりシグナル発生系を必要とする。表１は、変異検出技術を列挙しており、中にはＰＣＲに基くものもある。これらは、表２に挙げたシグナル発生系と組合わせて使用することもできる。また、表３に、その他の増幅技術を列挙する。融合遺伝子の多くの現行検出方法については、Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120 (1997)および標準テキストブック、例えばLaboratory Protocols for Mutation Detection、U.Landegren編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９９６）およびPCR、Newton & Grahamによる第２版、ＢＩＯＳ サイエンティフィック・パブリッシャーズ・リミテッド（１９９７）により概説されている。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
好ましい変異検出技術には、電気泳動法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）法、ＤＮＡ配列決定法、ＡＲＭＳ（登録商標）、ＡＬＥＸ（登録商標）、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、ＰＮＡ−ＬＮＡ ＰＣＲ ｃｌａｍｐ法、分子ビーコン、ＲＦＬＰ、および制限部位に基くＰＣＲおよびＦＲＥＴ技術がある。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法が特に好ましい方法である。
【００３２】
以下に、いくつかの検査方法について例示する。
【００３３】
前記検査方法において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子に生じた融合点の検出は、例えば、被検者のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の塩基配列を直接決定することにより行うことができる。この方法においてはまず、被検者から得られた生体試料より、ＤＮＡ試料を調製する。これらの試料は、例えば、組織または細胞から抽出したＲＮＡを基に調製することができる。
【００３４】
本方法においては、次いで、前記ＤＮＡ試料を用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子における融合点を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ホルマリン固定パラフィン包埋検体のような核酸に損傷がある検体でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子における融合点を含む核酸配列を増幅可能な核酸配列にハイブリダイズするプライマーを用いて、前記調製したＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列の大きさを決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の大きさ決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３５】
本発明で使用可能なプライマーとしては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１の増幅用プライマーとして配列番号１１と配列番号１５の組合せ（ＡＢ２７４７２２．１における第１７４２〜１７７９番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２の増幅用プライマーとして配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ（ＡＢ２７５８８９．１における第２４９９〜２５３２番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａの増幅用プライマーとして配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ（ＡＢ３７４３６１．１における第７１１〜７４３番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂの増幅用プライマーとして配列番号３２と配列番号３３の組合せ（ＡＢ３７４３６２．１における第７１２〜７８７番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４の増幅用プライマーとして配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ（ＡＢ３７４３６３．１における第１６９５〜１７２３番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａの増幅用プライマーとして配列番号４１と配列番号４５の組合せ（ＡＢ３７４３６４．１における第２５２〜２９５番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂの増幅用プライマーとして配列番号４７と配列番号４８の組合せ（ＡＢ３７４３６５．１における第２５２〜２７９番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６の増幅用プライマーとして配列番号５０と配列番号５１の組合せ（ＡＢ４６２４１１．１における第１５４０〜１５６０番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７の増幅用プライマーとして配列番号５６と配列番号５４の組合せ（ＡＢ４６２４１２．１における第１６５５〜１７１５番塩基）を使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する増幅用プライマーが挙げられ、より具体的には、実施例で使用した各プライマーセット１又は２を挙げることができる。なお、各組合せの直後に記載した括弧内の塩基番号で規定される塩基配列は、各プライマーセットで増幅される塩基配列（但し、プライマー配列に対応する配列を除く）である。
【００３６】
また、コントロールとして、ＧｅｎｅＢａｎｋに野生型として登録されているＡＬＫ遺伝子の配列（ＮＭ＿００４３０４．３）あるいはＥＭＬ４遺伝子（ＮＭ＿０１９０６３．３）を増幅するための増幅用プライマーが使用できる。例えば、ＡＬＫ遺伝子の増幅用プライマーとして配列番号５９と配列番号６０の組合せ（ＮＭ＿００４３０４．３の第４０７２〜４０９９番塩基）、または、配列番号６２と配列番号６３の組合せ（ＮＭ＿００４３０４．３の第４０２３〜４０６２番塩基）を使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する増幅用プライマーが挙げられる（図２１）。
【００３７】
なお、本明細書において、「或るプライマーセットを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する」とは、増幅対象遺伝子の塩基配列において、前記プライマーセットで増幅される塩基配列〔プライマー配列（但し、プライマー配列と増幅対象遺伝子との重複または相補配列部分に限り、例えば、付加的ランダム配列部分は含まない）に対応する配列を含む〕の全長又はその一部を増幅することを意味する。
【００３８】
まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を前記と同様な増幅プライマーで増幅し、ＤＮＡを単離する。次いで、単離されたＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４遺伝子は融合していなければ同一のＲＮＡ上には存在しないため、本発明の方法によっては検出されない。よって、目的の融合遺伝子の有無は、目的の大きさのＤＮＡ断片が得られたか否かで判断することができる。
【００３９】
本発明の検査方法は、前記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列の大きさを決定する方法以外に、融合遺伝子の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。例えば、以下のような方法を挙げることができる。
【００４０】
前記の方法では、煩雑であったり、多数の検体を試験したりすることが難しい。また、ＰＣＲ法による得られたＤＮＡ断片の大きさによる同定方法では、複数のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントを検討する場合、増幅可能な領域の長さが狭いためお互いを見分けることが難しい場合がある。よって、融合点を直接検出するような方法が好ましい。
【００４１】
この方法の例としては、一塩基伸長反応が挙げられる。一塩基伸長反応とは、非ラベルオリゴヌクレオチドプライマーを調べたい塩基位置直前のすぐ隣にアニーリングさせ、その３’末端を一分子のｄｄＮＴＰによって伸長させる。反応液中にはｄＮＴＰが含まれないため、目的の塩基に相補的な部位のみが伸長されることになる。このＤＮＡフラグメントを、遺伝子解析システムで解析、検出する方法である。この方法を利用した測定法としてＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（シーケノム社）が挙げられる。
【００４２】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出について説明する。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製し、次いで、調製したＤＮＡ試料を前記と同様な増幅用プライマーで増幅し、ＤＮＡを単離する。増幅用プライマーとしては、前記で挙げた増幅用プライマーを使用することができる。次いで、この増幅産物を鋳型として、伸長用プライマーにより一塩基伸長反応を行い、得られた物質の質量によって伸長された塩基を決定する。伸長用プライマーはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を検出できるように、該融合点を含む領域に設計することが好ましい。
【００４３】
ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４遺伝子は融合していない場合は同一のＲＮＡ上には存在しないため、増幅用プライマーで増幅されず、伸長用プライマーでの伸長もされないため、本発明の方法によっては検出されない。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が存在している場合には、増幅用プライマーで増幅でき、かつ、融合点を含む伸長プライマーで伸長されるので、精度良くＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無を判定することができる。
【００４４】
また、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子と相補的な配列の５’端に約１０塩基のランダムな配列を付加することで、ＰＣＲ増幅産物が質量分析可能な範囲外となり、一塩基伸長反応産物を特異的に検出することができる。これら増幅用プライマーや伸長用プライマーは、Assay Designer (シーケノム社)によって設計することができる。
【００４５】
また、各々のバリアントを特異的に検出できるように、増幅用プライマー及び伸長用プライマーを検討することで、マルチプレックスＰＣＲによる解析も可能である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
《実施例１：材料及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法》
１．鋳型ＤＮＡの構築
ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント１検出のための鋳型ＤＮＡとして、該バリアント１（配列番号１）全長を含むベクターであるpDNR-dual donor vector/EML4-ALKバリアント１を使用した（近畿大学医学部腫瘍内科より供与、pDNR-dual donor vectorはクロンテック社）。ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ｂ（配列番号４）検出のための鋳型ＤＮＡとして、該バリアント３ｂ全長を含むベクターであるpcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ｂを使用した（近畿大学医学部腫瘍内科より供与）。ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント２（配列番号２）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ａ（配列番号３）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント４（配列番号５）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント５ａ（配列番号６）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント５ｂ（配列番号７）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント６（配列番号８）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント７（配列番号９）の検出のための鋳型ＤＮＡは、In fusionシステム（クロンテック社）を用いて、各々融合ポイントを挟む約１，０００ｂｐのＤＮＡ配列をpcDNA3.1(+)（インビトロジェン社）に導入したプラスミドを作製、使用した。
【００４８】
ＡＬＫとしては、野生型ＡＬＫを発現するヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）より抽出したＲＮＡをｃＤＮＡにリバースしたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＬＫ検出のための融合ポイントをはさむ約１，０００ｂｐのＤＮＡ配列（配列番号１０）をＴＡクローニングにより導入したプラスミドを作製、使用した。ＡＬＫ検出のための融合ポイントとは、便宜的にエクソン１９とエクソン２０が接する部位を意味する。
【００４９】
２．試料と鋳型の抽出方法
細胞株における融合遺伝子発現株および非発現株として、ヒト肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子発現株：近畿大学医学部腫瘍内科より入手）及びＮＣＩ−Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ及び３ｂ遺伝子発現株：近畿大学医学部腫瘍内科（あるいはＡＴＣＣ）より入手）、ヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ発現株：ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）を用いた。これらの細胞株は、定法に従って培養した。
【００５０】
本測定系における臨床検体の実例として、肺がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いた。ホルマリン固定パラフィン包埋切片は、定法に従って作製した。
【００５１】
細胞株からのＲＮＡ抽出にはRNeasy Plus Mini Kit（キアゲン社）、パラフィン包埋切片からのＲＮＡ抽出にはRNeasy FFPE Kit（キアゲン社）を用いた。抽出したＲＮＡは、NanoDrop2000（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により定量し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（アプライド・バイオシステムズ社）により逆転写反応を行い、鋳型ＤＮＡを調製した。調製された鋳型ＤＮＡは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５２】
３．ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子及び野生型ＡＬＫ遺伝子の検出は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析装置を用いたＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（シーケノム社）により行った。検出対象とする遺伝子は、９種の融合遺伝子（バリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント６、及びバリアント７）並びにＡＬＫの１０種である。各バリアントの融合ポイントを含む特定領域をＰＣＲによって増幅した後、融合ポイントを含む領域に伸長用プライマーをハイブリダイズし、一塩基伸長反応を行った。一塩基伸長反応により生成されたＤＮＡ断片をマトリックスチップに塗布し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によってＤＮＡ断片の質量数から解析し、検出塩基を決定することで、測定対象の遺伝子を同定した。なお、ＡＬＫの検出のためには、融合点を含まず、融合遺伝子が有していないエクソン上（エクソン１９）にもプライマーを設計した。
【００５３】
検出反応は、iPLEX(TM) Gold（シーケノム社）を用い、プロトコールに準拠して行った。ＰＣＲ反応に用いるプライマー及び一塩基伸長反応用プライマーを表４にまとめて示す。表４に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号３２及び５６を除いて、いずれも５’端に、増幅対象塩基配列とは無関係な１０塩基からなるランダム配列が付加されている。プライマーはSigma Genosys社で合成した。表４に挙げたプライマーは、まず、Assay Designer（シーケノム社）に従って、融合点を含んで増幅可能なプライマーと、一塩基伸長反応可能なプライマーの１５０個の候補を得、次に、特異的な増幅が行えるか、及び、微量な試料でも検出可能かを検討して決定した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
上述の測定条件において検出される塩基を表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
《実施例２：プラスミドを用いた各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの検出の確認》
実施例１で調製したプラスミドＤＮＡの０．１ｎｇを用いて、野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は表５に示すとおりである。
【００５８】
検出結果（各マススペクトル）を図１に示す。図１において、遺伝子名の後の小括弧内の数字は、セット名（セット１又はセット２のいずれを使用したか）を示す。また、横軸及び縦軸の記載は省略したが、横軸は質量（mass）を示し、縦軸は強度（intensity）を示す。検出塩基がＴ、Ｇ、Ｃ、Ａである場合の一例として、図１に示すALK(1)、Variant1(1)、Variant3a(1)、Variant1(2)を、それぞれ、図２〜図５に示す。各マススペクトル（右側に行くほど高質量）において、右側の２本の点線は、それぞれ、一塩基伸長した塩基の種類によって表れるピークの位置を示しており、例えば、ALK(1)ではＴ（左側）及びＡ（右側）である場合の各ピークの位置を示しており、以下、同様に、Variant1(1)ではＧ（左側）及びＣ（右側）、Variant3a(1)ではＧ（左側）及びＣ（右側）、Variant1(2)ではＴ（左側）及びＡ（右側）である場合の各ピークの位置を示している。なお、各マススペクトルの左端の点線は、一塩基伸長が起こらなかった場合に表れるピークの位置を示す。その結果、作製したプライマーを使用して、全ての測定条件で野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が同定できた。
【００５９】
《実施例３：細胞を用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出》
実施例１で調製した鋳型ｃＤＮＡの１ｎｇを用いて、野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は、ヒト肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子発現株）でＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子が同定可能か、ＮＣＩ−Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子及び３ｂ遺伝子発現株）でＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子が同定可能か、及びヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ遺伝子発現株）で野生型ＡＬＫ遺伝子が同定可能かである。
【００６０】
その結果、作製したプライマーセットVariant1(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント１用プライマーセットのセット２を使用して、ＮＣＩ−Ｈ３１２２においてＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子を同定することができた。また、Variant3a(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ａ用プライマーセットのセット２を使用して、ＮＣＩ−Ｈ２２２８においてＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子を同定することができた。また、ALK(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＡＬＫ用プライマーセットのセット２を使用して、ＭＫＮ１において野生型ＡＬＫ遺伝子を同定することができた。一方、ＭＫＮ１において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子測定条件で該遺伝子を検出できないことを確認した。なお、セット２の代わりにセット１を用いた場合も、同様の結果が得られた。一例として、Variant3a(2)を用いてＭＫＮ１を測定した結果を、図６に示す。
【００６１】
《実施例４：臨床検体におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出》
実施例１に従って、肺がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）からｍＲＮＡを抽出し鋳型ｃＤＮＡを調製した。そのｃＤＮＡ ４ｎｇを用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した条件は以下のように、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７を検出可能な条件で行った。
【００６２】
その結果、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを検出した。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａが検出されたことより、この肺がん患者はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを保有することが同定された。
【００６３】
《実施例５：臨床検体のＰＣＲ増幅産物の配列解析》
実施例４で得られた、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの増幅反応で得られたＰＣＲ増幅産物の配列解析を行った。前記ＰＣＲ増幅産物を、TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社）によりサブクローニングし、得られた複数のシングルコロニーの挿入配列をダイレクトシークエンスにて解析した。その結果、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａと同一であった。このことから、使用した臨床検体は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを有することが確認できた。
【００６４】
《実施例６：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出感度の検討１》
実施例１に従ったＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出感度を、ＰＣＲ法と比較した。ＰＣＲの結果としてはＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの増幅工程で得られた増幅産物を使用した。ＰＣＲによる増幅産物の確認はバイオアナライザー（アジレント・テクノロジー）で行った。
【００６５】
プラスミド（pcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ａ）ＤＮＡ １ｎｇ、ＮＣＩ−Ｈ２２２８ ＤＮＡ ４ｎｇ、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）ＤＮＡ １０ｎｇを使用し、ＰＣＲ増幅法でもＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａが検出できた。ＰＣＲ増幅法の結果を図７に、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの結果を図８に、それぞれ示す。ＰＣＲ増幅法は、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムはホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を示した。
【００６６】
次に、プラスミド（pcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ａ）ＤＮＡ ０．１ｎｇ、ＮＣＩ−Ｈ２２２８ ＤＮＡ ０．４ｎｇ、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）ＤＮＡ １ｎｇでも同じように検討した。その結果、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）を使用したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出は、ＰＣＲ増幅法では確認できなかったが、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでは検出された。ＰＣＲ増幅法の結果を図９に、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの結果を図１０に、それぞれ示す。ＰＣＲ増幅法は、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムはホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を示した。
【００６７】
ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）は比較的入手しやすい臨床検体であるが、採取量はわずかであり貴重な試料である。以上より、微量な試料を対象とした場合にも、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムを使用することにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出可能となった。
【００６８】
《実施例７：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出感度の検討２》
臨床検体では、多量の正常細胞中に微量の異常細胞が混合している状態で存在している。そのような共雑物が混合している場合でも、目的のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能か検討した。
【００６９】
実施例３と同様に、細胞株中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを検出可能か検討した。具体的には、ＭＫＮ１とＮＣＩ−Ｈ２２２８の鋳型ＤＮＡを０：１（ｗ／ｗ）、１：０（ｗ／ｗ）、１：１（ｗ／ｗ）、９：１（ｗ／ｗ）、９９：１（ｗ／ｗ）の比率で混合し、その合計４ｎｇを使用してＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出を検討した。
【００７０】
その結果、いずれの条件でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを明確に検出することができた。このことから、この本方法によって、精度良くＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出可能なことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
肺癌患者から比較的入手可能なパラフィン包埋切片において、高感度且つ高精度に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の存在を検出することが可能となり、迅速且つ正確にＡＬＫ阻害剤の有効性を診断することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列表の配列番号１１〜６４の各配列で表される塩基配列は、プライマー配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の高感度な検出方法、検出用プライマー、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、第２染色体上のＥＭＬ４（echinoderm microtubule associated protein like 4）のＮ末端とＡＬＫ（anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase）のＣ末端が融合した産物である。ＡＬＫは受容体型チロシンキナーゼであるが、ＥＭＬ４との融合により活性体となり癌化能を示す（特許文献１、特許文献２）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子発現細胞ではＡＬＫの活性化が認められ、その細胞増殖抑制にＡＬＫ阻害剤が有効であることが明らかとなっている。すなわち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子はＡＬＫ阻害剤の感受性規定因子であるといえる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子は、肺癌腫瘍における発現が認められており、その発現頻度は約５％といわれている。
【０００３】
現在、癌組織からのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出には、凍結検体に対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法による定量法が報告されている（非特許文献１）が、この方法はＥＭＬ４とＡＬＫの融合点を含んだ約２００ｂｐ〜約１３００ｂｐを増幅する必要があるため、核酸が分解あるいは劣化したようなパラフィン包埋検体での測定には適応できていない。しかし、肺癌においては、生体組織の採取は困難であり、比較的入手可能なパラフィン包埋検体を用いた解析が望ましい。パラフィン包埋検体に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出法としては、免疫組織染色法や蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法が用いられている。しかしこれらの方法では、検出感度が低いこと、融合点が近いバリアントを検出する場合には判別が難しいことなどから、パラフィン包埋検体を用いた、更に高感度且つ高精度な、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出法の構築が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２９５４４４号公報
【特許文献２】特開２０１０−５０１１７５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；１４：６６１８−２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、パラフィン包埋検体のような検体（核酸、特にはｍＲＮＡ）に損傷があるような微量の試料において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を高感度且つ高精度に検出する方法、該方法に使用するプライマーおよびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記に挙げるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を含む約１００ｂｐ以下の領域を増幅可能なプライマーを使用し、例えば、一塩基伸長反応を利用する質量分析法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）によって、該ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無を検出可能であることを見出した。すなわち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の各々について、ＥＭＬ４とＡＬＫ遺伝子の各融合点を含む約１００ｂｐ以下の領域を増幅可能な増幅用プライマーを用いて該融合点を増幅することによって、パラフィン包埋切片において該融合遺伝子の全てを検出することを可能にした。更に、その増幅産物を鋳型として、該融合点にハイブリダイズ可能な相補的なプライマーを使用する一塩基伸長反応を行うことによって、高感度且つ高精度に全ての該融合遺伝子の存在を検出することを可能にした。
【０００８】
本発明は、
［１］（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、
（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法；
［２］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法；
［３］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法；
［４］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法；
［５］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法；
［６］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法；
［７］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法；
［８］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法；
［９］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法；
［１０］前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法；
［１１］（ａ）融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
（ｂ）前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法；
［１２］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１３及び／又は配列番号１６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法；
［１３］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１９及び／又は配列番号２２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法；
［１４］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号２５及び／又は配列番号２８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法；
［１５］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３１及び／又は配列番号３４であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法；
［１６］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３７及び／又は配列番号４０であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法；
［１７］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４３及び／又は配列番号４６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法；
［１８］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４９であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法；
［１９］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法；
［２０］前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５５及び／又は配列番号５８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法；
［２１］配列番号１１と１２の組合せ、配列番号１４と１５の組合せ、配列番号１７と１８の組合せ、配列番号２０と２１の組合せ、配列番号２３と２４の組合せ、配列番号２６と２７の組合せ、配列番号２９と３０の組合せ、配列番号３２と３３の組合せ、配列番号３５と３６の組合せ、配列番号３８と３９の組合せ、配列番号４１と４２の組合せ、配列番号４４と４５の組合せ、配列番号４７と４８の組合せ、配列番号５０と５１の組合せ、配列番号５３と５４の組合せ、配列番号５６と５７の組合せから選択される、プライマーセット；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、高感度且つ高精度に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の存在を検出することを可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラスミドを用いた各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの検出結果を示すマススペクトルである。
【図２】図１に示すマススペクトルの内、ALK(1)を用いた場合（検出塩基がＴ）の結果を示すマススペクトルである。
【図３】図１に示すマススペクトルの内、Variant1(1)を用いた場合（検出塩基がＧ）の結果を示すマススペクトルである。
【図４】図１に示すマススペクトルの内、Variant3a(1)を用いた場合（検出塩基がＣ）の結果を示すマススペクトルである。
【図５】図１に示すマススペクトルの内、Variant1(2)を用いた場合（検出塩基がＡ）の結果を示すマススペクトルである。
【図６】細胞株を用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果の一例〔Variant3a(2)；ＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ遺伝子発現株）〕を示すマススペクトルである。
【図７】検出感度を比較するために（図８参照）、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＰＣＲ増幅法によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示す電気泳動パターンである。
【図８】図７で実施したＰＣＲ増幅法における検出感度と比較するために、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示すマススペクトルである。
【図９】図７で使用したサンプルの１／１０量を使用して、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＰＣＲ増幅法によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示す電気泳動パターンである。
【図１０】図８で使用したサンプルの１／１０量を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）における、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出結果を示すマススペクトルである。
【図１１】各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの構造を模式的に示す説明図である。
【図１２】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号１）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー、伸長用プライマー。以下、同じ）の標的配列を示す説明図である。
【図１３】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号２）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１４】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号３）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１５】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号４）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１６】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号５）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１７】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号６）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１８】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂの融合点およびその近傍領域の配列（配列番号７）と、表４に示すプライマーセット１に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図１９】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号８）と、表４に示すプライマーセット１に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図２０】ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号９）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【図２１】野生型ＡＬＫ遺伝子の融合点およびその近傍領域の配列（配列番号１０）と、表４に示すプライマーセット１及び２に含まれる各プライマーの標的配列を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、遺伝子発現、コード、相補、鋳型、プライマー、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１２】
本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能である。
【００１３】
本明細書において、核酸とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００１４】
本明細書において「野生型遺伝子」とは、融合を生じる前の遺伝子を言う。具体的には、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒで示す、ＮＭ＿０１９０６３．３のＥＭＬ４遺伝子、ＮＭ＿００４３０４．３のＡＬＫ遺伝子である。
【００１５】
本明細書において「ＥＭＬ４-ＡＬＫ融合遺伝子」とは、ＥＭＬ４遺伝子の一部とＡＬＫ遺伝子の一部が融合し、腫瘍形成能を有するようになった遺伝子である（図１１）。具体的には、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒで示す、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１３とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１」（ＡＢ２７４７２２．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２０とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２」（ＡＢ２７５８８９．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−６とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａ」（ＡＢ３７４３６１．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−６とクリプティックエクソン（Additional cryptic exon）とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂ」（ＡＢ３７４３６２．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１４と未知配列とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が逆の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４」（ＡＢ３７４３６３．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａ」（ＡＢ３７４３６４．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−２とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の一部とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂ」（ＡＢ３７４３６５．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１３と未知配列とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６」（ＡＢ４６２４１１．１：図１１）、
・ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１−１４とＡＬＫ遺伝子のエクソン２０が正の向きで融合した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７」（ＡＢ４６２４１２．１：図１１）
が含まれる。
【００１６】
本明細書における「融合点」とは、前記ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の連結した部位を示す。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１２）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント２の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１３）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ｂの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間にクリプティックエクソンが挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子とクリプティックエクソンの接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子とクリプティックエクソンの接する部位であり（図１５）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント４の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間に未知配列が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子と未知配列の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子と未知配列の接する部位であり（図１６）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ａの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位であり（図１７）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント５ｂの融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間にＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の一部が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子とＡＬＫ遺伝子のイントロン１９の接する部位であり（図１８）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント６の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の間に未知配列が挿入されているので、ＥＭＬ４遺伝子と未知配列の接する部位あるいはＡＬＫ遺伝子と未知配列の接する部位であり（図１９）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント７の融合点は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の接する部位である（図２０）。
【００１７】
前記融合遺伝子の調製方法としては、例えば、特開２００８−２９５４４４号公報を参照して行うことができる。前記融合遺伝子を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒト肺癌患者由来肺組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することができる。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、前記融合遺伝子を得ることができる。また、本発明の実施例１に示すように、既にクローニングされているベクターから目的の領域を増幅し連結して融合遺伝子を作製することもできる。
【００１８】
本発明で使用可能な生体試料は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能な限り、限定されないが、病理検体（生検・細胞診・手術標本・胸水）および喀痰における凍結組織検体、パラフィン包埋検体などが使用できる。パラフィン包埋検体は、アルコール固定したものやホルマリン固定したものが含まれる。特に本発明の方法では、微量な組織のパラフィン包埋検体でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能であるので好ましい。
【００１９】
前記生体試料としては、体細胞が含まれていればよい。個体から単離された組織または液体の試料を使用することができ、たとえば血液、腫瘍生検、髄液、胸腔内液、呼吸器、唾液、細胞（血液細胞を含むが、これらに限定されるわけではない）、腫瘍、器官、さらにはインビトロ細胞培養成分の試料を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）。好ましくは、侵襲性の腫瘍生検による組織が簡便に使用できるので良い。
【００２０】
前記試料から核酸分子を調製する方法としては、当技術分野において周知の任意の多くの手順を使用することができる。
【００２１】
本発明で対象となる疾患は、ＥＭＬ４遺伝子の一部とＡＬＫ遺伝子の一部が融合して生成した「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子」と腫瘍形成に相関が認められる疾患であれば限定されないが、特に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７と相関が認められる疾患として肺癌が挙げられる。
【００２２】
このような疾患には、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害活性を有する阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）が治療薬として使用することができる。ＡＬＫ阻害剤としては、ＰＦ−０２３４１０６６、ＴＡＥ６８４などが挙げられる。薬効を示す物質としては、低分子化合物でも良いし、タンパク質（特には抗体）でも良い。本発明によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法を利用して該遺伝子の有無を判定することにより、前記ＡＬＫ阻害剤の利用方針を決定することができる。
【００２３】
「プローブ」という用語は、構造が異なる標的分子間を検出可能に区別することができる分子をいう。検出は、使用するプローブの型および標的分子の型に応じて、種々の異なる方法で達成することができる。したがって、たとえば、検出は、標的分子の活性レベルの識別に基づいてもよいが、好ましくは特異的結合の検出に基づく。このような特異的結合の例として、核酸プローブ・ハイブリダイゼーションを含む。
【００２４】
本明細書に使用される「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドに対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に配置されたときに、相補鎖に沿ってポリヌクレオチド合成の開始位置として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。このような条件は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシド類似体と、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素などの重合のための１つまたは複数の薬剤とが、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換分を含む。）中に、かつ適切な温度にて存在することを含む。プライマーは、ポリメラーゼのための薬剤の存在下においても伸張産物の合成をプライムするほど十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、少なくとも約５ヌクレオチドの長さの、標的配列に対して実質的に相補的な配列を含むが、いくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、より長いプライマーを使用してもよい。
【００２５】
プライマーは、増幅される特異的配列である標的配列に対して実質的に相補的な配列であって、プライマーがアニールすることができる配列を常に含む。プライマーは、任意に、付加配列を含んでいてもよい。付加配列は、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでの測定に必要な分析用の配列や、その他、測定に必要な配列を適宜付加することができる。これらのプライマーの設計は、公知のプライマー設計ソフト（例えば、Primer3：ＮＣＢＩ提供）を使用し、測定法に合わせて適宜行うことができる。
【００２６】
本発明では、損傷の激しい生体試料から、目的の遺伝子領域を増幅可能な増幅用プライマーを使用する。また、高感度に目的の遺伝子を検出するため、該増幅用プライマーで増幅された増幅産物を鋳型として、伸長用プライマーを使用することができる。本発明の伸長用プライマーは、プローブとしても使用することができる。
【００２７】
本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無の検出には、多数の公知の解析手順を使用することができる。一般に、融合遺伝子の有無の検出は、増幅反応および所望によりシグナル発生系を必要とする。表１は、変異検出技術を列挙しており、中にはＰＣＲに基くものもある。これらは、表２に挙げたシグナル発生系と組合わせて使用することもできる。また、表３に、その他の増幅技術を列挙する。融合遺伝子の多くの現行検出方法については、Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120 (1997)および標準テキストブック、例えばLaboratory Protocols for Mutation Detection、U.Landegren編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９９６）およびPCR、Newton & Grahamによる第２版、ＢＩＯＳ サイエンティフィック・パブリッシャーズ・リミテッド（１９９７）により概説されている。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
好ましい変異検出技術には、電気泳動法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）法、ＤＮＡ配列決定法、ＡＲＭＳ（登録商標）、ＡＬＥＸ（登録商標）、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、ＰＮＡ−ＬＮＡ ＰＣＲ ｃｌａｍｐ法、分子ビーコン、ＲＦＬＰ、および制限部位に基くＰＣＲおよびＦＲＥＴ技術がある。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法が特に好ましい方法である。
【００３２】
以下に、いくつかの検査方法について例示する。
【００３３】
前記検査方法において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子に生じた融合点の検出は、例えば、被検者のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の塩基配列を直接決定することにより行うことができる。この方法においてはまず、被検者から得られた生体試料より、ＤＮＡ試料を調製する。これらの試料は、例えば、組織または細胞から抽出したＲＮＡを基に調製することができる。
【００３４】
本方法においては、次いで、前記ＤＮＡ試料を用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子における融合点を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ホルマリン固定パラフィン包埋検体のような核酸に損傷がある検体でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子における融合点を含む核酸配列を増幅可能な核酸配列にハイブリダイズするプライマーを用いて、前記調製したＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列の大きさを決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の大きさ決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３５】
本発明で使用可能なプライマーとしては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１の増幅用プライマーとして配列番号１１と配列番号１５の組合せ（ＡＢ２７４７２２．１における第１７４２〜１７７９番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２の増幅用プライマーとして配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ（ＡＢ２７５８８９．１における第２４９９〜２５３２番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａの増幅用プライマーとして配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ（ＡＢ３７４３６１．１における第７１１〜７４３番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂの増幅用プライマーとして配列番号３２と配列番号３３の組合せ（ＡＢ３７４３６２．１における第７１２〜７８７番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４の増幅用プライマーとして配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ（ＡＢ３７４３６３．１における第１６９５〜１７２３番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａの増幅用プライマーとして配列番号４１と配列番号４５の組合せ（ＡＢ３７４３６４．１における第２５２〜２９５番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂの増幅用プライマーとして配列番号４７と配列番号４８の組合せ（ＡＢ３７４３６５．１における第２５２〜２７９番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６の増幅用プライマーとして配列番号５０と配列番号５１の組合せ（ＡＢ４６２４１１．１における第１５４０〜１５６０番塩基）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７の増幅用プライマーとして配列番号５６と配列番号５４の組合せ（ＡＢ４６２４１２．１における第１６５５〜１７１５番塩基）を使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する増幅用プライマーが挙げられ、より具体的には、実施例で使用した各プライマーセット１又は２を挙げることができる。なお、各組合せの直後に記載した括弧内の塩基番号で規定される塩基配列は、各プライマーセットで増幅される塩基配列（但し、プライマー配列に対応する配列を除く）である。
【００３６】
また、コントロールとして、ＧｅｎｅＢａｎｋに野生型として登録されているＡＬＫ遺伝子の配列（ＮＭ＿００４３０４．３）あるいはＥＭＬ４遺伝子（ＮＭ＿０１９０６３．３）を増幅するための増幅用プライマーが使用できる。例えば、ＡＬＫ遺伝子の増幅用プライマーとして配列番号５９と配列番号６０の組合せ（ＮＭ＿００４３０４．３の第４０７２〜４０９９番塩基）、または、配列番号６２と配列番号６３の組合せ（ＮＭ＿００４３０４．３の第４０２３〜４０６２番塩基）を使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する増幅用プライマーが挙げられる（図２１）。
【００３７】
なお、本明細書において、「或るプライマーセットを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する」とは、増幅対象遺伝子の塩基配列において、前記プライマーセットで増幅される塩基配列〔プライマー配列（但し、プライマー配列と増幅対象遺伝子との重複または相補配列部分に限り、例えば、付加的ランダム配列部分は含まない）に対応する配列を含む〕の全長又はその一部を増幅することを意味する。
【００３８】
まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を前記と同様な増幅プライマーで増幅し、ＤＮＡを単離する。次いで、単離されたＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４遺伝子は融合していなければ同一のＲＮＡ上には存在しないため、本発明の方法によっては検出されない。よって、目的の融合遺伝子の有無は、目的の大きさのＤＮＡ断片が得られたか否かで判断することができる。
【００３９】
本発明の検査方法は、前記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列の大きさを決定する方法以外に、融合遺伝子の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。例えば、以下のような方法を挙げることができる。
【００４０】
前記の方法では、煩雑であったり、多数の検体を試験したりすることが難しい。また、ＰＣＲ法による得られたＤＮＡ断片の大きさによる同定方法では、複数のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアントを検討する場合、増幅可能な領域の長さが狭いためお互いを見分けることが難しい場合がある。よって、融合点を直接検出するような方法が好ましい。
【００４１】
この方法の例としては、一塩基伸長反応が挙げられる。一塩基伸長反応とは、非ラベルオリゴヌクレオチドプライマーを調べたい塩基位置直前のすぐ隣にアニーリングさせ、その３’末端を一分子のｄｄＮＴＰによって伸長させる。反応液中にはｄＮＴＰが含まれないため、目的の塩基に相補的な部位のみが伸長されることになる。このＤＮＡフラグメントを、遺伝子解析システムで解析、検出する方法である。この方法を利用した測定法としてＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（シーケノム社）が挙げられる。
【００４２】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出について説明する。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製し、次いで、調製したＤＮＡ試料を前記と同様な増幅用プライマーで増幅し、ＤＮＡを単離する。増幅用プライマーとしては、前記で挙げた増幅用プライマーを使用することができる。次いで、この増幅産物を鋳型として、伸長用プライマーにより一塩基伸長反応を行い、得られた物質の質量によって伸長された塩基を決定する。伸長用プライマーはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を検出できるように、該融合点を含む領域に設計することが好ましい。
【００４３】
ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４遺伝子は融合していない場合は同一のＲＮＡ上には存在しないため、増幅用プライマーで増幅されず、伸長用プライマーでの伸長もされないため、本発明の方法によっては検出されない。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が存在している場合には、増幅用プライマーで増幅でき、かつ、融合点を含む伸長プライマーで伸長されるので、精度良くＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の有無を判定することができる。
【００４４】
また、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子と相補的な配列の５’端に約１０塩基のランダムな配列を付加することで、ＰＣＲ増幅産物が質量分析可能な範囲外となり、一塩基伸長反応産物を特異的に検出することができる。これら増幅用プライマーや伸長用プライマーは、Assay Designer (シーケノム社)によって設計することができる。
【００４５】
また、各々のバリアントを特異的に検出できるように、増幅用プライマー及び伸長用プライマーを検討することで、マルチプレックスＰＣＲによる解析も可能である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
《実施例１：材料及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法》
１．鋳型ＤＮＡの構築
ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント１検出のための鋳型ＤＮＡとして、該バリアント１（配列番号１）全長を含むベクターであるpDNR-dual donor vector/EML4-ALKバリアント１を使用した（近畿大学医学部腫瘍内科より供与、pDNR-dual donor vectorはクロンテック社）。ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ｂ（配列番号４）検出のための鋳型ＤＮＡとして、該バリアント３ｂ全長を含むベクターであるpcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ｂを使用した（近畿大学医学部腫瘍内科より供与）。ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント２（配列番号２）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ａ（配列番号３）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント４（配列番号５）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント５ａ（配列番号６）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント５ｂ（配列番号７）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント６（配列番号８）、ＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント７（配列番号９）の検出のための鋳型ＤＮＡは、In fusionシステム（クロンテック社）を用いて、各々融合ポイントを挟む約１，０００ｂｐのＤＮＡ配列をpcDNA3.1(+)（インビトロジェン社）に導入したプラスミドを作製、使用した。
【００４８】
ＡＬＫとしては、野生型ＡＬＫを発現するヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）より抽出したＲＮＡをｃＤＮＡにリバースしたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＬＫ検出のための融合ポイントをはさむ約１，０００ｂｐのＤＮＡ配列（配列番号１０）をＴＡクローニングにより導入したプラスミドを作製、使用した。ＡＬＫ検出のための融合ポイントとは、便宜的にエクソン１９とエクソン２０が接する部位を意味する。
【００４９】
２．試料と鋳型の抽出方法
細胞株における融合遺伝子発現株および非発現株として、ヒト肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子発現株：近畿大学医学部腫瘍内科より入手）及びＮＣＩ−Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ及び３ｂ遺伝子発現株：近畿大学医学部腫瘍内科（あるいはＡＴＣＣ）より入手）、ヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ発現株：ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）を用いた。これらの細胞株は、定法に従って培養した。
【００５０】
本測定系における臨床検体の実例として、肺がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いた。ホルマリン固定パラフィン包埋切片は、定法に従って作製した。
【００５１】
細胞株からのＲＮＡ抽出にはRNeasy Plus Mini Kit（キアゲン社）、パラフィン包埋切片からのＲＮＡ抽出にはRNeasy FFPE Kit（キアゲン社）を用いた。抽出したＲＮＡは、NanoDrop2000（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により定量し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（アプライド・バイオシステムズ社）により逆転写反応を行い、鋳型ＤＮＡを調製した。調製された鋳型ＤＮＡは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５２】
３．ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出方法
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子及び野生型ＡＬＫ遺伝子の検出は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析装置を用いたＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（シーケノム社）により行った。検出対象とする遺伝子は、９種の融合遺伝子（バリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント６、及びバリアント７）並びにＡＬＫの１０種である。各バリアントの融合ポイントを含む特定領域をＰＣＲによって増幅した後、融合ポイントを含む領域に伸長用プライマーをハイブリダイズし、一塩基伸長反応を行った。一塩基伸長反応により生成されたＤＮＡ断片をマトリックスチップに塗布し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によってＤＮＡ断片の質量数から解析し、検出塩基を決定することで、測定対象の遺伝子を同定した。なお、ＡＬＫの検出のためには、融合点を含まず、融合遺伝子が有していないエクソン上（エクソン１９）にもプライマーを設計した。
【００５３】
検出反応は、iPLEX(TM) Gold（シーケノム社）を用い、プロトコールに準拠して行った。ＰＣＲ反応に用いるプライマー及び一塩基伸長反応用プライマーを表４にまとめて示す。表４に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号３２及び５６を除いて、いずれも５’端に、増幅対象塩基配列とは無関係な１０塩基からなるランダム配列が付加されている。プライマーはSigma Genosys社で合成した。表４に挙げたプライマーは、まず、Assay Designer（シーケノム社）に従って、融合点を含んで増幅可能なプライマーと、一塩基伸長反応可能なプライマーの１５０個の候補を得、次に、特異的な増幅が行えるか、及び、微量な試料でも検出可能かを検討して決定した。
【００５４】
【表４】
【００５５】
上述の測定条件において検出される塩基を表５に示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
《実施例２：プラスミドを用いた各ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアントの検出の確認》
実施例１で調製したプラスミドＤＮＡの０．１ｎｇを用いて、野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は表５に示すとおりである。
【００５８】
検出結果（各マススペクトル）を図１に示す。図１において、遺伝子名の後の小括弧内の数字は、セット名（セット１又はセット２のいずれを使用したか）を示す。また、横軸及び縦軸の記載は省略したが、横軸は質量（mass）を示し、縦軸は強度（intensity）を示す。検出塩基がＴ、Ｇ、Ｃ、Ａである場合の一例として、図１に示すALK(1)、Variant1(1)、Variant3a(1)、Variant1(2)を、それぞれ、図２〜図５に示す。各マススペクトル（右側に行くほど高質量）において、右側の２本の点線は、それぞれ、一塩基伸長した塩基の種類によって表れるピークの位置を示しており、例えば、ALK(1)ではＴ（左側）及びＡ（右側）である場合の各ピークの位置を示しており、以下、同様に、Variant1(1)ではＧ（左側）及びＣ（右側）、Variant3a(1)ではＧ（左側）及びＣ（右側）、Variant1(2)ではＴ（左側）及びＡ（右側）である場合の各ピークの位置を示している。なお、各マススペクトルの左端の点線は、一塩基伸長が起こらなかった場合に表れるピークの位置を示す。その結果、作製したプライマーを使用して、全ての測定条件で野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が同定できた。
【００５９】
《実施例３：細胞を用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出》
実施例１で調製した鋳型ｃＤＮＡの１ｎｇを用いて、野生型ＡＬＫ遺伝子およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は、ヒト肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３１２２（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子発現株）でＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子が同定可能か、ＮＣＩ−Ｈ２２２８（ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子及び３ｂ遺伝子発現株）でＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子が同定可能か、及びヒト胃がん細胞株であるＭＫＮ１（野生型ＡＬＫ遺伝子発現株）で野生型ＡＬＫ遺伝子が同定可能かである。
【００６０】
その結果、作製したプライマーセットVariant1(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント１用プライマーセットのセット２を使用して、ＮＣＩ−Ｈ３１２２においてＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント１遺伝子を同定することができた。また、Variant3a(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＥＭＬ４−ＡＬＫバリアント３ａ用プライマーセットのセット２を使用して、ＮＣＩ−Ｈ２２２８においてＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子を同定することができた。また、ALK(2)、すなわち、表４及び表５に記載のＡＬＫ用プライマーセットのセット２を使用して、ＭＫＮ１において野生型ＡＬＫ遺伝子を同定することができた。一方、ＭＫＮ１において、ＥＭＬ４−ＡＬＫ／バリアント３ａ遺伝子測定条件で該遺伝子を検出できないことを確認した。なお、セット２の代わりにセット１を用いた場合も、同様の結果が得られた。一例として、Variant3a(2)を用いてＭＫＮ１を測定した結果を、図６に示す。
【００６１】
《実施例４：臨床検体におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出》
実施例１に従って、肺がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）からｍＲＮＡを抽出し鋳型ｃＤＮＡを調製した。そのｃＤＮＡ ４ｎｇを用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が、実施例１に示した方法によって検出可能か検討した。検討した条件は以下のように、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７を検出可能な条件で行った。
【００６２】
その結果、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを検出した。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａが検出されたことより、この肺がん患者はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを保有することが同定された。
【００６３】
《実施例５：臨床検体のＰＣＲ増幅産物の配列解析》
実施例４で得られた、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの増幅反応で得られたＰＣＲ増幅産物の配列解析を行った。前記ＰＣＲ増幅産物を、TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社）によりサブクローニングし、得られた複数のシングルコロニーの挿入配列をダイレクトシークエンスにて解析した。その結果、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａと同一であった。このことから、使用した臨床検体は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを有することが確認できた。
【００６４】
《実施例６：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出感度の検討１》
実施例１に従ったＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムによるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出感度を、ＰＣＲ法と比較した。ＰＣＲの結果としてはＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの増幅工程で得られた増幅産物を使用した。ＰＣＲによる増幅産物の確認はバイオアナライザー（アジレント・テクノロジー）で行った。
【００６５】
プラスミド（pcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ａ）ＤＮＡ １ｎｇ、ＮＣＩ−Ｈ２２２８ ＤＮＡ ４ｎｇ、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）ＤＮＡ １０ｎｇを使用し、ＰＣＲ増幅法でもＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａが検出できた。ＰＣＲ増幅法の結果を図７に、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの結果を図８に、それぞれ示す。ＰＣＲ増幅法は、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムはホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を示した。
【００６６】
次に、プラスミド（pcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント３ａ）ＤＮＡ ０．１ｎｇ、ＮＣＩ−Ｈ２２２８ ＤＮＡ ０．４ｎｇ、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）ＤＮＡ １ｎｇでも同じように検討した。その結果、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）を使用したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出は、ＰＣＲ増幅法では確認できなかったが、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムでは検出された。ＰＣＲ増幅法の結果を図９に、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムの結果を図１０に、それぞれ示す。ＰＣＲ増幅法は、プラスミド、細胞株（Ｈ２２２８）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムはホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）の結果を示した。
【００６７】
ホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）は比較的入手しやすい臨床検体であるが、採取量はわずかであり貴重な試料である。以上より、微量な試料を対象とした場合にも、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムを使用することにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出可能となった。
【００６８】
《実施例７：ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子の検出感度の検討２》
臨床検体では、多量の正常細胞中に微量の異常細胞が混合している状態で存在している。そのような共雑物が混合している場合でも、目的のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子が検出可能か検討した。
【００６９】
実施例３と同様に、細胞株中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを検出可能か検討した。具体的には、ＭＫＮ１とＮＣＩ−Ｈ２２２８の鋳型ＤＮＡを０：１（ｗ／ｗ）、１：０（ｗ／ｗ）、１：１（ｗ／ｗ）、９：１（ｗ／ｗ）、９９：１（ｗ／ｗ）の比率で混合し、その合計４ｎｇを使用してＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａの検出を検討した。
【００７０】
その結果、いずれの条件でもＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子バリアント３ａを明確に検出することができた。このことから、この本方法によって、精度良くＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出可能なことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
肺癌患者から比較的入手可能なパラフィン包埋切片において、高感度且つ高精度に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１、バリアント２、バリアント３ａ、バリアント３ｂ、バリアント４、バリアント５ａ、バリアント５ｂ、バリアント６、バリアント７の存在を検出することが可能となり、迅速且つ正確にＡＬＫ阻害剤の有効性を診断することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列表の配列番号１１〜６４の各配列で表される塩基配列は、プライマー配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、
（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法。
【請求項３】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法。
【請求項４】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法。
【請求項５】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法。
【請求項６】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法。
【請求項７】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法。
【請求項８】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法。
【請求項９】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法。
【請求項１０】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法。
【請求項１１】
（ａ）融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
（ｂ）前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法。
【請求項１２】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１３及び／又は配列番号１６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法。
【請求項１３】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１９及び／又は配列番号２２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法。
【請求項１４】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号２５及び／又は配列番号２８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法。
【請求項１５】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３１及び／又は配列番号３４であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法。
【請求項１６】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３７及び／又は配列番号４０であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法。
【請求項１７】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４３及び／又は配列番号４６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法。
【請求項１８】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４９であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法。
【請求項１９】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法。
【請求項２０】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５５及び／又は配列番号５８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法。
【請求項２１】
配列番号１１と１２の組合せ、配列番号１４と１５の組合せ、配列番号１７と１８の組合せ、配列番号２０と２１の組合せ、配列番号２３と２４の組合せ、配列番号２６と２７の組合せ、配列番号２９と３０の組合せ、配列番号３２と３３の組合せ、配列番号３５と３６の組合せ、配列番号３８と３９の組合せ、配列番号４１と４２の組合せ、配列番号４４と４５の組合せ、配列番号４７と４８の組合せ、配列番号５０と５１の組合せ、配列番号５３と５４の組合せ、配列番号５６と５７の組合せから選択される、プライマーセット。
【請求項１】
（Ａ）試料から鋳型ＤＮＡを調製する工程、
（Ｂ）前記鋳型ＤＮＡに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法。
【請求項３】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法。
【請求項４】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法。
【請求項５】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法。
【請求項６】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法。
【請求項７】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法。
【請求項８】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法。
【請求項９】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法。
【請求項１０】
前記［１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法。
【請求項１１】
（ａ）融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号１１と配列番号１５の組合せ、配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せ、配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せ、配列番号３２と配列番号３３の組合せ、配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せ、配列番号４１と配列番号４５の組合せ、配列番号４７と配列番号４８の組合せ、配列番号５０と配列番号５１の組合せ、配列番号５６と配列番号５４の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
（ｂ）前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法。
【請求項１２】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号１１と配列番号１５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１３及び／又は配列番号１６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント１を検出する方法。
【請求項１３】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２０と配列番号１８又は２１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号１９及び／又は配列番号２２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント２を検出する方法。
【請求項１４】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号２３又は２６と配列番号２４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号２５及び／又は配列番号２８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａを検出する方法。
【請求項１５】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３２と配列番号３３の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３１及び／又は配列番号３４であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ｂを検出する方法。
【請求項１６】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号３５又は３８と配列番号３６又は３９の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号３７及び／又は配列番号４０であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント４を検出する方法。
【請求項１７】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４１と配列番号４５の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４３及び／又は配列番号４６であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ａを検出する方法。
【請求項１８】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号４７と配列番号４８の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号４９であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント５ｂを検出する方法。
【請求項１９】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５０と配列番号５１の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５２であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント６を検出する方法。
【請求項２０】
前記［１１］の方法において、増幅用プライマーが配列番号５６と配列番号５４の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号５５及び／又は配列番号５８であるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント７を検出する方法。
【請求項２１】
配列番号１１と１２の組合せ、配列番号１４と１５の組合せ、配列番号１７と１８の組合せ、配列番号２０と２１の組合せ、配列番号２３と２４の組合せ、配列番号２６と２７の組合せ、配列番号２９と３０の組合せ、配列番号３２と３３の組合せ、配列番号３５と３６の組合せ、配列番号３８と３９の組合せ、配列番号４１と４２の組合せ、配列番号４４と４５の組合せ、配列番号４７と４８の組合せ、配列番号５０と５１の組合せ、配列番号５３と５４の組合せ、配列番号５６と５７の組合せから選択される、プライマーセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図７】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
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【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図７】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１００６２８（Ｐ２０１２−１００６２８Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５４１７９（Ｐ２０１０−２５４１７９）
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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