Ｆｃ融合タンパク質を精製する方法
本発明は、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを介してＦｃ融合タンパク質を精製する方法、具体的には、Ｆｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分の量を低減する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野にある。より具体的には、本発明は、特にＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分の量を、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを介して低減するために、前記製剤を精製することに関する。Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、好ましくは、青色アフィニティ樹脂に結合することができる融合タンパク質であり、より好ましくはＦｃ領域に融合されるＩＦＮ−βを含む融合タンパク質である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、一般に「生物学的製剤（biologicals）」と呼ばれる薬物として商業的に重要になってきている。最大の難関の１つは、商業的規模でタンパク質を精製するための、コスト効果がありしかも効率的なプロセスの開発である。タンパク質の大規模調製のために多くの方法が現在利用可能ではあるものの、粗生成物、例えば細胞培養上澄みは、所期生成物を含有するだけでなく、不純分をも含有する。これらの不純物は所期生成物から分離するのが難しい。組み換えタンパク質生成物を発現させる細胞の細胞培養上澄みは、細胞が無血清培地中で成長させられる場合には、含有する不純物がより少ない場合があるが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）は、精製過程中にまだ排除されないままである。加えて、保健当局は、ヒトの投与のために意図されたタンパク質に対して高い純度基準を要求している。
【０００３】
タンパク質精製のために幅広く用いられる数多くのクロマトグラフィ法が知られている。アフィニティ・クロマトグラフィなどのような方法が幅広く用いられている。
【０００４】
アフィニティ・クロマトグラフィは、クロマトグラフィ樹脂に対して固定化された別のタンパク質に対する当該タンパク質の親和性に基づいている。このような固定化されたリガンドの例は、特定の免疫グロブリン（Ｉｇｓ）のＦｃ部分に対する特異性を有する細菌細胞壁タンパク質であるタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇである。両タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇは、ＩｇＧ抗体に対して強力な親和性を有しているが、しかし、他の免疫グロブリン・クラス並びにイソタイプに対する親和性は様々である。
【０００５】
青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、マトリックス（例えばセファロース又はアガロース）に結合された色素リガンドCibacron Blueに基づいている。Blue Sepharose樹脂において、リガンドCibacron Blue F3G-Aは、クロロトリアジン環を通してsepharose（登録商標）に共有結合されている（Vlatakis G他、1987）。Blue Sepharoseは、インターフェロン・ベータ（Knight E Jr及びFahey, 1981）及びアルブミンを精製するために使用されている。商業的に利用可能な青色色素アフィニティ・マトリックスの例は、Blue Sepharose 6FF樹脂（GE Healthcare）、Blue Separose CL-6B（GE Healthcare）、Blue Trisacryl M (Pall/BioSepra）、Affi-Gel Blue (Bio-Rad)及びToyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience）又はCibacron Blue F3GA (Polysciences Inc.)を含む。
【０００６】
主として電荷の相違に基づいてタンパク質を分離するために、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）システムが用いられる。
【０００７】
陰イオン交換体は、弱又は強として分類することができる。弱陰イオン交換体上の電荷基は、弱塩基であり、弱塩基は脱プロトン化されるようになり、ひいては、高ｐＨでその電荷を失う。ＤＥＡＥ−セファロースが弱陰イオン交換体の一例であり、ここでは、アミノ基はほぼｐＨ９未満で正荷電することができ、ｐＨ値が高くなるとその電荷を徐々に失う。例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、対イオンとして塩化物を有している。他方において強陰イオン交換体は、強塩基を含有しており、強塩基は、イオン交換クロマトグラフィのために通常用いられるｐＨ範囲（ｐＨ１〜１４）全体を通して依然として正荷電される。Ｑ−セファロース（Ｑは第四アンモニウムを意味する）が、強陰イオン交換体の一例である。
【０００８】
陽イオン交換体も、弱又は強として分類することができる。強陽イオン交換体は、ｐＨ１〜１４において依然として荷電される強酸（例えばスルホプロピル基）を含有しているのに対して、弱陽イオン交換体は弱酸（例えばカルボキシメチル基）を含有し、この弱酸は、ｐＨが４又は５未満に低下するにつれて、その電荷を徐々に失う。例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）及びスルホプロピル（ＳＰ）は、対イオンとしてナトリウムを有している。
【０００９】
タンパク質の疎水性部分と、マトリックス上の不溶性の固定化疎水性基との疎水性相互作用に基づいてタンパク質を分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）が用いられる。一般に、高塩濃度緩衝剤中のタンパク質製剤が、ＨＩＣカラム上にローディングされる。緩衝剤中の塩は、溶液中のタンパク質の溶媒和を低減するように水分子と相互作用し、これにより、タンパク質中の疎水性領域を曝露し、次いでこの疎水性領域は、マトリックス上の疎水性基によって吸着される。分子が疎水性になればなるほど、結合を促進するのに必要とされる塩は少なくなる。通常、カラムからタンパク質を溶出するために、塩勾配の減少が用いられる。イオン強度が減少するのに伴って、タンパク質の親水性領域の曝露は増大し、そして疎水性が増大する順にタンパク質がカラムから溶出する。
【００１０】
Ｆｃ融合タンパク質は、しばしば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたタンパク質又はその生物活性ドメインを含むキメラ・タンパク質である。免疫グロブリンのＦｃフラグメントとも呼ばれるＦｃ領域は、ヒンジ領域（Ｈ）と抗体重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）ドメインを含む２つの同一のアームから成っている。Ｆｃ融合タンパク質は治療薬として幅広く使用される。それというのもこれらは、Ｆｃ領域によって与えられた利点をもたらすからである。これらの利点は、例えば次の通りである：
− ＩｇＧイソタイプに従って変化する親和性を有するタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティ・クロマトグラフィを用いて精製することが可能である。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４はタンパク質Ａに強く結合し、そしてＩｇＧ３を含む全てのヒトＩｇＧはタンパク質Ｇに強く結合する；
− Ｆｃ領域が、リソソーム分解から防御するサルベージ受容体ＦｃＲｎに結合するので、循環系における半減期が増大する；
− Ｆｃ融合タンパク質の医学的用途に応じて、Ｆｃエフェクタ機能が望ましいことがある。このようなエフェクタ機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃｙＲｓ）との相互作用を介した抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及び相補成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に結合することによる補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を含む。ＩｇＧイソフォームは、種々異なるレベルのエフェクタ機能を発揮する。一般には、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は強いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有するのに対して、ヒトＩｇＧ２は弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有する。ヒトＩｇＧ４は、弱いＡＤＣＣを示し、またＣＤＣ効果を示さない傾向がある。
【００１１】
血清半減期及びエフェクタ機能は、Ｆｃ融合タンパク質のために意図された治療用途に応じて、それぞれＦｃＲｎ、ＦｃｙＲｓ及びＣ１ｑとのＦｃ領域の結合を増減するように、Ｆｃ領域を工学的に作成することによって調節することができる。
【００１２】
ＡＤＣＣの場合、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクタ細胞、例えばナチュラル・キラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｙＲｓ）に結合し、ターゲット細胞の食作用又は溶解をもたらす。
【００１３】
ＣＤＣにおいて、抗体は、細胞表面で補体カスケードをトリガーすることにより、ターゲット細胞を殺す。ＩｇＧイソフォームは、ＩｇＧ４ < ＩｇＧ２ < ＩｇＧ１ ≦ ＩｇＧ３の順序で増大する種々異なるエフェクタ・レベルを発揮する。ヒトＩｇＧ１は、高いＡＤＣＣ及びＣＤＣを示し、そして、病原体及び癌細胞に対する治療用途に最も適している。
【００１４】
或る環境下において、例えばターゲット細胞の枯渇が望ましくないときには、エフェクタ機能の無効化が必要となる。対照的に、腫瘍用途のために意図されたＦｃ融合タンパク質の場合、エフェクタ機能の増大が、治療活性を改善することができる（Carter他, 2006）。
【００１５】
ＦｃｙＲｓ又は補体因子の結合を改善又は低減するようにＦｃ領域を工学的に作成することにより、エフェクタ機能を修飾することができる。
【００１６】
ＩｇＧと、活性化（ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩａ、ＦｃｙＲＩＩＩａ、及びＦｃｙＲＩＩＩｂ）及び阻害（ＦｃｙＲＩＩｂ）ＦｃｙＲｓ又は補体の第１成分（ｃ１ｑ）との結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン内に配置された残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域が、ＦｃｙＲｓ及び補体ｃ１ｑの結合にとって重要であり、またＩｇＧ２及びＩｇＧ４において固有の配列を有している。例えばKabat他によって定義されたＥＵインデックス・ポジション（Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S.,及びFoeller, C. (1991)）に基づく位置２３３〜２３６におけるＩｇＧ２残基をヒトＩｇＧ１へ置換すると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減した（Armour他 1999及びShields他 2001）。
【００１７】
ＩｇＧのＣＨ２ドメイン内に数多くの突然変異形が形成されており、これらのＡＤＣＣ及びＣＤＣに対する効果がin vitroで試験された（Shields他, 2001, Idusogie他, 2001及び2000, Steurer他, 1995）。具体的には、突然変異形Ｅ３３３Ａは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増大させることが報告された（Idusogie他, 2001及び2000）。
【００１８】
治療用Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増大させることは、その効力を改善するための別の方法であり、より高い循環レベル、より低い頻度の投与、及び低減された投与量を可能にする。このことは、Ｆｃ領域の、新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）との結合を促進することにより達成することができる。内皮細胞の表面上に発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存の形でＩｇＧと結合し、これを分解から保護する。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の界面に配置されたいくつかの突然変異形は、ＩｇＧ１の半減期を増大することが判っている（Hinton他, 2004及びVaccaro他, 2005）。
【００１９】
下記表１は、ＩｇＧ Ｆｃ領域のいくつかの周知の突然変異形を要約する（Invivogenのウェブサイトから採用）：
【表１】
【００２０】
治療上の有用性を有する１クラスのＦｃ融合タンパク質において、Ｆｃ領域は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーに属する特定の受容体の細胞外ドメインに融合されている（Locksley他, 2001, Bodmer他, 2002, Bossen他, 2006）。ＴＮＦＲファミリーの員の特質は、例えばNaismith及びSprang, 1998によって記載されているように、細胞外ドメイン内のシステイン豊富な擬似反復の存在である。
【００２１】
Ｆｃ融合タンパク質の別の例は、単一インターフェロン・ベータ・タンパク質に結合されたＦｃ領域から成っている。インターフェロン・ベータ（インターフェロンβ、ＩＦＮ−ベータ又はＩＦＮ−β）が、サイトカインのクラスに属する自然発生型の可溶性糖タンパク質である。インターフェロン（ＩＦＮ）は、広範囲の生物活性、例えば抗ウィルス、抗増殖、及び免疫調節特性を有している。インターフェロン・ベータは、数多くの疾患、例えば多発性硬化症、癌、又はウィルス疾患（例えばＳＡＲＳ又はＣ型肝炎ウィルス感染症）における治療用タンパク質薬物、いわゆる生物学的製剤（バイオロジカル）として使用される。
【００２２】
ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合された生物活性分子としてＩＦＮ−βを含有する融合タンパク質が国際公開第２００５／００１０２５号パンフレットに記載されている。
【００２３】
Ｆｃ融合タンパク質の治療上の有用性を考えると、ヒトへの投与に適した有意な量の精製済タンパク質が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
互いに結合された２つの異なるサブユニットから成るタンパク質（例えばＦｃ領域のアームに融合された単一タンパク質）が生成された結果、少なくとも３つの異なる種、すなわち２つのホモ二量体（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム及び単一タンパク質−Ｆｃアーム／単一タンパク質−Ｆｃアーム）及び１つのヘテロ二量体（例えばＦｃアーム／単一タンパク質−Ｆｃアーム）が形成される。
【００２５】
従って、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（すなわちＦｃ領域のアームに融合された単一タンパク質）の生成中に直面するおそれのある問題の１つは、当該任意のタンパク質に結合されないＦｃ領域の発現から生じる、又は当該タンパク質、具体的にはＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質のタンパク質分解的切断から生じる多量の「遊離Ｆｃ部分」、すなわちＦｃアームの二量体（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム・ホモ二量体）が発生することである。
【００２６】
本発明の目的は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の生成に際して主要な汚染物質を形成する前記遊離Ｆｃ部分を排除することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、Ｆｃ融合タンパク質の流体、組成物、又は製剤から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を精製し、これにより、存在する遊離Ｆｃ部分の量が低減される、精製方法の開発に基づいている。
【００２８】
本発明は従って、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質を精製する際に遊離Ｆｃ部分の濃度を低減する方法に関し、この方法は、前記製剤に、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを施し、そしてｐＨ約８．４〜約８．９で樹脂を洗浄することにより、遊離Ｆｃ部分を排除することを含む。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分を低減するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを用いることに関する。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有し、そして総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である精製済Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００３１】
第４の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するための方法に関する。この態様において、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、青色色素アフィニティ樹脂に結合することができ、そして、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが先行し、且つ／又は、引き続き、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップが行われる。好ましくは、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βである。
【００３２】
第５の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとを用いることに関する。
【００３３】
本発明の第６の態様は、本発明による方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、好ましくはＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βに関する。
【００３４】
本発明の第７の態様は、本発明による方法によって精製された、突然変異Ｆｃ領域であるＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、例１のステップ２において記載された青色セファロース・クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄１、４−洗浄２、５−溶出。
【図２】図２は、例１のステップ２からのロード（図２Ａ）、洗浄２（図２Ｂ）、及び溶出液（図２Ｃ）画分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析スペクトルを示す。ここでピーク（ａ）は遊離Ｆｃを、ピーク（ｂ）はＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを、そしてピーク（ｃ）はＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを表す。
【図３】図３は、例１のステップ４において記載された陽イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄、４−洗浄２、５−再生、６−浄化。
【図４】図４は、例１のステップ５において記載された疎水性相互作用クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄１、４−再生、５−浄化。
【００３６】
配列リストの簡単な説明
配列番号１は、ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔアミノ酸配列である。アミノ酸１〜１６６は、成熟ヒトインターフェロン・ベータを表し、そしてアミノ酸１６７〜３９３は、突然変異ヒト免疫グロブリン・ガンマ重鎖配列の一部を表す。
配列番号２は、配列番号１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号３は、ＩＦＮβ−Ｆｃアーム・アミノ酸配列である。アミノ酸１〜２１は、ＩＦＮ−βシグナル・ペプチドを表し、残基２２〜１８７は成熟ＩＦＮ−βを表し、残基１８８〜１９５はリンカー配列を表し、そして残基１９６〜４２２は、ヒト免疫グロブリン重鎖の一部を表す。
配列番号４は、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
互いに結合された２つの異なるサブユニットから成るタンパク質が生成された結果、少なくとも３つの異なる種、すなわち２つのホモ二量体及び１つのヘテロ二量体が形成される。例えば、ＩＦＮβ−Ｆｃ融合タンパク質を生成する時には、少なくとも以下の種が形成される：Ｆｃアーム／Ｆｃアーム二量体（ホモ二量体）、ＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム（ホモ二量体）及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム（ヘテロ二量体）。
【００３８】
Ｆｃ融合タンパク質の組成物（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）が望まれる場合には、総量のうちの３０％に達することもある遊離Ｆｃ部分（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム二量体）の濃度は低減されなければならない。
【００３９】
本発明は、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが、青色色素アフィニティ樹脂に結合するＦｃ融合タンパク質の流体又は組成物中に存在し得る遊離Ｆｃ部分の量または程度を効率に低減し、これによりＦｃ融合タンパク質の純度を増大させる好都合且つシンプルな方法を提供することである。
【００４０】
従って、本発明の第１の態様は、Ｆｃ融合タンパク質を含む流体中に存在する遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤を精製する方法であって、該方法が：
（ａ） 青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂上に前記流体をローディングし；
（ｂ） ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で該樹脂を洗浄し、これにより、該遊離Ｆｃ部分を該樹脂から排除し；そして
（ｃ） 該Ｆｃ融合タンパク質を該樹脂から溶出する
ステップを含む、方法に関する。
【００４１】
Ｆｃ融合タンパク質は、青色色素アフィニティ樹脂及び青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる。
【００４２】
Ｆｃ融合タンパク質を含む流体は、任意の組成物又は製剤、例えばヒト又は動物に由来する体液、又は細胞培養に由来する流体、例えば細胞培養上澄み又は細胞培養採取物であってよい。流体は、別の精製ステップから誘導された流体、例えば捕捉ステップ、又は青色セファロース・クロマトグラフィに先立つ任意の他の好適な精製ステップから生じた溶出液又は貫流液、例えばタンパク質Ａクロマトグラフィの溶出液であってもよい。
【００４３】
流体は好ましくは、細胞培養物質、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上澄みであってよい。本明細書中に使用される「細胞培養上澄み」という用語は、細胞が培養される培地、及びタンパク質が適宜の細胞信号、いわゆるシグナル・ペプチドを含有することを条件としてタンパク質が分泌される培地を意味する。細胞を発現させるＦｃ融合タンパク質が無血清培養条件下で培養されることが好ましい。従って、細胞培養上澄みには動物由来の成分が欠けていることが好ましい。最も好ましくは、細胞培養培地は化学的に定義された培地である。
【００４４】
本明細書中、Ｆｃ領域は、Ｆｃフラグメント又はＦｃドメインを意味することがある。本明細書中、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」又は「Ｆｃドメイン」は相互に置き換え可能であり、同じ意味を有するものとして解釈されるべきである。
【００４５】
本明細書中に使用される「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）という用語は、非免疫グロブリン・タンパク質（例えばＩＦＮ−β）を含む融合タンパク質を包含するものとする。非免疫グロブリン・タンパク質は本明細書中では、Ｆｃ領域由来部分（本明細書中では「Ｆｃ部分」と呼ぶ）の１つのアームだけに結合された「治療部分」（疾患の治療が意図されているかいないかとは関係なく）と呼ぶ。
【００４６】
本明細書中に使用する「Ｆｃ融合タンパク質」は、「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」と、融合タンパク質とを含む。融合タンパク質では、治療部分が非免疫グロブリン・タンパク質の２つのコピーから成っており、コピーのそれぞれがＦｃ部分のアームに結合されている（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）。本発明に従って精製されるべきＦｃ融合タンパク質は、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合する。
【００４７】
本明細書中に使用される「Ｆｃ部分」という用語は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせ、そして好ましくはヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから選択された、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメイン、好ましくはヒト定常領域の二量体を意味する。免疫グロブリン定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はこれらの組み合わせ又はイソタイプに由来していてよい。好ましくは、これはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。より好ましくは、これはＩｇＧ１である。
【００４８】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分は、エフェクタ機能を調節するために修飾されてもよい。
【００４９】
例えば、Ｆｃ部分がＩｇＧ１に由来する場合、ＥＵインデックス・ポジション（Kabat他, 1991）に従って、下記Ｆｃ突然変異形を導入することができる：
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P331S
E333A;K322A。
【００５０】
治療Ｆｃ融合タンパク質、すなわち、動物の疾患の治療又は予防のために、又は好ましくはヒトの治療又はヒトへの投与のために意図されたＦｃ融合タンパク質が、本発明による精製に特に適している。
【００５１】
青色色素アフィニティ樹脂と結合するいかなるＦｃ融合タンパク質も、本発明にしたがって精製することができる。
【００５２】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＰＤＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８結合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、又はＴＮＦ−ベータであるか、又はこれに由来していてよい。
【００５３】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、受容体、例えば膜貫通受容体に由来していてもよく、具体的には、受容体の細胞外ドメイン、及び所与の受容体の細胞外部分又は細胞外ドメインのリガンド結合フラグメントであるか、又はこれに由来していてよい。治療上興味深い受容体の例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７ＲＢ（ＩＬ−１７ＲＨ１）、ＩＬ−１７ＲＣ（ＩＬ−１７ＲＬ）、ＩＬ−１７ＲＤ（ｈＳＥＦ）、又はＩＬ−１７ＲＥ）、ＩＬ−１８受容体サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ−アルファ、ＩＬ−１８Ｒ−ベータ）、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリン アルファ４ １０ ベータ７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内付着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔ関連抗原である）、Ｆｃ−ガンマ−Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチンである。
【００５４】
上記定義に従って、本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体及びホモ二量体を含有していてよい。「ホモ二量体」は、単一非免疫グロブリン・タンパク質の２つのコピーを含み、これらのコピーのそれぞれがＦｃ部分のアームに結合されている（例えば２つのＩｇＧジスルフィド架橋ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームの二量体）。「ヘテロ二量体」又は「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」は、唯１つのアームが単一非免疫グロブリン・タンパク質に融合されているＦｃ部分を含む。
【００５５】
好ましくは、前記ヘテロ二量体は、２つのＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームのうちの１つに結合された単一ＩＦＮ−βを含む（例えば国際公開第２００５／００１０２５号パンフレット及び配列番号３）。２つのサブユニット、つまり単一ＩＦＮ−βタンパク質に結合された突然変異ＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームを含む第１サブユニット（すなわちＩＦＮβ−Ｆｃ ｍｕｔ、配列番号１のアミノ酸配列に対応）と、突然変異ＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームを含む第２サブユニット（すなわちＦｃ ｍｕｔ、配列番号１のアミノ酸残基１６７〜３９３に対応）とを含有するヘテロ二量体も本発明に照らして好ましいものである。従って、本発明によれば、好ましくは
（ａ） 配列番号１又は３；
（ｂ） 高緊縮条件下で配列番号２又は４の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；及び
（ｃ） （ａ）のポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも８０％又は８５％又は９０％又は９５％である（ａ）の突然変異タンパク質
から選択されたポリペプチドを含むＦｃ部分に融合された単一ＩＦＮ−βが、本発明の方法に従った精製に適している。
【００５６】
このような、Ｆｃ部分に融合された単一ＩＦＮ−βを、本発明の枠内で、概ねＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームと呼ぶ。
【００５７】
本発明に照らしてさらに別の好ましいＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームは、配列番号３の突然変異形Ｎ２７２Ａに対応する、ＥＵインデックス・ポジションに基づく突然変異形Ｎ２９７Ａを含む。
【００５８】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくはＦｃ融合タンパク質組成物の総タンパク質濃度の少なくとも５％未満、２％未満、又は１％未満まで、遊離Ｆｃ部分を低減、減少、又は排除するために、色素アフィニティ・クロマトグラフィを施される。
【００５９】
本明細書中に使用される「遊離Ｆｃ部分」又は単に「遊離Ｆｃ」という用語は、本発明に従って精製されるべきＦｃ融合タンパク質の任意の部分であって、治療部分に由来する完全な更なるドメイン又は完全な配列を含まないＦｃ部分に相当するか又は由来するものを包含するものとする。遊離Ｆｃは例えば、治療部分の重要な部分には結合されていない、ＩｇＧヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの二量体を含有していてよい。
【００６０】
Ｆｃ部分に由来する単量体が、遊離Ｆｃ画分中に含有されていてもよい。言うまでもなく、遊離Ｆｃは、治療部分からの数多くのアミノ酸残基をまだ含有していてよく、例えば治療部分に属するアミノ酸が、例えば１〜５０個、１〜２０個、又は１〜１０個、又は１〜５個、又は１つの単一アミノ酸がＦｃ部分にまだ融合されていてもよい。
【００６１】
本発明によれば、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、任意の好適な樹脂上で実施することができる。好ましくは樹脂は、Cibacron Blue F3G-Aリガンドを含む。好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、Blue Sepharose樹脂上で行われる。Blue Sepharose 6FF (GE Healthcare)という名称で商業的に利用可能な樹脂は、本発明の方法のステップ（ａ）に特に適したアフィニティ樹脂の一例である。Blue Sepharose FFの技術的特徴は次の通りである：
【表２】
【００６２】
他の好適な商業的に利用可能な青色色素アフィニティ・カラムは、Blue Sepharose CL-6B (GE Healthcare)、Blue Trisacryl M (Pall/BioSepra)、Affi-Gel Blue (Bio-Rad)、Econo-Pac ブルーカートリッジ(Bio-Rad)、SwellGel Blue (Pierce）、及びToyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience）又はCibacron Blue F3G-A (Polysciences Inc.)から選択される。
【００６３】
本発明の精製方法のステップ（ａ）において、Ｆｃ融合タンパク質を含む流体を青色色素樹脂上にローディングする前に、流体を好ましくは、６未満、好ましくは約４．５のｐＨに調節するか、或いは、必要な場合には約ｐＨ５で約２０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率まで水で希釈する。このことは、Ｆｃ融合タンパク質が青色色素樹脂に結合するのを可能にする。
【００６４】
本発明の方法のステップ（ｂ）において、ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で遊離Ｆｃ部分を青色色素樹脂から洗浄する。ｐＨは例えば約８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、又は約８．９であってよい。
【００６５】
ステップ（ｂ）において、任意の好適な緩衝剤（例えば酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を使用して、遊離Ｆｃ部分を青色色素アフィニティ樹脂から洗い落とす。８．７±０．２又は８．７±０．１のｐＨの酢酸アンモニウム緩衝剤が好ましい。
【００６６】
更なる好ましい実施態様の場合、ｐＨ約８．７のイソクラチック塩濃度４０〜１００ｍＭで、遊離Ｆｃ部分を青色セファロース・カラムから洗い落とす。イソクラチック塩濃度は、例えば４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｍＭの、ｐＨ約８．６〜約８．８の酢酸アンモニウムであってよい。これは好ましくは、ｐＨ約８．７±０．１の５０ｍＭ酢酸アンモニウムである。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤が、好ましくはｐＨ８．５の濃度５０ｍＭで使用されてもよい。
【００６７】
本発明の方法のステップ（ｃ）において、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・カラムからＦｃ融合タンパク質を溶出する。
【００６８】
ステップ（ｃ）においてＦｃ融合タンパク質を青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・カラムから溶出することは、ｐＨ約８．３〜８．７の緩衝剤中で行われる。好ましい実施態様の場合、溶出は、ｐＨを調節するためにアンモニアが添加された酢酸アンモニア、ＮａＣｌ、プロピレングリコールを含む緩衝剤中で実施される。１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、及び４０％〜５０％の濃度でプロピレングリコールが使用されることが好ましい。好適な緩衝剤濃度は、例えば約２５ｍＭ又は約５０ｍＭ又は約１００ｍＭ又は約１５０ｍＭ又は約２００ｍＭ又は約２５０ｍＭから選択される。
【００６９】
極めて好ましい実施態様の場合、本発明の方法は、Ｆｃ融合タンパク質の精製スキームの第２ステップとして用いられ、この場合、青色セファロース樹脂上にステップ（ａ）においてローディングされた流体は、前記Ｆｃ融合タンパク質を含む流体に対して最初に施されたタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティ・クロマトグラフィの溶出液である。流体は好ましくは、細胞培養物質、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上澄みであってよい。
【００７０】
タンパク質Ａ又はＧアフィニティ・クロマトグラフィは好ましくは捕捉ステップとして用いられ、ひいては、Ｆｃ融合タンパク質の調製のため、具体的には宿主細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）及びＦｃ融合タンパク質凝集体の排除のため、そしてＦｃ融合タンパク質製剤の濃縮のために役立つ。
【００７１】
MabSelect Xtra (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能なカラムは、捕捉ステップに特に適したアフィニティ樹脂の一例である。
【００７２】
本発明によれば、ステップ（ｃ）の青色セファロース・クロマトグラフィの溶出液は次いで、例えば下にさらに詳述するように、更なる精製のために使用することができる。
【００７３】
本発明の好ましい実施態様の場合、ステップ（ａ）は、パッキングされた青色色素アフィニティ樹脂１リットル当たり４０ｇのＦｃ融合タンパク質の最大動的容量で、青色セファロース樹脂をローディングすることを含む。
【００７４】
加えて、本発明の青色セファロース・クロマトグラフィは、遊離Ｆｃ部分のレベルを、約５％未満又は約２％未満又は約１％未満の遊離Ｆｃ部分に低減する。
従って、本発明の青色セファロース・クロマトグラフィ・ステップは、遊離Ｆｃ部分のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された検出レベル未満に低減する。従って、本発明の好ましい実施態様の場合、青色色素クロマトグラフィの溶出液は、１μｇのＦｃ融合タンパク質をローディングしたときに、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によっては検出することができない遊離Ｆｃ部分レベルを有している。
【００７５】
本発明の第２の態様は、Ｆｃ融合タンパク質、具体的には青色色素アフィニティ樹脂に結合することができるＦｃ融合タンパク質、及び具体的にはＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質、例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームを含む組成物中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低減するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを用いることに関する。好ましくは、青色色素樹脂は、青色セファロース樹脂である。
【００７６】
本発明の第３の態様は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有し、そして総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である精製済Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００７７】
本発明の第４の態様は、Ｆｃ融合タンパク質製剤（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）及び遊離Ｆｃ部分（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム二量体）から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を分離するための方法に関する。このプロセスにおいて、好ましくは、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィから選択された１又は複数の追加的なステップを有する精製方法において、青色色素アフィニティ・セファロース・クロマトグラフィが用いられてよい。精製ステップのうちの１又は複数の間に、濾過ステップ、例えばナノ濾過、又は限外濾過を用いることができる。
【００７８】
１実施態様の場合、精製されるべき、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームを含有する流体（すなわちＦｃ融合タンパク質製剤）に、例えばタンパク質Ａ上で最初の捕捉ステップを施す。次いで捕捉ステップの溶出液を、本発明に従って、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ上に適用することができる。
【００７９】
Ｆｃ融合タンパク質と濃度が低減された遊離Ｆｃ部分とを含む青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの溶出液に、次いで、更なるクロマトグラフィ・ステップ、例えば陽イオン交換クロマトグラフィを施し、続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィを施すことができる（例えば例１）。
【００８０】
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィにおいて使用される樹脂は、強陽イオン交換樹脂である。Fractogel SO3- (Merck)の名称で商業的に入手可能なカラムは、本発明の方法との関連において特に好適な陽イオン交換樹脂の一例である。
【００８１】
好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・ステップからの溶出液を、陽イオン交換樹脂上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析する。ローディング前に、陽イオン交換カラムを好ましくは、適切な平衡化緩衝剤で平衡化する。適切な平衡化／洗浄緩衝剤は、例えば、ｐＨ５．０±０．５、導電率７．５±０．５ｍＳ／ｃｍの酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ５．０±０．２、導電率７．５±０．２ｍＳ／ｃｍの酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ緩衝剤である。
【００８２】
陽イオン交換樹脂を、平衡化／洗浄緩衝剤で洗浄し、そして次いで、例えばｐＨ７．０±０．５、導電率１６±１ｍＳ／ｃｍの３５ｍＭ〜４５ｍＭのリン酸ナトリウム及び５０〜１５０ｍＭのＫＣｌの緩衝剤で、陽イオン交換樹脂からＦｃ融合タンパク質を溶出する。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ７．０±０．１、導電率１６±０．５ｍＳ／ｃｍの４０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００ｍＭのＫＣｌの緩衝剤である。
【００８３】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を主に含有する、陽イオン交換クロマトグラフィ・ステップからの溶出液に、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィを施す。疎水性相互作用クロマトグラフィは、任意の好適な樹脂上で実施することができる。PPG-600M (Tosoh)の名称で商業的に入手可能な樹脂が、本発明による疎水性相互作用クロマトグラフィ・ステップに特に適した樹脂である。
【００８４】
疎水性相互作用クロマトグラフィ・カラムを好ましくは、適切な平衡化緩衝剤で平衡化する。
【００８５】
陽イオン交換クロマトグラフィからの溶出液を、疎水性交換カラム上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析することができる。ローディング前に疎水性交換カラムの溶出液に、硫酸アンモニアを添加することが好ましい。
【００８６】
ローディング後、カラムを適切な洗浄緩衝剤で洗浄し、そしてＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を、貫流液中で捕集する。貫流液は好ましくは、２８０ｎｍにおける吸光ピークの主な上昇が現れたとき、そして洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで捕集する。
【００８７】
適切な平衡化／洗浄緩衝剤は、例えば、ｐＨ６．８±０．８、導電率５．３±８ｍＳ／ｃｍの３５ｍＭ〜４５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１〜０．８Ｍの硫酸アンモニウムの緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ６．８±０．２、導電率５．３±２ｍＳ／ｃｍの４０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム緩衝剤である。
【００８８】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を含む貫流液には、ナノ濾過及び透析の更なるステップを施すことができる。
【００８９】
精製されるべき、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を含有する流体（すなわちＦｃ融合タンパク質製剤）に、例えばタンパク質Ａ上で最初の捕捉ステップを施す。次いで捕捉ステップの溶出液を、本発明に従って、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ上に適用する。Ｆｃ融合タンパク質と濃度が低減された遊離Ｆｃ部分とを含む青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの溶出液に、更なるクロマトグラフィ・ステップ、例えば陰イオン交換クロマトグラフィを施し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィを施すこともできる。
【００９０】
陰イオン交換クロマトグラフィは、任意の好適な陰イオン交換樹脂、例えば上記「背景技術」で説明したような弱又は強陰イオン交換体上で実施することができる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィは、強陰イオン交換樹脂上で実施される。Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能な樹脂は、本発明による陰イオン交換クロマトグラフィに特に適した陰イオン交換樹脂の一例である。
【００９１】
好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・ステップからの溶出液を、陰イオン交換カラム上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析する。陰イオン交換カラムも好ましくは、ローディング緩衝剤で平衡化する。カラムを洗浄するために同じ緩衝剤を使用するのが好ましい。
【００９２】
適切な平衡化／ローディング／洗浄緩衝剤は、例えばｐＨ８．５±０．４の２５〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓを含有する緩衝剤である。緩衝剤は好ましくはｐＨ８．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓである。
【００９３】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を主に含有する、陰イオン交換カラムからの溶出液は、最大０．５Ｍ ＮａＣｌ ＋ Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ８．５に達する塩勾配を提供することにより得られる。
【００９４】
サイズ排除クロマトグラフィは任意の好適なゲル上で行うことができる。Superdex 200 (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能なゲルは、特に好適なサイズ排除ゲルの例である。陰イオン交換クロマトグラフィからの溶出液は、これをサイズ排除カラム上にローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中にさらに希釈又は透析することができる。サイズ排除カラム上にローディングする前に、陽イオン交換カラムの溶出液に硫酸アンモニウムを添加することが好ましい。
【００９５】
ローディング後、カラムを適切な洗浄緩衝剤で洗浄し、そしてＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を、貫流液中で捕集する。貫流液は好ましくは、２８０ｎｍにおける吸光ピークの主な上昇が現れたとき、そして洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで捕集する。
【００９６】
樹脂の体積、使用されるべきカラムの長さ及び直径、並びに動的容量及び流量は、いくつかのパラメータ、例えば処理されるべき流体の体積、本発明の方法を施すべき流体中のタンパク質の濃度などに依存する。各ステップ毎にこれらのパラメータを測定することは、当業者の平均的技能範囲内に含まれる。
【００９７】
本発明の精製方法の好ましい実施態様の場合、１又は複数の限外濾過又はナノ濾過ステップが実施される。限外濾過又はナノ濾過は、バルク・バッファ中のＦｃ融合タンパク質を平衡化するために、又はＦｃ融合タンパク質を所期濃度に濃縮するために、前のクロマトグラフィ・ステップから生じた溶出液中の小有機分子及び塩を除去するのに有用である。限外濾過は、分子量５ｋＤＡ未満、１０、１５、２０、２５、又は３０ｋＤＡ以上の成分の除去を可能にする孔径を有する限外濾過膜上で実施してよい。
【００９８】
本発明の方法に従って精製されたタンパク質が、ヒトへ投与するように意図されている場合、この方法に１又は複数のウィルス除去ステップを含むことが有利である。
【００９９】
例えば、保管又は輸送を容易にするために、本発明の任意の精製ステップの前及び／又は後に、材料を凍結して解凍することができる。
【０１００】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、真核生物発現系、例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞内に生成されてよく、その結果、グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質となる。
【０１０１】
本発明によれば、哺乳動物細胞、例えば動物細胞系、又はヒト細胞系内にＦｃ融合タンパク質を発現させることが最も好ましい。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウス骨髄腫細胞系ＮＳ０が、精製されるべきＦｃ融合タンパク質の発現に特に適した細胞系の例である。Ｆｃ融合タンパク質は好ましくは、ヒト細胞系、例えばヒト繊維肉腫ＨＴ１０８０細胞系、ヒト網膜芽細胞系ＰＥＲＣ６、又はヒト胚腎臓細胞系２９３、又は欧州特許第１２３０３５４号明細書に記載されている永久羊膜細胞系中で生成することもできる。
【０１０２】
精製されるべきＦｃ融合タンパク質が、これを分泌する哺乳動物細胞によって発現されるならば、本発明の精製方法の出発材料は、採取物又は粗採取物とも呼ばれる細胞培養上澄みである。細胞が、動物血清を含有する培地中に培養されるならば、細胞培養上澄みは不純物として血清タンパク質をも含有する。
【０１０３】
好ましくは、細胞を発現させ分泌するＦｃ融合タンパク質は、無血清条件下で培養する。Ｆｃ融合タンパク質は、化学的に定義された培地中で生成することもできる。この場合、本発明の精製方法の出発材料は、不純物として宿主細胞タンパク質を主に含有する無血清細胞培養上澄みである。細胞培地に成長因子、例えばインスリンが加えられる場合には、例えばこれらのタンパク質も、精製過程中に排除されることになる。
【０１０４】
細胞培養上澄み中に放出された可溶性の分泌Ｆｃ融合タンパク質を形成するために、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分の天然シグナル・ペプチドを使用するか、又は、異種シグナル・ペプチド、すなわち、使用される具体的な発現系において効率的である別の分泌タンパク質に由来するシグナル・ペプチド、例えばウシ又はヒトの成長シグナル・ペプチド、又は免疫グロブリン・シグナル・ペプチドが使用される。
【０１０５】
本明細書中に使用される「突然変異タンパク質」という用語は、好ましくは配列番号１の配列に対応するサブユニット（すなわちＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）を有するＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームの類似体（例えばＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）であって、サブユニットにおいて、元のＩＦＮβ−Ｆｃアーム／Ｆｃアームと比較して、結果としての生成物の活性を大きく変えることなしに、ＩＦＮβ−Ｆｃアームのアミノ酸残基のうちの１つ又は２つ以上が異なるアミノ酸残基によって置換されているか、又は末梢されているか、又はＩＦＮβ又はＦｃアームの元の配列に１又は複数のアミノ酸残基が付加されているものを意味する。これらの突然変異タンパク質は、周知の合成によって、且つ／又は部位特異的突然変異誘発技術によって、又はこれらに適した任意のその他の周知の技術によって調製される。
【０１０６】
本発明による突然変異タンパク質は、緊縮条件下で配列番号１に従ってＩＦＮβ−ＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリッド形成する核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされたタンパク質を含む。ＩＦＮβ−ＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ配列の一例は、配列番号２である。
【０１０７】
「緊縮条件」という用語は、当業者が従来より「緊縮」と呼んでいるハイブリダイゼーション及び後続の洗浄条件を意味する。Ausubel他, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.,§§6.3及び6.4 (1987, 1992)を参照されたい。限定することなしに、緊縮条件の例を挙げるならば、これらの例は、例えば５分間にわたって２ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、１５分間にわたって２ ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ、３０〜６０分間にわたって３７℃の０．１ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、そして３０〜６０分間にわたって６８℃の０．１ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中の、研究対象のハイブリッドの計算Ｔｍを１２〜２０℃下回る洗浄条件を含む。当業者には明らかなように、緊縮条件はまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチド・プローブ（例えば１０〜４０塩基）又は混合オリゴヌクレオチド・プローブの長さにも依存する。混合プローブが使用される場合には、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。上記Ausubelを参照されたい。
【０１０８】
同一性は、配列を比較することにより割り出された、２つ又は３つ以上のポリペプチド配列間、又は２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較されている配列の全長にわたって、それぞれ２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチドとヌクレオチド、又はアミノ酸とアミノ酸との正確な対応関係を意味する。
【０１０９】
正確な対応関係がない配列に対しては、「同一性％」を割り出すことができる。一般に、比較されるべき２つの配列は、配列間の最大相関を与えるようにアライニングされる。これらの配列は、アラインメント度を高めるために、一方又は両方の配列内に挿入「ギャップ」を含んでいてよい。比較されている配列のそれぞれの全長にわたって（いわゆるグローバル・アラインメント、これは同じ又は極めて類似した長さの配列に特に適している）、又はより短い、定義された長さにわたって（いわゆるローカル・アラインメント、これは等しくない長さの配列により適している）、同一性％を割り出すことができる。
【０１１０】
２つ又は３つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は当業者に良く知られている。このように例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J他, 1984)において入手可能なプログラム、例えばプログラムBESTFIT及びGAPを使用することにより、２つのポリヌクレオチド間の同一性％と、２つのポリペプチド配列間の同一性％及び相同性％とを割り出すことができる。BESTFITは、Smith及びWaterman (1981)の「ローカル相同性」アルゴリズムを利用し、そして２つの配列間の最良の単独類似性領域を見いだす。配列間の同一性及び／又は類似性を割り出すための他のプログラム、例えばBLASTプログラム群（Altschul S F他, 1990, Altschul S F他, 1997, NCBLのホームページwww.ncbi.nlm.nih.govからアクセス可能）及びFASTA (Pearson W R, 1990）も当業者に知られている。
【０１１１】
好ましい実施態様の場合、任意のこのような突然変異タンパク質の同一性又は相同性は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。
【０１１２】
本発明による突然変異タンパク質の好ましい変化は、「同類」置換として得られるものである。ＩＦＮβ−Ｆｃアームの同類アミノ酸置換は、十分に類似の物理化学特性を有する群内部の同義アミノ酸を含んでいてよく、これにより、群の員間の置換は分子の生物学的機能を維持し続ける（Grantham, 1974）。アミノ酸の挿入及び抹消が少数のアミノ酸だけ、例えば３０未満、２０未満、又は好ましくは１０未満だけに関与し、そして機能構造にとって重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は変位しない場合には、上記配列内で、これらの機能を変えることなしに、アミノ酸を挿入・抹消してもよいことは明らかである。このような抹消及び／又は挿入によって生成されたタンパク質及び突然変異タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【０１１３】
好ましくは、同類アミノ酸群は、表２において定義された群である。より好ましくは、同類アミノ酸群は、表３において定義された群であり、最も好ましくは、同類アミノ酸群は、表４において定義された群である。
【表３】
【表４】
【表５】
【０１１４】
第５の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとを用いることに関する。
【０１１５】
第６の態様において、本発明は、本発明による方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質に関する。好ましい実施態様の場合、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−ベータ（すなわちＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）である。
【０１１６】
第７の態様において、本発明は、本発明による方法によって精製された、突然変異Ｆｃ領域であるＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−ベータに関する（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）。
【０１１７】
このようなＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、好ましくは高度に精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質である。高度に精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、例えば１レーン当たり１又は２μｇの量のタンパク質をローディングした後、銀染色された非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲル中の単一バンドの存在によって検出される。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、ＨＰＬＣにおける単一ピークとしての溶出液と定義されてもよい。
【０１１８】
本発明の方法から得られた、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質の製剤は、２０％未満の不純物、好ましくは１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満の不純物を含有していてよく、或いは、均質になるまで、すなわちいかなる検出可能なタンパク質汚染物をも含まなくなるまで精製されてもよい。
【０１１９】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、治療用途、具体的には人間の患者へ投与するように意図されていてよい。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質が患者へ投与される場合、これは好ましくは全身投与され、そして好ましくは、皮下投与、筋内投与、例えば気道を介して上皮投与されるか、又は局所投与される。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質の具体的な医療用途いかんでは、直腸又はくも膜下投与が適していることもある。
【０１２０】
投与を目的として、本発明の好ましい実施態様において、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、医薬組成物中に製剤する、すなわち、医薬的に許容し得るキャリア、又は賦形剤などと一緒に製剤することができる。
【０１２１】
「医薬的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物活性の効果を妨害せず、しかもこれが投与される宿主に対して毒性でない、任意のキャリアを包含するものとする。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質は、ビヒクル、例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンゲル溶液中の単位投与形態で製剤されてよい。
【０１２２】
本発明による医薬組成物の活性成分は、種々の方法で個体に投与することができる。投与ルートは、皮膚内、経皮（例えば徐放性製剤）、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び鼻腔内ルートを含む。他の任意の治療上効果的なルート、例えば上皮又は内皮組織、例えば深肺上皮への吸収を気道投与のために用いることができる。活性成分は遺伝子療法によって投与することもでき、この場合、活性物質をコードするＤＮＡ分子が患者に（ベクターを介して）投与され、これにより、活性物質はin vivoで発現され分泌されることになる。加えて、本発明によるタンパク質は、生物活性物質の他の成分、例えば医薬的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、キャリア、希釈剤及びビヒクルと一緒に投与することもできる。
【０１２３】
非経口（例えば静脈、皮下、筋内）投与のために、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、医薬的に許容し得る非経口ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、及び、等張性（マンニトール）又は化学安定性（例えば保存剤及び緩衝剤）を維持する添加剤と連携して、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤することができる。製剤は、一般に用いられる技術によって滅菌される。
【０１２４】
活性タンパク質の「治療上効果的な量」は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質のタイプ、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質のそのリガンドに対する親和性、投与ルート、患者の臨床条件を含む、多くの変数の関数となる。
【０１２５】
単回又は複数回投与として個体に投与される投与量は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の薬物動態特性、投与ルート、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、併用治療、治療頻度、及び所期効果を含む種々様々な因子に応じて変化することができる。確立された投与量範囲の調節及び操作、並びに、個体内の治療部分の天然リガンドの阻害を見極めるためのin vitro及びin vivo法は、当業者が十分に実施できる範囲にある。
【０１２６】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、又は約２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用されてよい。
【０１２７】
更なる好ましい実施態様の場合、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、毎日又は隔日又は１週に３回又は１週に１回、投与される。
【０１２８】
一日の投与は通常、所期の結果を得るのに効果的な分割投与形態、又は徐放形態で行われる。第２又は後続の投与は、初期又は前回の個体への投与量と同じか、これよりも少ないか、又はこれよりも多い投与量で実施することができる。第２又は後続の投与は、疾患の発現中又は発現前に行うことができる。
【０１２９】
本発明についてここで十分に説明してきたが、当業者には明らかなように、本発明の思想及び範囲を逸脱することなしに、また過度の実験を行うことなしに、同等のパラメータ、濃度及び条件の幅広い範囲内で本発明を実施することができる。
【０１３０】
具体的な実施態様と関連して本発明を説明してきたが、言うまでもなく、更なる変更を加えることができる。本出願は、一般に、本発明の原理に従う、そして、本発明が関連する技術分野においては良く知られた慣習の範囲にあるような、又は添付の特許請求の範囲に従う前記本質的な特徴に適用され得るような、本開示内容から離脱したものを含む、本発明のいかなる変更形、用途、改変形にも範囲が及ぶものとする。
【０１３１】
雑誌の論文又は抄録、公開済又は未公開の米国又は外国特許出願文献、発行済の米国又は外国特許文献、又はあらゆる他の参考文献を含む、本明細書中に引用された全ての参考文献は、引用文献中に提示された全てのデータ、表、図、及び本文を含めて、その全体を参考のため本明細書中に引用する。加えて、本明細書中に引用した参考文献中に引用された参考文献の内容全体も、全体として参考のために引用する。
【０１３２】
周知の方法ステップ、コンベンショナルな方法ステップ、周知の方法又はコンベンショナルな方法に関する言及は、本発明の態様、説明又は実施態様が関連技術において開示、教示、又は示唆されていることを承認するものでは決してない。
【０１３３】
特定の実施態様の前記説明は、発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、本発明の一般概念を逸脱することなしに、過度の実験なしに、当業者の技能範囲内の知識（本明細書中に引用した参考文献の内容を含む）を応用することにより、他者がこのような具体的な実施態様を種々の用途のために、容易に変更且つ／又は改変することができる。従って、このような改変形及び変更形は、本明細書中に提示された教示内容及び指針に基づいて、開示された実施態様の同等物の範囲内にあるものとする。言うまでもなく、本明細書中の表現又は用語は、説明を目的としたものであって、限定することを目的とはしていないので、本明細書中の表現又は用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に提示された教示内容及び指針に照らして、当業者によって解釈することができる。
【実施例】
【０１３４】
例全体を通して頻繁に使用される略語のリスト
ＢＶ： 床容積
ＣＨＯ： チャイニーズ・ハムスター卵巣
Ｃｏｎｄ．： 導電率
ＨＣＰｓ： 宿主細胞タンパク質
ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質： 下記Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体及びＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔホモ二量体
ＫＣｌ： 塩化カリウム
ｋＤａ： キロダルトン
ＮａＣｌ： 塩化ナトリウム
ＯＤ： 光学濃度
ＰＥＳ： ポリエーテルスルホン
ＰＧ： プロピレングリコール
ｑ．ｓ．： 適量
ＲＴ： 室温
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ： ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＲＰ−ＨＰＬＣ： 逆相高性能液体クロマトグラフィ
ＵＶ： 紫外線
設備
PG 200/500カラム（GE Healthcare）
MC126 Conductometer (Mettler-Toledo) ２５℃の値に対して較正
Mp120 pHメーター(Mettler-Toledo)
【０１３５】
Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体は、インターフェロン−ベータタンパク質とＦｃドメインとの融合によって形成されたＦｃ融合タンパク質である。免疫グロブリンの、Ｆｃフラグメント又はＦｃ領域とも呼ばれるＦｃドメインは、ヒンジ領域（Ｈ）と、抗体重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）ドメインとを含む２つの同一アームから成っている。Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔは、２つのサブユニット、つまり単一ＩＦＮ−βタンパク質に結合された突然変異ＩｇＧ Ｆｃアームを含む第１サブユニット（配列番号１）と、突然変異ＩｇＧ Ｆｃアームを含む第２サブユニット（配列番号１のアミノ酸１６７〜３９３に対応）とを含有する。突然変異ＩｇＧ Ｆｃアーム（配列番号１のアミノ酸１６７〜３９３）は下記突然変異形を含有する：
【表６】
【０１３６】
ＣＨＯクローンは、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの発現に関して立証されている（ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質発現ＣＨＯクローンと呼ばれる）。
Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの両サブユニットがクローンから発現されるので、タンパク質の様々な種／形態が生成され、そして下記のように称される：
「遊離Ｆｃ」（Ｆｃｍｕｔ／Ｆｃｍｕｔ二量体）
「Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ」（Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体）
「ＩＦＮ−ベータ二量体」（ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔホモ二量体）
凝集体及び切断形。
【０１３７】
シンプルなバッチ・モードで生成された細胞培養上澄み上のＲＰ−ＨＰＬＣは、「Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ」が、生成された総分子のほぼ５０％を占めることを示した。「遊離Ｆｃ」は、生成された総分子のほぼ３０％であり、また「ＩＦＮ−ベータ二量体」は、生成された総分子のほぼ２０％である。
【０１３８】
精製方法は、生成された他の形態からのＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの精製に関して立証された。Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの分子はほぼ７０ｋＤａであり、そしてｐHは約７〜７．５である。この精製方法は、遊離Ｆｃを極めて低レベルまで低減するのを可能にする青色セファロース・クロマトグラフィを含む。
【０１３９】
例１
ステップ１：タンパク質Ａ上の捕捉ステップ及び捕捉後溶出液の濾過
無血清条件下で培養されたＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質発現ＣＨＯクローンの清浄化済の採取物に、具体的にはＨＣＰｓ及びＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質の凝集体を排除するために、先ず捕捉ステップとしてタンパク質Ａアフィニティ・クロマトグラフィを施す。捕捉後溶出液を室温で解凍し、そしてMillistak + A1 HCフィルタ（照会MA1HC01FS1; Millipore）上で濾過した。濾過カセットを、下記ステップ２において記載された平衡化緩衝液１で予洗した（すなわち１００リットル／ｍ2）。濾過後、フィルタ及び濾過システムをデッドボリュームの１．５〜２倍で洗浄した。この洗浄溶液を、濾過された捕捉後溶出液と一緒に捕集し、そして混合物に、青色セファロース・クロマトグラフィを施した。
【０１４０】
ステップ２：青色セファロース・クロマトグラフィ
生成された遊離Ｆｃ画分を除去するために、青色セファロース・クロマトグラフィを展開した。
【０１４１】
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を、溶出中を除いて３００ｃｍ／ｈで一定に保った。溶出中には流量は、溶出緩衝剤の粘度が高いため１６０ｃｍ／ｈであった。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）緩衝剤
【表７】
ｂ）カラム
BPG 200/500カラム（GE Healthcare）にBlue Sepharose 6FF 樹脂(GE Healthcare)を、床高８±１ｃｍ（約２．５リットルの樹脂）までパッキングした。
【０１４２】
青色セファロース・クロマトグラフィを実施するために、下記経過を辿った（表５も参照）:
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤１の値（すなわちｐＨ：５．０±０．２及び導電率２．５±０．２ｍＳ／ｃｍ）に達するまで、少なくとも６ＢＶの緩衝剤１で、カラムを平衡化した。
−ローディング
パッキングされた樹脂１リットル当たり約４０ｇのＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＲＰ−ＨＰＬＣ分析）の最大動的容量で、ｐＨ４．５の濾過済捕捉後溶出液をカラムにローディングした。種々異なるロード容量を用いて種々のランを実施した（下記表６参照）。
−洗浄１
安定なベースラインに達するまで、少なくとも５ＢＶの緩衝剤１でカラムを洗浄した。
−洗浄２
遊離Ｆｃに対応する２８０ｎｍの吸光ピークが現れるまで、少なくとも５ＢＶの緩衝剤２でカラムを洗浄した。安定なベースラインに達するまで、洗浄を続けた。
−溶出
流量を１６０ｃｍ／ｈまで低下させた。
少なくとも９ＢＶの緩衝剤３で溶出を達成し、そして溶出液を滅菌容器内に捕集した。このＢＶの緩衝剤をカラムに適用したときに、小さな吸光ピークが２８０ｎｍで現れ得る。この小さなピークは、残留量の遊離Ｆｃなので好ましくは捕集されるべきではない。次いで、吸光ピークの主な上昇が現れたとき、安定なベースラインに達するまで、ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質に対応する溶出液を捕集する。
−洗浄３
少なくとも５ＢＶの水でカラムを洗浄した。最初は１６０ｃｍ／ｈの流量を、３００ｃｍ／ｈまで増大させた。
−再生＆浄化
少なくとも３ＢＶの緩衝剤４で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。次いでｐＨが７．０に戻るまで、約１０ＢＶの精製水で樹脂を洗浄した。
【表８】
−保管
カラムを緩衝剤５で洗浄し、そして室温で保管した。
種々異なるロード容量を用いて種々のランを実施した。
【０１４３】
結果
図１は、ラン６７のクロマトグラフィ・プロフィールを示している（試験ロード容量１８ｇ／Ｌ、表６）。経過「洗浄２」及び「溶出」に関して記載した条件を用いて、２つの明確なピークを分解した。「洗浄２」のピークを遊離Ｆｃ画分として同定した。「溶出」のピークは、精製済ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体）を表す。「洗浄２」において用いられた条件、すなわち、ｐＨ８．７±０．１の５０ｍＭ 酢酸アンモニウムは、遊離Ｆｃ画分を１〜２％に低減した。図２Ｃに示されているように、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体を含有する青色セファロースからの溶出液は、Ｆｃ部分がないことが見いだされた。青色セファロース・クロマトグラフィはまた、ＨＣＰｓ含有率の更なる低減を可能にする。下記表６は、種々のランに対応する異なる画分中の遊離Ｆｃ含有率を報告する。
【表９】
【０１４４】
ステップ３：青色セファロース溶出液の透析
プロピレングリコールの濃度を低減するために、上記ステップ２の青色セファロース・カラムの溶出液を、好適な緩衝剤（酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）中に透析した。下記緩衝剤及びカセットを使用した：
ａ）カセット
ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）中０．４６ｍ2の膜表面及び３０Ｋｄａの有孔率を有するKvick Flow Cassette（GE Healthcare, 照会56-4113-51）。透析に必要なカセット数は４である。
ｂ）緩衝剤
【表１０】
【０１４５】
結果
このステップのＯＤ及びＲＰ−ＨＰＬＣの平均収率は８０〜１００％であった。
【０１４６】
ステップ４：Fractogel SO3-上の陽イオン交換クロマトグラフィ
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を、平衡化開始時、最終洗浄（精製水）時、及び保管段階を除いて２４０ｃｍ／ｈで一定に保った。平衡化開始時、最終洗浄（精製水）時、及び保管段階には流量は、圧力が増大するため１２５ｃｍ／ｈであった。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）緩衝剤
【表１１】
ｂ）カラム
BPG 200カラム（GE Healthcare）にFractogel SO3- (Merck, 照会1.14894）を、床高８±１ｃｍ（約２．５リットルの樹脂）までパッキングした。
【０１４７】
陽イオン交換クロマトグラフィを下記のように実施した。
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤の値に達するまで、少なくとも９ＢＶの平衡化緩衝剤で、カラムを平衡化した。圧力の発生に従って、流量を１２５ｃｍ／ｈから２４０ｃｍ／ｈに徐々に増大させた。
−ローディング
パッキングされた樹脂１リットル当たり２０ｇのＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＯＤ ２８０ｎｍ）の最大動的容量で、ステップ３において記載したように透析された青色セファロース後溶出液をカラムにローディングした。
−洗浄
安定なベースラインに達するまで、少なくとも４ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤１でカラムを洗浄した。
−溶出
少なくとも１０〜１１ＢＶの溶出緩衝剤で溶出を達成し、そして溶出液を滅菌容器内に捕集した。このＢＶの緩衝剤をカラムに適用したときに、小さな吸光ピークが２８０ｎｍで現れ得る。この小さなピークは好ましくは捕集されるべきではない。次いで、吸光ピークの主な上昇が現れたとき、ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ画分を含有する溶出液を捕集する。
−再生
この段は、ＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体の排除に相当する。ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、少なくとも８ＢＶの再生緩衝剤で、カラムを再生した。
−浄化
少なくとも３ＢＶの浄化緩衝剤で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。流量を１２５ｃｍ／ｈに徐々に低下させた。次いでｐＨが７に達するまで（ｐＨ紙で制御）、樹脂を精製水で洗浄した。
−保管
カラムを少なくとも２ＢＶの保管緩衝剤で洗浄し、そして室温で保管した。
【０１４８】
結果
図３は、陽イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。使用される溶出緩衝剤は、一方ではＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを、そして他方ではＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体を分離する能力を有している。従って、溶出ピークは、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ画分を表すのに対して、再生ピークは、ＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体を表す。導電率が増大すると（２５ｍＳ／ｃｍまで）、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体の分離は効果が少なくなる（結果は示さない）。陽イオン交換クロマトグラフィはまた、ＨＣＰｓ含有率の付加的な低減を可能にする。
【０１４９】
ステップ５：PPG-600Mにおける疎水性相互作用クロマトグラフィ
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を１３０ｃｍ／ｈで一定に保った。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）カラム
BPG 200/500カラム（GE Healthcare）にPPG-600M(Tosoh, 照会21304）を、床高１１±１ｃｍ（約３．５リットルの樹脂）までパッキングした。カラムは反対モード（維持しない）で使用し、この場合当該画分はカラムに結合されず、貫流液中に捕集される。
ｂ）緩衝剤
【表１２】
【０１５０】
疎水性相互作用クロマトグラフィを実施するために、下記経過を辿った。
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤の値に達するまで、少なくとも５ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤で、カラムを平衡化した。
−ローディング
６６．０７ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウムが添加された、上記ステップ４で得られたFractogelカラムの溶出液を、カラムにローディングした。パッキングされた樹脂１リットル当たり１０ｇの、今やほどんどＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔだけを含有するＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＯＤ ２８０ｎｍ）の最大動的容量で、得られた製剤を樹脂上にローディングした。
−洗浄
ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、少なくとも７ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤でカラムを洗浄した。２８０ｎｍの吸光ピークの主な上昇が現れたとき、洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで、精製済Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを含有する貫流液を捕集した。
−再生
凝集体及びＨＣＰｓに相当する２８０ｎｍにおける吸光ピークの安定なベースラインに達するまで、少なくとも３ＢＶの再生緩衝剤で、カラムを再生した。
−浄化
少なくとも３ＢＶの浄化緩衝剤で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。次いでｐＨが７に達するまで（ｐＨ紙で制御）、樹脂を精製水で洗浄した。
−保管
カラムを少なくとも３ＢＶの保管緩衝剤で洗浄し、そして室温で保管した。
【０１５１】
結果
図４は、疎水性相互作用クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。当該タンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）は、ローディング・ステップの未結合画分中、及び洗浄ステップの貫流液中に存在する。試験最大ロード容量は２４ｇ（ＯＤ２８０ｎｍ）／Ｌであったが、しかし凝集体及びＨＣＰｓに対する樹脂選択性は、用いられるロード容量がより低い（すなわち５〜１０ｇ／Ｌ）と、より良好であった。このステップのＯＤの平均収率は約９０％であった。疎水性相互作用クロマトグラフィは、残っているＨＣＰｓ及び凝集体の排除を可能にする。
【０１５２】
ステップ６：ナノ濾過
ステップ５で捕集された画分に、ViroSart CPVフィルタ（Sartorius)上のナノ濾過を施した。
【０１５３】
ステップ７：濃縮／最終透析
精製済Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを含有する疎水性相互クロマトグラフィ・カラムの貫流液を、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝剤に対して透析し、そして３ｇ／ｌまで濃縮した。この緩衝剤は凝集体の発生を最小化する。
【０１５４】
結論
遊離Ｆｃを極めて低いレベルまで低減することを可能にするステップを含む効率的な精製方法が、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの精製のために確立された。青色セファロース・クロマトグラフィのために開発された特定の洗浄条件が、遊離Ｆｃ画分量を効率的に低減した。適用されたクロマトグラフィ・ステップ、すなわち、陽イオン交換クロマトグラフィ、及びこれに続く疎水性相互作用クロマトグラフィは、均質になった当該タンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）を得るのを可能にした。
【０１５５】
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24. 国際公開第２００５／００１０２５号パンフレット
25. 欧州特許第１２３０３５４号明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野にある。より具体的には、本発明は、特にＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分の量を、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを介して低減するために、前記製剤を精製することに関する。Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、好ましくは、青色アフィニティ樹脂に結合することができる融合タンパク質であり、より好ましくはＦｃ領域に融合されるＩＦＮ−βを含む融合タンパク質である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、一般に「生物学的製剤（biologicals）」と呼ばれる薬物として商業的に重要になってきている。最大の難関の１つは、商業的規模でタンパク質を精製するための、コスト効果がありしかも効率的なプロセスの開発である。タンパク質の大規模調製のために多くの方法が現在利用可能ではあるものの、粗生成物、例えば細胞培養上澄みは、所期生成物を含有するだけでなく、不純分をも含有する。これらの不純物は所期生成物から分離するのが難しい。組み換えタンパク質生成物を発現させる細胞の細胞培養上澄みは、細胞が無血清培地中で成長させられる場合には、含有する不純物がより少ない場合があるが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）は、精製過程中にまだ排除されないままである。加えて、保健当局は、ヒトの投与のために意図されたタンパク質に対して高い純度基準を要求している。
【０００３】
タンパク質精製のために幅広く用いられる数多くのクロマトグラフィ法が知られている。アフィニティ・クロマトグラフィなどのような方法が幅広く用いられている。
【０００４】
アフィニティ・クロマトグラフィは、クロマトグラフィ樹脂に対して固定化された別のタンパク質に対する当該タンパク質の親和性に基づいている。このような固定化されたリガンドの例は、特定の免疫グロブリン（Ｉｇｓ）のＦｃ部分に対する特異性を有する細菌細胞壁タンパク質であるタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇである。両タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇは、ＩｇＧ抗体に対して強力な親和性を有しているが、しかし、他の免疫グロブリン・クラス並びにイソタイプに対する親和性は様々である。
【０００５】
青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、マトリックス（例えばセファロース又はアガロース）に結合された色素リガンドCibacron Blueに基づいている。Blue Sepharose樹脂において、リガンドCibacron Blue F3G-Aは、クロロトリアジン環を通してsepharose（登録商標）に共有結合されている（Vlatakis G他、1987）。Blue Sepharoseは、インターフェロン・ベータ（Knight E Jr及びFahey, 1981）及びアルブミンを精製するために使用されている。商業的に利用可能な青色色素アフィニティ・マトリックスの例は、Blue Sepharose 6FF樹脂（GE Healthcare）、Blue Separose CL-6B（GE Healthcare）、Blue Trisacryl M (Pall/BioSepra）、Affi-Gel Blue (Bio-Rad)及びToyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience）又はCibacron Blue F3GA (Polysciences Inc.)を含む。
【０００６】
主として電荷の相違に基づいてタンパク質を分離するために、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）システムが用いられる。
【０００７】
陰イオン交換体は、弱又は強として分類することができる。弱陰イオン交換体上の電荷基は、弱塩基であり、弱塩基は脱プロトン化されるようになり、ひいては、高ｐＨでその電荷を失う。ＤＥＡＥ−セファロースが弱陰イオン交換体の一例であり、ここでは、アミノ基はほぼｐＨ９未満で正荷電することができ、ｐＨ値が高くなるとその電荷を徐々に失う。例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、対イオンとして塩化物を有している。他方において強陰イオン交換体は、強塩基を含有しており、強塩基は、イオン交換クロマトグラフィのために通常用いられるｐＨ範囲（ｐＨ１〜１４）全体を通して依然として正荷電される。Ｑ−セファロース（Ｑは第四アンモニウムを意味する）が、強陰イオン交換体の一例である。
【０００８】
陽イオン交換体も、弱又は強として分類することができる。強陽イオン交換体は、ｐＨ１〜１４において依然として荷電される強酸（例えばスルホプロピル基）を含有しているのに対して、弱陽イオン交換体は弱酸（例えばカルボキシメチル基）を含有し、この弱酸は、ｐＨが４又は５未満に低下するにつれて、その電荷を徐々に失う。例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）及びスルホプロピル（ＳＰ）は、対イオンとしてナトリウムを有している。
【０００９】
タンパク質の疎水性部分と、マトリックス上の不溶性の固定化疎水性基との疎水性相互作用に基づいてタンパク質を分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）が用いられる。一般に、高塩濃度緩衝剤中のタンパク質製剤が、ＨＩＣカラム上にローディングされる。緩衝剤中の塩は、溶液中のタンパク質の溶媒和を低減するように水分子と相互作用し、これにより、タンパク質中の疎水性領域を曝露し、次いでこの疎水性領域は、マトリックス上の疎水性基によって吸着される。分子が疎水性になればなるほど、結合を促進するのに必要とされる塩は少なくなる。通常、カラムからタンパク質を溶出するために、塩勾配の減少が用いられる。イオン強度が減少するのに伴って、タンパク質の親水性領域の曝露は増大し、そして疎水性が増大する順にタンパク質がカラムから溶出する。
【００１０】
Ｆｃ融合タンパク質は、しばしば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたタンパク質又はその生物活性ドメインを含むキメラ・タンパク質である。免疫グロブリンのＦｃフラグメントとも呼ばれるＦｃ領域は、ヒンジ領域（Ｈ）と抗体重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）ドメインを含む２つの同一のアームから成っている。Ｆｃ融合タンパク質は治療薬として幅広く使用される。それというのもこれらは、Ｆｃ領域によって与えられた利点をもたらすからである。これらの利点は、例えば次の通りである：
− ＩｇＧイソタイプに従って変化する親和性を有するタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティ・クロマトグラフィを用いて精製することが可能である。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４はタンパク質Ａに強く結合し、そしてＩｇＧ３を含む全てのヒトＩｇＧはタンパク質Ｇに強く結合する；
− Ｆｃ領域が、リソソーム分解から防御するサルベージ受容体ＦｃＲｎに結合するので、循環系における半減期が増大する；
− Ｆｃ融合タンパク質の医学的用途に応じて、Ｆｃエフェクタ機能が望ましいことがある。このようなエフェクタ機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃｙＲｓ）との相互作用を介した抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及び相補成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に結合することによる補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を含む。ＩｇＧイソフォームは、種々異なるレベルのエフェクタ機能を発揮する。一般には、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は強いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有するのに対して、ヒトＩｇＧ２は弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有する。ヒトＩｇＧ４は、弱いＡＤＣＣを示し、またＣＤＣ効果を示さない傾向がある。
【００１１】
血清半減期及びエフェクタ機能は、Ｆｃ融合タンパク質のために意図された治療用途に応じて、それぞれＦｃＲｎ、ＦｃｙＲｓ及びＣ１ｑとのＦｃ領域の結合を増減するように、Ｆｃ領域を工学的に作成することによって調節することができる。
【００１２】
ＡＤＣＣの場合、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクタ細胞、例えばナチュラル・キラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｙＲｓ）に結合し、ターゲット細胞の食作用又は溶解をもたらす。
【００１３】
ＣＤＣにおいて、抗体は、細胞表面で補体カスケードをトリガーすることにより、ターゲット細胞を殺す。ＩｇＧイソフォームは、ＩｇＧ４ < ＩｇＧ２ < ＩｇＧ１ ≦ ＩｇＧ３の順序で増大する種々異なるエフェクタ・レベルを発揮する。ヒトＩｇＧ１は、高いＡＤＣＣ及びＣＤＣを示し、そして、病原体及び癌細胞に対する治療用途に最も適している。
【００１４】
或る環境下において、例えばターゲット細胞の枯渇が望ましくないときには、エフェクタ機能の無効化が必要となる。対照的に、腫瘍用途のために意図されたＦｃ融合タンパク質の場合、エフェクタ機能の増大が、治療活性を改善することができる（Carter他, 2006）。
【００１５】
ＦｃｙＲｓ又は補体因子の結合を改善又は低減するようにＦｃ領域を工学的に作成することにより、エフェクタ機能を修飾することができる。
【００１６】
ＩｇＧと、活性化（ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩａ、ＦｃｙＲＩＩＩａ、及びＦｃｙＲＩＩＩｂ）及び阻害（ＦｃｙＲＩＩｂ）ＦｃｙＲｓ又は補体の第１成分（ｃ１ｑ）との結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン内に配置された残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域が、ＦｃｙＲｓ及び補体ｃ１ｑの結合にとって重要であり、またＩｇＧ２及びＩｇＧ４において固有の配列を有している。例えばKabat他によって定義されたＥＵインデックス・ポジション（Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S.,及びFoeller, C. (1991)）に基づく位置２３３〜２３６におけるＩｇＧ２残基をヒトＩｇＧ１へ置換すると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減した（Armour他 1999及びShields他 2001）。
【００１７】
ＩｇＧのＣＨ２ドメイン内に数多くの突然変異形が形成されており、これらのＡＤＣＣ及びＣＤＣに対する効果がin vitroで試験された（Shields他, 2001, Idusogie他, 2001及び2000, Steurer他, 1995）。具体的には、突然変異形Ｅ３３３Ａは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増大させることが報告された（Idusogie他, 2001及び2000）。
【００１８】
治療用Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増大させることは、その効力を改善するための別の方法であり、より高い循環レベル、より低い頻度の投与、及び低減された投与量を可能にする。このことは、Ｆｃ領域の、新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）との結合を促進することにより達成することができる。内皮細胞の表面上に発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存の形でＩｇＧと結合し、これを分解から保護する。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の界面に配置されたいくつかの突然変異形は、ＩｇＧ１の半減期を増大することが判っている（Hinton他, 2004及びVaccaro他, 2005）。
【００１９】
下記表１は、ＩｇＧ Ｆｃ領域のいくつかの周知の突然変異形を要約する（Invivogenのウェブサイトから採用）：
【表１】
【００２０】
治療上の有用性を有する１クラスのＦｃ融合タンパク質において、Ｆｃ領域は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーに属する特定の受容体の細胞外ドメインに融合されている（Locksley他, 2001, Bodmer他, 2002, Bossen他, 2006）。ＴＮＦＲファミリーの員の特質は、例えばNaismith及びSprang, 1998によって記載されているように、細胞外ドメイン内のシステイン豊富な擬似反復の存在である。
【００２１】
Ｆｃ融合タンパク質の別の例は、単一インターフェロン・ベータ・タンパク質に結合されたＦｃ領域から成っている。インターフェロン・ベータ（インターフェロンβ、ＩＦＮ−ベータ又はＩＦＮ−β）が、サイトカインのクラスに属する自然発生型の可溶性糖タンパク質である。インターフェロン（ＩＦＮ）は、広範囲の生物活性、例えば抗ウィルス、抗増殖、及び免疫調節特性を有している。インターフェロン・ベータは、数多くの疾患、例えば多発性硬化症、癌、又はウィルス疾患（例えばＳＡＲＳ又はＣ型肝炎ウィルス感染症）における治療用タンパク質薬物、いわゆる生物学的製剤（バイオロジカル）として使用される。
【００２２】
ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合された生物活性分子としてＩＦＮ−βを含有する融合タンパク質が国際公開第２００５／００１０２５号パンフレットに記載されている。
【００２３】
Ｆｃ融合タンパク質の治療上の有用性を考えると、ヒトへの投与に適した有意な量の精製済タンパク質が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
互いに結合された２つの異なるサブユニットから成るタンパク質（例えばＦｃ領域のアームに融合された単一タンパク質）が生成された結果、少なくとも３つの異なる種、すなわち２つのホモ二量体（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム及び単一タンパク質−Ｆｃアーム／単一タンパク質−Ｆｃアーム）及び１つのヘテロ二量体（例えばＦｃアーム／単一タンパク質−Ｆｃアーム）が形成される。
【００２５】
従って、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（すなわちＦｃ領域のアームに融合された単一タンパク質）の生成中に直面するおそれのある問題の１つは、当該任意のタンパク質に結合されないＦｃ領域の発現から生じる、又は当該タンパク質、具体的にはＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質のタンパク質分解的切断から生じる多量の「遊離Ｆｃ部分」、すなわちＦｃアームの二量体（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム・ホモ二量体）が発生することである。
【００２６】
本発明の目的は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の生成に際して主要な汚染物質を形成する前記遊離Ｆｃ部分を排除することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、Ｆｃ融合タンパク質の流体、組成物、又は製剤から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を精製し、これにより、存在する遊離Ｆｃ部分の量が低減される、精製方法の開発に基づいている。
【００２８】
本発明は従って、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質を精製する際に遊離Ｆｃ部分の濃度を低減する方法に関し、この方法は、前記製剤に、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを施し、そしてｐＨ約８．４〜約８．９で樹脂を洗浄することにより、遊離Ｆｃ部分を排除することを含む。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分を低減するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを用いることに関する。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有し、そして総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である精製済Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００３１】
第４の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するための方法に関する。この態様において、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、青色色素アフィニティ樹脂に結合することができ、そして、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが先行し、且つ／又は、引き続き、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップが行われる。好ましくは、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βである。
【００３２】
第５の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとを用いることに関する。
【００３３】
本発明の第６の態様は、本発明による方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、好ましくはＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βに関する。
【００３４】
本発明の第７の態様は、本発明による方法によって精製された、突然変異Ｆｃ領域であるＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、例１のステップ２において記載された青色セファロース・クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄１、４−洗浄２、５−溶出。
【図２】図２は、例１のステップ２からのロード（図２Ａ）、洗浄２（図２Ｂ）、及び溶出液（図２Ｃ）画分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析スペクトルを示す。ここでピーク（ａ）は遊離Ｆｃを、ピーク（ｂ）はＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを、そしてピーク（ｃ）はＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを表す。
【図３】図３は、例１のステップ４において記載された陽イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄、４−洗浄２、５−再生、６−浄化。
【図４】図４は、例１のステップ５において記載された疎水性相互作用クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。（ｉ）２８０ｎｍにおけるＯＤ（ｍＡＵ）、（ｉｉ）導電率、（ｉｉｉ）ｐＨ。１−平衡化、２−ロード、３−洗浄１、４−再生、５−浄化。
【００３６】
配列リストの簡単な説明
配列番号１は、ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔアミノ酸配列である。アミノ酸１〜１６６は、成熟ヒトインターフェロン・ベータを表し、そしてアミノ酸１６７〜３９３は、突然変異ヒト免疫グロブリン・ガンマ重鎖配列の一部を表す。
配列番号２は、配列番号１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号３は、ＩＦＮβ−Ｆｃアーム・アミノ酸配列である。アミノ酸１〜２１は、ＩＦＮ−βシグナル・ペプチドを表し、残基２２〜１８７は成熟ＩＦＮ−βを表し、残基１８８〜１９５はリンカー配列を表し、そして残基１９６〜４２２は、ヒト免疫グロブリン重鎖の一部を表す。
配列番号４は、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
互いに結合された２つの異なるサブユニットから成るタンパク質が生成された結果、少なくとも３つの異なる種、すなわち２つのホモ二量体及び１つのヘテロ二量体が形成される。例えば、ＩＦＮβ−Ｆｃ融合タンパク質を生成する時には、少なくとも以下の種が形成される：Ｆｃアーム／Ｆｃアーム二量体（ホモ二量体）、ＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム（ホモ二量体）及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム（ヘテロ二量体）。
【００３８】
Ｆｃ融合タンパク質の組成物（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）が望まれる場合には、総量のうちの３０％に達することもある遊離Ｆｃ部分（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム二量体）の濃度は低減されなければならない。
【００３９】
本発明は、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが、青色色素アフィニティ樹脂に結合するＦｃ融合タンパク質の流体又は組成物中に存在し得る遊離Ｆｃ部分の量または程度を効率に低減し、これによりＦｃ融合タンパク質の純度を増大させる好都合且つシンプルな方法を提供することである。
【００４０】
従って、本発明の第１の態様は、Ｆｃ融合タンパク質を含む流体中に存在する遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤を精製する方法であって、該方法が：
（ａ） 青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂上に前記流体をローディングし；
（ｂ） ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で該樹脂を洗浄し、これにより、該遊離Ｆｃ部分を該樹脂から排除し；そして
（ｃ） 該Ｆｃ融合タンパク質を該樹脂から溶出する
ステップを含む、方法に関する。
【００４１】
Ｆｃ融合タンパク質は、青色色素アフィニティ樹脂及び青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる。
【００４２】
Ｆｃ融合タンパク質を含む流体は、任意の組成物又は製剤、例えばヒト又は動物に由来する体液、又は細胞培養に由来する流体、例えば細胞培養上澄み又は細胞培養採取物であってよい。流体は、別の精製ステップから誘導された流体、例えば捕捉ステップ、又は青色セファロース・クロマトグラフィに先立つ任意の他の好適な精製ステップから生じた溶出液又は貫流液、例えばタンパク質Ａクロマトグラフィの溶出液であってもよい。
【００４３】
流体は好ましくは、細胞培養物質、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上澄みであってよい。本明細書中に使用される「細胞培養上澄み」という用語は、細胞が培養される培地、及びタンパク質が適宜の細胞信号、いわゆるシグナル・ペプチドを含有することを条件としてタンパク質が分泌される培地を意味する。細胞を発現させるＦｃ融合タンパク質が無血清培養条件下で培養されることが好ましい。従って、細胞培養上澄みには動物由来の成分が欠けていることが好ましい。最も好ましくは、細胞培養培地は化学的に定義された培地である。
【００４４】
本明細書中、Ｆｃ領域は、Ｆｃフラグメント又はＦｃドメインを意味することがある。本明細書中、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」又は「Ｆｃドメイン」は相互に置き換え可能であり、同じ意味を有するものとして解釈されるべきである。
【００４５】
本明細書中に使用される「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）という用語は、非免疫グロブリン・タンパク質（例えばＩＦＮ−β）を含む融合タンパク質を包含するものとする。非免疫グロブリン・タンパク質は本明細書中では、Ｆｃ領域由来部分（本明細書中では「Ｆｃ部分」と呼ぶ）の１つのアームだけに結合された「治療部分」（疾患の治療が意図されているかいないかとは関係なく）と呼ぶ。
【００４６】
本明細書中に使用する「Ｆｃ融合タンパク質」は、「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」と、融合タンパク質とを含む。融合タンパク質では、治療部分が非免疫グロブリン・タンパク質の２つのコピーから成っており、コピーのそれぞれがＦｃ部分のアームに結合されている（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）。本発明に従って精製されるべきＦｃ融合タンパク質は、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合する。
【００４７】
本明細書中に使用される「Ｆｃ部分」という用語は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせ、そして好ましくはヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから選択された、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメイン、好ましくはヒト定常領域の二量体を意味する。免疫グロブリン定常ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はこれらの組み合わせ又はイソタイプに由来していてよい。好ましくは、これはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。より好ましくは、これはＩｇＧ１である。
【００４８】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分は、エフェクタ機能を調節するために修飾されてもよい。
【００４９】
例えば、Ｆｃ部分がＩｇＧ１に由来する場合、ＥＵインデックス・ポジション（Kabat他, 1991）に従って、下記Ｆｃ突然変異形を導入することができる：
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P331S
E333A;K322A。
【００５０】
治療Ｆｃ融合タンパク質、すなわち、動物の疾患の治療又は予防のために、又は好ましくはヒトの治療又はヒトへの投与のために意図されたＦｃ融合タンパク質が、本発明による精製に特に適している。
【００５１】
青色色素アフィニティ樹脂と結合するいかなるＦｃ融合タンパク質も、本発明にしたがって精製することができる。
【００５２】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＰＤＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８結合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、又はＴＮＦ−ベータであるか、又はこれに由来していてよい。
【００５３】
Ｆｃ融合タンパク質の治療部分は、受容体、例えば膜貫通受容体に由来していてもよく、具体的には、受容体の細胞外ドメイン、及び所与の受容体の細胞外部分又は細胞外ドメインのリガンド結合フラグメントであるか、又はこれに由来していてよい。治療上興味深い受容体の例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７ＲＢ（ＩＬ−１７ＲＨ１）、ＩＬ−１７ＲＣ（ＩＬ−１７ＲＬ）、ＩＬ−１７ＲＤ（ｈＳＥＦ）、又はＩＬ−１７ＲＥ）、ＩＬ−１８受容体サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ−アルファ、ＩＬ−１８Ｒ−ベータ）、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリン アルファ４ １０ ベータ７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内付着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔ関連抗原である）、Ｆｃ−ガンマ−Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチンである。
【００５４】
上記定義に従って、本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体及びホモ二量体を含有していてよい。「ホモ二量体」は、単一非免疫グロブリン・タンパク質の２つのコピーを含み、これらのコピーのそれぞれがＦｃ部分のアームに結合されている（例えば２つのＩｇＧジスルフィド架橋ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームの二量体）。「ヘテロ二量体」又は「Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質」は、唯１つのアームが単一非免疫グロブリン・タンパク質に融合されているＦｃ部分を含む。
【００５５】
好ましくは、前記ヘテロ二量体は、２つのＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームのうちの１つに結合された単一ＩＦＮ−βを含む（例えば国際公開第２００５／００１０２５号パンフレット及び配列番号３）。２つのサブユニット、つまり単一ＩＦＮ−βタンパク質に結合された突然変異ＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームを含む第１サブユニット（すなわちＩＦＮβ−Ｆｃ ｍｕｔ、配列番号１のアミノ酸配列に対応）と、突然変異ＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３アームを含む第２サブユニット（すなわちＦｃ ｍｕｔ、配列番号１のアミノ酸残基１６７〜３９３に対応）とを含有するヘテロ二量体も本発明に照らして好ましいものである。従って、本発明によれば、好ましくは
（ａ） 配列番号１又は３；
（ｂ） 高緊縮条件下で配列番号２又は４の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；及び
（ｃ） （ａ）のポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも８０％又は８５％又は９０％又は９５％である（ａ）の突然変異タンパク質
から選択されたポリペプチドを含むＦｃ部分に融合された単一ＩＦＮ−βが、本発明の方法に従った精製に適している。
【００５６】
このような、Ｆｃ部分に融合された単一ＩＦＮ−βを、本発明の枠内で、概ねＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームと呼ぶ。
【００５７】
本発明に照らしてさらに別の好ましいＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームは、配列番号３の突然変異形Ｎ２７２Ａに対応する、ＥＵインデックス・ポジションに基づく突然変異形Ｎ２９７Ａを含む。
【００５８】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくはＦｃ融合タンパク質組成物の総タンパク質濃度の少なくとも５％未満、２％未満、又は１％未満まで、遊離Ｆｃ部分を低減、減少、又は排除するために、色素アフィニティ・クロマトグラフィを施される。
【００５９】
本明細書中に使用される「遊離Ｆｃ部分」又は単に「遊離Ｆｃ」という用語は、本発明に従って精製されるべきＦｃ融合タンパク質の任意の部分であって、治療部分に由来する完全な更なるドメイン又は完全な配列を含まないＦｃ部分に相当するか又は由来するものを包含するものとする。遊離Ｆｃは例えば、治療部分の重要な部分には結合されていない、ＩｇＧヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの二量体を含有していてよい。
【００６０】
Ｆｃ部分に由来する単量体が、遊離Ｆｃ画分中に含有されていてもよい。言うまでもなく、遊離Ｆｃは、治療部分からの数多くのアミノ酸残基をまだ含有していてよく、例えば治療部分に属するアミノ酸が、例えば１〜５０個、１〜２０個、又は１〜１０個、又は１〜５個、又は１つの単一アミノ酸がＦｃ部分にまだ融合されていてもよい。
【００６１】
本発明によれば、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、任意の好適な樹脂上で実施することができる。好ましくは樹脂は、Cibacron Blue F3G-Aリガンドを含む。好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィは、Blue Sepharose樹脂上で行われる。Blue Sepharose 6FF (GE Healthcare)という名称で商業的に利用可能な樹脂は、本発明の方法のステップ（ａ）に特に適したアフィニティ樹脂の一例である。Blue Sepharose FFの技術的特徴は次の通りである：
【表２】
【００６２】
他の好適な商業的に利用可能な青色色素アフィニティ・カラムは、Blue Sepharose CL-6B (GE Healthcare)、Blue Trisacryl M (Pall/BioSepra)、Affi-Gel Blue (Bio-Rad)、Econo-Pac ブルーカートリッジ(Bio-Rad)、SwellGel Blue (Pierce）、及びToyopearl AF-Blue (Tosoh Bioscience）又はCibacron Blue F3G-A (Polysciences Inc.)から選択される。
【００６３】
本発明の精製方法のステップ（ａ）において、Ｆｃ融合タンパク質を含む流体を青色色素樹脂上にローディングする前に、流体を好ましくは、６未満、好ましくは約４．５のｐＨに調節するか、或いは、必要な場合には約ｐＨ５で約２０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率まで水で希釈する。このことは、Ｆｃ融合タンパク質が青色色素樹脂に結合するのを可能にする。
【００６４】
本発明の方法のステップ（ｂ）において、ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で遊離Ｆｃ部分を青色色素樹脂から洗浄する。ｐＨは例えば約８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、又は約８．９であってよい。
【００６５】
ステップ（ｂ）において、任意の好適な緩衝剤（例えば酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を使用して、遊離Ｆｃ部分を青色色素アフィニティ樹脂から洗い落とす。８．７±０．２又は８．７±０．１のｐＨの酢酸アンモニウム緩衝剤が好ましい。
【００６６】
更なる好ましい実施態様の場合、ｐＨ約８．７のイソクラチック塩濃度４０〜１００ｍＭで、遊離Ｆｃ部分を青色セファロース・カラムから洗い落とす。イソクラチック塩濃度は、例えば４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｍＭの、ｐＨ約８．６〜約８．８の酢酸アンモニウムであってよい。これは好ましくは、ｐＨ約８．７±０．１の５０ｍＭ酢酸アンモニウムである。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤が、好ましくはｐＨ８．５の濃度５０ｍＭで使用されてもよい。
【００６７】
本発明の方法のステップ（ｃ）において、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・カラムからＦｃ融合タンパク質を溶出する。
【００６８】
ステップ（ｃ）においてＦｃ融合タンパク質を青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・カラムから溶出することは、ｐＨ約８．３〜８．７の緩衝剤中で行われる。好ましい実施態様の場合、溶出は、ｐＨを調節するためにアンモニアが添加された酢酸アンモニア、ＮａＣｌ、プロピレングリコールを含む緩衝剤中で実施される。１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、及び４０％〜５０％の濃度でプロピレングリコールが使用されることが好ましい。好適な緩衝剤濃度は、例えば約２５ｍＭ又は約５０ｍＭ又は約１００ｍＭ又は約１５０ｍＭ又は約２００ｍＭ又は約２５０ｍＭから選択される。
【００６９】
極めて好ましい実施態様の場合、本発明の方法は、Ｆｃ融合タンパク質の精製スキームの第２ステップとして用いられ、この場合、青色セファロース樹脂上にステップ（ａ）においてローディングされた流体は、前記Ｆｃ融合タンパク質を含む流体に対して最初に施されたタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティ・クロマトグラフィの溶出液である。流体は好ましくは、細胞培養物質、例えば可溶化細胞、より好ましくは細胞培養上澄みであってよい。
【００７０】
タンパク質Ａ又はＧアフィニティ・クロマトグラフィは好ましくは捕捉ステップとして用いられ、ひいては、Ｆｃ融合タンパク質の調製のため、具体的には宿主細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）及びＦｃ融合タンパク質凝集体の排除のため、そしてＦｃ融合タンパク質製剤の濃縮のために役立つ。
【００７１】
MabSelect Xtra (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能なカラムは、捕捉ステップに特に適したアフィニティ樹脂の一例である。
【００７２】
本発明によれば、ステップ（ｃ）の青色セファロース・クロマトグラフィの溶出液は次いで、例えば下にさらに詳述するように、更なる精製のために使用することができる。
【００７３】
本発明の好ましい実施態様の場合、ステップ（ａ）は、パッキングされた青色色素アフィニティ樹脂１リットル当たり４０ｇのＦｃ融合タンパク質の最大動的容量で、青色セファロース樹脂をローディングすることを含む。
【００７４】
加えて、本発明の青色セファロース・クロマトグラフィは、遊離Ｆｃ部分のレベルを、約５％未満又は約２％未満又は約１％未満の遊離Ｆｃ部分に低減する。
従って、本発明の青色セファロース・クロマトグラフィ・ステップは、遊離Ｆｃ部分のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された検出レベル未満に低減する。従って、本発明の好ましい実施態様の場合、青色色素クロマトグラフィの溶出液は、１μｇのＦｃ融合タンパク質をローディングしたときに、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によっては検出することができない遊離Ｆｃ部分レベルを有している。
【００７５】
本発明の第２の態様は、Ｆｃ融合タンパク質、具体的には青色色素アフィニティ樹脂に結合することができるＦｃ融合タンパク質、及び具体的にはＦｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質、例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームを含む組成物中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低減するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィを用いることに関する。好ましくは、青色色素樹脂は、青色セファロース樹脂である。
【００７６】
本発明の第３の態様は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有し、そして総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である精製済Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【００７７】
本発明の第４の態様は、Ｆｃ融合タンパク質製剤（例えばＩＦＮβ−Ｆｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム及びＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）及び遊離Ｆｃ部分（例えばＦｃアーム／Ｆｃアーム二量体）から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を分離するための方法に関する。このプロセスにおいて、好ましくは、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィから選択された１又は複数の追加的なステップを有する精製方法において、青色色素アフィニティ・セファロース・クロマトグラフィが用いられてよい。精製ステップのうちの１又は複数の間に、濾過ステップ、例えばナノ濾過、又は限外濾過を用いることができる。
【００７８】
１実施態様の場合、精製されるべき、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームを含有する流体（すなわちＦｃ融合タンパク質製剤）に、例えばタンパク質Ａ上で最初の捕捉ステップを施す。次いで捕捉ステップの溶出液を、本発明に従って、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ上に適用することができる。
【００７９】
Ｆｃ融合タンパク質と濃度が低減された遊離Ｆｃ部分とを含む青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの溶出液に、次いで、更なるクロマトグラフィ・ステップ、例えば陽イオン交換クロマトグラフィを施し、続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィを施すことができる（例えば例１）。
【００８０】
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィにおいて使用される樹脂は、強陽イオン交換樹脂である。Fractogel SO3- (Merck)の名称で商業的に入手可能なカラムは、本発明の方法との関連において特に好適な陽イオン交換樹脂の一例である。
【００８１】
好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・ステップからの溶出液を、陽イオン交換樹脂上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析する。ローディング前に、陽イオン交換カラムを好ましくは、適切な平衡化緩衝剤で平衡化する。適切な平衡化／洗浄緩衝剤は、例えば、ｐＨ５．０±０．５、導電率７．５±０．５ｍＳ／ｃｍの酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ５．０±０．２、導電率７．５±０．２ｍＳ／ｃｍの酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ緩衝剤である。
【００８２】
陽イオン交換樹脂を、平衡化／洗浄緩衝剤で洗浄し、そして次いで、例えばｐＨ７．０±０．５、導電率１６±１ｍＳ／ｃｍの３５ｍＭ〜４５ｍＭのリン酸ナトリウム及び５０〜１５０ｍＭのＫＣｌの緩衝剤で、陽イオン交換樹脂からＦｃ融合タンパク質を溶出する。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ７．０±０．１、導電率１６±０．５ｍＳ／ｃｍの４０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１００ｍＭのＫＣｌの緩衝剤である。
【００８３】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を主に含有する、陽イオン交換クロマトグラフィ・ステップからの溶出液に、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィを施す。疎水性相互作用クロマトグラフィは、任意の好適な樹脂上で実施することができる。PPG-600M (Tosoh)の名称で商業的に入手可能な樹脂が、本発明による疎水性相互作用クロマトグラフィ・ステップに特に適した樹脂である。
【００８４】
疎水性相互作用クロマトグラフィ・カラムを好ましくは、適切な平衡化緩衝剤で平衡化する。
【００８５】
陽イオン交換クロマトグラフィからの溶出液を、疎水性交換カラム上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析することができる。ローディング前に疎水性交換カラムの溶出液に、硫酸アンモニアを添加することが好ましい。
【００８６】
ローディング後、カラムを適切な洗浄緩衝剤で洗浄し、そしてＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を、貫流液中で捕集する。貫流液は好ましくは、２８０ｎｍにおける吸光ピークの主な上昇が現れたとき、そして洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで捕集する。
【００８７】
適切な平衡化／洗浄緩衝剤は、例えば、ｐＨ６．８±０．８、導電率５．３±８ｍＳ／ｃｍの３５ｍＭ〜４５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１〜０．８Ｍの硫酸アンモニウムの緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは、ｐＨ６．８±０．２、導電率５．３±２ｍＳ／ｃｍの４０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム緩衝剤である。
【００８８】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を含む貫流液には、ナノ濾過及び透析の更なるステップを施すことができる。
【００８９】
精製されるべき、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を含有する流体（すなわちＦｃ融合タンパク質製剤）に、例えばタンパク質Ａ上で最初の捕捉ステップを施す。次いで捕捉ステップの溶出液を、本発明に従って、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ上に適用する。Ｆｃ融合タンパク質と濃度が低減された遊離Ｆｃ部分とを含む青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの溶出液に、更なるクロマトグラフィ・ステップ、例えば陰イオン交換クロマトグラフィを施し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィを施すこともできる。
【００９０】
陰イオン交換クロマトグラフィは、任意の好適な陰イオン交換樹脂、例えば上記「背景技術」で説明したような弱又は強陰イオン交換体上で実施することができる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィは、強陰イオン交換樹脂上で実施される。Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能な樹脂は、本発明による陰イオン交換クロマトグラフィに特に適した陰イオン交換樹脂の一例である。
【００９１】
好ましくは、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ・ステップからの溶出液を、陰イオン交換カラム上にこれをローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中に希釈又は透析する。陰イオン交換カラムも好ましくは、ローディング緩衝剤で平衡化する。カラムを洗浄するために同じ緩衝剤を使用するのが好ましい。
【００９２】
適切な平衡化／ローディング／洗浄緩衝剤は、例えばｐＨ８．５±０．４の２５〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓを含有する緩衝剤である。緩衝剤は好ましくはｐＨ８．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓである。
【００９３】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を主に含有する、陰イオン交換カラムからの溶出液は、最大０．５Ｍ ＮａＣｌ ＋ Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ８．５に達する塩勾配を提供することにより得られる。
【００９４】
サイズ排除クロマトグラフィは任意の好適なゲル上で行うことができる。Superdex 200 (GE Healthcare)の名称で商業的に入手可能なゲルは、特に好適なサイズ排除ゲルの例である。陰イオン交換クロマトグラフィからの溶出液は、これをサイズ排除カラム上にローディングする前に、適切なローディング緩衝剤中にさらに希釈又は透析することができる。サイズ排除カラム上にローディングする前に、陽イオン交換カラムの溶出液に硫酸アンモニウムを添加することが好ましい。
【００９５】
ローディング後、カラムを適切な洗浄緩衝剤で洗浄し、そしてＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質（例えばＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）を、貫流液中で捕集する。貫流液は好ましくは、２８０ｎｍにおける吸光ピークの主な上昇が現れたとき、そして洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで捕集する。
【００９６】
樹脂の体積、使用されるべきカラムの長さ及び直径、並びに動的容量及び流量は、いくつかのパラメータ、例えば処理されるべき流体の体積、本発明の方法を施すべき流体中のタンパク質の濃度などに依存する。各ステップ毎にこれらのパラメータを測定することは、当業者の平均的技能範囲内に含まれる。
【００９７】
本発明の精製方法の好ましい実施態様の場合、１又は複数の限外濾過又はナノ濾過ステップが実施される。限外濾過又はナノ濾過は、バルク・バッファ中のＦｃ融合タンパク質を平衡化するために、又はＦｃ融合タンパク質を所期濃度に濃縮するために、前のクロマトグラフィ・ステップから生じた溶出液中の小有機分子及び塩を除去するのに有用である。限外濾過は、分子量５ｋＤＡ未満、１０、１５、２０、２５、又は３０ｋＤＡ以上の成分の除去を可能にする孔径を有する限外濾過膜上で実施してよい。
【００９８】
本発明の方法に従って精製されたタンパク質が、ヒトへ投与するように意図されている場合、この方法に１又は複数のウィルス除去ステップを含むことが有利である。
【００９９】
例えば、保管又は輸送を容易にするために、本発明の任意の精製ステップの前及び／又は後に、材料を凍結して解凍することができる。
【０１００】
本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、真核生物発現系、例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞内に生成されてよく、その結果、グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質となる。
【０１０１】
本発明によれば、哺乳動物細胞、例えば動物細胞系、又はヒト細胞系内にＦｃ融合タンパク質を発現させることが最も好ましい。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウス骨髄腫細胞系ＮＳ０が、精製されるべきＦｃ融合タンパク質の発現に特に適した細胞系の例である。Ｆｃ融合タンパク質は好ましくは、ヒト細胞系、例えばヒト繊維肉腫ＨＴ１０８０細胞系、ヒト網膜芽細胞系ＰＥＲＣ６、又はヒト胚腎臓細胞系２９３、又は欧州特許第１２３０３５４号明細書に記載されている永久羊膜細胞系中で生成することもできる。
【０１０２】
精製されるべきＦｃ融合タンパク質が、これを分泌する哺乳動物細胞によって発現されるならば、本発明の精製方法の出発材料は、採取物又は粗採取物とも呼ばれる細胞培養上澄みである。細胞が、動物血清を含有する培地中に培養されるならば、細胞培養上澄みは不純物として血清タンパク質をも含有する。
【０１０３】
好ましくは、細胞を発現させ分泌するＦｃ融合タンパク質は、無血清条件下で培養する。Ｆｃ融合タンパク質は、化学的に定義された培地中で生成することもできる。この場合、本発明の精製方法の出発材料は、不純物として宿主細胞タンパク質を主に含有する無血清細胞培養上澄みである。細胞培地に成長因子、例えばインスリンが加えられる場合には、例えばこれらのタンパク質も、精製過程中に排除されることになる。
【０１０４】
細胞培養上澄み中に放出された可溶性の分泌Ｆｃ融合タンパク質を形成するために、Ｆｃ融合タンパク質の治療部分の天然シグナル・ペプチドを使用するか、又は、異種シグナル・ペプチド、すなわち、使用される具体的な発現系において効率的である別の分泌タンパク質に由来するシグナル・ペプチド、例えばウシ又はヒトの成長シグナル・ペプチド、又は免疫グロブリン・シグナル・ペプチドが使用される。
【０１０５】
本明細書中に使用される「突然変異タンパク質」という用語は、好ましくは配列番号１の配列に対応するサブユニット（すなわちＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）を有するＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアームの類似体（例えばＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）であって、サブユニットにおいて、元のＩＦＮβ−Ｆｃアーム／Ｆｃアームと比較して、結果としての生成物の活性を大きく変えることなしに、ＩＦＮβ−Ｆｃアームのアミノ酸残基のうちの１つ又は２つ以上が異なるアミノ酸残基によって置換されているか、又は末梢されているか、又はＩＦＮβ又はＦｃアームの元の配列に１又は複数のアミノ酸残基が付加されているものを意味する。これらの突然変異タンパク質は、周知の合成によって、且つ／又は部位特異的突然変異誘発技術によって、又はこれらに適した任意のその他の周知の技術によって調製される。
【０１０６】
本発明による突然変異タンパク質は、緊縮条件下で配列番号１に従ってＩＦＮβ−ＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリッド形成する核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされたタンパク質を含む。ＩＦＮβ−ＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ配列の一例は、配列番号２である。
【０１０７】
「緊縮条件」という用語は、当業者が従来より「緊縮」と呼んでいるハイブリダイゼーション及び後続の洗浄条件を意味する。Ausubel他, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.,§§6.3及び6.4 (1987, 1992)を参照されたい。限定することなしに、緊縮条件の例を挙げるならば、これらの例は、例えば５分間にわたって２ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、１５分間にわたって２ ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ、３０〜６０分間にわたって３７℃の０．１ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、そして３０〜６０分間にわたって６８℃の０．１ ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中の、研究対象のハイブリッドの計算Ｔｍを１２〜２０℃下回る洗浄条件を含む。当業者には明らかなように、緊縮条件はまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチド・プローブ（例えば１０〜４０塩基）又は混合オリゴヌクレオチド・プローブの長さにも依存する。混合プローブが使用される場合には、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。上記Ausubelを参照されたい。
【０１０８】
同一性は、配列を比較することにより割り出された、２つ又は３つ以上のポリペプチド配列間、又は２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較されている配列の全長にわたって、それぞれ２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチドとヌクレオチド、又はアミノ酸とアミノ酸との正確な対応関係を意味する。
【０１０９】
正確な対応関係がない配列に対しては、「同一性％」を割り出すことができる。一般に、比較されるべき２つの配列は、配列間の最大相関を与えるようにアライニングされる。これらの配列は、アラインメント度を高めるために、一方又は両方の配列内に挿入「ギャップ」を含んでいてよい。比較されている配列のそれぞれの全長にわたって（いわゆるグローバル・アラインメント、これは同じ又は極めて類似した長さの配列に特に適している）、又はより短い、定義された長さにわたって（いわゆるローカル・アラインメント、これは等しくない長さの配列により適している）、同一性％を割り出すことができる。
【０１１０】
２つ又は３つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は当業者に良く知られている。このように例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J他, 1984)において入手可能なプログラム、例えばプログラムBESTFIT及びGAPを使用することにより、２つのポリヌクレオチド間の同一性％と、２つのポリペプチド配列間の同一性％及び相同性％とを割り出すことができる。BESTFITは、Smith及びWaterman (1981)の「ローカル相同性」アルゴリズムを利用し、そして２つの配列間の最良の単独類似性領域を見いだす。配列間の同一性及び／又は類似性を割り出すための他のプログラム、例えばBLASTプログラム群（Altschul S F他, 1990, Altschul S F他, 1997, NCBLのホームページwww.ncbi.nlm.nih.govからアクセス可能）及びFASTA (Pearson W R, 1990）も当業者に知られている。
【０１１１】
好ましい実施態様の場合、任意のこのような突然変異タンパク質の同一性又は相同性は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。
【０１１２】
本発明による突然変異タンパク質の好ましい変化は、「同類」置換として得られるものである。ＩＦＮβ−Ｆｃアームの同類アミノ酸置換は、十分に類似の物理化学特性を有する群内部の同義アミノ酸を含んでいてよく、これにより、群の員間の置換は分子の生物学的機能を維持し続ける（Grantham, 1974）。アミノ酸の挿入及び抹消が少数のアミノ酸だけ、例えば３０未満、２０未満、又は好ましくは１０未満だけに関与し、そして機能構造にとって重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は変位しない場合には、上記配列内で、これらの機能を変えることなしに、アミノ酸を挿入・抹消してもよいことは明らかである。このような抹消及び／又は挿入によって生成されたタンパク質及び突然変異タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【０１１３】
好ましくは、同類アミノ酸群は、表２において定義された群である。より好ましくは、同類アミノ酸群は、表３において定義された群であり、最も好ましくは、同類アミノ酸群は、表４において定義された群である。
【表３】
【表４】
【表５】
【０１１４】
第５の態様において、本発明は、Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するために、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとを用いることに関する。
【０１１５】
第６の態様において、本発明は、本発明による方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質に関する。好ましい実施態様の場合、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−ベータ（すなわちＦｃアーム／ＩＦＮβ−Ｆｃアーム）である。
【０１１６】
第７の態様において、本発明は、本発明による方法によって精製された、突然変異Ｆｃ領域であるＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−ベータに関する（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）。
【０１１７】
このようなＦｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、好ましくは高度に精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質である。高度に精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、例えば１レーン当たり１又は２μｇの量のタンパク質をローディングした後、銀染色された非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲル中の単一バンドの存在によって検出される。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、ＨＰＬＣにおける単一ピークとしての溶出液と定義されてもよい。
【０１１８】
本発明の方法から得られた、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質の製剤は、２０％未満の不純物、好ましくは１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満の不純物を含有していてよく、或いは、均質になるまで、すなわちいかなる検出可能なタンパク質汚染物をも含まなくなるまで精製されてもよい。
【０１１９】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、治療用途、具体的には人間の患者へ投与するように意図されていてよい。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質が患者へ投与される場合、これは好ましくは全身投与され、そして好ましくは、皮下投与、筋内投与、例えば気道を介して上皮投与されるか、又は局所投与される。Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質の具体的な医療用途いかんでは、直腸又はくも膜下投与が適していることもある。
【０１２０】
投与を目的として、本発明の好ましい実施態様において、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、医薬組成物中に製剤する、すなわち、医薬的に許容し得るキャリア、又は賦形剤などと一緒に製剤することができる。
【０１２１】
「医薬的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物活性の効果を妨害せず、しかもこれが投与される宿主に対して毒性でない、任意のキャリアを包含するものとする。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質は、ビヒクル、例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンゲル溶液中の単位投与形態で製剤されてよい。
【０１２２】
本発明による医薬組成物の活性成分は、種々の方法で個体に投与することができる。投与ルートは、皮膚内、経皮（例えば徐放性製剤）、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び鼻腔内ルートを含む。他の任意の治療上効果的なルート、例えば上皮又は内皮組織、例えば深肺上皮への吸収を気道投与のために用いることができる。活性成分は遺伝子療法によって投与することもでき、この場合、活性物質をコードするＤＮＡ分子が患者に（ベクターを介して）投与され、これにより、活性物質はin vivoで発現され分泌されることになる。加えて、本発明によるタンパク質は、生物活性物質の他の成分、例えば医薬的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、キャリア、希釈剤及びビヒクルと一緒に投与することもできる。
【０１２３】
非経口（例えば静脈、皮下、筋内）投与のために、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質は、医薬的に許容し得る非経口ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、及び、等張性（マンニトール）又は化学安定性（例えば保存剤及び緩衝剤）を維持する添加剤と連携して、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤することができる。製剤は、一般に用いられる技術によって滅菌される。
【０１２４】
活性タンパク質の「治療上効果的な量」は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質のタイプ、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質のそのリガンドに対する親和性、投与ルート、患者の臨床条件を含む、多くの変数の関数となる。
【０１２５】
単回又は複数回投与として個体に投与される投与量は、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の薬物動態特性、投与ルート、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、併用治療、治療頻度、及び所期効果を含む種々様々な因子に応じて変化することができる。確立された投与量範囲の調節及び操作、並びに、個体内の治療部分の天然リガンドの阻害を見極めるためのin vitro及びin vivo法は、当業者が十分に実施できる範囲にある。
【０１２６】
Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、又は約２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用されてよい。
【０１２７】
更なる好ましい実施態様の場合、Ｆｃ領域に融合された精製済の単一タンパク質は、毎日又は隔日又は１週に３回又は１週に１回、投与される。
【０１２８】
一日の投与は通常、所期の結果を得るのに効果的な分割投与形態、又は徐放形態で行われる。第２又は後続の投与は、初期又は前回の個体への投与量と同じか、これよりも少ないか、又はこれよりも多い投与量で実施することができる。第２又は後続の投与は、疾患の発現中又は発現前に行うことができる。
【０１２９】
本発明についてここで十分に説明してきたが、当業者には明らかなように、本発明の思想及び範囲を逸脱することなしに、また過度の実験を行うことなしに、同等のパラメータ、濃度及び条件の幅広い範囲内で本発明を実施することができる。
【０１３０】
具体的な実施態様と関連して本発明を説明してきたが、言うまでもなく、更なる変更を加えることができる。本出願は、一般に、本発明の原理に従う、そして、本発明が関連する技術分野においては良く知られた慣習の範囲にあるような、又は添付の特許請求の範囲に従う前記本質的な特徴に適用され得るような、本開示内容から離脱したものを含む、本発明のいかなる変更形、用途、改変形にも範囲が及ぶものとする。
【０１３１】
雑誌の論文又は抄録、公開済又は未公開の米国又は外国特許出願文献、発行済の米国又は外国特許文献、又はあらゆる他の参考文献を含む、本明細書中に引用された全ての参考文献は、引用文献中に提示された全てのデータ、表、図、及び本文を含めて、その全体を参考のため本明細書中に引用する。加えて、本明細書中に引用した参考文献中に引用された参考文献の内容全体も、全体として参考のために引用する。
【０１３２】
周知の方法ステップ、コンベンショナルな方法ステップ、周知の方法又はコンベンショナルな方法に関する言及は、本発明の態様、説明又は実施態様が関連技術において開示、教示、又は示唆されていることを承認するものでは決してない。
【０１３３】
特定の実施態様の前記説明は、発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、本発明の一般概念を逸脱することなしに、過度の実験なしに、当業者の技能範囲内の知識（本明細書中に引用した参考文献の内容を含む）を応用することにより、他者がこのような具体的な実施態様を種々の用途のために、容易に変更且つ／又は改変することができる。従って、このような改変形及び変更形は、本明細書中に提示された教示内容及び指針に基づいて、開示された実施態様の同等物の範囲内にあるものとする。言うまでもなく、本明細書中の表現又は用語は、説明を目的としたものであって、限定することを目的とはしていないので、本明細書中の表現又は用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に提示された教示内容及び指針に照らして、当業者によって解釈することができる。
【実施例】
【０１３４】
例全体を通して頻繁に使用される略語のリスト
ＢＶ： 床容積
ＣＨＯ： チャイニーズ・ハムスター卵巣
Ｃｏｎｄ．： 導電率
ＨＣＰｓ： 宿主細胞タンパク質
ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質： 下記Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体及びＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔホモ二量体
ＫＣｌ： 塩化カリウム
ｋＤａ： キロダルトン
ＮａＣｌ： 塩化ナトリウム
ＯＤ： 光学濃度
ＰＥＳ： ポリエーテルスルホン
ＰＧ： プロピレングリコール
ｑ．ｓ．： 適量
ＲＴ： 室温
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ： ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＲＰ−ＨＰＬＣ： 逆相高性能液体クロマトグラフィ
ＵＶ： 紫外線
設備
PG 200/500カラム（GE Healthcare）
MC126 Conductometer (Mettler-Toledo) ２５℃の値に対して較正
Mp120 pHメーター(Mettler-Toledo)
【０１３５】
Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体は、インターフェロン−ベータタンパク質とＦｃドメインとの融合によって形成されたＦｃ融合タンパク質である。免疫グロブリンの、Ｆｃフラグメント又はＦｃ領域とも呼ばれるＦｃドメインは、ヒンジ領域（Ｈ）と、抗体重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）ドメインとを含む２つの同一アームから成っている。Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔは、２つのサブユニット、つまり単一ＩＦＮ−βタンパク質に結合された突然変異ＩｇＧ Ｆｃアームを含む第１サブユニット（配列番号１）と、突然変異ＩｇＧ Ｆｃアームを含む第２サブユニット（配列番号１のアミノ酸１６７〜３９３に対応）とを含有する。突然変異ＩｇＧ Ｆｃアーム（配列番号１のアミノ酸１６７〜３９３）は下記突然変異形を含有する：
【表６】
【０１３６】
ＣＨＯクローンは、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの発現に関して立証されている（ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質発現ＣＨＯクローンと呼ばれる）。
Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの両サブユニットがクローンから発現されるので、タンパク質の様々な種／形態が生成され、そして下記のように称される：
「遊離Ｆｃ」（Ｆｃｍｕｔ／Ｆｃｍｕｔ二量体）
「Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ」（Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔヘテロ二量体）
「ＩＦＮ−ベータ二量体」（ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔホモ二量体）
凝集体及び切断形。
【０１３７】
シンプルなバッチ・モードで生成された細胞培養上澄み上のＲＰ−ＨＰＬＣは、「Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ」が、生成された総分子のほぼ５０％を占めることを示した。「遊離Ｆｃ」は、生成された総分子のほぼ３０％であり、また「ＩＦＮ−ベータ二量体」は、生成された総分子のほぼ２０％である。
【０１３８】
精製方法は、生成された他の形態からのＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの精製に関して立証された。Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの分子はほぼ７０ｋＤａであり、そしてｐHは約７〜７．５である。この精製方法は、遊離Ｆｃを極めて低レベルまで低減するのを可能にする青色セファロース・クロマトグラフィを含む。
【０１３９】
例１
ステップ１：タンパク質Ａ上の捕捉ステップ及び捕捉後溶出液の濾過
無血清条件下で培養されたＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質発現ＣＨＯクローンの清浄化済の採取物に、具体的にはＨＣＰｓ及びＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質の凝集体を排除するために、先ず捕捉ステップとしてタンパク質Ａアフィニティ・クロマトグラフィを施す。捕捉後溶出液を室温で解凍し、そしてMillistak + A1 HCフィルタ（照会MA1HC01FS1; Millipore）上で濾過した。濾過カセットを、下記ステップ２において記載された平衡化緩衝液１で予洗した（すなわち１００リットル／ｍ2）。濾過後、フィルタ及び濾過システムをデッドボリュームの１．５〜２倍で洗浄した。この洗浄溶液を、濾過された捕捉後溶出液と一緒に捕集し、そして混合物に、青色セファロース・クロマトグラフィを施した。
【０１４０】
ステップ２：青色セファロース・クロマトグラフィ
生成された遊離Ｆｃ画分を除去するために、青色セファロース・クロマトグラフィを展開した。
【０１４１】
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を、溶出中を除いて３００ｃｍ／ｈで一定に保った。溶出中には流量は、溶出緩衝剤の粘度が高いため１６０ｃｍ／ｈであった。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）緩衝剤
【表７】
ｂ）カラム
BPG 200/500カラム（GE Healthcare）にBlue Sepharose 6FF 樹脂(GE Healthcare)を、床高８±１ｃｍ（約２．５リットルの樹脂）までパッキングした。
【０１４２】
青色セファロース・クロマトグラフィを実施するために、下記経過を辿った（表５も参照）:
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤１の値（すなわちｐＨ：５．０±０．２及び導電率２．５±０．２ｍＳ／ｃｍ）に達するまで、少なくとも６ＢＶの緩衝剤１で、カラムを平衡化した。
−ローディング
パッキングされた樹脂１リットル当たり約４０ｇのＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＲＰ−ＨＰＬＣ分析）の最大動的容量で、ｐＨ４．５の濾過済捕捉後溶出液をカラムにローディングした。種々異なるロード容量を用いて種々のランを実施した（下記表６参照）。
−洗浄１
安定なベースラインに達するまで、少なくとも５ＢＶの緩衝剤１でカラムを洗浄した。
−洗浄２
遊離Ｆｃに対応する２８０ｎｍの吸光ピークが現れるまで、少なくとも５ＢＶの緩衝剤２でカラムを洗浄した。安定なベースラインに達するまで、洗浄を続けた。
−溶出
流量を１６０ｃｍ／ｈまで低下させた。
少なくとも９ＢＶの緩衝剤３で溶出を達成し、そして溶出液を滅菌容器内に捕集した。このＢＶの緩衝剤をカラムに適用したときに、小さな吸光ピークが２８０ｎｍで現れ得る。この小さなピークは、残留量の遊離Ｆｃなので好ましくは捕集されるべきではない。次いで、吸光ピークの主な上昇が現れたとき、安定なベースラインに達するまで、ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質に対応する溶出液を捕集する。
−洗浄３
少なくとも５ＢＶの水でカラムを洗浄した。最初は１６０ｃｍ／ｈの流量を、３００ｃｍ／ｈまで増大させた。
−再生＆浄化
少なくとも３ＢＶの緩衝剤４で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。次いでｐＨが７．０に戻るまで、約１０ＢＶの精製水で樹脂を洗浄した。
【表８】
−保管
カラムを緩衝剤５で洗浄し、そして室温で保管した。
種々異なるロード容量を用いて種々のランを実施した。
【０１４３】
結果
図１は、ラン６７のクロマトグラフィ・プロフィールを示している（試験ロード容量１８ｇ／Ｌ、表６）。経過「洗浄２」及び「溶出」に関して記載した条件を用いて、２つの明確なピークを分解した。「洗浄２」のピークを遊離Ｆｃ画分として同定した。「溶出」のピークは、精製済ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体）を表す。「洗浄２」において用いられた条件、すなわち、ｐＨ８．７±０．１の５０ｍＭ 酢酸アンモニウムは、遊離Ｆｃ画分を１〜２％に低減した。図２Ｃに示されているように、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体を含有する青色セファロースからの溶出液は、Ｆｃ部分がないことが見いだされた。青色セファロース・クロマトグラフィはまた、ＨＣＰｓ含有率の更なる低減を可能にする。下記表６は、種々のランに対応する異なる画分中の遊離Ｆｃ含有率を報告する。
【表９】
【０１４４】
ステップ３：青色セファロース溶出液の透析
プロピレングリコールの濃度を低減するために、上記ステップ２の青色セファロース・カラムの溶出液を、好適な緩衝剤（酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）中に透析した。下記緩衝剤及びカセットを使用した：
ａ）カセット
ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）中０．４６ｍ2の膜表面及び３０Ｋｄａの有孔率を有するKvick Flow Cassette（GE Healthcare, 照会56-4113-51）。透析に必要なカセット数は４である。
ｂ）緩衝剤
【表１０】
【０１４５】
結果
このステップのＯＤ及びＲＰ−ＨＰＬＣの平均収率は８０〜１００％であった。
【０１４６】
ステップ４：Fractogel SO3-上の陽イオン交換クロマトグラフィ
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を、平衡化開始時、最終洗浄（精製水）時、及び保管段階を除いて２４０ｃｍ／ｈで一定に保った。平衡化開始時、最終洗浄（精製水）時、及び保管段階には流量は、圧力が増大するため１２５ｃｍ／ｈであった。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）緩衝剤
【表１１】
ｂ）カラム
BPG 200カラム（GE Healthcare）にFractogel SO3- (Merck, 照会1.14894）を、床高８±１ｃｍ（約２．５リットルの樹脂）までパッキングした。
【０１４７】
陽イオン交換クロマトグラフィを下記のように実施した。
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤の値に達するまで、少なくとも９ＢＶの平衡化緩衝剤で、カラムを平衡化した。圧力の発生に従って、流量を１２５ｃｍ／ｈから２４０ｃｍ／ｈに徐々に増大させた。
−ローディング
パッキングされた樹脂１リットル当たり２０ｇのＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＯＤ ２８０ｎｍ）の最大動的容量で、ステップ３において記載したように透析された青色セファロース後溶出液をカラムにローディングした。
−洗浄
安定なベースラインに達するまで、少なくとも４ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤１でカラムを洗浄した。
−溶出
少なくとも１０〜１１ＢＶの溶出緩衝剤で溶出を達成し、そして溶出液を滅菌容器内に捕集した。このＢＶの緩衝剤をカラムに適用したときに、小さな吸光ピークが２８０ｎｍで現れ得る。この小さなピークは好ましくは捕集されるべきではない。次いで、吸光ピークの主な上昇が現れたとき、ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ画分を含有する溶出液を捕集する。
−再生
この段は、ＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体の排除に相当する。ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、少なくとも８ＢＶの再生緩衝剤で、カラムを再生した。
−浄化
少なくとも３ＢＶの浄化緩衝剤で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。流量を１２５ｃｍ／ｈに徐々に低下させた。次いでｐＨが７に達するまで（ｐＨ紙で制御）、樹脂を精製水で洗浄した。
−保管
カラムを少なくとも２ＢＶの保管緩衝剤で洗浄し、そして室温で保管した。
【０１４８】
結果
図３は、陽イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。使用される溶出緩衝剤は、一方ではＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを、そして他方ではＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体を分離する能力を有している。従って、溶出ピークは、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ画分を表すのに対して、再生ピークは、ＩＦＮ−ベータ二量体及び凝集体を表す。導電率が増大すると（２５ｍＳ／ｃｍまで）、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ及びＩＦＮ−ベータ二量体の分離は効果が少なくなる（結果は示さない）。陽イオン交換クロマトグラフィはまた、ＨＣＰｓ含有率の付加的な低減を可能にする。
【０１４９】
ステップ５：PPG-600Mにおける疎水性相互作用クロマトグラフィ
全ての作業を室温（２０±５℃）で実施し、そして流量を１３０ｃｍ／ｈで一定に保った。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを常に記録した。
設備：ａ）カラム
BPG 200/500カラム（GE Healthcare）にPPG-600M(Tosoh, 照会21304）を、床高１１±１ｃｍ（約３．５リットルの樹脂）までパッキングした。カラムは反対モード（維持しない）で使用し、この場合当該画分はカラムに結合されず、貫流液中に捕集される。
ｂ）緩衝剤
【表１２】
【０１５０】
疎水性相互作用クロマトグラフィを実施するために、下記経過を辿った。
−平衡化
貫流液の導電率及びｐＨが緩衝剤の値に達するまで、少なくとも５ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤で、カラムを平衡化した。
−ローディング
６６．０７ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウムが添加された、上記ステップ４で得られたFractogelカラムの溶出液を、カラムにローディングした。パッキングされた樹脂１リットル当たり１０ｇの、今やほどんどＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔだけを含有するＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔタンパク質（ＯＤ ２８０ｎｍ）の最大動的容量で、得られた製剤を樹脂上にローディングした。
−洗浄
ＵＶシグナルの安定なベースラインに達するまで、少なくとも７ＢＶの平衡化／洗浄緩衝剤でカラムを洗浄した。２８０ｎｍの吸光ピークの主な上昇が現れたとき、洗浄終了時に安定なベースラインに達するまで、精製済Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを含有する貫流液を捕集した。
−再生
凝集体及びＨＣＰｓに相当する２８０ｎｍにおける吸光ピークの安定なベースラインに達するまで、少なくとも３ＢＶの再生緩衝剤で、カラムを再生した。
−浄化
少なくとも３ＢＶの浄化緩衝剤で、カラムを浄化し、続いて３０〜６０分間にわたって待機した。次いでｐＨが７に達するまで（ｐＨ紙で制御）、樹脂を精製水で洗浄した。
−保管
カラムを少なくとも３ＢＶの保管緩衝剤で洗浄し、そして室温で保管した。
【０１５１】
結果
図４は、疎水性相互作用クロマトグラフィのクロマトグラフィ・プロフィールを示している。当該タンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）は、ローディング・ステップの未結合画分中、及び洗浄ステップの貫流液中に存在する。試験最大ロード容量は２４ｇ（ＯＤ２８０ｎｍ）／Ｌであったが、しかし凝集体及びＨＣＰｓに対する樹脂選択性は、用いられるロード容量がより低い（すなわち５〜１０ｇ／Ｌ）と、より良好であった。このステップのＯＤの平均収率は約９０％であった。疎水性相互作用クロマトグラフィは、残っているＨＣＰｓ及び凝集体の排除を可能にする。
【０１５２】
ステップ６：ナノ濾過
ステップ５で捕集された画分に、ViroSart CPVフィルタ（Sartorius)上のナノ濾過を施した。
【０１５３】
ステップ７：濃縮／最終透析
精製済Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔを含有する疎水性相互クロマトグラフィ・カラムの貫流液を、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝剤に対して透析し、そして３ｇ／ｌまで濃縮した。この緩衝剤は凝集体の発生を最小化する。
【０１５４】
結論
遊離Ｆｃを極めて低いレベルまで低減することを可能にするステップを含む効率的な精製方法が、Ｆｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔの精製のために確立された。青色セファロース・クロマトグラフィのために開発された特定の洗浄条件が、遊離Ｆｃ画分量を効率的に低減した。適用されたクロマトグラフィ・ステップ、すなわち、陽イオン交換クロマトグラフィ、及びこれに続く疎水性相互作用クロマトグラフィは、均質になった当該タンパク質（すなわちＦｃｍｕｔ／ＩＦＮβ−Ｆｃｍｕｔ）を得るのを可能にした。
【０１５５】
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24. 国際公開第２００５／００１０２５号パンフレット
25. 欧州特許第１２３０３５４号明細書
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ融合タンパク質を含む流体中に存在する遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤を精製する方法であって、該方法が：
（ａ） 青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂上に前記流体をローディングし；
（ｂ） ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で該樹脂を洗浄し、これにより、該遊離Ｆｃ部分を該樹脂から排除し；そして
（ｃ） 該Ｆｃ融合タンパク質を該樹脂から溶出する
ステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが、固定化されたシバクロンブルー(Cibacron Blue） F3G-Aを有する樹脂を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂のために使用される樹脂が、ブルーセファロース（Blue Sepharose） FF樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）が、パッキングされた青色セファロース樹脂１リットル当たり４０ｇのＦｃ融合タンパク質の最大動的容量で、青色セファロース樹脂をローディングすることを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記流体が、ステップ（ａ）において、約ｐＨ５の該樹脂上にローディングされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ｐＨ８．７±０．２の酢酸アンモニウム緩衝剤を使用して行われる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該酢酸アンモニウムが５０ｍＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、少なくとも酢酸アンモニウムとプロピレングリコールとを含有するｐＨ８．５±０．２の溶出緩衝剤を使用して行われる、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）から生じる青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂の溶出液が、１μｇのＦｃ融合タンパク質をローディングしたときに、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によっては検出することができない遊離Ｆｃ部分レベルを有している、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）で、前記Ｆｃ融合タンパク質を含む流体が、濾過されたタンパク質Ａクロマトグラフィ溶出液である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域の部分を含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記定常領域がヒト定常領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定常領域が、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１２から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、好ましくはＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βが：
（ａ） 配列番号１又は３；
（ｂ） 高緊縮条件下で配列番号２又は４の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；及び
（ｃ） （ａ）のポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも８０％又は８５％又は９０％又は９５％である（ａ）の突然変異タンパク質
から選択されたポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数の追加的なステップを含む、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１又は複数の追加的なステップが、Ｆｃ融合タンパク質製剤からの、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の分離を可能にする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｃ領域に融合された該単一タンパク質が、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆｃ領域に融合された該単一タンパク質が、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βである、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載のポリペプチドを精製する方法であって：
（ａ） ポリペプチドを含む流体にタンパク質Ａクロマトグラフィを施し；
（ｂ） ステップ（ａ）の溶出液に、青色色素クロマトグラフィを施し；
（ｃ） ステップ（ｂ）の溶出液に、陽イオン交換クロマトグラフィを施し；
（ｄ） ステップ（ｃ）の溶出液に、疎水性相互作用クロマトグラフィを施し；そして
（ｅ） ステップ（ｄ）の該疎水性相互作用クロマトグラフィの貫流液を捕集する
ステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載のポリペプチドを精製する方法であって：
（ａ） ポリペプチドを含む流体にタンパク質Ａクロマトグラフィを施し；
（ｂ） ステップ（ａ）の溶出液に、青色色素クロマトグラフィを施し；
（ｃ） ステップ（ｂ）の溶出液に、陰イオン交換クロマトグラフィを施し；
（ｄ） ステップ（ｃ）の溶出液に、サイズ排除クロマトグラフィを施し；そして
（ｅ） ステップ（ｄ）のサイズ排除クロマトグラフィの溶出液を捕集する
ステップを含む、方法。
【請求項２４】
さらに、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を医薬組成物中に製剤することを含む、請求項１８から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低減するための、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの使用。
【請求項２６】
遊離Ｆｃ部分の濃度が、前記製剤の総タンパク質濃度の約５％未満又は約２％未満又は約１％未満に低減される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するための、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとの使用。
【請求項２８】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法によって精製されたＦｃ融合タンパク質。
【請求項２９】
総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が、約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である、請求項２８に記載の精製済Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項１８から２３までのいずれか１項に記載の方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質。
【請求項３１】
Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βから成る、請求項３０に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質。
【請求項３２】
Ｆｃ領域が突然変異Ｆｃ領域である、請求項３０又は３１に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質。
【請求項３３】
請求項３０から３２までのいずれか１項に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１】
Ｆｃ融合タンパク質を含む流体中に存在する遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤を精製する方法であって、該方法が：
（ａ） 青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂上に前記流体をローディングし；
（ｂ） ｐＨが約８．４〜約８．９の緩衝剤で該樹脂を洗浄し、これにより、該遊離Ｆｃ部分を該樹脂から排除し；そして
（ｃ） 該Ｆｃ融合タンパク質を該樹脂から溶出する
ステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の青色色素アフィニティ・クロマトグラフィが、固定化されたシバクロンブルー(Cibacron Blue） F3G-Aを有する樹脂を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂のために使用される樹脂が、ブルーセファロース（Blue Sepharose） FF樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）が、パッキングされた青色セファロース樹脂１リットル当たり４０ｇのＦｃ融合タンパク質の最大動的容量で、青色セファロース樹脂をローディングすることを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記流体が、ステップ（ａ）において、約ｐＨ５の該樹脂上にローディングされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ｐＨ８．７±０．２の酢酸アンモニウム緩衝剤を使用して行われる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該酢酸アンモニウムが５０ｍＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、少なくとも酢酸アンモニウムとプロピレングリコールとを含有するｐＨ８．５±０．２の溶出緩衝剤を使用して行われる、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）から生じる青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂の溶出液が、１μｇのＦｃ融合タンパク質をローディングしたときに、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によっては検出することができない遊離Ｆｃ部分レベルを有している、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）で、前記Ｆｃ融合タンパク質を含む流体が、濾過されたタンパク質Ａクロマトグラフィ溶出液である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域の部分を含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記定常領域がヒト定常領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記定常領域が、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１２から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質、好ましくはＦｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βが：
（ａ） 配列番号１又は３；
（ｂ） 高緊縮条件下で配列番号２又は４の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；及び
（ｃ） （ａ）のポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも８０％又は８５％又は９０％又は９５％である（ａ）の突然変異タンパク質
から選択されたポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数の追加的なステップを含む、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１又は複数の追加的なステップが、Ｆｃ融合タンパク質製剤からの、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質の分離を可能にする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｃ領域に融合された該単一タンパク質が、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィ樹脂に結合することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆｃ領域に融合された該単一タンパク質が、Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βである、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載のポリペプチドを精製する方法であって：
（ａ） ポリペプチドを含む流体にタンパク質Ａクロマトグラフィを施し；
（ｂ） ステップ（ａ）の溶出液に、青色色素クロマトグラフィを施し；
（ｃ） ステップ（ｂ）の溶出液に、陽イオン交換クロマトグラフィを施し；
（ｄ） ステップ（ｃ）の溶出液に、疎水性相互作用クロマトグラフィを施し；そして
（ｅ） ステップ（ｄ）の該疎水性相互作用クロマトグラフィの貫流液を捕集する
ステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載のポリペプチドを精製する方法であって：
（ａ） ポリペプチドを含む流体にタンパク質Ａクロマトグラフィを施し；
（ｂ） ステップ（ａ）の溶出液に、青色色素クロマトグラフィを施し；
（ｃ） ステップ（ｂ）の溶出液に、陰イオン交換クロマトグラフィを施し；
（ｄ） ステップ（ｃ）の溶出液に、サイズ排除クロマトグラフィを施し；そして
（ｅ） ステップ（ｄ）のサイズ排除クロマトグラフィの溶出液を捕集する
ステップを含む、方法。
【請求項２４】
さらに、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を医薬組成物中に製剤することを含む、請求項１８から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を含有するＦｃ融合タンパク質製剤中の遊離Ｆｃ部分の濃度を低減するための、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィの使用。
【請求項２６】
遊離Ｆｃ部分の濃度が、前記製剤の総タンパク質濃度の約５％未満又は約２％未満又は約１％未満に低減される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
Ｆｃ融合タンパク質製剤及び遊離Ｆｃ部分から、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質を分離するための、青色色素アフィニティ・クロマトグラフィと、アフィニティ・クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ナノ濾過、又は限外濾過のうちの１又は複数のステップとの使用。
【請求項２８】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法によって精製されたＦｃ融合タンパク質。
【請求項２９】
総タンパク質中の遊離Ｆｃ部分の濃度が、約５％未満又は約２％未満又は約１％未満である、請求項２８に記載の精製済Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項１８から２３までのいずれか１項に記載の方法によって精製された、Ｆｃ領域に融合された単一タンパク質。
【請求項３１】
Ｆｃ領域に融合された単一ＩＦＮ−βから成る、請求項３０に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質。
【請求項３２】
Ｆｃ領域が突然変異Ｆｃ領域である、請求項３０又は３１に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質。
【請求項３３】
請求項３０から３２までのいずれか１項に記載のＦｃ領域に融合された精製済単一タンパク質を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５００７５６（Ｐ２０１１−５００７５６Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３０４２８（Ｐ２０１０−５３０４２８）
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４２０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５３３５８
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４２０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５３３５８
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
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