【課題】新規なＤＮＡの同定および単離、ならびにα−サブユニットレセプターであるＧＦＲα３配列の存在によって特徴付けられる新規なポリペプチドの組換え産生方法の提供。
【解決手段】ＧＤＮＦ（すなわち、ＧＦＲ）レセプターファミリーの新規なα−サブユニットレセプターである哺乳動物ＧＦＲα３、発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドプローブ、ポリペプチド、ベクターおよび宿主細胞、ならびにこの哺乳動物ＧＦＲα３に対する免疫付着因子および抗体。さらに、チロシンキナーゼレセプター活性化（すなわち、自己リン酸化）、またはリガンド誘導α−サブユニットレセプターのホモ二量体化もしくはホモ−オリゴマー化に関連する他の活性を検出することによるα−サブユニットレセプターの活性化を測定する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９の配列を含むＧＦＲα３（グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリーレセプターα−３）ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離された核酸。
【請求項２】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸１〜３７９の配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記核酸が、（ａ）配列番号１７のアミノ酸２７〜３６９の配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１７のアミノ酸残基２７〜３６９を有するＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１７のアミノ酸残基１〜３６９を有するＧＦＲα３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項６】
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号２０９７５１（名称ＤＮＡ ４８６１４−１２６８）中のｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離された核酸。
【請求項７】
ＡＴＣＣ受託番号２０９７５１（名称ＤＮＡ ４８６１４−１２６８）中のｃＤＮＡのＧＦＲα３コード配列、またはその配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９の配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する核酸を含む、単離された核酸。
【請求項９】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸８４〜３２９の配列を含むＧＦＲα３ポリペプチドをコードする核酸分子、または（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補体、にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＧＦＲα３コード配列を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結された、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＧＦＲα３の発現に適切な条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該細胞培養物からＧＦＲα３を回収する工程、を包含する、ＧＦＲα３ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１５】
配列番号１７のアミノ酸残基８４〜３２９と少なくとも６５％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
単離されたネイティブ配列ＧＦＲα３ポリペプチドである、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１７のアミノ酸残基２７〜３６９を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
異種アミノ酸配列に融合された請求項１５に記載のＧＦＲα３ポリペプチドを含む、キメラ分子。
【請求項１９】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項１８に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１８に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
請求項１５に記載のＧＦＲα３ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項２２】
アゴニスト抗体である、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
末梢のニューロン障害を処置するための、請求項２１に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
α−サブユニットレセプターのアゴニスト結合ドメインを含むポリペプチドに対するアゴニスト結合を測定するための方法であって、細胞膜に位置する該ポリペプチドを候補アゴニストに曝露する工程、および該ポリペプチドのホモ二量体化またはホモオリゴマー化を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲα−レセプターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドがさらに、二量体化活性化酵素ドメインまたはオリゴマー化活性化酵素ドメインを含み、そしてホモ二量体化またはホモオリゴマー化が該ポリペプチドの酵素活性を測定することによって検出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素ドメインが、レセプターチロシンキナーゼの細胞内自己触媒ドメインであり、そしてホモ二量体化またはホモオリゴマー化が、該ポリペプチドの自己リン酸化を測定することによって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、チロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを含むポリペプチドレセプター構築物の自己リン酸化を測定する方法であって、以下の工程： （ａ）真核生物細胞が第１の固相に付着するように、該細胞の均一の集団で該第１の固相をコートする工程であって、ここで該細胞はその膜内に位置する該ポリペプチドレセプター構築物を有する、工程；
（ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程；
（ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を遊離させる工程；
（ｄ）該フラッグエピトープに特異的に結合する捕捉薬剤が、第２の固相に付着するように、該捕捉薬剤で該第２の固相をコートする工程；
（ｅ）該レセプター構築物が該第２の固相に付着するように、該付着している捕捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程；
（ｆ）該第２の固相を洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程；
（ｇ）該付着しているレセプター構築物を、該チロシンキナーゼレセプター中のリン酸化チロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に曝露する工程；および （ｈ）該付着しているレセプター構築物への該抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項２９】
前記細胞が、工程（ａ）の前に前記レセプター構築物をコードする核酸で形質転換される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が哺乳動物細胞株を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が付着性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記捕捉薬剤が捕捉抗体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の固相が、第１のアッセイプレートのウェルを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ホスホチロシン抗体が標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記標識が、発色試薬に曝露される酵素を含み、該発色試薬の色の変化が工程（ｈ）において測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記フラッグポリペプチドが、前記α−サブユニットレセプターリガンド結合ドメインのアミノ末端に融合される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記フラッグポリペプチドが、前記チロシンキナーゼレセプター細胞内触媒ドメインのカルボキシル末端に融合される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記チロシンキナーゼレセプターが、Ｒｓｅレセプター、ｔｒｋ Ａレセプター、ｔｒｋ Ｂレセプターまたはｔｒｋ Ｃレセプターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲα−レセプターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記レセプター構築物がさらに前記Ｒｓｅレセプターの膜貫通ドメインを含み、そして前記フラッグエピトープが前記ｇＤポリペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記分析物がα−サブユニットレセプターについてのアゴニストを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記分析物がα−サブユニットレセプターについてのアンタゴニストを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンタゴニストが、前記α−サブユニットレセプターに対するアゴニストによる該α−サブユニットレセプターの結合または活性化を競合的に阻害し、そして工程（ｂ）の後に、前記付着している細胞が該アゴニストに曝露される工程が続く、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記分析物が、前記α−サブユニットレセプターについてのアンタゴニストおよびアゴニストを含む組成物であり、そして前記アッセイが、該アゴニストに結合しそれによって該アゴニストによる前記ポリペプチド構築物の活性化を低減する該アンタゴニストの能力を測定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、チロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを含むポリペプチドレセプター構築物の自己リン酸化を測定するための方法であって、以下の工程： （ａ）付着性細胞が第１のアッセイプレートのウェルに付着するように、該細胞の均一の集団で該ウェルをコートする工程であって、ここで該細胞は、その細胞膜内に位置する該ポリペプチドレセプター構築物を有する、工程；
（ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程；
（ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を遊離させる工程；
（ｄ）該ポリペプチドレセプター構築物に特異的に結合する捕捉薬剤が、第２のアッセイプレートのウェルに付着するように、該捕捉薬剤で該ウェルをコートする工程；
（ｅ）該ポリペプチド構築物が該ウェルに付着するように、該付着している捕捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程；
（ｆ）該ウェルを洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程；
（ｇ）該付着しているポリペプチドレセプター構築物を、該ポリペプチドレセプター構築物中のリン酸化チロシン残基に選択的に結合する抗ホスホチロシン抗体に曝露する工程；および （ｈ）該付着しているポリペプチドレセプター構築物への該抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項４６】
前記α−サブユニットレセプターが、ＧＦＲ−αレセプターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、フラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項４８】
前記フラッグポリペプチドがｇＤフラッグエピトープを含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記チロシンキナーゼレセプターがＲｓｃレセプターである、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記Ｒｓｅレセプターの膜貫通ドメインをさらに含む、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記α−サブユニットレセプターがＧＦＲαレセプターである、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉薬剤でコートされた固相、ならびにα−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、フラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメインを含むポリペプチドを含む、キット。
【請求項５３】
前記固相がマイクロタイタープレートのウェルを含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
標識された抗ホスホチロシン抗体をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
前記標識が酵素を含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、フラッグポリペプチド、およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、を含むポリペプチドをコードする核酸で形質転換された細胞をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５７】
α−サブユニットレセプターのリガンド結合ドメイン、キナーゼレセプターの細胞内触媒ドメイン、およびフラッグエピトープを含むポリペプチドレセプター構築物のリン酸化を測定するためのアッセイであって、以下の工程： （ａ）真核生物細胞が第１の固相に付着するように、該細胞の均一の集団で該第１の固相をコートする工程であって、ここで該細胞は該ポリペプチドレセプター構築物を含む、工程；
（ｂ）該付着している細胞を分析物に曝露する工程；
（ｃ）該付着している細胞を溶解させ、それによって該細胞から細胞溶解物を遊離させる工程；
（ｄ）該フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉薬剤が、第２の固相に付着するように、該捕捉薬剤で該第２の固相をコートする工程；
（ｅ）該レセプター構築物が該第２の固相に付着するように、該付着している捕捉薬剤を工程（ｃ）において得られる該細胞溶解物に曝露する工程；
（ｆ）該第２の固相を洗浄し、結合していない細胞溶解物を除去する工程；
（ｇ）該付着しているキナーゼ構築物を、該レセプター構築物中のリン酸化された残基を同定する抗体に曝露する工程；および （ｈ）該付着しているレセプター構築物への該抗体の結合を測定する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項５８】
前記α−レセプターがＧＦＲα−レセプターである、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項５９】
前記キナーゼレセプターがセリン−トレオニンキナーゼレセプターである、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項６０】
ホスファターゼ活性を測定する、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項６１】
前記真核生物細胞がさらにホスファターゼを含み、そして工程（ｃ）の前に、該細胞をホスファターゼインヒビターに曝露する工程をさらに包含する、請求項６０に記載のアッセイ。
【請求項６２】
工程（ｆ）と（ｇ）との間に、前記付着しているキナーゼ構築物をホスファターゼに曝露する工程、次いで前記第２の固相を洗浄し、結合していないホスファターゼを除去する工程をさらに包含する、請求項６０に記載のアッセイ。

【図２】

【図３】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公開番号】特開２００９−１７１９７４（Ｐ２００９−１７１９７４Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−５８４２１（Ｐ２００９−５８４２１）
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【分割の表示】特願２０００−５３８０００（Ｐ２０００−５３８０００）の分割
【原出願日】平成１１年３月１９日（１９９９．３．１９）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】