Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬に感受性を示す細胞・組織におけるＤＮＡの簡便検査方法
【課題】ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の感受性を示す組織におけるＤＮＡの簡便な検査方法及びそれに用いられるプライマーセットを提供すること。
【解決手段】特定の塩基配列からなる第１のプライマー、特定の塩基配列からなる第２のプライマー、特定の塩基配列からなる第３のプライマーおよびこれらのプライマーを含んでなるプライマーセットとし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対して電気泳動を行うことで、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列からなる第１のプライマー、特定の塩基配列からなる第２のプライマー、特定の塩基配列からなる第３のプライマーおよびこれらのプライマーを含んでなるプライマーセットとし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対して電気泳動を行うことで、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬に感受性を示す細胞・組織におけるDNAの検査方法に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＮＳＣＬＣ）の治療に用いられる医薬品ｇｅｆｉｔｉｎｉｂは、２００２年７月に世界に先駆けて我が国で最初に承認された分子標的薬剤であり、本邦では、２００４年１２月末までに推定８万６千人以上が使用した。しかし、間質性肺炎等の重篤な肺障害の副作用が現れた患者数は報告されただけで１４７３人に上り、そのうち５８８人が死亡するに至っている。なお、患者３０００人を対象とした市販後調査では、日本におけるこの副作用の発症率は突出して高いとされ、米国の７倍から２０倍とも言われている。
【０００３】
しかしながら本剤は、奏効する患者には劇的な効果を示し、極めて有効な薬剤であることも事実である。したがって、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者（レスポンダー）を事前に予測することが可能となれば、重篤な副作用発生の危険を冒しながら効かない患者（ノンレスポンダー）に対して投与することは避けられ、レスポンダーのみに投薬する、即ち適正使用が実現できると考えられる。
【０００４】
最近、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂが劇的に奏効した患者のほぼ全例において、本剤の標的分子であるＥＧＦＲのキナーゼドメインをコードする遺伝子領域とその近傍に特徴的な体細胞変異が認められ、本剤が奏効しなかった患者にはそれら体細胞変異が認められなかったことが報告されている。これら遺伝子変異を有するＥＧＦＲは、野生型に比べ活性が上昇しており、薬剤がより有効に作用するものと考えられている。この現象は、海外における複数の異なる医療機関から報告されているが、観察された症例数は未だ十分とは言えない。厚生労働省は、２００５年１月２０日に検討会を開催し、現時点において使用を制限する等の措置を講じる必要性は乏しく、引き続き安全対策をとりつつ適正使用を進めることが適当としながら、ＥＧＦＲ遺伝子変異と本剤の治療成績についての研究を早急に進めるべき、との見解を発表している。特に、日本人においては、特定の変異の頻度が欧米人に比べて著しく高いとの報告があり、本邦における検証が急務である。
【０００５】
Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者において見出された体細胞変異のうち、その大部分はｅｘｏｎ１９中の塩基欠失型変異と、ｅｘｏｎ２１中の一塩基置換によるＬ８５８Ｒ及びＬ８６１Ｑのミスセンス変異であり、これら３種類の遺伝子変異を検出するだけで、既に報告されているｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者症例における体細胞変異の９割以上が説明可能と考えることができる。
【０００６】
さらに本邦では未だ承認されていないが、海外ではすでに承認されている薬剤で、本剤と同様にＥＧＦＲを標的分子とした類薬（例えば、ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）も、同じ変異を有する患者で有効であることが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記変異を検出する方法は、現時点において患者腫瘍組織の細胞より抽出したゲノムＤＮＡから特異的に増幅したＥＧＦＲ遺伝子における当該領域の塩基配列（シーケンス）解析が一般的であって、簡便に検査できるキットは世界的にも存在しない。
【０００８】
しかも、上記シーケンス解析では、自動解析装置に掛けるまでに手間のかかる操作及びコストがかかるという課題がある。具体的にはおよそ以下の操作が必要となる。
【０００９】
（１）ＰＣＲによるＥＧＦＲ遺伝子の特異的増幅（２〜３時間）
（２）電気泳動、或いはスピンカラム等によるＰＣＲ産物の精製とシーケンス反応の鋳型となる精製ＰＣＲ産物の定量操作（１〜１．５時間）
（３）高価な専用試薬とシーケンス用プライマーによるシーケンス反応（３時間）
（４）シーケンス反応生成物の濃縮、ｂｕｆｆｅｒへの再溶解と熱変性（０．５時間）
（５）自動シーケンサーへのセット、自動解析（１時間/１サンプル）
【００１０】
以上の全操作を連続的に行った場合、要する時間は最短で７時間程度ではあるが、自動シーケンサーにセットするまでの操作の自動化は現時点では困難であり、かなりの人手が必要である。また、シーケンス解析は、試料の調製具合などにより、必ずしも明確に判読できる結果が得られるとは限らない。特に腫瘍組織のようなヘテロな細胞集団では、採取した組織で変異を有する細胞が小集団である場合は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ上のピークにおいて、ノイズとの判別が困難な場合が多い。加えて、ＤＮＡシーケンサーを用いるため、シーケンサーの操作に熟練した者が実施する必要がある。
【００１１】
以上、本発明は、上記課題に着目し、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の感受性を示す組織におけるＤＮＡの簡便な検査方法及びそれに用いられるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者は、一般的なサーマルサイクラーと電気泳動装置を用いて実施可能な方法を開発した。つまり具体的には以下の手段を採用する。
【００１３】
まず、第一の手段として、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーの少なくともいずれかを用いることとし、更に望ましくは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを有するプライマーをセットとする。これらプライマーを用いることでＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９の増幅が可能となり、しかも前記のプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ、及び電気泳動を行なうことで後述の遺伝子変異の判定が実現できる。
【００１４】
また、第二の手段として、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の応答性遺伝子変異の判定方法において、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、ＰＣＲを行う工程により得られたＰＣＲ産物に対して電気泳動を行う工程、とする。これにより、上記の効果に加え、ごく一般的なサーマルサイクラーと電気泳動装置があれば判定が可能となるため、人手及び判別・機器操作の熟練についての負担の軽減が図れ、要する時間もシーケンス解析に比べ極めて短縮できる。更に、コストの面でも遥かに安価となる。
【００１５】
また、第三の手段として、配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーの少なくともいずれかを用いることとし、更にのぞましくは配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーを含んでなるプライマーをセットとする。これらプライマーを用いることでＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２１の増幅が可能となり、しかも前記のプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ、及び制限酵素を用いたＰＣＲ産物の切断を介して後述の遺伝子変異の判定が実現できる。
【００１６】
また、第四の手段として、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の応答性遺伝子変異の判定方法において、配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、前記ＰＣＲを行う工程により得られたＰＣＲ産物に対して制限酵素処理を行ってＰＣＲ産物の切断を行なう工程、を有するものとし、望ましくは制限酵素としてＥａｅＩ、あるいはそのイソシゾマー、ＰｖｕＩＩ、あるいはそのイソシゾマーの少なくともいずれかを用いることが望ましい。これにより、上記の効果に加え、ごく一般的なサーマルサイクラー、電気泳動装置と恒温槽を用いることで判別が可能となり、人手及び判別・機器操作の熟練についての負担の軽減が図れ、要する時間ももシーケンス解析に比べ極めて短縮できる。更に、コストの面でも遥かに安価となる。なお、上述の第一乃至第三及び本手段におけるプライマーは、同一の増幅条件にてＰＣＲを行うよう設計されているため、ＰＣＲで増幅する場合、上記効果に加え、各反応を同時に実施することができるという利点もある（即ち３種類の変異を判定するためには、ｅｘｏｎ１９用とｅｘｏｎ２１用の２本のＰＣＲチューブを同じサーマルサイクラーにセットするだけで良い）。
【発明の効果】
【００１７】
以上、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の感受性を示す組織におけるＤＮＡの簡便検査方法、及びそれに用いられるプライマーセットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【実施例】
【００１９】
（ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異検出法）
ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異には、いくつかの欠失パターンが認められるが、既知のその全てに共通しているものは、コドン７４７から７５０までのコアとなる４アミノ酸残基ＬＲＥＡ（ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、アラニン）の欠失である。従って、この４アミノ酸残基の欠失を特異的に検出するように以下のプライマーを設計した（配列番号１〜３参照）。
【００２０】
Ｅｘ１９Ｆ ：５’−ＡＴＣＧＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣ−３’
Ｅｘ１９ｍｉｄＲ ：５’−ＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣ―３’
Ｅｘ１９Ｒ ：５’−ＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧ−３’
【００２１】
そして、上記３種類のプライマーを、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）２．０μＬ、Ｅｘ１９Ｆプライマー （２０μＭ）０．５μＬ、Ｅｘ１９ｍｉｄＲ、及びＥｘ１９Ｒプライマー（各１０μＭ）０．５μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡpｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ ５ｕｎｉｔ／μＬを使用）１ｕｎｉｔ、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ０．５〜１．０μＬ（１０〜５０ｎｇ）、残りは水とする２５μＬの反応溶液を調製してＰＣＲを行った。なお、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、各プライマーの濃度、鋳型となるゲノムＤＮＡの量は適宜調節が可能である。またＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅも他社製のものに変更が可能である。
【００２２】
ＰＣＲの条件としては、９４℃３ｍｉｎの熱変性の後、９５℃２０ｓｅｃのサイクル熱変性、５６℃３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃４５ｓｅｃの伸長反応を３５〜４０サイクル程度行う。実施例では３５サイクル行なった。
【００２３】
ＰＣＲ後の産物は、その適量（３〜５μＬ程度）を３％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にて泳動する。実施例では５μＬを泳動した。野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の泳動パターンは泳動時間が短かすぎる際にはほぼ同じように見え、誤判定の原因となるので、５０Ｖ低電圧で泳動する場合は少なくとも１５分後に判定を行なうことが極めて望ましい（１００Ｖではもっと短くても良い。）
【００２４】
図１に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）及び変異型ホモ接合体（ｄｅｌ／ｄｅｌ）をそれぞれ代表する検体を判定した結果を示す。なお図１（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対応するダイレクトシーケンスの結果を、図１（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００２５】
図１（Ａ）の結果では、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）において明瞭なｅｌｅｃｔｒｏ− ｐｈｅｒｏｇｒａｍが得られていないことが分かる。ダイレクトシーケンスにおいては、理論上、ヘテロ接合体の場合は、図面左端から塩基欠失部位（野生型ホモ接合体で黒四角で囲んだ１２塩基領域）までは単一の明瞭なピークパターンを示すはずであり、実際、自動解析時のピーク同定では、野生型ホモ接合体及び変異型ホモ接合体とほぼ同じ塩基がアサインされている。一方、欠失部位以降はフレームシフトのため、理論上、バラバラのピークパターンを示すはずであり、実際そうなっている。しかし、この実施例によると、欠失部位以前も明瞭な解析結果が得られていない。これは、ＰＣＲ産物がヘテロデュープレックスを生成することによるシーケンス反応の妨害が主な原因と考えられ、一般の施設ではシーケンス反応の失敗か、変異の存在を意味する結果であるかの判別が付きにくく、判定結果を下すことは容易ではない（明確な結論を得るためには、ＰＣＲ産物のサブクローニングとさらなるシーケンスが必要である）。
【００２６】
これに対し、図１（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では予想される２３５ｂｐのメインバンドと、１６４ｂｐのバンド、更には、これらバンドよりも高分子量の位置にあるバンドが出現する。この高分子量のバンドは上記２種類のＰＣＲ産物のヘテロデュープレックスに起因するバンドであって、無関係のゲノムＤＮＡ領域から増幅した非特異的な産物ではない。なお、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）においてもこのヘテロデュープレックスに起因するバンドが生じるが、更に、野生型ホモ接合体のメインバンドのやや上に別のヘテロデュープレックスに起因する新たなバンドが出現する。このバンドは、野生型遺伝子から得られる２３５ｂｐのバンドと、図１（Ｂ）の例では変異型遺伝子から得られる２２３ｂｐのバンドから生じるヘテロデュープレックスである。また、変異型ホモ接合体（ｄｅｌ／ｄｅｌ）では、欠失した塩基数だけ短いバンドが一本のみ検出されている（図１（Ｂ）では２２３ｂｐのバンドのみ検出されている）。
【００２７】
以上、本検査法は、２本のプライマーを用いる通常のＰＣＲではなく、３本のプライマーを同時に用いたＰＣＲを行った後に、更にその増幅産物同士がヘテロデュープレックスを生成する点に着目して開発した点が主たる特徴であって、これにより野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の判別を可能とする。なお、腫瘍組織から抽出したＤＮＡでは、ヘテロ接合体で検出されることがほとんどであると報告されているが、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団が採取した組織内に等量に含まれることはむしろ稀である。その場合、シーケンス解析によって、欠失型変異の存在をｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏ− ｇｒａｍから判定するのは更に至難の技と考えられるが、本判定法はヘテロデュープレックスの出現を検出する方法であるため、容易に判定が可能である。
【００２８】
（ｅｘｏｎ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換変異の検出法）
既に報告されているｅｘｏｎ２１の変異では、コドン８５８のロイシンがアルギニンに置換する一塩基置換型変異（Ｔ＞Ｇ）が最も多く、この変異は欧米人に比べ日本人で著しく多いとされている。この塩基置換は制限酵素ＥａｅＩ、あるいはそのイソシゾマーの認識配列（Y／GGCCR）の消失を招くため、変異部位を挟んでＰＣＲを行い、制限酵素での切断で変異を検出できるよう、以下のプライマーを設計した（配列番号４、５参照）。
【００２９】
Ｅｘ２１Ｆ：５’−ＴＧＧＡＴＣＡＧＴＡＧＴＣＡＣＴＡＡＣＧ−３’
Ｅｘ２１Ｒ：５’−ＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧ−３’
【００３０】
そして、上記２種類のプライマーを、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）２．０μＬ、Ｅｘ２１Ｆプライマー及びＥｘ２１Ｒプライマー（各１０μＭ）０．５μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡpｏｌｙｍｅｒａ―ｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ ５ ｕｎｉｔ／μＬを使用）１ｕｎｉｔ、ｔｅｍｐｌａ―ｔｅ ＤＮＡ０．５〜１．０μＬ（１０〜５０ｎｇ）、残りは水とする２５μＬの反応溶液を調製してＰＣＲを行った。なお、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、各プライマーの濃度、鋳型となるゲノムＤＮＡの量は適宜調節が可能である。またＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅも他社製のものに変更が可能である。なおＰＣＲの増幅条件は上記ｅｘｏｎ１９の増幅と同じ条件とした。
【００３１】
ＰＣＲ後の産物（３７６ｂｐ）は、その適量（１〜５μＬ程度）を制限酵素で切断する。実施例では１μＬを以下の切断反応に用いた。典型的な切断反応液の組成として、ＰＣＲ産物１．０μＬ、ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ１を使用）１．５μＬ、水１２．０μＬ、ＥａｅＩ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬを用いた。これを３７℃で３０分〜一夜切断し、その全量を３％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にて泳動する（なお、ＥａｅＩを制限酵素として用いた場合、切断反応は極めて速やかに進行するため、約３０分で判定は可能となる）。また、泳動時間は５０Ｖ低電圧の場合、１０分で可能である。切断反応液の組成は、増幅産物の量などによって適宜調節・変更が可能であり、泳動時間・電圧等も変更可能である。さらに、今回は制限酵素として、ＥａｅＩを用いたが、同じ認識配列（Y／GGCCR、ＹはＣかＴ、ＲはＡかＧを示す）を共有する制限酵素（イソシゾマー）、例えばＣｆｒＩなどを使用することも可能である。
【００３２】
図２に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｍｔ）及び変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）の検体を判定した結果を示す。なお図２（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対するダイレクトシーケンスの結果を、図２（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００３３】
図２（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では
本酵素により２４９ｂｐと１２７ｂｐに切断されることが確認できるが、変異型ホモ接合体では切断されず３７６ｂｐのままであり、ヘテロ接合体では、これら３種類のバンド全てが検出されていることが分かる。
【００３４】
以上、本検査法では、上記設計した２本のプライマーを用いてＰＣＲを行った後に、制限酵素によって変異部位を含む領域を切断することにより、野生型ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び変異型ホモ接合体の検体の判別が可能となった。
【００３５】
（ｅｘｏｎ２１、Ｌ８６１Ｑをもたらす一塩基置換変異の検出法）
Ｅｘｏｎ２１においてアミノ酸置換をもたらす既知の変異のうち、もう一種類は、コドン８６１のロイシンがグルタミンに置換する一塩基置換型変異（Ｔ＞Ａ）である。この塩基置換は、制限酵素ＰｖｕＩＩの認識配列（ＣＡＧ／ＣＴＧ）の出現を招くため、変異部位を挟んでＰＣＲを行い、制限酵素での切断で変異を検出することができる。変異の部位が上記コドン８５８に近接しているため、Ｌ８５８Ｒ変異を判定するために増幅したＰＣＲ産物を利用して、制限酵素をＰｖｕＩＩに変更するだけで判定が可能となる。今回は制限酵素として、ＰｖｕＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を用いたが、そのイソシゾマー、例えばＢａｖＩやＤｍａＩなどを使用することも可能である。
【００３６】
本検査において使用するプライマー、反応溶液、反応条件については上述のｅｘｏｎ ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換変異の検出法と全く同じくすることができる。ただし、ＰｖｕＩＩを制限酵素として用いる場合、切断反応が比較的緩やかであるため、完全な切断には７時間程度を要するが、陽性対象と同時に行なえば３０分の消化でも判定は不可能ではない。しかし、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団が均等に含まれていない場合、誤判定を避けるためには切断反応に充分な時間（理想的には一夜）をかけることが望ましい。
【００３７】
図３に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｍｔ）及び変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）の検体を判定した結果を示す。なお図３（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対するダイレクトシーケンスの結果を、図３（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００３８】
図３（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では切断されず３７６ｂｐのままであるが、変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）では本酵素により２５９ｂｐと１１７ｂｐに切断され、また、ヘテロ接合体では、これら３種類のバンド全てが検出されていることが分かる。
【００３９】
以上、本検査法では、上記設計した２本のプライマーを用いてＰＣＲを行った後に、制限酵素によって変異部位を含む領域を切断することにより、野生型ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び変異型ホモ接合体の検体の判別が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異検出法による結果を示す図
【図２】Ｅｘｏｎ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換型変異の検出法による結果を示す図
【図３】Ｅｘｏｎ２１、Ｌ８６１Ｑをもたらす一塩基置換型変異の検出法による結果を示す図
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬に感受性を示す細胞・組織におけるDNAの検査方法に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＮＳＣＬＣ）の治療に用いられる医薬品ｇｅｆｉｔｉｎｉｂは、２００２年７月に世界に先駆けて我が国で最初に承認された分子標的薬剤であり、本邦では、２００４年１２月末までに推定８万６千人以上が使用した。しかし、間質性肺炎等の重篤な肺障害の副作用が現れた患者数は報告されただけで１４７３人に上り、そのうち５８８人が死亡するに至っている。なお、患者３０００人を対象とした市販後調査では、日本におけるこの副作用の発症率は突出して高いとされ、米国の７倍から２０倍とも言われている。
【０００３】
しかしながら本剤は、奏効する患者には劇的な効果を示し、極めて有効な薬剤であることも事実である。したがって、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者（レスポンダー）を事前に予測することが可能となれば、重篤な副作用発生の危険を冒しながら効かない患者（ノンレスポンダー）に対して投与することは避けられ、レスポンダーのみに投薬する、即ち適正使用が実現できると考えられる。
【０００４】
最近、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂが劇的に奏効した患者のほぼ全例において、本剤の標的分子であるＥＧＦＲのキナーゼドメインをコードする遺伝子領域とその近傍に特徴的な体細胞変異が認められ、本剤が奏効しなかった患者にはそれら体細胞変異が認められなかったことが報告されている。これら遺伝子変異を有するＥＧＦＲは、野生型に比べ活性が上昇しており、薬剤がより有効に作用するものと考えられている。この現象は、海外における複数の異なる医療機関から報告されているが、観察された症例数は未だ十分とは言えない。厚生労働省は、２００５年１月２０日に検討会を開催し、現時点において使用を制限する等の措置を講じる必要性は乏しく、引き続き安全対策をとりつつ適正使用を進めることが適当としながら、ＥＧＦＲ遺伝子変異と本剤の治療成績についての研究を早急に進めるべき、との見解を発表している。特に、日本人においては、特定の変異の頻度が欧米人に比べて著しく高いとの報告があり、本邦における検証が急務である。
【０００５】
Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者において見出された体細胞変異のうち、その大部分はｅｘｏｎ１９中の塩基欠失型変異と、ｅｘｏｎ２１中の一塩基置換によるＬ８５８Ｒ及びＬ８６１Ｑのミスセンス変異であり、これら３種類の遺伝子変異を検出するだけで、既に報告されているｇｅｆｉｔｉｎｉｂに応答性を示す患者症例における体細胞変異の９割以上が説明可能と考えることができる。
【０００６】
さらに本邦では未だ承認されていないが、海外ではすでに承認されている薬剤で、本剤と同様にＥＧＦＲを標的分子とした類薬（例えば、ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）も、同じ変異を有する患者で有効であることが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記変異を検出する方法は、現時点において患者腫瘍組織の細胞より抽出したゲノムＤＮＡから特異的に増幅したＥＧＦＲ遺伝子における当該領域の塩基配列（シーケンス）解析が一般的であって、簡便に検査できるキットは世界的にも存在しない。
【０００８】
しかも、上記シーケンス解析では、自動解析装置に掛けるまでに手間のかかる操作及びコストがかかるという課題がある。具体的にはおよそ以下の操作が必要となる。
【０００９】
（１）ＰＣＲによるＥＧＦＲ遺伝子の特異的増幅（２〜３時間）
（２）電気泳動、或いはスピンカラム等によるＰＣＲ産物の精製とシーケンス反応の鋳型となる精製ＰＣＲ産物の定量操作（１〜１．５時間）
（３）高価な専用試薬とシーケンス用プライマーによるシーケンス反応（３時間）
（４）シーケンス反応生成物の濃縮、ｂｕｆｆｅｒへの再溶解と熱変性（０．５時間）
（５）自動シーケンサーへのセット、自動解析（１時間/１サンプル）
【００１０】
以上の全操作を連続的に行った場合、要する時間は最短で７時間程度ではあるが、自動シーケンサーにセットするまでの操作の自動化は現時点では困難であり、かなりの人手が必要である。また、シーケンス解析は、試料の調製具合などにより、必ずしも明確に判読できる結果が得られるとは限らない。特に腫瘍組織のようなヘテロな細胞集団では、採取した組織で変異を有する細胞が小集団である場合は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ上のピークにおいて、ノイズとの判別が困難な場合が多い。加えて、ＤＮＡシーケンサーを用いるため、シーケンサーの操作に熟練した者が実施する必要がある。
【００１１】
以上、本発明は、上記課題に着目し、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の感受性を示す組織におけるＤＮＡの簡便な検査方法及びそれに用いられるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者は、一般的なサーマルサイクラーと電気泳動装置を用いて実施可能な方法を開発した。つまり具体的には以下の手段を採用する。
【００１３】
まず、第一の手段として、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーの少なくともいずれかを用いることとし、更に望ましくは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを有するプライマーをセットとする。これらプライマーを用いることでＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ１９の増幅が可能となり、しかも前記のプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ、及び電気泳動を行なうことで後述の遺伝子変異の判定が実現できる。
【００１４】
また、第二の手段として、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の応答性遺伝子変異の判定方法において、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、ＰＣＲを行う工程により得られたＰＣＲ産物に対して電気泳動を行う工程、とする。これにより、上記の効果に加え、ごく一般的なサーマルサイクラーと電気泳動装置があれば判定が可能となるため、人手及び判別・機器操作の熟練についての負担の軽減が図れ、要する時間もシーケンス解析に比べ極めて短縮できる。更に、コストの面でも遥かに安価となる。
【００１５】
また、第三の手段として、配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーの少なくともいずれかを用いることとし、更にのぞましくは配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーを含んでなるプライマーをセットとする。これらプライマーを用いることでＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ２１の増幅が可能となり、しかも前記のプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ、及び制限酵素を用いたＰＣＲ産物の切断を介して後述の遺伝子変異の判定が実現できる。
【００１６】
また、第四の手段として、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の応答性遺伝子変異の判定方法において、配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、前記ＰＣＲを行う工程により得られたＰＣＲ産物に対して制限酵素処理を行ってＰＣＲ産物の切断を行なう工程、を有するものとし、望ましくは制限酵素としてＥａｅＩ、あるいはそのイソシゾマー、ＰｖｕＩＩ、あるいはそのイソシゾマーの少なくともいずれかを用いることが望ましい。これにより、上記の効果に加え、ごく一般的なサーマルサイクラー、電気泳動装置と恒温槽を用いることで判別が可能となり、人手及び判別・機器操作の熟練についての負担の軽減が図れ、要する時間ももシーケンス解析に比べ極めて短縮できる。更に、コストの面でも遥かに安価となる。なお、上述の第一乃至第三及び本手段におけるプライマーは、同一の増幅条件にてＰＣＲを行うよう設計されているため、ＰＣＲで増幅する場合、上記効果に加え、各反応を同時に実施することができるという利点もある（即ち３種類の変異を判定するためには、ｅｘｏｎ１９用とｅｘｏｎ２１用の２本のＰＣＲチューブを同じサーマルサイクラーにセットするだけで良い）。
【発明の効果】
【００１７】
以上、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、および類薬の感受性を示す組織におけるＤＮＡの簡便検査方法、及びそれに用いられるプライマーセットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【実施例】
【００１９】
（ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異検出法）
ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異には、いくつかの欠失パターンが認められるが、既知のその全てに共通しているものは、コドン７４７から７５０までのコアとなる４アミノ酸残基ＬＲＥＡ（ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、アラニン）の欠失である。従って、この４アミノ酸残基の欠失を特異的に検出するように以下のプライマーを設計した（配列番号１〜３参照）。
【００２０】
Ｅｘ１９Ｆ ：５’−ＡＴＣＧＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣ−３’
Ｅｘ１９ｍｉｄＲ ：５’−ＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣ―３’
Ｅｘ１９Ｒ ：５’−ＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧ−３’
【００２１】
そして、上記３種類のプライマーを、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）２．０μＬ、Ｅｘ１９Ｆプライマー （２０μＭ）０．５μＬ、Ｅｘ１９ｍｉｄＲ、及びＥｘ１９Ｒプライマー（各１０μＭ）０．５μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡpｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ ５ｕｎｉｔ／μＬを使用）１ｕｎｉｔ、ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ０．５〜１．０μＬ（１０〜５０ｎｇ）、残りは水とする２５μＬの反応溶液を調製してＰＣＲを行った。なお、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、各プライマーの濃度、鋳型となるゲノムＤＮＡの量は適宜調節が可能である。またＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅも他社製のものに変更が可能である。
【００２２】
ＰＣＲの条件としては、９４℃３ｍｉｎの熱変性の後、９５℃２０ｓｅｃのサイクル熱変性、５６℃３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃４５ｓｅｃの伸長反応を３５〜４０サイクル程度行う。実施例では３５サイクル行なった。
【００２３】
ＰＣＲ後の産物は、その適量（３〜５μＬ程度）を３％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にて泳動する。実施例では５μＬを泳動した。野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の泳動パターンは泳動時間が短かすぎる際にはほぼ同じように見え、誤判定の原因となるので、５０Ｖ低電圧で泳動する場合は少なくとも１５分後に判定を行なうことが極めて望ましい（１００Ｖではもっと短くても良い。）
【００２４】
図１に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）及び変異型ホモ接合体（ｄｅｌ／ｄｅｌ）をそれぞれ代表する検体を判定した結果を示す。なお図１（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対応するダイレクトシーケンスの結果を、図１（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００２５】
図１（Ａ）の結果では、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）において明瞭なｅｌｅｃｔｒｏ− ｐｈｅｒｏｇｒａｍが得られていないことが分かる。ダイレクトシーケンスにおいては、理論上、ヘテロ接合体の場合は、図面左端から塩基欠失部位（野生型ホモ接合体で黒四角で囲んだ１２塩基領域）までは単一の明瞭なピークパターンを示すはずであり、実際、自動解析時のピーク同定では、野生型ホモ接合体及び変異型ホモ接合体とほぼ同じ塩基がアサインされている。一方、欠失部位以降はフレームシフトのため、理論上、バラバラのピークパターンを示すはずであり、実際そうなっている。しかし、この実施例によると、欠失部位以前も明瞭な解析結果が得られていない。これは、ＰＣＲ産物がヘテロデュープレックスを生成することによるシーケンス反応の妨害が主な原因と考えられ、一般の施設ではシーケンス反応の失敗か、変異の存在を意味する結果であるかの判別が付きにくく、判定結果を下すことは容易ではない（明確な結論を得るためには、ＰＣＲ産物のサブクローニングとさらなるシーケンスが必要である）。
【００２６】
これに対し、図１（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では予想される２３５ｂｐのメインバンドと、１６４ｂｐのバンド、更には、これらバンドよりも高分子量の位置にあるバンドが出現する。この高分子量のバンドは上記２種類のＰＣＲ産物のヘテロデュープレックスに起因するバンドであって、無関係のゲノムＤＮＡ領域から増幅した非特異的な産物ではない。なお、ヘテロ接合体（ｗ／ｄｅｌ）においてもこのヘテロデュープレックスに起因するバンドが生じるが、更に、野生型ホモ接合体のメインバンドのやや上に別のヘテロデュープレックスに起因する新たなバンドが出現する。このバンドは、野生型遺伝子から得られる２３５ｂｐのバンドと、図１（Ｂ）の例では変異型遺伝子から得られる２２３ｂｐのバンドから生じるヘテロデュープレックスである。また、変異型ホモ接合体（ｄｅｌ／ｄｅｌ）では、欠失した塩基数だけ短いバンドが一本のみ検出されている（図１（Ｂ）では２２３ｂｐのバンドのみ検出されている）。
【００２７】
以上、本検査法は、２本のプライマーを用いる通常のＰＣＲではなく、３本のプライマーを同時に用いたＰＣＲを行った後に、更にその増幅産物同士がヘテロデュープレックスを生成する点に着目して開発した点が主たる特徴であって、これにより野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の判別を可能とする。なお、腫瘍組織から抽出したＤＮＡでは、ヘテロ接合体で検出されることがほとんどであると報告されているが、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団が採取した組織内に等量に含まれることはむしろ稀である。その場合、シーケンス解析によって、欠失型変異の存在をｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏ− ｇｒａｍから判定するのは更に至難の技と考えられるが、本判定法はヘテロデュープレックスの出現を検出する方法であるため、容易に判定が可能である。
【００２８】
（ｅｘｏｎ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換変異の検出法）
既に報告されているｅｘｏｎ２１の変異では、コドン８５８のロイシンがアルギニンに置換する一塩基置換型変異（Ｔ＞Ｇ）が最も多く、この変異は欧米人に比べ日本人で著しく多いとされている。この塩基置換は制限酵素ＥａｅＩ、あるいはそのイソシゾマーの認識配列（Y／GGCCR）の消失を招くため、変異部位を挟んでＰＣＲを行い、制限酵素での切断で変異を検出できるよう、以下のプライマーを設計した（配列番号４、５参照）。
【００２９】
Ｅｘ２１Ｆ：５’−ＴＧＧＡＴＣＡＧＴＡＧＴＣＡＣＴＡＡＣＧ−３’
Ｅｘ２１Ｒ：５’−ＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧ−３’
【００３０】
そして、上記２種類のプライマーを、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）２．０μＬ、Ｅｘ２１Ｆプライマー及びＥｘ２１Ｒプライマー（各１０μＭ）０．５μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡpｏｌｙｍｅｒａ―ｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ ５ ｕｎｉｔ／μＬを使用）１ｕｎｉｔ、ｔｅｍｐｌａ―ｔｅ ＤＮＡ０．５〜１．０μＬ（１０〜５０ｎｇ）、残りは水とする２５μＬの反応溶液を調製してＰＣＲを行った。なお、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、各プライマーの濃度、鋳型となるゲノムＤＮＡの量は適宜調節が可能である。またＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅも他社製のものに変更が可能である。なおＰＣＲの増幅条件は上記ｅｘｏｎ１９の増幅と同じ条件とした。
【００３１】
ＰＣＲ後の産物（３７６ｂｐ）は、その適量（１〜５μＬ程度）を制限酵素で切断する。実施例では１μＬを以下の切断反応に用いた。典型的な切断反応液の組成として、ＰＣＲ産物１．０μＬ、ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ１を使用）１．５μＬ、水１２．０μＬ、ＥａｅＩ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬを用いた。これを３７℃で３０分〜一夜切断し、その全量を３％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にて泳動する（なお、ＥａｅＩを制限酵素として用いた場合、切断反応は極めて速やかに進行するため、約３０分で判定は可能となる）。また、泳動時間は５０Ｖ低電圧の場合、１０分で可能である。切断反応液の組成は、増幅産物の量などによって適宜調節・変更が可能であり、泳動時間・電圧等も変更可能である。さらに、今回は制限酵素として、ＥａｅＩを用いたが、同じ認識配列（Y／GGCCR、ＹはＣかＴ、ＲはＡかＧを示す）を共有する制限酵素（イソシゾマー）、例えばＣｆｒＩなどを使用することも可能である。
【００３２】
図２に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｍｔ）及び変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）の検体を判定した結果を示す。なお図２（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対するダイレクトシーケンスの結果を、図２（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００３３】
図２（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では
本酵素により２４９ｂｐと１２７ｂｐに切断されることが確認できるが、変異型ホモ接合体では切断されず３７６ｂｐのままであり、ヘテロ接合体では、これら３種類のバンド全てが検出されていることが分かる。
【００３４】
以上、本検査法では、上記設計した２本のプライマーを用いてＰＣＲを行った後に、制限酵素によって変異部位を含む領域を切断することにより、野生型ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び変異型ホモ接合体の検体の判別が可能となった。
【００３５】
（ｅｘｏｎ２１、Ｌ８６１Ｑをもたらす一塩基置換変異の検出法）
Ｅｘｏｎ２１においてアミノ酸置換をもたらす既知の変異のうち、もう一種類は、コドン８６１のロイシンがグルタミンに置換する一塩基置換型変異（Ｔ＞Ａ）である。この塩基置換は、制限酵素ＰｖｕＩＩの認識配列（ＣＡＧ／ＣＴＧ）の出現を招くため、変異部位を挟んでＰＣＲを行い、制限酵素での切断で変異を検出することができる。変異の部位が上記コドン８５８に近接しているため、Ｌ８５８Ｒ変異を判定するために増幅したＰＣＲ産物を利用して、制限酵素をＰｖｕＩＩに変更するだけで判定が可能となる。今回は制限酵素として、ＰｖｕＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を用いたが、そのイソシゾマー、例えばＢａｖＩやＤｍａＩなどを使用することも可能である。
【００３６】
本検査において使用するプライマー、反応溶液、反応条件については上述のｅｘｏｎ ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換変異の検出法と全く同じくすることができる。ただし、ＰｖｕＩＩを制限酵素として用いる場合、切断反応が比較的緩やかであるため、完全な切断には７時間程度を要するが、陽性対象と同時に行なえば３０分の消化でも判定は不可能ではない。しかし、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団が均等に含まれていない場合、誤判定を避けるためには切断反応に充分な時間（理想的には一夜）をかけることが望ましい。
【００３７】
図３に、変異を起こした細胞集団と変異を起こしていない細胞集団がほぼ等量含まれており、また染色体の数に異常が起こっていない状態において、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）、ヘテロ接合体（ｗ／ｍｔ）及び変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）の検体を判定した結果を示す。なお図３（Ａ）はそれぞれの遺伝子型に対するダイレクトシーケンスの結果を、図３（Ｂ）は今回開発した検査法による判定結果をそれぞれ示している。
【００３８】
図３（Ｂ）で示す本検査法での判定結果によると、野生型ホモ接合体（ｗ／ｗ）では切断されず３７６ｂｐのままであるが、変異型ホモ接合体（ｍｔ／ｍｔ）では本酵素により２５９ｂｐと１１７ｂｐに切断され、また、ヘテロ接合体では、これら３種類のバンド全てが検出されていることが分かる。
【００３９】
以上、本検査法では、上記設計した２本のプライマーを用いてＰＣＲを行った後に、制限酵素によって変異部位を含む領域を切断することにより、野生型ホモ接合体、ヘテロ接合体、及び変異型ホモ接合体の検体の判別が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ｅｘｏｎ１９の塩基欠失型変異検出法による結果を示す図
【図２】Ｅｘｏｎ２１、Ｌ８５８Ｒをもたらす一塩基置換型変異の検出法による結果を示す図
【図３】Ｅｘｏｎ２１、Ｌ８６１Ｑをもたらす一塩基置換型変異の検出法による結果を示す図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項２】
配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項３】
配列番号３記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項４】
請求項１、２及び３記載のプライマーを含んでなるプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、
前記ＰＣＲを行う工程により得たＰＣＲ産物に対して電気泳動を行う工程、を有する ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項６】
配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項７】
配列番号５記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項８】
請求項５及び６記載のプライマーを含んでなるプライマーセット。
【請求項９】
配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマー、を含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、
前記ＰＣＲを行う工程により得たＰＣＲ産物に対して制限酵素を用いてＰＣＲ産物を切断する工程、を有するｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１０】
前記制限酵素は、ＥａｅＩ、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１１】
前記制限酵素は、ＰｖｕＩＩ、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１２】
ＥａｅＩ、またはそのイソシゾマーの認識配列（Ｙ／ＧＧＣＣＲ、ＹはＣかＴ、ＲはＡかＧを示す）で切断することを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１３】
ＰｖｕＩＩ、またはそのイソシゾマーの認識配列（ＣＡＧ／ＣＴＧ）で切断することを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項２】
配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項３】
配列番号３記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項４】
請求項１、２及び３記載のプライマーを含んでなるプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号３記載の塩基配列からなるプライマーを含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、
前記ＰＣＲを行う工程により得たＰＣＲ産物に対して電気泳動を行う工程、を有する ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項６】
配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項７】
配列番号５記載の塩基配列からなるプライマー。
【請求項８】
請求項５及び６記載のプライマーを含んでなるプライマーセット。
【請求項９】
配列番号４記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号５記載の塩基配列からなるプライマー、を含む反応溶液を用いてＰＣＲを行う工程、
前記ＰＣＲを行う工程により得たＰＣＲ産物に対して制限酵素を用いてＰＣＲ産物を切断する工程、を有するｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１０】
前記制限酵素は、ＥａｅＩ、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１１】
前記制限酵素は、ＰｖｕＩＩ、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１２】
ＥａｅＩ、またはそのイソシゾマーの認識配列（Ｙ／ＧＧＣＣＲ、ＹはＣかＴ、ＲはＡかＧを示す）で切断することを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【請求項１３】
ＰｖｕＩＩ、またはそのイソシゾマーの認識配列（ＣＡＧ／ＣＴＧ）で切断することを特徴とする請求項９記載のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、及び類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２２３１３７（Ｐ２００６−２２３１３７Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３８７９６（Ｐ２００５−３８７９６）
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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