ＨＧＦＲの高親和結合部位およびその拮抗剤の同定方法
【課題】癌治療に対するより有効な治療戦略の開発のために、感受性の増加と副作用の減少を伴う肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）拮抗剤の同定を可能にする手段を提供する。
【解決手段】テスト薬剤を、i）肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチド、ii)または該ドメインを含むポリペプチド、またはｉｉｉ）ＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３ドメインおよびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、ＨＧＦＲの活性、機能、安定性および／または発現を測定することからなる。
【解決手段】テスト薬剤を、i）肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチド、ii)または該ドメインを含むポリペプチド、またはｉｉｉ）ＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３ドメインおよびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、ＨＧＦＲの活性、機能、安定性および／または発現を測定することからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）たんぱく質の分野に関する。より詳細には、本発明は、そのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するＨＧＦＲの高親和結合部位の同定、ならびＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするＨＧＦＲ拮抗剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔとも呼ばれる）は、チロシンキナーゼであり、ｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子の産物である。それは、５０ｋＤａのα−サブユニットと１４５ｋＤａのβ−サブユニットからなり、ジスルフィド結合により結合され、α−サブユニットは完全に細胞外である一方、β−サブユニットは（ＮからＣ末端まで）細胞外領域、膜貫通ドメインおよび細胞質チロシンキナーゼドメインを含む。成熟α／βヘテロ二量体受容体は、１７０ｋＤａの単一鎖前駆体からたんぱく質分解過程とグリコシル化により作成される。
【０００３】
ＨＧＦは、細胞分散因子としても知られ、細胞の増殖、運動、生存および形態形成を含む、広範囲の生物学的活性を有するヘアピン結合性の糖たんぱく質である。プロテオグリカンに対するその高い親和性のため細胞外マトリックスに貯蔵される、不活性な単一鎖前駆体（プロ−ＨＧＦ）として合成され、分泌される。プロ−ＨＧＦは、残基Ｒ４９４−Ｖ４９５でたんぱく質分解の切断を経て、生物学的に活性のある形態、ジスルフィド結合α／βヘテロ二量体を生じ、ここで、α鎖は、Ｎ−末端ドメインの後に４つのクリングルドメインからなり、β鎖は、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼと構造の相同性を共有する。しかしながら、β鎖は、セリンプロテアーゼの触媒三連構造を形成する３つの不可欠な残基のうちの２つがＨＧＦで保存されていないため、たんぱく質分解活性を欠如する。シグナル伝達できないにもかかわらず、プロ−ＨＧＦは、高親和性でＭｅｔに結合し、活性なＨＧＦを置換する。
【０００４】
近年、多くの構造機能研究は、ＭｅｔとＨＧＦの細胞外部分間の相互作用をいくらか明らかにした。
【０００５】
Ｍｅｔ細胞外領域は、モジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）構造を有し、３つの機能ドメイン：たんぱく質のＮ−末端において最初の５００残基にわたり、７枚羽根のβ−プロペラ構造を有する（セマフォリンおよびプレキシンにも存在する）Ｓｅｍａドメイン、約５０残基にわたり、４つの保存されたジスルフィド結合を含む（プレキシン、セマフォリンおよびインテグリンにも見出される）ＰＳＩドメイン、ならびにＰＳＩドメインを膜貫通へリックスに連結させ、４つのＩＰＴドメイン（プレキシンおよび転写因子に存在する免疫グロブリン関連ドメイン）により占められるさらなる４００残基を含む。
【０００６】
ＨＧＦは、二価リガンドであり、α−鎖のＭｅｔに対する高い親和性結合部位およびβ−鎖における低い親和結合部位を含む。α−とβ−鎖の協調は、ＨＧＦの生物学的活性に必要であるが、一方で、α−鎖、より正確には、Ｎ−ドメインと第１のクリングルは、Ｍｅｔ結合に十分であり、β−鎖は、Ｍｅｔ活性に必要である。
【０００７】
ＨＧＦのβ−鎖との複合体におけるＭｅｔのＳＥＭＡおよびＰＳＩドメインの結晶構造解析（国際公開第２００５／１０８４２４号Ａを参照）は、ＨＧＦに対する低い親和性結合部位がβ−プロペラの羽根２−３に位置し、Ｍｅｔに結合するＨＧＦ−βの部分が、セリンプロテアーゼがそれらの物質または阻害剤に結合するのに用いるのと同一の領域であることを明らかにした。重要なことに、２．５３Å分解能におけるＨＧＦのβ−鎖の結晶構造測定および特異的な突然変異分析は、ＨＧＦ β−鎖の活性ポケットにおけるＭｅｔ結合に関連する残基がプロ−ＨＧＦのたんぱく質分解変換後のみに曝露するようになることを明らかにし、それによりプロ−ＨＧＦが活性化することなく高い親和性でＭｅｔに結合する理由を説明する。ＨＧＦのβ−鎖とＭｅｔのＳｅｍａドメインの間の低い親和性相互作用が構造的かつ機能的に十分特徴付けられる一方で、Ｍｅｔのどの領域が高い親和性でＨＧＦのα−鎖に結合するか明確ではない。それゆえ、ＨＧＦがＭｅｔを活性化する主なメカニズムは、いまだにあまり理解されていない。このことは、この経路の生物学的および治療上の大きな重要性を考慮するといくらか驚きである。
【０００８】
ＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は、胚形成の期間および成人期の組織再生時に必要不可欠である。重要なことに、調節解除されたＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は、腫瘍形成および転移において重要な役割を担っている。自己分泌ＨＧＦ刺激、受容体過剰発現、遺伝子増幅および点変異を含む、異なるメカニズムによる不適切なＭｅｔ活性は、多種類のヒト悪性腫瘍で現れ、好ましくない予後と相関する。これらの知見は、癌治療の標的としてのＨＧＦ−Ｍｅｔ経路における大きな関心を生じ、多種のＭｅｔ／ＨＧＦ阻害剤の開発を導いた。これらは、Ｍｅｔキナーゼ活性を標的とする小分子化合物、中和する抗Ｍｅｔまたは抗ＨＧＦ抗体、デコイ受容体およびＨＧＦ由来因子を含む。それにもかかわらず、かかる分子がＨＧＦに対する高親和性結合を標的とするかどうか、高い親和性でＭｅｔに結合するＨＧＦに基づく正確な分子メカニズムがどんなものであるかは、いまだ知られていない。このことが、感受性の増加と副作用の減少を伴う、より選択的な治療剤を単離することから妨げうる。ＨＧＦに対するＭｅｔ高親和性結合部位の正確な知見は、極めて特異的なＭｅｔの拮抗剤を設計することを確実に助長する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、癌治療に対するより有効な治療戦略の開発のために、感受性の増加と副作用の減少を伴うＭｅｔ拮抗剤の同定を可能にする改善された解決手段が必要とされる。
【００１０】
本開示の目的は、かかる改善された解決手段を提供することである。
【００１１】
本発明によると、かかる目的は、特に下記の請求項で記載される特徴を有する解決手段により達成される。請求項は、本発明に関して提供される本明細書における技術的な教示の不可欠な部分を形成する。
【００１２】
それゆえ、本開示の目的は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、すなわち、ＨＧＦの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに対するＨＧＦ高親和性結合部位の同定である。本発明のさらなる目的は、癌治療の新しい治療戦略の開発のために、ＨＧＦに対するＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするＨＧＦＲの拮抗剤の同定方法を提供することである。
【００１３】
１の具体例において、本発明は、癌、特に肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌の治療に有用な薬理学的に活性のある薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチド、またはコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００１４】
１の具体例において、薬理学的に活性のある薬剤は、肝細胞増殖因子受容体阻害剤および／または拮抗剤であり、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンスヌクレオチド、ＲＮＡを基にした阻害剤、ｓｉＲＮＡ、抗体、ペプチド、ドミナントネガチィブ因子から選択されうる。
【００１５】
さらなる具体例において、本発明は、癌、特に肝細胞増殖受容体活性の調節不良を伴う癌に有用な肝細胞増殖因子受容体の拮抗剤／阻害剤として作用するテスト薬剤の能力を検出する方法であって、
（ａ）テスト薬剤を、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメイン、あるいは少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、
（ｂ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を測定し、次いで
（ｃ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を減少させる薬剤を選択する
工程を含む方法に関する。
【００１６】
なおさらなる具体例において、本発明は、癌を治療するための医薬として、肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインの使用に関する。
【００１７】
ここで、本発明は、付属の図面に関する非限定的な例としていずれかの好ましい具体例について詳細に記載される。図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】−図１は、ＭｅｔとＨＧＦサブドメインの改変と精製を示す。（Ａ）本研究で用いられた改変たんぱく質の模式図。左図：改変された受容体。Ｗ．Ｔ．ＭＥＴ、野生型Ｍｅｔ；ＥＸＴＲＡ、細胞外部分；ＩＮＴＲＡ、細胞内部分；ＳＰ、シグナルペプチド；ＳＥＭＡ、セマフォリン相同ドメイン；ＰＳＩ、プレキシン−セマフォリン−インテグリン相同ドメイン；ＩＰＴ１−４、免疫グロブリン−プレキシン−転写因子相同ドメイン１−４；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＪＭ、膜近傍ドメイン；ＫＤ、キナーゼドメイン；ＣＴ、Ｃ末端尾部；Ｅ、ＦＬＡＧまたはＭＹＣエピトープ；Ｈ、ポリ−ヒスチジンタグ。赤色の三角形は、α−とβ−鎖の間のたんぱく質分解切断部位を示す。右図：改変されたリガンド。Ｗ．Ｔ．ＨＧＦ、野生型ＨＧＦ；ＮＤ、Ｎ−ドメイン；Ｋ１−４、クリングル１−４；ＰＬＤ、プロテアーゼ様ドメイン；ＵＮＣＬ．ＨＧＦ、未切断ＨＧＦ。星印は、たんぱく質分解部位におけるＲ４９４Ｑアミノ酸置換を示す。（Ｂ）アフィニティー精製された受容体とリガンドのクーマシー染色。各たんぱく質群（Ｓｅｍａ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、デコイＭｅｔ；ＰＳＩ−ＩＰＴ、ＩＰＴ；ＨＧＦ−α、未切断ＨＧＦ、ＨＧＦ；ＨＧＦ ＮＫ１、ＨＧＦ−β）を、非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線に対して定量化する。ＭＷ、分子量マーカー；ｋＤａ、キロダルトン。
【図２】−図２は、ＨＧＦ−Ｍｅｔ相互作用のＥＬＩＳＡ解析を示す。（Ａ）Ｍｅｔサブドメインの活性ＨＧＦへの結合。改変された受容体を、固相に固定し、液相における上昇濃度の活性ＨＧＦに対して曝露した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明確にした。固相中で精製された受容体の代わりにＢＳＡを用いることにより非特異的な結合を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、およびＩＰＴのＨＧＦの異なる形態への結合。改変された受容体を固相に固定し、液相においてＭＹＣ−タグの活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−αまたはＨＧＦ ＮＫ１の上昇濃度に曝露した。抗−ＭＹＣ抗体を用いて結合を明確にした。液相中でＭＹＣ−タグのアンジオスタチン（ＡＳ）を用いることにより非特異的な結合を測定した。
【図３】−図３は、ＩＰＴドメイン３および４が高い親和性でＨＧＦ−αに結合するのに十分であることを示す。（Ａ）欠失されたＩＰＴ変異体の模式図。図１Ａと同じ色分けと説明。（Ｂ）ＩＰＴ変異体とＨＧＦ−α間相互作用のＥＬＩＳＡ解析。改変されたＩＰＴを固相で固定し、液相中で上昇濃度のＨＧＦ−αに曝露した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明確にした。
【図４】−図４は、ＩＰＴドメイン３および４が生存細胞でＨＧＦに結合するのに十分であることを示す。（Ａ）欠失Ｍｅｔ△２５−７４１受容体の模式図。図１Ａと同じ色分けと説明。（Ｂ）表面ビオチン化解析。細胞たんぱく質を、ＭｅｔのＣ末端部分に対する抗体を用いて免疫沈殿（ＩＰ）させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（ＳＡ）を用いてウェスタンブロッティング（ＷＢ）により解析した。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体で再結合させた。Ｗ．Ｔ．、野生型；Ａ５４９、Ａ５４９ヒト肺癌細胞；ＭＤＡ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞；ＴＯＶ、ＴＯＶ−１１２Ｄヒト卵巣癌細胞；Ｅｍｐｔｙ Ｖ．、空ベクター；ｐ１７０バンドは未処理Ｍｅｔに相当する；ｐ１４５は受容体の成熟形態である。（Ｃ）化学的架橋解析。Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞（Ｍｅｔ △２５−７４１）および野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞（Ｗ．Ｔ．ＴＯＶ）をＨＧＦとインキュベートし、次いで化学的架橋にかけた。細胞溶解物を、抗−Ｍｅｔ抗体を用いて免疫沈殿させ、抗−ＨＧＦ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。矢印は、ＨＧＦ−Ｍｅｔ△２５−７４１複合体を示す。（Ｄ）Ｍｅｔリン酸化解析。Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を、ネガティブコントロールとして１％ＰＢＳおよび等量のＨＧＦ、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ ＮＫ１またはＮＫ１−ＮＫ１で刺激した。抗−Ｍｅｔ抗体を用いた免疫沈殿および抗−ホスホチロシン（抗−ｐＴｙｒ）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより受容体のリン酸化を調べた。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体を用いて再結合させた。矢印は、Ｍｅｔ△２５−７４１または免疫グロブリン（Ｉｇ）に相当するバンドを示す。（Ｅ）ＮＫ１−ＮＫ１の模式図。Ｎ−からＣ−末端まで：ＳＰ、シグナルペプチド；ＮＤ、Ｎ−ドメイン；Ｋ１、クリングル１；Ｈ、ポリヒスチジンタグ。
【図５】−図５は、可溶性ＩＰＴがインビトロでＨＧＦ誘導侵襲性増殖を阻害することを示す。（Ａ）レンチウイルスを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、組み換えＨＧＦで刺激し、抗−ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロッティングによりＭｅｔリン酸化を調べた（上図）。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体を用いて再結合させた（下図）。Ｅｍｐｔｙ Ｖ．、空ベクター。（Ｂ）分枝形態形成アッセイ。レンチウイルスベクターを形質導入させたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の前もって形成させた球状体を、コラーゲン中に包埋し、次いで、組み換えＨＧＦで刺激すると分枝した細管を形成した。各球状体から生じる細管の平均数をスコア化することによりコラーゲン侵襲を定量化した。ＥＶ、空ベクター；ＤＭ、デコイＭｅｔ；ＳＰ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ。（Ｃ）Ｂに記載される実験からの代表的な図。倍率：２００Ｘ。
【図６】−図６は、可溶性ＩＰＴがマウスにおいて抗−腫瘍および抗−転移活性を示すことを表す。ＣＤ−１ヌル−／−マウスに、レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。（Ａ）腫瘍潜伏のカプラン−マイヤー類似ブロット（Ｘ軸、日数；Ｙ軸、腫瘍非存在の動物のパーセンテージ）。空 ｖ．、空ベクター。（Ｂ）経時的な平均腫瘍体積。（Ｃ）抗−ＦＬＡＧ抗体を用いた腫瘍切片の免疫組織化学的解析。倍率：４００Ｘ。（Ｄ）腫瘍血管解析。腫瘍切片を抗−フォンヴィレブランド因子抗体で染色した。腫瘍切片の球状体ｍｍあたりの血管数を顕微鏡により調べた。ＥＶ、空ベクター；ＤＭ、デコイＭｅｔ；ＳＰ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ。（Ｅ）転移発生率解析。死体解剖により、連続的な肺切片を顕微鏡で解析して微少転移の存在を調べた。転移発生率、−すなわち、マウス全数に対する転移を有するマウス数−を、パーセンテージ（バー）と（バーの末端における）フラクションの両方で示す。（Ｆ）空ベクターの群に由来する微少転移の代表的な図。肺切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。点線は血管の壁（ｖｓ）を同定する。転移細胞（ｍｃ）は塞栓として血管内部または実質で見出すことができる。倍率：４００Ｘ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示で提示されるデータは、ＨＧＦのα−鎖が、高親和性でＭｅｔのＩＰＴ領域に結合し、リガンドのたんぱく質分解処理を単独で行うことを示唆する。それらはまた、Ｓｅｍａドメインを欠く膜貫通ＭｅｔにおけるＨＧＦのＩＰＴへの結合が、リガンドの不活性および活性形態の区別にかかわらず、細胞質キナーゼドメインへの受容体活性のシグナル伝達に十分であることを示唆する。したがって、それらは、ＭｅｔのＩＰＴ領域とＳｅｍａドメインに由来する改変たんぱく質が、インビトロとインビボの両方でＨＧＦのプロ侵襲活性（ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を中和することができる証拠を提供する。
【００２０】
ＨＧＦが二価因子であることは長い間知られてきた。初期のたんぱく質改変研究は、ＨＧＦのＮドメインと第１クリングルにおける高い親和性Ｍｅｔ結合部位を同定した。後に、生化学および生物学的解析を合わせた解析は、ＨＧＦセリンプロテアーゼ様ドメイン（β−鎖）が必ずしも結合に必要ではないが、受容体活性を介在するのに重要な役割を担うことを示した。より最近では、詳細な結晶学および変異原性データは、ＨＧＦのβ−鎖上の低い親和性Ｍｅｔ結合部位およびＭｅｔのＳｅｍａドメインとの相互作用を構造的かつ機能的に完全に特徴付けた。しかしながら、ＨＧＦのα−鎖とＭｅｔ間の接触はいまだ解明されていない。少角Ｘ線分散および低温電子顕微鏡研究は、ＨＧＦのＮ−末端と第１クリングルおよびＭｅｔのＳｅｍａドメインの間の接触の存在を示唆した。しかし、プラズモン共鳴解析は、この相互作用が極めて低い親和性（Ｓｅｍａに対するＨＧＦ−βのものより約２倍低く、無傷な受容体に対するＨＧＦ−αのものより１００倍低い）を有することを明らかにした。この弱い相互作用はそれ自体でＨＧＦとＭｅｔの間の堅固な結合を説明できないので、Ｍｅｔ上の高い親和性ＨＧＦ結合部位はいまだ同定されていなかった。
【００２１】
本明細書で示される結果は、このギャップ（ｇａｐ）を埋めることに貢献し、この長い間探索されてきたＨＧＦ結合部位がＭｅｔのＩＰＴ領域、より正確には、細胞膜に近接する最後の２つの免疫グロブリン様ドメインに存在することを示唆する。第一に、４つのＩＰＴドメインのみを含む可溶性の欠失Ｍｅｔ受容体（ＩＰＴ）は、Ｍｅｔの全細胞外部分と実質的に同一の親和性を有するＨＧＦに結合する。逆に、Ｓｅｍａは、ＨＧＦに対して極めて低い親和性を示す。第二に、ＩＰＴは、変わらない強さで活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦまたはＨＧＦ−αに結合する。第三に、ＩＰＴ１およびＩＰＴ２の欠失は、ＨＧＦの形態のいずれに対するＩＰＴの親和性に影響しない。第四に、Ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩモジュールおよび第１の２つの免疫グロブリン様ドメインに相当する細胞外ドメインに大きな欠失を保有する改変Ｍｅｔ受容体（Ｍｅｔ△２５−７４１）は、活性ＨＧＦとプロ−ＨＧＦの間を区別できないが、ＨＧＦに結合し、細胞の内部へキナーゼ活性に対してシグナルを伝達する能力を保有する。最終的に、ＨＧＦ ＮＫ１の二量体形態は、ＨＧＦ−αの最小Ｍｅｔ結合ドメインを含むことが知られ、ＨＧＦより効率的ではないにしてもＭｅｔ△２５−７４１の活性を引き起こし、それによりＩＰＴ３−４のＨＧＦ ＮＫ１結合部位を同定することができる。
【００２２】
これらのデータがＨＧＦ結合におけるＩＰＴの重要な役割を指摘する一方で、Ｍｅｔの細胞外部分の２つの以前の構造／機能研究が、この領域のリガンド結合部位を同定することに失敗したことに注目すべきである。Ｍｅｔ細胞外ドメインのマップの第１の案は、ＥＬＩＳＡアッセイに基づくＨＧＦ結合にはＳｅｍａドメインが必要かつ十分であることを示唆した。第２の研究は、受容体二量体におけるＳｅｍａドメインの役割を解析し、Ｓｅｍａドメインの欠失を含むＭｅｔ細胞外部部分の改変された形態がＨＧＦを共沈殿できないことを示唆した。
【００２３】
本開示は、さらに、Ｍｅｔの細胞外部分がＨＧＦ誘導の侵襲性増殖を抑制する生物学的技術の道具として用いられる場合に、ＳｅｍａとＩＰＴの間の協調が観察されることを示す。インビトロ解析およびマウス移植実験において、ＩＰＴとＳｅｍａ−ＩＰＴ可溶性たんぱく質の両者が有意な抑制効果を示した。しかし、それらのいずれもが、低親和性と高親和性ＨＧＦ結合部位の両方を含む全Ｍｅｔ細胞外ドメインにより示される強力な抑制を達成することができなかった。このことは、これらの相互作用の両方がＭｅｔ活性の調節に貢献することを示唆する。ＨＧＦ−β−Ｓｅｍａの接触がすでに治療の標的として同定されてきた一方で、本明細書で示される結果は、薬理学的介入の機会を提供する第２の手段を明らかにする。組み換えたんぱく質または抗体は、真正なＨＧＦの代わりにＩＰＴ領域に結合し、ＨＧＦ／Ｍｅｔ依存性の癌治療のための、Ｍｅｔの高い競合抑制剤としての応用を示す。
【００２４】
材料と方法
たんぱく質の改変
本明細書に記載される可溶性または膜貫通型受容体および改変されたリガンドを、一般的なＰＣＲおよび遺伝学的改変技術により作成した。全ての因子は、Ｎ−末端にそれらの親たんぱく質のリーダー配列を保存する。可溶性Ｍｅｔたんぱく質のアミノ酸（ａａ）配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号Ｘ５４５５９）は、ａａ１−２４（シグナルペプチド）および：デコイＭｅｔ、ａａ２５−９３２；Ｓｅｍａ、ａａ２５−５１５；Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、ａａ２５−５６２；ＰＳＩＩＰＴ、ａａ５１６−９３２；ＩＰＴ、ａａ５６３−９３２；ＩＰＴ△１、ａａ６５７−９３２；ＩＰＴ△１−２、ａａ７４２−９３２；ＩＰＴ−３、ａａ７４２−８３８；ＩＰＴ−４、ａａ８３９−９３２に相当する。各分子のＣ−末端において、二重ＦＬＡＧ（ＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−配列番号：１９）または単一ＭＹＣ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ−配列番号：２０）エピトープ配列およびポリ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ−配列番号：２１）をたんぱく質の検出および精製のために付加した。膜貫通型の改変Ｍｅｔ△２５−７４１は、欠失した領域（ａａ２５−７４１）を除いて野生型Ｍｅｔと同一である。改変されたＨＧＦたんぱく質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号Ｍ７３２３９）は、ａａ１−３１（シグナルペプチド）および：ＨＧＦ、ａａ３２−７２８；ＨＧＦ−α、ａａ３２−４７３；ＨＧＦ ＮＫ１、ａａ３２−２０５；ＨＧＦ−β、ａａ４９５−７２８に相当する。上記ＭＹＣまたはＦＬＡＧエピトープおよびポリ−ヒスチジンタグをＣ−末端に付加した。未切断ＨＧＦは以前に公表されている（Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432）。ＮＫ１−ＮＫ１は、タンデムに繰り返される同一のＮ−末端領域ＨＧＦからなるＨＧＦ ＮＫ１の二量体形態である（隙間なくａａ３２−２０５に直接連結させたａａ１−２０５）。全ての改変されたたんぱく質をコードするｃＤＮＡを、Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25(2), 217-222で開示されるようにｇｆｐ ｃＤＮＡの代わりにレンチウイルストランスファーベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅ（配列番号：１）にサブクローン化した。ＧＦＰをコードする配列を、以下のｃＤＮＡ：デコイｍｅｔ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：２）、Ｓｅｍａ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：３）、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号．：４）、ＰＳＩ−ＩＰＴ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：５）、ＩＰＴ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：６）、ＩＰＴ△１ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：７）、ＩＰＴ△１−２ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：８）、ＩＰＴ３ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：９）、ＩＰＴ４ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：１０）、Ｍｅｔ△２５−７４１（配列番号：１１）、ＨＧＦ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１２）、ＨＧＦ−αＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１３）、ＨＧＦ−ＮＫ１ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１４）、ＨＧＦ−β ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１５）、未切断ＨＧＦ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１６）、ＮＫ１−ＮＫ１ ｈｉｓ（配列番号：１７）、アンジオスタチンＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１８）に置き換えた。
【００２５】
酵素免疫吸着測定法
全ての改変された受容体と因子を、血清の非存在下で、レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−３４５ヒトメラノーマ細胞の条件培地から回収した。Michieli P. et al. (2002) Nat Biotechnol. 20(5), 488-495に記載されるごとく、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより因子の精製を行った。精製したプロ−ＨＧＦ（最大濃度１００ｎｇ／μｇ）を２−１０％ ＦＢＳ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）で３７℃において２４時間インキュベートすることにより、プロ−ＨＧＦの活性ＨＧＦへの変換を行った。因子の変換を、抗−ＨＧＦ抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。ＦＢＳとの同一のインキュベートにかけた未切断ＨＧＦを全ての測定中でプロ−ＨＧＦとして用いて、活性ＨＧＦを未処理ＨＧＦと比較した。改変リガンドの可溶性受容体への結合を、固相中のＦＬＡＧ−タグ可溶性受容体および液相中のＭＹＧ−タグ改変リガンドを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。固定濃度（１００ｎｇ／ウェル）の精製した可溶性受容体を９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。たんぱく質でコートしたプレートを改変リガンドの濃度の増加とともにインキュベートし、ビオチン化された抗−ＨＧＦ抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗−ＭＹＣ抗体（カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて結合を明らかにした。結合データをプリズムソフトウェア（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて解析し適合させた。
【００２６】
細胞培養
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞をジョージタウン大学のＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ワシントン、コロンビア特別区）から購入した。１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で細胞を維持した。ＴＯＶ−１１２Ｄヒト卵巣癌細胞をＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１７３１）から取得し、１５％ ＦＢＳを添加したＭＣＤＢ１０５培地と培地１９９（全てＳｉｇｍａ）の１：１の混合物を用いて培養した。Ａ５４９ヒト肺癌細胞もＡＴＣＣから取得し（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、１０％ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中で維持した。
【００２７】
レンチウイルスベクター
Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25 (2), 217-222に記載されるごとく、２９３Ｔ細胞の一過的なトランスフェクションによりベクターストックを生成した。簡単に説明すると、トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡミックスを以下のとおりに調製した：ＥＮＶプラスミド（ＶＳＶ−Ｇ）、９μｇ；ＰＡＣＫＡＧＩＮＧプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ １６．２μｇ；ＲＥＶプラスミド、６．２５μｇ；ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲ（プラスミド番号２−１８）、３７．５μｇ。プラスミドをＴＥ／ＣａＣｌ２溶液に希釈し、ＨＢＳ溶液を加えて最大速度でボルテックスを行った。ＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨＢＳミックスを即座に細胞プレートに滴下し、次いで３７℃でインキュベートした。１４−１６時間後、培養した培地を新しいものに交換した。ベクター粒子を含む細胞培養上澄み液を、培地を交換してから約３６時間後に回収した。回収後、上澄み液を０．２μｍの細孔膜に通してろ過し、−８０℃で保存した。ウイルスｐ２４の抗原濃度をＨＩＶ−１ ｐ２４ ｃｏｒｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（マサチューセッツ州、ボストンのＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により製造業者の説明書に従って調べた。Vigna, E. and Naldini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308-316に記載されるごとく、細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、４０ｎｇ／ｍｌのｐ２４を用いて６ウェルプレート（２ｍｌの培地中に１０５細胞／ウェル）中で形質導入させた。培地を、形質導入後約１８時間で交換した。細胞の増殖とたんぱく質の産生を経時的にモニターした。次に、形質導入した細胞株を１５ｃｍプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させ、無血清培地中でインキュベートした。７２時間後、組み換え可溶性たんぱく質を含む上澄み液を回収し、ろ過し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製するか、または−３０℃で保存した。
【００２８】
免疫沈殿とウェスタンブロット解析
Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、抽出緩衝液（ＥＢ）を用いて、細胞溶解、免疫沈殿およびウェスタンブロット解析を行った。ＥＣＬシステム（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って用い、シグナルを検出した。免疫沈殿用の抗−Ｍｅｔ抗体は、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270により記載され、ＵＢＩ（ニューヨーク州、プラシド湖）から購入された。ウェスタンブロット用の抗−Ｍｅｔ抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗−ＦＬＡＧ抗体をＳｉｇｍａから取得した。レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＭｅｔリン酸化解析を、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく行った。
【００２９】
ＨＧＦ架橋およびＭｅｔ活性解析
Ｍｅｔ△２５−７４１を発現する、レンチウイルスベクターを形質導入したＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を、ＥＣＬ（登録商標） Ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って用いて表面ビオチン化解析にかけた。Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432に記載されるごとく、化学的な架橋を行った。簡単に説明すると、細胞から３日間血清増殖因子を取り除き、次いで１ｎＭ ＨＧＦで３時間インキュベートした。細胞溶解物を、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270に開示されるごとく、ＭｅｔのＣ末端の一部に対する抗体を用いて免疫沈殿し、３−１０％のポリアクリルアミド勾配を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、次いで抗−ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ）を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。受容体活性解析では、Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞から血清増殖因子を３日間取り除き、次に１ｎＭ ＨＧＦ、未切断ＨＧＦ、ＨＧＦ ＮＫ１またはＮＫ１−ＮＫ１で１０分間刺激した。Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、細胞をＥＢを用いて溶解した。細胞たんぱく質を上述のごとく抗−Ｍｅｔ抗体で免疫沈殿し、抗−ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体と再結合させた（Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270）。
【００３０】
生物学的アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を用いたコラーゲン侵襲アッセイを、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく前もって形成させた球状体を用いて行った。簡単に説明すると、細胞（７００細胞／ウェル）を、０．２４ｇ／ｍｌのメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）の存在下で非接着性９６−ウェルプレート（ドイツ、フリッケンハウゼンのＧｒｅｉｎｅｒ）中で一晩インキュベートすることにより球状体を作成した。球状体を、ラットの尻尾に由来する１．３ｍｇ／ｍｌ Ｉ型コラーゲンマトリックス（マサチューセッツ州、ベッドフォードのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０％ ＦＢＳを含むコラーゲンマトリックスに９６−ウェルプレート（４０球状体／ウェル）を用いて包埋した。包埋した球状体を３７℃で２４時間培養し、次いで、３０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ）または因子なしでさらに２４時間刺激した。各球状体から伸びる細管の数を顕微鏡を用いて評価した。１箇所の実験地点あたり少なくとも１２個の球状体を分析した。
【００３１】
腫瘍形成アッセイ
０．２ｍｌのＤＭＥＤ中のレンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞（３ｘ１０６細胞／マウス）を、Ｓｗｉｓｓ ＣＤ−１バックグラウンドの６週齢の免疫不全ｎｕ−／−雌マウス（イタリア、カルコのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後方の側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて２日ごとに測定した。腫瘍の体積を、式 Ｖ＝４／３πｘ２ｙ／２（式中、ｘは腫瘍の短径であり、ｙは腫瘍の長径である）を用いて算出した。注射した細胞により占められる最初の体積にほぼ相当する、１５ｍｍ３の腫瘤を腫瘍陽性の閾値として選別した。腫瘍がこの閾値より低いマウスを腫瘍なしと見なした。約４週間後、マウスに麻酔をかけ、解析のために腫瘍を抽出した。動物を死体解剖した。腫瘍と肺をパラフィンで包埋し、組織学的解析用に処理した。ヘマトキシリンとエオシンで染色した連続的な肺の切片において顕微鏡により微少転移解析を行った。腫瘍切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、サンプルの同定を知らされていない各々の病理学者が分析した。導入遺伝子の発現を、抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫組織化学により腫瘍切片上で調べた。切片をメイヤーヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。腫瘍の血管形成を抗−フォンヴィレブランド因子抗体（デンマーク、グロストラップのＤＡＫＯ）を用いて免疫組織化学により分析した。切片を上述のごとく対比染色した。血管密度を顕微鏡により測定した。１匹の動物あたり少なくとも１２領域を解析した。全ての動物実験の手順は、イタリアのトリノ大学およびイタリア保健省により承認された。
【００３２】
統計的解析
統計的有意性を、両側等分散性スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ）ｔ−検定（アレイ１、コントロール群；アレイ２、実験群）を用いて調べた。解析した全てのデータについて、ｐ＜０．０５を有意な閾値と想定した。全ての図において、値を平均±標準偏差として表し、統計的有意性を１個（ｐ＜０．０５）または２個（ｐ＜０．０１）の星により示す。
【００３３】
結果
ＨＧＦ／Ｍｅｔ機能ドメインの改変
ＭｅｔとＨＧＦに含まれる機能ドメインの模式図を図１Ａに表す。Ｍｅｔの細胞外部分は、Ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩヒンジ、および４つのＩＰＴモジュール（左図）を含む。ＨＧＦは、成熟たんぱく質においてジスルフィド結合により連結されたα−およびβ−鎖からなる。次に、α−鎖は、Ｎ末端ドメインと４つのクリングルを含む（右図）。ＭｅｔとＨＧＦ間の相互作用を解析するため、本発明者らは、全てのこれらの機能ドメインを、各々、可溶性たんぱく質として発現させた。それらが適切に分泌できるように、機能ドメインを、Ｎ末端で親たんぱく質のシグナルペプチドを含むように改変した。Ｃ末端には、抗体認識用に外因性エピトープ（ＦＬＡＧまたはＭＹＣ）およびたんぱく質精製用にポリヒスチジンタグを付加した。全ての改変された因子をコードするｃＤＮＡを、レンチウイルスベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．Ｗｐｒｅにサブクローン化し、組み換えレンチウイルス粒子を材料と方法に記載されるごとく産生した。組み換えたんぱく質をレンチウイルスベクター形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞の条件培養から回収し、アフィニティークロマトグラフィーにより均一になるまで精製した。精製したたんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる標準物質に対して定量化した（図１Ｂ）。
【００３４】
Ｍｅｔ−ＨＧＦ相互作用のＥＬＩＳＡ解析
ＨＧＦと相互作用するＭｅｔ細胞外ドメインの能力をＥＬＩＳＡ結合アッセイでテストした。可溶性受容体（デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、Ｓｅｍａ、ＰＳＩ−ＩＰＴ、ＩＰＴ）を固相に固定し、上昇濃度の活性ＨＧＦに晒した。ビオチン化抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明らかにした。可溶性Ｍｅｔドメインの代わりに固相中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて非特異的ＨＧＦ結合を調べた。材料と方法に記載されるごとく非線形回帰分析により結合親和性を調べた。これらの条件において、デコイＭｅｔはＨＧＦに約０．２−０．３ｎＭのＫＤで結合した。以前の測定と一致して、Ｓｅｍａ−ＰＳＩとＳｅｍａは、デコイＭｅｔと比較して少なくとも１ｌｏｇ低い親和性でＨＧＦに結合した。驚くべきことに、ＰＳＩ−ＩＰＴとＩＰＴの両方は、デコイＭｅｔとほぼ同一の親和性をもって極めて効果的にＨＧＦに結合した（図２Ａ）。ＰＳＩドメインの有無は、ＳｅｍａまたはＩＰＴのいずれもＨＧＦに対する結合親和性に影響しない。それゆえ、今まで天然に見出されるほぼ全てのＳｅｍａドメインがＣ末端でＰＳＩモジュールを有することから、本発明者らは、デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、およびＩＰＴを用いて結合解析を続けた。
【００３５】
プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−α、ＨＧＦ ＮＫ１およびＨＧＦ−βに対する各Ｍｅｔモジュールの親和性を調べ、それを活性ＨＧＦに対するものと比較するため、改変された受容体を固相に固定し、上昇濃度のＭＹＣ−タグリガンドに晒した。抗−ＭＹＣ抗体を用いて結合を明らかにした。液相中でクリングル含有たんぱく質アンジオスタチン（ＡＳ）−ＭＹＣエピトープでもタグを付けた−を用いて非特異的結合を調べた。プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ α−鎖およびＨＧＦ ＮＫ１は、ＨＧＦ α−鎖の最小Ｍｅｔ結合モジュールを表し、活性ＨＧＦと比較してそれぞれ３−、４−および１０−倍低い親和性でデコイＭｅｔに結合した（図２Ｂ）。ＨＧＦ−βのデコイＭｅｔ（またはいずれか他のＭｅｔドメイン）への結合は極めて低いため、この種のアッセイで検出できなかった。Ｓｅｍａ−ＰＳＩが顕著な親和性で活性ＨＧＦへ結合したのみで、他方、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−αまたはＨＧＦ ＮＫ１への結合は非特異的結合と区別できなかった（図２Ｃ）。対照的に、ＩＰＴは、活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦおよびＨＧＦ−αに同一の高い親和性で結合した（図２Ｄ）。ＨＧＦ ＮＫ１は、ＩＰＴに活性ＨＧＦより１０倍低く、すなわち、デコイＭｅｔへ結合したものと同一の親和性で結合した。これらのデータは、ＭｅｔのＩＰＴ領域が、リガンドのたんぱく質分解処理とは無関係にＨＧＦのα−鎖に高い親和性で結合することを示唆する。
【００３６】
ＨＧＦのα−鎖はＩＰＴドメイン３と４に高い親和性で結合する
ＭｅｔのＩＰＴ領域は、約４００個のアミノ酸まで伸長し、４つのＩＰＴドメインを含む。ＩＰＴ−ＨＧＦ接触面をより細かく位置付けするため、１つまたはそれ以上のドメインを欠失させた一連のＩＰＴ変異体を設計した（図３Ａ）。ＩＰＴ△１とＩＰＴ△１−２は、第１または第１の２つの免疫グロブリン様ドメインをそれぞれ欠失する、２つのＩＰＴのＮ末端欠失形態である。ＩＰＴ−３とＩＰＴ−４は、単一のたんぱく質として表される２つのＣ末端免疫グロブリン様ドメインに相当する。たんぱく質の産生と精製を上述のごとく行った。ＨＧＦのα−鎖と相互作用する改変ＩＰＴの能力を、コントロールとして全ＩＰＴ領域を用いてＥＬＩＳＡ結合アッセイで調べた。ＩＰＴ、ＩＰＴ△１、ＩＰＴ△１−２、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４を固相に固定し、上昇濃度のＨＧＦ−αに晒した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明らかにした。非特異的結合を上述のごとくＢＳＡを用いて測定した。図３Ｂに示されるように、第１の２つの免疫グロブリン様ドメインの欠失は、実質的にＨＧＦ結合に影響しなかった。
【００３７】
実際に、ＩＰＴ△１−２は、Ｍｅｔの最後の２つの免疫グロブリン様ドメインに相当するたんぱく質であり、ＨＧＦのα−鎖に、ＩＰＴより高いとはいかないまでも同等の強さで結合した。しかしながら、第３または第４の免疫グロブリン様ドメインのさらなる欠失は、ほぼ完全にＨＧＦ−α結合を妨げた。同様の結果をＨＧＦ−αの代わりに活性ＨＧＦまたはプロ−ＨＧＦを用いて得た。これらのデータは、Ｍｅｔの最後の２つの免疫グロブリン様ドメインが、真性Ｍｅｔとの関連で膜貫通へリックスに近接して存在し、ＨＧＦのα−鎖に高い親和性で結合するのに十分であることを示唆する。
【００３８】
ＩＰＴドメイン３と４は、生存細胞でＨＧＦに結合するのに十分である。
ＨＧＦが膜アンカー受容体との関連でＩＰＴ３と４に結合できるかどうかを調べるために、細胞外領域に大きな欠失を保有するＭｅｔたんぱく質を設計した。Ｓｅｍａドメイン（ａａ２５−５１５）、ＰＳＩドメイン（ａａ５１６−５６２）および第１の２つのＩＰＴドメイン（ＩＰＴ１と２、ａａ５６３−７４１）に相当する、アミノ酸２５−７４１を欠失させ、ＩＰＴ３と４、膜貫通へリックスおよび全細胞質領域を含む組み換え受容体を作成した（図４Ａ）。改変された受容体Ｍｅｔ△２５−７４１をコードするｃＤＮＡを、上述のごとく同一のレンチウイルスベクターにサブクローン化した。組み換えレンチウイルス粒子を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べられるごとく、内在性Ｍｅｔ発現を欠失するヒト卵巣癌細胞株ＴＯＶ−１１２Ｄを形質導入するのに用いた（Michieli, P., et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73）。表面ビオチン化解析は、Ｍｅｔ△２５−７４１がＴＯＶ−１１２Ｄ細胞の膜上に適切に発現され、曝露されることを明らかにした（図４Ｂ）。
【００３９】
Ｍｅｔ△２５−７４１がＨＧＦに結合できるかどうかを調べるために、レンチウイルスベクターを形質導入した細胞を、組み換えＨＧＦの存在下または非存在下でインキュベートし、その後、それらを架橋剤ＢＳ３で処理した。細胞溶解物をＭｅｔのＣ末端部分に対する抗体で免疫沈殿し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析し、抗−ＨＧＦでビオチン化した抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。コントロールとして、野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞について同一の解析を行った。免疫ブロットは、ＨＧＦで処理したＭｅｔ△２５−７４１を発現する細胞に相当するレーンにおいて約１８０ｋＤ分子量の異なるバンドを示すが、リガンドの存在または非存在のいずれにおいても、ＨＧＦなしの同一細胞または野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に相当するレーンでは該バンドを示さなかった（図４Ｃ）。Ｍｅｔ△２５−７４１とＨＧＦの両方が約９０ｋＤａの分子量を有することを考慮すると、免疫沈殿された架橋たんぱく質は、ＨＧＦとＭｅｔ△２５−７４１により形成された複合体と一致する。
【００４０】
ＩＰＴドメイン３および４へのＨＧＦの結合は生存細胞でＭｅｔ活性を生じる。
次に、本発明者らは、Ｍｅｔ△２５−７４１へのＨＧＦ結合がＭｅｔキナーゼ活性を誘導できるかどうかをテストした。この目的を達成するため、レンチウイルスベクターを形質導入したＴＯＶ−１１２Ｄ細胞をプロ−ＨＧＦまたは活性ＨＧＦで刺激し、細胞溶解物を上述のごとき抗−Ｍｅｔ抗体で免疫沈殿した。受容体活性を、抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロット解析により調べた。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体で再結合させて免疫沈殿した受容体の量を標準化した。特に、プロ−ＨＧＦと活性ＨＧＦの両方はＭｅｔ△２５−７４１の強いリン酸化を誘導することができた（図４Ｄ）。プロ−ＨＧＦの全長Ｍｅｔへの結合がキナーゼ活性を誘導せず、このことは、Ｓｅｍａドメインが何らかの形で活性ＨＧＦ受容体への結合に依存して遊離されるＭｅｔ触媒活性上の自己抑制効果を及ぼすことを示唆する。受容体刺激をまた、ＨＧＦ ＮＫ１およびタンデムに繰り返される２つのＮＫ１フラグメントからなる改変二量体リガンド（ＮＫ１−ＮＫ１；図４Ｅ）を用いて行った。図４Ｄに示されるように、レンチウイルスベクター形質導入ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞のＮＫ１−ＮＫ１刺激がＭｅｔ△２５−７４１の強力なリン酸化を生じる一方、単量体ＮＫ１による刺激は効果を示さなかった。これらの結果は、Ｍｅｔの２つのＣ末端ＩＰＴドメイン（ＩＰＴ３および４）が、ＨＧＦ（より正確には、ＨＧＦのα−鎖における最小Ｍｅｔ結合モジュールを表すＨＧＦ ＮＫ１）に結合し、細胞質キナーゼドメイン、推定上、以後のリガンド誘導受容体二量体への受容体活性のシグナルを伝達するのに十分であることを示唆する。しかしながら、それらはまた、ＩＰＴ３とＩＰＴ４単独では、ＨＧＦの生物学的に活性な形態を不活性な前駆体、プロＨＧＦと区別するのに十分でないことを示唆する。
【００４１】
可溶性ＩＰＴは、インビトロでＨＧＦ誘導性侵襲増殖を抑制する。
以前の研究において、可溶性たんぱく質（デコイＭｅｔ）として発現されたＭｅｔの細胞外部分が、インビトロおよび癌のマウスモデルでＨＧＦ誘導性侵襲増殖を抑制することが示された（Michieli P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73）。組み換え可溶性Ｓｅｍａ−ＰＳＩもまた、リガンド−依存性および−非依存性Ｍｅｔリン酸化の両方を抑制することが示された（Kong-Beltran M. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 75-84）。これらの結果に基づいて、可溶性ＩＰＴが生存細胞でＨＧＦ／Ｍｅｔ拮抗性活性を示すかどうかをテストした。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞は、Ｍｅｔを発現し、ＨＧＦ介在侵襲性増殖の解析用に樹立されたモデル系であり、これを可溶性デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩまたはＩＰＴをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。空ベクターで形質導入した細胞をコントロールとして用いた。比較レベルの可溶性因子（約５０ｐｍｏｌ／１０６細胞／２４時間）を分泌するレンチウイルスベクター形質導入細胞を、数日間血清飢餓とし、組み換え因子を培地中に蓄積させ、次いで組み換えＨＧＦで刺激した。Ｍｅｔチロシンリン酸化を、上述のごとき抗−ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロッティングにより調べた。図５Ａに示されるように、ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩの両方がＨＧＦ誘導Ｍｅｔリン酸化を部分的に抑制したが、一方で、デコイＭｅｔは、Ｍｅｔ活性を誘導するＨＧＦの能力を完全に中和した。ＭｅｔのＣ末端に対する抗体を用いた同一の免疫ブロット物の再結合は、免疫沈殿させたたんぱく質の量に実質的な相違がないことを明らかにした。
【００４２】
より生物学的な状況におけるＭｅｔ細胞外ドメインの抑制能力をテストするために、同一の細胞を用いてＨＧＦ依存性の分岐形態形成アッセイを行った。前もって形成された細胞の球状体を三次元コラーゲンマトリックスに播種し、次いで、組み換えＨＧＦで刺激して管状構造を形成させた。各コロニーから生じる細管の平均数をスコア化することにより分岐を定量化した。図５Ｂで示されるように、可溶性ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩの両方は、ＨＧＦ誘導性コロニー分岐を抑制した（空ベクター、１７．５個の細管／コロニー；ＩＰＴ、４．０個の細管／コロニー；Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、６．７個の細管／コロニー）。しかしながら、リン酸化実験で得られた結果と一致して、デコイＭｅｔは、そのサブドメインのいずれよりも強力なＨＧＦ−阻害剤であった（２．５個の細管／コロニー）。コロニー形態の代表的な図を図５Ｃに示す。
【００４３】
可溶性ＩＰＴはマウスにおける抗腫瘍および抗転移活性を示す。
上記の結果は、本発明者らに癌のマウスモデルにおける可溶性ＩＰＴの治療能力を探索することを想起させた。レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５メラノーマ細胞を、ＣＤ−１ ｎｕ−／−マウスに皮下注射し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。約３週間後、解析のために腫瘍を抽出し、マウスを死体解剖にかけた。カプラン−マイヤー類似解析において、腫瘍非存在の動物のパーセンテージを時間に対してプロットし、腫瘍潜伏を平均日数を算出して定量化する場合、全ての改変可溶性受容体が実験上の腫瘍の出現を遅らせた。しかしながら、ＩＰＴはＳｅｍａ−ＰＳＩよりわずかに効率的であり、デコイＭｅｔはＩＰＴまたはＳｅｍａ−ＰＳＩのいずれよりも強力であった（図６Ａ）。経時的な腫瘍組織量解析は、ＩＰＴがデコイＭｅｔよりわずかに効率的である一方、Ｓｅｍａ−ＰＳＩが実験の極めて早い期間のみに腫瘍増殖を抑制することを明らかにした（図６Ｂ）。導入遺伝子発現の免疫組織化学解析は、デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩおよびＩＰＴが腫瘍における同様のレベルと分布となることを示した（図６Ｃ）。
【００４４】
ＨＧＦが強力なプロ−血管形成因子であることから、腫瘍におけるＨＧＦ／Ｍｅｔの抑制が血管形成の障害を生じるかどうかを調べた。腫瘍切片を、フォンヴィレブランド因子に対する抗体を用いて免疫組織化学により解析し、血管密度を顕微鏡により測定した（図６Ｄ）。ＩＰＴが腫瘍血管密度を１．５倍まで減少させる一方、デコイＭｅｔはさらにより強い抑制を達成した（約４倍）；Ｓｅｍａ−ＰＳＩは腫瘍血管形成にあまり影響しなかった。死体解剖により、上述のマウスから肺を抽出し、組織学用に処理した。連続的な肺の切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡により解析することにより微少転移の存在を調べた。結果を図６Ａに示す。コントロール群では、６匹中４匹のマウス（６７％）が微少転移を生じていた。ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩ群においては、微少転移は、６匹中１匹のみのマウス（１７％）にしか見出されなかったが、デコイＭｅｔ群では転移を見出すことができなかった。転移病巣は、実質性（血管外）と塞栓性（血管内；代表的な図として図６Ｆを参照）の両方であった。
【００４５】
本開示で提供されるＨＧＦ上の高親和性ＨＧＦ結合部位の同定は、ＨＧＦおよびＨＧＦＲのより特異的な阻害剤／拮抗剤の作成を導く新しい手法の設計を可能にする。以下は、ＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするか、または新しい阻害剤／拮抗剤を作成する道具としてＨＧＦＲの高親和性部位を利用する、ＨＧＦ／ＨＧＦＲの高親和性／拮抗剤の同定のための新しい方法の非限定的な例である。
【００４６】
ＨＧＦ結合を抑制するＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合するモノクローナル抗体の開発
ＨＧＦと細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインとの相互作用が高親和性ＨＧＦ結合に不可欠である場合、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合し、ＨＧＦＲ結合に関してＨＧＦと競合する特異的なモノクローナル抗体を作成することができる。このことはいくつかの方策により行うことができる。
【００４７】
（Ａ）ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４から生じる組み換えたんぱく質またはペプチドは、一般的な遺伝子改変技術または化学合成により作成される。このたんぱく質またはペプチドは、適当な実験動物（一般的にはマウスまたはラット）に注入されて免疫応答を生じさせる。次いで、脾細胞は、免疫された動物から単離され、骨髄腫細胞株に融合され、抗体産生ハイブリドーマクローンが一般的なモノクローナル抗体技術により選択される。次に、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、固相中の組み換えＩＰＴ−３とＩＰＴ−４および液相中のハイブリドーマ産生抗体を利用する、本開示に記載されるものと同様のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングされる。市販されている抗−マウス免疫グロブリン抗体を用いて結合が明らかにされる。代替的に、抗体は、（液相中の）組み換えＨＧＦを（固相中の）ＩＰＴ−３とＩＰＴ４から置換するそれらの能力、または組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質を免疫沈殿するそれらの能力についてスクリーニングされる。
【００４８】
（Ｂ）適切な発現ベクターに挿入されたＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４をコードするポリヌクレオチド配列が実験動物に直接注入されて遺伝子産物に対する免疫応答が生じる。次いで、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、上述のごとく単離され、スクリーニングされる。
【００４９】
（Ｃ）適切な発現ベクターに挿入されたＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４をコードするポリヌクレオチド配列がＨＧＦＲを発現しない哺乳動物細胞株に移入されて細胞表面上のＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４の発現が得られる。次いで、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４を発現する細胞が実験動物に注入されて免疫応答が生じ、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、上述のごとく単離され、スクリーニングされる。
【００５０】
（Ｄ）哺乳動物リンパ球に由来する（好ましくは、ヒトであって、例えば、ＨＧＦＲを発現する腫瘍を侵襲するリンパ球に由来する）一般的な遺伝子改変技術（例えば、ファージディスプレイ）により作成された固有（ｎａｔｉｖｅ）の抗体ライブラリーは、組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質を用いてスクリーニングされる。次に、陽性クローン（すなわち、高親和性でＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合するクローン）が単離され、増殖され、抗体が生化学的に特徴付けされる。
【００５１】
（Ｅ）ヒト記憶Ｂ細胞は、Traggiai E. et al. (2004) Nat Med. 10(8), 871-875を含むいくつかの研究により開示されるごとく、ＨＧＦＲを発現する腫瘍を保有する患者の末梢血から単離される。不死化記憶Ｂ細胞の培養が樹立されると、当業者は、上記（Ａ）に記載される方法を用いて、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体を分泌する細胞をスクリーニングすることができる。かかる抗体産生細胞を同定した後、望ましい抗体がポリメラーゼ連鎖反応および一般的な遺伝子改変方法によりクローン化されうる。
【００５２】
ＨＧＦＲ活性を抑制するＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合するテスト化合物の同定
異なる方法を用いて、ＨＧＦＲの高親和性ＨＧＦ結合部位に結合し、ＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制する、多様な起源のテスト化合物を単離することが可能である。このことはいくつかの方策により行うことができる。
【００５３】
（Ａ）本開示に記載されるものと同様のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、当業者は、ＨＧＦとＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換する薬剤について、（合成化学物質ライブラー、天然化合物ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブリーを含むが、これらだけに限定されない）化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。この種のアッセイにおいて、組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質は、固相で不死化され、液相で一定量のＨＧＦとインキュベートされる。ライブリー化合物への曝露後、ＨＧＦ結合は市販されている抗−ＨＧＦ抗体を用いて測定される。
【００５４】
（Ｂ）本開示に記載されるもの（Ｍｅｔ△２５−７４１）と同様の細胞外部分におけるＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４のみを含むＨＧＦＲの改変された形態を発現する細胞株を用いて、当業者は、ＨＧＦのＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換するか、またはＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制する薬剤について、（合成化学物質ライブラー、天然化合物ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブリーを含むが、これらだけに限定されない）化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。このことは、前記改変された細胞をライブラリーと接触させ、次いで、本研究に記載されるごとく、あるいは分散アッセイ（Ｓｃａｔｔｅｒ ａｓｓａｙ）、再構成基質侵襲アッセイ、分岐形態形成アッセイ、細胞生存アッセイまたはMichieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとくその他のインビトロ生物学的試験を含む、ＨＧＦＲ活性を明確にするその他の手法により、ＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲリン酸化を測定することにより行うことができる。
【００５５】
上述のごとく改変された細胞株を用いて、当業者は、ＨＧＦのＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換するか、またはＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制するポリヌクレオチドまたは遺伝子産物について、（ｃＤＮＡ発現ライブラリー、低分子ヘアピンＲＮＡライブラリー、アンチセンスＤＮＡライブラリー、ランダムヌクレオチドライブラリーを含むが、これらだけに限定されない）遺伝学的ライブラリーをスクリーニングすることができる。このことは、トランスフェクト、形質導入またはヌクレオチドライブラリーを前記細胞に導入するいずれかの方法、次いで、同一細胞により発現されたＨＧＦＲの欠失形態を活性化するＨＧＦの能力をテストすることにより行うことができる。ＨＧＦＲ活性は、（Ｂ）に記載されるごとく測定される。
【００５６】
ＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合する化合物の生物学的活性を測定する典型的な機能アッセイ
抗−ＩＰＴ抗体またはＩＰＴ−結合化合物を作成するいかなる方策が用いられる場合であっても、最終産物（すなわち、ＩＰＴ−３またはＩＰＴ−４に対するモノクローナル抗体、あるいはＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合する天然または合成化合物）は、これらの薬剤がＨＧＦＲ活性を抑制する能力を有するかどうかを調べることを目的とした生物学的アッセイにかけられる。これらのアッセイは、培養した哺乳類動物の細胞を用いてインビトロで、または実験動物を用いてインビボで行うことができる。
【００５７】
（Ａ）分散アッセイ。ペトリ皿中において密集コロニーで増殖し、ＨＧＦＲを発現する上皮細胞は、ＨＧＦを用いる刺激により「分散」を誘導される。ＨＧＦ刺激の結果として、ペトリ皿中の細胞は、より分離し、分散した状態を表す。このアッセイは、数種類のテスト化合物の存在下で行われうる。テストされる化合物間において、ＨＧＦ刺激に反応して分散される表現型の非存在により、ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤／拮抗剤が同定されうる。
【００５８】
（Ｂ）細胞移動アッセイ。ＨＧＦＲを発現する細胞は、ＨＧＦ濃度勾配に沿って移動する能力を有する。言い換えると、細胞は、ＨＧＦのより高濃度に向かう走化作用により誘引される。この能力は、ボーデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイにおけるＨＧＦ阻害剤のスクリーニングに用いることができる。細胞が第１のチャンバーに播種され、多孔性膜により第１のチャンバーから分離される第２のチャンバーにＨＧＦがアプライされる。細胞は、膜を通過して移動し、ＨＧＦがより濃縮される第２のチャンバーに到達する。この工程を抑制する薬剤が、ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤／拮抗剤として同定される。
【００５９】
（Ｃ）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）移動アッセイまたは再構成基質侵襲アッセイ。これは、多孔性膜がコラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、またはその他の再構成有機マトリックスの膜で覆われる（Ｂ）に記載されるアッセイの変形である。細胞は、有機マトリックスを通って移動するため、有機マトリックスを消化しなくてはならない。これは、細胞の単純な移動よりむしろ侵襲を測定する、より厳密なアッセイである。
【００６０】
（Ｄ）コラーゲン侵襲アッセイまたは分岐形態形成アッセイ。このアッセイでは、ＨＧＦＲを発現する哺乳類動物細胞（好ましくは、上皮細胞または癌細胞）は、コラーゲンの三次元層中に播種され、次いで、それらが各々約１０００個の細胞の球状体を形成するまで増殖される。代替的に、球状体は、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73で開示されるごとくメチルセルロースの存在下で非接着性９６ウェルプレートにて一晩細胞をインキュベートすることにより前もって前形成されうる。球状体がコラーゲン層に包埋されると、それらはＨＧＦで刺激され、３７℃でインキュベートされる。これにより、球状体から中が空洞の細管を生じる；各細管は、管状構造で組織される数種類の細胞により形成され、内腔が見える一方の細胞側と培地の外側に見える第２の側が存在するように極性化される。アッセイが細管を生じるとともに、分岐し、より複雑な構造を形成するようになる。このアッセイは、ＨＧＦに極めて特異的である。この工程を抑制する薬剤は、極めて特異的なＨＧＦ／ＨＧＦＲ拮抗剤を示す高い可能性を有する。
【００６１】
（Ｅ）細胞分裂アッセイ。ＨＧＦは、ＨＧＦＲを発現するいずれかの細胞でＤＮＡ複製と細胞分裂を誘導する能力を有する。最も反応性の高い細胞は、一定の初代肝細胞、通常、マウスまたはラットである。ＨＧＦ誘導性ＤＮＡ複製をテストするために、細胞は血管増殖因子から生じ、次いで上昇濃度のＨＧＦで刺激される。即座に、放射活性チミジンが添加され、細胞は３７℃で約１日インキュベートされる。強い洗浄と固定後、細胞のＤＮＡに取り込まれた放射活性チミジンは、液体シンチレーション計測または放射性の定量化を可能にするその他の一般的な方法により測定される。
【００６２】
（Ｆ）生存アッセイ。ＨＧＦは、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死からＨＧＦＲを発現する細胞を保護する能力を有する。このことは、生存アッセイでＨＧＦＲ活性を測定するのに用いられうる。細胞は、ＨＧＦおよびテスト化合物（潜在的なＨＧＦＲ阻害剤）で前インキュベートされ、次いで、毒性薬物、接着の非存在、低酸素、熱ショック、放射能、またはＤＮＡ傷害のごときアポトーシス刺激にかけられる。適当な時間経過後、細胞死は、ＴＵＮＥＬ（ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ ビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識）、ヌクレオソーム、ＤＮＡラダー、カスパーゼ活性、生体染色色素、またはこれらのいずれかの変形を含む一般的な方法により測定される。
【００６３】
（Ｇ）マウス腫瘍形成アッセイ。この種のアッセイにおいて、潜在的なＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤の活性は、実験動物、好ましくはマウスまたはラットにおいて直接テストされる。マウスにおいて腫瘍を得るいくつかの方法が存在する。最も利用される方策は、移植片を作り出すこと、すなわち、腫瘍細胞（通常、ヒト起源）を動物レシピエント（通常、免疫不全マウス）に移植することである。細胞は、皮下（実験上の腫瘍を得るのに迅速かつ単純な方法）または同所、すなわち、腫瘍細胞が単離された場所と同一の器官（例えば、乳癌を哺乳動物の脂肪体へ、大腸癌を腸粘膜へ、肝細胞癌を肝臓実質へなど）に移植されうる。用いられる細胞がいかなるものであっても、腫瘍細胞の実験動物への注入は、実験上の腫瘍を生じる。この腫瘍を生じる動物は、現在、テスト化合物の抗腫瘍能力を評価するのに用いられうる。抗−ＨＧＦ／ＨＧＦＲ抗体または化合物は、静脈注射、腹腔内注射、浸透圧ポンプ、経口投与、座剤、遺伝子治療プロトコル、局所投与などを含む最も適当な既存の方法により、調節不良のＨＧＦ／ＨＧＦＲシグナル伝達を伴う腫瘍病巣を保有する動物に送達されうる。適当な処置期間後、動物は安楽死させられ、その腫瘍と器官が解析のために取り出される。
【００６４】
（Ｈ）マウス転移形成アッセイ。実験上の転移は、腫瘍細胞の全身注射によりマウスで誘導されうる。これらは、肺の毛細血管で捕捉されるようになり、次いで溶出して肺転移を生じる。これらは、顕微鏡、組織学的解析、免疫組織化学的方法、全身イメージングを含む、いくつかのアプローチにより死体解剖時に測定されうる。テスト化合物は、（Ｇ）に記載されるごとく送達される。
【００６５】
（Ｉ）遺伝子治療プロトコル。ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤が、抗体、組み換えたんぱく質、ペプチドまたは低分子干渉ＲＮＡである場合、腫瘍を生じる動物への送達は、遺伝子治療法により行うことができる。このことは、所望のポリヌクレオチドを、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ネイクド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、またはこれらの変形型から選択することができる適当な送達ベクターに導入することにある。ベクター調製物は、腫瘍部位、ベクターまたは腫瘍組織型に応じて腫瘍に全身的または局所的に送達されうる。遺伝子治療の生物学的な効果は、（Ｇ）にてその他の化合物について記載されるごとく解析される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）たんぱく質の分野に関する。より詳細には、本発明は、そのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するＨＧＦＲの高親和結合部位の同定、ならびＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするＨＧＦＲ拮抗剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔとも呼ばれる）は、チロシンキナーゼであり、ｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子の産物である。それは、５０ｋＤａのα−サブユニットと１４５ｋＤａのβ−サブユニットからなり、ジスルフィド結合により結合され、α−サブユニットは完全に細胞外である一方、β−サブユニットは（ＮからＣ末端まで）細胞外領域、膜貫通ドメインおよび細胞質チロシンキナーゼドメインを含む。成熟α／βヘテロ二量体受容体は、１７０ｋＤａの単一鎖前駆体からたんぱく質分解過程とグリコシル化により作成される。
【０００３】
ＨＧＦは、細胞分散因子としても知られ、細胞の増殖、運動、生存および形態形成を含む、広範囲の生物学的活性を有するヘアピン結合性の糖たんぱく質である。プロテオグリカンに対するその高い親和性のため細胞外マトリックスに貯蔵される、不活性な単一鎖前駆体（プロ−ＨＧＦ）として合成され、分泌される。プロ−ＨＧＦは、残基Ｒ４９４−Ｖ４９５でたんぱく質分解の切断を経て、生物学的に活性のある形態、ジスルフィド結合α／βヘテロ二量体を生じ、ここで、α鎖は、Ｎ−末端ドメインの後に４つのクリングルドメインからなり、β鎖は、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼと構造の相同性を共有する。しかしながら、β鎖は、セリンプロテアーゼの触媒三連構造を形成する３つの不可欠な残基のうちの２つがＨＧＦで保存されていないため、たんぱく質分解活性を欠如する。シグナル伝達できないにもかかわらず、プロ−ＨＧＦは、高親和性でＭｅｔに結合し、活性なＨＧＦを置換する。
【０００４】
近年、多くの構造機能研究は、ＭｅｔとＨＧＦの細胞外部分間の相互作用をいくらか明らかにした。
【０００５】
Ｍｅｔ細胞外領域は、モジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）構造を有し、３つの機能ドメイン：たんぱく質のＮ−末端において最初の５００残基にわたり、７枚羽根のβ−プロペラ構造を有する（セマフォリンおよびプレキシンにも存在する）Ｓｅｍａドメイン、約５０残基にわたり、４つの保存されたジスルフィド結合を含む（プレキシン、セマフォリンおよびインテグリンにも見出される）ＰＳＩドメイン、ならびにＰＳＩドメインを膜貫通へリックスに連結させ、４つのＩＰＴドメイン（プレキシンおよび転写因子に存在する免疫グロブリン関連ドメイン）により占められるさらなる４００残基を含む。
【０００６】
ＨＧＦは、二価リガンドであり、α−鎖のＭｅｔに対する高い親和性結合部位およびβ−鎖における低い親和結合部位を含む。α−とβ−鎖の協調は、ＨＧＦの生物学的活性に必要であるが、一方で、α−鎖、より正確には、Ｎ−ドメインと第１のクリングルは、Ｍｅｔ結合に十分であり、β−鎖は、Ｍｅｔ活性に必要である。
【０００７】
ＨＧＦのβ−鎖との複合体におけるＭｅｔのＳＥＭＡおよびＰＳＩドメインの結晶構造解析（国際公開第２００５／１０８４２４号Ａを参照）は、ＨＧＦに対する低い親和性結合部位がβ−プロペラの羽根２−３に位置し、Ｍｅｔに結合するＨＧＦ−βの部分が、セリンプロテアーゼがそれらの物質または阻害剤に結合するのに用いるのと同一の領域であることを明らかにした。重要なことに、２．５３Å分解能におけるＨＧＦのβ−鎖の結晶構造測定および特異的な突然変異分析は、ＨＧＦ β−鎖の活性ポケットにおけるＭｅｔ結合に関連する残基がプロ−ＨＧＦのたんぱく質分解変換後のみに曝露するようになることを明らかにし、それによりプロ−ＨＧＦが活性化することなく高い親和性でＭｅｔに結合する理由を説明する。ＨＧＦのβ−鎖とＭｅｔのＳｅｍａドメインの間の低い親和性相互作用が構造的かつ機能的に十分特徴付けられる一方で、Ｍｅｔのどの領域が高い親和性でＨＧＦのα−鎖に結合するか明確ではない。それゆえ、ＨＧＦがＭｅｔを活性化する主なメカニズムは、いまだにあまり理解されていない。このことは、この経路の生物学的および治療上の大きな重要性を考慮するといくらか驚きである。
【０００８】
ＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は、胚形成の期間および成人期の組織再生時に必要不可欠である。重要なことに、調節解除されたＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達は、腫瘍形成および転移において重要な役割を担っている。自己分泌ＨＧＦ刺激、受容体過剰発現、遺伝子増幅および点変異を含む、異なるメカニズムによる不適切なＭｅｔ活性は、多種類のヒト悪性腫瘍で現れ、好ましくない予後と相関する。これらの知見は、癌治療の標的としてのＨＧＦ−Ｍｅｔ経路における大きな関心を生じ、多種のＭｅｔ／ＨＧＦ阻害剤の開発を導いた。これらは、Ｍｅｔキナーゼ活性を標的とする小分子化合物、中和する抗Ｍｅｔまたは抗ＨＧＦ抗体、デコイ受容体およびＨＧＦ由来因子を含む。それにもかかわらず、かかる分子がＨＧＦに対する高親和性結合を標的とするかどうか、高い親和性でＭｅｔに結合するＨＧＦに基づく正確な分子メカニズムがどんなものであるかは、いまだ知られていない。このことが、感受性の増加と副作用の減少を伴う、より選択的な治療剤を単離することから妨げうる。ＨＧＦに対するＭｅｔ高親和性結合部位の正確な知見は、極めて特異的なＭｅｔの拮抗剤を設計することを確実に助長する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、癌治療に対するより有効な治療戦略の開発のために、感受性の増加と副作用の減少を伴うＭｅｔ拮抗剤の同定を可能にする改善された解決手段が必要とされる。
【００１０】
本開示の目的は、かかる改善された解決手段を提供することである。
【００１１】
本発明によると、かかる目的は、特に下記の請求項で記載される特徴を有する解決手段により達成される。請求項は、本発明に関して提供される本明細書における技術的な教示の不可欠な部分を形成する。
【００１２】
それゆえ、本開示の目的は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、すなわち、ＨＧＦの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに対するＨＧＦ高親和性結合部位の同定である。本発明のさらなる目的は、癌治療の新しい治療戦略の開発のために、ＨＧＦに対するＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするＨＧＦＲの拮抗剤の同定方法を提供することである。
【００１３】
１の具体例において、本発明は、癌、特に肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌の治療に有用な薬理学的に活性のある薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチド、またはコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００１４】
１の具体例において、薬理学的に活性のある薬剤は、肝細胞増殖因子受容体阻害剤および／または拮抗剤であり、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンスヌクレオチド、ＲＮＡを基にした阻害剤、ｓｉＲＮＡ、抗体、ペプチド、ドミナントネガチィブ因子から選択されうる。
【００１５】
さらなる具体例において、本発明は、癌、特に肝細胞増殖受容体活性の調節不良を伴う癌に有用な肝細胞増殖因子受容体の拮抗剤／阻害剤として作用するテスト薬剤の能力を検出する方法であって、
（ａ）テスト薬剤を、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメイン、あるいは少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、
（ｂ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を測定し、次いで
（ｃ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を減少させる薬剤を選択する
工程を含む方法に関する。
【００１６】
なおさらなる具体例において、本発明は、癌を治療するための医薬として、肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインの使用に関する。
【００１７】
ここで、本発明は、付属の図面に関する非限定的な例としていずれかの好ましい具体例について詳細に記載される。図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】−図１は、ＭｅｔとＨＧＦサブドメインの改変と精製を示す。（Ａ）本研究で用いられた改変たんぱく質の模式図。左図：改変された受容体。Ｗ．Ｔ．ＭＥＴ、野生型Ｍｅｔ；ＥＸＴＲＡ、細胞外部分；ＩＮＴＲＡ、細胞内部分；ＳＰ、シグナルペプチド；ＳＥＭＡ、セマフォリン相同ドメイン；ＰＳＩ、プレキシン−セマフォリン−インテグリン相同ドメイン；ＩＰＴ１−４、免疫グロブリン−プレキシン−転写因子相同ドメイン１−４；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＪＭ、膜近傍ドメイン；ＫＤ、キナーゼドメイン；ＣＴ、Ｃ末端尾部；Ｅ、ＦＬＡＧまたはＭＹＣエピトープ；Ｈ、ポリ−ヒスチジンタグ。赤色の三角形は、α−とβ−鎖の間のたんぱく質分解切断部位を示す。右図：改変されたリガンド。Ｗ．Ｔ．ＨＧＦ、野生型ＨＧＦ；ＮＤ、Ｎ−ドメイン；Ｋ１−４、クリングル１−４；ＰＬＤ、プロテアーゼ様ドメイン；ＵＮＣＬ．ＨＧＦ、未切断ＨＧＦ。星印は、たんぱく質分解部位におけるＲ４９４Ｑアミノ酸置換を示す。（Ｂ）アフィニティー精製された受容体とリガンドのクーマシー染色。各たんぱく質群（Ｓｅｍａ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、デコイＭｅｔ；ＰＳＩ−ＩＰＴ、ＩＰＴ；ＨＧＦ−α、未切断ＨＧＦ、ＨＧＦ；ＨＧＦ ＮＫ１、ＨＧＦ−β）を、非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線に対して定量化する。ＭＷ、分子量マーカー；ｋＤａ、キロダルトン。
【図２】−図２は、ＨＧＦ−Ｍｅｔ相互作用のＥＬＩＳＡ解析を示す。（Ａ）Ｍｅｔサブドメインの活性ＨＧＦへの結合。改変された受容体を、固相に固定し、液相における上昇濃度の活性ＨＧＦに対して曝露した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明確にした。固相中で精製された受容体の代わりにＢＳＡを用いることにより非特異的な結合を測定した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、およびＩＰＴのＨＧＦの異なる形態への結合。改変された受容体を固相に固定し、液相においてＭＹＣ−タグの活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−αまたはＨＧＦ ＮＫ１の上昇濃度に曝露した。抗−ＭＹＣ抗体を用いて結合を明確にした。液相中でＭＹＣ−タグのアンジオスタチン（ＡＳ）を用いることにより非特異的な結合を測定した。
【図３】−図３は、ＩＰＴドメイン３および４が高い親和性でＨＧＦ−αに結合するのに十分であることを示す。（Ａ）欠失されたＩＰＴ変異体の模式図。図１Ａと同じ色分けと説明。（Ｂ）ＩＰＴ変異体とＨＧＦ−α間相互作用のＥＬＩＳＡ解析。改変されたＩＰＴを固相で固定し、液相中で上昇濃度のＨＧＦ−αに曝露した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明確にした。
【図４】−図４は、ＩＰＴドメイン３および４が生存細胞でＨＧＦに結合するのに十分であることを示す。（Ａ）欠失Ｍｅｔ△２５−７４１受容体の模式図。図１Ａと同じ色分けと説明。（Ｂ）表面ビオチン化解析。細胞たんぱく質を、ＭｅｔのＣ末端部分に対する抗体を用いて免疫沈殿（ＩＰ）させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（ＳＡ）を用いてウェスタンブロッティング（ＷＢ）により解析した。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体で再結合させた。Ｗ．Ｔ．、野生型；Ａ５４９、Ａ５４９ヒト肺癌細胞；ＭＤＡ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞；ＴＯＶ、ＴＯＶ−１１２Ｄヒト卵巣癌細胞；Ｅｍｐｔｙ Ｖ．、空ベクター；ｐ１７０バンドは未処理Ｍｅｔに相当する；ｐ１４５は受容体の成熟形態である。（Ｃ）化学的架橋解析。Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞（Ｍｅｔ △２５−７４１）および野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞（Ｗ．Ｔ．ＴＯＶ）をＨＧＦとインキュベートし、次いで化学的架橋にかけた。細胞溶解物を、抗−Ｍｅｔ抗体を用いて免疫沈殿させ、抗−ＨＧＦ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。矢印は、ＨＧＦ−Ｍｅｔ△２５−７４１複合体を示す。（Ｄ）Ｍｅｔリン酸化解析。Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を、ネガティブコントロールとして１％ＰＢＳおよび等量のＨＧＦ、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ ＮＫ１またはＮＫ１−ＮＫ１で刺激した。抗−Ｍｅｔ抗体を用いた免疫沈殿および抗−ホスホチロシン（抗−ｐＴｙｒ）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより受容体のリン酸化を調べた。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体を用いて再結合させた。矢印は、Ｍｅｔ△２５−７４１または免疫グロブリン（Ｉｇ）に相当するバンドを示す。（Ｅ）ＮＫ１−ＮＫ１の模式図。Ｎ−からＣ−末端まで：ＳＰ、シグナルペプチド；ＮＤ、Ｎ−ドメイン；Ｋ１、クリングル１；Ｈ、ポリヒスチジンタグ。
【図５】−図５は、可溶性ＩＰＴがインビトロでＨＧＦ誘導侵襲性増殖を阻害することを示す。（Ａ）レンチウイルスを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、組み換えＨＧＦで刺激し、抗−ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロッティングによりＭｅｔリン酸化を調べた（上図）。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体を用いて再結合させた（下図）。Ｅｍｐｔｙ Ｖ．、空ベクター。（Ｂ）分枝形態形成アッセイ。レンチウイルスベクターを形質導入させたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の前もって形成させた球状体を、コラーゲン中に包埋し、次いで、組み換えＨＧＦで刺激すると分枝した細管を形成した。各球状体から生じる細管の平均数をスコア化することによりコラーゲン侵襲を定量化した。ＥＶ、空ベクター；ＤＭ、デコイＭｅｔ；ＳＰ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ。（Ｃ）Ｂに記載される実験からの代表的な図。倍率：２００Ｘ。
【図６】−図６は、可溶性ＩＰＴがマウスにおいて抗−腫瘍および抗−転移活性を示すことを表す。ＣＤ−１ヌル−／−マウスに、レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。（Ａ）腫瘍潜伏のカプラン−マイヤー類似ブロット（Ｘ軸、日数；Ｙ軸、腫瘍非存在の動物のパーセンテージ）。空 ｖ．、空ベクター。（Ｂ）経時的な平均腫瘍体積。（Ｃ）抗−ＦＬＡＧ抗体を用いた腫瘍切片の免疫組織化学的解析。倍率：４００Ｘ。（Ｄ）腫瘍血管解析。腫瘍切片を抗−フォンヴィレブランド因子抗体で染色した。腫瘍切片の球状体ｍｍあたりの血管数を顕微鏡により調べた。ＥＶ、空ベクター；ＤＭ、デコイＭｅｔ；ＳＰ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ。（Ｅ）転移発生率解析。死体解剖により、連続的な肺切片を顕微鏡で解析して微少転移の存在を調べた。転移発生率、−すなわち、マウス全数に対する転移を有するマウス数−を、パーセンテージ（バー）と（バーの末端における）フラクションの両方で示す。（Ｆ）空ベクターの群に由来する微少転移の代表的な図。肺切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。点線は血管の壁（ｖｓ）を同定する。転移細胞（ｍｃ）は塞栓として血管内部または実質で見出すことができる。倍率：４００Ｘ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示で提示されるデータは、ＨＧＦのα−鎖が、高親和性でＭｅｔのＩＰＴ領域に結合し、リガンドのたんぱく質分解処理を単独で行うことを示唆する。それらはまた、Ｓｅｍａドメインを欠く膜貫通ＭｅｔにおけるＨＧＦのＩＰＴへの結合が、リガンドの不活性および活性形態の区別にかかわらず、細胞質キナーゼドメインへの受容体活性のシグナル伝達に十分であることを示唆する。したがって、それらは、ＭｅｔのＩＰＴ領域とＳｅｍａドメインに由来する改変たんぱく質が、インビトロとインビボの両方でＨＧＦのプロ侵襲活性（ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を中和することができる証拠を提供する。
【００２０】
ＨＧＦが二価因子であることは長い間知られてきた。初期のたんぱく質改変研究は、ＨＧＦのＮドメインと第１クリングルにおける高い親和性Ｍｅｔ結合部位を同定した。後に、生化学および生物学的解析を合わせた解析は、ＨＧＦセリンプロテアーゼ様ドメイン（β−鎖）が必ずしも結合に必要ではないが、受容体活性を介在するのに重要な役割を担うことを示した。より最近では、詳細な結晶学および変異原性データは、ＨＧＦのβ−鎖上の低い親和性Ｍｅｔ結合部位およびＭｅｔのＳｅｍａドメインとの相互作用を構造的かつ機能的に完全に特徴付けた。しかしながら、ＨＧＦのα−鎖とＭｅｔ間の接触はいまだ解明されていない。少角Ｘ線分散および低温電子顕微鏡研究は、ＨＧＦのＮ−末端と第１クリングルおよびＭｅｔのＳｅｍａドメインの間の接触の存在を示唆した。しかし、プラズモン共鳴解析は、この相互作用が極めて低い親和性（Ｓｅｍａに対するＨＧＦ−βのものより約２倍低く、無傷な受容体に対するＨＧＦ−αのものより１００倍低い）を有することを明らかにした。この弱い相互作用はそれ自体でＨＧＦとＭｅｔの間の堅固な結合を説明できないので、Ｍｅｔ上の高い親和性ＨＧＦ結合部位はいまだ同定されていなかった。
【００２１】
本明細書で示される結果は、このギャップ（ｇａｐ）を埋めることに貢献し、この長い間探索されてきたＨＧＦ結合部位がＭｅｔのＩＰＴ領域、より正確には、細胞膜に近接する最後の２つの免疫グロブリン様ドメインに存在することを示唆する。第一に、４つのＩＰＴドメインのみを含む可溶性の欠失Ｍｅｔ受容体（ＩＰＴ）は、Ｍｅｔの全細胞外部分と実質的に同一の親和性を有するＨＧＦに結合する。逆に、Ｓｅｍａは、ＨＧＦに対して極めて低い親和性を示す。第二に、ＩＰＴは、変わらない強さで活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦまたはＨＧＦ−αに結合する。第三に、ＩＰＴ１およびＩＰＴ２の欠失は、ＨＧＦの形態のいずれに対するＩＰＴの親和性に影響しない。第四に、Ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩモジュールおよび第１の２つの免疫グロブリン様ドメインに相当する細胞外ドメインに大きな欠失を保有する改変Ｍｅｔ受容体（Ｍｅｔ△２５−７４１）は、活性ＨＧＦとプロ−ＨＧＦの間を区別できないが、ＨＧＦに結合し、細胞の内部へキナーゼ活性に対してシグナルを伝達する能力を保有する。最終的に、ＨＧＦ ＮＫ１の二量体形態は、ＨＧＦ−αの最小Ｍｅｔ結合ドメインを含むことが知られ、ＨＧＦより効率的ではないにしてもＭｅｔ△２５−７４１の活性を引き起こし、それによりＩＰＴ３−４のＨＧＦ ＮＫ１結合部位を同定することができる。
【００２２】
これらのデータがＨＧＦ結合におけるＩＰＴの重要な役割を指摘する一方で、Ｍｅｔの細胞外部分の２つの以前の構造／機能研究が、この領域のリガンド結合部位を同定することに失敗したことに注目すべきである。Ｍｅｔ細胞外ドメインのマップの第１の案は、ＥＬＩＳＡアッセイに基づくＨＧＦ結合にはＳｅｍａドメインが必要かつ十分であることを示唆した。第２の研究は、受容体二量体におけるＳｅｍａドメインの役割を解析し、Ｓｅｍａドメインの欠失を含むＭｅｔ細胞外部部分の改変された形態がＨＧＦを共沈殿できないことを示唆した。
【００２３】
本開示は、さらに、Ｍｅｔの細胞外部分がＨＧＦ誘導の侵襲性増殖を抑制する生物学的技術の道具として用いられる場合に、ＳｅｍａとＩＰＴの間の協調が観察されることを示す。インビトロ解析およびマウス移植実験において、ＩＰＴとＳｅｍａ−ＩＰＴ可溶性たんぱく質の両者が有意な抑制効果を示した。しかし、それらのいずれもが、低親和性と高親和性ＨＧＦ結合部位の両方を含む全Ｍｅｔ細胞外ドメインにより示される強力な抑制を達成することができなかった。このことは、これらの相互作用の両方がＭｅｔ活性の調節に貢献することを示唆する。ＨＧＦ−β−Ｓｅｍａの接触がすでに治療の標的として同定されてきた一方で、本明細書で示される結果は、薬理学的介入の機会を提供する第２の手段を明らかにする。組み換えたんぱく質または抗体は、真正なＨＧＦの代わりにＩＰＴ領域に結合し、ＨＧＦ／Ｍｅｔ依存性の癌治療のための、Ｍｅｔの高い競合抑制剤としての応用を示す。
【００２４】
材料と方法
たんぱく質の改変
本明細書に記載される可溶性または膜貫通型受容体および改変されたリガンドを、一般的なＰＣＲおよび遺伝学的改変技術により作成した。全ての因子は、Ｎ−末端にそれらの親たんぱく質のリーダー配列を保存する。可溶性Ｍｅｔたんぱく質のアミノ酸（ａａ）配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号Ｘ５４５５９）は、ａａ１−２４（シグナルペプチド）および：デコイＭｅｔ、ａａ２５−９３２；Ｓｅｍａ、ａａ２５−５１５；Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、ａａ２５−５６２；ＰＳＩＩＰＴ、ａａ５１６−９３２；ＩＰＴ、ａａ５６３−９３２；ＩＰＴ△１、ａａ６５７−９３２；ＩＰＴ△１−２、ａａ７４２−９３２；ＩＰＴ−３、ａａ７４２−８３８；ＩＰＴ−４、ａａ８３９−９３２に相当する。各分子のＣ−末端において、二重ＦＬＡＧ（ＳＤＹＫＤＤＤＤＫ−配列番号：１９）または単一ＭＹＣ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ−配列番号：２０）エピトープ配列およびポリ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ−配列番号：２１）をたんぱく質の検出および精製のために付加した。膜貫通型の改変Ｍｅｔ△２５−７４１は、欠失した領域（ａａ２５−７４１）を除いて野生型Ｍｅｔと同一である。改変されたＨＧＦたんぱく質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号Ｍ７３２３９）は、ａａ１−３１（シグナルペプチド）および：ＨＧＦ、ａａ３２−７２８；ＨＧＦ−α、ａａ３２−４７３；ＨＧＦ ＮＫ１、ａａ３２−２０５；ＨＧＦ−β、ａａ４９５−７２８に相当する。上記ＭＹＣまたはＦＬＡＧエピトープおよびポリ−ヒスチジンタグをＣ−末端に付加した。未切断ＨＧＦは以前に公表されている（Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432）。ＮＫ１−ＮＫ１は、タンデムに繰り返される同一のＮ−末端領域ＨＧＦからなるＨＧＦ ＮＫ１の二量体形態である（隙間なくａａ３２−２０５に直接連結させたａａ１−２０５）。全ての改変されたたんぱく質をコードするｃＤＮＡを、Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25(2), 217-222で開示されるようにｇｆｐ ｃＤＮＡの代わりにレンチウイルストランスファーベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅ（配列番号：１）にサブクローン化した。ＧＦＰをコードする配列を、以下のｃＤＮＡ：デコイｍｅｔ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：２）、Ｓｅｍａ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：３）、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号．：４）、ＰＳＩ−ＩＰＴ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：５）、ＩＰＴ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：６）、ＩＰＴ△１ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：７）、ＩＰＴ△１−２ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：８）、ＩＰＴ３ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：９）、ＩＰＴ４ ＦＬＡＧ．ｈｉｓ（配列番号：１０）、Ｍｅｔ△２５−７４１（配列番号：１１）、ＨＧＦ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１２）、ＨＧＦ−αＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１３）、ＨＧＦ−ＮＫ１ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１４）、ＨＧＦ−β ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１５）、未切断ＨＧＦ ＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１６）、ＮＫ１−ＮＫ１ ｈｉｓ（配列番号：１７）、アンジオスタチンＭＹＣ ｈｉｓ（配列番号：１８）に置き換えた。
【００２５】
酵素免疫吸着測定法
全ての改変された受容体と因子を、血清の非存在下で、レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−３４５ヒトメラノーマ細胞の条件培地から回収した。Michieli P. et al. (2002) Nat Biotechnol. 20(5), 488-495に記載されるごとく、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより因子の精製を行った。精製したプロ−ＨＧＦ（最大濃度１００ｎｇ／μｇ）を２−１０％ ＦＢＳ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）で３７℃において２４時間インキュベートすることにより、プロ−ＨＧＦの活性ＨＧＦへの変換を行った。因子の変換を、抗−ＨＧＦ抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。ＦＢＳとの同一のインキュベートにかけた未切断ＨＧＦを全ての測定中でプロ−ＨＧＦとして用いて、活性ＨＧＦを未処理ＨＧＦと比較した。改変リガンドの可溶性受容体への結合を、固相中のＦＬＡＧ−タグ可溶性受容体および液相中のＭＹＧ−タグ改変リガンドを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。固定濃度（１００ｎｇ／ウェル）の精製した可溶性受容体を９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。たんぱく質でコートしたプレートを改変リガンドの濃度の増加とともにインキュベートし、ビオチン化された抗−ＨＧＦ抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗−ＭＹＣ抗体（カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて結合を明らかにした。結合データをプリズムソフトウェア（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて解析し適合させた。
【００２６】
細胞培養
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞をジョージタウン大学のＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ワシントン、コロンビア特別区）から購入した。１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で細胞を維持した。ＴＯＶ−１１２Ｄヒト卵巣癌細胞をＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１７３１）から取得し、１５％ ＦＢＳを添加したＭＣＤＢ１０５培地と培地１９９（全てＳｉｇｍａ）の１：１の混合物を用いて培養した。Ａ５４９ヒト肺癌細胞もＡＴＣＣから取得し（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、１０％ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中で維持した。
【００２７】
レンチウイルスベクター
Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25 (2), 217-222に記載されるごとく、２９３Ｔ細胞の一過的なトランスフェクションによりベクターストックを生成した。簡単に説明すると、トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡミックスを以下のとおりに調製した：ＥＮＶプラスミド（ＶＳＶ−Ｇ）、９μｇ；ＰＡＣＫＡＧＩＮＧプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ １６．２μｇ；ＲＥＶプラスミド、６．２５μｇ；ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲ（プラスミド番号２−１８）、３７．５μｇ。プラスミドをＴＥ／ＣａＣｌ２溶液に希釈し、ＨＢＳ溶液を加えて最大速度でボルテックスを行った。ＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨＢＳミックスを即座に細胞プレートに滴下し、次いで３７℃でインキュベートした。１４−１６時間後、培養した培地を新しいものに交換した。ベクター粒子を含む細胞培養上澄み液を、培地を交換してから約３６時間後に回収した。回収後、上澄み液を０．２μｍの細孔膜に通してろ過し、−８０℃で保存した。ウイルスｐ２４の抗原濃度をＨＩＶ−１ ｐ２４ ｃｏｒｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（マサチューセッツ州、ボストンのＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により製造業者の説明書に従って調べた。Vigna, E. and Naldini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308-316に記載されるごとく、細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、４０ｎｇ／ｍｌのｐ２４を用いて６ウェルプレート（２ｍｌの培地中に１０５細胞／ウェル）中で形質導入させた。培地を、形質導入後約１８時間で交換した。細胞の増殖とたんぱく質の産生を経時的にモニターした。次に、形質導入した細胞株を１５ｃｍプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させ、無血清培地中でインキュベートした。７２時間後、組み換え可溶性たんぱく質を含む上澄み液を回収し、ろ過し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製するか、または−３０℃で保存した。
【００２８】
免疫沈殿とウェスタンブロット解析
Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、抽出緩衝液（ＥＢ）を用いて、細胞溶解、免疫沈殿およびウェスタンブロット解析を行った。ＥＣＬシステム（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って用い、シグナルを検出した。免疫沈殿用の抗−Ｍｅｔ抗体は、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270により記載され、ＵＢＩ（ニューヨーク州、プラシド湖）から購入された。ウェスタンブロット用の抗−Ｍｅｔ抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗−ＦＬＡＧ抗体をＳｉｇｍａから取得した。レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＭｅｔリン酸化解析を、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく行った。
【００２９】
ＨＧＦ架橋およびＭｅｔ活性解析
Ｍｅｔ△２５−７４１を発現する、レンチウイルスベクターを形質導入したＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を、ＥＣＬ（登録商標） Ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って用いて表面ビオチン化解析にかけた。Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432に記載されるごとく、化学的な架橋を行った。簡単に説明すると、細胞から３日間血清増殖因子を取り除き、次いで１ｎＭ ＨＧＦで３時間インキュベートした。細胞溶解物を、Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270に開示されるごとく、ＭｅｔのＣ末端の一部に対する抗体を用いて免疫沈殿し、３−１０％のポリアクリルアミド勾配を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、次いで抗−ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ）を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。受容体活性解析では、Ｍｅｔ△２５−７４１を発現するＴＯＶ−１１２Ｄ細胞から血清増殖因子を３日間取り除き、次に１ｎＭ ＨＧＦ、未切断ＨＧＦ、ＨＧＦ ＮＫ１またはＮＫ１−ＮＫ１で１０分間刺激した。Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57に記載されるごとく、細胞をＥＢを用いて溶解した。細胞たんぱく質を上述のごとく抗−Ｍｅｔ抗体で免疫沈殿し、抗−ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体と再結合させた（Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270）。
【００３０】
生物学的アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を用いたコラーゲン侵襲アッセイを、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとく前もって形成させた球状体を用いて行った。簡単に説明すると、細胞（７００細胞／ウェル）を、０．２４ｇ／ｍｌのメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）の存在下で非接着性９６−ウェルプレート（ドイツ、フリッケンハウゼンのＧｒｅｉｎｅｒ）中で一晩インキュベートすることにより球状体を作成した。球状体を、ラットの尻尾に由来する１．３ｍｇ／ｍｌ Ｉ型コラーゲンマトリックス（マサチューセッツ州、ベッドフォードのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０％ ＦＢＳを含むコラーゲンマトリックスに９６−ウェルプレート（４０球状体／ウェル）を用いて包埋した。包埋した球状体を３７℃で２４時間培養し、次いで、３０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ）または因子なしでさらに２４時間刺激した。各球状体から伸びる細管の数を顕微鏡を用いて評価した。１箇所の実験地点あたり少なくとも１２個の球状体を分析した。
【００３１】
腫瘍形成アッセイ
０．２ｍｌのＤＭＥＤ中のレンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞（３ｘ１０６細胞／マウス）を、Ｓｗｉｓｓ ＣＤ−１バックグラウンドの６週齢の免疫不全ｎｕ−／−雌マウス（イタリア、カルコのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後方の側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさを、ノギスを用いて２日ごとに測定した。腫瘍の体積を、式 Ｖ＝４／３πｘ２ｙ／２（式中、ｘは腫瘍の短径であり、ｙは腫瘍の長径である）を用いて算出した。注射した細胞により占められる最初の体積にほぼ相当する、１５ｍｍ３の腫瘤を腫瘍陽性の閾値として選別した。腫瘍がこの閾値より低いマウスを腫瘍なしと見なした。約４週間後、マウスに麻酔をかけ、解析のために腫瘍を抽出した。動物を死体解剖した。腫瘍と肺をパラフィンで包埋し、組織学的解析用に処理した。ヘマトキシリンとエオシンで染色した連続的な肺の切片において顕微鏡により微少転移解析を行った。腫瘍切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、サンプルの同定を知らされていない各々の病理学者が分析した。導入遺伝子の発現を、抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫組織化学により腫瘍切片上で調べた。切片をメイヤーヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。腫瘍の血管形成を抗−フォンヴィレブランド因子抗体（デンマーク、グロストラップのＤＡＫＯ）を用いて免疫組織化学により分析した。切片を上述のごとく対比染色した。血管密度を顕微鏡により測定した。１匹の動物あたり少なくとも１２領域を解析した。全ての動物実験の手順は、イタリアのトリノ大学およびイタリア保健省により承認された。
【００３２】
統計的解析
統計的有意性を、両側等分散性スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ）ｔ−検定（アレイ１、コントロール群；アレイ２、実験群）を用いて調べた。解析した全てのデータについて、ｐ＜０．０５を有意な閾値と想定した。全ての図において、値を平均±標準偏差として表し、統計的有意性を１個（ｐ＜０．０５）または２個（ｐ＜０．０１）の星により示す。
【００３３】
結果
ＨＧＦ／Ｍｅｔ機能ドメインの改変
ＭｅｔとＨＧＦに含まれる機能ドメインの模式図を図１Ａに表す。Ｍｅｔの細胞外部分は、Ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩヒンジ、および４つのＩＰＴモジュール（左図）を含む。ＨＧＦは、成熟たんぱく質においてジスルフィド結合により連結されたα−およびβ−鎖からなる。次に、α−鎖は、Ｎ末端ドメインと４つのクリングルを含む（右図）。ＭｅｔとＨＧＦ間の相互作用を解析するため、本発明者らは、全てのこれらの機能ドメインを、各々、可溶性たんぱく質として発現させた。それらが適切に分泌できるように、機能ドメインを、Ｎ末端で親たんぱく質のシグナルペプチドを含むように改変した。Ｃ末端には、抗体認識用に外因性エピトープ（ＦＬＡＧまたはＭＹＣ）およびたんぱく質精製用にポリヒスチジンタグを付加した。全ての改変された因子をコードするｃＤＮＡを、レンチウイルスベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．Ｗｐｒｅにサブクローン化し、組み換えレンチウイルス粒子を材料と方法に記載されるごとく産生した。組み換えたんぱく質をレンチウイルスベクター形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞の条件培養から回収し、アフィニティークロマトグラフィーにより均一になるまで精製した。精製したたんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる標準物質に対して定量化した（図１Ｂ）。
【００３４】
Ｍｅｔ−ＨＧＦ相互作用のＥＬＩＳＡ解析
ＨＧＦと相互作用するＭｅｔ細胞外ドメインの能力をＥＬＩＳＡ結合アッセイでテストした。可溶性受容体（デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、Ｓｅｍａ、ＰＳＩ−ＩＰＴ、ＩＰＴ）を固相に固定し、上昇濃度の活性ＨＧＦに晒した。ビオチン化抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明らかにした。可溶性Ｍｅｔドメインの代わりに固相中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて非特異的ＨＧＦ結合を調べた。材料と方法に記載されるごとく非線形回帰分析により結合親和性を調べた。これらの条件において、デコイＭｅｔはＨＧＦに約０．２−０．３ｎＭのＫＤで結合した。以前の測定と一致して、Ｓｅｍａ−ＰＳＩとＳｅｍａは、デコイＭｅｔと比較して少なくとも１ｌｏｇ低い親和性でＨＧＦに結合した。驚くべきことに、ＰＳＩ−ＩＰＴとＩＰＴの両方は、デコイＭｅｔとほぼ同一の親和性をもって極めて効果的にＨＧＦに結合した（図２Ａ）。ＰＳＩドメインの有無は、ＳｅｍａまたはＩＰＴのいずれもＨＧＦに対する結合親和性に影響しない。それゆえ、今まで天然に見出されるほぼ全てのＳｅｍａドメインがＣ末端でＰＳＩモジュールを有することから、本発明者らは、デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、およびＩＰＴを用いて結合解析を続けた。
【００３５】
プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−α、ＨＧＦ ＮＫ１およびＨＧＦ−βに対する各Ｍｅｔモジュールの親和性を調べ、それを活性ＨＧＦに対するものと比較するため、改変された受容体を固相に固定し、上昇濃度のＭＹＣ−タグリガンドに晒した。抗−ＭＹＣ抗体を用いて結合を明らかにした。液相中でクリングル含有たんぱく質アンジオスタチン（ＡＳ）−ＭＹＣエピトープでもタグを付けた−を用いて非特異的結合を調べた。プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ α−鎖およびＨＧＦ ＮＫ１は、ＨＧＦ α−鎖の最小Ｍｅｔ結合モジュールを表し、活性ＨＧＦと比較してそれぞれ３−、４−および１０−倍低い親和性でデコイＭｅｔに結合した（図２Ｂ）。ＨＧＦ−βのデコイＭｅｔ（またはいずれか他のＭｅｔドメイン）への結合は極めて低いため、この種のアッセイで検出できなかった。Ｓｅｍａ−ＰＳＩが顕著な親和性で活性ＨＧＦへ結合したのみで、他方、プロ−ＨＧＦ、ＨＧＦ−αまたはＨＧＦ ＮＫ１への結合は非特異的結合と区別できなかった（図２Ｃ）。対照的に、ＩＰＴは、活性ＨＧＦ、プロ−ＨＧＦおよびＨＧＦ−αに同一の高い親和性で結合した（図２Ｄ）。ＨＧＦ ＮＫ１は、ＩＰＴに活性ＨＧＦより１０倍低く、すなわち、デコイＭｅｔへ結合したものと同一の親和性で結合した。これらのデータは、ＭｅｔのＩＰＴ領域が、リガンドのたんぱく質分解処理とは無関係にＨＧＦのα−鎖に高い親和性で結合することを示唆する。
【００３６】
ＨＧＦのα−鎖はＩＰＴドメイン３と４に高い親和性で結合する
ＭｅｔのＩＰＴ領域は、約４００個のアミノ酸まで伸長し、４つのＩＰＴドメインを含む。ＩＰＴ−ＨＧＦ接触面をより細かく位置付けするため、１つまたはそれ以上のドメインを欠失させた一連のＩＰＴ変異体を設計した（図３Ａ）。ＩＰＴ△１とＩＰＴ△１−２は、第１または第１の２つの免疫グロブリン様ドメインをそれぞれ欠失する、２つのＩＰＴのＮ末端欠失形態である。ＩＰＴ−３とＩＰＴ−４は、単一のたんぱく質として表される２つのＣ末端免疫グロブリン様ドメインに相当する。たんぱく質の産生と精製を上述のごとく行った。ＨＧＦのα−鎖と相互作用する改変ＩＰＴの能力を、コントロールとして全ＩＰＴ領域を用いてＥＬＩＳＡ結合アッセイで調べた。ＩＰＴ、ＩＰＴ△１、ＩＰＴ△１−２、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４を固相に固定し、上昇濃度のＨＧＦ−αに晒した。抗−ＨＧＦ抗体を用いて結合を明らかにした。非特異的結合を上述のごとくＢＳＡを用いて測定した。図３Ｂに示されるように、第１の２つの免疫グロブリン様ドメインの欠失は、実質的にＨＧＦ結合に影響しなかった。
【００３７】
実際に、ＩＰＴ△１−２は、Ｍｅｔの最後の２つの免疫グロブリン様ドメインに相当するたんぱく質であり、ＨＧＦのα−鎖に、ＩＰＴより高いとはいかないまでも同等の強さで結合した。しかしながら、第３または第４の免疫グロブリン様ドメインのさらなる欠失は、ほぼ完全にＨＧＦ−α結合を妨げた。同様の結果をＨＧＦ−αの代わりに活性ＨＧＦまたはプロ−ＨＧＦを用いて得た。これらのデータは、Ｍｅｔの最後の２つの免疫グロブリン様ドメインが、真性Ｍｅｔとの関連で膜貫通へリックスに近接して存在し、ＨＧＦのα−鎖に高い親和性で結合するのに十分であることを示唆する。
【００３８】
ＩＰＴドメイン３と４は、生存細胞でＨＧＦに結合するのに十分である。
ＨＧＦが膜アンカー受容体との関連でＩＰＴ３と４に結合できるかどうかを調べるために、細胞外領域に大きな欠失を保有するＭｅｔたんぱく質を設計した。Ｓｅｍａドメイン（ａａ２５−５１５）、ＰＳＩドメイン（ａａ５１６−５６２）および第１の２つのＩＰＴドメイン（ＩＰＴ１と２、ａａ５６３−７４１）に相当する、アミノ酸２５−７４１を欠失させ、ＩＰＴ３と４、膜貫通へリックスおよび全細胞質領域を含む組み換え受容体を作成した（図４Ａ）。改変された受容体Ｍｅｔ△２５−７４１をコードするｃＤＮＡを、上述のごとく同一のレンチウイルスベクターにサブクローン化した。組み換えレンチウイルス粒子を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べられるごとく、内在性Ｍｅｔ発現を欠失するヒト卵巣癌細胞株ＴＯＶ−１１２Ｄを形質導入するのに用いた（Michieli, P., et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73）。表面ビオチン化解析は、Ｍｅｔ△２５−７４１がＴＯＶ−１１２Ｄ細胞の膜上に適切に発現され、曝露されることを明らかにした（図４Ｂ）。
【００３９】
Ｍｅｔ△２５−７４１がＨＧＦに結合できるかどうかを調べるために、レンチウイルスベクターを形質導入した細胞を、組み換えＨＧＦの存在下または非存在下でインキュベートし、その後、それらを架橋剤ＢＳ３で処理した。細胞溶解物をＭｅｔのＣ末端部分に対する抗体で免疫沈殿し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析し、抗−ＨＧＦでビオチン化した抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。コントロールとして、野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞について同一の解析を行った。免疫ブロットは、ＨＧＦで処理したＭｅｔ△２５−７４１を発現する細胞に相当するレーンにおいて約１８０ｋＤ分子量の異なるバンドを示すが、リガンドの存在または非存在のいずれにおいても、ＨＧＦなしの同一細胞または野生型ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞に相当するレーンでは該バンドを示さなかった（図４Ｃ）。Ｍｅｔ△２５−７４１とＨＧＦの両方が約９０ｋＤａの分子量を有することを考慮すると、免疫沈殿された架橋たんぱく質は、ＨＧＦとＭｅｔ△２５−７４１により形成された複合体と一致する。
【００４０】
ＩＰＴドメイン３および４へのＨＧＦの結合は生存細胞でＭｅｔ活性を生じる。
次に、本発明者らは、Ｍｅｔ△２５−７４１へのＨＧＦ結合がＭｅｔキナーゼ活性を誘導できるかどうかをテストした。この目的を達成するため、レンチウイルスベクターを形質導入したＴＯＶ−１１２Ｄ細胞をプロ−ＨＧＦまたは活性ＨＧＦで刺激し、細胞溶解物を上述のごとき抗−Ｍｅｔ抗体で免疫沈殿した。受容体活性を、抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロット解析により調べた。同一のブロット物を抗−Ｍｅｔ抗体で再結合させて免疫沈殿した受容体の量を標準化した。特に、プロ−ＨＧＦと活性ＨＧＦの両方はＭｅｔ△２５−７４１の強いリン酸化を誘導することができた（図４Ｄ）。プロ−ＨＧＦの全長Ｍｅｔへの結合がキナーゼ活性を誘導せず、このことは、Ｓｅｍａドメインが何らかの形で活性ＨＧＦ受容体への結合に依存して遊離されるＭｅｔ触媒活性上の自己抑制効果を及ぼすことを示唆する。受容体刺激をまた、ＨＧＦ ＮＫ１およびタンデムに繰り返される２つのＮＫ１フラグメントからなる改変二量体リガンド（ＮＫ１−ＮＫ１；図４Ｅ）を用いて行った。図４Ｄに示されるように、レンチウイルスベクター形質導入ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞のＮＫ１−ＮＫ１刺激がＭｅｔ△２５−７４１の強力なリン酸化を生じる一方、単量体ＮＫ１による刺激は効果を示さなかった。これらの結果は、Ｍｅｔの２つのＣ末端ＩＰＴドメイン（ＩＰＴ３および４）が、ＨＧＦ（より正確には、ＨＧＦのα−鎖における最小Ｍｅｔ結合モジュールを表すＨＧＦ ＮＫ１）に結合し、細胞質キナーゼドメイン、推定上、以後のリガンド誘導受容体二量体への受容体活性のシグナルを伝達するのに十分であることを示唆する。しかしながら、それらはまた、ＩＰＴ３とＩＰＴ４単独では、ＨＧＦの生物学的に活性な形態を不活性な前駆体、プロＨＧＦと区別するのに十分でないことを示唆する。
【００４１】
可溶性ＩＰＴは、インビトロでＨＧＦ誘導性侵襲増殖を抑制する。
以前の研究において、可溶性たんぱく質（デコイＭｅｔ）として発現されたＭｅｔの細胞外部分が、インビトロおよび癌のマウスモデルでＨＧＦ誘導性侵襲増殖を抑制することが示された（Michieli P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73）。組み換え可溶性Ｓｅｍａ−ＰＳＩもまた、リガンド−依存性および−非依存性Ｍｅｔリン酸化の両方を抑制することが示された（Kong-Beltran M. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 75-84）。これらの結果に基づいて、可溶性ＩＰＴが生存細胞でＨＧＦ／Ｍｅｔ拮抗性活性を示すかどうかをテストした。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ細胞は、Ｍｅｔを発現し、ＨＧＦ介在侵襲性増殖の解析用に樹立されたモデル系であり、これを可溶性デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩまたはＩＰＴをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。空ベクターで形質導入した細胞をコントロールとして用いた。比較レベルの可溶性因子（約５０ｐｍｏｌ／１０６細胞／２４時間）を分泌するレンチウイルスベクター形質導入細胞を、数日間血清飢餓とし、組み換え因子を培地中に蓄積させ、次いで組み換えＨＧＦで刺激した。Ｍｅｔチロシンリン酸化を、上述のごとき抗−ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロッティングにより調べた。図５Ａに示されるように、ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩの両方がＨＧＦ誘導Ｍｅｔリン酸化を部分的に抑制したが、一方で、デコイＭｅｔは、Ｍｅｔ活性を誘導するＨＧＦの能力を完全に中和した。ＭｅｔのＣ末端に対する抗体を用いた同一の免疫ブロット物の再結合は、免疫沈殿させたたんぱく質の量に実質的な相違がないことを明らかにした。
【００４２】
より生物学的な状況におけるＭｅｔ細胞外ドメインの抑制能力をテストするために、同一の細胞を用いてＨＧＦ依存性の分岐形態形成アッセイを行った。前もって形成された細胞の球状体を三次元コラーゲンマトリックスに播種し、次いで、組み換えＨＧＦで刺激して管状構造を形成させた。各コロニーから生じる細管の平均数をスコア化することにより分岐を定量化した。図５Ｂで示されるように、可溶性ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩの両方は、ＨＧＦ誘導性コロニー分岐を抑制した（空ベクター、１７．５個の細管／コロニー；ＩＰＴ、４．０個の細管／コロニー；Ｓｅｍａ−ＰＳＩ、６．７個の細管／コロニー）。しかしながら、リン酸化実験で得られた結果と一致して、デコイＭｅｔは、そのサブドメインのいずれよりも強力なＨＧＦ−阻害剤であった（２．５個の細管／コロニー）。コロニー形態の代表的な図を図５Ｃに示す。
【００４３】
可溶性ＩＰＴはマウスにおける抗腫瘍および抗転移活性を示す。
上記の結果は、本発明者らに癌のマウスモデルにおける可溶性ＩＰＴの治療能力を探索することを想起させた。レンチウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５メラノーマ細胞を、ＣＤ−１ ｎｕ−／−マウスに皮下注射し、腫瘍増殖を経時的にモニターした。約３週間後、解析のために腫瘍を抽出し、マウスを死体解剖にかけた。カプラン−マイヤー類似解析において、腫瘍非存在の動物のパーセンテージを時間に対してプロットし、腫瘍潜伏を平均日数を算出して定量化する場合、全ての改変可溶性受容体が実験上の腫瘍の出現を遅らせた。しかしながら、ＩＰＴはＳｅｍａ−ＰＳＩよりわずかに効率的であり、デコイＭｅｔはＩＰＴまたはＳｅｍａ−ＰＳＩのいずれよりも強力であった（図６Ａ）。経時的な腫瘍組織量解析は、ＩＰＴがデコイＭｅｔよりわずかに効率的である一方、Ｓｅｍａ−ＰＳＩが実験の極めて早い期間のみに腫瘍増殖を抑制することを明らかにした（図６Ｂ）。導入遺伝子発現の免疫組織化学解析は、デコイＭｅｔ、Ｓｅｍａ−ＰＳＩおよびＩＰＴが腫瘍における同様のレベルと分布となることを示した（図６Ｃ）。
【００４４】
ＨＧＦが強力なプロ−血管形成因子であることから、腫瘍におけるＨＧＦ／Ｍｅｔの抑制が血管形成の障害を生じるかどうかを調べた。腫瘍切片を、フォンヴィレブランド因子に対する抗体を用いて免疫組織化学により解析し、血管密度を顕微鏡により測定した（図６Ｄ）。ＩＰＴが腫瘍血管密度を１．５倍まで減少させる一方、デコイＭｅｔはさらにより強い抑制を達成した（約４倍）；Ｓｅｍａ−ＰＳＩは腫瘍血管形成にあまり影響しなかった。死体解剖により、上述のマウスから肺を抽出し、組織学用に処理した。連続的な肺の切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡により解析することにより微少転移の存在を調べた。結果を図６Ａに示す。コントロール群では、６匹中４匹のマウス（６７％）が微少転移を生じていた。ＩＰＴとＳｅｍａ−ＰＳＩ群においては、微少転移は、６匹中１匹のみのマウス（１７％）にしか見出されなかったが、デコイＭｅｔ群では転移を見出すことができなかった。転移病巣は、実質性（血管外）と塞栓性（血管内；代表的な図として図６Ｆを参照）の両方であった。
【００４５】
本開示で提供されるＨＧＦ上の高親和性ＨＧＦ結合部位の同定は、ＨＧＦおよびＨＧＦＲのより特異的な阻害剤／拮抗剤の作成を導く新しい手法の設計を可能にする。以下は、ＨＧＦＲの高親和性結合部位を標的とするか、または新しい阻害剤／拮抗剤を作成する道具としてＨＧＦＲの高親和性部位を利用する、ＨＧＦ／ＨＧＦＲの高親和性／拮抗剤の同定のための新しい方法の非限定的な例である。
【００４６】
ＨＧＦ結合を抑制するＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合するモノクローナル抗体の開発
ＨＧＦと細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインとの相互作用が高親和性ＨＧＦ結合に不可欠である場合、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合し、ＨＧＦＲ結合に関してＨＧＦと競合する特異的なモノクローナル抗体を作成することができる。このことはいくつかの方策により行うことができる。
【００４７】
（Ａ）ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４から生じる組み換えたんぱく質またはペプチドは、一般的な遺伝子改変技術または化学合成により作成される。このたんぱく質またはペプチドは、適当な実験動物（一般的にはマウスまたはラット）に注入されて免疫応答を生じさせる。次いで、脾細胞は、免疫された動物から単離され、骨髄腫細胞株に融合され、抗体産生ハイブリドーマクローンが一般的なモノクローナル抗体技術により選択される。次に、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、固相中の組み換えＩＰＴ−３とＩＰＴ−４および液相中のハイブリドーマ産生抗体を利用する、本開示に記載されるものと同様のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングされる。市販されている抗−マウス免疫グロブリン抗体を用いて結合が明らかにされる。代替的に、抗体は、（液相中の）組み換えＨＧＦを（固相中の）ＩＰＴ−３とＩＰＴ４から置換するそれらの能力、または組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質を免疫沈殿するそれらの能力についてスクリーニングされる。
【００４８】
（Ｂ）適切な発現ベクターに挿入されたＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４をコードするポリヌクレオチド配列が実験動物に直接注入されて遺伝子産物に対する免疫応答が生じる。次いで、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、上述のごとく単離され、スクリーニングされる。
【００４９】
（Ｃ）適切な発現ベクターに挿入されたＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４をコードするポリヌクレオチド配列がＨＧＦＲを発現しない哺乳動物細胞株に移入されて細胞表面上のＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４の発現が得られる。次いで、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４を発現する細胞が実験動物に注入されて免疫応答が生じ、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体は、上述のごとく単離され、スクリーニングされる。
【００５０】
（Ｄ）哺乳動物リンパ球に由来する（好ましくは、ヒトであって、例えば、ＨＧＦＲを発現する腫瘍を侵襲するリンパ球に由来する）一般的な遺伝子改変技術（例えば、ファージディスプレイ）により作成された固有（ｎａｔｉｖｅ）の抗体ライブラリーは、組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質を用いてスクリーニングされる。次に、陽性クローン（すなわち、高親和性でＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合するクローン）が単離され、増殖され、抗体が生化学的に特徴付けされる。
【００５１】
（Ｅ）ヒト記憶Ｂ細胞は、Traggiai E. et al. (2004) Nat Med. 10(8), 871-875を含むいくつかの研究により開示されるごとく、ＨＧＦＲを発現する腫瘍を保有する患者の末梢血から単離される。不死化記憶Ｂ細胞の培養が樹立されると、当業者は、上記（Ａ）に記載される方法を用いて、ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に対する抗体を分泌する細胞をスクリーニングすることができる。かかる抗体産生細胞を同定した後、望ましい抗体がポリメラーゼ連鎖反応および一般的な遺伝子改変方法によりクローン化されうる。
【００５２】
ＨＧＦＲ活性を抑制するＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合するテスト化合物の同定
異なる方法を用いて、ＨＧＦＲの高親和性ＨＧＦ結合部位に結合し、ＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制する、多様な起源のテスト化合物を単離することが可能である。このことはいくつかの方策により行うことができる。
【００５３】
（Ａ）本開示に記載されるものと同様のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、当業者は、ＨＧＦとＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換する薬剤について、（合成化学物質ライブラー、天然化合物ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブリーを含むが、これらだけに限定されない）化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。この種のアッセイにおいて、組み換えＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４たんぱく質は、固相で不死化され、液相で一定量のＨＧＦとインキュベートされる。ライブリー化合物への曝露後、ＨＧＦ結合は市販されている抗−ＨＧＦ抗体を用いて測定される。
【００５４】
（Ｂ）本開示に記載されるもの（Ｍｅｔ△２５−７４１）と同様の細胞外部分におけるＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４のみを含むＨＧＦＲの改変された形態を発現する細胞株を用いて、当業者は、ＨＧＦのＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換するか、またはＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制する薬剤について、（合成化学物質ライブラー、天然化合物ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブリーを含むが、これらだけに限定されない）化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。このことは、前記改変された細胞をライブラリーと接触させ、次いで、本研究に記載されるごとく、あるいは分散アッセイ（Ｓｃａｔｔｅｒ ａｓｓａｙ）、再構成基質侵襲アッセイ、分岐形態形成アッセイ、細胞生存アッセイまたはMichieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73に記載されるごとくその他のインビトロ生物学的試験を含む、ＨＧＦＲ活性を明確にするその他の手法により、ＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲリン酸化を測定することにより行うことができる。
【００５５】
上述のごとく改変された細胞株を用いて、当業者は、ＨＧＦのＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４との相互作用を置換するか、またはＨＧＦ誘導性ＨＧＦＲ活性を抑制するポリヌクレオチドまたは遺伝子産物について、（ｃＤＮＡ発現ライブラリー、低分子ヘアピンＲＮＡライブラリー、アンチセンスＤＮＡライブラリー、ランダムヌクレオチドライブラリーを含むが、これらだけに限定されない）遺伝学的ライブラリーをスクリーニングすることができる。このことは、トランスフェクト、形質導入またはヌクレオチドライブラリーを前記細胞に導入するいずれかの方法、次いで、同一細胞により発現されたＨＧＦＲの欠失形態を活性化するＨＧＦの能力をテストすることにより行うことができる。ＨＧＦＲ活性は、（Ｂ）に記載されるごとく測定される。
【００５６】
ＨＧＦＲの細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインに結合する化合物の生物学的活性を測定する典型的な機能アッセイ
抗−ＩＰＴ抗体またはＩＰＴ−結合化合物を作成するいかなる方策が用いられる場合であっても、最終産物（すなわち、ＩＰＴ−３またはＩＰＴ−４に対するモノクローナル抗体、あるいはＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４に結合する天然または合成化合物）は、これらの薬剤がＨＧＦＲ活性を抑制する能力を有するかどうかを調べることを目的とした生物学的アッセイにかけられる。これらのアッセイは、培養した哺乳類動物の細胞を用いてインビトロで、または実験動物を用いてインビボで行うことができる。
【００５７】
（Ａ）分散アッセイ。ペトリ皿中において密集コロニーで増殖し、ＨＧＦＲを発現する上皮細胞は、ＨＧＦを用いる刺激により「分散」を誘導される。ＨＧＦ刺激の結果として、ペトリ皿中の細胞は、より分離し、分散した状態を表す。このアッセイは、数種類のテスト化合物の存在下で行われうる。テストされる化合物間において、ＨＧＦ刺激に反応して分散される表現型の非存在により、ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤／拮抗剤が同定されうる。
【００５８】
（Ｂ）細胞移動アッセイ。ＨＧＦＲを発現する細胞は、ＨＧＦ濃度勾配に沿って移動する能力を有する。言い換えると、細胞は、ＨＧＦのより高濃度に向かう走化作用により誘引される。この能力は、ボーデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイにおけるＨＧＦ阻害剤のスクリーニングに用いることができる。細胞が第１のチャンバーに播種され、多孔性膜により第１のチャンバーから分離される第２のチャンバーにＨＧＦがアプライされる。細胞は、膜を通過して移動し、ＨＧＦがより濃縮される第２のチャンバーに到達する。この工程を抑制する薬剤が、ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤／拮抗剤として同定される。
【００５９】
（Ｃ）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）移動アッセイまたは再構成基質侵襲アッセイ。これは、多孔性膜がコラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、またはその他の再構成有機マトリックスの膜で覆われる（Ｂ）に記載されるアッセイの変形である。細胞は、有機マトリックスを通って移動するため、有機マトリックスを消化しなくてはならない。これは、細胞の単純な移動よりむしろ侵襲を測定する、より厳密なアッセイである。
【００６０】
（Ｄ）コラーゲン侵襲アッセイまたは分岐形態形成アッセイ。このアッセイでは、ＨＧＦＲを発現する哺乳類動物細胞（好ましくは、上皮細胞または癌細胞）は、コラーゲンの三次元層中に播種され、次いで、それらが各々約１０００個の細胞の球状体を形成するまで増殖される。代替的に、球状体は、Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73で開示されるごとくメチルセルロースの存在下で非接着性９６ウェルプレートにて一晩細胞をインキュベートすることにより前もって前形成されうる。球状体がコラーゲン層に包埋されると、それらはＨＧＦで刺激され、３７℃でインキュベートされる。これにより、球状体から中が空洞の細管を生じる；各細管は、管状構造で組織される数種類の細胞により形成され、内腔が見える一方の細胞側と培地の外側に見える第２の側が存在するように極性化される。アッセイが細管を生じるとともに、分岐し、より複雑な構造を形成するようになる。このアッセイは、ＨＧＦに極めて特異的である。この工程を抑制する薬剤は、極めて特異的なＨＧＦ／ＨＧＦＲ拮抗剤を示す高い可能性を有する。
【００６１】
（Ｅ）細胞分裂アッセイ。ＨＧＦは、ＨＧＦＲを発現するいずれかの細胞でＤＮＡ複製と細胞分裂を誘導する能力を有する。最も反応性の高い細胞は、一定の初代肝細胞、通常、マウスまたはラットである。ＨＧＦ誘導性ＤＮＡ複製をテストするために、細胞は血管増殖因子から生じ、次いで上昇濃度のＨＧＦで刺激される。即座に、放射活性チミジンが添加され、細胞は３７℃で約１日インキュベートされる。強い洗浄と固定後、細胞のＤＮＡに取り込まれた放射活性チミジンは、液体シンチレーション計測または放射性の定量化を可能にするその他の一般的な方法により測定される。
【００６２】
（Ｆ）生存アッセイ。ＨＧＦは、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死からＨＧＦＲを発現する細胞を保護する能力を有する。このことは、生存アッセイでＨＧＦＲ活性を測定するのに用いられうる。細胞は、ＨＧＦおよびテスト化合物（潜在的なＨＧＦＲ阻害剤）で前インキュベートされ、次いで、毒性薬物、接着の非存在、低酸素、熱ショック、放射能、またはＤＮＡ傷害のごときアポトーシス刺激にかけられる。適当な時間経過後、細胞死は、ＴＵＮＥＬ（ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ ビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識）、ヌクレオソーム、ＤＮＡラダー、カスパーゼ活性、生体染色色素、またはこれらのいずれかの変形を含む一般的な方法により測定される。
【００６３】
（Ｇ）マウス腫瘍形成アッセイ。この種のアッセイにおいて、潜在的なＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤の活性は、実験動物、好ましくはマウスまたはラットにおいて直接テストされる。マウスにおいて腫瘍を得るいくつかの方法が存在する。最も利用される方策は、移植片を作り出すこと、すなわち、腫瘍細胞（通常、ヒト起源）を動物レシピエント（通常、免疫不全マウス）に移植することである。細胞は、皮下（実験上の腫瘍を得るのに迅速かつ単純な方法）または同所、すなわち、腫瘍細胞が単離された場所と同一の器官（例えば、乳癌を哺乳動物の脂肪体へ、大腸癌を腸粘膜へ、肝細胞癌を肝臓実質へなど）に移植されうる。用いられる細胞がいかなるものであっても、腫瘍細胞の実験動物への注入は、実験上の腫瘍を生じる。この腫瘍を生じる動物は、現在、テスト化合物の抗腫瘍能力を評価するのに用いられうる。抗−ＨＧＦ／ＨＧＦＲ抗体または化合物は、静脈注射、腹腔内注射、浸透圧ポンプ、経口投与、座剤、遺伝子治療プロトコル、局所投与などを含む最も適当な既存の方法により、調節不良のＨＧＦ／ＨＧＦＲシグナル伝達を伴う腫瘍病巣を保有する動物に送達されうる。適当な処置期間後、動物は安楽死させられ、その腫瘍と器官が解析のために取り出される。
【００６４】
（Ｈ）マウス転移形成アッセイ。実験上の転移は、腫瘍細胞の全身注射によりマウスで誘導されうる。これらは、肺の毛細血管で捕捉されるようになり、次いで溶出して肺転移を生じる。これらは、顕微鏡、組織学的解析、免疫組織化学的方法、全身イメージングを含む、いくつかのアプローチにより死体解剖時に測定されうる。テスト化合物は、（Ｇ）に記載されるごとく送達される。
【００６５】
（Ｉ）遺伝子治療プロトコル。ＨＧＦ／ＨＧＦＲ阻害剤が、抗体、組み換えたんぱく質、ペプチドまたは低分子干渉ＲＮＡである場合、腫瘍を生じる動物への送達は、遺伝子治療法により行うことができる。このことは、所望のポリヌクレオチドを、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ネイクド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、またはこれらの変形型から選択することができる適当な送達ベクターに導入することにある。ベクター調製物は、腫瘍部位、ベクターまたは腫瘍組織型に応じて腫瘍に全身的または局所的に送達されうる。遺伝子治療の生物学的な効果は、（Ｇ）にてその他の化合物について記載されるごとく解析される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチドの使用。
【請求項３】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および／または発現を阻害する、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および／または発現を下方調節する、請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の阻害剤および／または拮抗剤である、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンスヌクレオチド、ＲＮＡを基にした阻害剤、ｓｉＲＮＡ、抗体、ペプチド、ドミナントネガティブ因子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
癌が、肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
癌、好ましくは肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌の治療に有用な肝細胞増殖因子受容体の拮抗剤／阻害剤として作用するテスト薬剤の能力を検出する方法であって、
（ａ）テスト薬剤を、ｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチド、またはｉｉｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、
（ｂ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を測定し、次いで
（ｃ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を減少させる薬剤を選別する：
工程を含む方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）の測定が、細胞シグナル伝達、細胞生存、および細胞増殖を測定することを含む、請求項８から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
癌を治療する医薬としての使用のための肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメイン。
【請求項１１】
癌を治療するための医薬としての使用のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１】
癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
癌の治療に有用な薬理学的な活性を有する薬剤のスクリーニングおよび／または開発のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチドの使用。
【請求項３】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および／または発現を阻害する、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の触媒活性、機能、安定性および／または発現を下方調節する、請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、肝細胞増殖因子受容体の阻害剤および／または拮抗剤である、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記薬理学的な活性を有する薬剤が、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンスヌクレオチド、ＲＮＡを基にした阻害剤、ｓｉＲＮＡ、抗体、ペプチド、ドミナントネガティブ因子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
癌が、肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
癌、好ましくは肝細胞増殖因子受容体活性の調節不良を伴う癌の治療に有用な肝細胞増殖因子受容体の拮抗剤／阻害剤として作用するテスト薬剤の能力を検出する方法であって、
（ａ）テスト薬剤を、ｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを含むポリペプチド、またはｉｉｉ）少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインを発現する細胞と接触させ、
（ｂ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を測定し、次いで
（ｃ）肝細胞増殖因子受容体の活性、機能、安定性および／または発現を減少させる薬剤を選別する：
工程を含む方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）の測定が、細胞シグナル伝達、細胞生存、および細胞増殖を測定することを含む、請求項８から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
癌を治療する医薬としての使用のための肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメイン。
【請求項１１】
癌を治療するための医薬としての使用のための、少なくとも肝細胞増殖因子受容体の細胞外ＩＰＴ−３およびＩＰＴ−４ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２９１１９１（Ｐ２００９−２９１１９１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１１７７２５（Ｐ２００９−１１７７２５）
【出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８２３８３３６）メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＴＨＥＲＥＳＩＳ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１７７２５（Ｐ２００９−１１７７２５）
【出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８２３８３３６）メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＴＨＥＲＥＳＩＳ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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