ＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル
【課題】ＨＬＡ−Ｂ抗原のサブタイプのひとつであるＢ４８に含まれる新規アリルの提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８アリル。その相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８アリル。該アリルでコードされるペプチドを有するタンパク。遺伝子型の判定の際に、該特定のアミノ酸配列、もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする、ＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法。
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８アリル。その相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８アリル。該アリルでコードされるペプチドを有するタンパク。遺伝子型の判定の際に、該特定のアミノ酸配列、もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする、ＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下ＨＬＡと略す）の新規アリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡ型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｂ抗原のサブタイプのひとつであるＢ４８に含まれる遺伝子型は２００７年１月１２日の時点で、１７種類が報告されている（例えば、非特許文献４参照）が、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成１9年1月19日検索]、インターネット＜URL：http://www.allelefrequencies.net＞
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ｂ抗原のサブタイプのひとつであるＢ４８に含まれる新規アリルを提供することにある。
【０００８】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ｂ遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、既知のアリルとは異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８新規アリルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８新規アリルを提供するものである。
【００１１】
本発明により、ＨＬＡ−Ｂ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の ｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）でＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出した２種類のＤＮＡ検体で既知の遺伝子型とは異なることが判明した。
【００１３】
ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりエクソン２およびエクソン３の配列を確認した。エクソン２およびエクソン３のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、エクソン２はＢ＊５２０１とＢ＊４８０１の配列であるが、エクソン３はＢ＊５２０１の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。よって、この検体がＢ＊５２０１と未知のアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００１４】
配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１Ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ｂ抗原のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１Ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、得られた１２クローンのプラスミドについて配列を確認した。
【００１５】
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５２０１が４クローン、ダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列を有する変異型が４クローン得られた。また、ＰＣＲ反応によって人工的に生じたと考えられる２種類のアリルの組換え体が４クローン得られた。
【００１６】
この遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＢ＊４８０１の配列のエクソン３内に８箇所の変異を確認した。これらの変異のうち６箇所は図２に示す９４番目のアミノ酸がスレオニンからイソロイシンへ、９５番目のアミノ酸がロイシンからイソロイシンへ、９７番目のアミノ酸がセリンからアルギニンへ、１０３番目のアミノ酸がバリンからロイシンへ、１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンへと置き換わる非同義置換であり、残りの２箇所は同義置換であった。エクソン３の配列だけを比較した場合、もっとも相同性が高いアリルはＢ＊４０５９であり、図1に示したＢ＊４０５９の配列のエクソン３内に３箇所の変異を確認した。これらの変異は、図２に示す１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１４番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアスパラギンへ、１１６番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンへと置き換わる非同義置換であった。これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ｂ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置しており、Ｂ４８に含まれる遺伝子型の中には、新規配列中に見出された６箇所のアミノ酸置換を有するものはない。
【００１７】
このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ｂ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ｂ＊４８０１と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とは、移植医療においては区別する必要があるので、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ｂ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ｂ＊４８１７」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを「Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ」または「Ｂ＊４８１７」のいずれかで表示する。
【００１８】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。
【００１９】
また本発明の新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパクもアリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ｂ＊４８０１）と本件新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ｂ＊４８０１のアミノ酸配列上、９４番目のアミノ酸がスレオニンからイソロイシンへ、９５番目のアミノ酸がロイシンからイソロイシンへ、９７番目のアミノ酸がセリンからアルギニンへ、１０３番目のアミノ酸がバリンからロイシンへ、１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンへと置き換わっている場合が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】既知のアリル（Ｂ＊４０５９及びＢ＊４８０１）とＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（Ｂ＊４０５９及びＢ＊４８０１）とＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とのアミノ酸配列の比較。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下ＨＬＡと略す）の新規アリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡ型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｂ抗原のサブタイプのひとつであるＢ４８に含まれる遺伝子型は２００７年１月１２日の時点で、１７種類が報告されている（例えば、非特許文献４参照）が、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成１9年1月19日検索]、インターネット＜URL：http://www.allelefrequencies.net＞
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ｂ抗原のサブタイプのひとつであるＢ４８に含まれる新規アリルを提供することにある。
【０００８】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ｂ遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、既知のアリルとは異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８新規アリルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８新規アリルを提供するものである。
【００１１】
本発明により、ＨＬＡ−Ｂ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の ｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）でＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出した２種類のＤＮＡ検体で既知の遺伝子型とは異なることが判明した。
【００１３】
ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりエクソン２およびエクソン３の配列を確認した。エクソン２およびエクソン３のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、エクソン２はＢ＊５２０１とＢ＊４８０１の配列であるが、エクソン３はＢ＊５２０１の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。よって、この検体がＢ＊５２０１と未知のアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００１４】
配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１Ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ｂ抗原のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１Ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、得られた１２クローンのプラスミドについて配列を確認した。
【００１５】
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５２０１が４クローン、ダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列を有する変異型が４クローン得られた。また、ＰＣＲ反応によって人工的に生じたと考えられる２種類のアリルの組換え体が４クローン得られた。
【００１６】
この遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＢ＊４８０１の配列のエクソン３内に８箇所の変異を確認した。これらの変異のうち６箇所は図２に示す９４番目のアミノ酸がスレオニンからイソロイシンへ、９５番目のアミノ酸がロイシンからイソロイシンへ、９７番目のアミノ酸がセリンからアルギニンへ、１０３番目のアミノ酸がバリンからロイシンへ、１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンへと置き換わる非同義置換であり、残りの２箇所は同義置換であった。エクソン３の配列だけを比較した場合、もっとも相同性が高いアリルはＢ＊４０５９であり、図1に示したＢ＊４０５９の配列のエクソン３内に３箇所の変異を確認した。これらの変異は、図２に示す１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１４番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアスパラギンへ、１１６番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンへと置き換わる非同義置換であった。これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ｂ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置しており、Ｂ４８に含まれる遺伝子型の中には、新規配列中に見出された６箇所のアミノ酸置換を有するものはない。
【００１７】
このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ｂ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ｂ＊４８０１と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とは、移植医療においては区別する必要があるので、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ｂ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ｂ＊４８１７」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを「Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ」または「Ｂ＊４８１７」のいずれかで表示する。
【００１８】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。
【００１９】
また本発明の新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパクもアリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ｂ＊４８０１）と本件新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ｂ＊４８０１のアミノ酸配列上、９４番目のアミノ酸がスレオニンからイソロイシンへ、９５番目のアミノ酸がロイシンからイソロイシンへ、９７番目のアミノ酸がセリンからアルギニンへ、１０３番目のアミノ酸がバリンからロイシンへ、１１３番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ、１１６番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンへと置き換わっている場合が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】既知のアリル（Ｂ＊４０５９及びＢ＊４８０１）とＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（Ｂ＊４０５９及びＢ＊４８０１）とＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル（Ｂ＊４８／４０Ｎｅｗ）とのアミノ酸配列の比較。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル。
【請求項２】
配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル。
【請求項３】
請求項１または２記載のいずれかでコードされるペプチドを有するタンパク。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法。
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル。
【請求項２】
配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ｂ４８新規アリル。
【請求項３】
請求項１または２記載のいずれかでコードされるペプチドを有するタンパク。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ｂ４８抗原のタイピング方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２０００３５（Ｐ２００８−２０００３５Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４３８７（Ｐ２００８−１４３８７）
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
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