ＨＰＶ感染を処置するためのｄｓＤＮＡ組成物および方法
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症を処置する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関する。このｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常は１９〜２５ヌクレオチド長であり、かつヒトＥ６ＡＰ遺伝子から選択されるＨＰＶ標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を持つアンチセンス鎖を含む。本発明はさらに、ｄｓＲＮＡと共に薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物；医薬組成物を用いてＨＰＶ感染およびＥ６ＡＰ遺伝子の発現により引き起こされる疾患を処置する方法；および細胞のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）と、子宮頸癌、肛門癌、ＨＰＶ関連前癌病変および性器疣贅などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ：ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の感染により媒介される病理学的過程を処置するためのＲＮＡ干渉の誘導における、その使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルス（ＰＶ：ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）は、上皮の過剰増殖病変を引き起こす、エンベロープを持たないＤＮＡウイルスである。このウイルスは自然界に広く存在し、高等脊椎動物に認められている。ウイルスの特徴付けは、特にヒト、ウシ、ウサギ、ウマおよびイヌで行われてきた。最初のパピローマウイルスは１９３３年にワタウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ：ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ ｒａｂｂｉｔ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）として報告された。それ以来、ワタウサギおよびウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１：ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）は、パピローマウイルスに関する研究における実験のプロトタイプとして利用されている。動物パピローマウイルスはほとんどが純粋な上皮増殖性病変に関連しており、動物における病変の大部分は皮膚である。ヒトでは１００種類を超えるパピローマウイルス（ＨＰＶ）が同定されており、皮膚上皮および粘膜上皮（口腔粘膜および生殖器粘膜）といった感染症の部位により分類されている。皮膚関連疾患には扁平疣贅、足底疣贅などがあり、粘膜関連疾患には喉頭乳頭腫、および子宮頸癌を含む肛門生殖器疾患がある（Ｆｉｅｌｄｓ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｎ．Ｙ．；非特許文献１）。
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、世界で最も多く見られる性感染症の１つである。ＨＰＶ感染症の大部分は無害である。ＨＰＶの中には、膣、頸部、外陰部（膣の外側の部分）、陰茎および直腸など、男性および女性の性器周辺に単独または複数の隆起物として認められる性器疣贅の原因となるタイプもある。ＨＰＶに感染した人の多くは症状を示さない。
【０００４】
大部分のＨＰＶサブタイプが起こすのは良性病変であるが、一部のサブタイプはハイリスクと考えられ、子宮頸部異形成および肛門異形成などの重篤な病変を引き起こす恐れがある。１５種のＨＰＶ型が最近ハイリスク型に分類された（非特許文献２）これらのハイリスクサブタイプは遺伝的に多様であり、ウイルスの主要カプシドタンパク質Ｌ１遺伝子の配列の相違が＞１０％であることが明らかにされている。（非特許文献１）。
【０００５】
多くの場合、ＨＰＶに感染した女性は無症状であり、子宮頸部のスクリーニングを行わない限り、発見されないことがある。子宮頸部のスクリーニングは、パップテストを用いて広く行われている。パップテストは子宮頸部組織を組織学的に評価するもので、異常な子宮頸部細胞を同定するために用いられる。パップテストの一環として、ＰＣＲまたは市販のハイブリッドキャプチャーＩＩ技法（ＨＣＩＩ：Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ）（Ｄｉｇｅｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）などの核酸ベースアッセイを用いて、ＨＰＶ感染症および特異的なサブタイプの存在を判定することができる。
【０００６】
異常な子宮頸部細胞が同定された場合、癌（ＣＩＮ−Ｉ：ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ−１（「子宮頸部上皮内腫瘍−１」）と呼ばれる細胞など）に進行するリスクが低いＬＳＩＬ（ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ：軽度扁平上皮内病変）；または癌に進行する可能性が高いＣＩＮ−２およびＣＩＮ−３と呼ばれる細胞などのＨＳＥＬ（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ：高度扁平上皮内病変）に分類される。
【０００７】
軽度病変の約８５％は自然消退し、残りはそのままの状態であるか、あるいは高度病変に進行する。高度病変は処置を行わないでいると、約１０％が癌性組織に変化すると予想される。ほとんどの場合、異形性に関連しているのはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８であるが、これに関連しているトランスフォーミングＨＰＶサブタイプは他にもいくつかある。
【０００８】
最近の研究によれば、ＨＩＶ陽性の男性同性愛者の最大８９％がこうしたハイリスクサブタイプのＨＰＶに感染している可能性がある。また、ＨＩＶ陽性患者は同時にＨＰＶの複数のサブタイプにも感染しやすいため、異形性進行のリスクが増大する。
【０００９】
過去２０年間の証拠から、子宮頸癌の発症にはＨＰＶ感染が十分条件ではないけれども必要条件であることが広く受け入れられている。子宮頸癌には９９．７％でＨＰＶが存在すると推定される。肛門癌でもＨＰＶ感染と肛門異形成および肛門癌の発症との関連は、子宮頸癌の場合と類似していると考えられる。肛門癌のＨＩＶ陰性患者のある研究では、肛門癌の８８％でＨＰＶ感染が認められた。米国では、２００３年に子宮頸癌の新症例が１２，２００例および子宮頸癌による死亡が４，１００例、同様に肛門癌の新症例が４，０００例および肛門癌による死亡が５００例であったと予測される。予防のためのスクリーニングが広く行われたため子宮頸癌の発生率は過去４０年で減少している一方、肛門癌の発生率は上昇している。ＨＩＶ陽性患者の肛門癌の発生率が一般集団よりも高いことから、肛門癌の発生率の上昇はＨＩＶ感染に一部起因しているかもしれない。肛門癌の発生率は、一般集団１００，０００人当たり０．９例であるのに対し、男性同性愛者集団１００，０００人当たり３５例、ＨＩＶ陽性の男性同性愛者集団１００，０００人当たり７０〜１００例である。こうしたＨＩＶ感染患者における肛門異形成の有病率の高さおよび肛門癌の増加傾向を踏まえ、２００３ ＵＳＰＨＡ／ＩＤＳＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＨＴＶ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓには、肛門異形成と診断された患者の処置ガイドラインが盛り込まれる見通しである。
【００１０】
ＨＰＶ感染症には一般に知られる治療法がない。性器疣贅は処置しなくても消失する場合が多いが、処置剤は存在する。処置の方法は、性器疣贅のサイズおよび位置などの因子によって異なる。使用される処置剤にはイミキモドクリーム、２０パーセントポドフィリン抗有糸分裂溶液、０．５パーセントポドフィロックス溶液、５パーセント５−フルオロウラシルクリームおよびトリクロロ酢酸がある。ポドフィリンまたはポドフィロックスの使用は、皮膚に吸収され先天性欠損の原因となる場合があるため、妊婦には推奨されない。５−フルオロウラシルクリームの使用も妊婦には推奨されない。小さな性器疣贅については、凍結（冷凍手術）、燃焼（電気焼灼）またはレーザー処置により物理的に除去できる。他の処置が奏効しない大きな疣贅は、手術により除去する必要がある場合もある。性器疣贅は、物理的除去後に再発することが知られており、こうした場合には、その疣贅にα−インターフェロンを直接注射してきた。しかしながら、α−インターフェロンは高価であるうえ、使用しても性器疣贅の再発率は低下しない。
【００１１】
したがって、ＨＰＶに有効な処置剤には改善すべき点がある。驚いたことに、こうした要求を満たし、しかも他の利益ももたらす化合物が発見された。
【００１２】
このほど、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる高度に保存された制御機構において二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止することが明らかになった。特許文献１（Ｆｉｒｅら、、）には、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡにより遺伝子の発現が阻害されることが開示されている。また、ｄｓＲＮＡは、植物（たとえば、特許文献２，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、、；および特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚら、、を参照されたい）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（たとえば、非特許文献３を参照されたい）および哺乳動物（特許文献４，Ｌｉｍｍｅｒ；およびＤＥ １０１ ００ ５８６．５，Ｋｒｅｕｔｚｅｒら、、を参照されたい）などの他の生体でも標的ＲＮＡを分解することが示されている。この自然機構は、異常または不必要な遺伝子制御により引き起こされる障害を処置する新しいクラスの医薬剤の開発するうえでこのところ注目されるようになった。
【００１３】
特許文献５には、ＨＰＶ感染が原因の疾患を処置する核酸ベースの薬物開発のこれまでの取り組みが開示されている。この公報は、細胞ベースの系でＨＰＶ複製を阻害するＨＰＶ ｍＲＮＡに対する２つのｓｉＲＮＡについて報告するものである。関連の刊行物は非特許文献４に掲載されている。
【００１４】
ＲＮＡｉの分野が著しく進歩し、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の処置に進歩は見られるものの、ＨＰＶ感染の進行を阻害し、ＨＰＶ感染に関連する疾患を処置できる薬が依然として求められている。こうした薬は全体として広範な遺伝子型多様性を示すハイリスクＨＰＶサブタイプをすべて阻害するように設計する必要があるため、この課題は一層困難なものになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／００８５７３号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ−Ｕ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００５）３２８：Ｓｌ−Ｓ６
【非特許文献２】Ｍｕｎｏｚ，Ｎ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００３）３４８（６）：５１８−２７
【非特許文献３】Ｙａｎｇ，Ｄ．，ら、，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００
【非特許文献４】Ｊｉａｎｇ，Ｍ．ら、Ｎ．Ａ．Ｒ．（２００５）３３（１８）：ｅｌ５１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＨＰＶの繁殖に必須な遺伝子の発現をサイレンシングする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＨＰＶ感染に関連する疾患の処置の問題に対する解決法を提供する。ＨＰＶが増殖するのに必要なヒト宿主種の保存された遺伝子にはＥ６ＡＰがある。
【００１８】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、このｄｓＲＮＡを用いて細胞または哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法とを提供する。本発明はまた、子宮頸癌および性器（ｇｅｎｔｉａｌ）疣贅のＨＰＶ感染に関連するＥ６ＡＰ遺伝子の発現により引き起こされる病態および疾患を処置する組成物および方法も提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＥ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を持つＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。このｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、この相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。
【００２０】
たとえば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列からなってもよく、第２の配列も表１のアンチセンス配列からなる群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は天然のヌクレオチドからなってもよいし、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオアート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチドなどの少なくとも１個の修飾ヌクレオチドからなってもよい。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドの群から選択されてもよい。通常、こうした修飾配列は、表１のセンス配列からなる群から選択される前記ｄｓＲＮＡの第１の配列および表１のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づく。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＲＮＡの１種を含む細胞を提供する。この細胞は通常、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、生体、通常はヒト被験者のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する医薬組成物であって、本発明のｄｓＲＮＡの１種または複数種および薬学的に許容されるキャリアまたは送達ビヒクルを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法であって、
（ａ）相互に相補的である少なくとも２個の配列を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入する。このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する工程；および
（ｂ）工程（ａ）で作製した細胞を、Ｅ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解するのに十分な時間維持し、それにより細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程、たとえば、癌または性器（ｇｅｎｔｉａｌ）疣贅を処置、予防または管理する方法であって、こうした処置、予防または管理を必要とする患者に治療有効量または予防有効量の本発明のｄｓＲＮＡの１種または複数種を投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターであって、本発明のＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む、ベクターを提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターを含む細胞を提供する。このベクターは、本発明のＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む。
【００２７】
（図面の簡単な説明）
図面はない
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ＨＰＶ増殖に必須な遺伝子の発現をサイレンシングする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＨＰＶ感染に関連する疾患の処置の問題に対する解決法を提供する。特に、本発明のｄｓＲＮＡは、ＨＰＶが増殖するのに必要なヒト宿主種の保存された遺伝子、ヒトＥ６ＡＰ遺伝子をサイレンシングする。本明細書では、こうした遺伝子をＨＰＶ標的遺伝子と総称する場合がある。
【００２９】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、そのｄｓＲＮＡを用いて細胞または哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法とを提供する。本発明はまた、ＨＰＶ感染に関連するＥ６ＡＰ遺伝子の発現により引き起こされる哺乳動物の病態および疾患をｄｓＲＮＡを用いて処置する組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導する。
【００３０】
本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＨＰＶ標的ｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を持つ、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。こうしたｄｓＲＮＡを用いることで、哺乳動物のＨＰＶの複製および／または維持に関係する遺伝子のｍＲＮＡの標的分解が可能になる。本発明者らは、細胞ベースおよび動物ベースのアッセイを用いて、こうしたｄｓＲＮＡがごく少量の投薬量で特異的かつ効率的にＲＮＡｉを誘発し、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を顕著に阻害することを明らかにした。したがって、こうしたｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、ＨＰＶの生活環に関与する宿主因子遺伝子を標的とし、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程を処置するのに有用である。
【００３１】
ＨＰＶ標的であるＨＰＶ Ｅ１、Ｅ６、ヒトＥ６ＡＰの説明
ヒト宿主の細胞のユビキチンリガーゼＥ６ＡＰは、ウイルスのＥ６タンパク質と複合体を形成することでＨＰＶ、特に組み込まれた（非エピソームの）形のＨＰＶの複製に関与している。Ｅ６は、細胞増殖経路を調節する多くのタンパク質に結合し、その分解を誘発する場合が多い（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｏ．ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｓ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２８：３３７−３４８）。Ｅ６はＥ６ＡＰと複合体を形成し、腫瘍抑制因子ｐ５３を標的として分解する（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ら、，１９９０．Ｃｅｌｌ．６３：１１２９−１１３６；ａｎｄ Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ら、，１９９３．Ｃｅｌｌ ７５：４９５−５０５）。このウイルスは、ｐ５３を不活化することで、ｐ５３による感染細胞のアポトーシスを妨げ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａ，２００３）、本来ならばｐ５３により阻止されるウイルスのＤＮＡの複製を促す（Ｌｅｐｉｋ，Ｄ．ら、１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６８２２−６８３１）ばかりでなく、ゲノムの完全性に対するｐ５３による制御を低下させることで腫瘍形成を促進する（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．ら、１９９９．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１８：７６９０−７７００）。
【００３２】
Ｅ１およびＥ６はいずれも、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，ｐｐ．９４７−９７８，ｉｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．Ｂｅｒｎａｒｄ Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６にかなり詳細に記載されている。Ｅ１ ＯＲＦは、プラスミドＤＮＡ複製に必須な６８〜７６ｋＤタンパク質をコードする。全長Ｅ１産物は、ＢＰＶ１のＬＣＲの複製起点に結合するリン酸化核タンパク質である。また、Ｅ１については、ＡＴＰ結合することと、Ｅ２転写トランス活性化因子（Ｅ２ＴＡ：Ｅ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）と呼ばれる全長Ｅ２タンパク質にインビトロで結合することでウイルスの転写を促進することも明らかになっている。Ｅ２への結合により、ＤＮＡ複製起点に対するＥ１の親和性も強まる。ＨＰＶ−１６では、Ｅ１は不死化に対して間接的な作用を及ぼしている。
【００３３】
Ｅ６は、約１６〜１９ｋＤの塩基性の小さな細胞トランスフォーミングタンパク質（たとえば、ＨＰＶ１６のＥ６は、１５１アミノ酸を含む）であり、核マトリックスおよび非核性膜画分に局在する。Ｅ６遺伝子産物は、４つのＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを含むことから亜鉛と結合する可能性が示唆され、さらに核酸結合タンパク質として働く可能性もある。ＨＰＶ−１６などのハイリスクＨＰＶでは、Ｅ６およびＥ７タンパク質は、宿主の扁平上皮細胞を不死化するのに必要かつ十分である。ハイリスクＨＰＶのＥ６遺伝子産物は、ｐ５３と複合体を形成し、その分解を促進する。
【００３４】
以下の詳細な説明は、本ｄｓＲＮＡと、ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む組成物との製造方法および使用方法と、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患および障害、たとえば、子宮頸癌および性器疣贅を処置する組成物および方法とを開示する。本発明の医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＨＰＶ標的遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を持つｄｓＲＮＡと共に薬学的に許容されるキャリアを含む。本発明の一実施形態は、医薬製剤中で組み合わせて、任意に別々のＨＰＶ標的遺伝子を標的とする複数種のｄｓＲＮＡを使用する。
【００３５】
したがって、本発明のある種の態様は、本発明のｄｓＲＮＡと共に薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物と、１個または複数個のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する組成物の使用方法と、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を処置する医薬組成物の使用方法とを提供する。
【００３６】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用するいくつかの用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の箇所における用語の使用法とこのセクションに示す定義との間に明らかな矛盾がある場合、このセクションの定義が優先するものとする。
【００３７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は通常それぞれ塩基として、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを含むヌクレオチドを表す。一方、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という語は、以下に詳述するような修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指す場合があることが理解されよう。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分で置き換えても、その置換部分を持つヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性が実質的に変化しない場合があることをよく知っている。たとえば、以下に限定されるものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合できる。このため、本発明のヌクレオチド配列では、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドを、たとえば、イノシンを含むヌクレオチドと置き換えてもよい。こうした置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「Ｅ６ＡＰ」とは、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６結合タンパク質すなわちＥ６ＡＰともいう）遺伝子またはタンパク質をいう。異なるアイソフォームを示すＥ６ＡＰのヒトｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３０８３８．１、ＮＭ＿１３０８３９．１およびＮＭ＿０００４６２．２として提供される。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「Ｅ１」とは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ヌクレオチド８６５〜２８１３）をいう。本明細書で使用する場合、「Ｅ６」とは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ヌクレオチド６５〜５５９）をいう。Ｅ１およびＥ６遺伝子の変異体も一般に多く開示されている。これらおよび今後公表されるＥ１およびＥ６遺伝子変異体は、「Ｅ１」および「Ｅ６」を使用することで、文脈に合わない場合を除き、本明細書に含まれるものとする。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなど、ＨＰＶ標的遺伝子の１個の転写の過程で形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分をいう。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「配列を含む鎖」という語は、ヌクレオチドの標準的な命名法で命名される配列により記載されるヌクレオチドの鎖（ｃｈａｉｎ）を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００４２】
本明細書で使用する場合、他に記載がない限り、「相補的」という語は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との関係の説明に使用する場合、当業者であれば理解するように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、何らかの条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成できることをいう。そうした条件は、たとえば、ストリンジェントな条件であってもよく、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後の洗浄が挙げられる。生体内で見られることがある生理的に適切な条件などの他の条件を用いてもよい。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に応じて、２個の配列の相補性テストに最適な一連の条件を決定することができる。
【００４３】
「相補的」には、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合が含まれる。本明細書では、こうした配列を相互に「完全に相補的」という場合がある。これに対し、本明細書で第１の配列を第２の配列に対して「実質的に相補的」という場合、２つの配列は、完全に相補的であってもよいし、最終用途に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持していれば、ハイブリダイゼーション時に１つまたは複数、ただし、通常は４、３または２以下のミスマッチ塩基対が形成されてもよい。一方、ハイブリダイゼーション時に２個のオリゴヌクレオチドを１つまたは複数の一本鎖オーバーハングが形成されるように設計する場合、こうしたオーバーハングは相補性の判定の際にミスマッチと見なさないものとする。たとえば、一方が２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、他方が２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであるｄｓＲＮＡにおいて、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、本発明では、やはり「完全に相補的」という場合がある。
【００４４】
さらに、本明細書で使用する場合、「相補的」配列は、ハイブリダイズの能力に関する上記の要件を満たす限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよいし、完全にそうした塩基対から形成されていてもよい。
【００４５】
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」という語は、使用された文脈から分かるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用する場合がある。
【００４６】
本明細書で使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」であるポリヌクレオチドとは、目的の（たとえば、Ｅ６ＡＰをコードする）ｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドをいう。たとえば、ポリヌクレオチドは、その配列がＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの連続部分と実質的に相補的である場合、Ｅ６ＡＰのｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【００４７】
「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という語は、本明細書で使用する場合、逆平行で、かつ上記で定義したような実質的に相補的な核酸鎖を２本含む二本鎖構造を持つリボ核酸分子の複合体をいう。二本鎖構造を形成している２本の鎖は、より大きな１個のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子である場合、文献ではそうしたｄｓＲＮＡをしばしばｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」）と呼んでいる。この２本の鎖がより大きな１個の分子の一部であるため、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖（ｃｈａｉｎ）で連結されている場合、連結されたＲＮＡ鎖（ｃｈａｉｎ）は「ヘアピンループ」、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖（ｃｈａｉｎ）以外の手段により２本の鎖が共有結合で連結されている場合、この連結構造を「リンカー」という。ＲＮＡの各鎖は、ヌクレオチドの数が同じでも、異なってもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチド数から二本鎖に存在する任意のオーバーハング数を引いた数である。ｄｓＲＮＡは、二本鎖構造に加えて、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。さらに、本明細書で使用する場合、「ｄｓＲＮＡ」は、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよびコンジュゲート部分の化学修飾を含めて、複数のヌクレオチドの実質的な修飾および本明細書に開示されているか、または当該技術分野において公知のすべてのタイプの修飾を含んでもよい。本明細書および特許請求の範囲では、ｓｉＲＮＡタイプの分子に用いられるこうした任意の修飾は「ｄｓＲＮＡ」により包含される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、不対ヌクレオチドをいうか、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長またはその逆であるとき、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出したヌクレオチドをいう。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡの末端に不対ヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、全長にわたり二本鎖であるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。分かりやすくするため、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを持つかどうか、あるいは、平滑末端であるかどうかを判断する際にｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端にコンジュゲートされた化学キャップまたは非ヌクレオチドの化学部分については考慮しない。
【００４９】
「アンチセンス鎖」という語は、標的配列と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖をいう。本明細書で使用する場合、「相補性領域」という語は、配列、たとえば、本明細書に定義するような標的配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域をいう。相補性領域が標的配列と完全には相補的でない場合、ミスマッチが最も認められるのは末端領域であり、存在する場合は、たとえば、５’および／または３’終端から６、５、４、３または２ヌクレオチドのような末端領域（単数または複数）内にあるのが一般的である。
【００５０】
「センス鎖」という語は、本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖をいう。
【００５１】
ｄｓＲＮＡについていう場合、「細胞に導入する」とは、当業者が理解するとおり、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、細胞の受動拡散プロセスまたは能動的プロセスにより、あるいは、助剤または装置により行うことができる。「細胞に導入する」とは、インビトロでの細胞に限定されるものではなく、ｄｓＲＮＡを、生体の一部を構成している「細胞に導入」してもよい。こうした場合、細胞への導入には、生体への送達が含まれる。たとえば、インビボでの送達では、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射しても、全身投与してもよい。インビトロで細胞に導入するには、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなど当該技術分野において公知の方法がある。
【００５２】
本明細書では、ＨＰＶ標的遺伝子について言及している場合、「発現をサイレンシングする」および「阻害する」という語は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の少なくとも一部を抑制することをいう。転写の抑制については、ＨＰＶ標的遺伝子は転写されるが、そのＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するように処置してある第１の細胞または細胞群から単離できるＨＰＶ標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そうした処置をしていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して減少していることで確認される。阻害の程度は、一般に以下の式で表される。
【００５３】
【数１】
あるいは、たとえば、細胞から分泌されるＨＰＶ標的遺伝子がコードするタンパク質の量または、たとえば、アポトーシスのようなある種の表現型を示す細胞数など、ＨＰＶ標的遺伝子の転写と機能的に関連するパラメーターの低下により阻害の程度を示してもよい。原則として、構成的に発現しても、ゲノム工学により発現してもこの標的を発現する任意の細胞を用いて、任意の適切なアッセイによりＨＰＶ標的遺伝子サイレンシングを判定してもよい。ただし、あるｄｓＲＮＡがＨＰＶ標的遺伝子の発現をある程度阻害し、そのため本発明に包含されるかどうかを判定するため基準が必要である場合、以下の実施例に記載するアッセイがこうした基準として役に立つ。
【００５４】
たとえば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子の発現は少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される場合がある。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子は少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子は少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。表２は、様々なＥ６ＡＰ ｄｓＲＮＡ分子を種々の濃度で用いたインビトロアッセイから得られた転写阻害の広範な値を示す。
【００５５】
「処置する」、「処置」および同種の語は、本明細書においてＨＰＶ感染の文脈で使用する場合、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程が軽減または緩和することをいう。処置という場合、ＨＰＶ感染を予防または防止し、ＨＰＶ感染により引き起こされる症状または病的変化を軽減する本発明の治療薬の使用を含む。本発明の文脈では、本明細書で以下に記載する他の（ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程以外の）症候に関係する場合、「処置する」、「処置」および同種のという語は、そうした症候に関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和したり、そうした症候を遅延または回復させたりすることを意味する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程またはＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の明確な症状の処置、予防または管理に際し、治療上の有益性を与える量をいう。治療効果のある具体的な量は、一般の開業医が容易に判定できるものであるが、たとえば、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程のタイプ、患者の病歴および年齢、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の段階ならびに他の治療剤の投与など、当該技術分野において公知の要因によって異なる場合がある。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む。本明細書で使用する場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、所期の薬理学的結果、治療結果または予防結果を得るのに有効なｄｓＲＮＡの量をいう。たとえば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメーターが少なくとも２５％低下したときにその臨床処置が有効と見なされる場合、その疾患または障害を処置する薬剤の治療有効量は、パラメーターを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。
【００５８】
「薬学的に許容されるキャリア」という語は、治療薬の投与のためのキャリアをいう。そうしたキャリアとして、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。ただし、細胞培地は、薬学的に許容されるキャリアとして使用しない。経口投与用の薬剤の薬学的に許容されるキャリアとして、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤があるが、これに限定されるものではない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウムおよびラクトースがあり、好適な崩壊剤にはコーンスターチおよびアルギン酸がある。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含めてもよく、潤滑剤が存在する場合はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。錠剤については、胃腸管での吸収を遅延させるため必要に応じてグリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの材料でコーティングしてもよい。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現できるベクターを導入してある細胞である。
【００６０】
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ｄｓＲＮＡはＨＰＶ標的遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性領域を含有するアンチセンス鎖を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常は１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつ前記ｄｓＲＮＡは前記ＨＰＶ標的遺伝子を発現している細胞と接触すると、前記ＨＰＶ標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％または４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００６１】
このｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列と実質的に相補的であり、通常完全に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖と相補的な領域を含むため、好適な条件下で組み合わせられたとき、２本の鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する。二本鎖構造は、一般的には１５〜３０塩基対長、より一般的には１８〜２５塩基対長、なおより一般的には１９〜２４塩基対長、最も一般的には１９〜２１塩基対長である。同様に、標的配列の相補性領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、より一般的には１８〜２５ヌクレオチド長、なおより一般的には１９〜２４ヌクレオチド長、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（単数または複数）をさらに含んでもよい。このｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察される当該技術分野において公知の標準的な方法により、たとえば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような自動ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。好ましい実施形態では、ＨＰＶ標的遺伝子はヒトＥ６ＡＰ遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１のセンス配列から選択される鎖および表１のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。表１に記載する標的配列内の他のところを標的とする別のアンチセンス薬については、標的配列およびＥ６ＡＰフランキング配列を用いて容易に決定することができる。
【００６２】
さらなる実施形態では、このｄｓＲＮＡは、表１に記載の配列の群から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２個の配列を含み、少なくとも２個の配列の１個が少なくとも２個の配列のもう１個の配列と相補的であり、かつ少なくとも２個の配列の１個はＥ６ＡＰ遺伝子の発現の際に産生されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。ｄｓＲＮＡは通常、一方のオリゴヌクレオチドが表１にセンス鎖として記載され、他方のオリゴヌクレオチドが表１にアンチセンス鎖として記載される、２個のオリゴヌクレオチドを含む。表１は、好ましいｄｓＲＮＡごとに二本鎖の名称および配列ＩＤ番号を示す。
【００６３】
当業者であれば、２０〜２３塩基対、とりわけ２１塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘導に特に効果があるとして注目されていることをよく知っている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、、，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。一方で、それより短いｄｓＲＮＡも長いｄｓＲＮＡも効果的である場合があることも分かっている。上述の実施形態では、表１に記載のオリゴヌクレオチド配列の性質により、本発明のｄｓＲＮＡは長さが最低２１ｎｔの少なくとも１本の鎖を含んでもよい。表１の配列の１つから一方または両方の末端のヌクレオチドをわずか数個除いた配列を含む短いｄｓＲＮＡも、上記のようなｄｓＲＮＡと同様に効果的である場合があると予想することは合理的といえる。このため、表１の配列の１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列を含み、かつＦＡＣＳアッセイまたは本明細書で以下に記載する他のアッセイでＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する能力の変化率が完全な配列を含むｄｓＲＮＡと比べて５、１０、１５、２０、２５または３０％以下であるｄｓＲＮＡを、本発明は意図している。さらに、表１に記載の標的配列内で切断するｄｓＲＮＡについては、参照配列および記載の標的配列を用いて容易に製造することができる。
【００６４】
さらに、表１に記載のＲＮＡｉ薬は、ＲＮＡｉにより切断されやすい各ＨＰＶ標的のｍＲＮＡ内の部位も同定する。このため、本発明は、本発明の薬の１つが標的とする配列内で標的するＲＮＡｉ薬をさらに含む。本明細書で使用する場合、第２のＲＮＡｉ薬が第１のＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖と相補的なｍＲＮＡ内で任意のメッセージを切断する場合、第２のＲＮＡｉ薬は第１のＲＮＡｉ薬の配列内で標的するという。こうした第２の薬は通常、表１に記載の配列の１つの連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを、ＨＰＶ標的遺伝子から選択した配列に連続する領域から抽出した新たなヌクレオチド配列と結合してなるものである。たとえば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチド（付加したＡＡ配列を除く）を標的Ｅ６ＡＰ遺伝子の６ヌクレオチドの隣りに組み合わせて、表１に記載の配列の１つに基づく２１ヌクレオチドの一本鎖薬を作製する。
【００６５】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つまたは複数のミスマッチを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが含むミスマッチは３以下である。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性領域の中央に位置していないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチが、たとえば、相補性領域の５’あるいは３’末端から５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチドなど、どちらの末端からも５ヌクレオチドまでに含まれることが好ましい。たとえば、ＨＰＶ標的遺伝子の領域と相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは通常、中央よりの１３ヌクレオチド内にミスマッチをまったく含まない。標的配列に対してミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害に有効であるかどうかを判定するには、本発明内に記載する方法を用いてもよい。ＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害においてミスマッチを含むｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、ＨＰＶ標的遺伝子の特定の相補性領域が、ウイルス（Ｅ１またはＥ６）あるいはヒト集団（Ｅ６ＡＰ）において多型性配列変異を含むことが分かっている場合に特に重要である。
【００６６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には１〜４ヌクレオチド、通常は１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングがある。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むｄｓＲＮＡは、平滑末端のｄｓＲＮＡよりも予想外に優れた阻害特性を持っている。さらに、本発明者らは、ヌクレオチドオーバーハングが１つだけ存在する場合、全体の安定性に影響を与えることなくｄｓＲＮＡの干渉活性が増強されることも発見した。オーバーハングが１つだけのｄｓＲＮＡは、インビボだけでなく種々の細胞、細胞培地、血液および血清で特に安定かつ有効であることが証明された。通常、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３末端、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。また、本ｄｓＲＮＡは平滑末端を含んでもよく、通常はアンチセンス鎖の５’末端に位置する。こうしたｄｓＲＮＡは安定性および阻害活性が向上しているため、少量の投薬量、すなわち、５ｍｇ／ｋｇ被投与者体重未満での投与が可能になる。通常、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングがあり、５’末端は、平滑末端である。別の実施形態では、オーバーハングの１つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスファートで置き換えられている。
【００６７】
なお別の実施形態では、ｄｓＲＮＡを化学修飾して安定性を高める。本発明の核酸については、参照によって本明細書に援用する「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら、（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような当該技術分野で十分に確立している方法により合成および／または修飾してもよい。化学修飾としては、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖（ｃｈａｉｎ）への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学部分への共有結合およびヌクレオチド間のホスファート結合からチオホスファートなどの別の結合への置換が挙げられるが、これに限定されるものではない。こうした修飾を複数用いても構わない。
【００６８】
２本のｄｓＲＮＡ鎖は、たとえば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用；金属イオンの配位またはプリンアナログの使用によるなど、種々のよく知られた技法により化学的に結合させることができる。一般に、ｄｓＲＮＡの修飾に使用できる化学基として、以下に限定されるものではないが、メチレンブルー；二官能基、通常はビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。一実施形態では、リンカーはヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、固相合成によりｄｓＲＮＡを作製し、標準的な方法に従いヘキサ−エチレングリコールリンカーを導入する（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：１４６６５−１４６７０を参照）。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端を、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に結合させる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端の化学結合は通常、三重らせん結合により形成される。表１は、本発明の修飾ＲＮＡｉ薬の例を示す。
【００６９】
なお別の実施形態では、２本の単鎖の一方または両方のヌクレオチドを修飾して、たとえば、以下に限定されるものではないが、ある種のヌクレアーゼなどの細胞酵素の分解活性を予防または阻害してもよい。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害する技法は、当該技術分野において公知であり、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非電荷の骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホルアミダートがあるが、これに限定されるものではない（たとえば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１：１１１６−８を参照されたい）。したがって、ｄｓＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基は、化学基、通常は２’−アミノまたは２’−メチル基により置き換えられている。また、少なくとも１個のヌクレオチドを修飾してロックドヌクレオチドを形成してもよい。こうしたロックドヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素とを連結するメチレン架橋を含む。ロックドヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドについては、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ら、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０）ａｎｄ Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４）に記載されている。ロックドヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入すると、相補配列に対する親和性が向上し、融解温度が数度上昇する（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１−７）。
【００７０】
リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすると、細胞吸収のほか、特定組織への標的化または膣上皮などの特異的な細胞型による取り込みを高めることができる。場合によっては、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートして細胞膜の直接浸透を促進する。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートするリガンドは、受容体介在性エンドサイトーシスの基質である。こうしたアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ薬の細胞透過を促進するために使用されている。たとえば、コレステロールは、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、非コンジュゲートアナログと比較して化合物の活性が実質的に高まる。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてきた他の親油性化合物として、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロールおよびメントールが挙げられる。受容体介在性エンドサイトーシスのためのリガンドの一例として葉酸がある。葉酸は、ホラート受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞に入る。葉酸を含むｄｓＲＮＡ化合物であれば、ホラート受容体介在性エンドサイトーシスを介して効率的に細胞に輸送されると考えられる。Ｌｉおよび共同研究者は、オリゴヌクレオチドの３’終端に葉酸が結合すると、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みが８倍増加することを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，７５，１５４０を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他のリガンドには、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲートおよび送達ペプチドがある。
【００７１】
オリゴヌクレオチドにカチオン性リガンドをコンジュゲートすると、ヌクレアーゼに対する耐性が高まる場合がある。カチオン性リガンドの代表的な例として、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムが挙げられる。興味深いことに、カチオン性リガンドをオリゴヌクレオチド全体に分散させると、アンチセンスオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに対して高い結合親和性を保持すること報告された。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３およびその参考文献を参照されたい。
【００７２】
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡに対する連結分子の結合から得られるように、ペンダント反応性官能基を含むｄｓＲＮＡを用いて合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドについては、種々の保護基のいずれかを含む合成リガンドまたは連結部分を持つリガンドなど、市販のリガンドと直接反応させてもよい。本発明の方法を用いれば、リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡを合成しやすくなる。その際、いくつかの好ましい実施形態では、リガンドに適切にコンジュゲートされていて、固体支持体材料にさらに結合できるヌクレオシドモノマーを用いる。この任意に固体支持体材料に結合したリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートについては、選択した血清結合リガンドとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に位置する連結部分との反応を介して、本発明の方法のいくつかのましい実施形態に従い調製する。場合によっては、ｄｓＲＮＡの３’終端に結合したアラルキルリガンドを含むｄｓＲＮＡを調製するには、最初に長鎖（ｃｈａｉｎ）アミノアルキル基を介してモノマー構成要素をコントロールドポアガラス支持体に共有結合させる。次いで標準的な固相合成法により、ヌクレオチドを、固体支持体に結合したモノマー構成要素に結合させる。モノマー構成要素はヌクレオシドでも、固相合成と相性がよい他の有機化合物でもよい。
【００７３】
本発明のコンジュゲートに使用するｄｓＲＮＡは、よく知られた固相合成法により手軽に日常的に作製することができる。その合成用の機器は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）など、複数のベンダーから販売されている。これに加えて、あるいはその代わりに、当該技術分野において公知の任意の他の合成手段を用いてもよい。ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製する類似の技法も知られている。
【００７４】
個々の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許：ポリアミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルリン結合を持つオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーに注目した米国特許第５，２１２，２９５号；修飾骨格を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；骨格修飾オリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによりその調製に注目した米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成方法に注目した米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に注目した米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を持つオリゴヌクレオチドを調製するプロセスに注目した米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に注目した米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチド合成のための方法および材料に注目した米国特許第５，５７１，９０２号；ヌクレオシドの様々な位置のいずれかに結合した、他の部分に対するリンカーとして使用できるアルキルチオ基を持つヌクレオシドに注目した米国特許第５，５７８，７１８号；キラル純度の高いホスホロチオアート結合を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物などの関連化合物を調製するプロセスに注目した米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，４７０号；どちらもコンジュゲート４’−デスメチルヌクレオシドアナログに注目した米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；骨格修飾オリゴヌクレオチドアナログに注目した米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に特に注目した米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号で確認することができる。
【００７５】
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを含むリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡおよびリガンド分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準的なヌクレオチド前駆体もしくはヌクレオシド前駆体または結合部分をすでに含んでいるヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに含んでいるリガンドヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドのリガンド含有構成要素を用いて好適なＤＮＡ合成機により構築できる。
【００７６】
結合部分をすでに含むヌクレオチドコンジュゲート前駆体を使用する場合、一般に配列特異的結合ヌクレオシドを合成しておき、次いで結合部分とリガンド分子を反応させ、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子などの種々の分子を含むオリゴヌクレオチドコンジュゲートについては、以前に記載されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，国際公開第９３／０７８８３号を参照されたい）。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドを、リガンドヌクレオシドコンジュゲートから得られたホスホラミダイトに加えて、標準的なホスホラミダイトおよび市販されていてオリゴヌクレオチド合成で日常的に使用される非標準のホスホラミダイトを用いて自動合成機により合成する。
【００７７】
２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基をオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに導入すると、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性が向上する。さらに、ホスホロチオアート骨格を含むオリゴヌクレオチドでは、ヌクレアーゼ安定性が高まる。このため、ホスホロチオアート骨格または２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基もしく２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか、あるいはその両方を含ませて、本発明の機能性結合ヌクレオシドを強化することができる。当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド修飾に関する概要リストについては、たとえば、国際公開第２００３７０９１８号に一部掲載されている。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ合成機を用いて、５’終端にアミノ基を持つ本発明の機能性ヌクレオシド配列を調製し、次いで選択したリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は、当業者によく知られている。代表的な活性エステルとして、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、結合基を介して選択したリガンドが５’位に結合したオリゴヌクレオチドが生成される。５’終端のアミノ基は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を用いて調製することができる。一実施形態では、リガンドヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、リガンド分子を５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。その際、リガンドは、直接的に、あるいは、リンカーを介して間接的に５’ヒドロキシ基に結合する。自動合成手順の最後でこうしたリガンドヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、５’終端にリガンドを含むリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを得るのが一般的である。
【００７９】
修飾ヌクレオシド間結合または骨格の例として、たとえば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートなどのメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートなどのホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の３’−５’結合を持つボラノホスファート、これらの２’−５’結合アナログならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を持つアナログが挙げられる。さらに、様々な塩形、混合塩形および遊離酸形も含まれる。
【００８０】
上記のリン原子含有結合体の調製に関する代表的な米国特許には、各々を参照によって本明細書に援用する米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，６９７，２４８号があるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間結合または骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖（ｃｈａｉｎ）アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合または１個もしくは複数個の短鎖（ｃｈａｉｎ）ヘテロ原子または複素環の糖間結合により形成される骨格を持っている。こうした骨格として、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を含む骨格；シロキサン骨格；硫化物骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を持つ前述以外の骨格が挙げられる。
【００８２】
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する代表的な米国特許として、各々を参照によって本明細書に援用する米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号があるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
場合によっては、オリゴヌクレオチドを非リガンド基で修飾してもよい。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを高めるため、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている非リガンド分子は多くあり、そうしたコンジュゲーションを行う手順は科学文献に示されている。このような非リガンド部分として、コレステロールなどの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、、，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖（ｃｈａｉｎ）、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、、，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１ １；Ｋａｂａｎｏｖら、、，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、、，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａら、、，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（ｃｈａｉｎ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、、，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、、，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が挙げられる。こうしたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は上述した。典型的なコンジュゲーションプロトコルでは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを含むオリゴヌクレオチドの合成を行う。次いでこのアミノ基をコンジュゲーション対象の分子と、適当なカップリング試薬または活性化試薬を用いて反応させる。コンジュゲーション反応に関しては、固体支持体に結合したままのオリゴヌクレオチドで行っても、オリゴヌクレオチドを溶液相で切断してから行ってもよい。一般に、ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドコンジュゲートを精製すると、純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートを用いると、ＨＰＶ感染の部位である膣上皮細胞の標的化が高まる場合があるため、特に好ましい。
【００８４】
本開示では、ＨＰＶ標的遺伝子をサイレンシングするため、ＨＰＶ関連障害の処置に有用なｄｓＲＮＡの種々の実施形態が記載されている。個々の治療薬の設計は様々な形をとる場合があるが、何らかの機能上の特徴により好ましいｄｓＲＮＡとそうでないｄｓＲＮＡとに分けられる。特に、良好な血清安定性、高度の活性、免疫応答のないこと、および優れた薬剤に似た挙動など、当業者により測定可能なあらゆる特徴を検査して、本発明の好ましいｄｓＲＮＡを同定する。状況によっては、好ましいｄｓＲＮＡにこうした機能的側面がすべて含まれているとは限らない。しかし、当業者であれば、こうした評価項目などを最適化し、本発明の好ましい化合物を選択することができる。
【００８５】
ヌクレオチドには多くの修飾が可能であるが、本発明者らは、薬理学的有益性、免疫学的な有益性および最終的な治療上の有益性を著しく高める化学修飾のパターンを特定した。表３は、表１に記載の本発明の二本鎖ｄｓＲＮＡに使用できる好ましい化学修飾のパターンを示す。
【００８６】
【表３−１】
【００８７】
【表３−２】
ＲＮＡｉ薬をコードするベクター
また、本発明のｄｓＲＮＡは、インビボで細胞内の組換えウイルスベクターから発現させてもよい。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列およびｄｓＲＮＡ配列を発現する好適な任意のプロモーターを含む。好適なプロモーターとして、たとえば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。これ以外の好適なプロモーターに何を選択するかは、当該技術分野の技術の範囲内にある。また、本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境でｄｓＲＮＡを発現させるための誘導性プロモーターまたは調節可能なプロモーターをさらに含んでもよい。インビボで本発明のｄｓＲＮＡを細胞へ送達する組換えウイルスベクターの使用については、以下に詳細に考察されている。
【００８８】
本発明のｄｓＲＮＡは、組換えウイルスベクターから別々の２個の相補的ＲＮＡ分子として発現させても、２つの相補的領域を含む１個のＲＮＡ分子として発現させてもよい。
【００８９】
発現対象のｄｓＲＮＡ分子（単数または複数）のコード配列を組み込めるのであればどのウイルスベクターを用いてもよく、たとえば、アデノウイルス（ＡＶ：ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）；レトロウイルス（レンチウイルス（ＬＶ：ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）；疱疹ウイルスおよび同種のもの由来のベクターがある。ウイルスベクターのトロピズムについては、必要に応じてエンベロープタンパク質または他のウイルスの別の表面抗原でベクターをシュードタイプ化するか、または様々なウイルスカプシドタンパク質を置換して改変することができる。
【００９０】
たとえば、本発明のレンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラおよび同種のものの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターを操作してカプシドタンパク質の異なる血清型を発現させて様々な細胞を標的とするように作製してもよい。たとえば、血清型２ゲノム上に血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターをＡＡＶ２／２と呼ぶが、ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子で置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを製造してもよい。カプシドタンパク質の様々な血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技法は、当該技術分野の技術の範囲内にある。たとえば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら、、（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたい。
【００９１】
本発明で使用するのに好適な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡをベクターに発現させるための核酸配列の挿入方法およびウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内にある。たとえば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＤｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０；ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら、、，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたい。
【００９２】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のベクターである。特に好ましい実施形態では、たとえば、Ｕ６もしくはＨ１ＲＮＡプロモーターあるいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターのどちからかを含む組換えＡＡＶベクターから本発明のｄｓＲＮＡを相補的な別々の２個の一本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
【００９３】
本発明のｄｓＲＮＡを発現する好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈら、、（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【００９４】
本発明のｄｓＲＮＡを発現する好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、、（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら、、（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、、（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許同第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開第９４／１３７８８号；および国際公開第９３／２４６４１号に記載されている。
【００９５】
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載するようなｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程など、ＨＰＶ標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害の処置に有用である。こうした医薬組成物は、送達モードを踏まえて製剤化される。たとえば、組成物を頸部の局所投与用に製剤化したり、非経口送達による全身投与用に製剤化したりする。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する十分な投薬量で投与する。本発明者らは、その効率を高めることで、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を驚くほど少量の投薬量で投与できることを明らかにした。ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害または抑制するには、１日に被投与者体重１キログラム当たりｄｓＲＮＡ５ｍｇの投薬量で十分であり、疣贅または子宮頸部または肛門の処置の場合、感染組織に直接塗布しても構わない。
【００９７】
一般にｄｓＲＮＡの１日の好適な用量は、被投与者の体重１キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲であり、通常は体重１キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲である。本医薬組成物は１日１回の投与でもよいし、あるいはこのｄｓＲＮＡは、適当な間隔をとってその日のうちに２回、３回またはそれ以上の分割用量で、さらには持続注入または膣ゲルの放出制御製剤による送達を用いて投与してもよい。その場合、各分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは、分割数が増えるにつれて少なくする必要がある。たとえば、ｄｓＲＮＡを数日間にわたり徐放する従来の徐放性製剤を用いて、数日間送達できるように投薬量単位を配合してもよい。徐放性製剤は、当該技術分野において周知であり、特に本発明の薬と共に使用できるような薬の経膣送達に有用である。この実施形態では、投薬量単位の１日用量は、徐放性に応じて様々になる。
【００９８】
当業者であれば、以下に限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、これまでの処置、被検体の全体的な健康状態および／または年齢および他の疾患の存在など、何らかの要因により被検体の効果的な処置に必要な投薬量およびタイミングが影響を受ける場合があることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物による被検体の処置は、１回の処置の場合もあれば、何度かの処置になる場合もある。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡの効果的投薬量およびインビボでの半減期については、従来の手法を用いて、あるいは、本明細書の別の箇所で記載するように適当な動物モデルを用いたインビボ試験に基づき推計することができる。
【００９９】
発明者らは、ＨＰＶ遺伝子型の多様性など様々な理由から、本発明の複数種のｄｓＲＮＡを同時に用いてＨＰＶ感染を処置することが望ましいであろうと考える。実施形態の１つでは、ｄｓＲＮＡの混合物の複雑度を最小限に抑えながら最も多くのＨＰＶ遺伝子型が標的となるようにｄｓＲＮＡの組み合わせを選択する。複数タイプのｄｓＲＮＡを含む本発明の医薬組成物は、本明細書に記載するような各投薬量のｄｓＲＮＡを含むことが予想される。
【０１００】
ｄｓＲＮＡの組み合わせについては、単一剤形の医薬組成物として一緒に提供してもよい。あるいは、別々の剤形としてｄｓＲＮＡの組み合わせを提供してもよく、この場合、その組み合わせを同時に投与してもよいし、異なる時間に場合によっては別の手段で投与しても構わない。このため、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの所望の組み合わせを含む医薬組成物を意図しているほか、併用レジメンの一部として提供されることを目的とした単一のｄｓＲＮＡ医薬組成物も意図している。したがって、後者の場合の併用療法剤の発明は、組成物そのものではなく、投与方法になる。
【０１０１】
マウス遺伝学の進歩により、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程など、様々なヒト疾患の研究用に多くのマウスモデルが作製されるようになった。こうしたモデルを用いてｄｓＲＮＡのインビボ検査ばかりでなく、治療有効用量の判定が行われている。
【０１０２】
本発明のｄｓＲＮＡをＨＰＶに感染した細胞を持つ哺乳動物に投与するには任意の方法を用いてよい。たとえば、投与は、局所（たとえば、経膣、経皮など）投与；経口投与；または非経口（たとえば、皮下、脳室内、筋肉内または腹腔内注射または点滴静注）投与であってもよい。投与は、急速投与（たとえば、注射）でもよいし、一定の期間続いても構わない（たとえば、持続注入または持続放出製剤の投与）。
【０１０３】
一般に、ＨＰＶに感染した細胞を持つ哺乳動物を処置する場合、膣ゲルまたはクリームでｄｓＲＮＡ分子を局所投与する。たとえば、リポソームを使用してあるいは使用せずに製剤化したｄｓＲＮＡを、頸部、肛門管または性器疣贅などのＨＰＶ病変部に局所塗布してもよい。局所投与では、無菌および非無菌水溶液、アルコール類などの一般的な溶媒に溶かした非水溶液または液体もしくは固体油基剤中の溶液などの組成物としてｄｓＲＮＡ分子を製剤化してもよい。こうした溶液は、緩衝液、希釈液および他の好適な添加剤をさらに含んでも構わない。局所投与用の組成物については、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤の形態で製剤化することもできる。当該技術分野において公知のポリマーおよび透過剤を用いて、ゲルおよびクリームを製剤化してもよい。子宮頸部キャップ、ペッサリー、コーティングコンドーム、グローブおよび同種のものを用いて、ｄｓＲＮＡおよび関連する賦形剤を含むゲルまたはクリームを頸部に塗布してもよい。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、油性基剤、増粘剤および同種のものを加えても構わない。
【０１０４】
非経口投与、髄膜内投与または脳室内投与の場合、無菌水溶液などの組成物としてｄｓＲＮＡ分子を製剤化することができ、組成物は緩衝液、希釈液および他の好適な添加剤（たとえば、浸透促進剤、キャリア化合物および他の薬学的に許容されるキャリア）をさらに含んでもよい。
【０１０５】
さらに、たとえば、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されているような生物学的または非生物学的手段などの非ウイルス方法を用いて、ＨＰＶ感染細胞を持つ哺乳動物にｄｓＲＮＡ分子を投与することもできる。非生物学的送達は、以下に限定されるものではないが、（１）本明細書に記載のｄｓＲＮＡ酸分子のリポソームへの導入および（２）ｄｓＲＮＡ分子と脂質またはリポソームとの複合体形成による核酸脂質複合体または核酸リポソーム複合体の形成など、様々な方法により行うことができる。リポソームは、インビトロでの細胞のトランスフェクションに一般に使用されるカチオン性脂質および中性脂質で構成されていてもよい。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成（たとえば、電荷による会合）してリポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例として、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクタク、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１，２（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−デイメチル−１−プロパンアミニウム）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３，［Ｎ−Ｎ’，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン）−カルバモイル］コレステロール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０６】
リポソームの形成手順は当該技術分野において周知である。リポソーム組成物は、たとえば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）など、数多くの親油性薬が市販されている。さらに、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰなどの市販されているカチオン性脂質を用いて、全身送達法を最適化することもできる。カチオン性脂質はそれぞれＤＯＰＥまたはコレステロールのような中性脂質と混合してもよい。場合によっては、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、、（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６４７−６５２（１９９７））に記載されているようなリポソームを使用してもよい。他の実施形態では、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンを用いてインビボおよびエキソビボ送達を行うこともできる（Ｂｏｌｅｔｔａら、、，Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１７２８（１９９６））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関する追加情報については、米国特許第６，２７１，３５９号、国際公開第９６／４０９６４号およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ら、２００５．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００２−７で確認することができる。
【０１０７】
ＨＰＶ感染細胞を持つ哺乳動物にｄｓＲＮＡ分子を投与するこれ以外の非ウイルス方法として、（リプソームに加えて）リポプレックスおよびナノエマルジョンなどのカチオン性脂質ベースの送達系が挙げられる。さらに、以下に限定されるものではないが、キトサン、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、デンドリマー（たとえば、ポリアミドアミン（ＰＡＮＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）デンドリマー）およびポロキサミンなどの縮合重合体送達系（すなわち、ＤＮＡポリマー複合体すなわち「ポリプレックス」）を用いてもよい。加えて、以下に限定されるものではないが、ポロキサマー、ゼラチン、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ＰＶＰ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ポリビニルピロリドン）およびＰＶＡ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ：ポリビニルアルコール）などの非縮合重合体送達系を用いてもよい。
【０１０８】
上述の送達または投与法の手順は当該技術分野において周知である。たとえば、縮合重合体送達系は、アニオン性ＤＮＡ分子との複合体形成により容易に利用できる。例として、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）は、負に荷電した細胞表面と相互作用する正に荷電した複合体を形成し、続いて急速にインターナリゼーションを受けることで機能する。
【０１０９】
生物学的送達は、以下に限定されるものではないが、ウイルスベクターの使用などの様々な方法により行うことができる。たとえば、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を皮膚細胞および子宮頸部細胞に送達してもよい。標準的な分子生物学技法を用いれば、核酸を細胞に送達するために以前に開発された多種多様なウイルスベクターの１つに、本明細書に記載の１個または複数個のｄｓＲＮＡを導入することができる。こうして得られたウイルスベクターを用いて、たとえば、感染により１個または複数個のｄｓＲＮＡを細胞に送達できる。
【０１１０】
本発明のｄｓＲＮＡについては、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液中で製剤化できる。「薬学的に許容されるキャリア」（本明細書では「賦形剤」ともいう）とは、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的不活性なビヒクルである。薬学的に許容されるキャリアについては液体でも固体でもよく、所望のバルク特性、稠度特性のほか、適切な輸送特性および化学的特性が得られると考えられる投与形式に合わせて選択すればよい。典型的な薬学的に許容されるキャリアには、限定としてではなく例として、水；食塩水溶液；結合剤（たとえば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）；潤滑剤（たとえば、デンプン、ポリエチレングリコールまたは酢酸ナトリウム）；崩壊薬（たとえば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）がある。
【０１１１】
さらに、ＨＰＶ標的遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡについては、他の分子、分子構造体または核酸の混合物と混合したり、封入したり、コンジュゲートしたり、あるいはその他の方法で結合したりしたｄｓＲＮＡを含む組成物として製剤化してもよい。たとえば、Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とする１種または複数種のｄｓＲＮＡ薬を含む組成物は、抗炎症剤（たとえば、非ステロイド系抗炎症剤およびコルチコステロイド）および抗ウイルス剤（たとえば、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビル）などの他の治療薬を含んでも構わない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＰＶ標的遺伝子と相補的な配列を持つ１個または複数個のｄｓＲＮＡを角質溶解薬と共に含んでもよい。角質溶解薬は、表皮の角質層を剥離または軟化する薬である。角質溶解薬の例として、サリチル酸があるが、これに限定されるものではない。これ以外の例は、米国特許第５，５４３，４１７号に記載されている。角質溶解薬を効果的な量で用いれば、たとえば、皮膚などの組織へのｄｓＲＮＡの浸透を促進することができる。たとえば、角質溶解薬を一定の量で用いれば、性器疣贅に塗布したｄｓＲＮＡを疣贅全体に浸透させることができる。
【０１１２】
こうした化合物の毒性および薬効については、細胞培養または実験動物を用いて、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効用量）を測定する標準的な製剤手順で判定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。治療係数が大きい化合物が好ましい化合物である。
【０１１３】
ヒトに使用する投薬量の範囲を求める（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）には、細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを用いることができる。本発明の組成物の投薬量は通常、ほとんど毒性がないか、まったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量はこの範囲内で、使用する剤形および選択した投与経路によって変わる場合がある。本発明の方法に使用する任意の化合物の治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推計してもよい。細胞培養で判定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状に対する最大作用の５０％を害する被検化合物の濃度）を含む化合物、あるいは、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物が、ある循環血漿中濃度範囲に達する（たとえば、そのポリペプチドの濃度が減少する）ように、動物モデルを用いてを求めてもよい。こうした情報を用いれば、ヒトで有用な用量をより正確に判定することができる。血漿中レベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーで測定してもよい。
【０１１４】
本発明のｄｓＲＮＡは、上記で論じたように１個ずつまたは複数まとめて投与するばかりでなく、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の処置に効果があることが分かっている他の薬と組み合わせて投与してもよい。いずれにしても、当該技術分野において公知であるか、本明細書に記載された有効性の標準的な指標を用いて観察された結果に基づき、管理医師はｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０１１５】
ｄｓＲＮＡの組み合わせについては、単独で有効なｄｓＲＮＡを同定したのと同じ方法を用いてインビトロおよびインビボで検査することができる。こうした組み合わせは、最小数で最も広範な遺伝子型をカバーするｓｉＲＮＡを選択する純粋な生物情報学を基礎にして選択してもよい。あるいは、こうした組み合わせを、単一のｄｓＲＮＡ薬に関する本明細書の記載に沿って、インビトロまたはインビボ評価に基づき選択してもよい。ｄｓＲＮＡの組み合わせを検査するのに好ましいアッセイは、ＨＰＶ１６陽性癌細胞株（たとえば、Ｈｅｎｇｓｔｅｒｍａｎｎら、、（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｉｒ．７９（１４）：９２９６；ａｎｄ Ｂｕｔｚら、、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：５９３８に記載のＳｉＨａまたはＣａｓｋｉなど）または、たとえば、Ｊｅｏｎら、、（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｉｒ．６９（５）：２９８９に記載されているような器官型培養系を用いたｓｉＲＮＡによるＨＰＶ標的のノックダウンの表現型を評価するものである。
【０１１６】
本発明者らは、ＨＰＶ感染の処置に使用できるｄｓＲＮＡの好ましい組み合わせをいくつか同定した。ごく一般的に言えば、ｄｓＲＮＡの組み合わせは、表１の中から選択される複数種のｄｓＲＮＡを含む。よって、本発明は、併用療法剤中に表１の中から選択される２、３、４、５またはそれ以上のｄｓＲＮＡ二本鎖の使用を意図している。原則として、治療製品の簡便性のため、ｄｓＲＮＡは最小数にすることが好ましい。このため、有害な、あるいは潜在的に有害なＨＰＶ遺伝子型の最大数をカバーするｄｓＲＮＡを選択しても、実際には、そうしたＨＰＶ遺伝子型をすべてカバーするとは限らない組み合わせを選択せざるを得ない場合もある。
【０１１７】
ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を処置する方法
本明細書に記載の方法および組成物を用いて、臨床症状が見られるあるいは見られないパピローマウイルス感染が原因である可能性があり、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる疾患および症候を処置することができる。本明細書では、こうした疾患および症候を「ＨＰＶ関連障害」または「ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程」という場合があり、たとえば、上皮性悪性腫瘍、皮膚癌（非メラノーマ性またはメラノーマ性）、子宮頸癌などの肛門性器悪性腫瘍、ＨＰＶ関連前癌病変（ＬＳＩＬまたはＨＳＩＬ子宮頸部組織など）、肛門癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性病変、良性病変、乳頭癌腫、乳頭腺嚢腫、神経障害性乳頭腫、乳頭腫症、皮膚および粘膜乳頭腫、コンジローマ、線維芽細胞腫瘍ならびにパピローマウイルスに関連する他の病態が挙げられる。
【０１１８】
たとえば、本明細書に記載の組成物を用いて、ＨＰＶが引き起こす疣贅を処置することができる。こうした疣贅として、たとえば、手掌、足底および爪周囲疣贅などの普通の疣贅（尋常性疣贅）；扁平および糸状疣贅；肛門、口頭、咽頭、喉頭および舌乳頭腫；およびＨＰＶ感染の最も重篤な所見の１つで、性器疣贅とも呼ばれる性病性疣贅（ｃｏｎｄｙｌｏｍａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）（たとえば、陰茎、外陰、膣および子宮頸部疣贅）が挙げられる。ＨＰＶのＤＮＡは子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ Ｉ〜ＩＩＩ）のどの段階でも認められ得るが、子宮頸部上皮内癌ではＨＰＶ型の特定のサブセットが認められる場合がある。したがって、特定のＨＰＶ型を持つ性器疣贅の女性は、子宮頸癌を発症するリスクが高いと考えられる。
【０１１９】
パピローマウイルス感染に関連して最も多く見られる疾患は、良性皮膚疣贅または普通の疣贅である。普通の疣贅には通常、ＨＰＶ１型、２型、３型、４型または１０型が認められる。パピローマウイルスにより引き起こされる他の症候として、たとえば、喉頭の良性上皮性腫瘍である喉頭乳頭腫が挙げられる。喉頭乳頭腫に最も一般的に関連しているのは２つのパピローマウイルス型、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１である。本明細書に記載の組成物を用いてこうした疾患および症候を処置することができる。
【０１２０】
また、本明細書に記載の組成物は、赤みを帯びた小さな斑として現れる散在性の扁平疣贅を特徴とする稀な遺伝的疾患、疣贅状表皮発育異常症（ＥＶ：ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）の処置に用いることもできる。
【０１２１】
さらに、本明細書に記載の組成物を用いて、ＨＰＶが病原体である細胞形質転換に起因する病変の処置、たとえば、子宮頸癌の処置を行うこともできる。
【０１２２】
さらに、本明細書に記載の組成物は、たとえば、陰茎、外陰、子宮頸部、膣 口頭、肛門および咽頭の異形性のようなＨＰＶによる異形性の処置および、たとえば、陰茎、外陰、子宮頸部、膣、肛門、口頭、咽頭および頭頸部の癌のようなＨＰＶによる癌の処置に用いることができる。
【０１２３】
本発明は、従来の任意の化学療法剤など他の抗癌化学療法剤と組み合わせて特定のｄｓＲＮＡを含ませることにより実施してもよい。こうした他の薬と特異的な結合薬とを組み合わせれば、化学療法プロトコルが促進される場合がある。当業者であれば、本発明の方法に組み込むことができる数多くの化学療法プロトコルを思いつくであろう。アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位元素ならびに天然物など、どのような化学療法剤を用いてもよい。たとえば、本発明の化合物を、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリンアナログなどの抗生物質、シクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシルなどのピリミジンアナログ、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソールおよびその天然合成誘導体と合成誘導体ならびに同種のものと共に投与しても構わない。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺腺癌などの混合腫瘍の場合、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と共に本化合物を投与してもよい。他の抗腫瘍薬プロトコルとして、テトラサイクリン化合物と、たとえば、手術、放射線など他の処置方式との併用があり、本明細書ではこれを「補助的抗腫瘍薬方式」ともいう。このように、本発明の方法を前述のような従来のレジメンと併用すれば、副作用の低下および有効性の向上といった効果が得られる。
【０１２４】
あるいはまた、Ｅ６ＡＰを標的とするｄｓＲＮＡを用いて、神経障害および行動障害を処置してもよい。Ｅ６ＡＰは、アンジェルマン症候群の患者でＥ６ＡＰ突然変異が同定されたことで神経障害および行動障害に関係していると言われている。アンジェルマン症候群（ＡＳ：Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とは、精神遅滞、言語障害、過度の笑い、発作、運動失調および特有のＥＥＧパターンを特徴とする、遺伝子刷り込みによる神経行動学的疾患である。（Ｈｉｔｃｈｉｎｓ，Ｍ．Ｐ．ら、２００４．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．１２５（２）：１６７−７２。）こうした症候を挙げることが処置の目的ではないように思われる。それよりも、多くの遺伝的欠損で観察されるように、Ｅ６ＡＰが神経症候および行動症候において重要な役割を果たしているというこの知見から同時に示唆されるものは、この標的がヒトの病的変化において様々な役割を担っている可能性があり、このクラスの他の疾患の好適な標的となることが予想され、Ｅ６ＡＰのサイレンシングにより他の生化学的欠損または疾患が改善されるであろうということである。本明細書で使用する場合、「Ｅ６ＡＰ関連障害」は、上記のＨＰＶ関連障害ならびに他の神経障害および行動障害を含む。
【０１２５】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法
なお別の態様では、本発明は、哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法では、本発明の表１の組成物を哺乳動物に投与して標的Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現をサイレンシングする。本発明のこのｄｓＲＮＡは特異性が高いため、標的Ｅ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシング後）を特異的に標的とする。こうしたｄｓＲＮＡを用いてこのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書の別の箇所で記載したように行うことができる。
【０１２６】
一実施形態では、本方法は、ｄｓＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、ｄｓＲＮＡは、処置対象の哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。処置対象の生体がヒトなどの哺乳動物である場合、以下に限定されるものではないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経気道（エアロゾル）投与、経鼻投与、直腸投与、経膣投与および局所（頬粘膜および舌下など）投与のような経口または非経口経路など、当該技術分野において公知の任意の手段で組成物を投与してもよい。好ましい実施形態では、組成物を局所／膣内投与で投与するか、点滴静注または注射により投与する。
【０１２７】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には、本明細書の記載と類似または同等の方法および材料を用いてもよいが、好適な方法および材料は以下に記載する。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許および他の参考文献については、参照によってその全体を援用する。矛盾が生じた場合、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法および例は単に例示のためのものであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１２８】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の遺伝子歩行
ヒトユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６ＡＰともいう）を標的とするｓｉＲＮＡを同定するため、ｓｉＲＮＡの設計を行った。異なるアイソフォームを示すＥ６ＡＰのヒトｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿１３０８３８．１、ＮＭ＿１３０８３９．１、ＮＭ＿０００４６２．２）を使用した。
【０１２９】
すべてのヒトＥ６ＡＰアイソフォームについてＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアのＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメント機能（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，ら、，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２：４６７３）を用いて、最小配列としてのｍＲＮＡ配列ＮＭ＿１３０８３８．１を同定し、さらに、すべてのＥ６ＡＰアイソフォームの効率的な標的化に必須となる参照配列の５〜４４９１位（末端位）の配列保存性を確認した。
【０１３０】
Ｅ６ＡＰの参照配列ＮＭ＿１３０８３８．１中にあり重複すると推察される１９ｍｅｒ（ｓｉＲＮＡセンス鎖配列を示す）をすべて同定し、４４７３個の１９ｍｅｒ候補配列を得た。こうした候補標的配列を合わせると、Ｅ６ＡＰ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲドメイン、コードドメインおよび３’ＵＴＲドメインならびにこれらのドメインの結合部位がカバーされる。
【０１３１】
候補のプールからｓｉＲＮＡのランク付けおよび選択を行うため、無関係な標的と相互作用すると予想されるポテンシャル（標的外ポテンシャル）をランク付けのパラメーターとして用いた。標的外ポテンシャルが低いｓｉＲＮＡを好ましいものと規定し、インビボでの特異性が高いと考えた。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡに特異的な標的外ポテンシャルの予測には、以下の仮説を設定した：
１）標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡと、ある鎖（シード領域）との相互作用およびその後のダウンレギュレーションを行うには、その鎖の２〜９位（５’から３’にカウント）において標的遺伝子に対する相補性があれば十分である（Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＬ，ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｊｕｎ；２１（６）：６３５−７）
２）各鎖の１位および１９位は標的外相互作用に無関係である
３）シード領域は、それ以外の配列よりも標的外ポテンシャルに強く関与している可能性がある
４）ある鎖の切断部位領域の１０位および１１位（５’から３’にカウント）は、３’から切断部位への配列（非シード領域）よりも標的外ポテンシャルに強く関与する場合があるが、シード領域ほどではない
５）１〜４の仮説を考慮しながら、遺伝子配列に対するｓｉＲＮＡ鎖配列の相補性およびミスマッチの位置に基づき、遺伝子および鎖ごとに標的外スコアを算出することができる
６）内部修飾の導入によりセンス鎖の活性が抑制され得ることを想定すれば、関係するのはアンチセンス鎖の標的外ポテンシャルのみになる
７）我々の基準で最も高い相同性を示す遺伝子（最良の標的外遺伝子）からｓｉＲＮＡの標的外ポテンシャルを推定できるため、このポテンシャルをその遺伝子の標的外スコアで表すことができる
潜在的な標的外遺伝子を同定するため、１９ｍｅｒアンチセンス配列を、一般に入手可能なヒトｍＲＮＡ配列に対して相同性検索に供した。このため、すべての１９ｍｅｒ候補アンチセンス配列についてヒトＲｅｆＳｅｑデータベースに対してＦａｓｔＡ（バージョン３．４）検索を行った。候補の１９ｍｅｒ配列からアンチセンス配列を作成するにはＰｅｒｌスクリプトを用いた（ｐｅｒｌスクリプト２）。ＦａｓｔＡ検索については、１９ｍｅｒの全長にわたる相同性を考慮に入れ、次の工程でこのスクリプト解析に好適なアウトプットをフォーマットするため、パラメーター／対ペア値−ｇ３０−ｆ３０−Ｌ−ｉ−Ｈを用いて実行した。検索の結果、候補ｓｉＲＮＡの潜在的な標的外遺伝子のリストが得られた。
【０１３３】
さらに、完全な１９ｍｅｒ長との相同性を示しつつ、ＦａｓｔＡアウトプットファイルに転送される可能性が非常に高い、１９ｍｅｒセンス鎖配列と同一の８個を超えて連続する核酸塩基のデータベースエントリーを作成するため、ＦａｓｔＡ検索をパラメーターの値をＥ１５０００として行った（仮説１を参照されたい）。
【０１３４】
最良の標的外遺伝子およびその標的外スコアを同定するため、ＦａｓｔＡのアウトプットファイルを解析した。潜在的な標的外遺伝子それぞれについて、１９ｍｅｒインプット配列ごとに以下の標的外特性を抽出した：
シード領域におけるミスマッチ数
非シード領域におけるミスマッチ数
切断部位領域におけるミスマッチ数
以下のように標的外遺伝子ごとに標的外スコアを算出した：
（シードのミスマッチ数に１０を掛ける）＋（切断部位のミスマッチ数に１．２を掛ける）＋非シードのミスマッチ数
１９ｍｅｒのインプット配列ごとに最低標的外スコアを抽出し、アウトプットファイルに連続的に書き込ませ、１９ｍｅｒのインプット配列に対応するｓｉＲＮＡすべてについて標的外スコアのリストを得た。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡのランキング表を作成するため、標的外スコアを結果表に記入した。最後に、すべてのｓｉＲＮＡを標的外スコアに従い降順に並べ替え、連続して３個を超えるＧのつながりを含む配列を選択から除外した。
【０１３６】
標的外スコアが＞＝３の３２７個のｓｉＲＮＡを選択し、合成した（表１）。
【０１３７】
【表１−１】
【０１３８】
【表１−２】
【０１３９】
【表１−３】
【０１４０】
【表１−４】
【０１４１】
【表１−５】
【０１４２】
【表１−６】
【０１４３】
【表１−７】
【０１４４】
【表１−８】
【０１４５】
【表１−９】
【０１４６】
【表１−１０】
【０１４７】
【表１−１１】
ｄｓＲＮＡ合成
試薬の入手先
本明細書に試薬の入手先が具体的に記載されていない場合、その試薬は、分子生物学で使用される品質／純度標準で分子生物学用試薬の任意のサプライヤーから入手できる。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡを１μｍｏｌｅのスケールで固相合成により作製した。その際、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、固体支持体としてコントロールドポアガラス（ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いた。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを、それぞれに対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて固相合成により作製した。こうした構成要素を、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら、（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学を用いてオリゴリボヌクレオチド鎖（ｃｈａｉｎ）の配列内の選択部位に組み込んだ。ヨウ素酸化剤溶液の代わりにアセトニトリルに溶かしたＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）溶液（１％）を用いてホスホロチオアート結合を導入した。追加の補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１４９】
確立した手順に従い、この粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製をイオン交換ＨＰＬＣにより行った。分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて波長２６０ｎｍにおける各ＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により収率および濃度を判定した。二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、水浴中にて８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温まで冷却して作製した。アニーリング済みのＲＮＡ溶液を使用時まで−２０℃で保存した。
【０１５０】
３’−コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（本明細書ではＣｈｏｌ−３’という）の合成では、適切に修飾された固体支持体を用いてＲＮＡを合成した。この修飾固体支持体は、以下のとおり調製した：
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート ＡＡ
【０１５１】
【化１】
水（５０ｍＬ）に溶かしたエチルグリシナートヒドロクロリド（３２．１９ｇ、０．２３モル）の氷冷した撹拌溶液に、４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。次いで、エチルアクリラート（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、この混合物を反応の終了がＴＬＣで確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、この溶液をジクロロメタンで分割（３×１００ｍＬ）した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残留物を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【０１５２】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ
【０１５３】
【化２】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。０℃の溶液にジイソプロピルカルボジイムド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を加えた。次いでジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温まで冷まし、さらに６時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを加えてジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。この生成物をカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製してＡＢ１１．８７ｇ（８８％）を得た。
【０１５４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ
【０１５５】
【化３】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を０℃のジメチルホルムアミドに加えた２０％ピペリジンに溶解した。この溶液の撹拌を１時間続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。この粗生成物をヒドロクロリド塩に変換して精製した。
【０１５６】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル ＡＤ
【０１５７】
【化４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣのヒドロクロリド塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解した。この懸濁液を０℃まで氷冷した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にコレステリルクロロホルマート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１０．３ｇ、９２％）により精製した。
【０１５８】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル ＡＥ
【０１５９】
【化５】
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリー化した。この混合物を０℃まで氷冷し、２０分以内に５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを撹拌しながらゆっくりと加えた。添加中の温度を５℃未満に保った。撹拌を０℃で３０分間続け、１ｍＬの氷酢酸を加え、直後に４０ｍＬの水に加えたＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ４ｇを加えた 得られた混合物を、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を、それぞれ１０ｍＬのリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、乾燥させ、蒸留乾固した。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃まで冷却し、ｐＨ９．５の冷たい炭酸塩緩衝液５０ｍＬで３回に分けて抽出した。この水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調整し、合わせて４０ｍＬのクロロホルムで５回に分けて抽出し、乾燥させ、蒸留乾固した。残留物を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得た。
【０１６０】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０、１１，１２，１３、１４，１５、１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＦ
【０１６１】
【化６】
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に加えたｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）との還流混合物に１時間かけてメタノール（２ｍＬ）を滴下した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温まで冷ました後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、生成物をカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製した（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＧ
【０１６２】
【化７】
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ １．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）で減圧蒸発させて乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。この反応を室温で一晩行った。メタノールを添加して反応をクエンチした。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。この有機層を１Ｍの水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンで蒸発させて除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３でのＲｆ＝０．５）により精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０１６３】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル ＡＨ
【０１６４】
【化８】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をコハク酸無水物（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で一晩真空乾燥させた。この混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液をアルゴン雰囲気下で室温にて１６時間撹拌した。次いで溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷水性クエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。この有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残留物を次の工程でそのまま使用した。
【０１６５】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
【０１６６】
【化９】
スクシナートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。この溶液にアセトニトリル（１．２５ｍＬ）に加えたＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）に加えた２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）に加えたトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物の色は鮮やかなオレンジ色になった。この溶液をリストアクションシェイカーを用いて短時間（５分）かき混ぜた。長鎖（ｃｈａｉｎ）アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ：ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌ ａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を加えた。この懸濁液を２時間かき混ぜた。ＣＰＧを焼結漏斗で濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで続けて洗浄した。酢酸無水物／ピリジンを用いて未反応アミノ基をマスクした。得られたＣＰＧの量をＵＶの測定により測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０１６７】
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書では「５’−Ｃ３２−」という）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書では「５’−Ｃｈｏｌ−」という）を含むｓｉＲＮＡの合成を行った。その際、コレステリル誘導体の場合に核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオアート結合を導入するため、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて酸化工程を行ったことが以外は国際公開第２００４／０６５６０１号に記載されているように行った。
【０１６８】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様では、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現活性を調節するＥ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入した転写ユニットから発現させる（たとえば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ら、，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ら、，国際公開第００／２２１１３号，Ｃｏｎｒａｄ，国際公開第００／２２１１４号，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。この導入遺伝子については、線状コンストラクト、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入してもよく、こうしたベクターは宿主ゲノムに組み込まれる導入遺伝子として導入され、遺伝し得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして遺伝するように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０１６９】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２種の別々の発現ベクターのプロモーターにより転写され、標的細胞にコトランスフェクトされてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡの１本１本の鎖は、共に同一の発現プラスミドにある２つのプロモーターにより転写されてもよい。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を含むようにリンカーポリヌクレオチド配列により結合された逆方向反復としてｄｓＲＮＡを発現させる。
【０１７０】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターに関しては、以下に限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（総説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ら、，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）を参照されたい）；アデノウイルス（たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ら、，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６を参照されたい），Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、、（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、、（１９９２），Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５））；あるいはアルファウイルスおよびこれ以外の当該技術分野において公知のものを用いて構築してもよい。インビトロおよび／またはインビボで様々な遺伝子を上皮細胞などの多種多様な細胞型に導入するには、レトロウイルスが用いられている（たとえば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、、，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、、，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら、、，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら、、，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、、，９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら、，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９ ；Ｋａｙら、、，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら、、，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら、、，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際公開第８９／０７１３６号；国際公開第８９／０２４６８号；国際公開第８９／０５３４５号；および国際公開第９２／０７５７３号を参照されたい）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子の形質導入および発現が可能な組換えレトロウイルスベクターについては、組換えレトロウイルスのゲノムをＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの好適なパッケージング細胞株にトランフェクトすることで作製できる（Ｃｏｍｅｔｔｅら、、，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０；Ｃｏｎｅら、、，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターを用いれば、感受性宿主（たとえば、ラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の種々の細胞および組織に感染させることができ（Ｈｓｕら、、，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染の際に分裂活性のある細胞を必要としないという利点もある。
【０１７１】
本発明のＤＮＡプラスミドあるいはウイルスベクターにおいてｄｓＲＮＡ発現を誘導するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（たとえば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（たとえば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または一般にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（たとえば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）あるいは原核生物プロモーター、たとえば、Ｔ７プロモーターであってもよい。ただし、Ｔ７プロモーターの場合、発現プラスミドはＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードする。このプロモーターは、膵臓に導入遺伝子発現を誘導することもできる（たとえば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら、、，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照されたい）。
【０１７２】
さらに、導入遺伝子の発現に関しては、たとえば、循環血中のグルコースレベルまたはホルモンといった何らかの生理的な制御因子に感受性を示す制御配列など、誘導型の制御配列および発現系を用いることで正確に制御できる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、、，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現の制御に好適なこうした誘導発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化を誘導する化学物質およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による制御がある。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の用途に応じて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができるであろう。
【０１７３】
通常、ｄｓＲＮＡ分子の発現が可能な組換えベクターについては下記のように送達し、標的細胞に存在し続ける。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現が可能なウイルスベクターを用いてもよい。こうしたベクターは、必要に応じて反復投与することができる。発現したら、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与により、患者から外植した標的細胞に投与してから患者に再導入することにより、あるいは所望の標的細胞への導入が可能な他の任意の手段によるなど、全身性であってもよい。
【０１７４】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは一般に、カチオン性脂質キャリア（たとえば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質ベースのキャリア（たとえば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランフェクトする。１週間またはそれ以上かけて単一のＥ６ＡＰ遺伝子または複数のＥ６ＡＰ遺伝子の異なる領域を標的とする、ｄｓＲＮＡによるノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションも本発明は意図している。本発明のベクターが宿主細胞にうまく導入されたどうかは、様々な既知の方法によりモニターすることができる。たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のような蛍光マーカーなどのレポーターで一過性トランスフェクション．を伝達させることができる。エキソビボでの細胞の安定なトランスフェクション．は、特異的な環境要因（たとえば、抗生物質および薬剤）に対する耐性、たとえば、ハイグロマイシンＢ耐性があるトランスフェクト細胞を認識するマーカーを用いて確認することができる。
【０１７５】
Ｅ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子はベクターに挿入し、ヒト患者の遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）により、または定位的注入（たとえば、Ｃｈｅｎら、、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照されたい）により被検体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈液に遺伝子治療ベクターを含ませてもよいし、遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、たとえば、レトロウイルスベクターのような完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトな状態で産生できる場合、医薬調製物は、その遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含んでも構わない。
【０１７６】
ＨＣＴ−１１６細胞を用いたＥ６ＡＰ ｓｉＲＮＡスクリーニング
ＨＣＴ−１１６細胞をＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ Ｎｏ．ＡＣＣ５８１）から入手し、加湿インキュベーターにおいて１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよび２ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎを含むように補充したＭｃＣｏｙｓ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ Ｎｏ．Ｆ１０１５）で５％ＣＯ２雰囲気、３７℃にて培養した。
【０１７７】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、９６ウェルプレートに密度２．０×１０４細胞／ウェルでＨＣＴ−１１６細胞を播種し、直接トランスフェクトした。製造者の記載のとおり、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクション（単一用量スクリーニング用の３０ｎＭおよび３ｎＭ、）を行った。
【０１７８】
トランスフェクションから２４時間後、ＨＣＴ−１１６細胞を溶解し、標準的なプロトコルに従い、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）（以前のＧｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｉｎｃ．））を用いてＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡの発現レベルを定量した。Ｅ６ＡＰにおけるｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡを基準に補正した。ｓｉＲＮＡごとに４種のデータポイントを集めた。Ｅ６ＡＰ遺伝子に無関係のｓｉＲＮＡ二本鎖を対照として用いた。Ｅ６ＡＰ特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖の各活性を、処置を行った細胞中のＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡ濃度と、対照ｓｉＲＮＡ二本鎖で処置した細胞中のＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡ濃度との比で表した。
【０１７９】
その結果を以下の表２に示す。Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とする多くの活性ｓｉＲＮＡ分子が同定された。
【０１８０】
【表２−１】
【０１８１】
【表２−２】
【０１８２】
【表２−３】
【０１８３】
【表２−４】
当業者であれば、本開示に具体的に記載した以外にも、以下に添付される特許請求の範囲の及ぶ範囲で本発明を実施する方法および組成物をよく知っている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）と、子宮頸癌、肛門癌、ＨＰＶ関連前癌病変および性器疣贅などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ：ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の感染により媒介される病理学的過程を処置するためのＲＮＡ干渉の誘導における、その使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルス（ＰＶ：ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）は、上皮の過剰増殖病変を引き起こす、エンベロープを持たないＤＮＡウイルスである。このウイルスは自然界に広く存在し、高等脊椎動物に認められている。ウイルスの特徴付けは、特にヒト、ウシ、ウサギ、ウマおよびイヌで行われてきた。最初のパピローマウイルスは１９３３年にワタウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ：ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ ｒａｂｂｉｔ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）として報告された。それ以来、ワタウサギおよびウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１：ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）は、パピローマウイルスに関する研究における実験のプロトタイプとして利用されている。動物パピローマウイルスはほとんどが純粋な上皮増殖性病変に関連しており、動物における病変の大部分は皮膚である。ヒトでは１００種類を超えるパピローマウイルス（ＨＰＶ）が同定されており、皮膚上皮および粘膜上皮（口腔粘膜および生殖器粘膜）といった感染症の部位により分類されている。皮膚関連疾患には扁平疣贅、足底疣贅などがあり、粘膜関連疾患には喉頭乳頭腫、および子宮頸癌を含む肛門生殖器疾患がある（Ｆｉｅｌｄｓ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｎ．Ｙ．；非特許文献１）。
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、世界で最も多く見られる性感染症の１つである。ＨＰＶ感染症の大部分は無害である。ＨＰＶの中には、膣、頸部、外陰部（膣の外側の部分）、陰茎および直腸など、男性および女性の性器周辺に単独または複数の隆起物として認められる性器疣贅の原因となるタイプもある。ＨＰＶに感染した人の多くは症状を示さない。
【０００４】
大部分のＨＰＶサブタイプが起こすのは良性病変であるが、一部のサブタイプはハイリスクと考えられ、子宮頸部異形成および肛門異形成などの重篤な病変を引き起こす恐れがある。１５種のＨＰＶ型が最近ハイリスク型に分類された（非特許文献２）これらのハイリスクサブタイプは遺伝的に多様であり、ウイルスの主要カプシドタンパク質Ｌ１遺伝子の配列の相違が＞１０％であることが明らかにされている。（非特許文献１）。
【０００５】
多くの場合、ＨＰＶに感染した女性は無症状であり、子宮頸部のスクリーニングを行わない限り、発見されないことがある。子宮頸部のスクリーニングは、パップテストを用いて広く行われている。パップテストは子宮頸部組織を組織学的に評価するもので、異常な子宮頸部細胞を同定するために用いられる。パップテストの一環として、ＰＣＲまたは市販のハイブリッドキャプチャーＩＩ技法（ＨＣＩＩ：Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ）（Ｄｉｇｅｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）などの核酸ベースアッセイを用いて、ＨＰＶ感染症および特異的なサブタイプの存在を判定することができる。
【０００６】
異常な子宮頸部細胞が同定された場合、癌（ＣＩＮ−Ｉ：ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ−１（「子宮頸部上皮内腫瘍−１」）と呼ばれる細胞など）に進行するリスクが低いＬＳＩＬ（ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ：軽度扁平上皮内病変）；または癌に進行する可能性が高いＣＩＮ−２およびＣＩＮ−３と呼ばれる細胞などのＨＳＥＬ（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ：高度扁平上皮内病変）に分類される。
【０００７】
軽度病変の約８５％は自然消退し、残りはそのままの状態であるか、あるいは高度病変に進行する。高度病変は処置を行わないでいると、約１０％が癌性組織に変化すると予想される。ほとんどの場合、異形性に関連しているのはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８であるが、これに関連しているトランスフォーミングＨＰＶサブタイプは他にもいくつかある。
【０００８】
最近の研究によれば、ＨＩＶ陽性の男性同性愛者の最大８９％がこうしたハイリスクサブタイプのＨＰＶに感染している可能性がある。また、ＨＩＶ陽性患者は同時にＨＰＶの複数のサブタイプにも感染しやすいため、異形性進行のリスクが増大する。
【０００９】
過去２０年間の証拠から、子宮頸癌の発症にはＨＰＶ感染が十分条件ではないけれども必要条件であることが広く受け入れられている。子宮頸癌には９９．７％でＨＰＶが存在すると推定される。肛門癌でもＨＰＶ感染と肛門異形成および肛門癌の発症との関連は、子宮頸癌の場合と類似していると考えられる。肛門癌のＨＩＶ陰性患者のある研究では、肛門癌の８８％でＨＰＶ感染が認められた。米国では、２００３年に子宮頸癌の新症例が１２，２００例および子宮頸癌による死亡が４，１００例、同様に肛門癌の新症例が４，０００例および肛門癌による死亡が５００例であったと予測される。予防のためのスクリーニングが広く行われたため子宮頸癌の発生率は過去４０年で減少している一方、肛門癌の発生率は上昇している。ＨＩＶ陽性患者の肛門癌の発生率が一般集団よりも高いことから、肛門癌の発生率の上昇はＨＩＶ感染に一部起因しているかもしれない。肛門癌の発生率は、一般集団１００，０００人当たり０．９例であるのに対し、男性同性愛者集団１００，０００人当たり３５例、ＨＩＶ陽性の男性同性愛者集団１００，０００人当たり７０〜１００例である。こうしたＨＩＶ感染患者における肛門異形成の有病率の高さおよび肛門癌の増加傾向を踏まえ、２００３ ＵＳＰＨＡ／ＩＤＳＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＨＴＶ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓには、肛門異形成と診断された患者の処置ガイドラインが盛り込まれる見通しである。
【００１０】
ＨＰＶ感染症には一般に知られる治療法がない。性器疣贅は処置しなくても消失する場合が多いが、処置剤は存在する。処置の方法は、性器疣贅のサイズおよび位置などの因子によって異なる。使用される処置剤にはイミキモドクリーム、２０パーセントポドフィリン抗有糸分裂溶液、０．５パーセントポドフィロックス溶液、５パーセント５−フルオロウラシルクリームおよびトリクロロ酢酸がある。ポドフィリンまたはポドフィロックスの使用は、皮膚に吸収され先天性欠損の原因となる場合があるため、妊婦には推奨されない。５−フルオロウラシルクリームの使用も妊婦には推奨されない。小さな性器疣贅については、凍結（冷凍手術）、燃焼（電気焼灼）またはレーザー処置により物理的に除去できる。他の処置が奏効しない大きな疣贅は、手術により除去する必要がある場合もある。性器疣贅は、物理的除去後に再発することが知られており、こうした場合には、その疣贅にα−インターフェロンを直接注射してきた。しかしながら、α−インターフェロンは高価であるうえ、使用しても性器疣贅の再発率は低下しない。
【００１１】
したがって、ＨＰＶに有効な処置剤には改善すべき点がある。驚いたことに、こうした要求を満たし、しかも他の利益ももたらす化合物が発見された。
【００１２】
このほど、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる高度に保存された制御機構において二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止することが明らかになった。特許文献１（Ｆｉｒｅら、、）には、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡにより遺伝子の発現が阻害されることが開示されている。また、ｄｓＲＮＡは、植物（たとえば、特許文献２，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、、；および特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚら、、を参照されたい）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（たとえば、非特許文献３を参照されたい）および哺乳動物（特許文献４，Ｌｉｍｍｅｒ；およびＤＥ １０１ ００ ５８６．５，Ｋｒｅｕｔｚｅｒら、、を参照されたい）などの他の生体でも標的ＲＮＡを分解することが示されている。この自然機構は、異常または不必要な遺伝子制御により引き起こされる障害を処置する新しいクラスの医薬剤の開発するうえでこのところ注目されるようになった。
【００１３】
特許文献５には、ＨＰＶ感染が原因の疾患を処置する核酸ベースの薬物開発のこれまでの取り組みが開示されている。この公報は、細胞ベースの系でＨＰＶ複製を阻害するＨＰＶ ｍＲＮＡに対する２つのｓｉＲＮＡについて報告するものである。関連の刊行物は非特許文献４に掲載されている。
【００１４】
ＲＮＡｉの分野が著しく進歩し、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の処置に進歩は見られるものの、ＨＰＶ感染の進行を阻害し、ＨＰＶ感染に関連する疾患を処置できる薬が依然として求められている。こうした薬は全体として広範な遺伝子型多様性を示すハイリスクＨＰＶサブタイプをすべて阻害するように設計する必要があるため、この課題は一層困難なものになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／００８５７３号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ−Ｕ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００５）３２８：Ｓｌ−Ｓ６
【非特許文献２】Ｍｕｎｏｚ，Ｎ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００３）３４８（６）：５１８−２７
【非特許文献３】Ｙａｎｇ，Ｄ．，ら、，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００
【非特許文献４】Ｊｉａｎｇ，Ｍ．ら、Ｎ．Ａ．Ｒ．（２００５）３３（１８）：ｅｌ５１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＨＰＶの繁殖に必須な遺伝子の発現をサイレンシングする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＨＰＶ感染に関連する疾患の処置の問題に対する解決法を提供する。ＨＰＶが増殖するのに必要なヒト宿主種の保存された遺伝子にはＥ６ＡＰがある。
【００１８】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、このｄｓＲＮＡを用いて細胞または哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法とを提供する。本発明はまた、子宮頸癌および性器（ｇｅｎｔｉａｌ）疣贅のＨＰＶ感染に関連するＥ６ＡＰ遺伝子の発現により引き起こされる病態および疾患を処置する組成物および方法も提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＥ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を持つＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。このｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、この相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。
【００２０】
たとえば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列からなってもよく、第２の配列も表１のアンチセンス配列からなる群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は天然のヌクレオチドからなってもよいし、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオアート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチドなどの少なくとも１個の修飾ヌクレオチドからなってもよい。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドの群から選択されてもよい。通常、こうした修飾配列は、表１のセンス配列からなる群から選択される前記ｄｓＲＮＡの第１の配列および表１のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づく。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＲＮＡの１種を含む細胞を提供する。この細胞は通常、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、生体、通常はヒト被験者のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する医薬組成物であって、本発明のｄｓＲＮＡの１種または複数種および薬学的に許容されるキャリアまたは送達ビヒクルを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法であって、
（ａ）相互に相補的である少なくとも２個の配列を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入する。このｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する工程；および
（ｂ）工程（ａ）で作製した細胞を、Ｅ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解するのに十分な時間維持し、それにより細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程、たとえば、癌または性器（ｇｅｎｔｉａｌ）疣贅を処置、予防または管理する方法であって、こうした処置、予防または管理を必要とする患者に治療有効量または予防有効量の本発明のｄｓＲＮＡの１種または複数種を投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターであって、本発明のＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む、ベクターを提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターを含む細胞を提供する。このベクターは、本発明のＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む。
【００２７】
（図面の簡単な説明）
図面はない
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ＨＰＶ増殖に必須な遺伝子の発現をサイレンシングする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ＨＰＶ感染に関連する疾患の処置の問題に対する解決法を提供する。特に、本発明のｄｓＲＮＡは、ＨＰＶが増殖するのに必要なヒト宿主種の保存された遺伝子、ヒトＥ６ＡＰ遺伝子をサイレンシングする。本明細書では、こうした遺伝子をＨＰＶ標的遺伝子と総称する場合がある。
【００２９】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、そのｄｓＲＮＡを用いて細胞または哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法とを提供する。本発明はまた、ＨＰＶ感染に関連するＥ６ＡＰ遺伝子の発現により引き起こされる哺乳動物の病態および疾患をｄｓＲＮＡを用いて処置する組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導する。
【００３０】
本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＨＰＶ標的ｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を持つ、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。こうしたｄｓＲＮＡを用いることで、哺乳動物のＨＰＶの複製および／または維持に関係する遺伝子のｍＲＮＡの標的分解が可能になる。本発明者らは、細胞ベースおよび動物ベースのアッセイを用いて、こうしたｄｓＲＮＡがごく少量の投薬量で特異的かつ効率的にＲＮＡｉを誘発し、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を顕著に阻害することを明らかにした。したがって、こうしたｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、ＨＰＶの生活環に関与する宿主因子遺伝子を標的とし、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程を処置するのに有用である。
【００３１】
ＨＰＶ標的であるＨＰＶ Ｅ１、Ｅ６、ヒトＥ６ＡＰの説明
ヒト宿主の細胞のユビキチンリガーゼＥ６ＡＰは、ウイルスのＥ６タンパク質と複合体を形成することでＨＰＶ、特に組み込まれた（非エピソームの）形のＨＰＶの複製に関与している。Ｅ６は、細胞増殖経路を調節する多くのタンパク質に結合し、その分解を誘発する場合が多い（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｏ．ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｓ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２８：３３７−３４８）。Ｅ６はＥ６ＡＰと複合体を形成し、腫瘍抑制因子ｐ５３を標的として分解する（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ら、，１９９０．Ｃｅｌｌ．６３：１１２９−１１３６；ａｎｄ Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ら、，１９９３．Ｃｅｌｌ ７５：４９５−５０５）。このウイルスは、ｐ５３を不活化することで、ｐ５３による感染細胞のアポトーシスを妨げ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ａｎｄ Ｋｒｉｓｈｎａ，２００３）、本来ならばｐ５３により阻止されるウイルスのＤＮＡの複製を促す（Ｌｅｐｉｋ，Ｄ．ら、１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６８２２−６８３１）ばかりでなく、ゲノムの完全性に対するｐ５３による制御を低下させることで腫瘍形成を促進する（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．ら、１９９９．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１８：７６９０−７７００）。
【００３２】
Ｅ１およびＥ６はいずれも、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，ｐｐ．９４７−９７８，ｉｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．Ｂｅｒｎａｒｄ Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６にかなり詳細に記載されている。Ｅ１ ＯＲＦは、プラスミドＤＮＡ複製に必須な６８〜７６ｋＤタンパク質をコードする。全長Ｅ１産物は、ＢＰＶ１のＬＣＲの複製起点に結合するリン酸化核タンパク質である。また、Ｅ１については、ＡＴＰ結合することと、Ｅ２転写トランス活性化因子（Ｅ２ＴＡ：Ｅ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）と呼ばれる全長Ｅ２タンパク質にインビトロで結合することでウイルスの転写を促進することも明らかになっている。Ｅ２への結合により、ＤＮＡ複製起点に対するＥ１の親和性も強まる。ＨＰＶ−１６では、Ｅ１は不死化に対して間接的な作用を及ぼしている。
【００３３】
Ｅ６は、約１６〜１９ｋＤの塩基性の小さな細胞トランスフォーミングタンパク質（たとえば、ＨＰＶ１６のＥ６は、１５１アミノ酸を含む）であり、核マトリックスおよび非核性膜画分に局在する。Ｅ６遺伝子産物は、４つのＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを含むことから亜鉛と結合する可能性が示唆され、さらに核酸結合タンパク質として働く可能性もある。ＨＰＶ−１６などのハイリスクＨＰＶでは、Ｅ６およびＥ７タンパク質は、宿主の扁平上皮細胞を不死化するのに必要かつ十分である。ハイリスクＨＰＶのＥ６遺伝子産物は、ｐ５３と複合体を形成し、その分解を促進する。
【００３４】
以下の詳細な説明は、本ｄｓＲＮＡと、ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む組成物との製造方法および使用方法と、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患および障害、たとえば、子宮頸癌および性器疣贅を処置する組成物および方法とを開示する。本発明の医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、通常１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＨＰＶ標的遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を持つｄｓＲＮＡと共に薬学的に許容されるキャリアを含む。本発明の一実施形態は、医薬製剤中で組み合わせて、任意に別々のＨＰＶ標的遺伝子を標的とする複数種のｄｓＲＮＡを使用する。
【００３５】
したがって、本発明のある種の態様は、本発明のｄｓＲＮＡと共に薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物と、１個または複数個のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する組成物の使用方法と、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を処置する医薬組成物の使用方法とを提供する。
【００３６】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用するいくつかの用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の箇所における用語の使用法とこのセクションに示す定義との間に明らかな矛盾がある場合、このセクションの定義が優先するものとする。
【００３７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は通常それぞれ塩基として、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを含むヌクレオチドを表す。一方、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という語は、以下に詳述するような修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指す場合があることが理解されよう。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分で置き換えても、その置換部分を持つヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性が実質的に変化しない場合があることをよく知っている。たとえば、以下に限定されるものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合できる。このため、本発明のヌクレオチド配列では、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドを、たとえば、イノシンを含むヌクレオチドと置き換えてもよい。こうした置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「Ｅ６ＡＰ」とは、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６結合タンパク質すなわちＥ６ＡＰともいう）遺伝子またはタンパク質をいう。異なるアイソフォームを示すＥ６ＡＰのヒトｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３０８３８．１、ＮＭ＿１３０８３９．１およびＮＭ＿０００４６２．２として提供される。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「Ｅ１」とは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ヌクレオチド８６５〜２８１３）をいう。本明細書で使用する場合、「Ｅ６」とは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１５２６、ヌクレオチド６５〜５５９）をいう。Ｅ１およびＥ６遺伝子の変異体も一般に多く開示されている。これらおよび今後公表されるＥ１およびＥ６遺伝子変異体は、「Ｅ１」および「Ｅ６」を使用することで、文脈に合わない場合を除き、本明細書に含まれるものとする。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなど、ＨＰＶ標的遺伝子の１個の転写の過程で形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分をいう。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「配列を含む鎖」という語は、ヌクレオチドの標準的な命名法で命名される配列により記載されるヌクレオチドの鎖（ｃｈａｉｎ）を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００４２】
本明細書で使用する場合、他に記載がない限り、「相補的」という語は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との関係の説明に使用する場合、当業者であれば理解するように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、何らかの条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成できることをいう。そうした条件は、たとえば、ストリンジェントな条件であってもよく、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後の洗浄が挙げられる。生体内で見られることがある生理的に適切な条件などの他の条件を用いてもよい。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に応じて、２個の配列の相補性テストに最適な一連の条件を決定することができる。
【００４３】
「相補的」には、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合が含まれる。本明細書では、こうした配列を相互に「完全に相補的」という場合がある。これに対し、本明細書で第１の配列を第２の配列に対して「実質的に相補的」という場合、２つの配列は、完全に相補的であってもよいし、最終用途に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持していれば、ハイブリダイゼーション時に１つまたは複数、ただし、通常は４、３または２以下のミスマッチ塩基対が形成されてもよい。一方、ハイブリダイゼーション時に２個のオリゴヌクレオチドを１つまたは複数の一本鎖オーバーハングが形成されるように設計する場合、こうしたオーバーハングは相補性の判定の際にミスマッチと見なさないものとする。たとえば、一方が２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、他方が２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであるｄｓＲＮＡにおいて、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、本発明では、やはり「完全に相補的」という場合がある。
【００４４】
さらに、本明細書で使用する場合、「相補的」配列は、ハイブリダイズの能力に関する上記の要件を満たす限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよいし、完全にそうした塩基対から形成されていてもよい。
【００４５】
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」という語は、使用された文脈から分かるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用する場合がある。
【００４６】
本明細書で使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」であるポリヌクレオチドとは、目的の（たとえば、Ｅ６ＡＰをコードする）ｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドをいう。たとえば、ポリヌクレオチドは、その配列がＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの連続部分と実質的に相補的である場合、Ｅ６ＡＰのｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【００４７】
「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という語は、本明細書で使用する場合、逆平行で、かつ上記で定義したような実質的に相補的な核酸鎖を２本含む二本鎖構造を持つリボ核酸分子の複合体をいう。二本鎖構造を形成している２本の鎖は、より大きな１個のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子である場合、文献ではそうしたｄｓＲＮＡをしばしばｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」）と呼んでいる。この２本の鎖がより大きな１個の分子の一部であるため、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖（ｃｈａｉｎ）で連結されている場合、連結されたＲＮＡ鎖（ｃｈａｉｎ）は「ヘアピンループ」、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖（ｃｈａｉｎ）以外の手段により２本の鎖が共有結合で連結されている場合、この連結構造を「リンカー」という。ＲＮＡの各鎖は、ヌクレオチドの数が同じでも、異なってもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチド数から二本鎖に存在する任意のオーバーハング数を引いた数である。ｄｓＲＮＡは、二本鎖構造に加えて、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。さらに、本明細書で使用する場合、「ｄｓＲＮＡ」は、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよびコンジュゲート部分の化学修飾を含めて、複数のヌクレオチドの実質的な修飾および本明細書に開示されているか、または当該技術分野において公知のすべてのタイプの修飾を含んでもよい。本明細書および特許請求の範囲では、ｓｉＲＮＡタイプの分子に用いられるこうした任意の修飾は「ｄｓＲＮＡ」により包含される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、不対ヌクレオチドをいうか、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長またはその逆であるとき、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出したヌクレオチドをいう。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡの末端に不対ヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、全長にわたり二本鎖であるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。分かりやすくするため、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを持つかどうか、あるいは、平滑末端であるかどうかを判断する際にｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端にコンジュゲートされた化学キャップまたは非ヌクレオチドの化学部分については考慮しない。
【００４９】
「アンチセンス鎖」という語は、標的配列と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖をいう。本明細書で使用する場合、「相補性領域」という語は、配列、たとえば、本明細書に定義するような標的配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域をいう。相補性領域が標的配列と完全には相補的でない場合、ミスマッチが最も認められるのは末端領域であり、存在する場合は、たとえば、５’および／または３’終端から６、５、４、３または２ヌクレオチドのような末端領域（単数または複数）内にあるのが一般的である。
【００５０】
「センス鎖」という語は、本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖をいう。
【００５１】
ｄｓＲＮＡについていう場合、「細胞に導入する」とは、当業者が理解するとおり、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、細胞の受動拡散プロセスまたは能動的プロセスにより、あるいは、助剤または装置により行うことができる。「細胞に導入する」とは、インビトロでの細胞に限定されるものではなく、ｄｓＲＮＡを、生体の一部を構成している「細胞に導入」してもよい。こうした場合、細胞への導入には、生体への送達が含まれる。たとえば、インビボでの送達では、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射しても、全身投与してもよい。インビトロで細胞に導入するには、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなど当該技術分野において公知の方法がある。
【００５２】
本明細書では、ＨＰＶ標的遺伝子について言及している場合、「発現をサイレンシングする」および「阻害する」という語は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の少なくとも一部を抑制することをいう。転写の抑制については、ＨＰＶ標的遺伝子は転写されるが、そのＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するように処置してある第１の細胞または細胞群から単離できるＨＰＶ標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そうした処置をしていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して減少していることで確認される。阻害の程度は、一般に以下の式で表される。
【００５３】
【数１】
あるいは、たとえば、細胞から分泌されるＨＰＶ標的遺伝子がコードするタンパク質の量または、たとえば、アポトーシスのようなある種の表現型を示す細胞数など、ＨＰＶ標的遺伝子の転写と機能的に関連するパラメーターの低下により阻害の程度を示してもよい。原則として、構成的に発現しても、ゲノム工学により発現してもこの標的を発現する任意の細胞を用いて、任意の適切なアッセイによりＨＰＶ標的遺伝子サイレンシングを判定してもよい。ただし、あるｄｓＲＮＡがＨＰＶ標的遺伝子の発現をある程度阻害し、そのため本発明に包含されるかどうかを判定するため基準が必要である場合、以下の実施例に記載するアッセイがこうした基準として役に立つ。
【００５４】
たとえば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子の発現は少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される場合がある。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子は少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によりＥ６ＡＰ遺伝子は少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。表２は、様々なＥ６ＡＰ ｄｓＲＮＡ分子を種々の濃度で用いたインビトロアッセイから得られた転写阻害の広範な値を示す。
【００５５】
「処置する」、「処置」および同種の語は、本明細書においてＨＰＶ感染の文脈で使用する場合、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程が軽減または緩和することをいう。処置という場合、ＨＰＶ感染を予防または防止し、ＨＰＶ感染により引き起こされる症状または病的変化を軽減する本発明の治療薬の使用を含む。本発明の文脈では、本明細書で以下に記載する他の（ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程以外の）症候に関係する場合、「処置する」、「処置」および同種のという語は、そうした症候に関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和したり、そうした症候を遅延または回復させたりすることを意味する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程またはＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の明確な症状の処置、予防または管理に際し、治療上の有益性を与える量をいう。治療効果のある具体的な量は、一般の開業医が容易に判定できるものであるが、たとえば、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程のタイプ、患者の病歴および年齢、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の段階ならびに他の治療剤の投与など、当該技術分野において公知の要因によって異なる場合がある。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む。本明細書で使用する場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、所期の薬理学的結果、治療結果または予防結果を得るのに有効なｄｓＲＮＡの量をいう。たとえば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメーターが少なくとも２５％低下したときにその臨床処置が有効と見なされる場合、その疾患または障害を処置する薬剤の治療有効量は、パラメーターを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。
【００５８】
「薬学的に許容されるキャリア」という語は、治療薬の投与のためのキャリアをいう。そうしたキャリアとして、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。ただし、細胞培地は、薬学的に許容されるキャリアとして使用しない。経口投与用の薬剤の薬学的に許容されるキャリアとして、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤があるが、これに限定されるものではない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウムおよびラクトースがあり、好適な崩壊剤にはコーンスターチおよびアルギン酸がある。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含めてもよく、潤滑剤が存在する場合はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。錠剤については、胃腸管での吸収を遅延させるため必要に応じてグリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの材料でコーティングしてもよい。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現できるベクターを導入してある細胞である。
【００６０】
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ｄｓＲＮＡはＨＰＶ標的遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性領域を含有するアンチセンス鎖を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、通常は１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつ前記ｄｓＲＮＡは前記ＨＰＶ標的遺伝子を発現している細胞と接触すると、前記ＨＰＶ標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％または４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００６１】
このｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列と実質的に相補的であり、通常完全に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖と相補的な領域を含むため、好適な条件下で組み合わせられたとき、２本の鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する。二本鎖構造は、一般的には１５〜３０塩基対長、より一般的には１８〜２５塩基対長、なおより一般的には１９〜２４塩基対長、最も一般的には１９〜２１塩基対長である。同様に、標的配列の相補性領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、より一般的には１８〜２５ヌクレオチド長、なおより一般的には１９〜２４ヌクレオチド長、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（単数または複数）をさらに含んでもよい。このｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察される当該技術分野において公知の標準的な方法により、たとえば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような自動ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。好ましい実施形態では、ＨＰＶ標的遺伝子はヒトＥ６ＡＰ遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１のセンス配列から選択される鎖および表１のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。表１に記載する標的配列内の他のところを標的とする別のアンチセンス薬については、標的配列およびＥ６ＡＰフランキング配列を用いて容易に決定することができる。
【００６２】
さらなる実施形態では、このｄｓＲＮＡは、表１に記載の配列の群から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２個の配列を含み、少なくとも２個の配列の１個が少なくとも２個の配列のもう１個の配列と相補的であり、かつ少なくとも２個の配列の１個はＥ６ＡＰ遺伝子の発現の際に産生されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。ｄｓＲＮＡは通常、一方のオリゴヌクレオチドが表１にセンス鎖として記載され、他方のオリゴヌクレオチドが表１にアンチセンス鎖として記載される、２個のオリゴヌクレオチドを含む。表１は、好ましいｄｓＲＮＡごとに二本鎖の名称および配列ＩＤ番号を示す。
【００６３】
当業者であれば、２０〜２３塩基対、とりわけ２１塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘導に特に効果があるとして注目されていることをよく知っている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、、，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。一方で、それより短いｄｓＲＮＡも長いｄｓＲＮＡも効果的である場合があることも分かっている。上述の実施形態では、表１に記載のオリゴヌクレオチド配列の性質により、本発明のｄｓＲＮＡは長さが最低２１ｎｔの少なくとも１本の鎖を含んでもよい。表１の配列の１つから一方または両方の末端のヌクレオチドをわずか数個除いた配列を含む短いｄｓＲＮＡも、上記のようなｄｓＲＮＡと同様に効果的である場合があると予想することは合理的といえる。このため、表１の配列の１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列を含み、かつＦＡＣＳアッセイまたは本明細書で以下に記載する他のアッセイでＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する能力の変化率が完全な配列を含むｄｓＲＮＡと比べて５、１０、１５、２０、２５または３０％以下であるｄｓＲＮＡを、本発明は意図している。さらに、表１に記載の標的配列内で切断するｄｓＲＮＡについては、参照配列および記載の標的配列を用いて容易に製造することができる。
【００６４】
さらに、表１に記載のＲＮＡｉ薬は、ＲＮＡｉにより切断されやすい各ＨＰＶ標的のｍＲＮＡ内の部位も同定する。このため、本発明は、本発明の薬の１つが標的とする配列内で標的するＲＮＡｉ薬をさらに含む。本明細書で使用する場合、第２のＲＮＡｉ薬が第１のＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖と相補的なｍＲＮＡ内で任意のメッセージを切断する場合、第２のＲＮＡｉ薬は第１のＲＮＡｉ薬の配列内で標的するという。こうした第２の薬は通常、表１に記載の配列の１つの連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを、ＨＰＶ標的遺伝子から選択した配列に連続する領域から抽出した新たなヌクレオチド配列と結合してなるものである。たとえば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチド（付加したＡＡ配列を除く）を標的Ｅ６ＡＰ遺伝子の６ヌクレオチドの隣りに組み合わせて、表１に記載の配列の１つに基づく２１ヌクレオチドの一本鎖薬を作製する。
【００６５】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つまたは複数のミスマッチを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが含むミスマッチは３以下である。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性領域の中央に位置していないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチが、たとえば、相補性領域の５’あるいは３’末端から５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチドなど、どちらの末端からも５ヌクレオチドまでに含まれることが好ましい。たとえば、ＨＰＶ標的遺伝子の領域と相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは通常、中央よりの１３ヌクレオチド内にミスマッチをまったく含まない。標的配列に対してミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害に有効であるかどうかを判定するには、本発明内に記載する方法を用いてもよい。ＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害においてミスマッチを含むｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、ＨＰＶ標的遺伝子の特定の相補性領域が、ウイルス（Ｅ１またはＥ６）あるいはヒト集団（Ｅ６ＡＰ）において多型性配列変異を含むことが分かっている場合に特に重要である。
【００６６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には１〜４ヌクレオチド、通常は１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングがある。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むｄｓＲＮＡは、平滑末端のｄｓＲＮＡよりも予想外に優れた阻害特性を持っている。さらに、本発明者らは、ヌクレオチドオーバーハングが１つだけ存在する場合、全体の安定性に影響を与えることなくｄｓＲＮＡの干渉活性が増強されることも発見した。オーバーハングが１つだけのｄｓＲＮＡは、インビボだけでなく種々の細胞、細胞培地、血液および血清で特に安定かつ有効であることが証明された。通常、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３末端、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。また、本ｄｓＲＮＡは平滑末端を含んでもよく、通常はアンチセンス鎖の５’末端に位置する。こうしたｄｓＲＮＡは安定性および阻害活性が向上しているため、少量の投薬量、すなわち、５ｍｇ／ｋｇ被投与者体重未満での投与が可能になる。通常、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングがあり、５’末端は、平滑末端である。別の実施形態では、オーバーハングの１つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスファートで置き換えられている。
【００６７】
なお別の実施形態では、ｄｓＲＮＡを化学修飾して安定性を高める。本発明の核酸については、参照によって本明細書に援用する「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら、（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような当該技術分野で十分に確立している方法により合成および／または修飾してもよい。化学修飾としては、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖（ｃｈａｉｎ）への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学部分への共有結合およびヌクレオチド間のホスファート結合からチオホスファートなどの別の結合への置換が挙げられるが、これに限定されるものではない。こうした修飾を複数用いても構わない。
【００６８】
２本のｄｓＲＮＡ鎖は、たとえば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用；金属イオンの配位またはプリンアナログの使用によるなど、種々のよく知られた技法により化学的に結合させることができる。一般に、ｄｓＲＮＡの修飾に使用できる化学基として、以下に限定されるものではないが、メチレンブルー；二官能基、通常はビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。一実施形態では、リンカーはヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、固相合成によりｄｓＲＮＡを作製し、標準的な方法に従いヘキサ−エチレングリコールリンカーを導入する（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：１４６６５−１４６７０を参照）。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端を、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に結合させる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端の化学結合は通常、三重らせん結合により形成される。表１は、本発明の修飾ＲＮＡｉ薬の例を示す。
【００６９】
なお別の実施形態では、２本の単鎖の一方または両方のヌクレオチドを修飾して、たとえば、以下に限定されるものではないが、ある種のヌクレアーゼなどの細胞酵素の分解活性を予防または阻害してもよい。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害する技法は、当該技術分野において公知であり、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非電荷の骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホルアミダートがあるが、これに限定されるものではない（たとえば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１：１１１６−８を参照されたい）。したがって、ｄｓＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基は、化学基、通常は２’−アミノまたは２’−メチル基により置き換えられている。また、少なくとも１個のヌクレオチドを修飾してロックドヌクレオチドを形成してもよい。こうしたロックドヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素とを連結するメチレン架橋を含む。ロックドヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドについては、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ら、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０）ａｎｄ Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４）に記載されている。ロックドヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入すると、相補配列に対する親和性が向上し、融解温度が数度上昇する（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１−７）。
【００７０】
リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすると、細胞吸収のほか、特定組織への標的化または膣上皮などの特異的な細胞型による取り込みを高めることができる。場合によっては、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートして細胞膜の直接浸透を促進する。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートするリガンドは、受容体介在性エンドサイトーシスの基質である。こうしたアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ薬の細胞透過を促進するために使用されている。たとえば、コレステロールは、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、非コンジュゲートアナログと比較して化合物の活性が実質的に高まる。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてきた他の親油性化合物として、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロールおよびメントールが挙げられる。受容体介在性エンドサイトーシスのためのリガンドの一例として葉酸がある。葉酸は、ホラート受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞に入る。葉酸を含むｄｓＲＮＡ化合物であれば、ホラート受容体介在性エンドサイトーシスを介して効率的に細胞に輸送されると考えられる。Ｌｉおよび共同研究者は、オリゴヌクレオチドの３’終端に葉酸が結合すると、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みが８倍増加することを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，７５，１５４０を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他のリガンドには、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲートおよび送達ペプチドがある。
【００７１】
オリゴヌクレオチドにカチオン性リガンドをコンジュゲートすると、ヌクレアーゼに対する耐性が高まる場合がある。カチオン性リガンドの代表的な例として、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムが挙げられる。興味深いことに、カチオン性リガンドをオリゴヌクレオチド全体に分散させると、アンチセンスオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに対して高い結合親和性を保持すること報告された。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２，１２，１０３およびその参考文献を参照されたい。
【００７２】
本発明のリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡに対する連結分子の結合から得られるように、ペンダント反応性官能基を含むｄｓＲＮＡを用いて合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドについては、種々の保護基のいずれかを含む合成リガンドまたは連結部分を持つリガンドなど、市販のリガンドと直接反応させてもよい。本発明の方法を用いれば、リガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡを合成しやすくなる。その際、いくつかの好ましい実施形態では、リガンドに適切にコンジュゲートされていて、固体支持体材料にさらに結合できるヌクレオシドモノマーを用いる。この任意に固体支持体材料に結合したリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートについては、選択した血清結合リガンドとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に位置する連結部分との反応を介して、本発明の方法のいくつかのましい実施形態に従い調製する。場合によっては、ｄｓＲＮＡの３’終端に結合したアラルキルリガンドを含むｄｓＲＮＡを調製するには、最初に長鎖（ｃｈａｉｎ）アミノアルキル基を介してモノマー構成要素をコントロールドポアガラス支持体に共有結合させる。次いで標準的な固相合成法により、ヌクレオチドを、固体支持体に結合したモノマー構成要素に結合させる。モノマー構成要素はヌクレオシドでも、固相合成と相性がよい他の有機化合物でもよい。
【００７３】
本発明のコンジュゲートに使用するｄｓＲＮＡは、よく知られた固相合成法により手軽に日常的に作製することができる。その合成用の機器は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）など、複数のベンダーから販売されている。これに加えて、あるいはその代わりに、当該技術分野において公知の任意の他の合成手段を用いてもよい。ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製する類似の技法も知られている。
【００７４】
個々の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許：ポリアミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルリン結合を持つオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーに注目した米国特許第５，２１２，２９５号；修飾骨格を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；骨格修飾オリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによりその調製に注目した米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成方法に注目した米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に注目した米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を持つオリゴヌクレオチドを調製するプロセスに注目した米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に注目した米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチド合成のための方法および材料に注目した米国特許第５，５７１，９０２号；ヌクレオシドの様々な位置のいずれかに結合した、他の部分に対するリンカーとして使用できるアルキルチオ基を持つヌクレオシドに注目した米国特許第５，５７８，７１８号；キラル純度の高いホスホロチオアート結合を持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物などの関連化合物を調製するプロセスに注目した米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを持つオリゴヌクレオチドに注目した米国特許第５，５８７，４７０号；どちらもコンジュゲート４’−デスメチルヌクレオシドアナログに注目した米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；骨格修飾オリゴヌクレオチドアナログに注目した米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に特に注目した米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号で確認することができる。
【００７５】
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを含むリガンドコンジュゲートｄｓＲＮＡおよびリガンド分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準的なヌクレオチド前駆体もしくはヌクレオシド前駆体または結合部分をすでに含んでいるヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに含んでいるリガンドヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドのリガンド含有構成要素を用いて好適なＤＮＡ合成機により構築できる。
【００７６】
結合部分をすでに含むヌクレオチドコンジュゲート前駆体を使用する場合、一般に配列特異的結合ヌクレオシドを合成しておき、次いで結合部分とリガンド分子を反応させ、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子などの種々の分子を含むオリゴヌクレオチドコンジュゲートについては、以前に記載されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，国際公開第９３／０７８８３号を参照されたい）。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドを、リガンドヌクレオシドコンジュゲートから得られたホスホラミダイトに加えて、標準的なホスホラミダイトおよび市販されていてオリゴヌクレオチド合成で日常的に使用される非標準のホスホラミダイトを用いて自動合成機により合成する。
【００７７】
２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基をオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに導入すると、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性が向上する。さらに、ホスホロチオアート骨格を含むオリゴヌクレオチドでは、ヌクレアーゼ安定性が高まる。このため、ホスホロチオアート骨格または２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基もしく２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか、あるいはその両方を含ませて、本発明の機能性結合ヌクレオシドを強化することができる。当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド修飾に関する概要リストについては、たとえば、国際公開第２００３７０９１８号に一部掲載されている。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ合成機を用いて、５’終端にアミノ基を持つ本発明の機能性ヌクレオシド配列を調製し、次いで選択したリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は、当業者によく知られている。代表的な活性エステルとして、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、結合基を介して選択したリガンドが５’位に結合したオリゴヌクレオチドが生成される。５’終端のアミノ基は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を用いて調製することができる。一実施形態では、リガンドヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、リガンド分子を５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。その際、リガンドは、直接的に、あるいは、リンカーを介して間接的に５’ヒドロキシ基に結合する。自動合成手順の最後でこうしたリガンドヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、５’終端にリガンドを含むリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを得るのが一般的である。
【００７９】
修飾ヌクレオシド間結合または骨格の例として、たとえば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートなどのメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートなどのホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の３’−５’結合を持つボラノホスファート、これらの２’−５’結合アナログならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を持つアナログが挙げられる。さらに、様々な塩形、混合塩形および遊離酸形も含まれる。
【００８０】
上記のリン原子含有結合体の調製に関する代表的な米国特許には、各々を参照によって本明細書に援用する米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，６９７，２４８号があるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間結合または骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖（ｃｈａｉｎ）アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合または１個もしくは複数個の短鎖（ｃｈａｉｎ）ヘテロ原子または複素環の糖間結合により形成される骨格を持っている。こうした骨格として、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を含む骨格；シロキサン骨格；硫化物骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を持つ前述以外の骨格が挙げられる。
【００８２】
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する代表的な米国特許として、各々を参照によって本明細書に援用する米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号があるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
場合によっては、オリゴヌクレオチドを非リガンド基で修飾してもよい。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを高めるため、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている非リガンド分子は多くあり、そうしたコンジュゲーションを行う手順は科学文献に示されている。このような非リガンド部分として、コレステロールなどの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、、，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖（ｃｈａｉｎ）、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、、，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１ １；Ｋａｂａｎｏｖら、、，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、、，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａら、、，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（ｃｈａｉｎ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、、，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、、，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、、，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が挙げられる。こうしたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は上述した。典型的なコンジュゲーションプロトコルでは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを含むオリゴヌクレオチドの合成を行う。次いでこのアミノ基をコンジュゲーション対象の分子と、適当なカップリング試薬または活性化試薬を用いて反応させる。コンジュゲーション反応に関しては、固体支持体に結合したままのオリゴヌクレオチドで行っても、オリゴヌクレオチドを溶液相で切断してから行ってもよい。一般に、ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドコンジュゲートを精製すると、純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートを用いると、ＨＰＶ感染の部位である膣上皮細胞の標的化が高まる場合があるため、特に好ましい。
【００８４】
本開示では、ＨＰＶ標的遺伝子をサイレンシングするため、ＨＰＶ関連障害の処置に有用なｄｓＲＮＡの種々の実施形態が記載されている。個々の治療薬の設計は様々な形をとる場合があるが、何らかの機能上の特徴により好ましいｄｓＲＮＡとそうでないｄｓＲＮＡとに分けられる。特に、良好な血清安定性、高度の活性、免疫応答のないこと、および優れた薬剤に似た挙動など、当業者により測定可能なあらゆる特徴を検査して、本発明の好ましいｄｓＲＮＡを同定する。状況によっては、好ましいｄｓＲＮＡにこうした機能的側面がすべて含まれているとは限らない。しかし、当業者であれば、こうした評価項目などを最適化し、本発明の好ましい化合物を選択することができる。
【００８５】
ヌクレオチドには多くの修飾が可能であるが、本発明者らは、薬理学的有益性、免疫学的な有益性および最終的な治療上の有益性を著しく高める化学修飾のパターンを特定した。表３は、表１に記載の本発明の二本鎖ｄｓＲＮＡに使用できる好ましい化学修飾のパターンを示す。
【００８６】
【表３−１】
【００８７】
【表３−２】
ＲＮＡｉ薬をコードするベクター
また、本発明のｄｓＲＮＡは、インビボで細胞内の組換えウイルスベクターから発現させてもよい。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列およびｄｓＲＮＡ配列を発現する好適な任意のプロモーターを含む。好適なプロモーターとして、たとえば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。これ以外の好適なプロモーターに何を選択するかは、当該技術分野の技術の範囲内にある。また、本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境でｄｓＲＮＡを発現させるための誘導性プロモーターまたは調節可能なプロモーターをさらに含んでもよい。インビボで本発明のｄｓＲＮＡを細胞へ送達する組換えウイルスベクターの使用については、以下に詳細に考察されている。
【００８８】
本発明のｄｓＲＮＡは、組換えウイルスベクターから別々の２個の相補的ＲＮＡ分子として発現させても、２つの相補的領域を含む１個のＲＮＡ分子として発現させてもよい。
【００８９】
発現対象のｄｓＲＮＡ分子（単数または複数）のコード配列を組み込めるのであればどのウイルスベクターを用いてもよく、たとえば、アデノウイルス（ＡＶ：ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）；レトロウイルス（レンチウイルス（ＬＶ：ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）；疱疹ウイルスおよび同種のもの由来のベクターがある。ウイルスベクターのトロピズムについては、必要に応じてエンベロープタンパク質または他のウイルスの別の表面抗原でベクターをシュードタイプ化するか、または様々なウイルスカプシドタンパク質を置換して改変することができる。
【００９０】
たとえば、本発明のレンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラおよび同種のものの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターを操作してカプシドタンパク質の異なる血清型を発現させて様々な細胞を標的とするように作製してもよい。たとえば、血清型２ゲノム上に血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターをＡＡＶ２／２と呼ぶが、ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子で置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを製造してもよい。カプシドタンパク質の様々な血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技法は、当該技術分野の技術の範囲内にある。たとえば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら、、（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたい。
【００９１】
本発明で使用するのに好適な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡをベクターに発現させるための核酸配列の挿入方法およびウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内にある。たとえば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＤｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０；ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら、、，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたい。
【００９２】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のベクターである。特に好ましい実施形態では、たとえば、Ｕ６もしくはＨ１ＲＮＡプロモーターあるいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターのどちからかを含む組換えＡＡＶベクターから本発明のｄｓＲＮＡを相補的な別々の２個の一本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
【００９３】
本発明のｄｓＲＮＡを発現する好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈら、、（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【００９４】
本発明のｄｓＲＮＡを発現する好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用するＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、、（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら、、（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、、（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許同第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開第９４／１３７８８号；および国際公開第９３／２４６４１号に記載されている。
【００９５】
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載するようなｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程など、ＨＰＶ標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害の処置に有用である。こうした医薬組成物は、送達モードを踏まえて製剤化される。たとえば、組成物を頸部の局所投与用に製剤化したり、非経口送達による全身投与用に製剤化したりする。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する十分な投薬量で投与する。本発明者らは、その効率を高めることで、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を驚くほど少量の投薬量で投与できることを明らかにした。ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害または抑制するには、１日に被投与者体重１キログラム当たりｄｓＲＮＡ５ｍｇの投薬量で十分であり、疣贅または子宮頸部または肛門の処置の場合、感染組織に直接塗布しても構わない。
【００９７】
一般にｄｓＲＮＡの１日の好適な用量は、被投与者の体重１キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲であり、通常は体重１キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲である。本医薬組成物は１日１回の投与でもよいし、あるいはこのｄｓＲＮＡは、適当な間隔をとってその日のうちに２回、３回またはそれ以上の分割用量で、さらには持続注入または膣ゲルの放出制御製剤による送達を用いて投与してもよい。その場合、各分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは、分割数が増えるにつれて少なくする必要がある。たとえば、ｄｓＲＮＡを数日間にわたり徐放する従来の徐放性製剤を用いて、数日間送達できるように投薬量単位を配合してもよい。徐放性製剤は、当該技術分野において周知であり、特に本発明の薬と共に使用できるような薬の経膣送達に有用である。この実施形態では、投薬量単位の１日用量は、徐放性に応じて様々になる。
【００９８】
当業者であれば、以下に限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、これまでの処置、被検体の全体的な健康状態および／または年齢および他の疾患の存在など、何らかの要因により被検体の効果的な処置に必要な投薬量およびタイミングが影響を受ける場合があることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物による被検体の処置は、１回の処置の場合もあれば、何度かの処置になる場合もある。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡの効果的投薬量およびインビボでの半減期については、従来の手法を用いて、あるいは、本明細書の別の箇所で記載するように適当な動物モデルを用いたインビボ試験に基づき推計することができる。
【００９９】
発明者らは、ＨＰＶ遺伝子型の多様性など様々な理由から、本発明の複数種のｄｓＲＮＡを同時に用いてＨＰＶ感染を処置することが望ましいであろうと考える。実施形態の１つでは、ｄｓＲＮＡの混合物の複雑度を最小限に抑えながら最も多くのＨＰＶ遺伝子型が標的となるようにｄｓＲＮＡの組み合わせを選択する。複数タイプのｄｓＲＮＡを含む本発明の医薬組成物は、本明細書に記載するような各投薬量のｄｓＲＮＡを含むことが予想される。
【０１００】
ｄｓＲＮＡの組み合わせについては、単一剤形の医薬組成物として一緒に提供してもよい。あるいは、別々の剤形としてｄｓＲＮＡの組み合わせを提供してもよく、この場合、その組み合わせを同時に投与してもよいし、異なる時間に場合によっては別の手段で投与しても構わない。このため、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの所望の組み合わせを含む医薬組成物を意図しているほか、併用レジメンの一部として提供されることを目的とした単一のｄｓＲＮＡ医薬組成物も意図している。したがって、後者の場合の併用療法剤の発明は、組成物そのものではなく、投与方法になる。
【０１０１】
マウス遺伝学の進歩により、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程など、様々なヒト疾患の研究用に多くのマウスモデルが作製されるようになった。こうしたモデルを用いてｄｓＲＮＡのインビボ検査ばかりでなく、治療有効用量の判定が行われている。
【０１０２】
本発明のｄｓＲＮＡをＨＰＶに感染した細胞を持つ哺乳動物に投与するには任意の方法を用いてよい。たとえば、投与は、局所（たとえば、経膣、経皮など）投与；経口投与；または非経口（たとえば、皮下、脳室内、筋肉内または腹腔内注射または点滴静注）投与であってもよい。投与は、急速投与（たとえば、注射）でもよいし、一定の期間続いても構わない（たとえば、持続注入または持続放出製剤の投与）。
【０１０３】
一般に、ＨＰＶに感染した細胞を持つ哺乳動物を処置する場合、膣ゲルまたはクリームでｄｓＲＮＡ分子を局所投与する。たとえば、リポソームを使用してあるいは使用せずに製剤化したｄｓＲＮＡを、頸部、肛門管または性器疣贅などのＨＰＶ病変部に局所塗布してもよい。局所投与では、無菌および非無菌水溶液、アルコール類などの一般的な溶媒に溶かした非水溶液または液体もしくは固体油基剤中の溶液などの組成物としてｄｓＲＮＡ分子を製剤化してもよい。こうした溶液は、緩衝液、希釈液および他の好適な添加剤をさらに含んでも構わない。局所投与用の組成物については、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤の形態で製剤化することもできる。当該技術分野において公知のポリマーおよび透過剤を用いて、ゲルおよびクリームを製剤化してもよい。子宮頸部キャップ、ペッサリー、コーティングコンドーム、グローブおよび同種のものを用いて、ｄｓＲＮＡおよび関連する賦形剤を含むゲルまたはクリームを頸部に塗布してもよい。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、油性基剤、増粘剤および同種のものを加えても構わない。
【０１０４】
非経口投与、髄膜内投与または脳室内投与の場合、無菌水溶液などの組成物としてｄｓＲＮＡ分子を製剤化することができ、組成物は緩衝液、希釈液および他の好適な添加剤（たとえば、浸透促進剤、キャリア化合物および他の薬学的に許容されるキャリア）をさらに含んでもよい。
【０１０５】
さらに、たとえば、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されているような生物学的または非生物学的手段などの非ウイルス方法を用いて、ＨＰＶ感染細胞を持つ哺乳動物にｄｓＲＮＡ分子を投与することもできる。非生物学的送達は、以下に限定されるものではないが、（１）本明細書に記載のｄｓＲＮＡ酸分子のリポソームへの導入および（２）ｄｓＲＮＡ分子と脂質またはリポソームとの複合体形成による核酸脂質複合体または核酸リポソーム複合体の形成など、様々な方法により行うことができる。リポソームは、インビトロでの細胞のトランスフェクションに一般に使用されるカチオン性脂質および中性脂質で構成されていてもよい。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成（たとえば、電荷による会合）してリポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例として、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクタク、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１，２（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−デイメチル−１−プロパンアミニウム）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３，［Ｎ−Ｎ’，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン）−カルバモイル］コレステロール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０６】
リポソームの形成手順は当該技術分野において周知である。リポソーム組成物は、たとえば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）など、数多くの親油性薬が市販されている。さらに、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰなどの市販されているカチオン性脂質を用いて、全身送達法を最適化することもできる。カチオン性脂質はそれぞれＤＯＰＥまたはコレステロールのような中性脂質と混合してもよい。場合によっては、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、、（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６４７−６５２（１９９７））に記載されているようなリポソームを使用してもよい。他の実施形態では、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンを用いてインビボおよびエキソビボ送達を行うこともできる（Ｂｏｌｅｔｔａら、、，Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１７２８（１９９６））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関する追加情報については、米国特許第６，２７１，３５９号、国際公開第９６／４０９６４号およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ら、２００５．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００２−７で確認することができる。
【０１０７】
ＨＰＶ感染細胞を持つ哺乳動物にｄｓＲＮＡ分子を投与するこれ以外の非ウイルス方法として、（リプソームに加えて）リポプレックスおよびナノエマルジョンなどのカチオン性脂質ベースの送達系が挙げられる。さらに、以下に限定されるものではないが、キトサン、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、デンドリマー（たとえば、ポリアミドアミン（ＰＡＮＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）デンドリマー）およびポロキサミンなどの縮合重合体送達系（すなわち、ＤＮＡポリマー複合体すなわち「ポリプレックス」）を用いてもよい。加えて、以下に限定されるものではないが、ポロキサマー、ゼラチン、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ＰＶＰ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ポリビニルピロリドン）およびＰＶＡ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ：ポリビニルアルコール）などの非縮合重合体送達系を用いてもよい。
【０１０８】
上述の送達または投与法の手順は当該技術分野において周知である。たとえば、縮合重合体送達系は、アニオン性ＤＮＡ分子との複合体形成により容易に利用できる。例として、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）は、負に荷電した細胞表面と相互作用する正に荷電した複合体を形成し、続いて急速にインターナリゼーションを受けることで機能する。
【０１０９】
生物学的送達は、以下に限定されるものではないが、ウイルスベクターの使用などの様々な方法により行うことができる。たとえば、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を皮膚細胞および子宮頸部細胞に送達してもよい。標準的な分子生物学技法を用いれば、核酸を細胞に送達するために以前に開発された多種多様なウイルスベクターの１つに、本明細書に記載の１個または複数個のｄｓＲＮＡを導入することができる。こうして得られたウイルスベクターを用いて、たとえば、感染により１個または複数個のｄｓＲＮＡを細胞に送達できる。
【０１１０】
本発明のｄｓＲＮＡについては、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液中で製剤化できる。「薬学的に許容されるキャリア」（本明細書では「賦形剤」ともいう）とは、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的不活性なビヒクルである。薬学的に許容されるキャリアについては液体でも固体でもよく、所望のバルク特性、稠度特性のほか、適切な輸送特性および化学的特性が得られると考えられる投与形式に合わせて選択すればよい。典型的な薬学的に許容されるキャリアには、限定としてではなく例として、水；食塩水溶液；結合剤（たとえば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）；潤滑剤（たとえば、デンプン、ポリエチレングリコールまたは酢酸ナトリウム）；崩壊薬（たとえば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）がある。
【０１１１】
さらに、ＨＰＶ標的遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡについては、他の分子、分子構造体または核酸の混合物と混合したり、封入したり、コンジュゲートしたり、あるいはその他の方法で結合したりしたｄｓＲＮＡを含む組成物として製剤化してもよい。たとえば、Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とする１種または複数種のｄｓＲＮＡ薬を含む組成物は、抗炎症剤（たとえば、非ステロイド系抗炎症剤およびコルチコステロイド）および抗ウイルス剤（たとえば、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビル）などの他の治療薬を含んでも構わない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＰＶ標的遺伝子と相補的な配列を持つ１個または複数個のｄｓＲＮＡを角質溶解薬と共に含んでもよい。角質溶解薬は、表皮の角質層を剥離または軟化する薬である。角質溶解薬の例として、サリチル酸があるが、これに限定されるものではない。これ以外の例は、米国特許第５，５４３，４１７号に記載されている。角質溶解薬を効果的な量で用いれば、たとえば、皮膚などの組織へのｄｓＲＮＡの浸透を促進することができる。たとえば、角質溶解薬を一定の量で用いれば、性器疣贅に塗布したｄｓＲＮＡを疣贅全体に浸透させることができる。
【０１１２】
こうした化合物の毒性および薬効については、細胞培養または実験動物を用いて、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効用量）を測定する標準的な製剤手順で判定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。治療係数が大きい化合物が好ましい化合物である。
【０１１３】
ヒトに使用する投薬量の範囲を求める（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）には、細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを用いることができる。本発明の組成物の投薬量は通常、ほとんど毒性がないか、まったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量はこの範囲内で、使用する剤形および選択した投与経路によって変わる場合がある。本発明の方法に使用する任意の化合物の治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推計してもよい。細胞培養で判定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状に対する最大作用の５０％を害する被検化合物の濃度）を含む化合物、あるいは、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物が、ある循環血漿中濃度範囲に達する（たとえば、そのポリペプチドの濃度が減少する）ように、動物モデルを用いてを求めてもよい。こうした情報を用いれば、ヒトで有用な用量をより正確に判定することができる。血漿中レベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーで測定してもよい。
【０１１４】
本発明のｄｓＲＮＡは、上記で論じたように１個ずつまたは複数まとめて投与するばかりでなく、ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程の処置に効果があることが分かっている他の薬と組み合わせて投与してもよい。いずれにしても、当該技術分野において公知であるか、本明細書に記載された有効性の標準的な指標を用いて観察された結果に基づき、管理医師はｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０１１５】
ｄｓＲＮＡの組み合わせについては、単独で有効なｄｓＲＮＡを同定したのと同じ方法を用いてインビトロおよびインビボで検査することができる。こうした組み合わせは、最小数で最も広範な遺伝子型をカバーするｓｉＲＮＡを選択する純粋な生物情報学を基礎にして選択してもよい。あるいは、こうした組み合わせを、単一のｄｓＲＮＡ薬に関する本明細書の記載に沿って、インビトロまたはインビボ評価に基づき選択してもよい。ｄｓＲＮＡの組み合わせを検査するのに好ましいアッセイは、ＨＰＶ１６陽性癌細胞株（たとえば、Ｈｅｎｇｓｔｅｒｍａｎｎら、、（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｉｒ．７９（１４）：９２９６；ａｎｄ Ｂｕｔｚら、、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：５９３８に記載のＳｉＨａまたはＣａｓｋｉなど）または、たとえば、Ｊｅｏｎら、、（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｉｒ．６９（５）：２９８９に記載されているような器官型培養系を用いたｓｉＲＮＡによるＨＰＶ標的のノックダウンの表現型を評価するものである。
【０１１６】
本発明者らは、ＨＰＶ感染の処置に使用できるｄｓＲＮＡの好ましい組み合わせをいくつか同定した。ごく一般的に言えば、ｄｓＲＮＡの組み合わせは、表１の中から選択される複数種のｄｓＲＮＡを含む。よって、本発明は、併用療法剤中に表１の中から選択される２、３、４、５またはそれ以上のｄｓＲＮＡ二本鎖の使用を意図している。原則として、治療製品の簡便性のため、ｄｓＲＮＡは最小数にすることが好ましい。このため、有害な、あるいは潜在的に有害なＨＰＶ遺伝子型の最大数をカバーするｄｓＲＮＡを選択しても、実際には、そうしたＨＰＶ遺伝子型をすべてカバーするとは限らない組み合わせを選択せざるを得ない場合もある。
【０１１７】
ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を処置する方法
本明細書に記載の方法および組成物を用いて、臨床症状が見られるあるいは見られないパピローマウイルス感染が原因である可能性があり、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる疾患および症候を処置することができる。本明細書では、こうした疾患および症候を「ＨＰＶ関連障害」または「ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程」という場合があり、たとえば、上皮性悪性腫瘍、皮膚癌（非メラノーマ性またはメラノーマ性）、子宮頸癌などの肛門性器悪性腫瘍、ＨＰＶ関連前癌病変（ＬＳＩＬまたはＨＳＩＬ子宮頸部組織など）、肛門癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性病変、良性病変、乳頭癌腫、乳頭腺嚢腫、神経障害性乳頭腫、乳頭腫症、皮膚および粘膜乳頭腫、コンジローマ、線維芽細胞腫瘍ならびにパピローマウイルスに関連する他の病態が挙げられる。
【０１１８】
たとえば、本明細書に記載の組成物を用いて、ＨＰＶが引き起こす疣贅を処置することができる。こうした疣贅として、たとえば、手掌、足底および爪周囲疣贅などの普通の疣贅（尋常性疣贅）；扁平および糸状疣贅；肛門、口頭、咽頭、喉頭および舌乳頭腫；およびＨＰＶ感染の最も重篤な所見の１つで、性器疣贅とも呼ばれる性病性疣贅（ｃｏｎｄｙｌｏｍａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）（たとえば、陰茎、外陰、膣および子宮頸部疣贅）が挙げられる。ＨＰＶのＤＮＡは子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ Ｉ〜ＩＩＩ）のどの段階でも認められ得るが、子宮頸部上皮内癌ではＨＰＶ型の特定のサブセットが認められる場合がある。したがって、特定のＨＰＶ型を持つ性器疣贅の女性は、子宮頸癌を発症するリスクが高いと考えられる。
【０１１９】
パピローマウイルス感染に関連して最も多く見られる疾患は、良性皮膚疣贅または普通の疣贅である。普通の疣贅には通常、ＨＰＶ１型、２型、３型、４型または１０型が認められる。パピローマウイルスにより引き起こされる他の症候として、たとえば、喉頭の良性上皮性腫瘍である喉頭乳頭腫が挙げられる。喉頭乳頭腫に最も一般的に関連しているのは２つのパピローマウイルス型、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１である。本明細書に記載の組成物を用いてこうした疾患および症候を処置することができる。
【０１２０】
また、本明細書に記載の組成物は、赤みを帯びた小さな斑として現れる散在性の扁平疣贅を特徴とする稀な遺伝的疾患、疣贅状表皮発育異常症（ＥＶ：ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）の処置に用いることもできる。
【０１２１】
さらに、本明細書に記載の組成物を用いて、ＨＰＶが病原体である細胞形質転換に起因する病変の処置、たとえば、子宮頸癌の処置を行うこともできる。
【０１２２】
さらに、本明細書に記載の組成物は、たとえば、陰茎、外陰、子宮頸部、膣 口頭、肛門および咽頭の異形性のようなＨＰＶによる異形性の処置および、たとえば、陰茎、外陰、子宮頸部、膣、肛門、口頭、咽頭および頭頸部の癌のようなＨＰＶによる癌の処置に用いることができる。
【０１２３】
本発明は、従来の任意の化学療法剤など他の抗癌化学療法剤と組み合わせて特定のｄｓＲＮＡを含ませることにより実施してもよい。こうした他の薬と特異的な結合薬とを組み合わせれば、化学療法プロトコルが促進される場合がある。当業者であれば、本発明の方法に組み込むことができる数多くの化学療法プロトコルを思いつくであろう。アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位元素ならびに天然物など、どのような化学療法剤を用いてもよい。たとえば、本発明の化合物を、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリンアナログなどの抗生物質、シクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシルなどのピリミジンアナログ、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソールおよびその天然合成誘導体と合成誘導体ならびに同種のものと共に投与しても構わない。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺腺癌などの混合腫瘍の場合、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と共に本化合物を投与してもよい。他の抗腫瘍薬プロトコルとして、テトラサイクリン化合物と、たとえば、手術、放射線など他の処置方式との併用があり、本明細書ではこれを「補助的抗腫瘍薬方式」ともいう。このように、本発明の方法を前述のような従来のレジメンと併用すれば、副作用の低下および有効性の向上といった効果が得られる。
【０１２４】
あるいはまた、Ｅ６ＡＰを標的とするｄｓＲＮＡを用いて、神経障害および行動障害を処置してもよい。Ｅ６ＡＰは、アンジェルマン症候群の患者でＥ６ＡＰ突然変異が同定されたことで神経障害および行動障害に関係していると言われている。アンジェルマン症候群（ＡＳ：Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とは、精神遅滞、言語障害、過度の笑い、発作、運動失調および特有のＥＥＧパターンを特徴とする、遺伝子刷り込みによる神経行動学的疾患である。（Ｈｉｔｃｈｉｎｓ，Ｍ．Ｐ．ら、２００４．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．１２５（２）：１６７−７２。）こうした症候を挙げることが処置の目的ではないように思われる。それよりも、多くの遺伝的欠損で観察されるように、Ｅ６ＡＰが神経症候および行動症候において重要な役割を果たしているというこの知見から同時に示唆されるものは、この標的がヒトの病的変化において様々な役割を担っている可能性があり、このクラスの他の疾患の好適な標的となることが予想され、Ｅ６ＡＰのサイレンシングにより他の生化学的欠損または疾患が改善されるであろうということである。本明細書で使用する場合、「Ｅ６ＡＰ関連障害」は、上記のＨＰＶ関連障害ならびに他の神経障害および行動障害を含む。
【０１２５】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法
なお別の態様では、本発明は、哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法では、本発明の表１の組成物を哺乳動物に投与して標的Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現をサイレンシングする。本発明のこのｄｓＲＮＡは特異性が高いため、標的Ｅ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシング後）を特異的に標的とする。こうしたｄｓＲＮＡを用いてこのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書の別の箇所で記載したように行うことができる。
【０１２６】
一実施形態では、本方法は、ｄｓＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、ｄｓＲＮＡは、処置対象の哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。処置対象の生体がヒトなどの哺乳動物である場合、以下に限定されるものではないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経気道（エアロゾル）投与、経鼻投与、直腸投与、経膣投与および局所（頬粘膜および舌下など）投与のような経口または非経口経路など、当該技術分野において公知の任意の手段で組成物を投与してもよい。好ましい実施形態では、組成物を局所／膣内投与で投与するか、点滴静注または注射により投与する。
【０１２７】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には、本明細書の記載と類似または同等の方法および材料を用いてもよいが、好適な方法および材料は以下に記載する。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許および他の参考文献については、参照によってその全体を援用する。矛盾が生じた場合、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法および例は単に例示のためのものであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１２８】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の遺伝子歩行
ヒトユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６ＡＰともいう）を標的とするｓｉＲＮＡを同定するため、ｓｉＲＮＡの設計を行った。異なるアイソフォームを示すＥ６ＡＰのヒトｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿１３０８３８．１、ＮＭ＿１３０８３９．１、ＮＭ＿０００４６２．２）を使用した。
【０１２９】
すべてのヒトＥ６ＡＰアイソフォームについてＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアのＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメント機能（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，ら、，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２：４６７３）を用いて、最小配列としてのｍＲＮＡ配列ＮＭ＿１３０８３８．１を同定し、さらに、すべてのＥ６ＡＰアイソフォームの効率的な標的化に必須となる参照配列の５〜４４９１位（末端位）の配列保存性を確認した。
【０１３０】
Ｅ６ＡＰの参照配列ＮＭ＿１３０８３８．１中にあり重複すると推察される１９ｍｅｒ（ｓｉＲＮＡセンス鎖配列を示す）をすべて同定し、４４７３個の１９ｍｅｒ候補配列を得た。こうした候補標的配列を合わせると、Ｅ６ＡＰ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲドメイン、コードドメインおよび３’ＵＴＲドメインならびにこれらのドメインの結合部位がカバーされる。
【０１３１】
候補のプールからｓｉＲＮＡのランク付けおよび選択を行うため、無関係な標的と相互作用すると予想されるポテンシャル（標的外ポテンシャル）をランク付けのパラメーターとして用いた。標的外ポテンシャルが低いｓｉＲＮＡを好ましいものと規定し、インビボでの特異性が高いと考えた。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡに特異的な標的外ポテンシャルの予測には、以下の仮説を設定した：
１）標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡと、ある鎖（シード領域）との相互作用およびその後のダウンレギュレーションを行うには、その鎖の２〜９位（５’から３’にカウント）において標的遺伝子に対する相補性があれば十分である（Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＬ，ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｊｕｎ；２１（６）：６３５−７）
２）各鎖の１位および１９位は標的外相互作用に無関係である
３）シード領域は、それ以外の配列よりも標的外ポテンシャルに強く関与している可能性がある
４）ある鎖の切断部位領域の１０位および１１位（５’から３’にカウント）は、３’から切断部位への配列（非シード領域）よりも標的外ポテンシャルに強く関与する場合があるが、シード領域ほどではない
５）１〜４の仮説を考慮しながら、遺伝子配列に対するｓｉＲＮＡ鎖配列の相補性およびミスマッチの位置に基づき、遺伝子および鎖ごとに標的外スコアを算出することができる
６）内部修飾の導入によりセンス鎖の活性が抑制され得ることを想定すれば、関係するのはアンチセンス鎖の標的外ポテンシャルのみになる
７）我々の基準で最も高い相同性を示す遺伝子（最良の標的外遺伝子）からｓｉＲＮＡの標的外ポテンシャルを推定できるため、このポテンシャルをその遺伝子の標的外スコアで表すことができる
潜在的な標的外遺伝子を同定するため、１９ｍｅｒアンチセンス配列を、一般に入手可能なヒトｍＲＮＡ配列に対して相同性検索に供した。このため、すべての１９ｍｅｒ候補アンチセンス配列についてヒトＲｅｆＳｅｑデータベースに対してＦａｓｔＡ（バージョン３．４）検索を行った。候補の１９ｍｅｒ配列からアンチセンス配列を作成するにはＰｅｒｌスクリプトを用いた（ｐｅｒｌスクリプト２）。ＦａｓｔＡ検索については、１９ｍｅｒの全長にわたる相同性を考慮に入れ、次の工程でこのスクリプト解析に好適なアウトプットをフォーマットするため、パラメーター／対ペア値−ｇ３０−ｆ３０−Ｌ−ｉ−Ｈを用いて実行した。検索の結果、候補ｓｉＲＮＡの潜在的な標的外遺伝子のリストが得られた。
【０１３３】
さらに、完全な１９ｍｅｒ長との相同性を示しつつ、ＦａｓｔＡアウトプットファイルに転送される可能性が非常に高い、１９ｍｅｒセンス鎖配列と同一の８個を超えて連続する核酸塩基のデータベースエントリーを作成するため、ＦａｓｔＡ検索をパラメーターの値をＥ１５０００として行った（仮説１を参照されたい）。
【０１３４】
最良の標的外遺伝子およびその標的外スコアを同定するため、ＦａｓｔＡのアウトプットファイルを解析した。潜在的な標的外遺伝子それぞれについて、１９ｍｅｒインプット配列ごとに以下の標的外特性を抽出した：
シード領域におけるミスマッチ数
非シード領域におけるミスマッチ数
切断部位領域におけるミスマッチ数
以下のように標的外遺伝子ごとに標的外スコアを算出した：
（シードのミスマッチ数に１０を掛ける）＋（切断部位のミスマッチ数に１．２を掛ける）＋非シードのミスマッチ数
１９ｍｅｒのインプット配列ごとに最低標的外スコアを抽出し、アウトプットファイルに連続的に書き込ませ、１９ｍｅｒのインプット配列に対応するｓｉＲＮＡすべてについて標的外スコアのリストを得た。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡのランキング表を作成するため、標的外スコアを結果表に記入した。最後に、すべてのｓｉＲＮＡを標的外スコアに従い降順に並べ替え、連続して３個を超えるＧのつながりを含む配列を選択から除外した。
【０１３６】
標的外スコアが＞＝３の３２７個のｓｉＲＮＡを選択し、合成した（表１）。
【０１３７】
【表１−１】
【０１３８】
【表１−２】
【０１３９】
【表１−３】
【０１４０】
【表１−４】
【０１４１】
【表１−５】
【０１４２】
【表１−６】
【０１４３】
【表１−７】
【０１４４】
【表１−８】
【０１４５】
【表１−９】
【０１４６】
【表１−１０】
【０１４７】
【表１−１１】
ｄｓＲＮＡ合成
試薬の入手先
本明細書に試薬の入手先が具体的に記載されていない場合、その試薬は、分子生物学で使用される品質／純度標準で分子生物学用試薬の任意のサプライヤーから入手できる。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡを１μｍｏｌｅのスケールで固相合成により作製した。その際、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、固体支持体としてコントロールドポアガラス（ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いた。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを、それぞれに対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて固相合成により作製した。こうした構成要素を、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら、（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学を用いてオリゴリボヌクレオチド鎖（ｃｈａｉｎ）の配列内の選択部位に組み込んだ。ヨウ素酸化剤溶液の代わりにアセトニトリルに溶かしたＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）溶液（１％）を用いてホスホロチオアート結合を導入した。追加の補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１４９】
確立した手順に従い、この粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製をイオン交換ＨＰＬＣにより行った。分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて波長２６０ｎｍにおける各ＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により収率および濃度を判定した。二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、水浴中にて８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温まで冷却して作製した。アニーリング済みのＲＮＡ溶液を使用時まで−２０℃で保存した。
【０１５０】
３’−コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（本明細書ではＣｈｏｌ−３’という）の合成では、適切に修飾された固体支持体を用いてＲＮＡを合成した。この修飾固体支持体は、以下のとおり調製した：
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート ＡＡ
【０１５１】
【化１】
水（５０ｍＬ）に溶かしたエチルグリシナートヒドロクロリド（３２．１９ｇ、０．２３モル）の氷冷した撹拌溶液に、４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。次いで、エチルアクリラート（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、この混合物を反応の終了がＴＬＣで確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、この溶液をジクロロメタンで分割（３×１００ｍＬ）した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残留物を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【０１５２】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ
【０１５３】
【化２】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。０℃の溶液にジイソプロピルカルボジイムド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を加えた。次いでジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温まで冷まし、さらに６時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを加えてジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。この生成物をカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製してＡＢ１１．８７ｇ（８８％）を得た。
【０１５４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ
【０１５５】
【化３】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を０℃のジメチルホルムアミドに加えた２０％ピペリジンに溶解した。この溶液の撹拌を１時間続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。この粗生成物をヒドロクロリド塩に変換して精製した。
【０１５６】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル ＡＤ
【０１５７】
【化４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣのヒドロクロリド塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解した。この懸濁液を０℃まで氷冷した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にコレステリルクロロホルマート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１０．３ｇ、９２％）により精製した。
【０１５８】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル ＡＥ
【０１５９】
【化５】
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリー化した。この混合物を０℃まで氷冷し、２０分以内に５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを撹拌しながらゆっくりと加えた。添加中の温度を５℃未満に保った。撹拌を０℃で３０分間続け、１ｍＬの氷酢酸を加え、直後に４０ｍＬの水に加えたＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ４ｇを加えた 得られた混合物を、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を、それぞれ１０ｍＬのリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、乾燥させ、蒸留乾固した。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃まで冷却し、ｐＨ９．５の冷たい炭酸塩緩衝液５０ｍＬで３回に分けて抽出した。この水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調整し、合わせて４０ｍＬのクロロホルムで５回に分けて抽出し、乾燥させ、蒸留乾固した。残留物を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得た。
【０１６０】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０、１１，１２，１３、１４，１５、１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＦ
【０１６１】
【化６】
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に加えたｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）との還流混合物に１時間かけてメタノール（２ｍＬ）を滴下した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温まで冷ました後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、生成物をカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製した（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＧ
【０１６２】
【化７】
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ １．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）で減圧蒸発させて乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。この反応を室温で一晩行った。メタノールを添加して反応をクエンチした。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。この有機層を１Ｍの水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンで蒸発させて除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３でのＲｆ＝０．５）により精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０１６３】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル ＡＨ
【０１６４】
【化８】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をコハク酸無水物（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で一晩真空乾燥させた。この混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液をアルゴン雰囲気下で室温にて１６時間撹拌した。次いで溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷水性クエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。この有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残留物を次の工程でそのまま使用した。
【０１６５】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
【０１６６】
【化９】
スクシナートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。この溶液にアセトニトリル（１．２５ｍＬ）に加えたＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）に加えた２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）に加えたトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物の色は鮮やかなオレンジ色になった。この溶液をリストアクションシェイカーを用いて短時間（５分）かき混ぜた。長鎖（ｃｈａｉｎ）アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ：ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌ ａｍｉｎｅ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を加えた。この懸濁液を２時間かき混ぜた。ＣＰＧを焼結漏斗で濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで続けて洗浄した。酢酸無水物／ピリジンを用いて未反応アミノ基をマスクした。得られたＣＰＧの量をＵＶの測定により測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０１６７】
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書では「５’−Ｃ３２−」という）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書では「５’−Ｃｈｏｌ−」という）を含むｓｉＲＮＡの合成を行った。その際、コレステリル誘導体の場合に核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオアート結合を導入するため、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて酸化工程を行ったことが以外は国際公開第２００４／０６５６０１号に記載されているように行った。
【０１６８】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様では、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現活性を調節するＥ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入した転写ユニットから発現させる（たとえば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ら、，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ら、，国際公開第００／２２１１３号，Ｃｏｎｒａｄ，国際公開第００／２２１１４号，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。この導入遺伝子については、線状コンストラクト、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入してもよく、こうしたベクターは宿主ゲノムに組み込まれる導入遺伝子として導入され、遺伝し得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして遺伝するように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０１６９】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２種の別々の発現ベクターのプロモーターにより転写され、標的細胞にコトランスフェクトされてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡの１本１本の鎖は、共に同一の発現プラスミドにある２つのプロモーターにより転写されてもよい。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を含むようにリンカーポリヌクレオチド配列により結合された逆方向反復としてｄｓＲＮＡを発現させる。
【０１７０】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターに関しては、以下に限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（総説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ら、，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）を参照されたい）；アデノウイルス（たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ら、，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６を参照されたい），Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、、（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、、（１９９２），Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５））；あるいはアルファウイルスおよびこれ以外の当該技術分野において公知のものを用いて構築してもよい。インビトロおよび／またはインビボで様々な遺伝子を上皮細胞などの多種多様な細胞型に導入するには、レトロウイルスが用いられている（たとえば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、、，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、、，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら、、，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら、、，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、、，９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら、，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９ ；Ｋａｙら、、，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら、、，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら、、，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際公開第８９／０７１３６号；国際公開第８９／０２４６８号；国際公開第８９／０５３４５号；および国際公開第９２／０７５７３号を参照されたい）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子の形質導入および発現が可能な組換えレトロウイルスベクターについては、組換えレトロウイルスのゲノムをＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの好適なパッケージング細胞株にトランフェクトすることで作製できる（Ｃｏｍｅｔｔｅら、、，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０；Ｃｏｎｅら、、，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターを用いれば、感受性宿主（たとえば、ラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の種々の細胞および組織に感染させることができ（Ｈｓｕら、、，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染の際に分裂活性のある細胞を必要としないという利点もある。
【０１７１】
本発明のＤＮＡプラスミドあるいはウイルスベクターにおいてｄｓＲＮＡ発現を誘導するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（たとえば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（たとえば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または一般にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（たとえば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）あるいは原核生物プロモーター、たとえば、Ｔ７プロモーターであってもよい。ただし、Ｔ７プロモーターの場合、発現プラスミドはＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードする。このプロモーターは、膵臓に導入遺伝子発現を誘導することもできる（たとえば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら、、，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照されたい）。
【０１７２】
さらに、導入遺伝子の発現に関しては、たとえば、循環血中のグルコースレベルまたはホルモンといった何らかの生理的な制御因子に感受性を示す制御配列など、誘導型の制御配列および発現系を用いることで正確に制御できる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、、，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現の制御に好適なこうした誘導発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化を誘導する化学物質およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による制御がある。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の用途に応じて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができるであろう。
【０１７３】
通常、ｄｓＲＮＡ分子の発現が可能な組換えベクターについては下記のように送達し、標的細胞に存在し続ける。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現が可能なウイルスベクターを用いてもよい。こうしたベクターは、必要に応じて反復投与することができる。発現したら、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与により、患者から外植した標的細胞に投与してから患者に再導入することにより、あるいは所望の標的細胞への導入が可能な他の任意の手段によるなど、全身性であってもよい。
【０１７４】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは一般に、カチオン性脂質キャリア（たとえば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質ベースのキャリア（たとえば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランフェクトする。１週間またはそれ以上かけて単一のＥ６ＡＰ遺伝子または複数のＥ６ＡＰ遺伝子の異なる領域を標的とする、ｄｓＲＮＡによるノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションも本発明は意図している。本発明のベクターが宿主細胞にうまく導入されたどうかは、様々な既知の方法によりモニターすることができる。たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のような蛍光マーカーなどのレポーターで一過性トランスフェクション．を伝達させることができる。エキソビボでの細胞の安定なトランスフェクション．は、特異的な環境要因（たとえば、抗生物質および薬剤）に対する耐性、たとえば、ハイグロマイシンＢ耐性があるトランスフェクト細胞を認識するマーカーを用いて確認することができる。
【０１７５】
Ｅ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子はベクターに挿入し、ヒト患者の遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）により、または定位的注入（たとえば、Ｃｈｅｎら、、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照されたい）により被検体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈液に遺伝子治療ベクターを含ませてもよいし、遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、たとえば、レトロウイルスベクターのような完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトな状態で産生できる場合、医薬調製物は、その遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含んでも構わない。
【０１７６】
ＨＣＴ−１１６細胞を用いたＥ６ＡＰ ｓｉＲＮＡスクリーニング
ＨＣＴ−１１６細胞をＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ Ｎｏ．ＡＣＣ５８１）から入手し、加湿インキュベーターにおいて１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよび２ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎを含むように補充したＭｃＣｏｙｓ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ Ｎｏ．Ｆ１０１５）で５％ＣＯ２雰囲気、３７℃にて培養した。
【０１７７】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、９６ウェルプレートに密度２．０×１０４細胞／ウェルでＨＣＴ−１１６細胞を播種し、直接トランスフェクトした。製造者の記載のとおり、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクション（単一用量スクリーニング用の３０ｎＭおよび３ｎＭ、）を行った。
【０１７８】
トランスフェクションから２４時間後、ＨＣＴ−１１６細胞を溶解し、標準的なプロトコルに従い、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）（以前のＧｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，Ｉｎｃ．））を用いてＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡの発現レベルを定量した。Ｅ６ＡＰにおけるｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡを基準に補正した。ｓｉＲＮＡごとに４種のデータポイントを集めた。Ｅ６ＡＰ遺伝子に無関係のｓｉＲＮＡ二本鎖を対照として用いた。Ｅ６ＡＰ特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖の各活性を、処置を行った細胞中のＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡ濃度と、対照ｓｉＲＮＡ二本鎖で処置した細胞中のＥ６ＡＰにおけるｍＲＮＡ濃度との比で表した。
【０１７９】
その結果を以下の表２に示す。Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とする多くの活性ｓｉＲＮＡ分子が同定された。
【０１８０】
【表２−１】
【０１８１】
【表２−２】
【０１８２】
【表２−３】
【０１８３】
【表２−４】
当業者であれば、本開示に具体的に記載した以外にも、以下に添付される特許請求の範囲の及ぶ範囲で本発明を実施する方法および組成物をよく知っている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のヒトＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオアート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項６または７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む、細胞。
【請求項１０】
生体のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含み、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡの前記第１の配列が表１からなる群から選択され、該ｄｓＲＮＡの前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ｄｓＲＮＡの前記第１の配列が表１からなる群から選択され、該ｄｓＲＮＡの前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための方法であって：
（ａ）該細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で作製した細胞を該Ｅ６ＡＰ遺伝子の該ｍＲＮＡ転写物が分解するのに十分な時間維持し、それにより該細胞の該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程を処置、予防または管理する方法であって、そうした処置、予防または管理を必要とする患者に治療有効量または予防有効量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、方法。
【請求項１５】
細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターは、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含み、該ｄｓＲＮＡの鎖の一方は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該ｄｓＲＮＡは３０塩基対長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ベクター。
【請求項１６】
請求項１６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
細胞のヒトＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させる、ｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記接触は前記Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを少なくとも４０％低下させる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記接触は３０ｎＭまたはそれ未満にてインビトロで行われる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
生体のＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させるための医薬組成物であって、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＰＶ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項２２】
Ｅ６ＡＰ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２に記載のｄｓＲＮＡから選択される少なくとも２種のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
ＨＰＶ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項２３に記載の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項１】
細胞のヒトＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオアート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１の配列が表１からなる群から選択され、前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項６または７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む、細胞。
【請求項１０】
生体のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含み、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡの前記第１の配列が表１からなる群から選択され、該ｄｓＲＮＡの前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ｄｓＲＮＡの前記第１の配列が表１からなる群から選択され、該ｄｓＲＮＡの前記第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための方法であって：
（ａ）該細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で作製した細胞を該Ｅ６ＡＰ遺伝子の該ｍＲＮＡ転写物が分解するのに十分な時間維持し、それにより該細胞の該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ感染により媒介される病理学的過程を処置、予防または管理する方法であって、そうした処置、予防または管理を必要とする患者に治療有効量または予防有効量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、方法。
【請求項１５】
細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターは、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含み、該ｄｓＲＮＡの鎖の一方は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該ｄｓＲＮＡは３０塩基対長未満であり、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ベクター。
【請求項１６】
請求項１６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
細胞のヒトＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２個の配列を含み、かつセンス鎖は第１の配列を含み、アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含有する第２の配列を含み、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現している細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させる、ｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記接触は前記Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを少なくとも４０％低下させる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記接触は３０ｎＭまたはそれ未満にてインビトロで行われる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
生体のＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させるための医薬組成物であって、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＰＶ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項２２】
Ｅ６ＡＰ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２に記載のｄｓＲＮＡから選択される少なくとも２種のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
ＨＰＶ関連障害を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に請求項２３に記載の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【公表番号】特表２０１０−５２２５４７（Ｐ２０１０−５２２５４７Ａ）
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００２４３（Ｐ２０１０−５００２４３）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６８６０
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【出願人】（５０８２９０９１０）アルニラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６８６０
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【出願人】（５０８２９０９１０）アルニラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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