ＩＧＦＲ経路のモディファイヤーとしてのＭＡＮ２Ａｓ及び使用方法
ヒトＭＡＮ２Ａ遺伝子はＩＧＦＲ経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥ＩＧＦＲ機能に関連する疾患の治療上の標的である。ＭＡＮ２Ａの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ＩＧＦＲのモジュレーターを同定する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
本出願は、２００４年１月２８日出願の米国特許仮出願第６０／５３９，８３７号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
ＰＴＥＮ（第１０染色体上で削除されるホスファターゼ及びＴｅｎｓｉｎ相同体）遺伝子中の体細胞突然変異は、様々なヒト組織において癌を生じさせることが知られている。加えて、ＰＴＥＮの生殖系列突然変異は、乳癌及び甲状腺癌の危険の増大を伴うヒトの疾患（Cowden病及びBannayan-Zonana症候群）の原因である（Nelen MR等 (1997) Hum Mol Genet, 8:1383-1387; Liaw D等 (1997) Nat Genet, 1:64-67; Marsh DJ等(1998) Hum Mol Genet, 3:507-515）。ＰＴＥＮは、第２メッセンジャーホスファチジルイノシトール３、４、５三リン酸エステル（ＰＩＰ３）により複数のシグナル伝達経路を調節することにより腫瘍抑制因子として作用すると考えられている。ＰＴＥＮは、ＰＩＰ３のＤ３位を脱リン酸化し、ＰＩＰ３レベル依存性のシグナル伝達イベントを下方制御する（Maehama T及びDixon JE (1998) J Biol Chem, 22, 13375-8）。特に、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）経路の下流の生存促進性経路は、ＰＴＥＮ活性によって調節される。ＩＧＦ経路の刺激、又はＰＴＥＮ機能の欠損により、ＰＩＰ３のレベルが上昇し、腫瘍形成に関連する生存促進経路が活性化する（Stambolic V等 (1998) Cell, 95:29-39）。このモデルと一致して、インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩのレベルの上昇は、癌の危険の増大（Yu H等 (1999) J Natl Cancer Inst 91:151-156）、及び予後の不良（Takanami I 等、1996, J Surg Oncol 61(3):205-8）と相関している。加えて、Ａｋｔ及びＰＩ（３）キナーゼ等のＩＧＦ経路のポジティブエフェクターのレベル又は活性の上昇は、複数の種類のヒト癌に関連付けられている（Nicholson KM及びAnderson NG (2002) Cellular Signalling, 14:381-395）。
キイロショウジョウバエでは、脊椎動物と同様に、インスリン成長因子レセプター（ＩＧＦＲ）経路に、ポジティブエフェクターであるＰＩ（３）キナーゼ、Ａｋｔ、及びＰＤＫと、インヒビターであるＰＴＥＮとが含まれる。これらタンパク質は、細胞の成長及び大きさ、並びに細胞の分裂及び生存の制御を含む多数のプロセスに関連付けられている（Oldham S及びHafen E. (2003) Trends Cell Biol. 13:79-85; Garafolo RS. (2002) Trends Endocr. Metab. 13:156-162; Backman SA等 (2002) Curr. Op. Neurobio. 12:1-7; Tapon N等 (2001) Curr Op. Cell Biol. 13:731-737）。ショウジョウバエのこの経路が活性化すると、細胞の大きさと数、並びに器官の大きさが増大する（Oldham S等 (2002) Dev. 129:4103-4109; Prober DA及びEdgar BA. (2002) Genes&Dev. 16:2286-2299; Potter CJ等 (2001) Cell 105:357-368; Verdu J等 (1999) Cell Biol. 1:500-506）。
【０００３】
グリコシル加水分解酵素ファミリーのメンバーであるαマンノシダーゼＩＩＡ（ＭＡＮ２Ａ）は、アスパラギンにリンクしたオリゴ糖（Ｎ−グリカン）成熟経路における最終的な加水分解段階を触媒するゴルジ酵素であり、高度なマンノースの複合体タイプ構造への転換における関与ステップとして作用する。ＭＡＮ２Ａ１のマウス相同体における突然変異は、ヒトの全身性エリトマトーデスに類似の全身性自己免疫疾患を引き起こす。オスのマウスにおけるＭＡＮ２Ａ２遺伝子の突然変異は、雄性不妊症を引き起こす。
【０００４】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子及び経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与及びこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路及びこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる（たとえば、Mechler BM等, 1985 EMBO J 4:1551-1557; Gateff E. 1982 Adv. Cancer Res. 37:33-74; Watson KL.等、1994 J Cell Sci. 18:19-33; Miklos GL及びRubin GM. 1996 Cell 86:521-529; Wassarman DA等、1995 Curr Opin Gen Dev 5:44-50; 及びBooth DR. 1999 Cancer Metastasis Rev. 18:261-284参照）。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（たとえばノックアウト）または過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｒｙ ｐｏｉｎｔ）」と呼ばれる）を有する無脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントの変異により元の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがＩＧＦＲなどの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
参照した特許、特許出願、公開公報、及び参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号における配列情報を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００５】
（発明の概要）
本発明者らは、ショウジョウバエでＩＧＦＲ経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをαマンノシダーゼＩＩＡ（ＭＡＮ２Ａ）と呼ぶ。本発明は、これらのＩＧＦＲモディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、ＩＧＦＲ機能及び／又はＭＡＮ２Ａ機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＭＡＮ２Ａ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的に結合してＩＧＦＲ機能を修復する。他の好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤は、アンチセンスオリゴマーやＲＮＡｉなど、たとえば対応する核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによってＭＡＮ２Ａ遺伝子発現または生成物の活性を抑制する核酸モジュレーターである。
ＭＡＮ２Ａ調節剤は、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいインビトロまたはインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＭＡＮ２Ａ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ＩＧＦＲ調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＭＡＮ２Ａ調節剤には、ＭＡＮ２Ａ関連タンパク質（たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体；ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；ＭＡＮ２Ａと特異的に結合するか相互作用する、または（例えばＭＡＮ２Ａ結合パートナーに結合することにより）ＭＡＮ２Ａ結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、加水分解酵素アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管新生アッセイ、及び低酸素誘発アッセイから選択される。
【０００６】
別の実施態様では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、細胞死、または細胞増殖の変化など、ＩＧＦＲ経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ＩＧＦＲ経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施態様では、この二次アッセイ系は、血管新生、細胞死、または細胞増殖の疾患（たとえば癌）などＩＧＦＲ経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
本発明はさらに、哺乳動物細胞をＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＭＡＮ２Ａ機能及び／又はＩＧＦＲ経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、ＩＧＦＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【０００７】
（発明の詳細な記載）
ＩＧＦＲシグナル伝達経路と相互作用するか、又はＩＧＦＲシグナル伝達経路を調節する遺伝子を同定するため、ショウジョウバエにおいて優性機能欠失スクリーニングを実行した。ＩＧＦＲ経路のモディファイヤー及びそれらのオルソログが同定された。ＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）遺伝子が、ＩＧＦＲ経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、このモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるＭＡＮ２Ａ遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、癌などのＩＧＦＲシグナル伝達経路の欠陥に関連する病変の治療における魅力的な薬剤標的である。
本発明では、ＭＡＮ２Ａ機能を評価するインビトロ及びインビボの方法を提供する。ＭＡＮ２Ａまたはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態及び病態におけるＩＧＦＲ経路とそのメンバーとの関連性を理解し、ＩＧＦＲに関連する病状の診断方法及び治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば酵素（たとえば触媒）活性または結合活性などのＭＡＮ２Ａ機能に影響を与えてＭＡＮ２Ａの発現を阻害または亢進することによって作用するＭＡＮ２Ａ調節剤を同定することができる。ＭＡＮ２Ａ調節剤は、診断、治療、及び製薬の開発に有用である。
【０００８】
本発明の核酸及びポリペプチド
本発明で使用することができるＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸はＧＩ＃４７５８６９７（配列番号１）、１１１７８２６（配列番号２）、２１７３４１２９（配列番号３）、及び５５４００９９（配列番号４）、ポリペプチド配列はＧＩ＃４７５８６９８（配列番号５）及び３１２３２４４（配列番号６）として、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている（Ｇｅｎｂａｎｋ識別（ＧＩ）番号により参照）。
用語「ＭＡＮ２Ａポリペプチド」とは、完全長のＭＡＮ２Ａタンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」ＭＡＮ２Ａ断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ＭＡＮ２Ａタンパク質に関連する機能活性を１つまたは複数示す。ＭＡＮ２Ａタンパク質、誘導体及び断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。一実施態様では、例えば細胞に基づくアッセイ又は動物アッセイにおいて、機能的に活性のあるＭＡＮ２Ａポリペプチドは、内因性ＭＡＮ２Ａ活性の欠陥を救援する能力を有するＭＡＮ２Ａ誘導体であり、救援誘導体は同じ種由来でも、異なる種由来でもよい。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、キナーゼドメイン又は結合ドメインなどＭＡＮ２Ａの構造ドメインを１つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2）。たとえば、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｎ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０１０７４）は、概ね、アミノ酸残基１６７−４９８及び１６７−４９８にそれぞれ位置している。また、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｃ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０７７４８）は、概ね、アミノ酸残基６４８−１１３９及び６４８−１１３５にそれぞれ位置している。ＭＡＮ２Ａポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施態様では、好ましい断片は、機能的に活性のある、ＭＡＮ２Ａの少なくとも２５個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは７５個、最も好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施態様では、この断片は機能的に活性のあるドメインの全体を含む。
【０００９】
用語「ＭＡＮ２Ａ核酸」とは、ＭＡＮ２ＡポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。好ましくは、このＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＭＡＮ２Ａと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。オルソログの同定方法は当技術分野において既知である。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在及び／または３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、ＢＬＡＳＴ分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴ結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域及び／または残基をハイライトし、系統樹を作製してもよい。多様種の多重相同シーケンス（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソログシーケンスは、それら２種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法（例えばＰｒｏＣｅｒｙｏｎ（バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク）を使用したもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある（パラログ）。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410）によって作製されたギャップを導入した後の、対象配列（またはその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【００１０】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute ; Smith及びWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197; Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)及びこれに引用される参考文献であるW. R. Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、5 suppl. 3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸張ペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００１１】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、ＭＡＮ２Ａの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズ及び洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行い；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、；０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄する高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＡＮ２Ａのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
他の実施態様では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理し；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行い；次いで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄する、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートし；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行い；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間洗浄する、低いストリンジェントな条件を使用することができる。
【００１２】
ＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドは、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する薬剤の同定及び試験、ならびにＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与に関連する他の用途に有用である。ＭＡＮ２Ａ核酸ならびにその誘導体及びオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（たとえば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などＭＡＮ２Ａ機能を評価するのに使用するアッセイのためのＭＡＮ２Ａタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（たとえば、Higgins SJ及びHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク）。具体的な実施態様では、組換えＭＡＮ２Ａは、欠陥ＩＧＦＲ機能を有することで知られている細胞系で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
ＭＡＮ２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、ネイティブＭＡＮ２Ａ遺伝子及び／またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／または特異的にプロセッシングする単離された宿主細胞系を使用することができる。
【００１３】
ＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の発現を検出するために、発現ベクターは、ＭＡＮ２Ａ遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つまたは複数の複製起点、及び１つまたは複数の選択可能なマーカー（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、インビトロアッセイ系（たとえば免疫アッセイ）におけるＭＡＮ２Ａタンパク質の物理的または機能的特性に基づいてＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
たとえば精製または検出を促進するために、ＭＡＮ２Ａタンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物（すなわち、ＭＡＮ２Ａタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。
【００１４】
ＭＡＮ２Ａ遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動）を使用して遺伝子産物を単離及び精製することができる。あるいは、標準の方法（たとえば免疫親和性精製）によって、天然源から天然に生じたＭＡＮ２Ａタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
本発明の方法では、ＭＡＮ２ＡまたはＩＧＦＲ経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００１５】
遺伝子改変動物
候補ＩＧＦＲ調節剤の活性を試験するため、または細胞死や細胞増殖などＩＧＦＲ経路のプロセスにおけるＭＡＮ２Ａの役割をさらに評価するために、ＭＡＮ２Ａの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したＭＡＮ２Ａの発現により、正常なＭＡＮ２Ａ発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管新生、または細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、ＩＧＦＲ発現が変化していてもよい（たとえばＩＧＦＲノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス又はラット）などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、及びショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸配列をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、または異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling、Science、1982年、218:348〜53及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションについては、Houdebine及びChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００１６】
一実施態様では、このトランスジェニック動物は、好ましくはＭＡＮ２Ａ発現が検出不可能または僅かとなるようにＭＡＮ２Ａ機能の低下をもたらす、内因性ＭＡＮ２Ａ遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（たとえばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性ＭＡＮ２Ａ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスＭＡＮ２Ａ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物及び他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（Houdebine及びChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施態様では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400）。
別の実施態様では、このトランスジェニック動物は、たとえばＭＡＮ２Ａの追加のコピーを導入することによって、またはＭＡＮ２Ａ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、ＭＡＮ２Ａ遺伝子の発現の変化（たとえば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【００１７】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施態様では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6）。
遺伝学の研究において欠陥ＩＧＦＲ機能に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を使用してＩＧＦＲ経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をＭＡＮ２Ａ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／または候補治療剤を与えたＭＡＮ２Ａ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
ＭＡＮ２Ａ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ＩＧＦＲ機能（及びそれ以外は正常なＭＡＮ２Ａ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補ＩＧＦＲ調節剤の活性をインビボで評価するために、ＩＧＦＲノックアウトマウスを使用することができる。好ましくは、候補ＩＧＦＲ調節剤をＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ＩＧＦＲ機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【００１８】
調節剤
本発明は、ＭＡＮ２Ａの機能及び／またはＩＧＦＲ経路と相互作用し及び／またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、ＩＧＦＲ経路に関連する様々な診断及び治療用途、ならびにＭＡＮ２Ａタンパク質及びＩＧＦＲ経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＭＡＮ２Ａ相互作用剤または調節剤を投与することによってＭＡＮ２Ａ活性を特異的に調節する工程を含む、ＩＧＦＲ経路を調節する方法も提供する。
ここで使用する「ＭＡＮ２Ａ調節剤」とは、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する任意の薬剤、例えば、ＭＡＮ２Ａと相互作用してＭＡＮ２Ａ活性を阻害又は増強するか、或いは正常なＭＡＮ２Ａ機能にその他の影響を与える薬剤である。ＭＡＮ２Ａ機能への影響は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルでもよい。好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＭＡＮ２Ａの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはＭＡＮ２Ａの機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの用語は、（たとえば、ＭＡＮ２Ａの結合パートナーと、またはタンパク質／結合パートナー複合体と結合してＭＡＮ２Ａ機能を変化させることによって）ＭＡＮ２Ａと結合パートナー、基質、またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＩＧＦＲ経路のモジュレーターであり（例えばＩＧＦＲ機能を回復させる及び／又は上方制御する）、よってＩＧＦＲ調節剤でもある。
好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤には、小分子化合物；抗体及び他のバイオ治療法等のＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質；及びアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。
【００１９】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有し及び／またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００以下、好ましくは５，０００以下、より好ましくは１，０００以下、最も好ましくは５００ダルトン以下である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定ＭＡＮ２Ａタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてＭＡＮ２Ａ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969; Radmann J及びGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ＩＧＦＲ経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００２０】
タンパク質モジュレーター
特異的なＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＩＧＦＲ経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、ならびに他のＭＡＮ２Ａ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なＭＡＮ２Ａ機能に影響を与える。別の実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、癌などＩＧＦＲに関連する疾患に関連性があるので、ＭＡＮ２Ａタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（たとえば診断上の手段用）。
ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＭＡＮ２Ａ発現、局在化、及び／または活性を調節するＭＡＮ２Ａ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＭＡＮ２Ａと自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。ＭＡＮ２Ａモジュレーターには、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質及びＭＡＮ２Ａタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母ツーハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.及びHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203; Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14; Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70; Vidal M及びLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（たとえば、Pandley A及びMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。
【００２１】
ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（たとえば、Harlow及びLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー: Cold Spring Harbor Loboratory Press参照）。ＭＡＮ２Ａ抗体については以下でさらに論じる。
好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質はＭＡＮ２Ａタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＭＡＮ２Ａ基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【００２２】
抗体
別の実施態様では、このタンパク質モジュレーターはＭＡＮ２Ａに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＭＡＮ２Ａモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにＭＡＮ２Ａの通常のプロセッシング及び成熟を担当するＭＡＮ２Ａ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
周知の方法を使用してＭＡＮ２Ａポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＭＡＮ２Ａポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＭＡＮ２Ａに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、ＭＡＮ２Ａのアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のＭＡＮ２Ａポリペプチドスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を使用することによって、特に抗原性であるＭＡＮ２Ａのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood、1981年、Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A.、78:3824〜28;Hopp及びWood、1983年、Mol. Immunol.、20:483〜89; Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66）。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow及びLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ＭＡＮ２Ａの粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＭＡＮ２Ａ断片を使用する場合は、これらは、好ましくはＭＡＮ２Ａタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗原及び／または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００２３】
固定した対応するＭＡＮ２Ａポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci.、1984、81:6851〜6855; Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される（Co MS及びQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501; Morrison SL.、1992年、Ann. Rev. Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００２４】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＭＡＮ２Ａ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426; Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、85:5879〜5883; Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（Harlow及びLane、1988年、上掲）。
【００２５】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（たとえば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例えば、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；国際公開公報ＷＯ００７３４６９号）。
【００２６】
特異的生物療法
好ましい実施形態では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は生物療法に適用できる。生物療法剤は製薬的に許容可能な担体に形成され、シグナル伝達経路を活性化又は阻害するために投与できる。この調節は、リガンドと結合し、よって経路の活性を阻害するか、又は受容体と結合し、受容体の活性を阻害又は活性化することにより行うことができる。あるいは、生物療法剤自体を、受容体を活性化又は阻害可能なリガンドとしてもよい。生物療法剤及び生物療法剤の製造方法は、米国特許第６，１４６，６２８号に詳述されている。
ＭＡＮ２Ａがリガンドであるとき、その天然レセプターを活性化するか、又は阻害する生物療法剤として使用することができる。或いは、ＭＡＮ２Ａに対する抗体を、前述のようにして生物療法剤として使用することもできる。
ＭＡＮ２Ａがレセプターであるとき、そのリガンド、リガンドに対する抗体、又はＭＡＮ２Ａ自体を生物療法剤として使用し、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの活性を調節することができる。
【００２７】
核酸モジュレーター
他の好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤としては、一般的にＭＡＮ２Ａ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのＭＡＮ２Ａ ＲＮＡの転位、ＭＡＮ２Ａ ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＭＡＮ２Ａ ＲＮＡをスプライシングして１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得ること、またはＭＡＮ２Ａ ＲＮＡに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、ＭＡＮ２Ａ核酸の機能を妨げる。
一実施態様では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、または３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００２８】
別の実施態様では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルホリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作製方法及び使用方法は、当分野で周知である（たとえば、国際公開公報ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton J及びWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。
好ましい代替ＭＡＮ２Ａ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811; Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年; Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年; Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001; Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；国際公開公報ＷＯ０１２９０５８号；国際公開公報ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498；Novina CD及びSharp P. 2004 Nature 430:161-164；Soutschek J他 2004 Nature 432:173-178）。
【００２９】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物及び人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの役割、及び／またはＭＡＮ２Ａとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ＭＡＮ２Ａに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、ＩＧＦＲに関連する病態を処置する治療剤として、ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【００３０】
アッセイ系
本発明は、ＭＡＮ２Ａ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出及び／または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＭＡＮ２Ａ核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＭＡＮ２Ａ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がＩＧＦＲ経路に関連する方式でＭＡＮ２Ａに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＭＡＮ２Ａモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
好ましい実施態様では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（たとえば加水分解酵素活性）が系によってもたらされる条件下で、ＭＡＮ２Ａポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＭＡＮ２Ａ活性を、したがってＩＧＦＲ経路を調節することが示される。アッセイに使用するＭＡＮ２Ａポリペプチド又は核酸は、上述の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。
【００３１】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００３２】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91及び付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性または組換えによって生成された）、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば受容体−リガンド結合）、転写活性（たとえばレポーター遺伝子）、酵素活性（たとえば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＭＡＮ２Ａを組換えによって発現する系及び個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母ツーハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質を使用する場合、ＭＡＮ２Ａタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（たとえば候補ＭＡＮ２Ａに特異的に結合する作用剤の、ＭＡＮ２Ａ発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００３３】
スクリーニングアッセイでは、ＭＡＮ２Ａポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＭＡＮ２Ａ活性を保持しているその断片でもよい。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、好ましくはヒトＭＡＮ２Ａ、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施態様では、スクリーニングアッセイで、ＭＡＮ２Ａと内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはＭＡＮ２Ａに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＭＡＮ２Ａ遺伝子機能を評価することができる。
ＭＡＮ２Ａモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイはハイスループットまたはウルトラハイスループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603; Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。好ましい一実施態様では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはＤＮＡ−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RP及びPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451）。
候補ＭＡＮ２Ａ及びＩＧＦＲ経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（例えば、米国特許第５，５５０，０１９号及び６，１３３，４３７号（アポトーシスアッセイ）、同第５，９７６，７８２号、６，２２５，１１８号及び６，４４４，４３４号（血管新生アッセイ））。好ましい特異的なアッセイを以下に詳述する。
【００３４】
加水分解酵素アッセイ。加水分解酵素は、特にエステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレオチダーセ、及びホスファターゼなどの基質の加水分解を触媒する。酵素活性アッセイは、加水分解活性を測定するために使用することができる。酵素の活性は、反応産物の出現率を分光光度的に測定することにより、過剰基質の存在下で測定する。加水分解のアッセイ及びハイスループットアレイは、当分野の当業者に既知である（Park CB及びClark DS (2002) Biotech Bioeng 78:229-235）。
【００３５】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス又はプログラムされた細胞死とは、細胞内部で自殺プログラムが起動されて、ＤＮＡの断片化、細胞質の収縮、膜の変化、及び細胞死が起こることである。アポトーシスは、カスパーゼファミリーのタンパク質分解酵素によって媒介される。細胞の多くの変更パラメータは、アポトーシスが起こる間に測定することができる。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによって細胞死に特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によって細胞死をさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。その他の細胞に基づくアッセイには、カスパーゼ−３／７アッセイ及び細胞死ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。カスパーゼ−３／７アッセイは、多数のアポトーシス経路におけるプログラム細胞死の段階で発生する事象のカスケードの一部としてのカスパーゼ切断活性の活性化に基づいている。カスパーゼ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）同種カスパーゼ−３／７、ｃａｔ＃６７７９０）では、溶解緩衝液と基質を混合して細胞に添加する。カスパーゼ基質は活性のカスパーゼ３／７で切断すると蛍光性となる。ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイは、当技術分野の専門家に周知の通常の細胞死アッセイであり、市販されている（Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃１７７４４２５）。このアッセイは、ＤＮＡとヒストンそれぞれに対して方向付けられたモノクローナル抗体を使用することにより、特に細胞可溶化物の細胞質断片中のモノ及びオリゴヌクレオソームの量を決定する定量的サンドイッチ−酵素−イムノアッセイである。ＤＮＡ断片化が原形質膜の崩壊の数時間前に起こり、細胞質中に蓄積されるという事実から、単一及び少ヌクレオソームはアポトーシスの間に細胞質中で濃縮された。アポトーシスが起こっていない細胞の細胞質断片にヌクレオソームは存在しない。ホスホ−ヒストンＨ２Ｂアッセイは、アポトーシスの結果であるヒストンＨ２Ｂのリン酸化に基づく別のアポトーシスアッセイである。ホスホヒストンＨ２Ｂに関連する蛍光色素を使用して、アポトーシスに起因するホスホヒストンＨ２Ｂの増大を測定することが出来る。アポトーシスに関連する多数のパラメータを同時に測定するアポトーシスアッセイも開発されている。そのようなアッセイでは、抗体又は蛍光色素に関連付けることができ、アポトーシスの様々な段階を特徴づける様々な細胞パラメータを標識し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ(登録商標)ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳシステムなどの装置を用いて結果を測定する。測定可能なパラメータ及びそれらのマーカーには、中間段階のアポトーシスを特徴づける抗活性カスパーゼ３抗体、アポトーシスの後期段階を特徴づける抗ＰＡＲＰ−ｐ８５抗体（切断ＰＡＲＰ）、核を標識し、初期アポトーシスの指標として核膨張を、及び後期アポトーシスの指標として核凝縮を測定するために使用されるヘキスト標識、並びに高い細胞膜透過性により死細胞のＤＮＡを標識するＴＯＴＯ−３蛍光色素、並びに細胞中の細胞骨格の変化を評価してＴＯＴＯ−３標識とうまく相関させる抗αチューブリン又はＦアクチン標識が含まれる。
アポトーシスアッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞死の誘発における変化により、候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞死において直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した細胞死応答の差により、ＭＡＮ２Ａが細胞死応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。
【００３６】
細胞増殖及び細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J. Immunol. Meth.、107、79）、または他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。
また、ヒストンＨ３のリン酸化による有糸分裂が起こった細胞集団を同定するホスホ−ヒストンＨ３染色によって細胞増殖をアッセイする。セリン１０におけるヒストンＨ３のリン酸化は、ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて検出される（Chadlee, D.N. 1995, J. Biol. Chem 270:20098-105）。また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403; Jeoung, J.、1995年、J. Biol. Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８００液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。別の細胞増殖アッセイでは、染料アラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能）を使用する。これにより、生存細胞が減少した際には、蛍光発光させて細胞数を間接的測定値を提供する（Voytik-Harbin SL他, 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。また別の増殖アッセイであるＭＴＳアッセイは、インビトロでの化成物の細胞障害性の評価に基づき、可溶性のテトラゾリウム塩であるＭＴＳを使用する。ＭＴＳアッセイとして例えばＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水溶性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｃａｔ．＃Ｇ５４２１）などが市販されている。
【００３７】
また、軟寒天中のコロニー形成、又はクローン原生生存アッセイによって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。たとえば、ＭＡＮ２Ａで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
細胞増殖は代謝的活性細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定することによってもアッセイできる。このようなアッセイとしては、Ｐｒｏｍｅｇａ社による発光同種アッセイであるＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）などが市販されている。
【００３８】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる（Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55）。ＭＡＮ２Ａで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期の異なる段階における細胞の蓄積を示すフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）で評価することができる。
細胞周期への遺伝子の関与は、ＦＯＸＯ核転位置アッセイによっても分析することができる。転写因子のＦＯＸＯファミリーは、細胞周期の進行及び細胞死を含む様々な細胞機能のメディエーターであり、ＰＩ３キナーゼ経路の活性化により負に調節される。ＦＯＸＯファミリーメンバーのＡｋｔリン酸化により、細胞質におけるＦＯＸＯ隔離及び転写の不活性化が起こる（Medema, R. H.他 (2000) Nature 404:782-787）。ＰＴＥＮはＰＩ３キナーゼ経路の負の制御因子である。ＰＴＥＮの活性化、或いはＰＩ３キナーゼ又はＡＫＴの欠失は、ＦＯＸＯのリン酸化を防ぎ、核におけるＦＯＸＯ蓄積、ＦＯＸＯが制御された遺伝子の転写活性化、及びアポトーシスを起こす。或いは、ＰＴＥＮの欠失は、経路の活性化及び細胞の生存に繋がる（Nakamuara, N.他 (2000) Mol Cell Biol 20:8969-8982）。細胞質へのＦＯＸＯの転位置をアッセイに用いて、ＰＴＥＮ経路のメンバー及び／又はモジュレーターを同定するためのスクリーニングを行う。検出試薬としてＧＦＰ又はルシフェラーゼを用いたＦＯＸＯ転位置アッセイは、当技術分野において既知である（例えば、Zhang X他 (2002) J Biol Chem 277:45276-45284; 及びLi他 (2003) Mol Cell Biol 23:104-118）。
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞アッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、ＭＡＮ２Ａが細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【００３９】
血管新生。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管新生をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）；血管新生エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管新生アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この血管新生アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管新生の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、血管新生アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管新生アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で血管新生アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管新生の差により、ＭＡＮ２Ａが血管新生において直接役割を果たすことが示唆される。特に、米国特許第５，９７６，７８２号、同第６，２２５，１１８号及び同第６，４４４，４３４号に様々な血管新生アッセイが記載されている。
【００４０】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、インビトロで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ＭＡＮ２Ａで形質移入させた細胞を（たとえばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、及び残りはＮ２を用いた）低酸素条件下及び正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ＭＡＮ２Ａが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【００４１】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングし、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
細胞−細胞接着アッセイでは、天然で生じたリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンド及びペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチド及びモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をインサイツで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。
【００４２】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ＭＡＮ２Ａタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当分野で周知である（Harlow及びLane、1988年、1999年、上掲）。ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
場合によっては、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも、抗体モジュレーターを試験するために使用できる。
【００４３】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＭＡＮ２Ａ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＮ２Ａを発現する２種の細胞プール）中のＭＡＮ２Ａ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125; Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm DH及びGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＭＡＮ２Ａタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow E及びLane D、1988年及び1999年、上掲）。
場合によっては、特にＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡ発現を伴うアッセイ系において、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも核酸モジュレーターを試験するために使用できる。
【００４４】
二次アッセイ
調節剤がＩＧＦＲ経路に関連する様式でＭＡＮ２Ａに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＭＡＮ２Ａ調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するＭＡＮ２Ａ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がＭＡＮ２Ａと相互作用する特異性を試験することもできる。
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＮ２Ａを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＭＡＮ２Ａ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置または偽薬で処置した）細胞や動物と比較してＩＧＦＲ経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、ＩＧＦＲまたは相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【００４５】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは内因性ＩＧＦＲ経路活性を検出するか、あるいはこれはＩＧＦＲ経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【００４６】
動物アッセイ
候補ＭＡＮ２Ａモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるＩＧＦＲ経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥ＩＧＦＲ経路のモデルでは、ＩＧＦＲ経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（たとえば過剰発現または発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
好ましい実施態様では、新脈管形成及び血管新生をモニターすることによってＩＧＦＲ経路の活性を評価する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける、ＭＡＮ２Ａに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるＩＧＦＲ及び正常なＩＧＦＲを有する動物モデルを使用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦなど様々な血管新生剤、またはＭＡＮ２Ａを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入（ＳＣ）する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、または静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを回収する（Ｓｉｇｍａ ｐｌａｓｍａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｔ）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新脈管形成の程度と相関していることが判明した。
【００４７】
別の好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。腫瘍異種移植アッセイは、当技術分野において既知である（例えば、Ogawa K他, 2000, Oncogene 19:6043-6052を参照）。異種移植片は、通常、既存の腫瘍由来またはインビトロ培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植されたＳＣである。内因的にＭＡＮ２Ａを発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、大量瞬時投与によってＩＶ、ＳＣ、ＩＰ、またはＰＯで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃で固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
別の好ましい実施態様では、ホローファイバーアッセイを使用して腫瘍形成能をモニターする。ホローファイバーアッセイは米国特許第５，６９８，４１３号に開示されている。要約すると、本方法は、実験動物に対し、標的細胞を含む生体適合性の半透明なカプセル封入器を埋め込むこと、実験動物を候補調節剤で処置すること、及び候補モジュレーターに対する反応について標的細胞を評価することを含む。埋め込まれる細胞は、通常、既存の腫瘍又は腫瘍細胞系由来のヒト細胞である。適当な時間、通常約６日を置いて、埋め込んだ細胞を回収し、候補モジュレーターの評価に使用する。腫瘍形成能とモジュレーターの有効性は、マクロカプセル中に存在する生細胞の量をアッセイすることにより評価してもよく、これは、当技術分野において既知の試験、例えばＭＴＴ染色変換アッセイ、ニュートラルレッド染色取り込み、トリパンブルー染色、生細胞計算、軟寒天中に形成されたコロニーの数、細胞の回復能及びインビトロでの複製能等により決定できる。
【００４８】
別の好ましい実施態様では、腫瘍形成能アッセイは、組織特異性の制御配列の制御の下で、優性オンコジーン、又は腫瘍サプレッサー遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物、通常マウスを使用する。これらのアッセイは通常トランスジェニック腫瘍アッセイと呼ばれる。好ましい用途では、トランスジェニックモデルにおける腫瘍の進行の特徴づけ又は制御が良好に行われる。例示的なモデルでは、「ＲＩＰ１−Ｔａｇ２」導入遺伝子は、インスリン遺伝子制御領域の制御の下でＳＶ４０大型Ｔ抗原オンコジーンを有し、膵臓β細胞に発現し、結果的に島細胞悪性腫瘍となる（Hanahan D, 1985, Nature 315:115-122; Parangi S等, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2002-2007; Bergers G等, 1999, Science 284:808-812）。通常過剰増殖性の島細胞のサブセット中の静止毛細血管が血管新生性となるので、「血管新生スイッチ（angiogenic switch）」は、約５週目に起こる。ＲＩＰ１−ＴＡＧ２マウスは１４週で死亡する。候補モジュレーターは、血管新生スイッチの直前（例えば腫瘍予防のモデルの場合）、小規模腫瘍の成長期（例えば処置のモデルの場合）、又は大規模及び／又は浸潤性腫瘍の成長期（例えば退行のモデルの場合）を含め、様々な段階において投与できる。腫瘍形成能及びモジュレーターの有効性は、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態、血管密度、アポトーシス指数などを含め、寿命延長及び／又は腫瘍特性の評価であってもよい。
【００４９】
診断及び治療上の使用
特異的なＭＡＮ２Ａ調節剤は、疾病または疾病予後が血管新生、細胞死、または増殖疾患などＩＧＦＲ経路の欠陥に関連している様々な診断及び治療用途に有用である。したがって、本発明は、ＭＡＮ２Ａ活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくはＩＧＦＲ機能の欠陥又は不全（例えば、ＩＧＦＲの過剰発現、過少発現、又は誤発現、或いは遺伝子突然変異による）を有することが事前に確定されている細胞におけるＩＧＦＲ経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、ＩＧＦＲ機能が修復されたことが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づいたことを意味する。例えば、ＩＧＦＲ機能が修復されると、細胞増殖及び／又は細胞周期の進行が正常化するか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づく。本発明はまた、ＩＧＦＲ経路を調節するＭＡＮ２Ａ調節剤の治療的有効量を投与することによる、ＩＧＦＲ機能不全に関連する疾患又は疾病の治療方法を提供する。さらに本発明は、ＭＡＮ２Ａ調節剤を投与することによる、細胞、好ましくはＭＡＮ２Ａ機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞において、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する方法を提供する。これらに加えて、本発明は、ＭＡＮ２Ａ調節剤の治療的有効量を投与することによる、ＭＡＮ２Ａ機能不全に関連する疾患又は疾病の治療法を提供する。
ＭＡＮ２ＡがＩＧＦＲ経路に関係しているという発見により、ＩＧＦＲ経路の欠陥に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、ならびにこのような疾病及び疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【００５０】
特定の試料でＭＡＮ２Ａが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley & Sons, Inc.、第4章; Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125 ;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm及びGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ＭＡＮ２Ａを発現する欠陥ＩＧＦＲシグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、ＭＡＮ２Ａ調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、ＩＧＦＲ欠陥組織は正常組織に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現する。たとえば、完全または部分ＭＡＮ２Ａ ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍及び正常細胞系由来、または腫瘍及び同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がＭＡＮ２Ａを発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織及び腫瘍試料中のＭＡＮ２Ａ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用する（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
たとえばＭＡＮ２Ａオリゴヌクレオチドなどの試薬、及びＭＡＮ２Ａに対する抗体を利用して、上に記載した（１）ＭＡＮ２Ａ遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ＭＡＮ２Ａに媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【００５１】
ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を少なくとも１つ、抗体の検出や抗体の固定化等に適する全ての試薬及び／又は装置、並びにそのようなキットを診断又は治療に使用する際の指示書を備えた、様々な試料中のＭＡＮ２Ａの発現を検出するキットもまた提供される。
したがって、特定の実施態様では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得て、（ｂ）試料をＭＡＮ２Ａ発現用のプローブと接触させ、（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較し、及び（ｄ）工程（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＭＡＮ２Ａ発現の変化と結び付けられる患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表１に示す癌である。プローブは、ＤＮＡまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【００５２】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【００５３】
Ｉ．ショウジョウバエＩＧＦＲの過剰発現スクリーニング
ショウジョウバエで、優性機能喪失スクリーニングを行い、ＩＧＦＲシグナル伝達経路と相互作用するか、又はＩＧＦＲシグナル伝達経路を調節する遺伝子を同定した。ショウジョウバエの眼の初期発生段階におけるＩＧＦＲの過剰発現による経路の活性化は、細胞数の増大を引き起こし、その結果成虫の眼が大きく且つ粗くなる（Potter CJ他 (2001) Cell 105:357-368; Huang他、1999. Dev. 126:5365-5372）。本発明者は、ＩＧＦＲの過剰発現により拡大した眼を持つハエのストックをつくり、この表現型のモディファイヤーを同定した。次いで、そのモディファイヤーのヒトオルソログを同定した。
スクリーニングのストックは２つの導入遺伝子を有していた。この表現型は以下の通りである。
＋；＋；P｛ＤｍＩＧＦＲ−ｐＥｘｐ−ＵＡＳ｝Ｐ｛Ｇａｌ４−ｐＥｘｐ−１Ｘｅｙ｝／ＴＭ６Ｂ
【００５４】
上記表現型のスクリーニングによるストックのメスを、３種類のトランスポゾン（ｐｉｇｇｙＢａｃベース）からなる集団に交雑した。その結果得られた、導入遺伝子とトランスポゾンとを含む子孫を、次いで眼過成長表現型に対するトランスポゾンの影響についてスコア化した（亢進、抑制又は影響無し）。全てのデータを記録し、元の交雑をもう一度行ってモディファイヤーの全てを再度試験した。眼の表現型のモディファイヤーがＩＧＦＲ経路のメンバーとして同定された。ＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）は眼の表現型のサプレッサー（抑制物質）であった。モディファイヤーのオルソログを本明細書ではＭＡＮ２Ａと呼ぶ。
ＢＬＡＳＴ分析（Altschul他、上掲）を行ってショウジョウバエモディファイヤーのオルソログを同定した。例えば、ＭＡＮ２Ａ由来の代表的配列であるＧＩ＃４７５８６９８（配列番号５）、及び３１２３２４４（配列番号６）は、ショウジョウバエＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）と、それぞれ４３％、及び４４％のアミノ酸同一性を有していた。
【００５５】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、及び機能的サブユニットを、ＰＳＯＲＴ（Nakai K.及びHorton P.、Trends Biochem Sci、1999、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000）、ＰＦＡＭ（Bateman A.等、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2）、ＳＭＡＲＴ（Ponting CP等、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32）、ＴＭ−ＨＭＭ（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998）、及びクラスト（clust）（Remm M及びSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89）プログラムを使用して分析した。例えば、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｎ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０１０７４）は、概ね、アミノ酸残基１６７−４９８及び１６７−４９８にそれぞれ位置している。また、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｃ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０７７４８）は、概ね、アミノ酸残基６４８−１１３９及び６４８−１１３５にそれぞれ位置している。
【００５６】
ＩＩ．ハイスループットのＩｎ Ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＭＡＮ２Ａペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がＭＡＮ２Ａ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【００５７】
ＩＩＩ．ハイスループットのＩｎ Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
３３Ｐ標識のＭＡＮ２Ａペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補ＩＧＦＲ調節剤として同定された。
【００５８】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、ＭＡＮ２Ａタンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入での総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、二フッ化ビニリデン樹脂膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【００５９】
Ｖ．発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織及び腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、ＵＣ Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｒｄａｉｓ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ及びＡｍｂｉｏｎから得た。
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を使用した。
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムヘキサマー及び各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、及びｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。発現分析は７９００ＨＴ機器を使用して行った。
【００６０】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマー及び２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを、９６ウェルプレートでは２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｏｏｌ）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織及び細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差の２倍を超える場合（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての正常試料））に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【００６１】
結果を表１に示す。各腫瘍種類について、同一患者から採取した腫瘍試料と一致する正常組織の対の数を示す。また、各腫瘍種類について、少なくとも二倍の過剰発現を示した試料の割合を示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（または複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
表１
【００６２】
ＶＩ．ＭＡＮ２Ａ機能アッセイ
ＲＮＡｉ実験を行い、小干渉ＲＮＡ（siRNA, Elbashir等、上掲）を用いて様々な細胞系におけるＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）の発現をノックダウンした。
細胞増殖及び成長に対するＭＡＮ２Ａ ＲＮＡｉの影響。上述のようにＢｒｄＵ及びＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞増殖に対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。これら実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）のＲＮＡｉが、２３１Ｔ乳癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、ＰＣ３前立腺癌細胞、及びＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞における増殖を低減させることが示された。
【００６３】
上述のように標準コロニー成長アッセイを用いて、細胞成長に対するＭＡＮ２Ａ発現低下の影響を研究した。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉが、Ａ５４９及びＡ２７８０卵巣癌細胞における増殖を低減し、また２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞及びＡ５４９細胞の細胞数を低下させることが示された。ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）のＲＮＡｉは、Ａ５４９細胞の細胞数を低下させた。
上述のように［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを用いて、細胞増殖に対するＭＡＮ２Ａ発現の影響を研究した。この実験の結果、配列番号１のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉは、Ａ５４９細胞及びＡ２７８０細胞、並びにＲＤ１黄紋筋肉腫細胞における増殖を低減させることが示された。配列番号４のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉは、Ａ５４９及びＲＤ１細胞における増殖を低減させる。
【００６４】
アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ ＲＮＡｉの影響。上述のようにホスホ−ヒストンＨ２Ｂアッセイを行って、アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。この実験の結果は、配列番号１のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉが、２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞、及びＵ８７ＭＧ細胞におけるアポトーシスを増大させ、配列番号４のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉが、ＰＣ３細胞におけるアポトーシスを増大させることを示すものであった。
上述のようにマルチパラメータアポトーシスアッセイを行って、アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）のＲＮＡｉが、Ａ２７８０細胞及びＡ５４９細胞にアポトーシスを増大させることが示された。
【００６５】
転写レポーターアッセイ。また、様々な転写因子の発現に対するＭＡＮ２Ａ過剰発現の影響を研究した。ＭＡＮ２Ａの過剰発現により、転写因子の発現が増大した。加えて、他の転写レポーターアッセイを行い、様々な転写因子の発現に対するＭＡＮ２Ａの過剰発現の影響を測定した。このアッセイでは、ラット腸管上皮（ＲＩＥ）細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＭＡＮ２Ａと一緒に様々な転写因子とルシフェラーゼを含むレポーターコンストラクトを用いて同時形質移入した。次いでＭＡＮ２Ａの過剰発現に起因する転写活性を読み出すことによりルシフェラーゼ強度を測定した。過剰発現した配列番号１のＭＡＮ２Ａは、ＡＰ１（活性因子タンパク質１）転写因子の発現を増大させた。
【００６６】
ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路への関与：ＭＡＮ２Ａ ＦＯＸＯ核転写アッセイ。上述のようにＦＯＸＯ核転写アッセイを行って、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を評価した。一組の実験では、ＲＮＡｉによってＭＡＮ２Ａの発現を低減させた細胞を、ＧＦＰタグを付したＦＯＸＯを発現するプラスミドを用いて過渡的に形質移入した。次いで核及び細胞質等の細胞要素の自動画像化を行ってＦＯＸＯの転位置を評価した。その結果、配列番号１のＭＡＮ２Ａの発現低下により、核内におけるＦＯＸＯの貯留、ＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こった。これはＵ２０Ｓ骨肉腫細胞におけるＰＴＥＮの欠失に類似していた。別の実験では、ＦＯＸＯを含むプラスミドと共にＭＡＮ２Ａに方向付けたｓｉＲＮＡ、並びにプロモーター、ＦＯＸＯ応答因子、及びルシフェラーゼを含むカセットを用いて細胞を同時形質移入した。次いで、ルシフェラーゼ活性について細胞を分析し、ｓｉＲＮＡを含まない細胞と比較した。この結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）の発現低下により、Ａ２７８０細胞及びＰＣ３細胞において、ＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こり、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）の発現の低下により、Ａ２７８０細胞においてＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こった。これらの結果は、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を示唆するものである。
Ｐａｎ−ＡＫＴアッセイ。このアッセイは、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を検出するために開発されたものである。本アッセイでは、ＰＲＡＳ４０、ＢＡＤ、４ＥＢＰ１、及びＲＰＳ６等、ＡＫＴの複数の基質についてリン酸化の変化を検出する。この実験のために、コンセンサスリン酸化ＡＫＴ基質配列ＲｘＲｘｘＳ／Ｔを含む、リン酸化したＡＫＴ基質に対して抗体を産生させる。次いで、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール（ＡＫＴ）の存在下で、その後ＭＡＮ２Ａノックアウトを用いて、リン酸化基質の発現レベルを通常レベルで定量化した。例えば、ＡＫＴレベルを低下させたとき、その全ての基質の発現も低減した。その結果ＭＡＮ２Ａ１及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１及び４）のＲＮＡｉは、２３１Ｔ細胞及びＡ５４９細胞におけるリン酸化ＡＫＴ基質のレベルを低下させることが示された。
【００６７】
本発明者は、基質としてＲＰＳ６アッセイを用いて一連の実験を行った。ＲＰＳ６は、ＡＫＴのＩＧＦ依存性基質である。ＩＧＦ１処理により、細胞質のＲＰＳ６のレベルが上昇した。他の場合では、ＰＩ３ＫインヒビターであるＬｉｌｙ化合物ＬＹ２９４００２は、ＡＫＴ及び細胞質のＲＰＳ６レベルを低下させた。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、ＲＰＳ６抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化ＲＰＳ６の量が低減することが示された。
基質として４ＥＢＰ１を用いて別の実験を行った。この基質については、ＡＫＴ経路の阻害により、細胞質の染色が低減し、核の染色が増大した。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、４ＥＢＰ１抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、核／細胞質の染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化４ＥＢＰ１の量が低減することが示された。
【００６８】
本発明者はまた、基質としてＰＲＡＳ４０を使用して別の実験を行った。この基質については、経路の阻害により、細胞質の染色が低減し、核及び核周囲の染色が増大した。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、ＰＲＡＳ４０抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、核／細胞質の染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞、及びＡ５４９細胞におけるリン酸化ＰＲＡＳ４０の量が低減し、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化ＰＲＡＳ４０の量が低減することが示された。総括すると、これらの実験の結果は、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａ２の関与を示すものである。
【００６９】
ハイスループットＰＴＥＮ／ＩＧＦ転写読み取りアッセイ。このアッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）転写読み取りアッセイの拡張版であり、内在性ＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化をモニターする。このアッセイは、経路シグナル伝達の活性を読み取って、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御細胞遺伝子の発現の変化を測定する。
本発明者は、ＰＴＥＮ／ＩＧＦシグナル伝達により転写が制御された一連の遺伝子を同定し、次いでＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブの組を設定し、試験した。ＲＮＡｉによりＰＴＥＮ／ＩＧＦの発現を低減させて、複数の細胞種類における転写制御された遺伝子の発現に対するその影響を研究した。次いで遺伝子群からの読み出しを１０の最も頑強なプローブに絞り込んだ。
【００７０】
次に、本発明者は、ここで対象とするＭＡＮ２Ａ等の標的遺伝子のｓｉＲＮＡにより癌細胞を処理し、標的遺伝子のレベルの低下がＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御遺伝子パネルの発現レベルにどのように影響するかを研究した。
少なくとも２つの異なるＲＮＡｉオリゴによりノックアウトしたとき、遺伝子群の少なくとも３分の１にＰＴＥＮ／ＩＧＦノックアウトと同じ活性パターンを示す遺伝子を、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路に関与していると同定した。
【００７１】
３８４ウェルフォーマットにおいて、ＲＮＡｓにＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを実施した。
ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉは、２３１Ｔ細胞及びＰＣ３細胞において、転写制御した遺伝子の少なくとも３分の１に、少なくとも２つのＲＮＡｉオリゴのＰＴＥＮ／ＩＧＦ ＲＮＡｉと同じ活性パターンを示した。
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
本出願は、２００４年１月２８日出願の米国特許仮出願第６０／５３９，８３７号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
ＰＴＥＮ（第１０染色体上で削除されるホスファターゼ及びＴｅｎｓｉｎ相同体）遺伝子中の体細胞突然変異は、様々なヒト組織において癌を生じさせることが知られている。加えて、ＰＴＥＮの生殖系列突然変異は、乳癌及び甲状腺癌の危険の増大を伴うヒトの疾患（Cowden病及びBannayan-Zonana症候群）の原因である（Nelen MR等 (1997) Hum Mol Genet, 8:1383-1387; Liaw D等 (1997) Nat Genet, 1:64-67; Marsh DJ等(1998) Hum Mol Genet, 3:507-515）。ＰＴＥＮは、第２メッセンジャーホスファチジルイノシトール３、４、５三リン酸エステル（ＰＩＰ３）により複数のシグナル伝達経路を調節することにより腫瘍抑制因子として作用すると考えられている。ＰＴＥＮは、ＰＩＰ３のＤ３位を脱リン酸化し、ＰＩＰ３レベル依存性のシグナル伝達イベントを下方制御する（Maehama T及びDixon JE (1998) J Biol Chem, 22, 13375-8）。特に、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）経路の下流の生存促進性経路は、ＰＴＥＮ活性によって調節される。ＩＧＦ経路の刺激、又はＰＴＥＮ機能の欠損により、ＰＩＰ３のレベルが上昇し、腫瘍形成に関連する生存促進経路が活性化する（Stambolic V等 (1998) Cell, 95:29-39）。このモデルと一致して、インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩのレベルの上昇は、癌の危険の増大（Yu H等 (1999) J Natl Cancer Inst 91:151-156）、及び予後の不良（Takanami I 等、1996, J Surg Oncol 61(3):205-8）と相関している。加えて、Ａｋｔ及びＰＩ（３）キナーゼ等のＩＧＦ経路のポジティブエフェクターのレベル又は活性の上昇は、複数の種類のヒト癌に関連付けられている（Nicholson KM及びAnderson NG (2002) Cellular Signalling, 14:381-395）。
キイロショウジョウバエでは、脊椎動物と同様に、インスリン成長因子レセプター（ＩＧＦＲ）経路に、ポジティブエフェクターであるＰＩ（３）キナーゼ、Ａｋｔ、及びＰＤＫと、インヒビターであるＰＴＥＮとが含まれる。これらタンパク質は、細胞の成長及び大きさ、並びに細胞の分裂及び生存の制御を含む多数のプロセスに関連付けられている（Oldham S及びHafen E. (2003) Trends Cell Biol. 13:79-85; Garafolo RS. (2002) Trends Endocr. Metab. 13:156-162; Backman SA等 (2002) Curr. Op. Neurobio. 12:1-7; Tapon N等 (2001) Curr Op. Cell Biol. 13:731-737）。ショウジョウバエのこの経路が活性化すると、細胞の大きさと数、並びに器官の大きさが増大する（Oldham S等 (2002) Dev. 129:4103-4109; Prober DA及びEdgar BA. (2002) Genes&Dev. 16:2286-2299; Potter CJ等 (2001) Cell 105:357-368; Verdu J等 (1999) Cell Biol. 1:500-506）。
【０００３】
グリコシル加水分解酵素ファミリーのメンバーであるαマンノシダーゼＩＩＡ（ＭＡＮ２Ａ）は、アスパラギンにリンクしたオリゴ糖（Ｎ−グリカン）成熟経路における最終的な加水分解段階を触媒するゴルジ酵素であり、高度なマンノースの複合体タイプ構造への転換における関与ステップとして作用する。ＭＡＮ２Ａ１のマウス相同体における突然変異は、ヒトの全身性エリトマトーデスに類似の全身性自己免疫疾患を引き起こす。オスのマウスにおけるＭＡＮ２Ａ２遺伝子の突然変異は、雄性不妊症を引き起こす。
【０００４】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子及び経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与及びこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路及びこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる（たとえば、Mechler BM等, 1985 EMBO J 4:1551-1557; Gateff E. 1982 Adv. Cancer Res. 37:33-74; Watson KL.等、1994 J Cell Sci. 18:19-33; Miklos GL及びRubin GM. 1996 Cell 86:521-529; Wassarman DA等、1995 Curr Opin Gen Dev 5:44-50; 及びBooth DR. 1999 Cancer Metastasis Rev. 18:261-284参照）。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（たとえばノックアウト）または過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｒｙ ｐｏｉｎｔ）」と呼ばれる）を有する無脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントの変異により元の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがＩＧＦＲなどの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
参照した特許、特許出願、公開公報、及び参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号における配列情報を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００５】
（発明の概要）
本発明者らは、ショウジョウバエでＩＧＦＲ経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをαマンノシダーゼＩＩＡ（ＭＡＮ２Ａ）と呼ぶ。本発明は、これらのＩＧＦＲモディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、ＩＧＦＲ機能及び／又はＭＡＮ２Ａ機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＭＡＮ２Ａ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的に結合してＩＧＦＲ機能を修復する。他の好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤は、アンチセンスオリゴマーやＲＮＡｉなど、たとえば対応する核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによってＭＡＮ２Ａ遺伝子発現または生成物の活性を抑制する核酸モジュレーターである。
ＭＡＮ２Ａ調節剤は、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいインビトロまたはインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＭＡＮ２Ａ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ＩＧＦＲ調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＭＡＮ２Ａ調節剤には、ＭＡＮ２Ａ関連タンパク質（たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体；ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；ＭＡＮ２Ａと特異的に結合するか相互作用する、または（例えばＭＡＮ２Ａ結合パートナーに結合することにより）ＭＡＮ２Ａ結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、加水分解酵素アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管新生アッセイ、及び低酸素誘発アッセイから選択される。
【０００６】
別の実施態様では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、細胞死、または細胞増殖の変化など、ＩＧＦＲ経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ＩＧＦＲ経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施態様では、この二次アッセイ系は、血管新生、細胞死、または細胞増殖の疾患（たとえば癌）などＩＧＦＲ経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
本発明はさらに、哺乳動物細胞をＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＭＡＮ２Ａ機能及び／又はＩＧＦＲ経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、ＩＧＦＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【０００７】
（発明の詳細な記載）
ＩＧＦＲシグナル伝達経路と相互作用するか、又はＩＧＦＲシグナル伝達経路を調節する遺伝子を同定するため、ショウジョウバエにおいて優性機能欠失スクリーニングを実行した。ＩＧＦＲ経路のモディファイヤー及びそれらのオルソログが同定された。ＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）遺伝子が、ＩＧＦＲ経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、このモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるＭＡＮ２Ａ遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、癌などのＩＧＦＲシグナル伝達経路の欠陥に関連する病変の治療における魅力的な薬剤標的である。
本発明では、ＭＡＮ２Ａ機能を評価するインビトロ及びインビボの方法を提供する。ＭＡＮ２Ａまたはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態及び病態におけるＩＧＦＲ経路とそのメンバーとの関連性を理解し、ＩＧＦＲに関連する病状の診断方法及び治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば酵素（たとえば触媒）活性または結合活性などのＭＡＮ２Ａ機能に影響を与えてＭＡＮ２Ａの発現を阻害または亢進することによって作用するＭＡＮ２Ａ調節剤を同定することができる。ＭＡＮ２Ａ調節剤は、診断、治療、及び製薬の開発に有用である。
【０００８】
本発明の核酸及びポリペプチド
本発明で使用することができるＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸はＧＩ＃４７５８６９７（配列番号１）、１１１７８２６（配列番号２）、２１７３４１２９（配列番号３）、及び５５４００９９（配列番号４）、ポリペプチド配列はＧＩ＃４７５８６９８（配列番号５）及び３１２３２４４（配列番号６）として、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている（Ｇｅｎｂａｎｋ識別（ＧＩ）番号により参照）。
用語「ＭＡＮ２Ａポリペプチド」とは、完全長のＭＡＮ２Ａタンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」ＭＡＮ２Ａ断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ＭＡＮ２Ａタンパク質に関連する機能活性を１つまたは複数示す。ＭＡＮ２Ａタンパク質、誘導体及び断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。一実施態様では、例えば細胞に基づくアッセイ又は動物アッセイにおいて、機能的に活性のあるＭＡＮ２Ａポリペプチドは、内因性ＭＡＮ２Ａ活性の欠陥を救援する能力を有するＭＡＮ２Ａ誘導体であり、救援誘導体は同じ種由来でも、異なる種由来でもよい。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、キナーゼドメイン又は結合ドメインなどＭＡＮ２Ａの構造ドメインを１つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2）。たとえば、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｎ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０１０７４）は、概ね、アミノ酸残基１６７−４９８及び１６７−４９８にそれぞれ位置している。また、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｃ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０７７４８）は、概ね、アミノ酸残基６４８−１１３９及び６４８−１１３５にそれぞれ位置している。ＭＡＮ２Ａポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施態様では、好ましい断片は、機能的に活性のある、ＭＡＮ２Ａの少なくとも２５個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは７５個、最も好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施態様では、この断片は機能的に活性のあるドメインの全体を含む。
【０００９】
用語「ＭＡＮ２Ａ核酸」とは、ＭＡＮ２ＡポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。好ましくは、このＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＭＡＮ２Ａと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。オルソログの同定方法は当技術分野において既知である。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在及び／または３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、ＢＬＡＳＴ分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴ結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域及び／または残基をハイライトし、系統樹を作製してもよい。多様種の多重相同シーケンス（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソログシーケンスは、それら２種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法（例えばＰｒｏＣｅｒｙｏｎ（バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク）を使用したもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある（パラログ）。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410）によって作製されたギャップを導入した後の、対象配列（またはその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【００１０】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute ; Smith及びWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197; Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)及びこれに引用される参考文献であるW. R. Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、5 suppl. 3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸張ペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００１１】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、ＭＡＮ２Ａの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズ及び洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行い；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、；０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄する高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＡＮ２Ａのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
他の実施態様では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理し；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行い；次いで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄する、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートし；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行い；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間洗浄する、低いストリンジェントな条件を使用することができる。
【００１２】
ＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＭＡＮ２Ａ核酸及びポリペプチドは、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する薬剤の同定及び試験、ならびにＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与に関連する他の用途に有用である。ＭＡＮ２Ａ核酸ならびにその誘導体及びオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（たとえば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などＭＡＮ２Ａ機能を評価するのに使用するアッセイのためのＭＡＮ２Ａタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（たとえば、Higgins SJ及びHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク）。具体的な実施態様では、組換えＭＡＮ２Ａは、欠陥ＩＧＦＲ機能を有することで知られている細胞系で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
ＭＡＮ２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、ネイティブＭＡＮ２Ａ遺伝子及び／またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／または特異的にプロセッシングする単離された宿主細胞系を使用することができる。
【００１３】
ＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の発現を検出するために、発現ベクターは、ＭＡＮ２Ａ遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つまたは複数の複製起点、及び１つまたは複数の選択可能なマーカー（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、インビトロアッセイ系（たとえば免疫アッセイ）におけるＭＡＮ２Ａタンパク質の物理的または機能的特性に基づいてＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
たとえば精製または検出を促進するために、ＭＡＮ２Ａタンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物（すなわち、ＭＡＮ２Ａタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。
【００１４】
ＭＡＮ２Ａ遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動）を使用して遺伝子産物を単離及び精製することができる。あるいは、標準の方法（たとえば免疫親和性精製）によって、天然源から天然に生じたＭＡＮ２Ａタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
本発明の方法では、ＭＡＮ２ＡまたはＩＧＦＲ経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００１５】
遺伝子改変動物
候補ＩＧＦＲ調節剤の活性を試験するため、または細胞死や細胞増殖などＩＧＦＲ経路のプロセスにおけるＭＡＮ２Ａの役割をさらに評価するために、ＭＡＮ２Ａの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したＭＡＮ２Ａの発現により、正常なＭＡＮ２Ａ発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管新生、または細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、ＩＧＦＲ発現が変化していてもよい（たとえばＩＧＦＲノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス又はラット）などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、及びショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸配列をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、または異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling、Science、1982年、218:348〜53及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションについては、Houdebine及びChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００１６】
一実施態様では、このトランスジェニック動物は、好ましくはＭＡＮ２Ａ発現が検出不可能または僅かとなるようにＭＡＮ２Ａ機能の低下をもたらす、内因性ＭＡＮ２Ａ遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（たとえばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性ＭＡＮ２Ａ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスＭＡＮ２Ａ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物及び他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（Houdebine及びChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施態様では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400）。
別の実施態様では、このトランスジェニック動物は、たとえばＭＡＮ２Ａの追加のコピーを導入することによって、またはＭＡＮ２Ａ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、ＭＡＮ２Ａ遺伝子の発現の変化（たとえば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【００１７】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施態様では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6）。
遺伝学の研究において欠陥ＩＧＦＲ機能に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を使用してＩＧＦＲ経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をＭＡＮ２Ａ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／または候補治療剤を与えたＭＡＮ２Ａ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
ＭＡＮ２Ａ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ＩＧＦＲ機能（及びそれ以外は正常なＭＡＮ２Ａ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補ＩＧＦＲ調節剤の活性をインビボで評価するために、ＩＧＦＲノックアウトマウスを使用することができる。好ましくは、候補ＩＧＦＲ調節剤をＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ＩＧＦＲ機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【００１８】
調節剤
本発明は、ＭＡＮ２Ａの機能及び／またはＩＧＦＲ経路と相互作用し及び／またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、ＩＧＦＲ経路に関連する様々な診断及び治療用途、ならびにＭＡＮ２Ａタンパク質及びＩＧＦＲ経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＭＡＮ２Ａ相互作用剤または調節剤を投与することによってＭＡＮ２Ａ活性を特異的に調節する工程を含む、ＩＧＦＲ経路を調節する方法も提供する。
ここで使用する「ＭＡＮ２Ａ調節剤」とは、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する任意の薬剤、例えば、ＭＡＮ２Ａと相互作用してＭＡＮ２Ａ活性を阻害又は増強するか、或いは正常なＭＡＮ２Ａ機能にその他の影響を与える薬剤である。ＭＡＮ２Ａ機能への影響は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルでもよい。好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＭＡＮ２Ａの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはＭＡＮ２Ａの機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの用語は、（たとえば、ＭＡＮ２Ａの結合パートナーと、またはタンパク質／結合パートナー複合体と結合してＭＡＮ２Ａ機能を変化させることによって）ＭＡＮ２Ａと結合パートナー、基質、またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＩＧＦＲ経路のモジュレーターであり（例えばＩＧＦＲ機能を回復させる及び／又は上方制御する）、よってＩＧＦＲ調節剤でもある。
好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤には、小分子化合物；抗体及び他のバイオ治療法等のＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質；及びアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。
【００１９】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有し及び／またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００以下、好ましくは５，０００以下、より好ましくは１，０００以下、最も好ましくは５００ダルトン以下である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定ＭＡＮ２Ａタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてＭＡＮ２Ａ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969; Radmann J及びGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ＩＧＦＲ経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００２０】
タンパク質モジュレーター
特異的なＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＩＧＦＲ経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、ならびに他のＭＡＮ２Ａ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なＭＡＮ２Ａ機能に影響を与える。別の実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、癌などＩＧＦＲに関連する疾患に関連性があるので、ＭＡＮ２Ａタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（たとえば診断上の手段用）。
ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＭＡＮ２Ａ発現、局在化、及び／または活性を調節するＭＡＮ２Ａ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＭＡＮ２Ａと自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。ＭＡＮ２Ａモジュレーターには、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質及びＭＡＮ２Ａタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母ツーハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.及びHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203; Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14; Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70; Vidal M及びLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（たとえば、Pandley A及びMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。
【００２１】
ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（たとえば、Harlow及びLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー: Cold Spring Harbor Loboratory Press参照）。ＭＡＮ２Ａ抗体については以下でさらに論じる。
好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質はＭＡＮ２Ａタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施態様では、ＭＡＮ２Ａ調節剤はＭＡＮ２Ａ基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【００２２】
抗体
別の実施態様では、このタンパク質モジュレーターはＭＡＮ２Ａに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＭＡＮ２Ａモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにＭＡＮ２Ａの通常のプロセッシング及び成熟を担当するＭＡＮ２Ａ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
周知の方法を使用してＭＡＮ２Ａポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＭＡＮ２Ａポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＭＡＮ２Ａに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、ＭＡＮ２Ａのアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のＭＡＮ２Ａポリペプチドスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を使用することによって、特に抗原性であるＭＡＮ２Ａのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood、1981年、Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A.、78:3824〜28;Hopp及びWood、1983年、Mol. Immunol.、20:483〜89; Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66）。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow及びLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ＭＡＮ２Ａの粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＭＡＮ２Ａ断片を使用する場合は、これらは、好ましくはＭＡＮ２Ａタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗原及び／または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００２３】
固定した対応するＭＡＮ２Ａポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci.、1984、81:6851〜6855; Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される（Co MS及びQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501; Morrison SL.、1992年、Ann. Rev. Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００２４】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＭＡＮ２Ａ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426; Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、85:5879〜5883; Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（Harlow及びLane、1988年、上掲）。
【００２５】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（たとえば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例えば、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；国際公開公報ＷＯ００７３４６９号）。
【００２６】
特異的生物療法
好ましい実施形態では、ＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質は生物療法に適用できる。生物療法剤は製薬的に許容可能な担体に形成され、シグナル伝達経路を活性化又は阻害するために投与できる。この調節は、リガンドと結合し、よって経路の活性を阻害するか、又は受容体と結合し、受容体の活性を阻害又は活性化することにより行うことができる。あるいは、生物療法剤自体を、受容体を活性化又は阻害可能なリガンドとしてもよい。生物療法剤及び生物療法剤の製造方法は、米国特許第６，１４６，６２８号に詳述されている。
ＭＡＮ２Ａがリガンドであるとき、その天然レセプターを活性化するか、又は阻害する生物療法剤として使用することができる。或いは、ＭＡＮ２Ａに対する抗体を、前述のようにして生物療法剤として使用することもできる。
ＭＡＮ２Ａがレセプターであるとき、そのリガンド、リガンドに対する抗体、又はＭＡＮ２Ａ自体を生物療法剤として使用し、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの活性を調節することができる。
【００２７】
核酸モジュレーター
他の好ましいＭＡＮ２Ａ調節剤としては、一般的にＭＡＮ２Ａ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのＭＡＮ２Ａ ＲＮＡの転位、ＭＡＮ２Ａ ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＭＡＮ２Ａ ＲＮＡをスプライシングして１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得ること、またはＭＡＮ２Ａ ＲＮＡに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、ＭＡＮ２Ａ核酸の機能を妨げる。
一実施態様では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、または３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００２８】
別の実施態様では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルホリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作製方法及び使用方法は、当分野で周知である（たとえば、国際公開公報ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton J及びWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。
好ましい代替ＭＡＮ２Ａ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811; Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年; Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年; Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001; Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；国際公開公報ＷＯ０１２９０５８号；国際公開公報ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498；Novina CD及びSharp P. 2004 Nature 430:161-164；Soutschek J他 2004 Nature 432:173-178）。
【００２９】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物及び人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａの役割、及び／またはＭＡＮ２Ａとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ＭＡＮ２Ａに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、ＩＧＦＲに関連する病態を処置する治療剤として、ＭＡＮ２Ａに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【００３０】
アッセイ系
本発明は、ＭＡＮ２Ａ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出及び／または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＭＡＮ２Ａ核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＭＡＮ２Ａ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がＩＧＦＲ経路に関連する方式でＭＡＮ２Ａに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＭＡＮ２Ａモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
好ましい実施態様では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（たとえば加水分解酵素活性）が系によってもたらされる条件下で、ＭＡＮ２Ａポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＭＡＮ２Ａ活性を、したがってＩＧＦＲ経路を調節することが示される。アッセイに使用するＭＡＮ２Ａポリペプチド又は核酸は、上述の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。
【００３１】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００３２】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91及び付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性または組換えによって生成された）、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば受容体−リガンド結合）、転写活性（たとえばレポーター遺伝子）、酵素活性（たとえば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＭＡＮ２Ａを組換えによって発現する系及び個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母ツーハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにＭＡＮ２Ａ相互作用タンパク質を使用する場合、ＭＡＮ２Ａタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（たとえば候補ＭＡＮ２Ａに特異的に結合する作用剤の、ＭＡＮ２Ａ発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００３３】
スクリーニングアッセイでは、ＭＡＮ２Ａポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＭＡＮ２Ａ活性を保持しているその断片でもよい。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＭＡＮ２Ａポリペプチドは、好ましくはヒトＭＡＮ２Ａ、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施態様では、スクリーニングアッセイで、ＭＡＮ２Ａと内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはＭＡＮ２Ａに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＭＡＮ２Ａ遺伝子機能を評価することができる。
ＭＡＮ２Ａモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイはハイスループットまたはウルトラハイスループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603; Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。好ましい一実施態様では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはＤＮＡ−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RP及びPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451）。
候補ＭＡＮ２Ａ及びＩＧＦＲ経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（例えば、米国特許第５，５５０，０１９号及び６，１３３，４３７号（アポトーシスアッセイ）、同第５，９７６，７８２号、６，２２５，１１８号及び６，４４４，４３４号（血管新生アッセイ））。好ましい特異的なアッセイを以下に詳述する。
【００３４】
加水分解酵素アッセイ。加水分解酵素は、特にエステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレオチダーセ、及びホスファターゼなどの基質の加水分解を触媒する。酵素活性アッセイは、加水分解活性を測定するために使用することができる。酵素の活性は、反応産物の出現率を分光光度的に測定することにより、過剰基質の存在下で測定する。加水分解のアッセイ及びハイスループットアレイは、当分野の当業者に既知である（Park CB及びClark DS (2002) Biotech Bioeng 78:229-235）。
【００３５】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス又はプログラムされた細胞死とは、細胞内部で自殺プログラムが起動されて、ＤＮＡの断片化、細胞質の収縮、膜の変化、及び細胞死が起こることである。アポトーシスは、カスパーゼファミリーのタンパク質分解酵素によって媒介される。細胞の多くの変更パラメータは、アポトーシスが起こる間に測定することができる。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによって細胞死に特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によって細胞死をさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。その他の細胞に基づくアッセイには、カスパーゼ−３／７アッセイ及び細胞死ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。カスパーゼ−３／７アッセイは、多数のアポトーシス経路におけるプログラム細胞死の段階で発生する事象のカスケードの一部としてのカスパーゼ切断活性の活性化に基づいている。カスパーゼ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）同種カスパーゼ−３／７、ｃａｔ＃６７７９０）では、溶解緩衝液と基質を混合して細胞に添加する。カスパーゼ基質は活性のカスパーゼ３／７で切断すると蛍光性となる。ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイは、当技術分野の専門家に周知の通常の細胞死アッセイであり、市販されている（Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃１７７４４２５）。このアッセイは、ＤＮＡとヒストンそれぞれに対して方向付けられたモノクローナル抗体を使用することにより、特に細胞可溶化物の細胞質断片中のモノ及びオリゴヌクレオソームの量を決定する定量的サンドイッチ−酵素−イムノアッセイである。ＤＮＡ断片化が原形質膜の崩壊の数時間前に起こり、細胞質中に蓄積されるという事実から、単一及び少ヌクレオソームはアポトーシスの間に細胞質中で濃縮された。アポトーシスが起こっていない細胞の細胞質断片にヌクレオソームは存在しない。ホスホ−ヒストンＨ２Ｂアッセイは、アポトーシスの結果であるヒストンＨ２Ｂのリン酸化に基づく別のアポトーシスアッセイである。ホスホヒストンＨ２Ｂに関連する蛍光色素を使用して、アポトーシスに起因するホスホヒストンＨ２Ｂの増大を測定することが出来る。アポトーシスに関連する多数のパラメータを同時に測定するアポトーシスアッセイも開発されている。そのようなアッセイでは、抗体又は蛍光色素に関連付けることができ、アポトーシスの様々な段階を特徴づける様々な細胞パラメータを標識し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ(登録商標)ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳシステムなどの装置を用いて結果を測定する。測定可能なパラメータ及びそれらのマーカーには、中間段階のアポトーシスを特徴づける抗活性カスパーゼ３抗体、アポトーシスの後期段階を特徴づける抗ＰＡＲＰ−ｐ８５抗体（切断ＰＡＲＰ）、核を標識し、初期アポトーシスの指標として核膨張を、及び後期アポトーシスの指標として核凝縮を測定するために使用されるヘキスト標識、並びに高い細胞膜透過性により死細胞のＤＮＡを標識するＴＯＴＯ−３蛍光色素、並びに細胞中の細胞骨格の変化を評価してＴＯＴＯ−３標識とうまく相関させる抗αチューブリン又はＦアクチン標識が含まれる。
アポトーシスアッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞死の誘発における変化により、候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞死において直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した細胞死応答の差により、ＭＡＮ２Ａが細胞死応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。
【００３６】
細胞増殖及び細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J. Immunol. Meth.、107、79）、または他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。
また、ヒストンＨ３のリン酸化による有糸分裂が起こった細胞集団を同定するホスホ−ヒストンＨ３染色によって細胞増殖をアッセイする。セリン１０におけるヒストンＨ３のリン酸化は、ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて検出される（Chadlee, D.N. 1995, J. Biol. Chem 270:20098-105）。また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403; Jeoung, J.、1995年、J. Biol. Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８００液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。別の細胞増殖アッセイでは、染料アラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能）を使用する。これにより、生存細胞が減少した際には、蛍光発光させて細胞数を間接的測定値を提供する（Voytik-Harbin SL他, 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。また別の増殖アッセイであるＭＴＳアッセイは、インビトロでの化成物の細胞障害性の評価に基づき、可溶性のテトラゾリウム塩であるＭＴＳを使用する。ＭＴＳアッセイとして例えばＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水溶性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｃａｔ．＃Ｇ５４２１）などが市販されている。
【００３７】
また、軟寒天中のコロニー形成、又はクローン原生生存アッセイによって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。たとえば、ＭＡＮ２Ａで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
細胞増殖は代謝的活性細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定することによってもアッセイできる。このようなアッセイとしては、Ｐｒｏｍｅｇａ社による発光同種アッセイであるＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）などが市販されている。
【００３８】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる（Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55）。ＭＡＮ２Ａで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期の異なる段階における細胞の蓄積を示すフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）で評価することができる。
細胞周期への遺伝子の関与は、ＦＯＸＯ核転位置アッセイによっても分析することができる。転写因子のＦＯＸＯファミリーは、細胞周期の進行及び細胞死を含む様々な細胞機能のメディエーターであり、ＰＩ３キナーゼ経路の活性化により負に調節される。ＦＯＸＯファミリーメンバーのＡｋｔリン酸化により、細胞質におけるＦＯＸＯ隔離及び転写の不活性化が起こる（Medema, R. H.他 (2000) Nature 404:782-787）。ＰＴＥＮはＰＩ３キナーゼ経路の負の制御因子である。ＰＴＥＮの活性化、或いはＰＩ３キナーゼ又はＡＫＴの欠失は、ＦＯＸＯのリン酸化を防ぎ、核におけるＦＯＸＯ蓄積、ＦＯＸＯが制御された遺伝子の転写活性化、及びアポトーシスを起こす。或いは、ＰＴＥＮの欠失は、経路の活性化及び細胞の生存に繋がる（Nakamuara, N.他 (2000) Mol Cell Biol 20:8969-8982）。細胞質へのＦＯＸＯの転位置をアッセイに用いて、ＰＴＥＮ経路のメンバー及び／又はモジュレーターを同定するためのスクリーニングを行う。検出試薬としてＧＦＰ又はルシフェラーゼを用いたＦＯＸＯ転位置アッセイは、当技術分野において既知である（例えば、Zhang X他 (2002) J Biol Chem 277:45276-45284; 及びLi他 (2003) Mol Cell Biol 23:104-118）。
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞アッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、ＭＡＮ２Ａが細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【００３９】
血管新生。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管新生をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）；血管新生エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管新生アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この血管新生アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管新生の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、血管新生アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管新生アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で血管新生アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管新生の差により、ＭＡＮ２Ａが血管新生において直接役割を果たすことが示唆される。特に、米国特許第５，９７６，７８２号、同第６，２２５，１１８号及び同第６，４４４，４３４号に様々な血管新生アッセイが記載されている。
【００４０】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、インビトロで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ＭＡＮ２Ａで形質移入させた細胞を（たとえばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、及び残りはＮ２を用いた）低酸素条件下及び正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、ＭＡＮ２Ａを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ＩＧＦＲ機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＩＧＦＲが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補ＩＧＦＲ調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ＩＧＦＲ調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ＭＡＮ２Ａ機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ＭＡＮ２Ａが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【００４１】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングし、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
細胞−細胞接着アッセイでは、天然で生じたリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンド及びペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチド及びモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をインサイツで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。
【００４２】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ＭＡＮ２Ａタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当分野で周知である（Harlow及びLane、1988年、1999年、上掲）。ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
場合によっては、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも、抗体モジュレーターを試験するために使用できる。
【００４３】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＭＡＮ２Ａ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＮ２Ａを発現する２種の細胞プール）中のＭＡＮ２Ａ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125; Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm DH及びGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＭＡＮ２Ａタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow E及びLane D、1988年及び1999年、上掲）。
場合によっては、特にＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡ発現を伴うアッセイ系において、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも核酸モジュレーターを試験するために使用できる。
【００４４】
二次アッセイ
調節剤がＩＧＦＲ経路に関連する様式でＭＡＮ２Ａに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＭＡＮ２Ａ調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するＭＡＮ２Ａ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がＭＡＮ２Ａと相互作用する特異性を試験することもできる。
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＮ２Ａを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＭＡＮ２Ａ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置または偽薬で処置した）細胞や動物と比較してＩＧＦＲ経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、ＩＧＦＲまたは相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【００４５】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは内因性ＩＧＦＲ経路活性を検出するか、あるいはこれはＩＧＦＲ経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【００４６】
動物アッセイ
候補ＭＡＮ２Ａモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるＩＧＦＲ経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥ＩＧＦＲ経路のモデルでは、ＩＧＦＲ経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（たとえば過剰発現または発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
好ましい実施態様では、新脈管形成及び血管新生をモニターすることによってＩＧＦＲ経路の活性を評価する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける、ＭＡＮ２Ａに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるＩＧＦＲ及び正常なＩＧＦＲを有する動物モデルを使用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦなど様々な血管新生剤、またはＭＡＮ２Ａを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入（ＳＣ）する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、または静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを回収する（Ｓｉｇｍａ ｐｌａｓｍａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｔ）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新脈管形成の程度と相関していることが判明した。
【００４７】
別の好ましい実施態様では、ＭＡＮ２Ａにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。腫瘍異種移植アッセイは、当技術分野において既知である（例えば、Ogawa K他, 2000, Oncogene 19:6043-6052を参照）。異種移植片は、通常、既存の腫瘍由来またはインビトロ培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植されたＳＣである。内因的にＭＡＮ２Ａを発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、大量瞬時投与によってＩＶ、ＳＣ、ＩＰ、またはＰＯで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃で固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
別の好ましい実施態様では、ホローファイバーアッセイを使用して腫瘍形成能をモニターする。ホローファイバーアッセイは米国特許第５，６９８，４１３号に開示されている。要約すると、本方法は、実験動物に対し、標的細胞を含む生体適合性の半透明なカプセル封入器を埋め込むこと、実験動物を候補調節剤で処置すること、及び候補モジュレーターに対する反応について標的細胞を評価することを含む。埋め込まれる細胞は、通常、既存の腫瘍又は腫瘍細胞系由来のヒト細胞である。適当な時間、通常約６日を置いて、埋め込んだ細胞を回収し、候補モジュレーターの評価に使用する。腫瘍形成能とモジュレーターの有効性は、マクロカプセル中に存在する生細胞の量をアッセイすることにより評価してもよく、これは、当技術分野において既知の試験、例えばＭＴＴ染色変換アッセイ、ニュートラルレッド染色取り込み、トリパンブルー染色、生細胞計算、軟寒天中に形成されたコロニーの数、細胞の回復能及びインビトロでの複製能等により決定できる。
【００４８】
別の好ましい実施態様では、腫瘍形成能アッセイは、組織特異性の制御配列の制御の下で、優性オンコジーン、又は腫瘍サプレッサー遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物、通常マウスを使用する。これらのアッセイは通常トランスジェニック腫瘍アッセイと呼ばれる。好ましい用途では、トランスジェニックモデルにおける腫瘍の進行の特徴づけ又は制御が良好に行われる。例示的なモデルでは、「ＲＩＰ１−Ｔａｇ２」導入遺伝子は、インスリン遺伝子制御領域の制御の下でＳＶ４０大型Ｔ抗原オンコジーンを有し、膵臓β細胞に発現し、結果的に島細胞悪性腫瘍となる（Hanahan D, 1985, Nature 315:115-122; Parangi S等, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2002-2007; Bergers G等, 1999, Science 284:808-812）。通常過剰増殖性の島細胞のサブセット中の静止毛細血管が血管新生性となるので、「血管新生スイッチ（angiogenic switch）」は、約５週目に起こる。ＲＩＰ１−ＴＡＧ２マウスは１４週で死亡する。候補モジュレーターは、血管新生スイッチの直前（例えば腫瘍予防のモデルの場合）、小規模腫瘍の成長期（例えば処置のモデルの場合）、又は大規模及び／又は浸潤性腫瘍の成長期（例えば退行のモデルの場合）を含め、様々な段階において投与できる。腫瘍形成能及びモジュレーターの有効性は、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態、血管密度、アポトーシス指数などを含め、寿命延長及び／又は腫瘍特性の評価であってもよい。
【００４９】
診断及び治療上の使用
特異的なＭＡＮ２Ａ調節剤は、疾病または疾病予後が血管新生、細胞死、または増殖疾患などＩＧＦＲ経路の欠陥に関連している様々な診断及び治療用途に有用である。したがって、本発明は、ＭＡＮ２Ａ活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくはＩＧＦＲ機能の欠陥又は不全（例えば、ＩＧＦＲの過剰発現、過少発現、又は誤発現、或いは遺伝子突然変異による）を有することが事前に確定されている細胞におけるＩＧＦＲ経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、ＩＧＦＲ機能が修復されたことが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づいたことを意味する。例えば、ＩＧＦＲ機能が修復されると、細胞増殖及び／又は細胞周期の進行が正常化するか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づく。本発明はまた、ＩＧＦＲ経路を調節するＭＡＮ２Ａ調節剤の治療的有効量を投与することによる、ＩＧＦＲ機能不全に関連する疾患又は疾病の治療方法を提供する。さらに本発明は、ＭＡＮ２Ａ調節剤を投与することによる、細胞、好ましくはＭＡＮ２Ａ機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞において、ＭＡＮ２Ａ機能を調節する方法を提供する。これらに加えて、本発明は、ＭＡＮ２Ａ調節剤の治療的有効量を投与することによる、ＭＡＮ２Ａ機能不全に関連する疾患又は疾病の治療法を提供する。
ＭＡＮ２ＡがＩＧＦＲ経路に関係しているという発見により、ＩＧＦＲ経路の欠陥に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、ならびにこのような疾病及び疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【００５０】
特定の試料でＭＡＮ２Ａが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley & Sons, Inc.、第4章; Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125 ;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm及びGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ＭＡＮ２Ａを発現する欠陥ＩＧＦＲシグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、ＭＡＮ２Ａ調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、ＩＧＦＲ欠陥組織は正常組織に比べてＭＡＮ２Ａを過剰発現する。たとえば、完全または部分ＭＡＮ２Ａ ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍及び正常細胞系由来、または腫瘍及び同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がＭＡＮ２Ａを発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織及び腫瘍試料中のＭＡＮ２Ａ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用する（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
たとえばＭＡＮ２Ａオリゴヌクレオチドなどの試薬、及びＭＡＮ２Ａに対する抗体を利用して、上に記載した（１）ＭＡＮ２Ａ遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したＭＡＮ２Ａ ｍＲＮＡの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＭＡＮ２Ａ遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ＭＡＮ２Ａに媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【００５１】
ＭＡＮ２Ａに特異的な抗体を少なくとも１つ、抗体の検出や抗体の固定化等に適する全ての試薬及び／又は装置、並びにそのようなキットを診断又は治療に使用する際の指示書を備えた、様々な試料中のＭＡＮ２Ａの発現を検出するキットもまた提供される。
したがって、特定の実施態様では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得て、（ｂ）試料をＭＡＮ２Ａ発現用のプローブと接触させ、（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較し、及び（ｄ）工程（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＭＡＮ２Ａ発現の変化と結び付けられる患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表１に示す癌である。プローブは、ＤＮＡまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【００５２】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【００５３】
Ｉ．ショウジョウバエＩＧＦＲの過剰発現スクリーニング
ショウジョウバエで、優性機能喪失スクリーニングを行い、ＩＧＦＲシグナル伝達経路と相互作用するか、又はＩＧＦＲシグナル伝達経路を調節する遺伝子を同定した。ショウジョウバエの眼の初期発生段階におけるＩＧＦＲの過剰発現による経路の活性化は、細胞数の増大を引き起こし、その結果成虫の眼が大きく且つ粗くなる（Potter CJ他 (2001) Cell 105:357-368; Huang他、1999. Dev. 126:5365-5372）。本発明者は、ＩＧＦＲの過剰発現により拡大した眼を持つハエのストックをつくり、この表現型のモディファイヤーを同定した。次いで、そのモディファイヤーのヒトオルソログを同定した。
スクリーニングのストックは２つの導入遺伝子を有していた。この表現型は以下の通りである。
＋；＋；P｛ＤｍＩＧＦＲ−ｐＥｘｐ−ＵＡＳ｝Ｐ｛Ｇａｌ４−ｐＥｘｐ−１Ｘｅｙ｝／ＴＭ６Ｂ
【００５４】
上記表現型のスクリーニングによるストックのメスを、３種類のトランスポゾン（ｐｉｇｇｙＢａｃベース）からなる集団に交雑した。その結果得られた、導入遺伝子とトランスポゾンとを含む子孫を、次いで眼過成長表現型に対するトランスポゾンの影響についてスコア化した（亢進、抑制又は影響無し）。全てのデータを記録し、元の交雑をもう一度行ってモディファイヤーの全てを再度試験した。眼の表現型のモディファイヤーがＩＧＦＲ経路のメンバーとして同定された。ＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）は眼の表現型のサプレッサー（抑制物質）であった。モディファイヤーのオルソログを本明細書ではＭＡＮ２Ａと呼ぶ。
ＢＬＡＳＴ分析（Altschul他、上掲）を行ってショウジョウバエモディファイヤーのオルソログを同定した。例えば、ＭＡＮ２Ａ由来の代表的配列であるＧＩ＃４７５８６９８（配列番号５）、及び３１２３２４４（配列番号６）は、ショウジョウバエＣＧ４６０６（α−ｍａｎ−ＩＩｂ）と、それぞれ４３％、及び４４％のアミノ酸同一性を有していた。
【００５５】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、及び機能的サブユニットを、ＰＳＯＲＴ（Nakai K.及びHorton P.、Trends Biochem Sci、1999、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000）、ＰＦＡＭ（Bateman A.等、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2）、ＳＭＡＲＴ（Ponting CP等、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32）、ＴＭ−ＨＭＭ（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998）、及びクラスト（clust）（Remm M及びSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89）プログラムを使用して分析した。例えば、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｎ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０１０７４）は、概ね、アミノ酸残基１６７−４９８及び１６７−４９８にそれぞれ位置している。また、ＧＩ＃４７５８６９８及び３１２３２４４（それぞれ配列番号５及び６）由来のＭＡＮ２Ａのグリコシル加水分解酵素ファミリー３８Ｃ末端ドメイン（ＰＦＡＭ０７７４８）は、概ね、アミノ酸残基６４８−１１３９及び６４８−１１３５にそれぞれ位置している。
【００５６】
ＩＩ．ハイスループットのＩｎ Ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＭＡＮ２Ａペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がＭＡＮ２Ａ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【００５７】
ＩＩＩ．ハイスループットのＩｎ Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
３３Ｐ標識のＭＡＮ２Ａペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補ＩＧＦＲ調節剤として同定された。
【００５８】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、ＭＡＮ２Ａタンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入での総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、二フッ化ビニリデン樹脂膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【００５９】
Ｖ．発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織及び腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、ＵＣ Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｒｄａｉｓ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ及びＡｍｂｉｏｎから得た。
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を使用した。
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムヘキサマー及び各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、及びｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。発現分析は７９００ＨＴ機器を使用して行った。
【００６０】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマー及び２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを、９６ウェルプレートでは２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｏｏｌ）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織及び細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差の２倍を超える場合（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての正常試料））に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【００６１】
結果を表１に示す。各腫瘍種類について、同一患者から採取した腫瘍試料と一致する正常組織の対の数を示す。また、各腫瘍種類について、少なくとも二倍の過剰発現を示した試料の割合を示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（または複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
表１
【００６２】
ＶＩ．ＭＡＮ２Ａ機能アッセイ
ＲＮＡｉ実験を行い、小干渉ＲＮＡ（siRNA, Elbashir等、上掲）を用いて様々な細胞系におけるＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）の発現をノックダウンした。
細胞増殖及び成長に対するＭＡＮ２Ａ ＲＮＡｉの影響。上述のようにＢｒｄＵ及びＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞増殖に対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。これら実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）のＲＮＡｉが、２３１Ｔ乳癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、ＰＣ３前立腺癌細胞、及びＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞における増殖を低減させることが示された。
【００６３】
上述のように標準コロニー成長アッセイを用いて、細胞成長に対するＭＡＮ２Ａ発現低下の影響を研究した。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉが、Ａ５４９及びＡ２７８０卵巣癌細胞における増殖を低減し、また２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞及びＡ５４９細胞の細胞数を低下させることが示された。ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）のＲＮＡｉは、Ａ５４９細胞の細胞数を低下させた。
上述のように［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを用いて、細胞増殖に対するＭＡＮ２Ａ発現の影響を研究した。この実験の結果、配列番号１のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉは、Ａ５４９細胞及びＡ２７８０細胞、並びにＲＤ１黄紋筋肉腫細胞における増殖を低減させることが示された。配列番号４のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉは、Ａ５４９及びＲＤ１細胞における増殖を低減させる。
【００６４】
アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ ＲＮＡｉの影響。上述のようにホスホ−ヒストンＨ２Ｂアッセイを行って、アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。この実験の結果は、配列番号１のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉが、２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞、及びＵ８７ＭＧ細胞におけるアポトーシスを増大させ、配列番号４のＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉが、ＰＣ３細胞におけるアポトーシスを増大させることを示すものであった。
上述のようにマルチパラメータアポトーシスアッセイを行って、アポトーシスに対するＭＡＮ２Ａ発現の低下の影響を研究した。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１、及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１、及び４）のＲＮＡｉが、Ａ２７８０細胞及びＡ５４９細胞にアポトーシスを増大させることが示された。
【００６５】
転写レポーターアッセイ。また、様々な転写因子の発現に対するＭＡＮ２Ａ過剰発現の影響を研究した。ＭＡＮ２Ａの過剰発現により、転写因子の発現が増大した。加えて、他の転写レポーターアッセイを行い、様々な転写因子の発現に対するＭＡＮ２Ａの過剰発現の影響を測定した。このアッセイでは、ラット腸管上皮（ＲＩＥ）細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＭＡＮ２Ａと一緒に様々な転写因子とルシフェラーゼを含むレポーターコンストラクトを用いて同時形質移入した。次いでＭＡＮ２Ａの過剰発現に起因する転写活性を読み出すことによりルシフェラーゼ強度を測定した。過剰発現した配列番号１のＭＡＮ２Ａは、ＡＰ１（活性因子タンパク質１）転写因子の発現を増大させた。
【００６６】
ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路への関与：ＭＡＮ２Ａ ＦＯＸＯ核転写アッセイ。上述のようにＦＯＸＯ核転写アッセイを行って、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を評価した。一組の実験では、ＲＮＡｉによってＭＡＮ２Ａの発現を低減させた細胞を、ＧＦＰタグを付したＦＯＸＯを発現するプラスミドを用いて過渡的に形質移入した。次いで核及び細胞質等の細胞要素の自動画像化を行ってＦＯＸＯの転位置を評価した。その結果、配列番号１のＭＡＮ２Ａの発現低下により、核内におけるＦＯＸＯの貯留、ＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こった。これはＵ２０Ｓ骨肉腫細胞におけるＰＴＥＮの欠失に類似していた。別の実験では、ＦＯＸＯを含むプラスミドと共にＭＡＮ２Ａに方向付けたｓｉＲＮＡ、並びにプロモーター、ＦＯＸＯ応答因子、及びルシフェラーゼを含むカセットを用いて細胞を同時形質移入した。次いで、ルシフェラーゼ活性について細胞を分析し、ｓｉＲＮＡを含まない細胞と比較した。この結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）の発現低下により、Ａ２７８０細胞及びＰＣ３細胞において、ＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こり、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）の発現の低下により、Ａ２７８０細胞においてＦＯＸＯの細胞質への転位置が起こった。これらの結果は、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を示唆するものである。
Ｐａｎ−ＡＫＴアッセイ。このアッセイは、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路におけるＭＡＮ２Ａの関与を検出するために開発されたものである。本アッセイでは、ＰＲＡＳ４０、ＢＡＤ、４ＥＢＰ１、及びＲＰＳ６等、ＡＫＴの複数の基質についてリン酸化の変化を検出する。この実験のために、コンセンサスリン酸化ＡＫＴ基質配列ＲｘＲｘｘＳ／Ｔを含む、リン酸化したＡＫＴ基質に対して抗体を産生させる。次いで、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール（ＡＫＴ）の存在下で、その後ＭＡＮ２Ａノックアウトを用いて、リン酸化基質の発現レベルを通常レベルで定量化した。例えば、ＡＫＴレベルを低下させたとき、その全ての基質の発現も低減した。その結果ＭＡＮ２Ａ１及びＭＡＮ２Ａ２（それぞれ配列番号１及び４）のＲＮＡｉは、２３１Ｔ細胞及びＡ５４９細胞におけるリン酸化ＡＫＴ基質のレベルを低下させることが示された。
【００６７】
本発明者は、基質としてＲＰＳ６アッセイを用いて一連の実験を行った。ＲＰＳ６は、ＡＫＴのＩＧＦ依存性基質である。ＩＧＦ１処理により、細胞質のＲＰＳ６のレベルが上昇した。他の場合では、ＰＩ３ＫインヒビターであるＬｉｌｙ化合物ＬＹ２９４００２は、ＡＫＴ及び細胞質のＲＰＳ６レベルを低下させた。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、ＲＰＳ６抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化ＲＰＳ６の量が低減することが示された。
基質として４ＥＢＰ１を用いて別の実験を行った。この基質については、ＡＫＴ経路の阻害により、細胞質の染色が低減し、核の染色が増大した。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、４ＥＢＰ１抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、核／細胞質の染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化４ＥＢＰ１の量が低減することが示された。
【００６８】
本発明者はまた、基質としてＰＲＡＳ４０を使用して別の実験を行った。この基質については、経路の阻害により、細胞質の染色が低減し、核及び核周囲の染色が増大した。９６ウェルプレートに細胞を広げ、ＭＡＮ２ＡのＲＮＡｉを形質移入し、固定し、ＰＲＡＳ４０抗体で処理して染色した。測定は、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール細胞と比較して、核／細胞質の染色が増大又は低減した細胞の数量比に基づいて行った。この実験の結果、ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉにより、２３１Ｔ細胞、ＰＣ３細胞、及びＡ５４９細胞におけるリン酸化ＰＲＡＳ４０の量が低減し、ＭＡＮ２Ａ２（配列番号４）のＲＮＡｉにより、Ａ５４９細胞におけるリン酸化ＰＲＡＳ４０の量が低減することが示された。総括すると、これらの実験の結果は、ＩＧＦＲ経路におけるＭＡＮ２Ａ２の関与を示すものである。
【００６９】
ハイスループットＰＴＥＮ／ＩＧＦ転写読み取りアッセイ。このアッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）転写読み取りアッセイの拡張版であり、内在性ＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化をモニターする。このアッセイは、経路シグナル伝達の活性を読み取って、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御細胞遺伝子の発現の変化を測定する。
本発明者は、ＰＴＥＮ／ＩＧＦシグナル伝達により転写が制御された一連の遺伝子を同定し、次いでＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブの組を設定し、試験した。ＲＮＡｉによりＰＴＥＮ／ＩＧＦの発現を低減させて、複数の細胞種類における転写制御された遺伝子の発現に対するその影響を研究した。次いで遺伝子群からの読み出しを１０の最も頑強なプローブに絞り込んだ。
【００７０】
次に、本発明者は、ここで対象とするＭＡＮ２Ａ等の標的遺伝子のｓｉＲＮＡにより癌細胞を処理し、標的遺伝子のレベルの低下がＰＴＥＮ／ＩＧＦ制御遺伝子パネルの発現レベルにどのように影響するかを研究した。
少なくとも２つの異なるＲＮＡｉオリゴによりノックアウトしたとき、遺伝子群の少なくとも３分の１にＰＴＥＮ／ＩＧＦノックアウトと同じ活性パターンを示す遺伝子を、ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路に関与していると同定した。
【００７１】
３８４ウェルフォーマットにおいて、ＲＮＡｓにＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを実施した。
ＭＡＮ２Ａ１（配列番号１）のＲＮＡｉは、２３１Ｔ細胞及びＰＣ３細胞において、転写制御した遺伝子の少なくとも３分の１に、少なくとも２つのＲＮＡｉオリゴのＰＴＥＮ／ＩＧＦ ＲＮＡｉと同じ活性パターンを示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を提供する工程と、
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補ＩＧＦＲ経路調節剤として同定する工程と
を含む、候補ＩＧＦＲ経路調節剤を同定する方法。
【請求項２】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加えて培養細胞が欠陥ＩＧＦＲ機能を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アッセイが加水分解酵素アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、及び低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ｄ）（ｃ）で同定された候補ＩＧＦＲ経路調節剤を、ＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、ＩＧＦＲ機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
モデル系が欠陥ＩＧＦＲ機能を有するマウスモデルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりＩＧＦＲ機能が修復される、細胞のＩＧＦＲ経路を調節する方法。
【請求項１４】
ＩＧＦＲ機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
候補モジュレーターが抗体及び小分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
（ｄ）ＭＡＮ２Ａを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、
（ｅ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、
（ｆ）作用剤の影響を受けた第２アッセイ系の活性を検出する工程
をさらに含み、作用剤の影響を受けた第２アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補ＩＧＦＲ経路調節剤であることが同定され、
ここで第２アッセイが作用剤の影響を受けたＩＧＦＲ経路における変化を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト動物がＩＧＦＲ経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の細胞をＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のＩＧＦＲ経路を調節する方法。
【請求項２１】
ＩＧＦＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）患者から生体試料を得て、
（ｂ）試料をＭＡＮ２Ａ発現用のプローブと接触させ、
（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較し、そして
（ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する
ことを含む、患者の疾病を診断する方法。
【請求項２４】
前記疾病が癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、表１に示すように２５％より高い発現レベルである癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）ＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を提供する工程と、
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補ＩＧＦＲ経路調節剤として同定する工程と
を含む、候補ＩＧＦＲ経路調節剤を同定する方法。
【請求項２】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加えて培養細胞が欠陥ＩＧＦＲ機能を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アッセイが加水分解酵素アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、及び低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アッセイ系がＭＡＮ２Ａ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ｄ）（ｃ）で同定された候補ＩＧＦＲ経路調節剤を、ＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、ＩＧＦＲ機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
モデル系が欠陥ＩＧＦＲ機能を有するマウスモデルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＧＦＲ機能に欠陥がある細胞を、ＭＡＮ２Ａポリペプチドに特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりＩＧＦＲ機能が修復される、細胞のＩＧＦＲ経路を調節する方法。
【請求項１４】
ＩＧＦＲ機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
候補モジュレーターが抗体及び小分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
（ｄ）ＭＡＮ２Ａを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、
（ｅ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、
（ｆ）作用剤の影響を受けた第２アッセイ系の活性を検出する工程
をさらに含み、作用剤の影響を受けた第２アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補ＩＧＦＲ経路調節剤であることが同定され、
ここで第２アッセイが作用剤の影響を受けたＩＧＦＲ経路における変化を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト動物がＩＧＦＲ経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の細胞をＭＡＮ２Ａポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のＩＧＦＲ経路を調節する方法。
【請求項２１】
ＩＧＦＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）患者から生体試料を得て、
（ｂ）試料をＭＡＮ２Ａ発現用のプローブと接触させ、
（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較し、そして
（ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する
ことを含む、患者の疾病を診断する方法。
【請求項２４】
前記疾病が癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、表１に示すように２５％より高い発現レベルである癌である、請求項２４に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２４４１３（Ｐ２００７−５２４４１３Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１６２８（Ｐ２００６−５５１６２８）
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７３７２５
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０４４０８７９７）エクセリクシス， インク． (65)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７３７２５
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０４４０８７９７）エクセリクシス， インク． (65)
【Ｆターム（参考）】
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