ＬＡＭＰ法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット
【課題】LAMP法によりジフテリア毒素遺伝子を高感度および特異的に検出できるプライマー配列、このプライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子の検出方法を提供する。上記プライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子検出用キットを提供する。
【解決手段】ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、検体からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された特定の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット、または、配列表に示された他の特定の塩基配列をさらに含むプライマーセット。
【解決手段】ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、検体からＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された特定の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット、または、配列表に示された他の特定の塩基配列をさらに含むプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリアは、主にジフテリア菌Corynebacterium diphtheriaeによって起こる感染症で、我が国の感染症法では2類に分類される重要な疾患である。ジフテリアは、日本ではワクチン接種の普及に伴い患者の報告が激減し、過去に10年間に数例の発生が見られるだけで報告のない年もある。しかし、１９９０年代のロシアでのジフテリア大発生（患者数１５万人、死者４０００人）により、まだ制圧にはほど遠いことが示されたのは記憶に新しい。ジフテリアのサーベイランスとワクチン接種の重要性が再認識されている。また、欧州ではジフテリア様患者から毒素産生性C.ulceransの分離報告があり、日本国内でも2001年と2002年に2名のジフテリア様患者から本菌が分離・確認された。近年、さまざまな疾病の診断に分子学的検査法が盛んに導入されており、ジフテリアの検査においても早期かつ簡便な方法が求められている。また、アジア地区ではジフテリアの散発が報告されている。
【０００３】
臨床検査の現場におけるジフテリア毒素遺伝子検出の意義と現状
ジフテリアの病態には、ジフテリア菌が産生する主要な病原因子であるジフテリア毒素が極めて重要な役割を果たしており、感染症法においても、患者から分離された菌がこのジフテリア毒素を産生するかどうかが、感染症としてのジフテリアと見なされるかどうかの決め手となる。
【０００４】
従って、現行の実験室内診断（臨床検査）は基本的に分離菌のジフテリア毒素産生性の証明をクライテリアとしており、スワブ等の臨床検体から菌が分離されることが前提である。そのため、菌分離が不能で診断そのものが成り立たず「ジフテリア疑い」で終わってしまうことも多く、また運良く菌が分離されても菌の同定と毒素産生性の証明を経て診断が確定するまでに１週間近くの期間が必要である。ジフテリアは隔離が義務づけられる2類感染症であり、公衆衛生的見地から実験室診断（臨床検査）の迅速化が求められている。
【０００５】
新規迅速診断法が備えるべき条件と問題
前項に述べたように、「ジフテリア毒素産生菌」の存在を迅速に検知できることが条件である。この条件を満たすために、分子生物学的な手法を用いた試みがなされてきた。ジフテリア毒素遺伝子をターゲットとしたPCR法、リアルタイムPCR法が研究レベルではすでに開発されている（PCR法： Nakao et al. J. Clin. Microbiol. 1997, 35(7)1651-1655(非特許文献1、リアルタイムPCR法： Mothershed et al. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(12)4713-4719(非特許文献 2)。
【０００６】
ジフテリア菌の分子学的検査法としては
【０００７】
【非特許文献１】Nakao et al. J. Clin. Microbiol. 1997, 35(7)1651-1655
【非特許文献２】Mothershed et al. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(12)4713-4719
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
PCRを用いた実験室診断法はジフテリア菌DNA検出系として十分に実用に耐え得るものであり、現行の実験室診断を補助する方法として使われつつある。しかし、サーマルサイクラー等の特殊な機器を必要とすることが難点であり、より簡便で一般の実験室でも遂行可能な方法の開発が望まれている。
【０００９】
近年、PCR法に代わる遺伝子診断法として、簡便かつ迅速な診断を可能とするLAMP法（Loop mediated isothermal Amplification）が開発され、多くの感染症でその応用研究が進められている。LAMP法はPCR反応に必須な遺伝子増幅装置を必要とせず、短時間に判定できる利点を有し、さらに反応系に蛍光色素を添加することで目視による判定を可能とする。そのため機器類が十分に整備されていない病院などの検査室にも導入可能な検査技術として注目されている。しかし、ジフテリア菌に対するLAMP法プライマーは、実用に耐え得る程度の増幅能力を有するものは開発されていないため、ジフテリア菌を特異的に検出するLAMP法プライマーの設計とその評価が必要であった。
【００１０】
本発明は、ジフテリア毒素産生菌の簡便で高感度・特異的な検出を行なうことを課題としている。この課題を解決するために、本発明は、LAMP法によりジフテリア毒素遺伝子を高感度・特異的に増幅・検出できるプライマー配列を提供し、このプライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、上記プライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
［1］ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。
［2］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む［1］に記載の方法。
［3］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む［2］に記載の方法。
［4］増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［5］検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
［6］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む［5］に記載のプライマーセット。
［7］［5］または［6］に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者らは、ジフテリア毒素に特異的な遺伝子領域（ジフテリア毒素遺伝子 (tox) のうち毒素Aサブユニットをコードする領域の内部）に対し６種のLAMP法プライマーを組み合わせたプライマーセットCd#16を設計することにより、高感度で特異性に優れたジフテリア毒素遺伝子検出系を構築した。
【００１４】
本発明によれば、ジフテリア毒素遺伝子を高感度かつ特異的に検出することができる。LAMP法はPCR法のような煩雑な操作を必要しないため、病院などの検査室に導入可能な技術である。そのため、本発明により簡便かつ迅速なジフテリア診断が臨床現場で可能となる。これにより、感染症法で患者の隔離が義務づけられているジフテリアの診断の迅速化を通して、公衆衛生的に迅速な対応が可能になると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
(1)ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
(2)検体からＤＮＡを抽出する。
(3)抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
(4)増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。
【００１６】
[プライマーセット]
本発明の方法では、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。ジフテリア菌は、Corynebacterium diphtheriae属する細菌であり、12種類のジフテリア菌(毒素原性、非毒素原性)遺伝子に特異的な配列を探索し、Aサブユニット遺伝子の内部の配列(配列番号7)を選定し、さらにこの配列に対しLAMP法プライマーの設計を行なった。設計にはLAMP法プライマー設計支援ソフト（PrimerExplorer Ver.3、栄研化学）を使用し、設計されたプライマーセットの中から本発明者らが、候補となり得ると考えた8種類のプライマーセットを選択した。そして、選択されたプライマーセットを合成し、各プライマーセットについて、その検出感度と特異性を1種類のジフテリア菌から精製したDNAを用いて検討した。その結果、本発明のプライマーセットが最も高い感度を示した。
【００１７】
本発明においては、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットとしては、以下の配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００１８】
図１に、ジフテリア菌のジフテリア毒素遺伝子に対するプライマーセットCd#16の設計位置を示した。LFとLBはloop プライマーを示し、LAMP法による増幅領域はF2からB2cである。
【００１９】
配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることで、ジフテリア毒素遺伝子の一部のＤＮＡをLAMP法により増幅することができる。増幅されるＤＮＡの最小単位は70bpと計算されるが、LAMP法ではＤＮＡがカリフラワー様に増幅するので、実際には70bp以外の様々なサイズの遺伝子が増幅される。
【００２０】
Cd#16#F3#HPLC：AAAGGTTCGGTGATGGTG(配列番号1)
Cd#16#B3#HPLC：CAATGAGCTACCTACTGATCG(配列番号2)
Cd#16#FIP#HPLC：TAACGCTTTCGCCTGTTCCCTGTAGTGCTCAGCCTTCC(配列番号3)
Cd#16#BIP#HPLC：GTGGAAAACGTGGCCAAGATCCTGACACGATTTCCTGC(配列番号4)
【００２１】
Cd#16#F3は、tox遺伝子ORF中の位置：nt 449-466であり、Cd#16#B3：は、tox遺伝子ORF中の位置：nt 672-652である。Cd#16#FIPは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 552-533, 474-491であり、Cd#16#BIPは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 584-603, 651-634である。
【００２２】
本発明の方法では、上記4種類のプライマーは、それぞれ上記で示した全配列を有することが、検体中にジフテリア毒素遺伝子が存在する場合、ジフテリア毒素遺伝子を菌株の種類によらず確実に増幅するという観点から好ましい。但し、各プライマーともその一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、同様のプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号1〜4のいずれかの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅することができるプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部または全部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００２３】
本発明のプライマーセットは、前記４種類のＤＮＡに加えて、以下のＤＮＡ（ｌｏｏｐプライマー）をさらに含むことが好ましい。
Cd#16#LF#HPLC：CGCTAGAACTCCCCTCAGC(配列番号5)
Cd#16#LB#HPLC：GCGATGTATGAGTATATGGCTCAAG(配列番号6)
【００２４】
Cd#16#LFは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 514-496であり、Cd#16#LBは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 604-628である。
【００２５】
本発明の方法において、プライマーセットは、上記ｌｏｏｐプライマーを含まなくても、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅することはできる。しかし、上記ｌｏｏｐプライマーを含む場合の方が、増幅時間を大幅に短縮でき、好ましい。
【００２６】
上記ｌｏｏｐプライマーにおいても、各プライマーの一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、ｌｏｏｐプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号５または６の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅する際のｌｏｏｐプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００２７】
尚、本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、より好ましくは１から３個、さらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個を意味する。
【００２８】
本発明の上記プライマーセットを構成する各ＤＮＡは、前記塩基配列に基づいて、既知のＤＮＡ調製方法により適宜入手することができる。
【００２９】
本発明は、上記プライマーセットを用いる、ジフテリア毒素遺伝子の検出方法に関するが、本発明は、上記プライマーセット自体を発明として包含する。さらに本発明は、上記本発明のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキットも包含する。
【００３０】
本発明のプライマーセットは、例えば、1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量の前記4種類または6種類のプライマー(ＤＮＡ)を含む形態であることができる。1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量のプライマー(ＤＮＡ)量は、例えば、5 〜 40 pmol / 反応チューブの範囲である。
【００３１】
[ＤＮＡ抽出]
本発明の方法では、検体からＤＮＡを抽出する。具体的には、検体中の菌株から市販のDNA抽出キットを用いて直接DNAを抽出する。DNA抽出キットとしては例えば、QIAamp DNA Micro Kit （Cat. No. 56301、Qiagen社）を挙げることができる。あるいは、検体からＤＮＡを抽出せず、菌体を煮沸(boil)するだけの簡単な調製法でも、本発明の方法において鋳型として用いるＤＮＡは調製できる。
【００３２】
[LAMP法による増幅]
本発明の方法では、抽出したＤＮＡ（DNAテンプレイト）を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水）を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイト(抽出したＤＮＡ)を加える。次いで、例えば、65℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
【００３３】
[増幅されたＤＮＡの確認]
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれている場合、増幅操作によりジフテリア毒素遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるＤＮＡはない。
【００３４】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認することができる。増幅産物の濁度の測定は、具体的には、以下のように行うことができる。リアルタイム濁度測定装置により経時的に、あるいは濁度測定装置により最終増幅産物の濁度を測定する。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、UVランプを当てることにより目視で反応液の蛍光発色を観察することで行うことができる。
【００３５】
本発明は、前記方法で説明したプライマーセットを包含する。さらに、本発明は、本発明のプライマーセットを含むキットも包含する。キットに含まれるものは、例えば、以下の物であることができる。
1.Bst DNAポリメラーゼ
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA（陽性コントロール）
6.反応チューブ
7.説明書
【００３６】
前述のように、本発明の方法では、ＤＮＡの増副産物の有無を濁度測定または蛍光目視検出により行うことができる。蛍光目視で検出する場合は、上記キットに蛍光目視試薬を含めることができる。濁度測定装置を使用する場合には、キットには蛍光目視検出試薬は含めない。
【実施例】
【００３７】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３８】
材料と方法
菌株と試薬
ジフテリア菌ATCC700971(NCTC13129)は米国ATCCから購入した。その他のジフテリア菌菌株は研究室保存のものおよびATCCから購入したものを用いた。
【００３９】
血液寒天培地は日水製薬（株）製のものを用いた。BHI (Brain Heart Infusion)液体培地はDifco (Becton Dickinson)製のものを37g/lになるように精製水で溶解し滅菌して用いた。
【００４０】
DNA増幅には栄研化学製LoopAmp DNA増幅試薬キットを用いた。血液寒天上のコロニーからの総DNA抽出にはQiagen 社製のGenomic Tip -20または100とQiagen Genomic Buffer Setを用いた。
【００４１】
培養
凍結保存した菌を血液寒天培地に塗布あるいはBHI液体培地に懸濁し、37℃一晩から二晩培養して実験に用いた。これらの培養を同様の培地に植え継いだ培養も、同様に用いた。
【００４２】
DNA調製
(1) 血液寒天上コロニーからのQiagen による精製
血液寒天平板培地上で37℃一晩培養した菌体を2mlの精製水に懸濁しながらコンラージ棒で集め、遠心して洗ったのち、Qiagenキットの指定に従い総DNAを抽出した。リゾチームのみ指定と異なる量(50mg/ml)を用いた。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
【００４３】
(2) 塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心による精製
200mlのBHI液体培地で37℃一晩培養した菌体を遠心集菌し、生理食塩水で菌体を洗浄してから凍結融解したのち、27mg/mlのリゾチームを含むQiagen Genomic Buffer SetのB1溶液11mlに懸濁して37℃一晩インキュベート、さらにタカラバイオ社製Proteinase Kを1ml加えて37℃1時間インキュベートした。次にQiagen Genomic Buffer SetのB2溶液を4mlとQiagen RNase溶液を10μl加え50℃1時間インキュベートして菌体を溶解した。得られた菌体ライセートを、のフェノール/クロロホルム処理2回とのクロロホルム処理1回で除蛋白を行ない、エタノール沈澱で粗DNA画分を得た。粗DNA画分から、常法による塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心で精製DNAを得た。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
【００４４】
(3) 寒天平板培地上コロニーからのボイル法による粗DNAの調製
血液寒天平板培地またはBHI寒天平板培地上に菌を塗布し37℃一晩培養して生じたコロニーをかきとり、精製水に懸濁してOD600を測定して適当に精製水で希釈して、OD6001= 1の懸濁液を調製した。このOD = 1の懸濁液をさらに10倍ずつ段階希釈し、OD = 0.001までの懸濁液を調製した。これらの懸濁液をアルミブロックヒーターで100℃30分加熱し、遠心した上清をDNAテンプレートとして用いた。
【００４５】
プライマーの設計
栄研化学（株）のwebサイト上で動作するwebアプリケーション"Primer Explorer Ver3"を用いて、NCBIから得られたジフテリア毒素遺伝子の塩基配列情報をもとにプライマーを設計した。設計したプライマーはジフテリア毒素Aサブユニットに対応する遺伝子領域上に位置し、上記配列番号1〜6に示す塩基配列である。プライマーは、全て北海道システムサイエンス社による受託合成（HPLC精製グレード）のものを用いた。
【００４６】
LAMP法によるDNA増幅
栄研化学（株）「LoopAmp DNA増幅試薬」の取扱説明書によった。増幅されたDNAの検出は、栄研化学LA-320c型リアルタイム濁度検出器によった。
【００４７】
PCR
LAMPプライマーセットの感度と特異性は、既存のPCR法（非特許文献1）と比較することにより実施した。遺伝子増幅の有無は、PCR産物5μLを1％アガロースゲル電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色により確認した。
【００４８】
LAMP検出系
Loopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学）を用いて、LAMPプライマーセットの検出感度と特異性を評価した。LAMP検出系は反応液25 μl中に、0.2 μM の各outer primer (F3, B3)、1.6 μMの各inner primer (FIP,BIP)、0.8 μMの各loop primer (LF,LB)、1 μlのBst-DNA polymerase、12.5 μlの２×反応液、1 μlのDNA溶液を含み、65℃で１時間反応させた。その後、80℃で2分間の反応停止処理を行なった。反応チューブにはLoopamp反応チューブ（栄研化学）を使用し、遺伝子増幅に伴う濁度の増加はリアルタイム測定装置（Loomamp LA-320C、栄研化学）を用いて測定した。表1にLAMP検出系の反応組成を示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
プライマーセットCd#16を用いたLAMP検出系の感度をまとめて以下の表2に示す。精製ジフテリア菌DNAを連続希釈し、LAMP検出系の検出限界を測定し、表に示した。リアルタイム測定装置（Loopamp LA-320C、栄研化学）を用いて濁度の増加を測定した結果である。
【００５１】
【表２】
【００５２】
BHI液体培地で培養したジフテリア菌C. diphtheriae ATCC700971株よりCsCl密度勾配超遠心法で精製したゲノムDNAを様々な濃度に希釈して鋳型として用い、通常の条件（64℃）で増幅反応を行なうことにより、１０コピー以上のゲノムDNAが反応液中にあれば、本発明のプラーマーセットCd#16を用いたLAMP法で検出可能であることが明らかになった。
【００５３】
図２にBHI液体培養からCsCl精製したジフテリア菌DNA を鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。10コピーを１５〜３０分で増幅する感度であった。
【００５４】
また、実際の臨床検査現場での簡便な使用を考え、培養した菌体を蒸留水に懸濁し100℃で30分間加熱した上清を供試することでも検出が可能であった。血液寒天培地上のコロニーではOD600 = 1になるように懸濁した菌懸濁液から、BHI液体培地で培養した菌体の場合は、OD600 = 0.001になるように懸濁した菌懸濁液から、ジフテリア毒素遺伝子が検出された。
【００５５】
Corynebacterium属細菌に対するLAMP検出系の特異性を示すため、ジフテリア菌14菌株および近縁菌Corynebacterium ulcerans 2菌株のDNAを鋳型として、プライマーセットCd#16を用いたLAMP法での検出結果とPCR法による検出結果を比較することで特異性を検討した結果を以下の表3に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表3に示すように、C. diphtheriae 14菌株と近縁菌Corynebacterium ulcerans 2菌株から精製したゲノムDNAについて、本発明のプライマーセットCd#16を用いてLAMP法によるジフテリア毒素遺伝子の検出を試みた。C. diphtheriae 14菌株のうち10菌株からジフテリア毒素遺伝子が検出され、残り4菌株からは検出されなかった。Corynebacterium ulcerans 2菌株についてはいずれからもジフテリア毒素遺伝子が検出された。これら16菌株についての検出結果は、従来法であるジフテリア毒素遺伝子を対象としたPCR法による検出結果と完全に一致したことから、本発明のプライマーセットCd#16は、特異性の高いLAMP法検出に適していることが示された。
【００５８】
図3に血液寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。感度は1OD (約1 x 105 cfu)であった。
【００５９】
図4にBHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。感度は、0.001OD (=100cfu)であった。ただしボイルしてすぐ使うことが好ましい。
【００６０】
図5にBHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAの調製DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果とＰＣＲを増幅の結果を合わせて示す。12菌株のジフテリア菌 (毒素原性、非毒素原性)（毒素原性C. ulcerans）を用いた。検出結果はPCRとよく一致した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によるプライマーセットを用いたLAMP検出系は、ジフテリア菌感染症の体外診断薬としての実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】LAMP法プライマーの設計の説明図。
【図２】BHI液体培養からCsCl精製したジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図３】血液寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図４】BHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図５】BHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果とＰＣＲを増幅の結果を合わせて示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリアは、主にジフテリア菌Corynebacterium diphtheriaeによって起こる感染症で、我が国の感染症法では2類に分類される重要な疾患である。ジフテリアは、日本ではワクチン接種の普及に伴い患者の報告が激減し、過去に10年間に数例の発生が見られるだけで報告のない年もある。しかし、１９９０年代のロシアでのジフテリア大発生（患者数１５万人、死者４０００人）により、まだ制圧にはほど遠いことが示されたのは記憶に新しい。ジフテリアのサーベイランスとワクチン接種の重要性が再認識されている。また、欧州ではジフテリア様患者から毒素産生性C.ulceransの分離報告があり、日本国内でも2001年と2002年に2名のジフテリア様患者から本菌が分離・確認された。近年、さまざまな疾病の診断に分子学的検査法が盛んに導入されており、ジフテリアの検査においても早期かつ簡便な方法が求められている。また、アジア地区ではジフテリアの散発が報告されている。
【０００３】
臨床検査の現場におけるジフテリア毒素遺伝子検出の意義と現状
ジフテリアの病態には、ジフテリア菌が産生する主要な病原因子であるジフテリア毒素が極めて重要な役割を果たしており、感染症法においても、患者から分離された菌がこのジフテリア毒素を産生するかどうかが、感染症としてのジフテリアと見なされるかどうかの決め手となる。
【０００４】
従って、現行の実験室内診断（臨床検査）は基本的に分離菌のジフテリア毒素産生性の証明をクライテリアとしており、スワブ等の臨床検体から菌が分離されることが前提である。そのため、菌分離が不能で診断そのものが成り立たず「ジフテリア疑い」で終わってしまうことも多く、また運良く菌が分離されても菌の同定と毒素産生性の証明を経て診断が確定するまでに１週間近くの期間が必要である。ジフテリアは隔離が義務づけられる2類感染症であり、公衆衛生的見地から実験室診断（臨床検査）の迅速化が求められている。
【０００５】
新規迅速診断法が備えるべき条件と問題
前項に述べたように、「ジフテリア毒素産生菌」の存在を迅速に検知できることが条件である。この条件を満たすために、分子生物学的な手法を用いた試みがなされてきた。ジフテリア毒素遺伝子をターゲットとしたPCR法、リアルタイムPCR法が研究レベルではすでに開発されている（PCR法： Nakao et al. J. Clin. Microbiol. 1997, 35(7)1651-1655(非特許文献1、リアルタイムPCR法： Mothershed et al. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(12)4713-4719(非特許文献 2)。
【０００６】
ジフテリア菌の分子学的検査法としては
【０００７】
【非特許文献１】Nakao et al. J. Clin. Microbiol. 1997, 35(7)1651-1655
【非特許文献２】Mothershed et al. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(12)4713-4719
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
PCRを用いた実験室診断法はジフテリア菌DNA検出系として十分に実用に耐え得るものであり、現行の実験室診断を補助する方法として使われつつある。しかし、サーマルサイクラー等の特殊な機器を必要とすることが難点であり、より簡便で一般の実験室でも遂行可能な方法の開発が望まれている。
【０００９】
近年、PCR法に代わる遺伝子診断法として、簡便かつ迅速な診断を可能とするLAMP法（Loop mediated isothermal Amplification）が開発され、多くの感染症でその応用研究が進められている。LAMP法はPCR反応に必須な遺伝子増幅装置を必要とせず、短時間に判定できる利点を有し、さらに反応系に蛍光色素を添加することで目視による判定を可能とする。そのため機器類が十分に整備されていない病院などの検査室にも導入可能な検査技術として注目されている。しかし、ジフテリア菌に対するLAMP法プライマーは、実用に耐え得る程度の増幅能力を有するものは開発されていないため、ジフテリア菌を特異的に検出するLAMP法プライマーの設計とその評価が必要であった。
【００１０】
本発明は、ジフテリア毒素産生菌の簡便で高感度・特異的な検出を行なうことを課題としている。この課題を解決するために、本発明は、LAMP法によりジフテリア毒素遺伝子を高感度・特異的に増幅・検出できるプライマー配列を提供し、このプライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、上記プライマー配列を用いたジフテリア毒素遺伝子検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
［1］ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。
［2］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む［1］に記載の方法。
［3］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む［2］に記載の方法。
［4］増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［5］検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
［6］前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む［5］に記載のプライマーセット。
［7］［5］または［6］に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者らは、ジフテリア毒素に特異的な遺伝子領域（ジフテリア毒素遺伝子 (tox) のうち毒素Aサブユニットをコードする領域の内部）に対し６種のLAMP法プライマーを組み合わせたプライマーセットCd#16を設計することにより、高感度で特異性に優れたジフテリア毒素遺伝子検出系を構築した。
【００１４】
本発明によれば、ジフテリア毒素遺伝子を高感度かつ特異的に検出することができる。LAMP法はPCR法のような煩雑な操作を必要しないため、病院などの検査室に導入可能な技術である。そのため、本発明により簡便かつ迅速なジフテリア診断が臨床現場で可能となる。これにより、感染症法で患者の隔離が義務づけられているジフテリアの診断の迅速化を通して、公衆衛生的に迅速な対応が可能になると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
(1)ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
(2)検体からＤＮＡを抽出する。
(3)抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
(4)増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。
【００１６】
[プライマーセット]
本発明の方法では、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。ジフテリア菌は、Corynebacterium diphtheriae属する細菌であり、12種類のジフテリア菌(毒素原性、非毒素原性)遺伝子に特異的な配列を探索し、Aサブユニット遺伝子の内部の配列(配列番号7)を選定し、さらにこの配列に対しLAMP法プライマーの設計を行なった。設計にはLAMP法プライマー設計支援ソフト（PrimerExplorer Ver.3、栄研化学）を使用し、設計されたプライマーセットの中から本発明者らが、候補となり得ると考えた8種類のプライマーセットを選択した。そして、選択されたプライマーセットを合成し、各プライマーセットについて、その検出感度と特異性を1種類のジフテリア菌から精製したDNAを用いて検討した。その結果、本発明のプライマーセットが最も高い感度を示した。
【００１７】
本発明においては、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットとしては、以下の配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００１８】
図１に、ジフテリア菌のジフテリア毒素遺伝子に対するプライマーセットCd#16の設計位置を示した。LFとLBはloop プライマーを示し、LAMP法による増幅領域はF2からB2cである。
【００１９】
配列番号1〜4の4種類のＤＮＡからなるプライマーセットを用いることで、ジフテリア毒素遺伝子の一部のＤＮＡをLAMP法により増幅することができる。増幅されるＤＮＡの最小単位は70bpと計算されるが、LAMP法ではＤＮＡがカリフラワー様に増幅するので、実際には70bp以外の様々なサイズの遺伝子が増幅される。
【００２０】
Cd#16#F3#HPLC：AAAGGTTCGGTGATGGTG(配列番号1)
Cd#16#B3#HPLC：CAATGAGCTACCTACTGATCG(配列番号2)
Cd#16#FIP#HPLC：TAACGCTTTCGCCTGTTCCCTGTAGTGCTCAGCCTTCC(配列番号3)
Cd#16#BIP#HPLC：GTGGAAAACGTGGCCAAGATCCTGACACGATTTCCTGC(配列番号4)
【００２１】
Cd#16#F3は、tox遺伝子ORF中の位置：nt 449-466であり、Cd#16#B3：は、tox遺伝子ORF中の位置：nt 672-652である。Cd#16#FIPは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 552-533, 474-491であり、Cd#16#BIPは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 584-603, 651-634である。
【００２２】
本発明の方法では、上記4種類のプライマーは、それぞれ上記で示した全配列を有することが、検体中にジフテリア毒素遺伝子が存在する場合、ジフテリア毒素遺伝子を菌株の種類によらず確実に増幅するという観点から好ましい。但し、各プライマーともその一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、同様のプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号1〜4のいずれかの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅することができるプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部または全部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００２３】
本発明のプライマーセットは、前記４種類のＤＮＡに加えて、以下のＤＮＡ（ｌｏｏｐプライマー）をさらに含むことが好ましい。
Cd#16#LF#HPLC：CGCTAGAACTCCCCTCAGC(配列番号5)
Cd#16#LB#HPLC：GCGATGTATGAGTATATGGCTCAAG(配列番号6)
【００２４】
Cd#16#LFは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 514-496であり、Cd#16#LBは、tox遺伝子ORF中の位置：nt 604-628である。
【００２５】
本発明の方法において、プライマーセットは、上記ｌｏｏｐプライマーを含まなくても、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅することはできる。しかし、上記ｌｏｏｐプライマーを含む場合の方が、増幅時間を大幅に短縮でき、好ましい。
【００２６】
上記ｌｏｏｐプライマーにおいても、各プライマーの一部の塩基を欠失または置換したもの、あるいは、他の塩基が付加されたものでも、ｌｏｏｐプライマーとしての機能を発揮するものはあり得る。即ち、配列番号５または６の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法によって増幅する際のｌｏｏｐプライマー機能を有するＤＮＡを、プライマーセットの一部のＤＮＡとして含むプライマーセットも、本発明の方法で使用できる。
【００２７】
尚、本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、より好ましくは１から３個、さらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個を意味する。
【００２８】
本発明の上記プライマーセットを構成する各ＤＮＡは、前記塩基配列に基づいて、既知のＤＮＡ調製方法により適宜入手することができる。
【００２９】
本発明は、上記プライマーセットを用いる、ジフテリア毒素遺伝子の検出方法に関するが、本発明は、上記プライマーセット自体を発明として包含する。さらに本発明は、上記本発明のプライマーセットを含む、検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキットも包含する。
【００３０】
本発明のプライマーセットは、例えば、1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量の前記4種類または6種類のプライマー(ＤＮＡ)を含む形態であることができる。1回のLAMP法による遺伝子の増幅に必要な量のプライマー(ＤＮＡ)量は、例えば、5 〜 40 pmol / 反応チューブの範囲である。
【００３１】
[ＤＮＡ抽出]
本発明の方法では、検体からＤＮＡを抽出する。具体的には、検体中の菌株から市販のDNA抽出キットを用いて直接DNAを抽出する。DNA抽出キットとしては例えば、QIAamp DNA Micro Kit （Cat. No. 56301、Qiagen社）を挙げることができる。あるいは、検体からＤＮＡを抽出せず、菌体を煮沸(boil)するだけの簡単な調製法でも、本発明の方法において鋳型として用いるＤＮＡは調製できる。
【００３２】
[LAMP法による増幅]
本発明の方法では、抽出したＤＮＡ（DNAテンプレイト）を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬（例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水）を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイト(抽出したＤＮＡ)を加える。次いで、例えば、65℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
【００３３】
[増幅されたＤＮＡの確認]
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれている場合、増幅操作によりジフテリア毒素遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるＤＮＡはない。
【００３４】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かは、例えば、増幅産物の濁度を測定すること、または蛍光目視検出で確認することができる。増幅産物の濁度の測定は、具体的には、以下のように行うことができる。リアルタイム濁度測定装置により経時的に、あるいは濁度測定装置により最終増幅産物の濁度を測定する。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して反応させ、UVランプを当てることにより目視で反応液の蛍光発色を観察することで行うことができる。
【００３５】
本発明は、前記方法で説明したプライマーセットを包含する。さらに、本発明は、本発明のプライマーセットを含むキットも包含する。キットに含まれるものは、例えば、以下の物であることができる。
1.Bst DNAポリメラーゼ
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA（陽性コントロール）
6.反応チューブ
7.説明書
【００３６】
前述のように、本発明の方法では、ＤＮＡの増副産物の有無を濁度測定または蛍光目視検出により行うことができる。蛍光目視で検出する場合は、上記キットに蛍光目視試薬を含めることができる。濁度測定装置を使用する場合には、キットには蛍光目視検出試薬は含めない。
【実施例】
【００３７】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３８】
材料と方法
菌株と試薬
ジフテリア菌ATCC700971(NCTC13129)は米国ATCCから購入した。その他のジフテリア菌菌株は研究室保存のものおよびATCCから購入したものを用いた。
【００３９】
血液寒天培地は日水製薬（株）製のものを用いた。BHI (Brain Heart Infusion)液体培地はDifco (Becton Dickinson)製のものを37g/lになるように精製水で溶解し滅菌して用いた。
【００４０】
DNA増幅には栄研化学製LoopAmp DNA増幅試薬キットを用いた。血液寒天上のコロニーからの総DNA抽出にはQiagen 社製のGenomic Tip -20または100とQiagen Genomic Buffer Setを用いた。
【００４１】
培養
凍結保存した菌を血液寒天培地に塗布あるいはBHI液体培地に懸濁し、37℃一晩から二晩培養して実験に用いた。これらの培養を同様の培地に植え継いだ培養も、同様に用いた。
【００４２】
DNA調製
(1) 血液寒天上コロニーからのQiagen による精製
血液寒天平板培地上で37℃一晩培養した菌体を2mlの精製水に懸濁しながらコンラージ棒で集め、遠心して洗ったのち、Qiagenキットの指定に従い総DNAを抽出した。リゾチームのみ指定と異なる量(50mg/ml)を用いた。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
【００４３】
(2) 塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心による精製
200mlのBHI液体培地で37℃一晩培養した菌体を遠心集菌し、生理食塩水で菌体を洗浄してから凍結融解したのち、27mg/mlのリゾチームを含むQiagen Genomic Buffer SetのB1溶液11mlに懸濁して37℃一晩インキュベート、さらにタカラバイオ社製Proteinase Kを1ml加えて37℃1時間インキュベートした。次にQiagen Genomic Buffer SetのB2溶液を4mlとQiagen RNase溶液を10μl加え50℃1時間インキュベートして菌体を溶解した。得られた菌体ライセートを、のフェノール/クロロホルム処理2回とのクロロホルム処理1回で除蛋白を行ない、エタノール沈澱で粗DNA画分を得た。粗DNA画分から、常法による塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心で精製DNAを得た。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
【００４４】
(3) 寒天平板培地上コロニーからのボイル法による粗DNAの調製
血液寒天平板培地またはBHI寒天平板培地上に菌を塗布し37℃一晩培養して生じたコロニーをかきとり、精製水に懸濁してOD600を測定して適当に精製水で希釈して、OD6001= 1の懸濁液を調製した。このOD = 1の懸濁液をさらに10倍ずつ段階希釈し、OD = 0.001までの懸濁液を調製した。これらの懸濁液をアルミブロックヒーターで100℃30分加熱し、遠心した上清をDNAテンプレートとして用いた。
【００４５】
プライマーの設計
栄研化学（株）のwebサイト上で動作するwebアプリケーション"Primer Explorer Ver3"を用いて、NCBIから得られたジフテリア毒素遺伝子の塩基配列情報をもとにプライマーを設計した。設計したプライマーはジフテリア毒素Aサブユニットに対応する遺伝子領域上に位置し、上記配列番号1〜6に示す塩基配列である。プライマーは、全て北海道システムサイエンス社による受託合成（HPLC精製グレード）のものを用いた。
【００４６】
LAMP法によるDNA増幅
栄研化学（株）「LoopAmp DNA増幅試薬」の取扱説明書によった。増幅されたDNAの検出は、栄研化学LA-320c型リアルタイム濁度検出器によった。
【００４７】
PCR
LAMPプライマーセットの感度と特異性は、既存のPCR法（非特許文献1）と比較することにより実施した。遺伝子増幅の有無は、PCR産物5μLを1％アガロースゲル電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色により確認した。
【００４８】
LAMP検出系
Loopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学）を用いて、LAMPプライマーセットの検出感度と特異性を評価した。LAMP検出系は反応液25 μl中に、0.2 μM の各outer primer (F3, B3)、1.6 μMの各inner primer (FIP,BIP)、0.8 μMの各loop primer (LF,LB)、1 μlのBst-DNA polymerase、12.5 μlの２×反応液、1 μlのDNA溶液を含み、65℃で１時間反応させた。その後、80℃で2分間の反応停止処理を行なった。反応チューブにはLoopamp反応チューブ（栄研化学）を使用し、遺伝子増幅に伴う濁度の増加はリアルタイム測定装置（Loomamp LA-320C、栄研化学）を用いて測定した。表1にLAMP検出系の反応組成を示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
プライマーセットCd#16を用いたLAMP検出系の感度をまとめて以下の表2に示す。精製ジフテリア菌DNAを連続希釈し、LAMP検出系の検出限界を測定し、表に示した。リアルタイム測定装置（Loopamp LA-320C、栄研化学）を用いて濁度の増加を測定した結果である。
【００５１】
【表２】
【００５２】
BHI液体培地で培養したジフテリア菌C. diphtheriae ATCC700971株よりCsCl密度勾配超遠心法で精製したゲノムDNAを様々な濃度に希釈して鋳型として用い、通常の条件（64℃）で増幅反応を行なうことにより、１０コピー以上のゲノムDNAが反応液中にあれば、本発明のプラーマーセットCd#16を用いたLAMP法で検出可能であることが明らかになった。
【００５３】
図２にBHI液体培養からCsCl精製したジフテリア菌DNA を鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。10コピーを１５〜３０分で増幅する感度であった。
【００５４】
また、実際の臨床検査現場での簡便な使用を考え、培養した菌体を蒸留水に懸濁し100℃で30分間加熱した上清を供試することでも検出が可能であった。血液寒天培地上のコロニーではOD600 = 1になるように懸濁した菌懸濁液から、BHI液体培地で培養した菌体の場合は、OD600 = 0.001になるように懸濁した菌懸濁液から、ジフテリア毒素遺伝子が検出された。
【００５５】
Corynebacterium属細菌に対するLAMP検出系の特異性を示すため、ジフテリア菌14菌株および近縁菌Corynebacterium ulcerans 2菌株のDNAを鋳型として、プライマーセットCd#16を用いたLAMP法での検出結果とPCR法による検出結果を比較することで特異性を検討した結果を以下の表3に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表3に示すように、C. diphtheriae 14菌株と近縁菌Corynebacterium ulcerans 2菌株から精製したゲノムDNAについて、本発明のプライマーセットCd#16を用いてLAMP法によるジフテリア毒素遺伝子の検出を試みた。C. diphtheriae 14菌株のうち10菌株からジフテリア毒素遺伝子が検出され、残り4菌株からは検出されなかった。Corynebacterium ulcerans 2菌株についてはいずれからもジフテリア毒素遺伝子が検出された。これら16菌株についての検出結果は、従来法であるジフテリア毒素遺伝子を対象としたPCR法による検出結果と完全に一致したことから、本発明のプライマーセットCd#16は、特異性の高いLAMP法検出に適していることが示された。
【００５８】
図3に血液寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。感度は1OD (約1 x 105 cfu)であった。
【００５９】
図4にBHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。感度は、0.001OD (=100cfu)であった。ただしボイルしてすぐ使うことが好ましい。
【００６０】
図5にBHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAの調製DNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果とＰＣＲを増幅の結果を合わせて示す。12菌株のジフテリア菌 (毒素原性、非毒素原性)（毒素原性C. ulcerans）を用いた。検出結果はPCRとよく一致した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によるプライマーセットを用いたLAMP検出系は、ジフテリア菌感染症の体外診断薬としての実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】LAMP法プライマーの設計の説明図。
【図２】BHI液体培養からCsCl精製したジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図３】血液寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図４】BHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果を示す。
【図５】BHI寒天平板培地上コロニーからのボイル法によるジフテリア菌DNAを鋳型とし、プライマーセットCd#16を用いて行ったLAMP増幅の結果とＰＣＲを増幅の結果を合わせて示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む
検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項2に記載の方法。
【請求項４】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
【請求項６】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項5に記載のプライマーセット。
【請求項７】
請求項5または6に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【請求項１】
ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からＤＮＡを抽出し、
抽出したＤＮＡを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを確認する、ことを含む
検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含む請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項2に記載の方法。
【請求項４】
増幅産物中に増幅されたＤＮＡが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号１〜４の塩基配列を有する４つのＤＮＡを含むプライマーセット。
【請求項６】
前記プライマーセットが配列表に示された配列番号５〜６の塩基配列を有する２つのＤＮＡをさらに含む請求項5に記載のプライマーセット。
【請求項７】
請求項5または6に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２２８８６８（Ｐ２００７−２２８８６８Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４０５８（Ｐ２００６−５４０５８）
【出願日】平成１８年２月２８日（２００６．２．２８）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２８日（２００６．２．２８）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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