ＭＣＭ６モノクローナル抗体およびＭＣＭ７モノクローナル抗体ならびに子宮頚部疾患の検出におけるそれらの使用のための方法
患者の試料における高悪性度子宮頚部疾患を診断するための組成物および方法が提供される。この組成物は、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に特異的に結合する、新規モノクローナル抗体ならびにその変異体および断片を含む。本発明のＭＣＭ６抗体またはＭＣＭ７抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体がさらに提供される。本発明のＭＣＭ６モノクローナル抗体またはＭＣＭ７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本明細書に開示される。この組成物は、患者由来の子宮頚部試料中のＭＣＭ６、ＭＣＭ７、またはＭＣＭ６とＭＣＭ７との両方の過剰発現を検出することを含む高悪性度子宮頚部疾患を診断する方法の実行において有用性を見出す。本発明の方法を実行するためのキットがさらに提供される。ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび抗体生成でのこれらのポリペプチドの使用方法も本発明によって包含される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に結合できる抗体およびこれら抗体の使用方法、特に子宮頚部疾患の診断における使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
子宮頚部の癌腫は、女性における２番目に多い一般的新生物であり、女性の全癌の約１２％の割合を占め、毎年約２５万人の死亡を引き起こしている。非特許文献１。集団スクリーニングプログラムが利用可能でない多くの発展途上国では、臨床に関する問題は、より深刻である。これらの国では、子宮頚癌は、女性における癌による死亡の第１位の原因である。
【０００３】
子宮頸癌の症例は、腺癌も見られるが、その大多数は、扁平上皮細胞癌を示す。子宮頚癌は、詳細に明らかにされた非侵襲性の上皮内段階を経て進行し、この上皮内段階は形態的に識別することが可能であるので、集団スクリーニングによって防止され得る。非特許文献２。正常な細胞がどのように癌化するかは、理解されていないが、正常な重層上皮から子宮頚部上皮内新生物（ＣＩＮ）を経て浸潤癌へと連続範囲で病理組織学的に変化するという概念が何年もの間広く受け入れられている。子宮頚癌の前駆病変は異形成であり、当該技術分野では、ＣＩＮまたは扁平上皮内病変（ＳＩＬ）として知られている。扁平上皮内異常は、３層（ＣＩＮ）または２層（ベセスダ）システムを用いて分類され得る。ベセスダシステムに基づいて、ＣＩＮＩおよびＨＰＶ感染に対応する軽度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）は、通常、侵襲性疾患への進行のリスクが比較的低い増殖性ＨＰＶ感染を表す。３層システムのＣＩＮＩＩおよびＣＩＮＩＩＩに対応する高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）は、ＬＳＩＬよりも子宮頚癌への進行のリスクがより高いが、ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬは両方とも悪性疾患の潜在的な前駆病変と見られる。患者試料も、このシステムに基づいてＡＳＣＵＳ（意義不明な異型扁平上皮細胞）またはＡＧＵＳ（意義不明な異型腺細胞）に分類され得る。
【０００４】
子宮頚癌と高リスク型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えば、１６型、１８型、および３１型）による感染との強い関連が確立されている。実際に、疫学的証拠および分子生物学的な証拠の大部分は、子宮頚癌の原因因子としてＨＰＶ感染を確立した。さらに、ＨＰＶは、高悪性度子宮頚部疾患の症例の８５％以上で発見される。しかし、ＨＰＶ感染は極めて一般的であり、３０歳を超える女性の５〜１５％で起きている可能性があるが、高悪性度子宮頚部疾患または癌をこれまでに発症しているＨＰＶ陽性女性はほとんどいない。ＨＰＶ単独での存在は感染を示すだけであって、高悪性度子宮頚部疾患を示さず、従って、ＨＰＶ感染単独についての検査は、数多い偽陽性をもたらす。例えば、非特許文献３を参照。
【０００５】
ＨＰＶが子宮頚部の下層組織内の基底幹細胞に感染することを最近の文献は示唆している。重層子宮頚上皮への細胞の遊走を結果として生じる、成熟ケラチノサイトへの幹細胞の分化は、ＨＰＶウイルスの複製および細胞の再感染と関連する。このウイルスの複製プロセスの間に、細胞周期の調節解除、活発な増殖、ＤＮＡ複製、転写活性化、およびゲノム不安定性を含む多くの細胞変化が起こる（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
大部分のＨＰＶ感染は、ウイルス感染が１２ヵ月の期間内にそれ自体で消散する、実在して一過性のものである。１つ以上の発癌性サブタイプのＨＰＶによる持続感染を発症する個体にとっては、非ＨＰＶ感染患者と比較して新生物を発症するリスクがある。子宮頚部新生物の発症におけるＨＰＶの重要性を考えると、ＨＰＶの臨床検出は、子宮頚部新生物発症のリスクのある患者の同定における重要な診断ツールとなった。ＨＰＶをベースにした子宮頚部疾患スクリーニングの臨床的有用性は、その陰性を予測する価値にある。通常のパップスメアの履歴と組み合わせたＨＰＶ陰性の結果は、疾患のない状態およびその後の１〜３年間の間の子宮頚部新生物発症の低リスクを示す、優れた指標である。しかしながら、ＨＰＶ陽性結果は、子宮頚部疾患の診断ではなく、むしろそれは感染の表示である。大部分のＨＰＶ感染は一過性のものであり、１２ヵ月間の期間内に自然と消滅するが、高リスクのサブタイプのＨＰＶウイルスによる持続感染は、子宮頚部新生物の発症のより高いリスクを示す。ＨＰＶテストを補充するために、子宮頚部新生物と関連する分子マーカーの同定は、子宮頚部疾患の診断の臨床特異性を改善することが期待される。
【０００７】
パパニコロー染色での子宮頚部スメア（パップスメア）の細胞診は、現在、子宮頚癌の検出のための選り抜きの方法である。パップテストは、実質的に６０年間変わることなく残っている主観的方法である。しかしながら、その性能についていくつかの懸念がある。単回のパップテストの報告される感度（検査で陽性と出る疾患陽性の比率）は低く、かつ広範なバリエーションを示す（３０〜８７％）。単回のパップテストの特異性（検査で陰性と出る疾患陰性の比率）は、スクリーニング集団では８６％まで低い場合もあり得、そして根底にある高悪性度疾患を決定するためのＡＳＣＵＳ ＰＬＵＳ集団ではさらにかなり低いことがある。非特許文献１参照。ＬＳＩＬまたはＣＩＮＩとして特徴付けられるパップスメアの有意なパーセンテージは、高悪性度病変に対して実際に陽性である。さらに、パップスメアの１０％までは、ＡＳＣＵＳ（意義不明な異型扁平上皮細胞）として分類され、すなわち、正常、中程度もしくは重度の病変または腫瘍として明白に分類することが可能でない。しかしながら、このＡＳＣＵＳ集団の１０％までは、高悪性度病変を有し、結果的に見過ごされることを経験では示している。例えば、非特許文献７を参照。従って、高悪性度子宮頚部疾患で選択的に過剰発現される分子バイオマーカーおよびこれらのバイオマーカーを検出するための組成物は、高悪性度子宮頚部疾患を診断するための信頼できる方法を実行するのに必要である。
【０００８】
ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、真核性ＤＮＡ複製の不可欠な部分で役割を果たしている。ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、重複したＤＮＡ鎖のデノボ合成中に、ＤＮＡ上に前複製複合体をのせ、二重鎖ＤＮＡをほどく手助けをするためのヘリカーゼとして機能することによりＤＮＡ複製の初期段階に機能する。ＭＣＭタンパク質の各々は、それらの高度に保存された中心ドメインにＤＮＡ依存ＡＴＰａｓｅモチーフを有する。ＭＣＭタンパク質のレベルは、通常、細胞周期のＧ０期からＧ１／Ｓ期へと正常細胞が進行するにつれて変化する形で増加する。Ｇ０期では、ＭＣＭ２タンパク質およびＭＣＭ５タンパク質は、ＭＣＭ７タンパク質およびＭＣＭ３タンパク質よりもずっと少ない。ＭＣＭ６は、ＭＣＭ２、ＭＣＭ４、およびＭＣＭ７と複合体を形成して、ヒストンＨ３に結合する。さらに、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、およびＭＣＭ７の部分複合体は、ヘリカーゼ活性を有しており、その活性は、ＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性およびＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性によって媒介される。例えば、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照。それらすべては、それら全体が本明細書に参考として援用される。
【０００９】
ＭＣＭタンパク質および特にＭＣＭ５が、子宮頚部疾患（非特許文献２）ならびに他の癌（非特許文献８）の検出に有用であると初期の刊行物は示している。発表された文献は、ＭＣＭ５に対する抗体が子宮頚新生物細胞を検出できることを示している。高悪性度子宮頚部疾患の検出に対する特異性は、ＭＣＭ５に対しては実証されていない（非特許文献２）。ＭＣＭ５発現の検出は、高悪性度子宮頚部疾患に限定されるだけでなく、高リスクＨＶＰによる感染の後に細胞周期に再度入った同定された低悪性度の異形成および増殖細胞においても検出される。ＭＣＭ５に対する抗体による子宮頚新生物の検出は、図４に示される。ＭＣＭ５に加えて、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７を含むＭＣＭファミリーの他のメンバーは、組織試料において子宮頚腫瘍を検出するための潜在的に有用なマーカーであることが示されている（非特許文献８；非特許文献１１）。ＭＣＭ７が、免疫化学形式を使用する高悪性度子宮頚部疾患の検出のための特異的なマーカーであるように思われると最近の結果は示している（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【非特許文献１】Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ３：１〜１０
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４９３２〜１４９３７
【非特許文献３】Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０３：３０４〜３０９
【非特許文献４】Ｃｒｕｍ（２０００）Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３：２４３〜２５１
【非特許文献５】Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：１０１８６〜１０２０１
【非特許文献６】Ｐｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４：１３５９〜１３６８
【非特許文献７】Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＪＡＭＡ ２８１：１６０５〜１６１０
【非特許文献８】Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：２１２１〜２１３２
【非特許文献９】Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１４：１４４７〜１４５４
【非特許文献１０】Ｉｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０８９〜１１０１
【非特許文献１１】Ｂｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：８１７３〜８１８０
【非特許文献１２】Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ． ４３：６９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカーの発現を検出できる抗体が当該技術分野では必要である。そのような抗体は、初期のＨＰＶ感染および軽度の異形成等の臨床疾患とは考えられない状態と高悪性度疾患とを区別するための方法で使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
高悪性度子宮頚部疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、本発明の核バイオマーカータンパク質、詳細にはＭＣＭタンパク質、より詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７へと結合し得るモノクローナル抗体を含む。これらのモノクローナル抗体の抗原結合断片および変異体、これらの抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株、および本発明のモノクローナル抗体を含むキットも本明細書に包含される。
【００１２】
本発明の組成物は、高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法における有用性を見出す。これらの方法は、核バイオマーカーの過剰発現が高悪性度子宮頚部疾患を示す、少なくとも１つの核バイオマーカーの発現を検出することを含む。特に、これらの方法は、子宮頚部試料におけるＭＣＭ６またはＭＣＭ７の過剰発現を検出するために本発明の抗体を用いることを含む。
【００１３】
本発明の組成物は、さらに、ＭＣＭ６モノクローナル抗体またはＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合することができるエピトープを含む単離されたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、ＭＣＭ６抗体またはＭＣＭ７抗体を産生するための方法における有用性を見出す。ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープのアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子もまた提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
高悪性度子宮頚部疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、高悪性度子宮頚部疾患で選択的に過剰発現される核バイオマーカータンパク質、詳細にはＭＣＭタンパク質、より詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７に結合できるモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた開示される。本明細書に記述するモノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供される。本組成物は、患者の高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法における有用性を見出す。
【００１５】
本発明の組成物は、ＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７に、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。ＭＣＭ６のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、配列番号３（受入番号ＮＰ＿００５９０６）および配列番号４（受入番号ＮＭ＿００５９１５）にそれぞれ示される。ＭＣＭ７のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、配列番号１（受入番号ＮＰ＿００５９０７）および配列番号２（受入番号ＮＭ＿００５９１６）にそれぞれ示される。特定の実施形態では、９Ｄ４．３と命名されたＭＣＭ６モノクローナル抗体および２Ｅ６．２と命名されたＭＣＭ７モノクローナル抗体が提供される。ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年４月１４日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ２０１１０−２２０９）の特許寄託機関に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９が割り当てられた。ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年８月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ２０１１０−２２０９）の特許寄託機関に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１が割り当てられた。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づいて維持される。この寄託は、単に当業者の便宜のために行なわれたものであり、寄託が米国特許法１１２条によって必要とされることを承認するわけではない。
【００１６】
モノクローナル抗体９Ｄ４．３および２Ｅ６．２の結合特性を有する抗体も本明細書で開示される。そのような抗体としては、競合結合アッセイでこれらの抗体と競合する抗体、ならびにモノクローナル抗体９Ｄ４．３もしくは２Ｅ６．２に結合できるエピトープに結合する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７にそれぞれ特異的に結合する能力を保持するモノクローナル抗体９Ｄ４．３および２Ｅ６．２の変異体および断片も提供される。組成物は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株および本明細書で開示される少なくとも１つのモノクローナル抗体を含むキットを含む。
【００１７】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が抗原に対する結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠如する他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、および骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
【００１８】
用語「抗体」および「複数の抗体」は、天然に存在する形態の抗体および組換え抗体（単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、および多特異性抗体、ならびに前述のものすべてのものの断片および誘導体等）を広く包含する。それらの断片および誘導体は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、その抗体に結合されたタンパク質または化学部分を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ，単鎖抗体、二重特異性抗体）に結合し得る抗体断片、および前述のものを含む組換えペプチドを包含する。本明細書で使用される場合、「ＭＣＭ６抗体」または「ＭＣＭ７抗体」は、ＭＣＭ６（配列番号３）もしくはＭＣＭ７（配列番号１）、またはそれらの変異体もしくは断片に特異的に結合する任意の抗体を指し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、および親抗体の抗原結合機能を保持するそれらの断片を包含する。
【００１９】
本発明のＭＣＭ６抗体およびＭＣＭ７抗体は、最適には、モノクローナル抗体である。本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る自然に発生する可能性のある変異を除いて同じである）から得られる抗体を指す。
【００２０】
「ネイティブ抗体」および「ネイティブ免疫グロブリン」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されている約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。ジスルフィド結合の数が、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間では変化する一方、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合される。各重鎖および軽鎖は、また、鎖内のジスルフィド架橋を一定の間隔であけている。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ）を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【００２１】
用語「可変の」は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広範に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性で使用される事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均等には分布されていない。それは、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおいて、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、大体はｐシート立体配置の形をとり、ｐシート構造を結合するループを形成する３つのＣＤＲ（および場合によってはｐシート構造の部分を形成する１５のＣＤＲ）によって結合される４つのＦＲ領域を含む。抗体の各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によっておよび他の鎖からのＣＤＲを用いてごく接近して共に保持され、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ． Ｉ，６４７〜６６９頁（１９９１）参照）。
【００２２】
定常ドメインは、抗体を抗原に結合する際に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の様々なエフェクター機能を示す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ２５ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．［１９９１］）および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７［１９８７］）を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書で見なされる場合の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７〜１０６２）、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、２つの同じ抗原結合断片（それぞれが１つの抗原結合部位を有するいわゆる「Ｆａｂ」断片および残りの「Ｆｃ」断片（その名称は、容易に結晶化するその能力を反映する））を生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋結合できる１つのＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【００２５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体断片である。二本鎖のＦｖ種では、この領域は、強く非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種では、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるそれに類似した「二量体」構造で結合できるように、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが可動性のペプチドリンカーによって共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面で抗原結合部位を画定するするのは、この立体配置内である。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりは低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２６】
Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が添加されることによってＦａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。
【００２７】
ＭＣＭ６抗体およびＭＣＭ７抗体の断片は、全長抗体の所望の親和性を保持する限り、本発明によって包含される。従って、例えば、ＭＣＭ６抗体の断片は、ＭＣＭ６抗原に結合する能力を保持する。同様に、ＭＣＭ７抗体の断片は、ＭＣＭ７抗原に結合する能力を保持する。そのような断片は、対応する全長抗体と類似する特性（すなわち、それらの断片はＭＣＭ６またはＭＣＭ７に特異的に結合する）によって特徴付けられる。そのような断片は、本明細書では「抗原結合」断片といわれる。
【００２８】
抗体の適切な抗原結合断片は、全長抗体の一部（通常、その抗原結合領域または可変領域）を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片、ならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖と重鎖の一部とから構成される免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意図する。Ｆ（ａｂ’）２によって、両軽鎖と両重鎖の一部とを含む免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意図する。「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓＦｖ」抗体断片によって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチドに存在する、抗体のこれらのドメインを含む断片を意図する。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、および第５，８５６，４５６号を参照。これらは、本明細書中に参考として援用される。通常、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、このことにより、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ． １１３，ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），２６９〜３１５頁）を参照。
【００２９】
抗体または抗体の断片は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号に記述されている技法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７には、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体それぞれの単離が記述されている。その後の刊行物には、鎖シャッフリング法による高親和性（ｎＭの範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９〜７８３）、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略として、コンビナトリアル感染およびインビボでの組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５〜２２６６）が記述されている。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な別の手段である。
【００３０】
種々の技法が、抗体断片の産生のために開発されてきた。伝統的に、こうした断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化から誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７〜１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照）。しかしながら、これらの断片は、今や組換え宿主細胞によって直接生成され得る。例えば、抗体断片は、上述した抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収され、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片を産生するための他の技法は、熟練した実施者にとって明らかである。
【００３１】
好ましくは、本発明の抗体は、事実上モノクローナルである。上述のように、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る自然に発生する可能性のある変異を除いて同一である）から採取される抗体を意図する。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。この用語は、免疫グロブリン全体、ならびに断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび抗体の抗原結合機能を保持する他の断片）を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、本明細書の以下で定義するとおりの単一の抗原性部位（すなわち、ＭＣＭ６タンパク質またはＭＣＭ７タンパク質内の特定のエピトープ）に対して指向される。さらに、通常は、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記述されたハイブリドーマ法によって生成されることが可能であり、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって生成され得る。「モノクローナル抗体」は、また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１〜５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号に記述されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３２】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９６の方法、またはその改変法を使用して調製されることが可能である。通常、マウスが抗原を含む溶液によって免疫される。免疫は、生理食塩水に、好ましくはフロイント完全アジュバント等のアジュバントに抗原を含む溶液を混合または乳化させ、その混合液または乳濁液を非経口的に注入することによって実行され得る。当該技術分野で公知のいかなる免疫方法も、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用され得る。動物を免疫した後、脾臓（および必要に応じて、いくつかの大きなリンパ節）を摘出し、解離して単一の細胞にする。脾臓細胞は、目的の抗原を被覆したプレートまたはウェルに細胞懸濁液を塗布することによってスクリーニングされ得る。抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞（すなわち抗体産生細胞）は、プレートに結合し、洗い流されない。結果として生じるＢ細胞、または解離したすべての脾臓細胞は、次いで、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成するために、骨髄腫細胞と融合するよう誘導され、選択培地で培養される。結果として生じる細胞は、段階希釈によってプレーティングされ、目的の抗原に特異的に結合する（かつ無関連の抗原には結合しない）抗体の産生に関してアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマは、次いで、インビトロで（例えば、組織培養瓶または中空糸型リアクター内で）、またはインビボでの（マウス内の腹水として）のいずれかで培養される。モノクローナル抗体は、また、反復免疫多重部位技術（ＲＩＭＭＳ）を使用して産生され得る。例えば、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６（４）：３８１〜３８９；Ｗｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． １９（５）：６９５〜７０７；およびＢｙｎｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（５）：４０７〜４１１を参照。これらすべては、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３３】
ハイブリドーマの使用の別の方法として、米国特許第５，５４５，４０３号；同第５，５４５，４０５号；および同第５，９９８，１４４号（これらは、参照することによって本明細書に援用される）に開示されるように、ＣＨＯ細胞株等の細胞株で産生され得る。手短に言えば、細胞株は、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現することができるベクターをトランスフェクトされる。２つのタンパク質を別々のベクター上にトランスフェクトすることによって、キメラ抗体が産生され得る。別の利点は、抗体の正確な糖鎖付加である。モノクローナル抗体は、また、それによってバイオマーカータンパク質を結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離するために、バイオマーカータンパク質を用いて組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定および単離されることが可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成しスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒｆＺＡＰ θ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングで使用するために特に受け入れられる方法と試薬の例は、例えば、以下で見られ得る：米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報 国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；同第９２／０９６９０号；および同第９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５〜７３４。
【００３４】
本発明の一部の態様では、抗体は、組織学的試料よりはむしろ細胞学的な所望の染色に基づいて選択され得る。すなわち、特定の実施形態では、抗体は、最終試料の型（例えば、細胞学的調製物）を考慮し、そして結合特異性に関して選択される。ＭＣＭ６またはＭＣＭ７等の目的の特異的なバイオマーカーに対する抗体は、多段階スクリーニングのプロセスによって選択および精製される。抗体選択のためのそのような方法は、係属中の米国特許出願第１１／０８７，２２７号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、出願日２００５年３月２３日（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記述されている。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体もまた提供される。抗体に関連して使用されるとき、「結合特性」または「結合特異性」とは、比較抗体と同一または同様の抗原エピトープを抗体が認識することを意味する。そのような抗体の例としては、例えば、競合結合アッセイで本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体が挙げられる。当業者は、抗体が、標準的な方法を使用して別の抗体に競合的に干渉するかどうかを決定することができ得る。
【００３６】
「エピトープ」によって、それに対して抗体が産生され、抗体が結合する、抗原分子の一部分を意図する。「ＭＣＭ６エピトープ」は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体が結合する、ＭＣＭ６タンパク質の一部分を含む。「ＭＣＭ７エピトープ」は、ＭＣＭ７モノクローナル抗体が結合する、ＭＣＭ７タンパク質の一部分を含む。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が直鎖状の様式で次々に連続して配置される）、非直鎖状アミノ酸残基（本明細書では「非直鎖状エピトープ」と呼ばれる；これらのエピトープは、連続して配置されない）、または直鎖状と非直鎖状の両アミノ酸残基を含み得る。一般的に、エピトープは、短いアミノ酸配列（例えば約５アミノ酸長）である。エピトープを同定するための体系的な技法は、当該技術分野では周知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号および以下に示す例に記述されている。手短に言えば、１つの方法では、抗原由来の一組の重なり合ったオリゴペプチドが合成され、各ピンに独特のオリゴペプチドで、ピンの固相アレイに結合され得る。ピンのアレイは、９６穴マイクロタイタープレートを含み得、９６オリゴペプチドのすべてを（例えば、バイオマーカーに特異的なモノクローナル抗体に対する結合に関して）同時にアッセイすることが可能である。あるいは、ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））が、現在、エピトープマッピング用に市販されている。これらの方法を用いて、所定の抗体が結合するエピトープを同定するために、連続したアミノ酸の可能なすべてのサブセットに対する結合親和性が、決定され得る。抗体を採取する動物を免疫するためにエピトープの長さのペプチド配列が使用される場合、エピトープは、また、推論によって同定され得る。
【００３７】
本発明はまた、ＭＣＭ６モノクローナル抗体またはＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、モノクローナル抗体に結合する抗原（すなわち、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７）の一部に対応する。そのようなポリペプチドは、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に選択的に結合する抗体を産生するための方法における有用性を見出す。抗体の産生で使用されるポリペプチドの能力は、本明細書では「抗原活性」と呼ばれる。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列（配列番号３に示すＭＣＭ６アミノ酸配列の残基７６０〜７７２に対応する）は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体、より詳細にはモノクローナル抗体９Ｄ４．３によって認識されるエピトープを含む。配列番号６に示すアミノ酸配列（配列番号１に示すＭＣＭ７アミノ酸配列の残基１２７〜１３８に対応する）は、ＭＣＭ７モノクローナル抗体、より詳細にはモノクローナル抗体２Ｅ６．２によって認識されるエピトープを含む。元々のポリペプチドの抗原活性を保持する、配列番号５および配列番号６に示すＭＣＭ６およびＭＣＭ７のエピトープ配列の変異体および断片も提供される。本発明は、さらに、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープ、ならびにその変異体および断片を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【００３８】
ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープを含む本発明のポリペプチドは、本明細書で上述したように、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法で使用され得る。そのようなポリペプチドは、また、ポリクローナルＭＣＭ６抗体またはポリクローナルＭＣＭ７抗体の産生で使用され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープ（すなわち免疫原）を含むポリペプチドを用いて適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類）を免疫することによって調製され得る。免疫された被験体の抗体力価は、固定化されたバイオマーカータンパク質を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる等の標準的技法によって長期にわたりモニターされることが可能である。免疫後の適切な時期に、例えば、抗体力価が最も高いときに、抗体産生細胞を被験体から採取し、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７）によって最初に記述されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ），７７〜９６頁）、またはトリオーマ技法等の標準的技法によってモノクローナル抗体を調製するために使用することが可能である。ハイブリドーマを生成する技術は周知である（一般に、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０〜５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， ＮＹ； ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ， ５４：３８７〜４０２を参照）。
【００３９】
本明細書で記述されるＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７のエピトープを含むモノクローナル抗体またはポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、また、本発明によって包含される。変異体は、目的の抗体をコードするクローン化ＤＮＡ配列における変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は、当該技術分野では周知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３６７〜３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号、およびそれに記載される参考文献を参照。これらは、本明細書中に参考として援用される。目的のポリペプチドの生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換についてのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のモデルに見ることができ、本明細書中に参考として援用される。１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が好適であり得る。保存的置換の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒ。
【００４０】
目的のポリペプチドの変異体を構築する際に、変異体が所望の活性（すなわち、バイオマーカーへの同様の結合親和性）を持ち続けるように、改変はなされる。言うまでもなく、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡでなされたいかなる変異もその配列を読み枠から外してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生成することができる相補領域を作成しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照。
【００４１】
好ましくは、参照ポリペプチドの変異体は、参照抗体分子のアミノ酸配列に対して、または参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％もしくは７５％の配列同一性を、好ましくは少なくとも８０％もしくは８５％の配列同一性を、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、それらの分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的で、パーセント配列同一性は、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップエクステンションペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスによるアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２〜４８９に教示されている。変異体は、例えば、参照抗体とわずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、もしくは１つのアミノ酸残基が異なる可能性がある。
【００４２】
２つのアミノ酸配列の最適な整列に関して、変異体アミノ酸配列の隣接セグメントは、参照アミノ酸配列に対して追加のアミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有する可能性がある。参照アミノ酸配列との比較のために使用される隣接セグメントは、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０、もしくはそれより多くのアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップに関連する配列同一性の補正は、なされることが可能である（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを参照）。
【００４３】
本発明のＭＣＭ６およびＭＣＭ７のモノクローナル抗体は、試料中のバイオマーカータンパク質の検出を促進するために、以下に記述する検出可能な物質によって標識され得る。そのような抗体は、本発明の方法の実行における有用性を見出す。本発明の抗体および抗体断片は、抗体結合の検出を促進するために、検出可能な物質にカップリングされ得る。本明細書で使用されるとき、用語「標識」は、「標識された」抗体を生成するために、抗体に直接的にまたは間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）で検出可能であり得るか、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。抗体を標識する目的のための検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ，または３Ｈが挙げられる。
【００４４】
本発明の少なくとも１つのＭＣＭ６または１つのＭＣＭ７のモノクローナル抗体を含むキットがさらに提供される。「キット」によって、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７の発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬（すなわち、抗体）を含む任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）が意図される。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、販売促進、配布、または販売され得る。さらに、キットは、キットおよびその使用方法を記述する添付文書を含み得る。
【００４５】
本発明のキットは，通常、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に対する少なくとも１つのモノクローナル抗体、抗体結合の検出のための化学物質、対比染料、および必要に応じて、陽性染色細胞の同定を促進するための青味剤を含む。抗原−抗体結合を検出するいかなる化学物質でも、本発明のキットで使用され得る。一部の実施形態では、検出化学物質は、二次抗体に結合された標識ポリマーを含む。例えば、抗原−抗体結合部位で色素原の沈着を触媒する酵素に結合される二次抗体が、提供され得る。抗体結合の検出で使用するためのそのような酵素および技法は、当該技術分野では周知である。一実施形態では、キットは、ＨＲＰ標識ポリマーに結合された二次抗体を含む。結合した酵素に適合する色素原（例えば、ＨＲＰ標識二次抗体の場合は、ＤＡＢ）、および非特異的染色をブロックするための過酸化水素等の溶液が、さらに提供され得る。別の実施形態では、バイオマーカータンパク質に結合する抗体は、モノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬の使用、それに続くマウスプローブ試薬に結合するＨＲＰと結合させたデキストランポリマーの添加によって検出される。そのような検出試薬は、例えば、バイオケアメディカル（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）から市販されている。
【００４６】
本発明のキットは、さらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（例えば、過酸化水素）、タンパク質ブロッキング試薬（例えば、精製カゼイン）、および対比染料（例えば、ヘマトキシリン）を含み得る。青味剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０およびアジ化ナトリウムを用いる水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ、ｐＨ７．４）は、さらに、陽性染色細胞の検出を促進するためのキットで提供され得る。キットは、また、品質管理目的のために陽性および陰性のコントロール試料を含み得る。
【００４７】
別の実施形態では、本発明のキットは、少なくとも２つのモノクローナル抗体を含む。本発明のいくつかの態様では、キットは、ＭＣＭ６およびＭＣＭ７抗体、より詳細には、ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３およびＭＣＭ７抗体２Ｅ６．２を含む。複数の抗体がキット内に存在するとき、各抗体は、個々の試薬として、または、すべての目的の抗体を含む抗体カクテルとして提供され得る。さらに、任意のまたはすべてのキット試薬は、シールされた容器等の外部環境から試薬を保護する容器内に提供され得る。本発明のキットは、高悪性度子宮頚部疾患の診断において有用であり、さらにパップ染色のための試薬（例えば、ＥＡ５０およびオレンジＧ）を含み得る。
【００４８】
本発明の組成物は、２００５年３月２３日に出願した係属中の米国出願第１１／０８７，２２７号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」（その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される方法等、患者における高悪性度子宮頚部疾患の診断のための方法における有用性を見出す。「高悪性度子宮頚部疾患を診断する」は、例えば、子宮頚部疾患を診断するかもしくは子宮頚部疾患の存在を検出し、この疾患の進行をモニターし、そして高悪性度子宮頚部疾患を示す細胞または試料を同定するもしくは検出することを含むことを意図する。用語「高悪性度子宮頚部疾患を診断する、検出する、および同定する」は、本明細書では交換可能に使われる。「高悪性度子宮頚部疾患」によって、コルポスコピーによって前癌病態、悪性病態、中程度から重度の異形成、および子宮頚癌と分類される状態を意図する。根本的な高悪性度子宮頚部疾患は、ＣＩＮＩＩ、ＣＩＮＩＩＩ、ＨＳＩＬ、上皮内癌、腺癌、および癌（ＦＩＧＯ病期Ｉ〜ＩＶ）の組織学的同定を含む。
【００４９】
本発明の方法は、高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現される少なくとも１つの核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。「核バイオマーカー」によって、細胞の核内で主に発現されるタンパク質の任意の遺伝子を意図する。核バイオマーカーは、細胞の他の部分ではより少ない程度で発現され得る。「高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現される」によって、目的の核バイオマーカーは、高悪性度子宮頚部疾患において過剰発現されるが、何ら異形成の存在しない、ＬＳＩＬ、ＣＩＮＩ、ＨＰＶ感染試料として分類される状態、未熟化生細胞、および臨床疾患であると思われない他の状態では過剰発現されないことを意図する。従って、本発明の核バイオマーカーの検出は、良性増殖、初期ＨＰＶ感染、または軽度の異形成を示す試料から、根本的な高悪性度子宮頚部疾患を示す試料を区別することを可能にする。特定の目的の核バイオマーカーとしては、ＭＣＭタンパク質、詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７が挙げられる。
【００５０】
本発明の特定の態様では、方法は、患者から子宮頚部の試料を採取すること、その試料を本発明の少なくとも１つのＭＣＭ６またはＭＣＭ７のモノクローナル抗体と接触させること、およびＭＣＭタンパク質への抗体の結合を検出することを含む。別の実施形態では、試料を、少なくとも２つのモノクローナル抗体（ＭＣＭ６に特異的に結合する第１の抗体（特にモノクローナル抗体９Ｄ４．３）、ＭＣＭ７に特異的に結合する第２の抗体（特にモノクローナル抗体２Ｅ６．２））と接触させる。抗体結合を検出するための技法は、当該技術分野では周知である。目的のバイオマーカーへの抗体結合は、抗体結合のレベルに対応し、従ってバイオマーカータンパク質発現のレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する化学試薬の使用によって検出され得る。抗体−抗原結合を検出するための任意の方法が本発明の方法を実行するために使用され得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「子宮頚部試料」は、バイオマーカーの発現を検出できる、子宮頚部からの細胞、組織、または体液のあらゆるサンプリングを指す。そのような身体試料の例としては、婦人科学的液体、バイオプシー、およびスメアが挙げられるが、これらに限定されない。子宮頚部試料は、例えば、領域をかきとるかもしくは綿球で採取すること、または針を使用して体液を吸引することを含む様々な技法によって患者から採取され得る。子宮頚部試料を収集するための方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、子宮頚部試料は、子宮頚部細胞、詳細には、液体ベースの調製物中の子宮頚部細胞を含む。一実施形態では、子宮頚部試料は、例えば、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）調製物（ＣＹＴＹＣ，Ｉｎｃ．）等の液体ベースの細胞診標本調製のガイドラインに従って収集される。子宮頚部試料は、拡大下で検査するためにスライドガラスに移され得る。固定液および染色液は、標本を保存するため、および検査を容易にするために、スライドガラスの上の細胞に適用され得る。一実施形態では、子宮頚部試料は、米国特許第５，３４６，８３１号（本明細書中に参考として援用される）に記述されるように単層試料を提供するために収集および処理される。
【００５２】
当業者は、本発明の方法における任意のまたはすべてのステップが手動または自動化方法で技術者によって実行され得ることを認識する。従って、子宮頚部試料の調製、抗体、および抗体結合の検出のステップは、自動化され得る。本発明の方法は、また、高悪性度子宮頚部疾患のより正確な診断を可能にするために、従来のパップ染色技法と組み合わせることも可能である。
【００５３】
以下の実施例は、制限の目的ではなく例証の目的で提示される。
【実施例】
【００５４】
実験
実施例１：ＭＣＭ７に対するマウスモノクローナル抗体の生成
ＭＣＭ７に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチド）は、ＭＣＭ７タンパク質の組換えヘキサヒスチジンタグ付きＮ末端断片であった。Ｔｎｉ細胞中でバキュロウイルス発現系を用いて、抗原を発現させた。具体的には、ヘキサヒスチジンタグ付きＭＣＭ７ Ｎ末端断片のコード配列（配列番号７）を、Ｔｎｉ細胞での発現のためのｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。バキュロウイルス発現系を用いて組換えタンパク質を生成するための方法は、当該技術分野では周知である。タグ付きＭＣＭ７断片を、Ｎｉ＋２イオン（Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡ）を荷電したキレート化アガロースを用いて精製して、免疫原として使用した。免疫原性ＭＣＭ７ Ｎ末端ポリペプチド断片のアミノ酸配列を配列番号８で提供する。
【００５５】
基本的に、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９６に記述されるように、マウスの免疫およびハイブリドーマ融合を実行した。溶液中の免疫原性タグ付きＭＣＭ７断片によってマウスを免疫した。抗体産生細胞を免疫マウスから単離して、骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成した。これらのハイブリドーマを選択培地で培養した。結果として生じた細胞を段階希釈によってプレーティングし、ＭＣＭ７に特異的に結合する（かつ無関係の抗原には結合しない）抗体の産生に関してアッセイした。目的のモノクローナル抗体がＭＣＭ７タンパク質とだけに反応し、ヘキサヒチジンタグとは反応しなかったことを確認するために、選択したハイブリドーマをＭＣＭ７−ＦＬＡＧタグ付きタンパク質に対してスクリーニングした。次いで、選択したモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を分泌するハイブリドーマを培養した。
【００５６】
組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を使用して「消耗した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存率が０〜１５％に低下するまで増殖した細胞）の培養培地の上清から、抗体を精製した。低ｐＨを使用して抗体を溶出し、その後直ちにｐＨを中和した。２８０ｎＭの著しい吸光度を有する画分をプールした。得られたプールをＰＢＳに対して透析した。精製した抗体をさらに特徴決定を行なった。ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２は、ＩｇＧ１アイソタイプであると決定された。この抗体のエピトープマッピングの詳細については、後述する。
【００５７】
実施例２： ＭＣＭ６に対するマウスモノクローナル抗体の生成
ＭＣＭ６に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチド）は、組換えＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６タンパク質であった。ＨＥＫ２９３細胞中でＣｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製の専用発現ベクターを用いて抗原を発現させたか、またはもう１つの方法としてＴｎｉ細胞中でバキュロウイルス発現系を用いて抗原を発現させた。ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６のコード配列を配列番号９に示す。抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲルマトリックスおよび溶出のためのＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．[ミズーリ州セントルイス]）を使用してＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６を細胞溶解産物から精製した。ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６タンパク質を免疫原として使用した。免疫原性ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に提供する。
【００５８】
基本的に、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６（４）：３８１〜３８９に記述されるようにＲＩＭＭＳ技術によってマウス免疫およびリンパ球融合を実行した。免疫原性ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６によってマウスを免疫した。組換えＭＣＭ６タンパク質を使用して非クローン化ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングを行った。組換えＭＣＭ６タンパク質の別々のバッチを使用して二次スクリーニングおよびクローン化ハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を分泌するハイブリドーマを培養した。
【００５９】
組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を使用して「消耗した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存率が０〜１５％に低下するまで増殖した細胞）の培養培地の上清から、抗体を精製した。低ｐＨを使用して抗体を溶出し、その後直ちにｐＨを中和した。２８０ｎＭの著しい吸光度を有する画分をプールした。得られたプールをＰＢＳに対して透析した。精製した抗体をさらに特徴決定を行なった。ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３は、ＩｇＧ２ａアイソタイプであると決定された。この抗体のエピトープマッピングの詳細については、後述する。
【００６０】
実施例３：ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の単離
以下の手順を用いてハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を単離する。
【００６１】
培地の調製
・無菌の１，０００ｍｌの保存瓶に、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１００ｍｌを加える。
・ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１０ｍｌを加える。
・ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液１０ｍｌを加える。
・約１０００ｍｌになるに充分な量のＥｘＣｅｌｌ６１０−ＨＳＦ培地を加える。
・瓶に無菌キャップを取り付け、きつく締める。静かに回転させて、混合させる。
・真空ポンプシステムに１０００ｍｌの無菌アセテート真空フィルターユニット（０．２μｍ）を接続する。
・培地溶液の約半分を無菌アセテート真空フィルターユニットに静かに注いで、真空の電源を入れる。
・培地の最初の半分を濾過したら、残りの培地をフィルターユニットに注ぎ、濾過を続ける。
・培地をすべて濾過したら、真空フィルターユニットから真空ホースを取り外し、真空ポンプの電源を切る。フィルター瓶からフィルターユニットの受取部分を取り外す。新しい無菌瓶のキャップを瓶に取り付ける。
・２℃〜１０℃で保存する。遮光する。
【００６２】
最初のハイブリドーマ細胞培養
・事前に３７℃に温めたＨ２Ｏ槽中でハイブリドーマ凍結保存培養物のバイアルを解凍する。
・凍結バイアルの外側に７０％エタノールをスプレーする。
・解凍したバイアルを生物学的安全キャビネットに移す。
・凍結バイアルから細胞を取り出し、細胞を１５ｍｌ遠心管に移す。
・細胞培養培地７ｍｌを、解凍した細胞を含む１５ｍｌ遠心管に滴下して加える。
・解凍した細胞および培養培地を含む１５ｍｌ遠心管を５分間、２００ｇの力で遠心分離する。
・細胞が遠心分離機内にある間に、４５ｍｌの細胞培養培地を無菌Ｔ−２２５フラスコに加える。
・遠心分離した後、遠心管に細胞ペレットが存在するかを目視検査する。
・細胞ペレットを取り出さないよう気をつけながら遠心管から培地を取り除く。注：細胞ペレットが崩れている場合、遠心分離ステップを繰り返す。
・ペレット状の細胞を含む１５ｍｌ遠心管に５ｍｌの細胞培養培地を加える。細胞ペレットをピペッティングして培地中に再懸濁させる。
・再懸濁させた細胞の内容物全部および培養培地を、４５ｍｌの培地を含むＴ−２２５フラスコに移す。
・Ｔ−２２５フラスコにキャップを取り付ける。
・顕微鏡下でインタクトな細胞が存在するかを観察する。Ｔ−２２５フラスコを直ちにＣＯ２インキュベーターに入れ、細胞を一晩インキュベートする。
【００６３】
ハイブリドーマ細胞株の増殖
・細胞培養物の生存率、濃度、および夾雑の存在のモニタリングを継続して行う。
・最初のＴ−２２５フラスコからの細胞懸濁液をモニタリングし、濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、培地が計２００〜２５０ｍｌになるように調整する。
・細胞を除去して、最小限の細胞密度の必要性を満たすために必要に応じて培地をさらに加える。細胞懸濁液を分けて、新たに１つの無菌Ｔ−２２５フラスコに移す。２つのＴ−２２５フラスコをＣＯ２インキュベーター内に置く。
・濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、フラスコの培地が各々計２００〜２５０ｍｌになるまで、２つのＴ−２２５フラスコからの細胞をモニタリングする。
・細胞を除去して、最小限の細胞密度の必要性を満たすために必要に応じて培地をさらに加える。細胞懸濁液を分けて、新たに２つの無菌Ｔ−２２５フラスコに移し、計４つのＴ−２２５フラスコにする。すべてのフラスコをＣＯ２インキュベーターに戻す。
・細胞をモニタリングし、細胞濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、Ｔ−２２５フラスコあたり約２５０ｍｌの合計体積（すなわち、合計約１，０００ｍｌ）になるまで４つのＴ−２２５フラスコ内の体積を調整する。
・細胞が０〜１５％の最終生存率で増殖を消耗するまで、４つのＴ−２２５フラスコの細胞のモニタリングを継続する。ここで、細胞培養上清は、清澄化プロセスを行える状態になる。
【００６４】
上清の清澄化
・卓上の遠心分離機の電源を入れる。５００ｍｌ遠心管アダプターをローターバケットに設置し、蓋を閉めて、温度を４℃±４℃に設定する。
・無菌技法を用いて、今や消耗したＴ−２２５フラスコ４つのすべてからの培地を２本の５００ｍｌ円錐形遠心管に注ぐ。
・２本の５００ｍｌ遠心管のバランスがとれていることを確実にする。それらのバランスをとる必要がある場合、１つの遠心管から他管に上清を移す。
・消耗した上清を１３５０ｇ（±４０ｇ）で１５分間、２℃〜１０℃で遠心分離する。
・遠心分離が完了した後、上清を１０００ｍｌの無菌保存瓶に無菌でデカンテーションしぎ、無菌キャップをしっかり締める。
・無菌で１ｍｌを微量遠心管に移す。試料の入った微量遠心管を２℃〜１０℃で（遮光して）保存する。
・清澄した上清試料は、Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（登録商標）Ａｓｓａｙを用いてＩｇＧ評価を行える状態である。
【００６５】
緩衝液の調製
結合緩衝液：
・約６００ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏをきれいなビーカーに加える。
・７７．２８ｍｌのホウ酸溶液（４％ Ｗ／Ｖ）を加える。室温できれいなスタラーバーで攪拌する。
・塩化ナトリウムを２３３．７６ｇ量り取り、攪拌しながら溶液に加える。
・溶液をＤＩ Ｈ２Ｏで約９５０ｍｌにして、攪拌を続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が澄んできたら、水酸化ナトリウムでｐＨを９．０±０．２に調整する。
・溶液を取り出してきれいな１０００ｍｌメスシリンダーに入れ、１０００ｍｌになるに充分な量のＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・完成した緩衝液を適切な保存瓶に移す。この緩衝液を使用するまで７日間保存しておくことが可能である。
・この全プロセスを繰り返して、さらに０．２リットル〜１．０リットルの結合緩衝液を調製する。
【００６６】
溶出緩衝液
・一塩基性リン酸ナトリウムを１．７２５ｇ量り取り、きれいなスタラーバー付きのきれいな２５０ｍｌビーカーに入れる。
・クエン酸ナトリウムを３．６７６ｇ量り取り、同じきれいな２５０ｍｌビーカーに入れる。
・約１７５ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを加えて、溶解するまで室温で攪拌する。
・塩化ナトリウムを４．３８ｇ量り取り、攪拌を続けながら溶液に加える。
・ＤＩ Ｈ２Ｏで約２２５ｍｌの溶液にして、攪拌を続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が澄んできたら、塩酸でｐＨを３．５±０．２に調整する。
・溶液を取り出してきれいな２５０ｍｌメスシリンダーに入れ、２５０ｍｌになるに充分な量のＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・真空ポンプシステムに５００ｍｌの無菌アセテート真空フィルターユニット（０．２μｍ）を接続して、溶液を濾過滅菌する。
・フィルターを取り外して、容器を無菌キャップで閉じる。
【００６７】
抗体吸着
・清澄にした上清（約１Ｌ）を、きれいなスタラーバー付きのきれいな４０００ｍｌプラスチック製ビーカーに注ぐ。
・ほぼ同量（約１Ｌ）の結合緩衝液を、清澄にした上清を含んでいるきれいな４０００ｍｌプラスチック製ビーカーに加える。きれいなスタラーバーを加える。
・ビーカーをきれいなプラスチック製ラップで覆い、「抗体結合」のラベルを付ける。
・必要となるＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）プロテインＡの概算量を表１のデータを用いて算出する。
【００６８】
【表１】
・きれいなディスポーザブルカラムと止め栓アセンブリーをリングスタンドとクランプに取り付ける。止め栓を閉じる。
・瓶を数回反転させることにより適当量のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを混合させる。必要体積を取り出して、ディスポーザブルカラムに入れる。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを１０ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏで洗浄する。止め栓を開いて、ＤＩ Ｈ２Ｏを排出させる。止め栓を閉じる。さらに１０ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを用いて繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄する。止め栓を開いて、結合緩衝液を排出させる。止め栓を閉じる。さらに１０ｍｌの結合緩衝液で繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを約１０ｍｌの清澄にした上清および結合緩衝液の溶液（４０００ｍｌビーカーから）中で再懸濁させ、清澄にした上清および結合緩衝液の溶液を含んでいる４０００ｍｌビーカーにビーズを移す。残っているビーズをすべて移すために、必要に応じて繰り返す。完了したら、カラムおよび止め栓を廃棄する。
・２℃〜１０℃で約１８時間、混合物を勢いよく混合させる。
・混合が完了したら、攪拌プレートの電源を切って、緩衝化された上清およびビーズ懸濁液を有する「抗体結合」ビーカーを取り出して、実験台エリアに戻す。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズをビーカーの底に沈澱させる（約５分間）。
・きれいなディスポーザブルカラムおよび止め栓アセンブリーをリングスタンドおよびクランプに取り付ける。止め栓を閉じる。
・きれいな２５０ｍｌ瓶または適切な容器に「結合後のカラム洗浄」とラベルを付ける。
・きれいなプラスチック製ビーカーに「結合後の上清」とラベルを付ける。
・ビーズを４０００ｍｌビーカーの底に残しながら、４０００ｍｌビーカーから上清をラベルが付いたきれいな２リットルのプラスチック製ビーカーにデカンティングする。「結合後の上清」溶液を含んでいる２０００ｍｌビーカーをきれいなラップで覆い、２℃〜１０℃で保存する。
・デカンティングした４０００ｍｌ「抗体結合」ビーカーに、約１５ｍｌの結合緩衝液を加える。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを再懸濁させ、これらをカラムに移す。止め栓を開いて、結合緩衝液を「結合後のカラム洗浄」容器に排出させる。排出が完了したら、止め栓を閉める。
・前述のステップのように、さらに結合緩衝液を加えて、混合させ、カラムに移すことで、「抗体結合」ビーカー中の残っているＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズをすべて移す。排出が完了したら、止め栓を閉める。
・カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄するために必要な結合緩衝液の概算量を表２のデータを用いて算出する。
【００６９】
【表２】
・カラム内のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを、適切な体積の結合緩衝液で、適切な回数洗浄し、「結合後のカラム洗浄液」の容器に溶出液（ｅｆｌｕｅｎｔ）を続けて収集する。
・完了したら、止め栓を閉じる。「結合後のカラム洗浄液」容器を２℃〜１０℃で保存する。
・カラム内のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させるために必要な溶出緩衝液および中和緩衝液の合計体積を表３から決定する。
【００７０】
【表３】
・９本の無菌の円錐形遠心管に「溶出抗体」、画分番号（１〜９）のラベルを付ける。
・画分ごとに必要な適切な体積（上記の表Ｃから決定されるとおり）の中和緩衝液を９本各々の「溶出抗体」画分管に入れ、カラムの止め栓の放出口下にしっかりと設置する。
・画分ごとに必要とされる適切な体積（上記の表３から決定されるとおり）の溶出緩衝液を用いて画分ごとにカラム画分内にＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させ、その間に中和緩衝液を含む「溶出抗体」の各管に溶出液を収集する。
・溶出が完了したら、「溶出抗体」の各画分の管を何回か静かに回旋させて混合させる。画分番号３から約５０μｌを取り出して、ｐＨ試験紙片の上に置いて、溶出液がおよそ６．５〜８．５の間のｐＨに中和されていることを確認する。必要に応じて、ｐＨを範囲内にするために必要なさらなる中和緩衝液または溶出緩衝液を加える。
・ｐＨ評価が完了したら、各画分からの試料の吸光度スキャンを２８０ｎｍ〜４００ｎｍで行って、透析プロセスに進む前に溶出液中のＩｇＧの概算濃度を決定する。
【００７１】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００以上である場合、溶出液プールの一部として画分を受け入れる。
【００７２】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００未満である場合、溶出液プールの一部として画分を拒絶する。
・無菌の円錐形遠心管に「溶出抗体」、「溶出液プール」のラベルを付け、プールの一部として受け入れられたすべての画分を合わせる。
・溶出液プールからの試料の吸光度スキャンを行って、透析プロセスに進む前に溶出液中のＩｇＧの概算濃度を決定する。
・溶出液プールの体積を推定して、ＩｇＧの概算合計ｍｇを算出する。
・溶出液プールの体積： （ｍｌ）× ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ）＝ 合計ＩｇＧ（ｍｇ）
抗体透析
・「溶出抗体」管を２℃〜１０℃で取り出す。
・溶出液の概算体積と表４のデータを使用して、抗体溶出液を透析するために必要な透析チューブの概算の長さを算出する。
【００７３】
【表４】
・必要な適切な長さの透析チューブをカットする（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）２ 再生セルロース膜、１２，０００〜１４，０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、直径１６ｍｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１３２６７８）。
・１０００ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏ中で透析膜チューブを３０分以内で水和させる。
・抗体溶出液を透析するために必要な透析緩衝液の概算体積を表５のデータを使用して算出する。
【００７４】
【表５】
・適切量の透析緩衝液を適切な大きさのプラスチック製ビーカーに入れる。ビーカーに「透析抗体」のラベルを付ける。きれいなスタラーバーを加えて、冷蔵庫内または２〜１０℃の冷温室内の攪拌プレートの上にビーカーを置く。
・透析チューブをＤＩ Ｈ２Ｏで完全に洗い流す。透析チューブの一端から約７ｃｍのところで結び目を２つ作り、しっかりと結ぶ。
・透析チューブに約５ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・透析チューブに「溶出抗体」収集チューブからの溶出抗体を満たす。
・透析チューブの他端（開放端）を端から約７ｃｍのところで結び目を２つ作り、しっかりと結ぶ。ヘッドスペースが表４から算出されたものとほぼ同じであることを確実にする。
・充填して閉じた透析チューブを、適切な体積（表５から）の１×ＰＢＳを含む透析リザーバー内に設置する。
・ビーカーをきれいなプラスチック製ラップで覆う。透析試料が自由に回転するが透析物の渦に引き込まれないように、攪拌プレート上の速度を調節する。透析は、２℃〜１０℃で、２４時間内に、緩衝液を計３回交換して行うべきである。
【００７５】
抗体濾過
・無菌収集チューブに「透析した抗体」のラベルを付ける。
・透析ビーカーから透析した試料チューブを取り外す。透析チューブの一端を切って開放端にして、透析した試料を「透析した抗体」の遠心管に移す。
・別の無菌収集チューブに「透析した抗体」のラベルを付ける。
・最終の透析した体積を保持する適切な容量の無菌ルアーロック（Ｌｕｅｒ Ｌｏｋ）シリンジを選択する。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルターをシリンジの開口部に取り付ける（０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）膜、低タンパク質結合、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号４１９２）。シリンジからプランジャーを取り外し、シリンジを真っすぐ立てながら、「透析した抗体」の管から透析したモノクローナル抗体をシリンジに移す。プランジャーを交換する。
・開けた、無菌で「精製抗体」のラベルが付いた収集チューブの口部の上にＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルターを保持し、シリンジのプランジャーを押し下げて精製抗体を濾過して「精製抗体」の管に入れる。
・濾過が完了したら、「精製抗体」の管にキャップを取り付け、２℃〜１０℃で保存する。
・Ａ２８０手順を用いて精製したモノクローナル抗体の濃度を決定する。
【００７６】
実施例４：エピトープマッピングのための一般法
一般的アプローチ
エピトープマッピングを行って、特定のモノクローナル抗体によって認識される抗原性タンパク質内の直鎖状アミノ酸配列（すなわちエピトープ）を同定する。エピトープマッピングのための一般的アプローチは、一般に異種発現系における全長タンパク質ならびにタンパク質の様々な断片（すなわち切断型）の発現を必要とする。次いで、これらの種々の組換えタンパク質を使用して、特異的モノクローナル抗体が標的タンパク質の１つ以上の切断型に結合できるかどうかを決定する。反復切断の使用および重なるアミノ酸領域を有する組換えタンパク質の産生を介して、研究中のモノクローナル抗体によって認識される領域を同定することが可能である。ウェスタンブロット解析またはＥＬＩＳＡを使用して、研究中の特異的モノクローナル抗体が１つ以上の組換えタンパク質断片に結合できるかどうかを決定する。このアプローチは、エピトープを含むペプチド領域を最終的に同定することができ、場合によっては、エピトープを８〜１５アミノ酸配列まで正確に精密化することができる。エピトープは、８〜１５アミノ酸の連続する直鎖状配列であり得、またはペプチド鎖の異なる部分から構成されるタンパク質上の部位に結合する抗体とは不連続であり得る。不連続のエピトープは、通常、マッピングが不可能である。
【００７７】
構築物の設計および作製
エピトープマッピングの第１のステップは、入れ子遺伝子の切断の設計である。しばしば、遺伝子は、さらなる解析のために４つの同等の部分に分けられる。
【００７８】
遺伝子クローニング戦略
一般のクローニング戦略は、クローン化遺伝子断片のＰＣＲに基づく生成から開始される。クローン化断片を効率的に発現させるために、特に、小さいアミノ酸領域を使用するときは、クローン化断片は、融合タンパク質（すなわち、その系で安定して発現される別の担体タンパク質に融合される）として発現される。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、担体タンパク質として頻繁に使用される。ＧＦＰは、それに続くインビトロタンパク質発現ステップの間に切断断片を安定化させ、発現を向上させるために、融合パートナーとして含まれる。ＧＦＰは、また、抗ＧＦＰ抗体を使用する融合タンパク質発現の追跡を可能にする。
【００７９】
ＧＦＰタンパク質構築物を作製するためのクローニングは、メガプライミングアプローチまたはｐＳｃｒｅｅｎ−ＧＦＰベクターへのプラスミドクローニングの使用によるいずれかを用いて実行される。通常、切断断片は、メガプライミングと呼ばれる技法を用いて、ＧＦＰおよびタンパク質発現に必要な制御配列に融合される。
【００８０】
メガプライミングは、２つ以上のＤＮＡ断片を、それぞれの断片の端で相同領域をアニールし、アニールされた一本鎖ＤＮＡを、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させることによって連結することである。このプロセスは、２つ以上の小さい断片をそれらが共有する配列によって結合し、１つの大きなＤＮＡ断片を作製する。この大きな断片は、次いで、標準ＰＣＲを用いて増幅される。
【００８１】
メガプライミングが成功裏に使用できない場合、切断断片は、ＧＦＰおよびタンパク質発現制御配列を含むプラスミドにクローニングされ得る。このクローニングは、エピトープマッピングに必要なＧＦＰ／断片融合物を作製する。プロトコールの残りの部分は、次いで、以下に記述するように行うことが可能である。
【００８２】
タンパク質の発現
例えば、メガプライミングによって作製された発現構築物は、次いで、迅速翻訳系（ＲＴＳ）に導入される。ＲＴＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解産物由来の無細胞タンパク質発現系である。この系は、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質の迅速な（３〜４時間）発現を可能にする。
【００８３】
ＲＴＳが適切なレベルのタンパク質発現を生成しない場合は、切断断片は、ＧＦＰタンパク質発現プラスミドにクローニングされる。これらの融合プラスミドは、次いで、タンパク質発現のために最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系に形質転換される。タンパク質発現は、細菌の増殖培養物中で誘導され、増殖の後細胞は溶解される。複雑な細胞溶解産物中のタンパク質は、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、およびプロトコールの残りの部分は、以下と同様である。
【００８４】
タンパク質検出およびエピトープマッピング
ＲＴＳによって生成されたタンパク質断片は、ＰＡＧＥを用いて分離され、次いでニトロセルロース膜上に移される。膜結合タンパク質は、次いで、溶けた研究中の抗体に曝露される。抗体／タンパク質の結合は、当該技術分野で公知の比色技法を用いて同定される。
【００８５】
全長タンパク質および切断タンパク質断片の一部のサブセットの抗体結合は、陽性の結果を構成する。タンパク質の特定の部分が欠如して抗体結合を除去する場合、エピトープは、この断片の上に位置する。
【００８６】
マッピングされる抗体がニトロセルロース膜に結合されたタンパク質を認識しない場合は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降等の抗体／タンパク質相互作用を検出するための代替法が用いられる。抗体／タンパク質相互作用を検出するための方法は、当該技術分野で周知である。
【００８７】
エピトープ位置の精密化
上述のプロトコールは、エピトープの位置をタンパク質の約４分の１まで絞り込むだけなので、エピトープの位置をさらに解明するために、エピトープを含むことが決定されたタンパク質の４分の１で、プロセスを繰り返す必要がある。非常に大きなタンパク質に関しては、エピトープを８〜１５アミノ酸まで絞り込むために、このプロセスを２回または３回繰り返すことが必要になり得る。
【００８８】
実施例５：ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のためのエピトープの特徴付け
ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のエピトープマッピングを、基本的に上記の実施例４に記述したように実行した。具体的には、ＰＣＲを用いて、全長ＭＣＭ６タンパク質の４つのＭＣＭ６遺伝子切断物を作製し、続いてＲＴＳによってＧＦＰ融合タンパク質として組換えＭＣＭ６タンパク質断片を生成し、最終的に、ウェスタンブロット法によって特定のＭＣＭ６断片に結合する抗体を検出した。ＲＴＳでの頑強で安定な発現を確実にするために、第２ラウンドのＰＣＲにおいてＧＦＰをＭＣＭ６遺伝子切断物と連結させた。
【００８９】
９Ｄ４．３抗体に結合する断片を同定するために、ＭＣＭ６タンパク質断片をウェスタンブロット法によって解析した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。断片４と命名されたＭＣＭ６切断生成物を用いて陽性バンドが検出された。断片４を５つのより小さい断片に分割し、上記のプロセスを繰り返してエピトープを絞り込んだ。
【００９０】
ＭＣＭ６タンパク質断片の第２のセットも、ウェスタンブロット法によって解析し、９Ｄ４．３抗体に結合する断片を同定した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。モノクローナル抗体９Ｄ４．３は、４−４と命名したＭＣＭ６の領域に結合することが示された。この断片を再び６つのより小さい断片に分割し、上記のプロセスを繰り返してエピトープを絞り込んだ。
【００９１】
ＭＣＭ６タンパク質断片を再び前述のとおりのウェスタンブロット法によって解析した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。４−４−１と命名したＭＣＭ６断片を用いて陽性バンドが検出された。さらに断片を生成して、エピトープ領域を絞り込んだ。ウェスタンブロット解析は、ＭＣＭ６抗体９Ｄ４．３のエピトープがアミノ酸配列ＩＤＳＥＥＥＬＩＮＫＫＲＩ（配列番号５）を含むことを示した。
【００９２】
結果
最初の結果は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のエピトープがＭＣＭ６タンパク質のＣ末端領域内に位置することを示した。ＭＣＭ６タンパク質の連続する切断は、９Ｄ４．３によって認識されるエピトープが１３アミノ酸の領域内に位置し、特に、配列番号３（ＩＤＳＥＥＥＬＩＮＫＫＲＩ（配列番号５））のアミノ酸残基７６０〜７７２に対応することを示した。追加のラウンドのＲＴＳによって、エピトープの位置をさらに精密化することが可能になり得る。
【００９３】
実施例６：ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープの特徴付け
ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープマッピングを基本的に実施例５に上述したように行った。全長ＭＣＭ７遺伝子配列（配列番号１）を、遺伝子断片を設計するための出発配列として用いた。
【００９４】
結果
ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープを、配列番号１（ＰＡＥＬＭＲＲＦＥＬＹＦ（配列番号６））のアミノ酸残基１２７〜１３８を含むタンパク質領域内に位置すると決定した。追加のラウンドのＲＴＳによって、エピトープの位置をさらに精密化することが可能になり得る。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に結合できる抗体およびこれら抗体の使用方法、特に子宮頚部疾患の診断における使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
子宮頚部の癌腫は、女性における２番目に多い一般的新生物であり、女性の全癌の約１２％の割合を占め、毎年約２５万人の死亡を引き起こしている。非特許文献１。集団スクリーニングプログラムが利用可能でない多くの発展途上国では、臨床に関する問題は、より深刻である。これらの国では、子宮頚癌は、女性における癌による死亡の第１位の原因である。
【０００３】
子宮頸癌の症例は、腺癌も見られるが、その大多数は、扁平上皮細胞癌を示す。子宮頚癌は、詳細に明らかにされた非侵襲性の上皮内段階を経て進行し、この上皮内段階は形態的に識別することが可能であるので、集団スクリーニングによって防止され得る。非特許文献２。正常な細胞がどのように癌化するかは、理解されていないが、正常な重層上皮から子宮頚部上皮内新生物（ＣＩＮ）を経て浸潤癌へと連続範囲で病理組織学的に変化するという概念が何年もの間広く受け入れられている。子宮頚癌の前駆病変は異形成であり、当該技術分野では、ＣＩＮまたは扁平上皮内病変（ＳＩＬ）として知られている。扁平上皮内異常は、３層（ＣＩＮ）または２層（ベセスダ）システムを用いて分類され得る。ベセスダシステムに基づいて、ＣＩＮＩおよびＨＰＶ感染に対応する軽度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）は、通常、侵襲性疾患への進行のリスクが比較的低い増殖性ＨＰＶ感染を表す。３層システムのＣＩＮＩＩおよびＣＩＮＩＩＩに対応する高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）は、ＬＳＩＬよりも子宮頚癌への進行のリスクがより高いが、ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬは両方とも悪性疾患の潜在的な前駆病変と見られる。患者試料も、このシステムに基づいてＡＳＣＵＳ（意義不明な異型扁平上皮細胞）またはＡＧＵＳ（意義不明な異型腺細胞）に分類され得る。
【０００４】
子宮頚癌と高リスク型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えば、１６型、１８型、および３１型）による感染との強い関連が確立されている。実際に、疫学的証拠および分子生物学的な証拠の大部分は、子宮頚癌の原因因子としてＨＰＶ感染を確立した。さらに、ＨＰＶは、高悪性度子宮頚部疾患の症例の８５％以上で発見される。しかし、ＨＰＶ感染は極めて一般的であり、３０歳を超える女性の５〜１５％で起きている可能性があるが、高悪性度子宮頚部疾患または癌をこれまでに発症しているＨＰＶ陽性女性はほとんどいない。ＨＰＶ単独での存在は感染を示すだけであって、高悪性度子宮頚部疾患を示さず、従って、ＨＰＶ感染単独についての検査は、数多い偽陽性をもたらす。例えば、非特許文献３を参照。
【０００５】
ＨＰＶが子宮頚部の下層組織内の基底幹細胞に感染することを最近の文献は示唆している。重層子宮頚上皮への細胞の遊走を結果として生じる、成熟ケラチノサイトへの幹細胞の分化は、ＨＰＶウイルスの複製および細胞の再感染と関連する。このウイルスの複製プロセスの間に、細胞周期の調節解除、活発な増殖、ＤＮＡ複製、転写活性化、およびゲノム不安定性を含む多くの細胞変化が起こる（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
大部分のＨＰＶ感染は、ウイルス感染が１２ヵ月の期間内にそれ自体で消散する、実在して一過性のものである。１つ以上の発癌性サブタイプのＨＰＶによる持続感染を発症する個体にとっては、非ＨＰＶ感染患者と比較して新生物を発症するリスクがある。子宮頚部新生物の発症におけるＨＰＶの重要性を考えると、ＨＰＶの臨床検出は、子宮頚部新生物発症のリスクのある患者の同定における重要な診断ツールとなった。ＨＰＶをベースにした子宮頚部疾患スクリーニングの臨床的有用性は、その陰性を予測する価値にある。通常のパップスメアの履歴と組み合わせたＨＰＶ陰性の結果は、疾患のない状態およびその後の１〜３年間の間の子宮頚部新生物発症の低リスクを示す、優れた指標である。しかしながら、ＨＰＶ陽性結果は、子宮頚部疾患の診断ではなく、むしろそれは感染の表示である。大部分のＨＰＶ感染は一過性のものであり、１２ヵ月間の期間内に自然と消滅するが、高リスクのサブタイプのＨＰＶウイルスによる持続感染は、子宮頚部新生物の発症のより高いリスクを示す。ＨＰＶテストを補充するために、子宮頚部新生物と関連する分子マーカーの同定は、子宮頚部疾患の診断の臨床特異性を改善することが期待される。
【０００７】
パパニコロー染色での子宮頚部スメア（パップスメア）の細胞診は、現在、子宮頚癌の検出のための選り抜きの方法である。パップテストは、実質的に６０年間変わることなく残っている主観的方法である。しかしながら、その性能についていくつかの懸念がある。単回のパップテストの報告される感度（検査で陽性と出る疾患陽性の比率）は低く、かつ広範なバリエーションを示す（３０〜８７％）。単回のパップテストの特異性（検査で陰性と出る疾患陰性の比率）は、スクリーニング集団では８６％まで低い場合もあり得、そして根底にある高悪性度疾患を決定するためのＡＳＣＵＳ ＰＬＵＳ集団ではさらにかなり低いことがある。非特許文献１参照。ＬＳＩＬまたはＣＩＮＩとして特徴付けられるパップスメアの有意なパーセンテージは、高悪性度病変に対して実際に陽性である。さらに、パップスメアの１０％までは、ＡＳＣＵＳ（意義不明な異型扁平上皮細胞）として分類され、すなわち、正常、中程度もしくは重度の病変または腫瘍として明白に分類することが可能でない。しかしながら、このＡＳＣＵＳ集団の１０％までは、高悪性度病変を有し、結果的に見過ごされることを経験では示している。例えば、非特許文献７を参照。従って、高悪性度子宮頚部疾患で選択的に過剰発現される分子バイオマーカーおよびこれらのバイオマーカーを検出するための組成物は、高悪性度子宮頚部疾患を診断するための信頼できる方法を実行するのに必要である。
【０００８】
ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、真核性ＤＮＡ複製の不可欠な部分で役割を果たしている。ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、重複したＤＮＡ鎖のデノボ合成中に、ＤＮＡ上に前複製複合体をのせ、二重鎖ＤＮＡをほどく手助けをするためのヘリカーゼとして機能することによりＤＮＡ複製の初期段階に機能する。ＭＣＭタンパク質の各々は、それらの高度に保存された中心ドメインにＤＮＡ依存ＡＴＰａｓｅモチーフを有する。ＭＣＭタンパク質のレベルは、通常、細胞周期のＧ０期からＧ１／Ｓ期へと正常細胞が進行するにつれて変化する形で増加する。Ｇ０期では、ＭＣＭ２タンパク質およびＭＣＭ５タンパク質は、ＭＣＭ７タンパク質およびＭＣＭ３タンパク質よりもずっと少ない。ＭＣＭ６は、ＭＣＭ２、ＭＣＭ４、およびＭＣＭ７と複合体を形成して、ヒストンＨ３に結合する。さらに、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、およびＭＣＭ７の部分複合体は、ヘリカーゼ活性を有しており、その活性は、ＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性およびＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性によって媒介される。例えば、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照。それらすべては、それら全体が本明細書に参考として援用される。
【０００９】
ＭＣＭタンパク質および特にＭＣＭ５が、子宮頚部疾患（非特許文献２）ならびに他の癌（非特許文献８）の検出に有用であると初期の刊行物は示している。発表された文献は、ＭＣＭ５に対する抗体が子宮頚新生物細胞を検出できることを示している。高悪性度子宮頚部疾患の検出に対する特異性は、ＭＣＭ５に対しては実証されていない（非特許文献２）。ＭＣＭ５発現の検出は、高悪性度子宮頚部疾患に限定されるだけでなく、高リスクＨＶＰによる感染の後に細胞周期に再度入った同定された低悪性度の異形成および増殖細胞においても検出される。ＭＣＭ５に対する抗体による子宮頚新生物の検出は、図４に示される。ＭＣＭ５に加えて、ＭＣＭ２およびＭＣＭ７を含むＭＣＭファミリーの他のメンバーは、組織試料において子宮頚腫瘍を検出するための潜在的に有用なマーカーであることが示されている（非特許文献８；非特許文献１１）。ＭＣＭ７が、免疫化学形式を使用する高悪性度子宮頚部疾患の検出のための特異的なマーカーであるように思われると最近の結果は示している（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【非特許文献１】Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ３：１〜１０
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４９３２〜１４９３７
【非特許文献３】Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０３：３０４〜３０９
【非特許文献４】Ｃｒｕｍ（２０００）Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３：２４３〜２５１
【非特許文献５】Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：１０１８６〜１０２０１
【非特許文献６】Ｐｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４：１３５９〜１３６８
【非特許文献７】Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＪＡＭＡ ２８１：１６０５〜１６１０
【非特許文献８】Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：２１２１〜２１３２
【非特許文献９】Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１４：１４４７〜１４５４
【非特許文献１０】Ｉｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０８９〜１１０１
【非特許文献１１】Ｂｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：８１７３〜８１８０
【非特許文献１２】Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ． ４３：６９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカーの発現を検出できる抗体が当該技術分野では必要である。そのような抗体は、初期のＨＰＶ感染および軽度の異形成等の臨床疾患とは考えられない状態と高悪性度疾患とを区別するための方法で使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
高悪性度子宮頚部疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、本発明の核バイオマーカータンパク質、詳細にはＭＣＭタンパク質、より詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７へと結合し得るモノクローナル抗体を含む。これらのモノクローナル抗体の抗原結合断片および変異体、これらの抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株、および本発明のモノクローナル抗体を含むキットも本明細書に包含される。
【００１２】
本発明の組成物は、高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法における有用性を見出す。これらの方法は、核バイオマーカーの過剰発現が高悪性度子宮頚部疾患を示す、少なくとも１つの核バイオマーカーの発現を検出することを含む。特に、これらの方法は、子宮頚部試料におけるＭＣＭ６またはＭＣＭ７の過剰発現を検出するために本発明の抗体を用いることを含む。
【００１３】
本発明の組成物は、さらに、ＭＣＭ６モノクローナル抗体またはＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合することができるエピトープを含む単離されたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、ＭＣＭ６抗体またはＭＣＭ７抗体を産生するための方法における有用性を見出す。ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープのアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子もまた提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
高悪性度子宮頚部疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、高悪性度子宮頚部疾患で選択的に過剰発現される核バイオマーカータンパク質、詳細にはＭＣＭタンパク質、より詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７に結合できるモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた開示される。本明細書に記述するモノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供される。本組成物は、患者の高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法における有用性を見出す。
【００１５】
本発明の組成物は、ＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７に、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。ＭＣＭ６のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、配列番号３（受入番号ＮＰ＿００５９０６）および配列番号４（受入番号ＮＭ＿００５９１５）にそれぞれ示される。ＭＣＭ７のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、配列番号１（受入番号ＮＰ＿００５９０７）および配列番号２（受入番号ＮＭ＿００５９１６）にそれぞれ示される。特定の実施形態では、９Ｄ４．３と命名されたＭＣＭ６モノクローナル抗体および２Ｅ６．２と命名されたＭＣＭ７モノクローナル抗体が提供される。ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年４月１４日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ２０１１０−２２０９）の特許寄託機関に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９が割り当てられた。ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年８月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ２０１１０−２２０９）の特許寄託機関に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１が割り当てられた。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づいて維持される。この寄託は、単に当業者の便宜のために行なわれたものであり、寄託が米国特許法１１２条によって必要とされることを承認するわけではない。
【００１６】
モノクローナル抗体９Ｄ４．３および２Ｅ６．２の結合特性を有する抗体も本明細書で開示される。そのような抗体としては、競合結合アッセイでこれらの抗体と競合する抗体、ならびにモノクローナル抗体９Ｄ４．３もしくは２Ｅ６．２に結合できるエピトープに結合する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７にそれぞれ特異的に結合する能力を保持するモノクローナル抗体９Ｄ４．３および２Ｅ６．２の変異体および断片も提供される。組成物は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株および本明細書で開示される少なくとも１つのモノクローナル抗体を含むキットを含む。
【００１７】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が抗原に対する結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠如する他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、および骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
【００１８】
用語「抗体」および「複数の抗体」は、天然に存在する形態の抗体および組換え抗体（単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、および多特異性抗体、ならびに前述のものすべてのものの断片および誘導体等）を広く包含する。それらの断片および誘導体は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、その抗体に結合されたタンパク質または化学部分を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ，単鎖抗体、二重特異性抗体）に結合し得る抗体断片、および前述のものを含む組換えペプチドを包含する。本明細書で使用される場合、「ＭＣＭ６抗体」または「ＭＣＭ７抗体」は、ＭＣＭ６（配列番号３）もしくはＭＣＭ７（配列番号１）、またはそれらの変異体もしくは断片に特異的に結合する任意の抗体を指し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、および親抗体の抗原結合機能を保持するそれらの断片を包含する。
【００１９】
本発明のＭＣＭ６抗体およびＭＣＭ７抗体は、最適には、モノクローナル抗体である。本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る自然に発生する可能性のある変異を除いて同じである）から得られる抗体を指す。
【００２０】
「ネイティブ抗体」および「ネイティブ免疫グロブリン」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されている約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。ジスルフィド結合の数が、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間では変化する一方、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合される。各重鎖および軽鎖は、また、鎖内のジスルフィド架橋を一定の間隔であけている。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ）を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【００２１】
用語「可変の」は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広範に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性で使用される事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均等には分布されていない。それは、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおいて、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、大体はｐシート立体配置の形をとり、ｐシート構造を結合するループを形成する３つのＣＤＲ（および場合によってはｐシート構造の部分を形成する１５のＣＤＲ）によって結合される４つのＦＲ領域を含む。抗体の各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によっておよび他の鎖からのＣＤＲを用いてごく接近して共に保持され、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ． Ｉ，６４７〜６６９頁（１９９１）参照）。
【００２２】
定常ドメインは、抗体を抗原に結合する際に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の様々なエフェクター機能を示す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ２５ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．［１９９１］）および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７［１９８７］）を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書で見なされる場合の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７〜１０６２）、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、２つの同じ抗原結合断片（それぞれが１つの抗原結合部位を有するいわゆる「Ｆａｂ」断片および残りの「Ｆｃ」断片（その名称は、容易に結晶化するその能力を反映する））を生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋結合できる１つのＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【００２５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体断片である。二本鎖のＦｖ種では、この領域は、強く非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種では、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるそれに類似した「二量体」構造で結合できるように、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが可動性のペプチドリンカーによって共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面で抗原結合部位を画定するするのは、この立体配置内である。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりは低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２６】
Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が添加されることによってＦａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。
【００２７】
ＭＣＭ６抗体およびＭＣＭ７抗体の断片は、全長抗体の所望の親和性を保持する限り、本発明によって包含される。従って、例えば、ＭＣＭ６抗体の断片は、ＭＣＭ６抗原に結合する能力を保持する。同様に、ＭＣＭ７抗体の断片は、ＭＣＭ７抗原に結合する能力を保持する。そのような断片は、対応する全長抗体と類似する特性（すなわち、それらの断片はＭＣＭ６またはＭＣＭ７に特異的に結合する）によって特徴付けられる。そのような断片は、本明細書では「抗原結合」断片といわれる。
【００２８】
抗体の適切な抗原結合断片は、全長抗体の一部（通常、その抗原結合領域または可変領域）を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片、ならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖と重鎖の一部とから構成される免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意図する。Ｆ（ａｂ’）２によって、両軽鎖と両重鎖の一部とを含む免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意図する。「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓＦｖ」抗体断片によって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチドに存在する、抗体のこれらのドメインを含む断片を意図する。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、および第５，８５６，４５６号を参照。これらは、本明細書中に参考として援用される。通常、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、このことにより、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ． １１３，ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），２６９〜３１５頁）を参照。
【００２９】
抗体または抗体の断片は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号に記述されている技法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７には、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体それぞれの単離が記述されている。その後の刊行物には、鎖シャッフリング法による高親和性（ｎＭの範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９〜７８３）、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略として、コンビナトリアル感染およびインビボでの組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５〜２２６６）が記述されている。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な別の手段である。
【００３０】
種々の技法が、抗体断片の産生のために開発されてきた。伝統的に、こうした断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化から誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７〜１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照）。しかしながら、これらの断片は、今や組換え宿主細胞によって直接生成され得る。例えば、抗体断片は、上述した抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収され、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片を産生するための他の技法は、熟練した実施者にとって明らかである。
【００３１】
好ましくは、本発明の抗体は、事実上モノクローナルである。上述のように、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る自然に発生する可能性のある変異を除いて同一である）から採取される抗体を意図する。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。この用語は、免疫グロブリン全体、ならびに断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび抗体の抗原結合機能を保持する他の断片）を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、本明細書の以下で定義するとおりの単一の抗原性部位（すなわち、ＭＣＭ６タンパク質またはＭＣＭ７タンパク質内の特定のエピトープ）に対して指向される。さらに、通常は、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記述されたハイブリドーマ法によって生成されることが可能であり、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって生成され得る。「モノクローナル抗体」は、また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１〜５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号に記述されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３２】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９６の方法、またはその改変法を使用して調製されることが可能である。通常、マウスが抗原を含む溶液によって免疫される。免疫は、生理食塩水に、好ましくはフロイント完全アジュバント等のアジュバントに抗原を含む溶液を混合または乳化させ、その混合液または乳濁液を非経口的に注入することによって実行され得る。当該技術分野で公知のいかなる免疫方法も、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用され得る。動物を免疫した後、脾臓（および必要に応じて、いくつかの大きなリンパ節）を摘出し、解離して単一の細胞にする。脾臓細胞は、目的の抗原を被覆したプレートまたはウェルに細胞懸濁液を塗布することによってスクリーニングされ得る。抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞（すなわち抗体産生細胞）は、プレートに結合し、洗い流されない。結果として生じるＢ細胞、または解離したすべての脾臓細胞は、次いで、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成するために、骨髄腫細胞と融合するよう誘導され、選択培地で培養される。結果として生じる細胞は、段階希釈によってプレーティングされ、目的の抗原に特異的に結合する（かつ無関連の抗原には結合しない）抗体の産生に関してアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマは、次いで、インビトロで（例えば、組織培養瓶または中空糸型リアクター内で）、またはインビボでの（マウス内の腹水として）のいずれかで培養される。モノクローナル抗体は、また、反復免疫多重部位技術（ＲＩＭＭＳ）を使用して産生され得る。例えば、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６（４）：３８１〜３８９；Ｗｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ． １９（５）：６９５〜７０７；およびＢｙｎｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（５）：４０７〜４１１を参照。これらすべては、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３３】
ハイブリドーマの使用の別の方法として、米国特許第５，５４５，４０３号；同第５，５４５，４０５号；および同第５，９９８，１４４号（これらは、参照することによって本明細書に援用される）に開示されるように、ＣＨＯ細胞株等の細胞株で産生され得る。手短に言えば、細胞株は、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現することができるベクターをトランスフェクトされる。２つのタンパク質を別々のベクター上にトランスフェクトすることによって、キメラ抗体が産生され得る。別の利点は、抗体の正確な糖鎖付加である。モノクローナル抗体は、また、それによってバイオマーカータンパク質を結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離するために、バイオマーカータンパク質を用いて組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定および単離されることが可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成しスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒｆＺＡＰ θ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングで使用するために特に受け入れられる方法と試薬の例は、例えば、以下で見られ得る：米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報 国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；同第９２／０９６９０号；および同第９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５〜７３４。
【００３４】
本発明の一部の態様では、抗体は、組織学的試料よりはむしろ細胞学的な所望の染色に基づいて選択され得る。すなわち、特定の実施形態では、抗体は、最終試料の型（例えば、細胞学的調製物）を考慮し、そして結合特異性に関して選択される。ＭＣＭ６またはＭＣＭ７等の目的の特異的なバイオマーカーに対する抗体は、多段階スクリーニングのプロセスによって選択および精製される。抗体選択のためのそのような方法は、係属中の米国特許出願第１１／０８７，２２７号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、出願日２００５年３月２３日（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記述されている。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体もまた提供される。抗体に関連して使用されるとき、「結合特性」または「結合特異性」とは、比較抗体と同一または同様の抗原エピトープを抗体が認識することを意味する。そのような抗体の例としては、例えば、競合結合アッセイで本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体が挙げられる。当業者は、抗体が、標準的な方法を使用して別の抗体に競合的に干渉するかどうかを決定することができ得る。
【００３６】
「エピトープ」によって、それに対して抗体が産生され、抗体が結合する、抗原分子の一部分を意図する。「ＭＣＭ６エピトープ」は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体が結合する、ＭＣＭ６タンパク質の一部分を含む。「ＭＣＭ７エピトープ」は、ＭＣＭ７モノクローナル抗体が結合する、ＭＣＭ７タンパク質の一部分を含む。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が直鎖状の様式で次々に連続して配置される）、非直鎖状アミノ酸残基（本明細書では「非直鎖状エピトープ」と呼ばれる；これらのエピトープは、連続して配置されない）、または直鎖状と非直鎖状の両アミノ酸残基を含み得る。一般的に、エピトープは、短いアミノ酸配列（例えば約５アミノ酸長）である。エピトープを同定するための体系的な技法は、当該技術分野では周知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号および以下に示す例に記述されている。手短に言えば、１つの方法では、抗原由来の一組の重なり合ったオリゴペプチドが合成され、各ピンに独特のオリゴペプチドで、ピンの固相アレイに結合され得る。ピンのアレイは、９６穴マイクロタイタープレートを含み得、９６オリゴペプチドのすべてを（例えば、バイオマーカーに特異的なモノクローナル抗体に対する結合に関して）同時にアッセイすることが可能である。あるいは、ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））が、現在、エピトープマッピング用に市販されている。これらの方法を用いて、所定の抗体が結合するエピトープを同定するために、連続したアミノ酸の可能なすべてのサブセットに対する結合親和性が、決定され得る。抗体を採取する動物を免疫するためにエピトープの長さのペプチド配列が使用される場合、エピトープは、また、推論によって同定され得る。
【００３７】
本発明はまた、ＭＣＭ６モノクローナル抗体またはＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、モノクローナル抗体に結合する抗原（すなわち、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７）の一部に対応する。そのようなポリペプチドは、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に選択的に結合する抗体を産生するための方法における有用性を見出す。抗体の産生で使用されるポリペプチドの能力は、本明細書では「抗原活性」と呼ばれる。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列（配列番号３に示すＭＣＭ６アミノ酸配列の残基７６０〜７７２に対応する）は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体、より詳細にはモノクローナル抗体９Ｄ４．３によって認識されるエピトープを含む。配列番号６に示すアミノ酸配列（配列番号１に示すＭＣＭ７アミノ酸配列の残基１２７〜１３８に対応する）は、ＭＣＭ７モノクローナル抗体、より詳細にはモノクローナル抗体２Ｅ６．２によって認識されるエピトープを含む。元々のポリペプチドの抗原活性を保持する、配列番号５および配列番号６に示すＭＣＭ６およびＭＣＭ７のエピトープ配列の変異体および断片も提供される。本発明は、さらに、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープ、ならびにその変異体および断片を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【００３８】
ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープを含む本発明のポリペプチドは、本明細書で上述したように、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法で使用され得る。そのようなポリペプチドは、また、ポリクローナルＭＣＭ６抗体またはポリクローナルＭＣＭ７抗体の産生で使用され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７のエピトープ（すなわち免疫原）を含むポリペプチドを用いて適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類）を免疫することによって調製され得る。免疫された被験体の抗体力価は、固定化されたバイオマーカータンパク質を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる等の標準的技法によって長期にわたりモニターされることが可能である。免疫後の適切な時期に、例えば、抗体力価が最も高いときに、抗体産生細胞を被験体から採取し、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７）によって最初に記述されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ），７７〜９６頁）、またはトリオーマ技法等の標準的技法によってモノクローナル抗体を調製するために使用することが可能である。ハイブリドーマを生成する技術は周知である（一般に、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０〜５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， ＮＹ； ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ， ５４：３８７〜４０２を参照）。
【００３９】
本明細書で記述されるＭＣＭ６もしくはＭＣＭ７のエピトープを含むモノクローナル抗体またはポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、また、本発明によって包含される。変異体は、目的の抗体をコードするクローン化ＤＮＡ配列における変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は、当該技術分野では周知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３６７〜３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号、およびそれに記載される参考文献を参照。これらは、本明細書中に参考として援用される。目的のポリペプチドの生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換についてのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のモデルに見ることができ、本明細書中に参考として援用される。１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が好適であり得る。保存的置換の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒ。
【００４０】
目的のポリペプチドの変異体を構築する際に、変異体が所望の活性（すなわち、バイオマーカーへの同様の結合親和性）を持ち続けるように、改変はなされる。言うまでもなく、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡでなされたいかなる変異もその配列を読み枠から外してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生成することができる相補領域を作成しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照。
【００４１】
好ましくは、参照ポリペプチドの変異体は、参照抗体分子のアミノ酸配列に対して、または参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％もしくは７５％の配列同一性を、好ましくは少なくとも８０％もしくは８５％の配列同一性を、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、それらの分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的で、パーセント配列同一性は、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップエクステンションペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスによるアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２〜４８９に教示されている。変異体は、例えば、参照抗体とわずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、もしくは１つのアミノ酸残基が異なる可能性がある。
【００４２】
２つのアミノ酸配列の最適な整列に関して、変異体アミノ酸配列の隣接セグメントは、参照アミノ酸配列に対して追加のアミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有する可能性がある。参照アミノ酸配列との比較のために使用される隣接セグメントは、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０、もしくはそれより多くのアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップに関連する配列同一性の補正は、なされることが可能である（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを参照）。
【００４３】
本発明のＭＣＭ６およびＭＣＭ７のモノクローナル抗体は、試料中のバイオマーカータンパク質の検出を促進するために、以下に記述する検出可能な物質によって標識され得る。そのような抗体は、本発明の方法の実行における有用性を見出す。本発明の抗体および抗体断片は、抗体結合の検出を促進するために、検出可能な物質にカップリングされ得る。本明細書で使用されるとき、用語「標識」は、「標識された」抗体を生成するために、抗体に直接的にまたは間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）で検出可能であり得るか、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。抗体を標識する目的のための検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ，または３Ｈが挙げられる。
【００４４】
本発明の少なくとも１つのＭＣＭ６または１つのＭＣＭ７のモノクローナル抗体を含むキットがさらに提供される。「キット」によって、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７の発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬（すなわち、抗体）を含む任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）が意図される。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、販売促進、配布、または販売され得る。さらに、キットは、キットおよびその使用方法を記述する添付文書を含み得る。
【００４５】
本発明のキットは，通常、ＭＣＭ６またはＭＣＭ７に対する少なくとも１つのモノクローナル抗体、抗体結合の検出のための化学物質、対比染料、および必要に応じて、陽性染色細胞の同定を促進するための青味剤を含む。抗原−抗体結合を検出するいかなる化学物質でも、本発明のキットで使用され得る。一部の実施形態では、検出化学物質は、二次抗体に結合された標識ポリマーを含む。例えば、抗原−抗体結合部位で色素原の沈着を触媒する酵素に結合される二次抗体が、提供され得る。抗体結合の検出で使用するためのそのような酵素および技法は、当該技術分野では周知である。一実施形態では、キットは、ＨＲＰ標識ポリマーに結合された二次抗体を含む。結合した酵素に適合する色素原（例えば、ＨＲＰ標識二次抗体の場合は、ＤＡＢ）、および非特異的染色をブロックするための過酸化水素等の溶液が、さらに提供され得る。別の実施形態では、バイオマーカータンパク質に結合する抗体は、モノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬の使用、それに続くマウスプローブ試薬に結合するＨＲＰと結合させたデキストランポリマーの添加によって検出される。そのような検出試薬は、例えば、バイオケアメディカル（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）から市販されている。
【００４６】
本発明のキットは、さらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（例えば、過酸化水素）、タンパク質ブロッキング試薬（例えば、精製カゼイン）、および対比染料（例えば、ヘマトキシリン）を含み得る。青味剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０およびアジ化ナトリウムを用いる水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ、ｐＨ７．４）は、さらに、陽性染色細胞の検出を促進するためのキットで提供され得る。キットは、また、品質管理目的のために陽性および陰性のコントロール試料を含み得る。
【００４７】
別の実施形態では、本発明のキットは、少なくとも２つのモノクローナル抗体を含む。本発明のいくつかの態様では、キットは、ＭＣＭ６およびＭＣＭ７抗体、より詳細には、ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３およびＭＣＭ７抗体２Ｅ６．２を含む。複数の抗体がキット内に存在するとき、各抗体は、個々の試薬として、または、すべての目的の抗体を含む抗体カクテルとして提供され得る。さらに、任意のまたはすべてのキット試薬は、シールされた容器等の外部環境から試薬を保護する容器内に提供され得る。本発明のキットは、高悪性度子宮頚部疾患の診断において有用であり、さらにパップ染色のための試薬（例えば、ＥＡ５０およびオレンジＧ）を含み得る。
【００４８】
本発明の組成物は、２００５年３月２３日に出願した係属中の米国出願第１１／０８７，２２７号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」（その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される方法等、患者における高悪性度子宮頚部疾患の診断のための方法における有用性を見出す。「高悪性度子宮頚部疾患を診断する」は、例えば、子宮頚部疾患を診断するかもしくは子宮頚部疾患の存在を検出し、この疾患の進行をモニターし、そして高悪性度子宮頚部疾患を示す細胞または試料を同定するもしくは検出することを含むことを意図する。用語「高悪性度子宮頚部疾患を診断する、検出する、および同定する」は、本明細書では交換可能に使われる。「高悪性度子宮頚部疾患」によって、コルポスコピーによって前癌病態、悪性病態、中程度から重度の異形成、および子宮頚癌と分類される状態を意図する。根本的な高悪性度子宮頚部疾患は、ＣＩＮＩＩ、ＣＩＮＩＩＩ、ＨＳＩＬ、上皮内癌、腺癌、および癌（ＦＩＧＯ病期Ｉ〜ＩＶ）の組織学的同定を含む。
【００４９】
本発明の方法は、高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現される少なくとも１つの核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。「核バイオマーカー」によって、細胞の核内で主に発現されるタンパク質の任意の遺伝子を意図する。核バイオマーカーは、細胞の他の部分ではより少ない程度で発現され得る。「高悪性度子宮頚部疾患において選択的に過剰発現される」によって、目的の核バイオマーカーは、高悪性度子宮頚部疾患において過剰発現されるが、何ら異形成の存在しない、ＬＳＩＬ、ＣＩＮＩ、ＨＰＶ感染試料として分類される状態、未熟化生細胞、および臨床疾患であると思われない他の状態では過剰発現されないことを意図する。従って、本発明の核バイオマーカーの検出は、良性増殖、初期ＨＰＶ感染、または軽度の異形成を示す試料から、根本的な高悪性度子宮頚部疾患を示す試料を区別することを可能にする。特定の目的の核バイオマーカーとしては、ＭＣＭタンパク質、詳細にはＭＣＭ６およびＭＣＭ７が挙げられる。
【００５０】
本発明の特定の態様では、方法は、患者から子宮頚部の試料を採取すること、その試料を本発明の少なくとも１つのＭＣＭ６またはＭＣＭ７のモノクローナル抗体と接触させること、およびＭＣＭタンパク質への抗体の結合を検出することを含む。別の実施形態では、試料を、少なくとも２つのモノクローナル抗体（ＭＣＭ６に特異的に結合する第１の抗体（特にモノクローナル抗体９Ｄ４．３）、ＭＣＭ７に特異的に結合する第２の抗体（特にモノクローナル抗体２Ｅ６．２））と接触させる。抗体結合を検出するための技法は、当該技術分野では周知である。目的のバイオマーカーへの抗体結合は、抗体結合のレベルに対応し、従ってバイオマーカータンパク質発現のレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する化学試薬の使用によって検出され得る。抗体−抗原結合を検出するための任意の方法が本発明の方法を実行するために使用され得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「子宮頚部試料」は、バイオマーカーの発現を検出できる、子宮頚部からの細胞、組織、または体液のあらゆるサンプリングを指す。そのような身体試料の例としては、婦人科学的液体、バイオプシー、およびスメアが挙げられるが、これらに限定されない。子宮頚部試料は、例えば、領域をかきとるかもしくは綿球で採取すること、または針を使用して体液を吸引することを含む様々な技法によって患者から採取され得る。子宮頚部試料を収集するための方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、子宮頚部試料は、子宮頚部細胞、詳細には、液体ベースの調製物中の子宮頚部細胞を含む。一実施形態では、子宮頚部試料は、例えば、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）調製物（ＣＹＴＹＣ，Ｉｎｃ．）等の液体ベースの細胞診標本調製のガイドラインに従って収集される。子宮頚部試料は、拡大下で検査するためにスライドガラスに移され得る。固定液および染色液は、標本を保存するため、および検査を容易にするために、スライドガラスの上の細胞に適用され得る。一実施形態では、子宮頚部試料は、米国特許第５，３４６，８３１号（本明細書中に参考として援用される）に記述されるように単層試料を提供するために収集および処理される。
【００５２】
当業者は、本発明の方法における任意のまたはすべてのステップが手動または自動化方法で技術者によって実行され得ることを認識する。従って、子宮頚部試料の調製、抗体、および抗体結合の検出のステップは、自動化され得る。本発明の方法は、また、高悪性度子宮頚部疾患のより正確な診断を可能にするために、従来のパップ染色技法と組み合わせることも可能である。
【００５３】
以下の実施例は、制限の目的ではなく例証の目的で提示される。
【実施例】
【００５４】
実験
実施例１：ＭＣＭ７に対するマウスモノクローナル抗体の生成
ＭＣＭ７に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチド）は、ＭＣＭ７タンパク質の組換えヘキサヒスチジンタグ付きＮ末端断片であった。Ｔｎｉ細胞中でバキュロウイルス発現系を用いて、抗原を発現させた。具体的には、ヘキサヒスチジンタグ付きＭＣＭ７ Ｎ末端断片のコード配列（配列番号７）を、Ｔｎｉ細胞での発現のためのｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。バキュロウイルス発現系を用いて組換えタンパク質を生成するための方法は、当該技術分野では周知である。タグ付きＭＣＭ７断片を、Ｎｉ＋２イオン（Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡ）を荷電したキレート化アガロースを用いて精製して、免疫原として使用した。免疫原性ＭＣＭ７ Ｎ末端ポリペプチド断片のアミノ酸配列を配列番号８で提供する。
【００５５】
基本的に、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９６に記述されるように、マウスの免疫およびハイブリドーマ融合を実行した。溶液中の免疫原性タグ付きＭＣＭ７断片によってマウスを免疫した。抗体産生細胞を免疫マウスから単離して、骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成した。これらのハイブリドーマを選択培地で培養した。結果として生じた細胞を段階希釈によってプレーティングし、ＭＣＭ７に特異的に結合する（かつ無関係の抗原には結合しない）抗体の産生に関してアッセイした。目的のモノクローナル抗体がＭＣＭ７タンパク質とだけに反応し、ヘキサヒチジンタグとは反応しなかったことを確認するために、選択したハイブリドーマをＭＣＭ７−ＦＬＡＧタグ付きタンパク質に対してスクリーニングした。次いで、選択したモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を分泌するハイブリドーマを培養した。
【００５６】
組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を使用して「消耗した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存率が０〜１５％に低下するまで増殖した細胞）の培養培地の上清から、抗体を精製した。低ｐＨを使用して抗体を溶出し、その後直ちにｐＨを中和した。２８０ｎＭの著しい吸光度を有する画分をプールした。得られたプールをＰＢＳに対して透析した。精製した抗体をさらに特徴決定を行なった。ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２は、ＩｇＧ１アイソタイプであると決定された。この抗体のエピトープマッピングの詳細については、後述する。
【００５７】
実施例２： ＭＣＭ６に対するマウスモノクローナル抗体の生成
ＭＣＭ６に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチド）は、組換えＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６タンパク質であった。ＨＥＫ２９３細胞中でＣｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製の専用発現ベクターを用いて抗原を発現させたか、またはもう１つの方法としてＴｎｉ細胞中でバキュロウイルス発現系を用いて抗原を発現させた。ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６のコード配列を配列番号９に示す。抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲルマトリックスおよび溶出のためのＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．[ミズーリ州セントルイス]）を使用してＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６を細胞溶解産物から精製した。ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６タンパク質を免疫原として使用した。免疫原性ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に提供する。
【００５８】
基本的に、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６（４）：３８１〜３８９に記述されるようにＲＩＭＭＳ技術によってマウス免疫およびリンパ球融合を実行した。免疫原性ＦＬＡＧタグ付きＭＣＭ６によってマウスを免疫した。組換えＭＣＭ６タンパク質を使用して非クローン化ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングを行った。組換えＭＣＭ６タンパク質の別々のバッチを使用して二次スクリーニングおよびクローン化ハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を分泌するハイブリドーマを培養した。
【００５９】
組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を使用して「消耗した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存率が０〜１５％に低下するまで増殖した細胞）の培養培地の上清から、抗体を精製した。低ｐＨを使用して抗体を溶出し、その後直ちにｐＨを中和した。２８０ｎＭの著しい吸光度を有する画分をプールした。得られたプールをＰＢＳに対して透析した。精製した抗体をさらに特徴決定を行なった。ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３は、ＩｇＧ２ａアイソタイプであると決定された。この抗体のエピトープマッピングの詳細については、後述する。
【００６０】
実施例３：ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の単離
以下の手順を用いてハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を単離する。
【００６１】
培地の調製
・無菌の１，０００ｍｌの保存瓶に、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１００ｍｌを加える。
・ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１０ｍｌを加える。
・ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液１０ｍｌを加える。
・約１０００ｍｌになるに充分な量のＥｘＣｅｌｌ６１０−ＨＳＦ培地を加える。
・瓶に無菌キャップを取り付け、きつく締める。静かに回転させて、混合させる。
・真空ポンプシステムに１０００ｍｌの無菌アセテート真空フィルターユニット（０．２μｍ）を接続する。
・培地溶液の約半分を無菌アセテート真空フィルターユニットに静かに注いで、真空の電源を入れる。
・培地の最初の半分を濾過したら、残りの培地をフィルターユニットに注ぎ、濾過を続ける。
・培地をすべて濾過したら、真空フィルターユニットから真空ホースを取り外し、真空ポンプの電源を切る。フィルター瓶からフィルターユニットの受取部分を取り外す。新しい無菌瓶のキャップを瓶に取り付ける。
・２℃〜１０℃で保存する。遮光する。
【００６２】
最初のハイブリドーマ細胞培養
・事前に３７℃に温めたＨ２Ｏ槽中でハイブリドーマ凍結保存培養物のバイアルを解凍する。
・凍結バイアルの外側に７０％エタノールをスプレーする。
・解凍したバイアルを生物学的安全キャビネットに移す。
・凍結バイアルから細胞を取り出し、細胞を１５ｍｌ遠心管に移す。
・細胞培養培地７ｍｌを、解凍した細胞を含む１５ｍｌ遠心管に滴下して加える。
・解凍した細胞および培養培地を含む１５ｍｌ遠心管を５分間、２００ｇの力で遠心分離する。
・細胞が遠心分離機内にある間に、４５ｍｌの細胞培養培地を無菌Ｔ−２２５フラスコに加える。
・遠心分離した後、遠心管に細胞ペレットが存在するかを目視検査する。
・細胞ペレットを取り出さないよう気をつけながら遠心管から培地を取り除く。注：細胞ペレットが崩れている場合、遠心分離ステップを繰り返す。
・ペレット状の細胞を含む１５ｍｌ遠心管に５ｍｌの細胞培養培地を加える。細胞ペレットをピペッティングして培地中に再懸濁させる。
・再懸濁させた細胞の内容物全部および培養培地を、４５ｍｌの培地を含むＴ−２２５フラスコに移す。
・Ｔ−２２５フラスコにキャップを取り付ける。
・顕微鏡下でインタクトな細胞が存在するかを観察する。Ｔ−２２５フラスコを直ちにＣＯ２インキュベーターに入れ、細胞を一晩インキュベートする。
【００６３】
ハイブリドーマ細胞株の増殖
・細胞培養物の生存率、濃度、および夾雑の存在のモニタリングを継続して行う。
・最初のＴ−２２５フラスコからの細胞懸濁液をモニタリングし、濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、培地が計２００〜２５０ｍｌになるように調整する。
・細胞を除去して、最小限の細胞密度の必要性を満たすために必要に応じて培地をさらに加える。細胞懸濁液を分けて、新たに１つの無菌Ｔ−２２５フラスコに移す。２つのＴ−２２５フラスコをＣＯ２インキュベーター内に置く。
・濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、フラスコの培地が各々計２００〜２５０ｍｌになるまで、２つのＴ−２２５フラスコからの細胞をモニタリングする。
・細胞を除去して、最小限の細胞密度の必要性を満たすために必要に応じて培地をさらに加える。細胞懸濁液を分けて、新たに２つの無菌Ｔ−２２５フラスコに移し、計４つのＴ−２２５フラスコにする。すべてのフラスコをＣＯ２インキュベーターに戻す。
・細胞をモニタリングし、細胞濃度が約６００，０００細胞／ｍｌ〜８００，０００細胞／ｍｌになり、Ｔ−２２５フラスコあたり約２５０ｍｌの合計体積（すなわち、合計約１，０００ｍｌ）になるまで４つのＴ−２２５フラスコ内の体積を調整する。
・細胞が０〜１５％の最終生存率で増殖を消耗するまで、４つのＴ−２２５フラスコの細胞のモニタリングを継続する。ここで、細胞培養上清は、清澄化プロセスを行える状態になる。
【００６４】
上清の清澄化
・卓上の遠心分離機の電源を入れる。５００ｍｌ遠心管アダプターをローターバケットに設置し、蓋を閉めて、温度を４℃±４℃に設定する。
・無菌技法を用いて、今や消耗したＴ−２２５フラスコ４つのすべてからの培地を２本の５００ｍｌ円錐形遠心管に注ぐ。
・２本の５００ｍｌ遠心管のバランスがとれていることを確実にする。それらのバランスをとる必要がある場合、１つの遠心管から他管に上清を移す。
・消耗した上清を１３５０ｇ（±４０ｇ）で１５分間、２℃〜１０℃で遠心分離する。
・遠心分離が完了した後、上清を１０００ｍｌの無菌保存瓶に無菌でデカンテーションしぎ、無菌キャップをしっかり締める。
・無菌で１ｍｌを微量遠心管に移す。試料の入った微量遠心管を２℃〜１０℃で（遮光して）保存する。
・清澄した上清試料は、Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（登録商標）Ａｓｓａｙを用いてＩｇＧ評価を行える状態である。
【００６５】
緩衝液の調製
結合緩衝液：
・約６００ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏをきれいなビーカーに加える。
・７７．２８ｍｌのホウ酸溶液（４％ Ｗ／Ｖ）を加える。室温できれいなスタラーバーで攪拌する。
・塩化ナトリウムを２３３．７６ｇ量り取り、攪拌しながら溶液に加える。
・溶液をＤＩ Ｈ２Ｏで約９５０ｍｌにして、攪拌を続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が澄んできたら、水酸化ナトリウムでｐＨを９．０±０．２に調整する。
・溶液を取り出してきれいな１０００ｍｌメスシリンダーに入れ、１０００ｍｌになるに充分な量のＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・完成した緩衝液を適切な保存瓶に移す。この緩衝液を使用するまで７日間保存しておくことが可能である。
・この全プロセスを繰り返して、さらに０．２リットル〜１．０リットルの結合緩衝液を調製する。
【００６６】
溶出緩衝液
・一塩基性リン酸ナトリウムを１．７２５ｇ量り取り、きれいなスタラーバー付きのきれいな２５０ｍｌビーカーに入れる。
・クエン酸ナトリウムを３．６７６ｇ量り取り、同じきれいな２５０ｍｌビーカーに入れる。
・約１７５ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを加えて、溶解するまで室温で攪拌する。
・塩化ナトリウムを４．３８ｇ量り取り、攪拌を続けながら溶液に加える。
・ＤＩ Ｈ２Ｏで約２２５ｍｌの溶液にして、攪拌を続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が澄んできたら、塩酸でｐＨを３．５±０．２に調整する。
・溶液を取り出してきれいな２５０ｍｌメスシリンダーに入れ、２５０ｍｌになるに充分な量のＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・真空ポンプシステムに５００ｍｌの無菌アセテート真空フィルターユニット（０．２μｍ）を接続して、溶液を濾過滅菌する。
・フィルターを取り外して、容器を無菌キャップで閉じる。
【００６７】
抗体吸着
・清澄にした上清（約１Ｌ）を、きれいなスタラーバー付きのきれいな４０００ｍｌプラスチック製ビーカーに注ぐ。
・ほぼ同量（約１Ｌ）の結合緩衝液を、清澄にした上清を含んでいるきれいな４０００ｍｌプラスチック製ビーカーに加える。きれいなスタラーバーを加える。
・ビーカーをきれいなプラスチック製ラップで覆い、「抗体結合」のラベルを付ける。
・必要となるＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）プロテインＡの概算量を表１のデータを用いて算出する。
【００６８】
【表１】
・きれいなディスポーザブルカラムと止め栓アセンブリーをリングスタンドとクランプに取り付ける。止め栓を閉じる。
・瓶を数回反転させることにより適当量のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを混合させる。必要体積を取り出して、ディスポーザブルカラムに入れる。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを１０ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏで洗浄する。止め栓を開いて、ＤＩ Ｈ２Ｏを排出させる。止め栓を閉じる。さらに１０ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを用いて繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄する。止め栓を開いて、結合緩衝液を排出させる。止め栓を閉じる。さらに１０ｍｌの結合緩衝液で繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを約１０ｍｌの清澄にした上清および結合緩衝液の溶液（４０００ｍｌビーカーから）中で再懸濁させ、清澄にした上清および結合緩衝液の溶液を含んでいる４０００ｍｌビーカーにビーズを移す。残っているビーズをすべて移すために、必要に応じて繰り返す。完了したら、カラムおよび止め栓を廃棄する。
・２℃〜１０℃で約１８時間、混合物を勢いよく混合させる。
・混合が完了したら、攪拌プレートの電源を切って、緩衝化された上清およびビーズ懸濁液を有する「抗体結合」ビーカーを取り出して、実験台エリアに戻す。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズをビーカーの底に沈澱させる（約５分間）。
・きれいなディスポーザブルカラムおよび止め栓アセンブリーをリングスタンドおよびクランプに取り付ける。止め栓を閉じる。
・きれいな２５０ｍｌ瓶または適切な容器に「結合後のカラム洗浄」とラベルを付ける。
・きれいなプラスチック製ビーカーに「結合後の上清」とラベルを付ける。
・ビーズを４０００ｍｌビーカーの底に残しながら、４０００ｍｌビーカーから上清をラベルが付いたきれいな２リットルのプラスチック製ビーカーにデカンティングする。「結合後の上清」溶液を含んでいる２０００ｍｌビーカーをきれいなラップで覆い、２℃〜１０℃で保存する。
・デカンティングした４０００ｍｌ「抗体結合」ビーカーに、約１５ｍｌの結合緩衝液を加える。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを再懸濁させ、これらをカラムに移す。止め栓を開いて、結合緩衝液を「結合後のカラム洗浄」容器に排出させる。排出が完了したら、止め栓を閉める。
・前述のステップのように、さらに結合緩衝液を加えて、混合させ、カラムに移すことで、「抗体結合」ビーカー中の残っているＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズをすべて移す。排出が完了したら、止め栓を閉める。
・カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄するために必要な結合緩衝液の概算量を表２のデータを用いて算出する。
【００６９】
【表２】
・カラム内のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを、適切な体積の結合緩衝液で、適切な回数洗浄し、「結合後のカラム洗浄液」の容器に溶出液（ｅｆｌｕｅｎｔ）を続けて収集する。
・完了したら、止め栓を閉じる。「結合後のカラム洗浄液」容器を２℃〜１０℃で保存する。
・カラム内のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させるために必要な溶出緩衝液および中和緩衝液の合計体積を表３から決定する。
【００７０】
【表３】
・９本の無菌の円錐形遠心管に「溶出抗体」、画分番号（１〜９）のラベルを付ける。
・画分ごとに必要な適切な体積（上記の表Ｃから決定されるとおり）の中和緩衝液を９本各々の「溶出抗体」画分管に入れ、カラムの止め栓の放出口下にしっかりと設置する。
・画分ごとに必要とされる適切な体積（上記の表３から決定されるとおり）の溶出緩衝液を用いて画分ごとにカラム画分内にＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させ、その間に中和緩衝液を含む「溶出抗体」の各管に溶出液を収集する。
・溶出が完了したら、「溶出抗体」の各画分の管を何回か静かに回旋させて混合させる。画分番号３から約５０μｌを取り出して、ｐＨ試験紙片の上に置いて、溶出液がおよそ６．５〜８．５の間のｐＨに中和されていることを確認する。必要に応じて、ｐＨを範囲内にするために必要なさらなる中和緩衝液または溶出緩衝液を加える。
・ｐＨ評価が完了したら、各画分からの試料の吸光度スキャンを２８０ｎｍ〜４００ｎｍで行って、透析プロセスに進む前に溶出液中のＩｇＧの概算濃度を決定する。
【００７１】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００以上である場合、溶出液プールの一部として画分を受け入れる。
【００７２】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００未満である場合、溶出液プールの一部として画分を拒絶する。
・無菌の円錐形遠心管に「溶出抗体」、「溶出液プール」のラベルを付け、プールの一部として受け入れられたすべての画分を合わせる。
・溶出液プールからの試料の吸光度スキャンを行って、透析プロセスに進む前に溶出液中のＩｇＧの概算濃度を決定する。
・溶出液プールの体積を推定して、ＩｇＧの概算合計ｍｇを算出する。
・溶出液プールの体積： （ｍｌ）× ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ）＝ 合計ＩｇＧ（ｍｇ）
抗体透析
・「溶出抗体」管を２℃〜１０℃で取り出す。
・溶出液の概算体積と表４のデータを使用して、抗体溶出液を透析するために必要な透析チューブの概算の長さを算出する。
【００７３】
【表４】
・必要な適切な長さの透析チューブをカットする（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）２ 再生セルロース膜、１２，０００〜１４，０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、直径１６ｍｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１３２６７８）。
・１０００ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏ中で透析膜チューブを３０分以内で水和させる。
・抗体溶出液を透析するために必要な透析緩衝液の概算体積を表５のデータを使用して算出する。
【００７４】
【表５】
・適切量の透析緩衝液を適切な大きさのプラスチック製ビーカーに入れる。ビーカーに「透析抗体」のラベルを付ける。きれいなスタラーバーを加えて、冷蔵庫内または２〜１０℃の冷温室内の攪拌プレートの上にビーカーを置く。
・透析チューブをＤＩ Ｈ２Ｏで完全に洗い流す。透析チューブの一端から約７ｃｍのところで結び目を２つ作り、しっかりと結ぶ。
・透析チューブに約５ｍｌのＤＩ Ｈ２Ｏを加える。
・透析チューブに「溶出抗体」収集チューブからの溶出抗体を満たす。
・透析チューブの他端（開放端）を端から約７ｃｍのところで結び目を２つ作り、しっかりと結ぶ。ヘッドスペースが表４から算出されたものとほぼ同じであることを確実にする。
・充填して閉じた透析チューブを、適切な体積（表５から）の１×ＰＢＳを含む透析リザーバー内に設置する。
・ビーカーをきれいなプラスチック製ラップで覆う。透析試料が自由に回転するが透析物の渦に引き込まれないように、攪拌プレート上の速度を調節する。透析は、２℃〜１０℃で、２４時間内に、緩衝液を計３回交換して行うべきである。
【００７５】
抗体濾過
・無菌収集チューブに「透析した抗体」のラベルを付ける。
・透析ビーカーから透析した試料チューブを取り外す。透析チューブの一端を切って開放端にして、透析した試料を「透析した抗体」の遠心管に移す。
・別の無菌収集チューブに「透析した抗体」のラベルを付ける。
・最終の透析した体積を保持する適切な容量の無菌ルアーロック（Ｌｕｅｒ Ｌｏｋ）シリンジを選択する。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルターをシリンジの開口部に取り付ける（０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）膜、低タンパク質結合、Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号４１９２）。シリンジからプランジャーを取り外し、シリンジを真っすぐ立てながら、「透析した抗体」の管から透析したモノクローナル抗体をシリンジに移す。プランジャーを交換する。
・開けた、無菌で「精製抗体」のラベルが付いた収集チューブの口部の上にＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルターを保持し、シリンジのプランジャーを押し下げて精製抗体を濾過して「精製抗体」の管に入れる。
・濾過が完了したら、「精製抗体」の管にキャップを取り付け、２℃〜１０℃で保存する。
・Ａ２８０手順を用いて精製したモノクローナル抗体の濃度を決定する。
【００７６】
実施例４：エピトープマッピングのための一般法
一般的アプローチ
エピトープマッピングを行って、特定のモノクローナル抗体によって認識される抗原性タンパク質内の直鎖状アミノ酸配列（すなわちエピトープ）を同定する。エピトープマッピングのための一般的アプローチは、一般に異種発現系における全長タンパク質ならびにタンパク質の様々な断片（すなわち切断型）の発現を必要とする。次いで、これらの種々の組換えタンパク質を使用して、特異的モノクローナル抗体が標的タンパク質の１つ以上の切断型に結合できるかどうかを決定する。反復切断の使用および重なるアミノ酸領域を有する組換えタンパク質の産生を介して、研究中のモノクローナル抗体によって認識される領域を同定することが可能である。ウェスタンブロット解析またはＥＬＩＳＡを使用して、研究中の特異的モノクローナル抗体が１つ以上の組換えタンパク質断片に結合できるかどうかを決定する。このアプローチは、エピトープを含むペプチド領域を最終的に同定することができ、場合によっては、エピトープを８〜１５アミノ酸配列まで正確に精密化することができる。エピトープは、８〜１５アミノ酸の連続する直鎖状配列であり得、またはペプチド鎖の異なる部分から構成されるタンパク質上の部位に結合する抗体とは不連続であり得る。不連続のエピトープは、通常、マッピングが不可能である。
【００７７】
構築物の設計および作製
エピトープマッピングの第１のステップは、入れ子遺伝子の切断の設計である。しばしば、遺伝子は、さらなる解析のために４つの同等の部分に分けられる。
【００７８】
遺伝子クローニング戦略
一般のクローニング戦略は、クローン化遺伝子断片のＰＣＲに基づく生成から開始される。クローン化断片を効率的に発現させるために、特に、小さいアミノ酸領域を使用するときは、クローン化断片は、融合タンパク質（すなわち、その系で安定して発現される別の担体タンパク質に融合される）として発現される。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、担体タンパク質として頻繁に使用される。ＧＦＰは、それに続くインビトロタンパク質発現ステップの間に切断断片を安定化させ、発現を向上させるために、融合パートナーとして含まれる。ＧＦＰは、また、抗ＧＦＰ抗体を使用する融合タンパク質発現の追跡を可能にする。
【００７９】
ＧＦＰタンパク質構築物を作製するためのクローニングは、メガプライミングアプローチまたはｐＳｃｒｅｅｎ−ＧＦＰベクターへのプラスミドクローニングの使用によるいずれかを用いて実行される。通常、切断断片は、メガプライミングと呼ばれる技法を用いて、ＧＦＰおよびタンパク質発現に必要な制御配列に融合される。
【００８０】
メガプライミングは、２つ以上のＤＮＡ断片を、それぞれの断片の端で相同領域をアニールし、アニールされた一本鎖ＤＮＡを、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させることによって連結することである。このプロセスは、２つ以上の小さい断片をそれらが共有する配列によって結合し、１つの大きなＤＮＡ断片を作製する。この大きな断片は、次いで、標準ＰＣＲを用いて増幅される。
【００８１】
メガプライミングが成功裏に使用できない場合、切断断片は、ＧＦＰおよびタンパク質発現制御配列を含むプラスミドにクローニングされ得る。このクローニングは、エピトープマッピングに必要なＧＦＰ／断片融合物を作製する。プロトコールの残りの部分は、次いで、以下に記述するように行うことが可能である。
【００８２】
タンパク質の発現
例えば、メガプライミングによって作製された発現構築物は、次いで、迅速翻訳系（ＲＴＳ）に導入される。ＲＴＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解産物由来の無細胞タンパク質発現系である。この系は、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質の迅速な（３〜４時間）発現を可能にする。
【００８３】
ＲＴＳが適切なレベルのタンパク質発現を生成しない場合は、切断断片は、ＧＦＰタンパク質発現プラスミドにクローニングされる。これらの融合プラスミドは、次いで、タンパク質発現のために最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系に形質転換される。タンパク質発現は、細菌の増殖培養物中で誘導され、増殖の後細胞は溶解される。複雑な細胞溶解産物中のタンパク質は、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、およびプロトコールの残りの部分は、以下と同様である。
【００８４】
タンパク質検出およびエピトープマッピング
ＲＴＳによって生成されたタンパク質断片は、ＰＡＧＥを用いて分離され、次いでニトロセルロース膜上に移される。膜結合タンパク質は、次いで、溶けた研究中の抗体に曝露される。抗体／タンパク質の結合は、当該技術分野で公知の比色技法を用いて同定される。
【００８５】
全長タンパク質および切断タンパク質断片の一部のサブセットの抗体結合は、陽性の結果を構成する。タンパク質の特定の部分が欠如して抗体結合を除去する場合、エピトープは、この断片の上に位置する。
【００８６】
マッピングされる抗体がニトロセルロース膜に結合されたタンパク質を認識しない場合は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降等の抗体／タンパク質相互作用を検出するための代替法が用いられる。抗体／タンパク質相互作用を検出するための方法は、当該技術分野で周知である。
【００８７】
エピトープ位置の精密化
上述のプロトコールは、エピトープの位置をタンパク質の約４分の１まで絞り込むだけなので、エピトープの位置をさらに解明するために、エピトープを含むことが決定されたタンパク質の４分の１で、プロセスを繰り返す必要がある。非常に大きなタンパク質に関しては、エピトープを８〜１５アミノ酸まで絞り込むために、このプロセスを２回または３回繰り返すことが必要になり得る。
【００８８】
実施例５：ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のためのエピトープの特徴付け
ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のエピトープマッピングを、基本的に上記の実施例４に記述したように実行した。具体的には、ＰＣＲを用いて、全長ＭＣＭ６タンパク質の４つのＭＣＭ６遺伝子切断物を作製し、続いてＲＴＳによってＧＦＰ融合タンパク質として組換えＭＣＭ６タンパク質断片を生成し、最終的に、ウェスタンブロット法によって特定のＭＣＭ６断片に結合する抗体を検出した。ＲＴＳでの頑強で安定な発現を確実にするために、第２ラウンドのＰＣＲにおいてＧＦＰをＭＣＭ６遺伝子切断物と連結させた。
【００８９】
９Ｄ４．３抗体に結合する断片を同定するために、ＭＣＭ６タンパク質断片をウェスタンブロット法によって解析した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。断片４と命名されたＭＣＭ６切断生成物を用いて陽性バンドが検出された。断片４を５つのより小さい断片に分割し、上記のプロセスを繰り返してエピトープを絞り込んだ。
【００９０】
ＭＣＭ６タンパク質断片の第２のセットも、ウェスタンブロット法によって解析し、９Ｄ４．３抗体に結合する断片を同定した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。モノクローナル抗体９Ｄ４．３は、４−４と命名したＭＣＭ６の領域に結合することが示された。この断片を再び６つのより小さい断片に分割し、上記のプロセスを繰り返してエピトープを絞り込んだ。
【００９１】
ＭＣＭ６タンパク質断片を再び前述のとおりのウェスタンブロット法によって解析した。９Ｄ４．３モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを直接プローブした。４−４−１と命名したＭＣＭ６断片を用いて陽性バンドが検出された。さらに断片を生成して、エピトープ領域を絞り込んだ。ウェスタンブロット解析は、ＭＣＭ６抗体９Ｄ４．３のエピトープがアミノ酸配列ＩＤＳＥＥＥＬＩＮＫＫＲＩ（配列番号５）を含むことを示した。
【００９２】
結果
最初の結果は、ＭＣＭ６モノクローナル抗体９Ｄ４．３のエピトープがＭＣＭ６タンパク質のＣ末端領域内に位置することを示した。ＭＣＭ６タンパク質の連続する切断は、９Ｄ４．３によって認識されるエピトープが１３アミノ酸の領域内に位置し、特に、配列番号３（ＩＤＳＥＥＥＬＩＮＫＫＲＩ（配列番号５））のアミノ酸残基７６０〜７７２に対応することを示した。追加のラウンドのＲＴＳによって、エピトープの位置をさらに精密化することが可能になり得る。
【００９３】
実施例６：ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープの特徴付け
ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープマッピングを基本的に実施例５に上述したように行った。全長ＭＣＭ７遺伝子配列（配列番号１）を、遺伝子断片を設計するための出発配列として用いた。
【００９４】
結果
ＭＣＭ７モノクローナル抗体２Ｅ６．２のエピトープを、配列番号１（ＰＡＥＬＭＲＲＦＥＬＹＦ（配列番号６））のアミノ酸残基１２７〜１３８を含むタンパク質領域内に位置すると決定した。追加のラウンドのＲＴＳによって、エピトープの位置をさらに精密化することが可能になり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＭ７またはその変異体もしくは断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、
（ａ）特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体に結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）競合結合アッセイにおいて、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であるモノクローナル抗体であって、該断片がＭＣＭ７、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合できる能力を保持するモノクローナル抗体、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
【請求項４】
ＭＣＭ６またはその変異体もしくは断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、
（ａ）特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体に結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）競合結合アッセイにおいて、ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であるモノクローナル抗体であって、該断片がＭＣＭ６、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合できる能力を保持する、モノクローナル抗体、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項５】
特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３。
【請求項６】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
【請求項７】
請求項１に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頚部疾患を診断するためのキット。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項４に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頚部疾患を診断するためのキット。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも２つのモノクローナル抗体を含むキットであって、第１の抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるＭＣＭ７モノクローナル抗体であり、第２の抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるＭＣＭ６モノクローナル抗体である、キット。
【請求項１２】
各抗体が、別々の抗体試薬としてまたは抗体カクテルとして提供される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記キットが、さらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬、タンパク質ブロッキング試薬、バイオマーカータンパク質に結合する抗体を検出するための化学物質、対比染料、青味剤、および使用説明書を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１４】
パップ染色用の試薬をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１５】
患者において高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法であって、
（ａ）患者から子宮頚部試料を採取することと、
（ｂ）該試料を、ＭＣＭ７に特異的に結合する請求項１に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることと、
（ｃ）ＭＣＭ７への該抗体の結合を検出することと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者において高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法であって、
（ａ）患者から子宮頚部試料を採取することと、
（ｂ）該試料をＭＣＭ６に特異的に結合する請求項４に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることと、
（ｃ）ＭＣＭ６への該抗体の結合を検出することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を、ＭＣＭ７に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、個別の抗体試薬としてまたは抗体カクテルとして前記子宮頚部試料と順次接触する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリプチドであって、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ抗原活性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
ＭＣＭ６モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリプチドであって、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ抗原活性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
ＭＣＭ７抗体を生成するための方法であって、請求項２２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することを含む、方法。
【請求項２５】
ＭＣＭ７モノクローナル抗体を生成するための方法であって、
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項２２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することと、
（ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離することと、
（ｃ）該抗体産生細胞を培養中の不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離することと
を含む、方法。
【請求項２６】
ＭＣＭ６抗体を生成するための方法であって、請求項２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することを含む、方法。
【請求項２７】
ＭＣＭ６モノクローナル抗体を生成するための方法であって、
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項２３に記載のポリペプチドによって動物を免疫することと、
（ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離することと、
（ｃ）該抗体産生細胞を培養中の不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離することと
を含む、方法。
【請求項１】
ＭＣＭ７またはその変異体もしくは断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、
（ａ）特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体に結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）競合結合アッセイにおいて、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であるモノクローナル抗体であって、該断片がＭＣＭ７、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合できる能力を保持するモノクローナル抗体、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
【請求項４】
ＭＣＭ６またはその変異体もしくは断片に特異的に結合することができるモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、
（ａ）特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体に結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）競合結合アッセイにおいて、ハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であるモノクローナル抗体であって、該断片がＭＣＭ６、またはその変異体もしくは断片に特異的に結合できる能力を保持する、モノクローナル抗体、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項５】
特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３。
【請求項６】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株。
【請求項７】
請求項１に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頚部疾患を診断するためのキット。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項４に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頚部疾患を診断するためのキット。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも２つのモノクローナル抗体を含むキットであって、第１の抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるＭＣＭ７モノクローナル抗体であり、第２の抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるＭＣＭ６モノクローナル抗体である、キット。
【請求項１２】
各抗体が、別々の抗体試薬としてまたは抗体カクテルとして提供される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記キットが、さらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬、タンパク質ブロッキング試薬、バイオマーカータンパク質に結合する抗体を検出するための化学物質、対比染料、青味剤、および使用説明書を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１４】
パップ染色用の試薬をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１５】
患者において高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法であって、
（ａ）患者から子宮頚部試料を採取することと、
（ｂ）該試料を、ＭＣＭ７に特異的に結合する請求項１に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることと、
（ｃ）ＭＣＭ７への該抗体の結合を検出することと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者において高悪性度子宮頚部疾患を診断するための方法であって、
（ａ）患者から子宮頚部試料を採取することと、
（ｂ）該試料をＭＣＭ６に特異的に結合する請求項４に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることと、
（ｃ）ＭＣＭ６への該抗体の結合を検出することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６９１１としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株９Ｄ４．３によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を、ＭＣＭ７に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−６６６９としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株２Ｅ６．２によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、個別の抗体試薬としてまたは抗体カクテルとして前記子宮頚部試料と順次接触する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＣＭ７モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリプチドであって、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ抗原活性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
ＭＣＭ６モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリプチドであって、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ抗原活性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
ＭＣＭ７抗体を生成するための方法であって、請求項２２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することを含む、方法。
【請求項２５】
ＭＣＭ７モノクローナル抗体を生成するための方法であって、
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項２２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することと、
（ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離することと、
（ｃ）該抗体産生細胞を培養中の不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離することと
を含む、方法。
【請求項２６】
ＭＣＭ６抗体を生成するための方法であって、請求項２に記載のポリペプチドによって動物を免疫することを含む、方法。
【請求項２７】
ＭＣＭ６モノクローナル抗体を生成するための方法であって、
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項２３に記載のポリペプチドによって動物を免疫することと、
（ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離することと、
（ｃ）該抗体産生細胞を培養中の不死化細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｄ）該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離することと
を含む、方法。
【公表番号】特表２００９−５２００２４（Ｐ２００９−５２００２４Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７２１１（Ｐ２００８−５４７２１１）
【出願日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７３４１１
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０７００６０９７）トリパス イメージング， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３１１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７３４１１
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０７００６０９７）トリパス イメージング， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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