ＭＮ／ＣＡＩＸ／ＣＡ９及び腎臓癌の予後診断
本明細書に開示されているのは、脊椎動物を冒す腎細胞癌腫特に腎臓明細胞癌腫に関する予後診断方法である。例示的な予後診断方法は、罹患した患者由来の試料中でＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の存在を検出する工程及びそのレベル及び／又は程度を定量する工程を含み、ここで５０％以下の細胞がＭＮ／ＣＡ９遺伝子を発現することが判明した場合には該患者はより不良な予後を有するものとみなされる。該予後診断方法において有用であるＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物としては、ＭＮタンパク質、ＭＮポリペプチド及び／又はＭＮ核酸が含まれる。本方法は、単独で又は従来の腫瘍病期及び／又は等級の情報と組合せた形で腎細胞癌腫患者のための治療の選択を補助するものとして有用である。本発明の方法は例えば、より積極的な療法レジメンを必要とする患者又は特にＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９標的療法といったアシュバント免疫療法に応答する確率が最も高い患者を同定するために使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床遺伝子工学の全般的分野及び生化学工学、免疫化学及び腫瘍学の分野に関する。より詳細には、これはＭＮ遺伝子つまり、代替的にＭＮタンパク質、ＭＮ／ＣＡ ＩＸイソ酵素、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡ ＩＸ、ＭＮ／Ｇ２５０又はＧ２５０タンパク質として現在知られているオンコプロテインをコードする、代替的にＭＮ／ＣＡ９、ＣＡ９又は炭酸脱水酵素９として知られている１つの腫瘍遺伝子とみなされる細胞遺伝子に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、腎臓癌、特に腎臓明細胞癌腫についての予後診断検定のため及び癌治療に関する臨床的決定を行なうための根拠を提供する、腎臓癌患者の試料中のＭＮ抗原又はＭＮ遺伝子発現の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
上述のように、ＭＮ遺伝子及びタンパク質は、本明細書でその名前を互換的に使用している一定数の代替的名称で知られている。ＭＮタンパク質は亜鉛を結合し炭酸脱水酵素（ＣＡ）活性を有することがわかっており、現在９番目の炭酸脱水酵素イソ酵素−ＭＮ／ＣＡ ＩＸ又はＣＡ ＩＸ［２２］とみなされている。炭酸脱水酵素の命名法に従うと、ヒトＣＡイソ酵素は、大文字のローマ字及びローマ数字で書かれ、一方その遺伝子はイタリック体とアラビア数字で書かれている。代替的には、「ＭＮ」は本明細書で、前後関係によって指示されるように炭酸脱水酵素イソ酵素ＩＸ（ＣＡ ＩＸ）タンパク質／ポリペプチド、又は炭酸脱水酵素イソ酵素９（ＣＡ９）遺伝子、核酸、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのいずれかを意味するために使用される。
【０００４】
ＭＮタンパク質はＧ２５０抗原を用いても同定されてきた。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら［２３］は「配列分析とデータベース検索により、Ｇ２５０抗原が子宮頸癌腫中で同定されたヒト腫瘍関連抗原であるＭＮと同一であることが判明した（パストレック（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）ら、１９９４年）」と記述している。
【０００５】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献１（１９９３年９月１６日公開）及び特許文献２（１９９５年２月７日発行）は、ＭＮ遺伝子及びタンパク質の発見について記述している。ＭＮ遺伝子は、テスト対象となった全ての脊椎動物の染色体ＤＮＡ中に存在することが発見されており、その発現は発癌性と強い相関関係をもつことがわかっている。一般に、腫瘍形成は、ＣＡ ＩＸタンパク質の発現異常という形で明らかになる。例えば、腫瘍形成は、（１）通常は何らかの有意な度合いでＣＡ ＩＸタンパク質を発現することのない組織内にＣＡ ＩＸタンパク質が存在する場合；（２）ＣＡ ＩＸタンパク質が、通常はそれを発現する組織に不在である場合；（３）ＣＡ９遺伝子発現が１つの組織内で通常発現されるレベルよりも有意な形で増大したレベルにあるか又は有意な形で減少したレベルにある場合；又は（４）ＣＡ ＩＸタンパク質が１つの細胞内部の異常な場所で発現される場合、に知らされる可能性がある。特許文献１はさらに、その他のＭＮ関連の発明の中でも、Ｍ７５ＭＡｂ及びＭ７５ＭＡｂを分泌するＶＵ−Ｍ７５ハイブリドーマを含めたＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を開示している。Ｍ７５ＭＡｂは特異的にＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質のプロテオブリカン（ＰＧ）ドメイン上の免疫優性エピトープに結合する。
【０００６】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献３（１９９５年１２月２１日公開）は、図１の中で、本明細書に記述されている通りに単離された全長ＭＮｃＤＮＡのヌクレオチド配列［配列番号１］及びそのＭＮｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列［配列番号２］を提供している。特許文献３は同様に、ＭＮプロモータのためのヌクレオチド配列を図６で提供している。これらのＭＮｃＤＮＡ、プロモータ、及びアミノ酸配列は本明細書に参照により援用されている。
【０００７】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献４（２００３年１２月４日公開）は、その他のＭＮ関連発明の中でも、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメイン上のものを含めた、非免疫優性エピトープに向けられているＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的ＭＡｂｓを開示している。かかるＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的ＭＡｂの一例が、Ｖ／１０−ＵＶ−ハイブリドーマから分泌されたＶ／１０ＭＡｂである。
【０００８】
ＭＮタンパク質は現在、最初に記述された腫瘍関連炭酸脱水酵素イソ酵素であると考えられている。炭酸脱水酵素ファミリー（ＣＡ）には、可逆的水和−脱水つまりＣＯ２＋Ｈ２Ｏ⇔ＨＣＯ３−＋Ｈ＋に関与する１１の触媒的に活性な亜鉛金属酵素が含まれる。ＣＡは異なる生体の中で広く分布している。ＣＡはさまざまな生理学的及び生物学的プロセスに参与し、著しく多様な組織分布、細胞内局在化及び生物学的機能を示す［２４、２５、２６］。炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡ ＩＸは、最近同定されたイソ酵素のうちの１つである［２２、２７］。形質転換された細胞系列及び複数のヒト悪性腫瘍中のＣＡ ＩＸ過剰発現のため、それは腫瘍関連抗原として認識されヒトの癌の発生に結びつけられてきた［８、１６、２８］
ＣＡ ＩＸは、ユニークなＮ末端プロテオグリカン様延長を伴うグリコシル化膜貫通型ＣＡアイソフォームである［２２］。トランスフェクション研究を通して、ＣＡ ＩＸが３Ｔ３細胞の形質転換を誘発できる、ということが実証されてきた［２２］。最近の研究は、ＣＡ ＩＸが細胞付着に参加するばかりでなく、ＭＮプロモータの低酸素症応答性要素に対するＨＩＦ−１タンパク質結合を介して低酸素症においても誘導され得るということを明らかにした［２９、３０］。ＭＮ遺伝子の転写は、腎細胞癌腫細胞内で野生型フォン・ヒッペル・リンドラ腫瘍抑制遺伝子による負の調節を受ける［３１］。フォン・ヒッペル・リンドラ腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物は、酸素依存型タンパク質分解のためのＨＩＦ−１αのターゲティングを担当するユビキチンリガーゼ複合体と相互作用する［３２、３３］。かくして、酸素の低いレベルはＨＩＦ−１αの安定化を導き、そのことが今度はＭＮの発現増加を導く［３０］。癌におけるＭＮの高発現領域は、多くの癌において報告されているような腫瘍低酸素症と結びつけられ、低酸素条件下での腫瘍細胞のインキュベーションは、ＭＮ発現の誘発を導く［３０、３４〜３８］。
【０００９】
ＭＮ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｍ７５を用いた数多くの研究が、前癌状態及び癌性頸部病巣を診断／予後診断する上でのＭＮの診断／予後診断的有用性を確認してきた［１６、３９、４０］。子宮頸癌腫のＭ７５ＭＡｂを用いた免疫組織化学研究及び腎細胞癌腫のＰＣＲベース（ＲＴ−ＰＣＲ）の調査がこれらの癌と密接な関連性をもつものとしてＭＮ発現を同定し、腫瘍バイオマーカーとしてのＭＮの有用性を確認した［１６、３９、４１］。さまざまな癌（なかでも特に子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌及び前立腺癌）において、ＣＡ ＩＸ発現は増大し、一部の腫瘍において微細血管密度及び低酸素症と相関されてきた［３４、３５］。
【００１０】
通常ＭＮタンパク質を発現しない組織において、ＣＡ ＩＸの陽性率は、その他の前癌／癌の中でも肺、乳房及び子宮頸部の前癌／癌［３６−３８］といった新生物発生前／新生物疾患についての診断とみなされている。きわめてわずかな正常組織しかＭＮタンパク質を何らかの有意な度合いで発現しないということが発見されてきた。これらのＭＮ発現する正常細胞としては、ヒト胃粘膜及び胆嚢上皮及び消化管のその他の一部の正常細胞が含まれる［４２−４４］。
【００１１】
成人の悪性腫瘍全体の３％を占める腎細胞癌腫（ＲＣＣ）は、泌尿器癌の中でも最も致死率の高いものである［１］。ＲＣＣは、ＵＳにおいて、癌死亡原因の第９位にあり、２００４年には３５０００件の新たな症例と１２０００人超の死亡者が予想されている［２］。ＲＣＣの発生率は、さまざまな腹部及び胃腸疾患の評価のための超音波検査及びコンピュータ断層撮影がより広く用いられたことに大きく起因して、１９７０年代から増大した［３］。ＲＣＣについては、利用可能な最良の予後診断インジケータは病期であるが、現行の予後診断因子つまりフールマン等級及び性能状態ならびに病期は、患者の転帰及び癌攻撃性を予測するには不充分である［４−６］。かくしてさらなる予後診断情報を提供するバイオマーカーの同定が、最適な治療及び転帰を画定するためにきわめて重要であると思われる。
【００１２】
上述の通り、炭酸脱水酵素ファミリーの一成員であるＭＮが一部の腫瘍タイプにおいて構成的に誘導されるものの、大部分の正常な組織内には存在しない、ということが以前の研究によって示されてきた［７−１０］。さらに、悪性及び良性の腎臓組織についての以前の免疫生化学研究は、ＭＮが同様にＲＣＣ内において高レベルで発現されることを明らかにしており、ＭＮ発現が有用な診断的バイオマーカーであることを示唆している［１１、１２、１５−１７］。ブイ（Ｂｕｉ）ら［１７］は、ＲＣＣ内でＣＡ ＩＸと共に使用された場合にもう１つのバイオマーカーＫｉ６７が生存率を高レベルで予測すると記述している。さらにザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら［１８］は、ＲＣＣ患者の体液（尿及びＣＡ ＩＸ血清）中に可溶形態のＣＡ ＩＸを発見した。［同様にザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献４（２００３年１２月４日公開）も参照のこと］。
【００１３】
本明細書で開示されているのは、ＭＮ発現がＲＣＣ特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）のための予後診断マーカーとして有用であることが示されている方法である。ＣＣＣは、ＲＣＣを約８５％まで含んでいる。本明細書で開示されている実際はＲＣＣ特にＣＣＣ内の分子マーカーとしてのＭＮの見込みのある有意性を裏づけるものである。ＲＣＣ特にＣＣＣにおける低いＭＮ発現は、予後不良因子であることが発見され、逆に高いＭＮ発現は予後良好因子であることが発見された。ＭＮ発現は本明細書中で、Ｔ病期及びフールマン等級と比べた場合の最高のＲＲＧ因子であることが開示されている。ＭＮ発現の低下は本明細書において生存率不良と独立して関連づけされるものとして開示されている。
【００１４】
本発明の予後診断方法は、ＲＣＣ／ＣＣＣについてのより良好な予後とより不良な予後の間のカットオフとして５０％のＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９発現を用いている。リアオ（Ｌｉａｏ）ら［１２］（２８２８頁目）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫染色パターンを「５０％超の細胞が染色された場合広範性とし５０％以下の細胞が染色された場合には限局性である」として記述した。本発明の方法はカットオフ値として５０％を使用しているが、ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］（４頁目）は、組織アレイからのＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫染色評点情報の生存木解析により、「８５％という染色割合（％）が患者の生存の層化のための理想的カットオフであった」ということを発見した［同様にブイ（Ｂｕｉ）ら、特許文献５（２００３年１０月３０日公開）も参照のこと］。
【００１５】
本発明の予後診断方法は、臨床的転帰及び腫瘍の挙動を予測するために使用できる。本明細書で開示されている予後診断方法は、ＭＮ発現のレベル、程度及び／又は強度を検出しかつ／又は定量し、その他の適切な療法の中でもアシュバント免疫療法及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９標的療法の恩恵を受けることのできるハイリスクＲＣＣ／ＣＣＣ患者を同定することができる。
【００１６】
ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］からの予備データはＭＮ／ＣＡ ＩＸと免疫療法応答の関係を表わしている。同様にして、ＭＮ／ＣＡ ＩＸに対するモノクローナル抗体に基づく療法又はＭＮ／ＣＡ ＩＸベースのＲＣＣワクチンを用いた免疫療法［１５、１９−２１］ならびに［例えばザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献６（２０００年５月４日公開）で開示されているような］プロモータ活性をもつＭＮプロモータフラグメント又はＭＮ遺伝子プロモータ、好ましくは低酸素症応答性要素（ＨＲＥ）を含むＭＮプロモータフラグメント、好ましくはＭＮＨＲＥに対し操作可能に連結された細胞傷害性タンパク質／ポリペプチド及び／又はサイトカインをコードするベクターも同様に、ＲＣＣ／ＣＣＣ患者試料内のＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９発現のレベル及び／又は程度に従って考慮することができる。
【特許文献１】国際公開第９３／１８１５２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，３８７，６７６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／３４６５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／１０００２９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／０８９６５９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第００／２４９１３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）に罹患する患者、特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）に罹患する患者から採取した試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出しかつ／又はそのレベル及び／又は程度を定量するための方法において、前記検出及び／又は定量が患者の予後を判定する上で有用であることを特徴とする方法に関する。ＲＣＣ／ＣＣＣ患者は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物そしてより好ましくはヒトであろう。本方法は、ＲＣＣ／ＣＣＣ患者から採取した新生物細胞を含む試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出しそのレベル及び／又は程度を定量する工程及び前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することをＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が示している場合該患者がより不良な予後を有することを判定する工程を含む。より不良な予後は、例えば、累積生存率の短縮、再発のリスクの増大及び／又は転移のリスクの増大に関して測定することができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原であり、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物細胞を含む脊椎動物の試料、好ましくは哺乳動物の試料、より好ましくはヒトの試料中で定量される。臨床的転帰を予測することに加えて、本発明の方法は同様に、アシュバント療法を必要とするハイリスク患者を同定しかつ／又はその他の治療単位の中でもＭＮ／ＣＡ９／ＣＡ ＩＸ標的療法に対する候補を同定することもできる。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、対象脊椎動物を冒す腎細胞癌腫に関する予後診断方法に関するものであり、例示的な方法は、
（ａ）前記脊椎動物から採取した新生細胞を含む試料中でＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が前記試料中に存在する場合、前記試料中の細胞数に対して前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量する工程、及び
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを示している場合に、前記脊椎動物がより不良の予後を有するものと判定する工程、
を含み、
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、
（１）配列番号１のコード領域、
（２）配列番号１のコード領域の相補体に対し４２℃で５０％のホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
（３）遺伝子コードの縮重に起因してコドン配列内の（２）のヌクレオチド配列と又は配列番号１のコード領域と異なるヌクレオチド配列、
より成る群から選択されたヌクレオチド配列によってコードされる。配列番号１は前出のザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際特許公開第９５／３４６５０号パンフレットで開示されているように全長ＭＮｃＤＮＡである。
【００２０】
検出工程（ａ）において前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出するために本発明の方法に従って使用されるべき好ましい検定は、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物がＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドを含んでいるようなものであり、前記検定は、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法、放射免疫測定法、競合免疫検定法、２重抗体サンドイッチ検定、免疫組織化学的染色検定、凝集検定、及び螢光免疫検定より成る群から選択される。より好ましくは、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）は、免疫組織化学的染色の使用を含み、前記定量工程（ｂ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）及び／又はＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の免疫染色の強度及び／又は程度を判定する工程を含み、ここで前記試料中の５０％以下の細胞が免疫反応性を有する場合、前記試料中の５０％超の細胞が免疫反応性を有する場合に比べて不良な予後を前記脊椎動物が有するという結論を下される。好ましくは定量工程（ｂ）はＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）を判定する工程を含む。さらに一層好ましくは、前記検出工程（ａ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ−特異的モノクローナル抗体、好ましくは、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有するハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されたＭ７５ＭＡｂの使用を含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＣＡ ＩＸ抗原であり、ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物発生前／新生物の脊椎動物試料、好ましくは哺乳動物試料、より好ましくはヒト試料中で定量され、ここで該脊椎動物、哺乳動物又はヒトはＲＣＣ特にＣＣＣに罹患している。かかる試料は他の試料の中でも例えば組織標本、組織抽出物、体液、細胞、細胞溶解物及び細胞抽出物であり得る。例えば免疫組織化学的染色による検定のための好ましい組織標本には、その他の組織試料中でも細胞塗布標本、生検された組織又は器官からの組織学的切片、そしてインプリント調製物が含まれる。かかる組織標本は、さまざまな形で維持され得、例えば新鮮状態、凍結状態又はホルマリン、アルコール又はアセトン又はその他の形で固定された状態及び／又はパラフィン包埋されパラフィン除去された状態にあり得る。好ましい組織標本は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織標本である。
【００２２】
対象脊椎動物を冒す腎細胞癌腫についての予後診断方法である例示的かつ好ましい方法は、
（ａ）前記脊椎動物から取られた新生物細胞を含む試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程であって、試料中のＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の有無を検出するためのＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的抗体での免疫組織化学的染色の使用を含む工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質が前記試料中に存在する場合に、細胞の数に対して前記試料中の前記ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質のレベル及び／又は程度を定量する工程であって、前記試料中の細胞のＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性評点を判定すること及び細胞膜染色で免疫反応性細胞の割合（％）を判定することを含む工程を含み、ここで免疫反応性細胞の割合（％）には
免疫反応性細胞が全く無い場合、０の値
５０％以下の免疫反応性細胞の場合、１の値
５０％超の免疫反応性細胞の場合、２の値
をもつ免疫反応性評点が割当てられ、ここで試料の免疫反応性評点が１以下である場合、工程（ｃ）で、前記免疫反応性評点が２である場合に比べて不良な予後を前記脊椎動物が有しているという結論が下される。
【００２３】
代替的な好ましい実施形態においては、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）において本発明の方法に従って使用すべき好ましい検定は、核酸ベースの検定であり、ここで前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含む。好ましくは、前記検出工程（ａ）は、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ又は定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲによるものである。
【００２４】
好ましくは、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物について本発明の予後診断方法に従って試験すべき腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫、乳頭癌細胞癌腫及び色素嫌性癌腫より成る群から選択される。より好ましくは、腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫である。好ましくは前記脊椎動物は哺乳動物、より好ましくはヒトである。さらに一層好ましくは、脊椎動物はヒトの患者であり、前記腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫、乳頭癌細胞癌及び色素嫌性癌腫から成る群の中から選択される。好ましくは、前記腎細胞癌腫は腎明細胞癌腫腫瘍であり、前記試料は前記腫瘍から及び／又は前記腫瘍から誘導された転移性病巣から取られたものである。
【００２５】
本発明に従った好ましい予後診断方法は、累積生存率の短縮、前記腎細胞癌腫の再発リスクの増大及び／又は転移リスクの増大に関してより不良な予後が測定されるようなものである。さらに好ましい方法は、前記腎細胞癌腫が１つの腫瘍又は１つの腫瘍とその腫瘍からの誘導された１つ以上の転移性病巣を含み、該腫瘍又は該腫瘍と前記１つ以上の転移性病巣の外科的除去の後の転移リスクの増大、前記新生物疾患の再発リスクの増大及び／又は累積生存率の短縮に関してより不良な予後が測定される方法である。
【００２６】
好ましくは、前記予後診断方法は、前記脊椎動物を冒す前記腎細胞癌腫のための治療を選択する一助として使用される。本発明の方法は、例えば、より積極的な療法レジメンを立証するべく最低の生存率をもつ患者のサブセットを同定するために使用できる。本発明の一実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の検出及び定量は、患者の予後を判定するため従来の腫瘍病期及び等級の情報と組合せて使用される。例えば、前記脊椎動物中の前記腎細胞癌腫が３以上のＴ病期及び／又は３以上のフールマン等級を有する場合には、検定工程（ａ）及び定量工程（ｂ）が前記脊椎動物試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現していることを示した場合、前記脊椎動物はより積極的な療法レジメンで治療されるべきである。
【００２７】
前記脊椎動物の体内で腫瘍Ｔ病期が３以上であり、かつ／又はフールマン等級が３以上である場合でも、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合に比べてより良好な予後を有しており、比較的攻撃性の低い療法を選択すべきである。逆に、前記脊椎動物の体内で腫瘍Ｔ病期が２以下でありかつ／又はフールマン等級が２以下である場合でも、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合に比べてより予後を有しており、より積極的な療法が選択されるべきである。
【００２８】
本明細書で開示されている本発明の態様について以下でより詳しく説明する。
【００２９】
参考文献
略語
本明細書では以下の略語が用いられる。
【００３０】
ａａ − アミノ酸
ＡＥＣ − ３−アミノ−９−エチルカルバゾル
ＡＴＣＣ − アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
ｂｐ − 塩基対
ＣＡ − 炭酸脱水酵素
ＣＡＩ − 炭酸脱水酵素阻害物質
ＣＣＣ − 腎細胞癌腫の明細胞亜型
Ｃｉ − キュリー
Ｃｌ − 信頼区間
ｃｍ − センチメートル
ＣＳ − 累積生存率
Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ − カルボキシル末端
℃ − 摂氏温度
ＤＡＢ − ジアミノベンジジン４塩酸
ｄｓ − ２本鎖
ＥＤＴＡ − エチレンジアミン４酢酸
ＥＬＩＳＡ − 酵素免疫測定法
Ｇｒ − 等級
ＨＲＰ − ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＣ − 細胞内
ＩＦＮ − インターフェロン（サイトカイン例）
ＩＬ−２ − インターロイキン−２（サイトカイン例）
ｋｂ − キロ塩基
ｋｂｐ − キロ塩基対
ｋｄ又はｋＤａ − キロダルトン
Ｍ − モル濃度
ＭＡｂ − モノクローナル抗体
ｍｉｎ − 分
ｍｇ − ミリグラム
ｍｌ − ミリリットル
ｍＭ − ミリモル濃度
ｍｍｏｌ − ミリモル
ｎ − 症例数
ｎｇ − ナノグラム
ｎｍ − ナノメートル
ｎＭ − ナノモル濃度
ｎｔ − ヌクレオチド
Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ − アミノ末端
ＯＲ − オッズ比
ＯＲＦ − 読取り枠
ＰＢＳ − リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ − ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＧ − プロテオグルカン
ｐＩ − 等電点
ＲＣＣ − 腎細胞癌腫
ＲＴ−ＰＣＲ − 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴＵ − そのまま使用可
ＳＤ − 標準偏差
ＳＤＳ − ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＰＳＳ − 「社会科学のための統計パッケージ」
ＳＳＰＥ − ＮａＣｌ（０．１８Ｍ）、リン酸ナトリウム（０．０１Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．００１Ｍ）
Ｓｔｇ − 病期
ＴＭ − 膜貫通
Ｔｒｉｓ − トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
μＣｉ − マイクロキュリー
μｇ − マイクログラム
μｌ − マイクロリットル
μＭ − マイクロモル濃度
ヌクレオチド及びアミノ酸配列記号
本明細書のヌクレオチドを表わすために、以下の記号が用いられる：
塩基記号 意味
Ａ アデニン
Ｃ シトシン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
Ｕ ウラシル
Ｉ イノシン
Ｍ Ａ又はＣ
Ｒ Ａ又はＧ
Ｗ Ａ又はＴ／Ｕ
Ｓ Ｃ又はＧ
Ｙ Ｃ又はＴ／Ｕ
Ｋ Ｇ又はＴ／Ｕ
Ｖ Ａ又はＣ又はＧ
Ｈ Ａ又はＣ又はＴ／Ｕ
Ｄ Ａ又はＧ又はＴ／Ｕ
Ｂ Ｃ又はＧ又はＴ／Ｕ
Ｎ／Ｘ Ａ又はＣ又はＧ又はＴ／Ｕ
各々３つの隣接するヌクレオチド（トリプレットコード又はコドン）の異なる配置により特定され、特定の順序で連結されて特徴的タンパク質を形成する２０の主たるアミノ酸が存在する。本明細書では前記アミノ酸を識別するために以下のように３文字又は１文字の慣例を使用することがある：
アミノ酸名 ３文字略号 １文字略号
アラニン Ａｌａ Ａ
アルギニン Ａｒｇ Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ
システイン Ｃｙｓ Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ Ｑ
グリシン Ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ Ｌ
リジン Ｌｙｓ Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ
プロリン Ｐｒｏ Ｐ
セリン Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ
チロシン Ｔｙｒ Ｙ
バリン Ｖａｌ Ｖ
不明又はその他 Ｘ
【参考文献】
【００３１】
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、患者の体内の腎細胞癌腫（ＲＣＣ）特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）の予後診断方法を提供する。本方法には、腎細胞癌腫特にＣＣＣの診断を受けた患者から取出した試料中に存在するＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物がある場合そのレベル及び／又は程度を定量化する工程が含まれる。ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、ＣＡ ＩＸタンパク質、ＣＡ ＩＸポリペプチド、ＣＡ９核酸、特にＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡなどであり得る。ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物レベルは、ＭＮ／ＣＡ９を発現する細胞の割合（％）を判定する工程を含む、試料中の細胞の数に対して定量化され、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの不在を含めた前記レベルは、患者のより良好な又はより不良な予後と相関される。前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は好ましくは、患者から取られた試料中で定量されたＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドである。本方法は例えば、療法選択を助け、癌化学療法、腫瘍再発及び転移を監視するために使用することができる。特に、アジュバント療法を必要とするハイリスク患者特に始めからより積極的な療法を必要とする患者を識別するためにＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベルを使用することができる。
【００３３】
患者の試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量化する好ましい方法は、免疫組織化学的染色によるものである。より好ましくは、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）は免疫組織化学的染色によるものであり、前記定量工程（ｂ）は免疫反応性細胞の割合（％）及び／又は免疫反応性細胞の免疫染色の強度又は程度を判定する工程を含む。さらに一層好ましくは、前記検出工程（ａ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体、好ましくは、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有しブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されるＭ７５ＭＡｂの使用を含む。
【００３４】
代替的な好ましい実施形態においては、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出及び定量工程（ａ）及び（ｂ）において本発明の方法に従って用いられるべき好ましい検定は、核酸ベースの検定であり、ここで前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含む。好ましくは、前記検出及び定量工程（ａ）及び（ｂ）はインサイチュハイブリダイゼーション又はノーザンブロットによるものである。
【００３５】
適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、螢光剤、化学発光物質、色原体、酵素基質又は補因子、酵素阻害物質、遊離ラジカル、粒子、染料などといった標識の使用を含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定、酵素免疫学的検定、例えばＥＬＩＳＡ、螢光免疫検定などといった周知のさまざまな検定の中で使用可能である。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号明細書；第３，７９１，９３２号明細書；第３，８１７，８３７号明細書及び４，２３３，４０２号明細書を参照のこと。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態においては、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを発現している試料内の細胞の割合（％）が判定され、かくして１患者についての予後診断と相関される。ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡの発現が測定される場合、試料中の５０％以下の細胞中のＣＡ９ｍＲＮＡ又はＣＡ９ｃＤＮＡの発現がより不良な予後診断を表わす。
【００３７】
さらに、複数の方法を組合せて使用することが可能である。例えばＣＡ ＩＸタンパク質及びＣＡ９ｍＲＮＡ発現の両方を、それぞれに免疫組織化学及びインサイチュハイブリダイゼーションによって査定することができる。好ましい一実施形態は、腎細胞癌腫を患う患者からの腫瘍試料及び対照としての非新生物性腎臓組織の符合試料のスクリーニングによって例示されるであろう。当業者であれば日常的方法を用いて、５０％のカットオフがどこにくるか又は腎細胞癌腫特に腎臓明細胞癌腫を患う患者について異なるタイプの組織試料に関していかにして５０％のカットオフを判定できるかを見極めるために、本発明の検定を最適化することができるであろう。
【００３８】
当業者であれば、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を定量化するためにその他のさまざまな新生物発生前／新生物性試料を使用できるということがわかる。例えば、腎細胞癌腫に罹患している患者の場合、試料は、腫瘍から又は腫瘍に由来する転移病巣から又は腫瘍又は転移病巣の内部又はそのすぐ周囲にある細胞外流体から取ってもよい。
【００３９】
さらに、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出し定量化するためには、本明細書で開示されているものに加えて代替的方法を使用できることがわかる。
【００４０】
新生物細胞／組織
本明細書で使用する「癌性」及び「新生物性」という用語は、「前癌状態の」及び「新生物発生前の」という語と同様、同等の意味を有する。
【００４１】
本明細書で使用されている通り、「腎細胞癌腫」又は「ＲＣＣ」は、腎実質の癌腫であると考えられており、同様に腎臓癌、（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓の腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙ）、腎腺癌（ｒｅｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎癌腫（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎腫（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｍａ）、又はグラウィッツ腫瘍（Ｇｒａｗｉｔｚ’ｓ ｔｕｍｏｒ）とも呼ばれる。腎臓明細胞癌腫又は「ＣＣＣ」は、最高約８５％のＲＣＣを含む腎細胞癌腫の優勢の亜型である。ＲＣＣのその他の３つの亜型は、顆粒細胞、顆粒細胞と明細胞の混合及び紡錘細胞亜型である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原であり、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物細胞を含む脊椎動物試料、好ましくは哺乳動物試料、より好ましくはヒト試料の中で検出され定量される。かかる試料は、なかでも組織標本、組織抽出物、体液、細胞、細胞溶解物及び細胞抽出物であり得る。例えば免疫組織化学的染色により検定すべき好ましい組織標本としては、細胞塗布標本、生検された組織又は器官からの組織学切片、及びその他の組織試料の中のインプリント調製物が含まれる。免疫組織化学的染色のプロトコルの例が以下の実施例での材料と方法の節で記述されている。かかる組織標本はさまざまな形で維持することができる。例えば、これらを新鮮な状態、凍結状態、又はホルマリン、アルコール又はアセトン又はその他の形で固定させた状態及び／又はパラフィン包埋及び脱パラフィン状態におくことができる。生検された組織試料は、他の生検技術の中でも例えば吸引、咬合、ブラシ、錐体内視鏡的、切除、切開、針、細胞、経皮せん孔及び表面生検によって除去された試料であり得る。好ましい組織試料はホルマリン固定されたパラフィン包埋組織試料である。
【００４３】
検定
本発明の方法と共に使用するため、数多くの形式を適合化することができる。当該技術において一般に知られているその他の検定の中でも、例えばウエスタンブロット法、酵素免疫測定法、放射免疫測定、競合免疫測定、２重抗体サンドイッチ検定、免疫組織化学的染色検定、凝集検定、螢光免疫測定法、免疫金を用いた免疫電子及び走査顕微鏡法を用いて、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドの検出及び定量を実施することができる。かかる検定におけるＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の定量は、当該技術分野において既知の従来の方法により適合化させることができる。例えば検出方法が免疫組織化学的染色によるものである場合ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドの定量は、免疫反応性細胞の割合（％）及び／又は免疫反応性細胞の免疫染色の強度又は程度を判定することによって実施され得、さらに、これらの値の加算又は乗算、又はこれらの値を用いたその他の数学的計算を含むことができる。
【００４４】
免疫学的検定技術の当業者にとっては、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドに対する抗体を用いて、患者の体組織及び／又は細胞内のＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原を検出し定量ができるということは明白である。一実施形態においては、細胞外ドメインを含むＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドに対して作られた標識された抗体を使用できるイムノメトリック検定を用いることができる。かかる検定においては、抗原結合抗体と複合体形成する標識された抗体の量は、試料中のＣＡ ＩＸ抗原の量に正比例する。
【００４５】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質／ポリペプチドを同定するために本発明に従って有用であるモノクローナル抗体は、その他の標識のなかでも、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）といった酵素、螢光化合物、又は１２５Ｉといった放射性同位元素を用いて、任意の従来の要領で標識することができる。本発明に従った好ましい標識は、１２６Ｉであり、好ましい抗体標識方法はクロラミン−Ｔを使用するものである［４７］。同様に好ましいのは、ペルオキシダーゼを用いて抗体を標識する方法である。当業者にとって既知のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を視覚化する数多くのその他の手段も同様に使用可能である。
【００４６】
免疫組織化学検査例
以下の実施例１中で記述されている免疫組織化学検定では、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの分布及び発現パターンを調査するために抗体染色が使用されている。腎摘出術患者からのパラフィン包埋組織切片が脱パラフィン化され再水和され、その後ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体Ｍ７５で染色される。その後切片はマウスＩｇＧを認識するビオチニル化抗体と反応され、その後ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体と反応させられる。免疫ペルオキシダーゼ錯体はその後、四塩酸ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又は３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの色原体で視覚化される。
【００４７】
核酸ベースの検定
本発明のある実施形態においては、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡが検出され、存在する場合には、ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを発現している試料中の細胞の割合（％）が判定され、かくして患者について予後診断と相関される。核酸ベースの方法の一例はノーザンブロット法であり、ここでＭＮ／ＣＡ９−特異的ｍＲＮＡ発現を検出するためのプローブとして用いられる核酸配列は、ＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡ配列の全て又は一部に相補的である。ＲＮＡの調製は、変性アガロースゲル上で実施され、活性化されたセルロース、ニトロセルロース又はガラス又はナイロン膜などの適切な支持体に移送される。ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するのに用いられる核酸は、放射性標識され、オートラジオグラフィによって分析される。非放射性標識例えばフルオロフォア又はリポータ基例えばジゴキシゲニンなども又、ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するために使用可能である。
【００４８】
ＣＡ ＩＸ特異的ｍＲＮＡ発現を測定するための代替的な好ましい方法としては、生物学的試料から単離されたＲＮＡから生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物に対するＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡ配列から誘導された核酸プローブのハイブリダイゼーションを介したＣＡ９ｍＲＮＡ発現の検出がある。ＣＡ９遺伝子の２４０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを増幅するように設計されたＰＣＲプライマの例としては、センス５’−ＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡ−３’［配列番号１０］；アンチセンス５’−ＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’）［配列番号１１］がある。ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら及びウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは、患者の試料中のＲＴ−ＰＣＲによるＣＡ ＩＸの検出が免疫組織化学と充分相関することを報告している［１０，１１］。
【００４９】
ＭＮ遺伝子及びタンパク質
「ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」及び「ＭＮ／ＣＡ９」という用語はここでは、ＭＮと同義であるものと考えられている。同様にＧ２５０抗原はＭＮタンパク質／ポリペプチドを意味するものとして考えられている［２３］。
【００５０】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９３／１８１５２号パンフレット及び／又は国際公開第９５／３４６５０号パンフレットは、ＭＮｃＤＮＡ配列［配列番号１］、ＭＮアミノ酸配列［配列番号２］及びＭＮゲノム配列［配列番号３］を開示している。ＭＮ遺伝子は１１のエキソンと１０のイントロンの形で組織される。
【００５１】
ＭＮｃＤＮＡ［配列番号１］のＯＲＦは、４９．７ｋｄの計算上の分子量をもつ４５９個のアミノ酸タンパク質に対するコード能力を有する。ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の全体的アミノ酸組成はむしろ酸性であり、４．３というｐＩを有することが予測される。２次元電気泳動とそれに続く免疫ブロット法によるＣＧＬ３細胞からの未変性ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の分析は、コンピュータ予測と合致して、ＭＮ／ＣＡ ＩＸが４．７〜６．３の範囲内のｐＩを有する複数の等電性形態で存在する酸性タンパク質である、ということを示した。［ＣＧＬ３細胞は、スタンブリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５号、２５２〜２５９頁（１９８２年１月１５日）で報告されたヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ）型の突然変異体ＨｅＬａクローンであるＨｅＬａＤ９８／ＡＨ．２（ＨｅＬａＳとしても知られている）から誘導された発癌性のハイブリットＨｅＬａ線維芽細胞である］。
【００５２】
ＭＮタンパク質の最初の３７個のアミノ酸は、推定上のＭＮシグナルペプチドである［配列番号６］。ＭＮタンパク質は、細胞外ドメイン［アミノ酸（ａａ）３８−４１４；配列番号７］、膜貫通ドメイン［ａａ４１５〜４３４；配列番号８］及び細胞内ドメイン［ａａ４３５〜４５９；配列番号９］を有する。細胞外ドメインは、プロテオグリカン様ドメイン［ａａ５３−１１１；配列番号４］及び炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメイン［ａａ１３５−３９１；配列番号５］を含有する。
【００５３】
ＣＡドメインは、固定独立性の誘発のために不可欠であり、一方腫瘍アンカー及びＩＣテールはその生物学的効果については可欠である。ＭＮタンパク質は同様に、トランスフェクションを受けた細胞内での原形質膜の波打ち運動をひき起こす能力も有し、固体支持体に対するその付着に関与していると思われる。データは、細胞増殖、接着及び細胞内伝達の調節へのＭＮの関与をはっきりと表わしている。
【００５４】
ＭＮタンパク質及びポリペプチド
「ＭＮタンパク質及び／又はポリペプチド」（ＭＮタンパク質／ポリペプチド）という文言はここでは、ＭＮ遺伝子又はそのフラグメントによってコードされるタンパク質及び／又はポリペプチドを意味するものとして定義づけられる。本発明に従ったＭＮタンパク質の例及び好ましいＭＮタンパク質は、配列番号２により表わされている演繹されたアミノ酸配列を有する。好ましいＭＮ／ポリペプチドはＭＮと実質的相同性を有するタンパク質及び／又はポリペプチドである［配列２］。例えば、かかる実質的に相同なＭＮ／ポリペプチドは、好ましくはＭａｂＭ７５又はその等価物であるＭＮ特異的抗体と反応性をもつものである。Ｍ７５Ｍａｂを分泌するＶＵ−Ｍ７５ハイブリドーマは、１９９２年９月１７日付けでＨＢ１１１２８としてＡＴＣＣに寄託された。
【００５５】
「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、ペプチド連結によって共有結合されたアミノ酸鎖であり、ここでは５０個以下のアミノ酸で構成されると考えられている。「タンパク質」はここでは５０個超のアミノ酸から成るポリペプチドであるものとして定義されている。ポリペプチドという用語はペプチド及びオリゴペプチドという用語を包含する。
【００５６】
本明細書で使用される「低ＣＡ ＩＸ」又は「低ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」というのは、ＲＣＣ患者から採取した新生物試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子を発現するという判定を意味する。これに対して、「高ＣＡ ＩＸ」又は「高ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」は、ＲＣＣ患者から採取した新生物試料中の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子を発現するという判定を意味する。
【００５７】
インビボで新生物細胞によって産生されるタンパク質又はポリペプチドの配列を、細胞培養中の腫瘍細胞又は形質転換された細胞によって産生されたものから改変させることができる、ということがわかる。かくして、制限無くそのアミノ酸置換、延長、欠失、トランケーション、補間及び組合せを含めた変動するアミノ酸配列をもつＭＮタンパク質及び／又はポリペプチドは、それらを含有するタンパク質又はポリペプチドが免疫原性であり、かかるポリペプチド又はタンパク質により惹起された抗体が、ワクチンとして投与された場合に防御免疫及び／又は抗腫瘍形成活性を提供するのに充分な程度まで天然に発生するＭＮ及びポリペプチドを交叉反応することを条件として、本発明の意図する範囲の中に入る。同様に、体液の中に現存しているタンパク質はタンパク質分解プロセスなどの分解性プロセスを受けるということもわかる。かくして、有意にトランケートされたＭＮ及びＭＮポリペプチドが血清などの体液中に見出される可能性がある。「ＭＮ抗原」という文言は、ここではＭＮ及び／又はポリペプチドを包含するものとして用いられている。
【００５８】
ＭＮ及びポリペプチドのアミノ酸配列を遺伝子技術により修飾できることがさらに理解されるであろう。１つ以上のアミノ酸を欠失又は置換させることが可能である。かかるアミノ酸変更が、タンパク質又はポリペプチドの生物活性の任意の測定可能な変化をひき起こし、本発明の範囲内にあるタンパク質又はポリペプチドならびにＭＮムテインを結果としてもたらす可能性は無い。
【００５９】
核酸プローブ
本発明の核酸プローブは、ＭＮｃＤＮＡ配列［配列番号１］又はその他のＭＮ遺伝子配列例えば完全ゲノム配列［配列番号３］に相補的であるか又は実質的に相補的である配列を含むプローブである。「実質的に相補的な」という文言は、ここでは当該技術分野においてそれが充分理解されている意味を有するものとして定義され、従って標準的ハイブリダイゼーション条件下で使用される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、相補性の精度を制御するように調整可能である。２つの核酸は例えば、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする場合に、互いに実質的に相補的である。
【００６０】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件はここでは当該技術分野においてストリンジェントであると理解されている標準的なハイブリダイゼーション条件に適合するものと考えられている。少なくとも８０〜９０％の相同性を有する非常に密な関係をもつｎｔ配列のみがストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることになる。
【００６１】
例えば、ストリンジェント条件は、例えば２０℃〜５５℃の範囲の温度で０．１５Ｍ〜０．９Ｍの塩などの、５０℃〜７０℃の温度で０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌにより提供されるもののような比較的低塩及び／又は高温条件を包含する。比較的ストリンジェンシーの低い条件は、例えば６５℃で０．１％のＳＳＰＥ及び０．１％のＳＤＳの最終洗浄液を伴う、４２℃の５０％ホルムアミドの存在下で０．１５Ｍ〜０．９ＭのＮａＣｌによって提供されるような、温度上昇が実現するようなハイブリッド２重鎖の不安定化に役立つ漸増量のホルムアミドの添加によって、比較的ストリンジェンシーの高い条件にすることができる。
【００６２】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１．９１及び９．４７〜９．５１頁（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３８７〜３８９頁、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８２年）；ツチヤ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ）ら、Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第７１（６）号、７２１〜７２５頁（１９９１年６月）；及び米国特許第５，９８９，８３８号明細書、米国特許第５，９７２，３５３号明細書、米国特許第５，９８１，７１１号明細書、米国特許第６，０５１，２２６号明細書の中で記述されている。
【００６３】
抗体
「抗体」という用語は、本明細書では、全抗体のみならず抗体の生物活性フラグメント、好ましくは抗原結合領域を含有するフラグメントを含むものとして定義されている。抗体の定義の中にさらに含まれるのは、ＭＮ及びもう１つの組織特異的抗原に対し特異的である２重特異性抗体である。
【００６４】
本発明の方法に従って有用である抗体は、従来の方法及び／又は遺伝子工学により調製してもよい。抗体は、超可変領域を含む軽及び／又は重鎖（ＶＨ及びＶＬ）の可変領域から、そしてさらに一層好ましくはＶＨ及びＶＬの両方の領域から遺伝子工学処理され得る。例えば、本明細書で使用される「抗体」という用語は、その他の可能性の中でも「一価の」抗体を含むポリクローナル及びモノクローナル抗体及びその生物活性フラグメント［４５］；共有結合的、又は非共有結合的のいずれの形で会合されていようとＦａｂ’及びＦ（ａｂ）２フラグメントを含むＦａｂタンパク質；単独の軽鎖又は重鎖、好ましくは可変的重鎖及び軽鎖領域（ＶＨ及びＶＬ）領域そしてより好ましくは超可変的領域を含む領域［その他の場合ＶＨ及びＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている］；Ｆｏタンパク質；複数の抗原を結合する能力をもつ「ハイブリッド」抗体；定常−可変領域キメラ；由来の異なる重鎖及び軽鎖を伴う「複合」免疫グロブリン；２重特異性抗体、好ましくは２重特異性ＭＡｂｓ；標準組換え型技術によってと同時にオリゴヌクレオチド誘導型突然変異誘発技術［４６］によっても調製されるような改善された特異性及びその他の特性をもつ「改変型」抗体、を含んでいる。
【００６５】
本発明に従ったＣＡ ＩＸタンパク質／ポリペプチドを同定するのに有用な抗体は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）といった酵素、螢光化合物、又はその他の標識の中でも１２６Ｉなどの放射性同位元素を用いて任意の従来の要領で標識され得る。本発明に従った好ましい標識は、１２５Ｉであり、抗体を標識する好ましい方法はクロラミン−Ｔを用いたものである［４７］。
【００６６】
本発明に従って有用な代表的モノクローナル抗体には、以前にザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許及び特許出願の中で記述されたＭａｂｓＭ７５、ＭＮ９、ＭＮ１２及びＭＮ７が含まれる［米国特許第６，２９７，０４１号明細書、米国特許第６，２０４，３７０号明細書；米国特許第６，０９３，５４８号明細書；米国特許第６，０５１，２２６号明細書；米国特許第６，００４，５３５号明細書；米国特許第５，９８９，８３８号明細書；米国特許第５，９８１，７１１号明細書；米国特許第５，９７２，３５３号明細書；米国特許第５，９５５，０７５号明細書；米国特許第５，３８７，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００３００４９８２８号明細書及び同第２００２０１３７９１０号明細書及び国際公報国際公開第０３／１０００２９号パンフレット］。本発明に従って有用なモノクローナル抗体は、例えば臨床試料中でさまざまな実験室予後診断試験においてＭＮ／ポリペプチドを同定するのに役立つ。例えばモノクローナル抗体Ｍ７５（ＭａｂＭ７５）は、米国組織標準培養収集機関［ＡＴＣＣ］において１９９２年９月１７日付けでＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１１２８として寄託されたマウスリンパ球ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５によって産生される。ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５の産生は、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公報国際公開第９３／１８１５２号パンフレット中に記述されている。ＭａｂＭ７５は、非グリコシル化ＧＳＴ−ＭＮ融合タンパク質及び非変性ＣＡ ＩＸタンパク質の両方を、ＣＧＬ３細胞中で発現される通りに同等にうまく認識する。Ｍ７５Ｍａｂは、ＣＡ ＩＸタンパク質の未変性形態及び変性形態の両方を認識する［１４］。
【００６７】
抗体の調製を含む本明細書で有用な付加的な分子生物学的技術を記述する一般的なテキストとしては、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）及びキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｎｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．；サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）、第１〜３巻；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．アウサベル（Ａｕｓａｂｅｌ）ら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（２０００年まで補完）；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）、ポール（Ｐａｕｌ）（編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９８年）、及びハーローら、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）が含まれる。
【００６８】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸ及び予後診断；ＲＣＣ療法の選択における使用
低レベルのＣＡ ＩＸ染色はさらに不良な転帰と相関したことから（実施例１）、アジュバント免疫療法及びＣＡ９標的療法を含む積極的療法を必要とするハイリスク患者を識別するために、ＣＡ ＩＸの検出及び定量を使用することができる。さまざまなアジュバント免疫療法に対する入念な患者の選択及び層化が、治療に応答する確率の最も高い患者を区別することができる。転移性ＲＣＣにおける、その他のサイトカインの中でも例えばＩＦＮ又はＩＬ−２などを用いた全身的サイトカイン療法に対する応答が、前途有望なものであった。ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］からの予備データは、ＣＡ ＩＸと免疫療法応答の関係を示唆している。同様にして、ＣＡ ＩＸに対するモノクローナル抗体に基づく療法又はＣＡ ＩＸベースのＲＣＣワクチンでの免疫療法［１５，１９−２１］又はＣＡ９誘導型遺伝子療法も又、ＣＡ ＩＸの検出及び定量に従って考慮可能である。
【００６９】
さらに、本発明の予後診断方法は、腫瘍等級及び／又は腫瘍病期などの従来のマーカーと組合せてＣＡ ＩＸ検出及び定量を使用することができる。本明細書に開示されている免疫組織化学分析は、高い等級の腫瘍中に低いＣＡ ＩＸが存在する場合そして高い病期の腫瘍中に低いＣＡ ＩＸが存在する場合に、最も低い生存率が見られるということを明らかにした。かかる患者は、より積極的な療法レジメンに対する候補となると思われる。
【００７０】
ＭＮ特異的抗体の治療的使用：
モノクローナル及び／又はポリクローナル、好ましくはモノクローナルのＭＮ特異的抗体は、単独で又はリシンＡなどの化学療法薬及び毒性作用物質と組合せた形で、ＣＡ９発現腎細胞癌腫の治療において治療用に使用することができる。治療的使用のためにさらに好まれるのは、生物活性抗体フラグメントであると思われる。かかる治療的使用のための同じく好ましいＭＮ特異的抗体は、ＭＮ−特異的ヒト化モノクローナル抗体、完全ヒトモノクローナル抗体及び／又は２重特異的抗体であろう。
【００７１】
ＭＮ特異的抗体は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現する腎細胞癌腫に罹患する患者に対して、生理学的に受容可能な非毒性液体ビヒクル中に分散された状態で、治療上有効な量で投与され得る。ＭＮ特異的抗体は単独で、又は抗腫瘍薬の担体として投与され得る。ＭＮ特異的抗体に連結され得るさまざまな抗増殖性、抗新生物性又は細胞傷害性作用物質としては、代謝拮抗物質例えば葉酸拮抗剤、メトトレキサート又はプリン又はピリミジン類似体メルカプトプリン及びフルオロウラシルがある。その他のものとしては、抗生物質、レクチン例えばリジン及びアブリン、毒素例えばジフテリア毒素のサブユニット、放射性核種例えば２１１アスタテン及び１３１ヨウ素、放射線感受性増強物質例えばミザニダゾル又は中性子感受性増強物質例えばホウ素含有有機物質が含まれる。かかる作用物質は、グルタルアルデヒド架橋結合などの従来の技術によって抗体に付着され得る。
【００７２】
ＭＮ特異的抗体を、細胞傷害性細胞（例えばヒトＴ細胞、単球又はＮＫ細胞）をターゲティングするために使用することができる。細胞傷害性細胞は、ＭＮ特異的抗体のＦｃ部分を結合する細胞傷害性細胞上のＦｃレセプタを通して又は２重の特異性をもつ橋かけ抗体すなわちＭＮ及び細胞傷害性細胞に特異的な２重特異性抗体を介して、ＭＮを発現する腫瘍細胞に付着し得る。
【００７３】
細胞傷害性細胞は、２重特異性抗体がその細胞に結合できるようにすることによってターゲティングされ得る。ターゲティングの後、細胞を患者に投与できる。ターゲティングされた細胞での療法は、外科療法、放射線療法又は化学療法に対する補助として使用可能である。
【００７４】
腫瘍ワクチンとしての抗イディオタイプＭＮ特異的抗体及び免疫療法としての抗−抗イディオタイプ抗体血清：ＭＮ抗イディオタイプ抗体は、ＭＮ発現異常に付随する新生物性疾患のためのワクチンとしての治療上の有用性を有する。ＭＮ特異的抗−抗イディオタイプ抗体血清もまた治療的な抗腫瘍効力を有する。これらの治療上の有用性は、以下で記述する研究によって実証されているように、ＭＮ特異的Ｇ２５０ＭＡｂ及びそれに対する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）そしてさらなる抗−抗イディオタイプ血清（Ａｂ３）を用いて行なわれた調査によって実証されている。
【００７５】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｊａｐａｎ）、第１０（３）号、２４１〜２４４頁、（１９９６年）（英語要約）は抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を「免疫グロブリン分子の可変領域内部にある抗原決定基に対して向けられた抗体。正常な抗原を擬態するＡｂ２（いわゆる内部イメージＡｂ２）を公称抗原に対して特異的に宿主の免疫系を誘導するためのワクチン接種用代理抗原として使用することができる」と定義している。
【００７６】
以前にＧ２５０ＭＡｂ−ＮＵＨ３１、５１、７１、８２（ＩｇＧ１）及びＮＵＨ４４（ＩｇＧ２ａ）に対して向けられた６つの内部イメージマウスＡｂ２を単離したウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら（同文献）は、腫瘍ワクチンとしてのモノクローナルＡｂ２の応用について探究している。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは、「ＲＣＣ腫瘍関連抗原に関するイディオタイプワクチン接種が抗原特異的液性ならびに細胞応答を誘導し、・・・ＲＣＣ関連抗原・・・Ｇ２５０［ＭＮ］を擬態する・・・異なる内部イメージＡｂ２で免疫化されたマウスから得た抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）の抗腫瘍効力・・・２×１０５ＳＫ−ＲＣ−５２（Ｇ２５０＋）ＲＣＣ細胞の皮下注射を受けた・・・小さい立証済みの２×１０５のＮＵ１２ヒトＲＣＣ異種移植片（Ｇ２５０＋、２０ｍｍ３）を担持するＮｕ／ｎｕＢＡＬＢ／ｃマウスは、０．２ｍｌのＡｂ３血清の腹腔内注射により処置された。この処置の結果、腫瘍の完全な拒絶及び対照グループ（ｐ＜０．０１）と比べて有意な腫瘍成長阻害がもたらされたという以前の結果」を考慮して調査を行なった。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは「Ａｂ２ｓでの免疫化が免疫応答性動物の体内で強力な抗腫瘍効果を惹起する」という結論を下した。
【００７７】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、第１５９（５）号、（追補）：要約７２４号（１９９８年５月）は、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）のための免疫療法標的としてのＭＮについて記述している。ＭＮ特異的ＭＡｂＧ２５０の治療上の潜在的可能性は、ＩＦＮ／ＩＬ−２／ＭＣＳＦ（インターフェロン、インターロイキン−２、マクロファージコロニー刺激因子）及びＡｂ２（ＮＵＨ８２）誘発マウス血清（Ａｂ３−８２）と組合せた形で評価された。Ａｂ２は、ＲＣＣのための腫瘍ワクチンとして有用であることが示されてきたＭＡｂＧ２５０に対し発生させたモノクローナル抗イデオタイプ抗体である。
【００７８】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら（同文献）は、ＮＵＲ−２ＲＣＣ異種移植片を有するマウスが、ＭＣＳＦを伴う／伴わない０．２ｍｌのＡｂ３血清又はサイトカイン及び／又はＭＡｂＧ２５０の腫瘍周囲注射により処置されたことを報告した。ＭＡｂＧ２５０で処置された動物の体内の腫瘍体積は、対照の体内に比べ有意な形で小さいものであった。ＩＦＮ又はＩＬ−２での処置は類似の有効性を示したが、ＭＣＳＦは有意な腫瘍阻害を全く示さない結果となった。ＩＦＮ／ＩＬ−２／ＭＡｂＧ２５０療法は、ＭＡｂＧ２５０又はサイトカイン単療法に比べて、抗腫瘍効果を有意な形で増大させた。さらにＡｂ３ベース（Ａｂ２誘発型）免疫療法は結果として、ＭＡｂＧ２５０又はその他のサイトカイン組合せ療法と比べて多大な腫瘍単剤療法成長阻害をもたらした。
【００７９】
遺伝子療法：さらに、抗−ＣＡ ＩＸモノクローナル抗体などのＣＡ ＩＸ特異的分子を、（例えば野生型フォン・ヒッペル−リンドラ遺伝子での）遺伝子療法用のＣＡ ＩＸ特異的発現細胞に対するターゲティングされた送達のため、又は細胞傷害性タンパク質の発現をもたらすためベクターにカップリングさせることができた。
【００８０】
かかる方法は、ＭＮ／ＣＡ９が低酸素状態が調節された遺伝子であることから、診断及び予後診断上特に重要なものであり得る。ＣＡ ＩＸ過剰圧力と組合された低酸素状態は、その試料を取った哺乳動物がより不良な予後診断を有するものと考えられるということを表わしており、前記哺乳動物のための治療についての決定が前記低酸素条件の存在を考慮して下される。低酸素状態マーカーとしてのＭＮ／ＣＡ ＩＸは一般に療法決定を行なう上で有用である。例えば、異常なほどに高レベルであるＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現することがわかっている腫瘍を有する癌患者は、一部のタイプの化学療法及び放射線療法の候補ではなく低酸素状態選択的化学療法に対する候補であろう。
【００８１】
ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）［４８］は、１５７頁目で、「充実性腫瘍が正常の組織に比べて酸素化度がはるかに低い」ということを指摘している。このことから、放射線療法及び抗癌化学療法に対する耐性ならびに腫瘍転移の増加に対する素因が導かれる。ブラウンは、癌治療において腫瘍低酸素状態をいかに利用できるかを説明している。ブラウン［４８］が提案している癌治療のための腫瘍低酸素状態利用の１つの戦略は、低酸素状態下でのみ毒性を示す薬物を使用することにある。この戦略の下で使用可能な好ましい薬物及び薬物例としては、チラパザミン及びミトザントロンのジ−Ｎ−オキシド類似体であるＡＱ４Ｎが含まれる。
【００８２】
ブラウン［４８］によって提案されている低酸素状態の第２の様式は、ＨＩＦ−１の選択的誘発を利用するべく開発された遺伝子療法戦略によるものである。好ましくは、以上で言及されている遺伝子療法ベクターには、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ低酸素状態応答要素（ＨＲＥ）又はもう１つの遺伝子のＨＲＥを含むＭＮ／ＣＡ ＩＸプロモータ又はＭＮ／ＣＡ９プロモータフラグメントが含まれ、より好ましくはここでＣＡ ＩＸプロモータ又はＣＡ ＩＸプロモータフラグメントは２つ以上のＨＲＥを含み、ここで前記ＨＲＥは、ＭＮ／ＣＡ９のものであるかかつ／又はその他の遺伝子のものであるかかつ／又は好ましい状況下では遺伝子工学処理されたＨＲＥコンセンサス配列のもののいずれかである。
【００８３】
ブラウンは、ＨＩＦ−１に対する応答性がきわめて高いプロモータが低酸素状態ではあるものの正常有酸素状態である条件下で条件付きで致死的な遺伝子の発現を駆動することになるような腫瘍特異的送達系を開発することができると指摘している。ＭＮ／ＣＡ９プロモータはまさに、１つ以上のＨＲＥを含むＭＮ／ＣＡ９プロモータフラグメントと同様に、低酸素状態に対する高い応答性をもつこのようなプロモータである。「通常ヒトの体内に発見されない酵素の発現は、低酸素状態応答性プロモータ［ＭＮ／ＣＡ９プロモータ］の制御下で、腫瘍中で非毒性プロドラッグを毒性薬物へと転換することができた；［ブラウン［［４８］、１６０頁］。例としては、トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら［４９］に対しブラウンにより引用された非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に転換する細菌シトシンデアミナーゼの使用がある。
【００８４】
ラットクリフ（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ）らの米国特許第５，９４２，４３４号明細書及び６，２６５，３９０号明細書は、低酸素状態の下で抗癌薬物がいかにして活性化された状態となるか（ただし、薬物を活性化させる酵素が低酸素状態の下で著しく増加するような薬物活性化系を使用した結果として、治療効果がはるかに増強される）を説明している。
【００８５】
コンピュータ化されたＭＮ／ＣＡ ＩＸデータ解析：
ＭＮ／ＣＡ９発現（例えばレベル及び／又は程度）とＲＣＣ予後診断の相関関係は、当業者にとって既知のあらゆる方法によって、例えばコンピュータプログラムによって分析可能である。かかるコンピュータプログラムは、確率の高い予後診断と腎細胞癌腫患者から誘導されたＣＡ９発現データを相関させるためのアルゴリズムを含むことができるであろう。
【００８６】
以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる形であれ本発明を限定する意図をもつものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１
以下の実験は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸを予後診断用マーカーならびに診断マーカーとしてＲＣＣ特にＣＣＣにおいて使用できるか否かを調査するために設計された。９２名の患者からの腎摘出術標本をこの研究の中で使用した。これらのうちの８０例が腎細胞癌腫であり、１０例が腺腫であり、２例が好酸性顆粒細胞腫であった。腎細胞癌腫のうち６７が明細胞癌腫（ＣＣＣ）であった。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体（Ｍ７５）を用いた免疫組織化学的分析が、パラフィン包埋標本について実施された。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色を腫瘍病期、等級、リンパ節転移、遠隔転移及び累積生存期間と相関させた。
【００８８】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、明細胞癌腫の９１．２％に存在していた。低い染色は予後不良因子であり、逆に高い染色は良好予後因子であった。ＭＮ発現は、Ｔ病期及び等級と比べ最良予後因子であることがわかった。低等級・病期腫瘍においてさえ、低いＭＮ発現の存在は、生存期間の短縮と相関していた。
【００８９】
本明細書で開示されている研究からの結論は、ＭＮがＲＣＣ特にＣＣＣにおける有意な分子マーカーであるということである。ＭＮ発現の低下は低い生存率と独立して結びつけられる。ＭＮは、臨床的転帰を予測し、アジュバント免疫療法及びＭＮ標的療法を必要とするハイリスク患者を識別するために使用可能である。
【００９０】
材料と方法
Ｃｕｋｕｒｏｖａ大学病理学部の保管所から得た８０例のＲＣＣ症例、１０例の腎腺癌と２例の腎臓好酸性顆粒細胞腫症例に由来する腎摘出標本の試料を評価した。全ての患者は１９９６年〜２００３年の同じ大学病院の泌尿器科で手術を受けた。各症例の組織学的スライドを診断的に再度査定するべく再検討した。フールマン核等級付けシステム［１３］に従って等級付けを実施した。
【００９１】
ホルマリン固定させ、パラフィン包埋した組織試料の厚み５μｍの切片を脱パラフィン化し、一連の等級付けされたアルコールを通して再水和させた。マイクロ波オーブン内で１０分間、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で抗原検索を実施した。２０〜２５分間、これらを休ませて室温まで冷却させた。５分間ＰＢＳ中でスライドを洗浄した後、１０分間遮断用血清と共にインキュベーションを行なった。その後、室温で６０分間１／３００の濃度でＭＮ／ＣＡ ＩＸの外部ドメインに対して発生させたマウスモノクローナル抗ヒト抗体（Ｍ７５）を適用した［１４］。ＰＢＳ中で５分間スライドを洗浄した後、これらを２０分間、そのまま使用可能なビオチニル化された万能２次抗体の中で２５℃でインキュベートした（ＮＣＬ−ＲＴＵ−Ｄ、Ｎｏｖａｃａｓｒｔａ、英国）。その後スライドを５分間ＰＢＳ中で洗浄し、次に１０分間ＲＴＵトストプトアピジン／ベルオキシダーゼ複合試薬の中で２５℃でインキュベートした。インキュベーションの後、スライドを再び５分間ＰＢＳで２回洗浄した。免疫ペルオキシダーゼをＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾル；ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）で視覚化した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで切片を対比染色し、次にカバースリップを置いた。負の対照として全ての染色手順内でイソタイプ抗体を使用した。
【００９２】
単一切片の全フィールド内に見られる陽性細胞の割合（％）に基づいて、半定量的に免疫組織学的結果を評定した。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は膜関連タンパク質である。従って、細胞が鮮明で明確な膜染色を示した時点で、それはＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性をもつものと解釈された。０〜２＋の尺度（リアオ（Ｌｉａｏ）ら［１２］により記述されている通り染色された場合、完全に陰性は０、５０％以上の細胞が染色された場合１＋焦束、５０％未満の細胞が染色された場合２＋拡散）。染色パターンは、それぞれ強度が０〜１＋及び２＋である場合に高及び低発現のものとみなされた。全ての標本が２名の病理学者によりブラインド検査された。２人の間の観測者間信頼度は８８％であった。
【００９３】
ウィンドウズ（登録商標）バージョン１０．０用のＳＰＳＳ（もとは「社会科学のための統計パッケージ」）を統計分析のために使用した。独立したグループ間のＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色レベルの差をカイ２重又はフィッシャの直接確率検定によって評価した。累積生存率を推定するためにはカプラン・マイヤー法を使用し層別生存率関数を比較するためには対数−順位検定を応用した。ＭＮ／ＣＡ ＩＸの統計的独立性及び有意性を試験するためには、コックス比例ハザードモデルを使用した（モデル内で、従属変数として年令、等級、Ｔ病期及びＭＮ／ＣＡ ＩＸを使用した）。平均ＩＳＤ（標準偏差）、ｎ（症例数）及び割合（％）としてデータを表現した。０．０５未満のｐ値は有意とみなされた。
【００９４】
結果
合計９２の標本のうち、８０はＲＣＣであり、ＲＣＣのうち６７は明細胞亜型（ＣＣＣ）、１０は乳頭癌、３は色素嫌性癌であった。残りの１２は、１０の腺癌及び２の好酸性顆粒細胞腫から成っていた。
【００９５】
８０のＲＣＣのうち、６例のＣＣＣを含めた１０例は染色を全く示さなかった。従ってＲＣＣ腫瘍標本内のＭＮ発現は８７．５％であった。染色を示したもののうち、３１例が５０％未満の染色を示し、そのうち２５例はＣＣＣであった。３９のＲＣＣつまり３６例のＣＣＣと３例の乳頭癌は５０％超の染色を示した。［免疫組織化学的染色例は、乳頭癌腫において高いＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色パターン（図１）をそして明細胞癌腫において強度の膜質染色（図２）を示した］。１０の腺癌のうちいずれも染色を示さなかった。２つの好酸性顆粒細胞腫のうち、１例は染色せず、その他は５０％未満の染色を示した（表１）。
【表１】
【００９６】
全体として、明細胞型を伴う６７のＲＣＣ患者が分析に含み入れられた。外科手術時の患者の年令は１８〜８１才の範囲であった（平均５４．８±１１．６才）。女性／男性比は１．９：１であり、男性患者が４４名（６５．７％）、女性患者が２３名（３４．３％）であった。６２名の患者（９２．５％）に対し根治的腎摘出術が実施され、５名（７．５％）に対し部分的腎摘出術が実施された。病理学的病期に関しては、２２名が病期Ｉ、３１名が病期ＩＩ、８名が病期ＩＩＩそして６名が病期ＩＶであった。病理学的等級に関しては、２４名が等級１（３５．８％）、２０名が等級２（２９．９％）、１６名が等級３（２３．９％）そして７名が等級４の症例であった（１０．４％）。表２は、患者と腫瘍の特徴を列挙している。
【表２】
【００９７】
ＣＣＣにおける染色パターンと腫瘍の病理学的Ｔ及びＮ病期、Ｍ病期及び等級の関係を評価し、結果は表３に示されている。低病期Ｔの腫瘍は６６％の症例において高いＣＡ ＩＸ染色を示し、一方高い病期Ｔの腫瘍は、大部分が低いＣＡ ＩＸ染色を示した（９２．９％）。いかなるリンパ節転移も存在しなかった場合、５７．１％の症例で高い染色パターンが存在した、一方リンパ節転移を伴う場合、低パターンのＣＡ ＩＸ染色が全（１００％）症例に見られた。全体のうち、６３名の患者が遠隔転移を全くもたず、そのうち３６（５７．１％）が高パターンのＣＡ ＩＸ染色を示した。遠隔転移を有する４名（１００％）の患者の全てが低パターンのＣＡ ＩＸ染色を示した。低等級（１又は２）の腫瘍は最も高いＣＡ ＩＸ染色（７１．１％）を有し、一方高等級（３又は４）の腫瘍は大部分が低いＣＡ ＩＸ染色（８１．８％）を有していた（表３）。
【表３】
【００９８】
ＣＣＣ患者のうち、６名は追跡調査ができなかった。Ｔ病期、等級及びＣＡ ＩＸ発現に従った６１名の残りの患者の平均及び中央値累積生存率が表４及び図３ａ、ｂ、ｃ、４及び５の中で詳細に記されている。高いＣＡ ＩＸ発現、平均累積生存率は６４．１カ月であった。等級が考慮された場合、低等級グループ内で平均累積期間は５３．５カ月であった；しかしながら低等級腫瘍内で低いＣＡ ＩＸ発現が存在した場合、生存率は２８．７カ月まで下降した。類似の要領で、低いＴ病期の腫瘍中の４９．４カ月という累積生存率は、かかる低等級腫瘍が低レベルのＣＡ ＩＸ染色を示した時点で２８．７カ月まで低下した。累積生存率は、腫瘍のＴ病期（ｐ＝０．０２）及び等級（ｐ＝０．００６）と共にＣＡ ＩＸ染色レベル（ｐ＝０．０００）と相関していた。
【表４】
【００９９】
逆に、高腫瘍等級患者は２２．６カ月の生存率を有していたが、高等級腫瘍内でＣＡ ＩＸ染色が高い場合、生存率は６１カ月にはね上った。高病期−高ＣＡ ＩＸ発現グループにおいては、１名の患者しかおらず、その患者は８カ月生存したことから、類似の結論に到達することはできなかった。
【０１００】
コックス比例ハザードモデルの結果は、表５に示されている。結果は、ＣＡ ＩＸがＲＣＣ患者中の生存速度と関係性をもつ独立した有意な因子であることを示している。
【表５】
【０１０１】
結論
８０例のＲＣＣのこの研究において、ＣＡ ＩＸ染色は８７．５％であったが、これは以前の報告書［７］と一貫性ある値である。ＣＣＣのグループでは、染色は９１％であったが、これはＣＡ ＩＸが特にＲＣＣの明細胞亜型について強いバイオマーカーであることを示唆している。ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら［１０］は、ＣＣＣ内のＣＡ ＩＸ発現が９２％であることを発見した。この率はブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］によって９４％であるものと報告された。
【０１０２】
その予後診断値に関しては、低レベルのＣＡ ＩＸ染色は、さらに不良な転帰と相関していた。高いＴ病期腫瘍は低いＣＡ ＩＸ発現（９２．９％）を有していた。症例のうち４例のみがリンパ節転移を有していたとしても、これらの症例は全て低レベルのＣＡ ＩＸ染色を有していた。遠隔転移に関しては、全てが低いＣＡ ＩＸ発現を再び有し、一方、転移を、全く伴わない症例の４２．９％のみが同じパターンで染色した。再び高腫瘍等級で、高い率の低ＣＡ ＩＸ発現（８１．８％）が存在した。累積生存率を腫瘍等級、病期及びＣＡ ＩＸ発現と相関させた場合、ＣＡ ＩＸ発現は、少なくともＴ病期及び腫瘍等級と同じ位優れた生存率達成因子であった。患者の数が不充分であったことから、Ｎ及びＭ病期に起因する生存率は推定できなかった。
【０１０３】
対象研究グループ内の全体的生存率は、文献［１］中に報告されているものよりも低い。これも又、数の少なさならびに場合によっては患者の社会経済状態に起因している可能性がある。
【０１０４】
低いＣＡ ＩＸ、高い病期及び高い腫瘍等級のグループの全てにおいて、生存率は類似のものであった（それぞれ１９．３、２２．６、２３．６カ月）。しかしながら、高等級腫瘍内に低ＣＡ ＩＸ（１５．５カ月）及び高病期腫瘍内に低ＣＡ ＩＸ（２０．３カ月）が存在する場合、最低の生存率しか見られなかった。従って、より積極的な療法レジメンを立証するためにはこれらの患者サブセットを予測することがきわめて重要である。
【０１０５】
ＲＣＣは生物学的免疫療法に応答することが示されてきた。転移性ＲＣＣにおける全身的サイトカイン療法に対する応答は、全体的結果がなおも不適切であるものの、前途有望である。さまざまなアジュバント免疫療法に対する入念な患者の選択及び層化により、治療に応答する確率の最も高い患者を区別することができる。
【０１０６】
結論として、本明細書ではＭＮ／ＣＡ ＩＸはＲＣＣ／ＣＣＣの予後診断における有意でかつ前途有望な分子マーカーであることが示されている。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現の低下は低い生存率と独立して結びつけられる。臨床的帰結及び腫瘍の挙動を予測するためにＭＮ／ＣＡ ＩＸを使用することが可能である。ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、上述のものによって例示されているように、その他の療法の中でもアジュバント免疫療法及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ標的療法の恩恵を受け得るハイリスク患者を識別することができる。
【０１０７】
ブダペスト条約寄託物
以下に列挙する材料は、現在１０８１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓｕｓ、バージニア州２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。該寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれた。成育可能な培養の維持は、寄託年月日から３０年間保証されている。ハイブリドーマ及びプラスミドは、ブダペスト条約の条項に基づいてＡＴＣＣによって利用可能となり、当該出願からの特許の付与の時点で寄託されたハイブリドーマ及びプラスミドの無制限の利用可能性を公衆に保証するＡＴＣＣと出願人らの間の合意の対象となる。寄託された菌株の利用可能性は、その特許法に従ってあらゆる政府の権限に基づき付与される権利を侵害して本発明を実施するための許諾としてみなされるべきものではない。
【表６】
【０１０８】
同様にして、Ｖ／１０のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系列Ｖ／１０−ＶＵは、受託番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢの下でＵｎｉｖｅｒｓｅｉｔ Ｇｅｎｔ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５、Ｂ−９０００ Ｇｅｎｔ、ベルギーにあるＬａｂｅｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｉｅ （ＬＭＢＰ） Ｂｅｌｇｉｕｍ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＢＣＣＭ） ［ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ］の国際寄託当局（ＩＤＡ）にブダペスト条約に基づいて２００３年２月１９日付けで寄託された。
【０１０９】
本発明の前述の実施形態の記述は、例示及び説明を目的として提示された。これらは網羅的であるように又は本発明をまさに開示されている通りの形態に限定するように意図されておらず、明らかに上述の教示に照らして数多くの修正及び変更が可能である。実施形態は、本発明の原理及びその実践的応用を説明し、かくして当業者がさまざまな実施形態の中でかつ考慮されている特定の用途に適するようなさまざまな修正を伴って本発明を利用できるようにする目的で選択され記述されたものである。
【０１１０】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】腎臓乳頭癌腫における高パターンのＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色を示す［ＭＮ／ＣＡ ＩＸ×１００］。
【図２】腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）に見られる強度の膜質染色を示す［ＭＮ／ＣＡ ＩＸ×２００］。
【図３】Ｔ病期（ａ）、腫瘍等級（ｂ）及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現（ｃ）に基づく６１ＣＣＣ患者の累積生存率（ＣＳ）をグラフで示す。
【図４】Ｔ病期及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に基づく６１人のＣＣＣ患者のＣＳをグラフで示す。
【図５】腫瘍等級及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に基づく６１人のＣＣＣ患者のＣＳをグラフで示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床遺伝子工学の全般的分野及び生化学工学、免疫化学及び腫瘍学の分野に関する。より詳細には、これはＭＮ遺伝子つまり、代替的にＭＮタンパク質、ＭＮ／ＣＡ ＩＸイソ酵素、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡ ＩＸ、ＭＮ／Ｇ２５０又はＧ２５０タンパク質として現在知られているオンコプロテインをコードする、代替的にＭＮ／ＣＡ９、ＣＡ９又は炭酸脱水酵素９として知られている１つの腫瘍遺伝子とみなされる細胞遺伝子に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、腎臓癌、特に腎臓明細胞癌腫についての予後診断検定のため及び癌治療に関する臨床的決定を行なうための根拠を提供する、腎臓癌患者の試料中のＭＮ抗原又はＭＮ遺伝子発現の同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
上述のように、ＭＮ遺伝子及びタンパク質は、本明細書でその名前を互換的に使用している一定数の代替的名称で知られている。ＭＮタンパク質は亜鉛を結合し炭酸脱水酵素（ＣＡ）活性を有することがわかっており、現在９番目の炭酸脱水酵素イソ酵素−ＭＮ／ＣＡ ＩＸ又はＣＡ ＩＸ［２２］とみなされている。炭酸脱水酵素の命名法に従うと、ヒトＣＡイソ酵素は、大文字のローマ字及びローマ数字で書かれ、一方その遺伝子はイタリック体とアラビア数字で書かれている。代替的には、「ＭＮ」は本明細書で、前後関係によって指示されるように炭酸脱水酵素イソ酵素ＩＸ（ＣＡ ＩＸ）タンパク質／ポリペプチド、又は炭酸脱水酵素イソ酵素９（ＣＡ９）遺伝子、核酸、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのいずれかを意味するために使用される。
【０００４】
ＭＮタンパク質はＧ２５０抗原を用いても同定されてきた。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら［２３］は「配列分析とデータベース検索により、Ｇ２５０抗原が子宮頸癌腫中で同定されたヒト腫瘍関連抗原であるＭＮと同一であることが判明した（パストレック（Ｐａｓｔｏｒｅｋ）ら、１９９４年）」と記述している。
【０００５】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献１（１９９３年９月１６日公開）及び特許文献２（１９９５年２月７日発行）は、ＭＮ遺伝子及びタンパク質の発見について記述している。ＭＮ遺伝子は、テスト対象となった全ての脊椎動物の染色体ＤＮＡ中に存在することが発見されており、その発現は発癌性と強い相関関係をもつことがわかっている。一般に、腫瘍形成は、ＣＡ ＩＸタンパク質の発現異常という形で明らかになる。例えば、腫瘍形成は、（１）通常は何らかの有意な度合いでＣＡ ＩＸタンパク質を発現することのない組織内にＣＡ ＩＸタンパク質が存在する場合；（２）ＣＡ ＩＸタンパク質が、通常はそれを発現する組織に不在である場合；（３）ＣＡ９遺伝子発現が１つの組織内で通常発現されるレベルよりも有意な形で増大したレベルにあるか又は有意な形で減少したレベルにある場合；又は（４）ＣＡ ＩＸタンパク質が１つの細胞内部の異常な場所で発現される場合、に知らされる可能性がある。特許文献１はさらに、その他のＭＮ関連の発明の中でも、Ｍ７５ＭＡｂ及びＭ７５ＭＡｂを分泌するＶＵ−Ｍ７５ハイブリドーマを含めたＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を開示している。Ｍ７５ＭＡｂは特異的にＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質のプロテオブリカン（ＰＧ）ドメイン上の免疫優性エピトープに結合する。
【０００６】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献３（１９９５年１２月２１日公開）は、図１の中で、本明細書に記述されている通りに単離された全長ＭＮｃＤＮＡのヌクレオチド配列［配列番号１］及びそのＭＮｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列［配列番号２］を提供している。特許文献３は同様に、ＭＮプロモータのためのヌクレオチド配列を図６で提供している。これらのＭＮｃＤＮＡ、プロモータ、及びアミノ酸配列は本明細書に参照により援用されている。
【０００７】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献４（２００３年１２月４日公開）は、その他のＭＮ関連発明の中でも、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメイン上のものを含めた、非免疫優性エピトープに向けられているＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的ＭＡｂｓを開示している。かかるＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的ＭＡｂの一例が、Ｖ／１０−ＵＶ−ハイブリドーマから分泌されたＶ／１０ＭＡｂである。
【０００８】
ＭＮタンパク質は現在、最初に記述された腫瘍関連炭酸脱水酵素イソ酵素であると考えられている。炭酸脱水酵素ファミリー（ＣＡ）には、可逆的水和−脱水つまりＣＯ２＋Ｈ２Ｏ⇔ＨＣＯ３−＋Ｈ＋に関与する１１の触媒的に活性な亜鉛金属酵素が含まれる。ＣＡは異なる生体の中で広く分布している。ＣＡはさまざまな生理学的及び生物学的プロセスに参与し、著しく多様な組織分布、細胞内局在化及び生物学的機能を示す［２４、２５、２６］。炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡ ＩＸは、最近同定されたイソ酵素のうちの１つである［２２、２７］。形質転換された細胞系列及び複数のヒト悪性腫瘍中のＣＡ ＩＸ過剰発現のため、それは腫瘍関連抗原として認識されヒトの癌の発生に結びつけられてきた［８、１６、２８］
ＣＡ ＩＸは、ユニークなＮ末端プロテオグリカン様延長を伴うグリコシル化膜貫通型ＣＡアイソフォームである［２２］。トランスフェクション研究を通して、ＣＡ ＩＸが３Ｔ３細胞の形質転換を誘発できる、ということが実証されてきた［２２］。最近の研究は、ＣＡ ＩＸが細胞付着に参加するばかりでなく、ＭＮプロモータの低酸素症応答性要素に対するＨＩＦ−１タンパク質結合を介して低酸素症においても誘導され得るということを明らかにした［２９、３０］。ＭＮ遺伝子の転写は、腎細胞癌腫細胞内で野生型フォン・ヒッペル・リンドラ腫瘍抑制遺伝子による負の調節を受ける［３１］。フォン・ヒッペル・リンドラ腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物は、酸素依存型タンパク質分解のためのＨＩＦ−１αのターゲティングを担当するユビキチンリガーゼ複合体と相互作用する［３２、３３］。かくして、酸素の低いレベルはＨＩＦ−１αの安定化を導き、そのことが今度はＭＮの発現増加を導く［３０］。癌におけるＭＮの高発現領域は、多くの癌において報告されているような腫瘍低酸素症と結びつけられ、低酸素条件下での腫瘍細胞のインキュベーションは、ＭＮ発現の誘発を導く［３０、３４〜３８］。
【０００９】
ＭＮ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｍ７５を用いた数多くの研究が、前癌状態及び癌性頸部病巣を診断／予後診断する上でのＭＮの診断／予後診断的有用性を確認してきた［１６、３９、４０］。子宮頸癌腫のＭ７５ＭＡｂを用いた免疫組織化学研究及び腎細胞癌腫のＰＣＲベース（ＲＴ−ＰＣＲ）の調査がこれらの癌と密接な関連性をもつものとしてＭＮ発現を同定し、腫瘍バイオマーカーとしてのＭＮの有用性を確認した［１６、３９、４１］。さまざまな癌（なかでも特に子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌及び前立腺癌）において、ＣＡ ＩＸ発現は増大し、一部の腫瘍において微細血管密度及び低酸素症と相関されてきた［３４、３５］。
【００１０】
通常ＭＮタンパク質を発現しない組織において、ＣＡ ＩＸの陽性率は、その他の前癌／癌の中でも肺、乳房及び子宮頸部の前癌／癌［３６−３８］といった新生物発生前／新生物疾患についての診断とみなされている。きわめてわずかな正常組織しかＭＮタンパク質を何らかの有意な度合いで発現しないということが発見されてきた。これらのＭＮ発現する正常細胞としては、ヒト胃粘膜及び胆嚢上皮及び消化管のその他の一部の正常細胞が含まれる［４２−４４］。
【００１１】
成人の悪性腫瘍全体の３％を占める腎細胞癌腫（ＲＣＣ）は、泌尿器癌の中でも最も致死率の高いものである［１］。ＲＣＣは、ＵＳにおいて、癌死亡原因の第９位にあり、２００４年には３５０００件の新たな症例と１２０００人超の死亡者が予想されている［２］。ＲＣＣの発生率は、さまざまな腹部及び胃腸疾患の評価のための超音波検査及びコンピュータ断層撮影がより広く用いられたことに大きく起因して、１９７０年代から増大した［３］。ＲＣＣについては、利用可能な最良の予後診断インジケータは病期であるが、現行の予後診断因子つまりフールマン等級及び性能状態ならびに病期は、患者の転帰及び癌攻撃性を予測するには不充分である［４−６］。かくしてさらなる予後診断情報を提供するバイオマーカーの同定が、最適な治療及び転帰を画定するためにきわめて重要であると思われる。
【００１２】
上述の通り、炭酸脱水酵素ファミリーの一成員であるＭＮが一部の腫瘍タイプにおいて構成的に誘導されるものの、大部分の正常な組織内には存在しない、ということが以前の研究によって示されてきた［７−１０］。さらに、悪性及び良性の腎臓組織についての以前の免疫生化学研究は、ＭＮが同様にＲＣＣ内において高レベルで発現されることを明らかにしており、ＭＮ発現が有用な診断的バイオマーカーであることを示唆している［１１、１２、１５−１７］。ブイ（Ｂｕｉ）ら［１７］は、ＲＣＣ内でＣＡ ＩＸと共に使用された場合にもう１つのバイオマーカーＫｉ６７が生存率を高レベルで予測すると記述している。さらにザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら［１８］は、ＲＣＣ患者の体液（尿及びＣＡ ＩＸ血清）中に可溶形態のＣＡ ＩＸを発見した。［同様にザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献４（２００３年１２月４日公開）も参照のこと］。
【００１３】
本明細書で開示されているのは、ＭＮ発現がＲＣＣ特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）のための予後診断マーカーとして有用であることが示されている方法である。ＣＣＣは、ＲＣＣを約８５％まで含んでいる。本明細書で開示されている実際はＲＣＣ特にＣＣＣ内の分子マーカーとしてのＭＮの見込みのある有意性を裏づけるものである。ＲＣＣ特にＣＣＣにおける低いＭＮ発現は、予後不良因子であることが発見され、逆に高いＭＮ発現は予後良好因子であることが発見された。ＭＮ発現は本明細書中で、Ｔ病期及びフールマン等級と比べた場合の最高のＲＲＧ因子であることが開示されている。ＭＮ発現の低下は本明細書において生存率不良と独立して関連づけされるものとして開示されている。
【００１４】
本発明の予後診断方法は、ＲＣＣ／ＣＣＣについてのより良好な予後とより不良な予後の間のカットオフとして５０％のＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９発現を用いている。リアオ（Ｌｉａｏ）ら［１２］（２８２８頁目）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫染色パターンを「５０％超の細胞が染色された場合広範性とし５０％以下の細胞が染色された場合には限局性である」として記述した。本発明の方法はカットオフ値として５０％を使用しているが、ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］（４頁目）は、組織アレイからのＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫染色評点情報の生存木解析により、「８５％という染色割合（％）が患者の生存の層化のための理想的カットオフであった」ということを発見した［同様にブイ（Ｂｕｉ）ら、特許文献５（２００３年１０月３０日公開）も参照のこと］。
【００１５】
本発明の予後診断方法は、臨床的転帰及び腫瘍の挙動を予測するために使用できる。本明細書で開示されている予後診断方法は、ＭＮ発現のレベル、程度及び／又は強度を検出しかつ／又は定量し、その他の適切な療法の中でもアシュバント免疫療法及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９標的療法の恩恵を受けることのできるハイリスクＲＣＣ／ＣＣＣ患者を同定することができる。
【００１６】
ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］からの予備データはＭＮ／ＣＡ ＩＸと免疫療法応答の関係を表わしている。同様にして、ＭＮ／ＣＡ ＩＸに対するモノクローナル抗体に基づく療法又はＭＮ／ＣＡ ＩＸベースのＲＣＣワクチンを用いた免疫療法［１５、１９−２１］ならびに［例えばザバダ（Ｚａｖａｄａ）ら、特許文献６（２０００年５月４日公開）で開示されているような］プロモータ活性をもつＭＮプロモータフラグメント又はＭＮ遺伝子プロモータ、好ましくは低酸素症応答性要素（ＨＲＥ）を含むＭＮプロモータフラグメント、好ましくはＭＮＨＲＥに対し操作可能に連結された細胞傷害性タンパク質／ポリペプチド及び／又はサイトカインをコードするベクターも同様に、ＲＣＣ／ＣＣＣ患者試料内のＭＮ／ＣＡ ＩＸ／ＣＡ９発現のレベル及び／又は程度に従って考慮することができる。
【特許文献１】国際公開第９３／１８１５２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，３８７，６７６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／３４６５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／１０００２９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／０８９６５９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第００／２４９１３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）に罹患する患者、特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）に罹患する患者から採取した試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出しかつ／又はそのレベル及び／又は程度を定量するための方法において、前記検出及び／又は定量が患者の予後を判定する上で有用であることを特徴とする方法に関する。ＲＣＣ／ＣＣＣ患者は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物そしてより好ましくはヒトであろう。本方法は、ＲＣＣ／ＣＣＣ患者から採取した新生物細胞を含む試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出しそのレベル及び／又は程度を定量する工程及び前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することをＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が示している場合該患者がより不良な予後を有することを判定する工程を含む。より不良な予後は、例えば、累積生存率の短縮、再発のリスクの増大及び／又は転移のリスクの増大に関して測定することができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原であり、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物細胞を含む脊椎動物の試料、好ましくは哺乳動物の試料、より好ましくはヒトの試料中で定量される。臨床的転帰を予測することに加えて、本発明の方法は同様に、アシュバント療法を必要とするハイリスク患者を同定しかつ／又はその他の治療単位の中でもＭＮ／ＣＡ９／ＣＡ ＩＸ標的療法に対する候補を同定することもできる。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、対象脊椎動物を冒す腎細胞癌腫に関する予後診断方法に関するものであり、例示的な方法は、
（ａ）前記脊椎動物から採取した新生細胞を含む試料中でＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が前記試料中に存在する場合、前記試料中の細胞数に対して前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量する工程、及び
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを示している場合に、前記脊椎動物がより不良の予後を有するものと判定する工程、
を含み、
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、
（１）配列番号１のコード領域、
（２）配列番号１のコード領域の相補体に対し４２℃で５０％のホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
（３）遺伝子コードの縮重に起因してコドン配列内の（２）のヌクレオチド配列と又は配列番号１のコード領域と異なるヌクレオチド配列、
より成る群から選択されたヌクレオチド配列によってコードされる。配列番号１は前出のザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際特許公開第９５／３４６５０号パンフレットで開示されているように全長ＭＮｃＤＮＡである。
【００２０】
検出工程（ａ）において前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出するために本発明の方法に従って使用されるべき好ましい検定は、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物がＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドを含んでいるようなものであり、前記検定は、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法、放射免疫測定法、競合免疫検定法、２重抗体サンドイッチ検定、免疫組織化学的染色検定、凝集検定、及び螢光免疫検定より成る群から選択される。より好ましくは、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）は、免疫組織化学的染色の使用を含み、前記定量工程（ｂ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）及び／又はＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の免疫染色の強度及び／又は程度を判定する工程を含み、ここで前記試料中の５０％以下の細胞が免疫反応性を有する場合、前記試料中の５０％超の細胞が免疫反応性を有する場合に比べて不良な予後を前記脊椎動物が有するという結論を下される。好ましくは定量工程（ｂ）はＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）を判定する工程を含む。さらに一層好ましくは、前記検出工程（ａ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ−特異的モノクローナル抗体、好ましくは、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有するハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されたＭ７５ＭＡｂの使用を含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＣＡ ＩＸ抗原であり、ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物発生前／新生物の脊椎動物試料、好ましくは哺乳動物試料、より好ましくはヒト試料中で定量され、ここで該脊椎動物、哺乳動物又はヒトはＲＣＣ特にＣＣＣに罹患している。かかる試料は他の試料の中でも例えば組織標本、組織抽出物、体液、細胞、細胞溶解物及び細胞抽出物であり得る。例えば免疫組織化学的染色による検定のための好ましい組織標本には、その他の組織試料中でも細胞塗布標本、生検された組織又は器官からの組織学的切片、そしてインプリント調製物が含まれる。かかる組織標本は、さまざまな形で維持され得、例えば新鮮状態、凍結状態又はホルマリン、アルコール又はアセトン又はその他の形で固定された状態及び／又はパラフィン包埋されパラフィン除去された状態にあり得る。好ましい組織標本は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織標本である。
【００２２】
対象脊椎動物を冒す腎細胞癌腫についての予後診断方法である例示的かつ好ましい方法は、
（ａ）前記脊椎動物から取られた新生物細胞を含む試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程であって、試料中のＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の有無を検出するためのＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的抗体での免疫組織化学的染色の使用を含む工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質が前記試料中に存在する場合に、細胞の数に対して前記試料中の前記ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質のレベル及び／又は程度を定量する工程であって、前記試料中の細胞のＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性評点を判定すること及び細胞膜染色で免疫反応性細胞の割合（％）を判定することを含む工程を含み、ここで免疫反応性細胞の割合（％）には
免疫反応性細胞が全く無い場合、０の値
５０％以下の免疫反応性細胞の場合、１の値
５０％超の免疫反応性細胞の場合、２の値
をもつ免疫反応性評点が割当てられ、ここで試料の免疫反応性評点が１以下である場合、工程（ｃ）で、前記免疫反応性評点が２である場合に比べて不良な予後を前記脊椎動物が有しているという結論が下される。
【００２３】
代替的な好ましい実施形態においては、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）において本発明の方法に従って使用すべき好ましい検定は、核酸ベースの検定であり、ここで前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含む。好ましくは、前記検出工程（ａ）は、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ又は定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲによるものである。
【００２４】
好ましくは、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物について本発明の予後診断方法に従って試験すべき腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫、乳頭癌細胞癌腫及び色素嫌性癌腫より成る群から選択される。より好ましくは、腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫である。好ましくは前記脊椎動物は哺乳動物、より好ましくはヒトである。さらに一層好ましくは、脊椎動物はヒトの患者であり、前記腎細胞癌腫は、腎臓明細胞癌腫、乳頭癌細胞癌及び色素嫌性癌腫から成る群の中から選択される。好ましくは、前記腎細胞癌腫は腎明細胞癌腫腫瘍であり、前記試料は前記腫瘍から及び／又は前記腫瘍から誘導された転移性病巣から取られたものである。
【００２５】
本発明に従った好ましい予後診断方法は、累積生存率の短縮、前記腎細胞癌腫の再発リスクの増大及び／又は転移リスクの増大に関してより不良な予後が測定されるようなものである。さらに好ましい方法は、前記腎細胞癌腫が１つの腫瘍又は１つの腫瘍とその腫瘍からの誘導された１つ以上の転移性病巣を含み、該腫瘍又は該腫瘍と前記１つ以上の転移性病巣の外科的除去の後の転移リスクの増大、前記新生物疾患の再発リスクの増大及び／又は累積生存率の短縮に関してより不良な予後が測定される方法である。
【００２６】
好ましくは、前記予後診断方法は、前記脊椎動物を冒す前記腎細胞癌腫のための治療を選択する一助として使用される。本発明の方法は、例えば、より積極的な療法レジメンを立証するべく最低の生存率をもつ患者のサブセットを同定するために使用できる。本発明の一実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の検出及び定量は、患者の予後を判定するため従来の腫瘍病期及び等級の情報と組合せて使用される。例えば、前記脊椎動物中の前記腎細胞癌腫が３以上のＴ病期及び／又は３以上のフールマン等級を有する場合には、検定工程（ａ）及び定量工程（ｂ）が前記脊椎動物試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現していることを示した場合、前記脊椎動物はより積極的な療法レジメンで治療されるべきである。
【００２７】
前記脊椎動物の体内で腫瘍Ｔ病期が３以上であり、かつ／又はフールマン等級が３以上である場合でも、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合に比べてより良好な予後を有しており、比較的攻撃性の低い療法を選択すべきである。逆に、前記脊椎動物の体内で腫瘍Ｔ病期が２以下でありかつ／又はフールマン等級が２以下である場合でも、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合に比べてより予後を有しており、より積極的な療法が選択されるべきである。
【００２８】
本明細書で開示されている本発明の態様について以下でより詳しく説明する。
【００２９】
参考文献
略語
本明細書では以下の略語が用いられる。
【００３０】
ａａ − アミノ酸
ＡＥＣ − ３−アミノ−９−エチルカルバゾル
ＡＴＣＣ − アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
ｂｐ − 塩基対
ＣＡ − 炭酸脱水酵素
ＣＡＩ − 炭酸脱水酵素阻害物質
ＣＣＣ − 腎細胞癌腫の明細胞亜型
Ｃｉ − キュリー
Ｃｌ − 信頼区間
ｃｍ − センチメートル
ＣＳ − 累積生存率
Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ − カルボキシル末端
℃ − 摂氏温度
ＤＡＢ − ジアミノベンジジン４塩酸
ｄｓ − ２本鎖
ＥＤＴＡ − エチレンジアミン４酢酸
ＥＬＩＳＡ − 酵素免疫測定法
Ｇｒ − 等級
ＨＲＰ − ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＣ − 細胞内
ＩＦＮ − インターフェロン（サイトカイン例）
ＩＬ−２ − インターロイキン−２（サイトカイン例）
ｋｂ − キロ塩基
ｋｂｐ − キロ塩基対
ｋｄ又はｋＤａ − キロダルトン
Ｍ − モル濃度
ＭＡｂ − モノクローナル抗体
ｍｉｎ − 分
ｍｇ − ミリグラム
ｍｌ − ミリリットル
ｍＭ − ミリモル濃度
ｍｍｏｌ − ミリモル
ｎ − 症例数
ｎｇ − ナノグラム
ｎｍ − ナノメートル
ｎＭ − ナノモル濃度
ｎｔ − ヌクレオチド
Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ − アミノ末端
ＯＲ − オッズ比
ＯＲＦ − 読取り枠
ＰＢＳ − リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ − ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＧ − プロテオグルカン
ｐＩ − 等電点
ＲＣＣ − 腎細胞癌腫
ＲＴ−ＰＣＲ − 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴＵ − そのまま使用可
ＳＤ − 標準偏差
ＳＤＳ − ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＰＳＳ − 「社会科学のための統計パッケージ」
ＳＳＰＥ − ＮａＣｌ（０．１８Ｍ）、リン酸ナトリウム（０．０１Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．００１Ｍ）
Ｓｔｇ − 病期
ＴＭ − 膜貫通
Ｔｒｉｓ − トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
μＣｉ − マイクロキュリー
μｇ − マイクログラム
μｌ − マイクロリットル
μＭ − マイクロモル濃度
ヌクレオチド及びアミノ酸配列記号
本明細書のヌクレオチドを表わすために、以下の記号が用いられる：
塩基記号 意味
Ａ アデニン
Ｃ シトシン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
Ｕ ウラシル
Ｉ イノシン
Ｍ Ａ又はＣ
Ｒ Ａ又はＧ
Ｗ Ａ又はＴ／Ｕ
Ｓ Ｃ又はＧ
Ｙ Ｃ又はＴ／Ｕ
Ｋ Ｇ又はＴ／Ｕ
Ｖ Ａ又はＣ又はＧ
Ｈ Ａ又はＣ又はＴ／Ｕ
Ｄ Ａ又はＧ又はＴ／Ｕ
Ｂ Ｃ又はＧ又はＴ／Ｕ
Ｎ／Ｘ Ａ又はＣ又はＧ又はＴ／Ｕ
各々３つの隣接するヌクレオチド（トリプレットコード又はコドン）の異なる配置により特定され、特定の順序で連結されて特徴的タンパク質を形成する２０の主たるアミノ酸が存在する。本明細書では前記アミノ酸を識別するために以下のように３文字又は１文字の慣例を使用することがある：
アミノ酸名 ３文字略号 １文字略号
アラニン Ａｌａ Ａ
アルギニン Ａｒｇ Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ
システイン Ｃｙｓ Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ Ｑ
グリシン Ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ Ｌ
リジン Ｌｙｓ Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ
プロリン Ｐｒｏ Ｐ
セリン Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ
チロシン Ｔｙｒ Ｙ
バリン Ｖａｌ Ｖ
不明又はその他 Ｘ
【参考文献】
【００３１】
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、患者の体内の腎細胞癌腫（ＲＣＣ）特に腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）の予後診断方法を提供する。本方法には、腎細胞癌腫特にＣＣＣの診断を受けた患者から取出した試料中に存在するＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物がある場合そのレベル及び／又は程度を定量化する工程が含まれる。ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は、ＣＡ ＩＸタンパク質、ＣＡ ＩＸポリペプチド、ＣＡ９核酸、特にＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡなどであり得る。ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物レベルは、ＭＮ／ＣＡ９を発現する細胞の割合（％）を判定する工程を含む、試料中の細胞の数に対して定量化され、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの不在を含めた前記レベルは、患者のより良好な又はより不良な予後と相関される。前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物は好ましくは、患者から取られた試料中で定量されたＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドである。本方法は例えば、療法選択を助け、癌化学療法、腫瘍再発及び転移を監視するために使用することができる。特に、アジュバント療法を必要とするハイリスク患者特に始めからより積極的な療法を必要とする患者を識別するためにＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベルを使用することができる。
【００３３】
患者の試料中のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量化する好ましい方法は、免疫組織化学的染色によるものである。より好ましくは、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出工程（ａ）は免疫組織化学的染色によるものであり、前記定量工程（ｂ）は免疫反応性細胞の割合（％）及び／又は免疫反応性細胞の免疫染色の強度又は程度を判定する工程を含む。さらに一層好ましくは、前記検出工程（ａ）は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体、好ましくは、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有しブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されるＭ７５ＭＡｂの使用を含む。
【００３４】
代替的な好ましい実施形態においては、前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物検出及び定量工程（ａ）及び（ｂ）において本発明の方法に従って用いられるべき好ましい検定は、核酸ベースの検定であり、ここで前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含む。好ましくは、前記検出及び定量工程（ａ）及び（ｂ）はインサイチュハイブリダイゼーション又はノーザンブロットによるものである。
【００３５】
適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、螢光剤、化学発光物質、色原体、酵素基質又は補因子、酵素阻害物質、遊離ラジカル、粒子、染料などといった標識の使用を含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定、酵素免疫学的検定、例えばＥＬＩＳＡ、螢光免疫検定などといった周知のさまざまな検定の中で使用可能である。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号明細書；第３，７９１，９３２号明細書；第３，８１７，８３７号明細書及び４，２３３，４０２号明細書を参照のこと。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態においては、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを発現している試料内の細胞の割合（％）が判定され、かくして１患者についての予後診断と相関される。ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡの発現が測定される場合、試料中の５０％以下の細胞中のＣＡ９ｍＲＮＡ又はＣＡ９ｃＤＮＡの発現がより不良な予後診断を表わす。
【００３７】
さらに、複数の方法を組合せて使用することが可能である。例えばＣＡ ＩＸタンパク質及びＣＡ９ｍＲＮＡ発現の両方を、それぞれに免疫組織化学及びインサイチュハイブリダイゼーションによって査定することができる。好ましい一実施形態は、腎細胞癌腫を患う患者からの腫瘍試料及び対照としての非新生物性腎臓組織の符合試料のスクリーニングによって例示されるであろう。当業者であれば日常的方法を用いて、５０％のカットオフがどこにくるか又は腎細胞癌腫特に腎臓明細胞癌腫を患う患者について異なるタイプの組織試料に関していかにして５０％のカットオフを判定できるかを見極めるために、本発明の検定を最適化することができるであろう。
【００３８】
当業者であれば、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を定量化するためにその他のさまざまな新生物発生前／新生物性試料を使用できるということがわかる。例えば、腎細胞癌腫に罹患している患者の場合、試料は、腫瘍から又は腫瘍に由来する転移病巣から又は腫瘍又は転移病巣の内部又はそのすぐ周囲にある細胞外流体から取ってもよい。
【００３９】
さらに、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を検出し定量化するためには、本明細書で開示されているものに加えて代替的方法を使用できることがわかる。
【００４０】
新生物細胞／組織
本明細書で使用する「癌性」及び「新生物性」という用語は、「前癌状態の」及び「新生物発生前の」という語と同様、同等の意味を有する。
【００４１】
本明細書で使用されている通り、「腎細胞癌腫」又は「ＲＣＣ」は、腎実質の癌腫であると考えられており、同様に腎臓癌、（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓の腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙ）、腎腺癌（ｒｅｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎癌腫（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎腫（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｍａ）、又はグラウィッツ腫瘍（Ｇｒａｗｉｔｚ’ｓ ｔｕｍｏｒ）とも呼ばれる。腎臓明細胞癌腫又は「ＣＣＣ」は、最高約８５％のＲＣＣを含む腎細胞癌腫の優勢の亜型である。ＲＣＣのその他の３つの亜型は、顆粒細胞、顆粒細胞と明細胞の混合及び紡錘細胞亜型である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物はＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原であり、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は、新生物細胞を含む脊椎動物試料、好ましくは哺乳動物試料、より好ましくはヒト試料の中で検出され定量される。かかる試料は、なかでも組織標本、組織抽出物、体液、細胞、細胞溶解物及び細胞抽出物であり得る。例えば免疫組織化学的染色により検定すべき好ましい組織標本としては、細胞塗布標本、生検された組織又は器官からの組織学切片、及びその他の組織試料の中のインプリント調製物が含まれる。免疫組織化学的染色のプロトコルの例が以下の実施例での材料と方法の節で記述されている。かかる組織標本はさまざまな形で維持することができる。例えば、これらを新鮮な状態、凍結状態、又はホルマリン、アルコール又はアセトン又はその他の形で固定させた状態及び／又はパラフィン包埋及び脱パラフィン状態におくことができる。生検された組織試料は、他の生検技術の中でも例えば吸引、咬合、ブラシ、錐体内視鏡的、切除、切開、針、細胞、経皮せん孔及び表面生検によって除去された試料であり得る。好ましい組織試料はホルマリン固定されたパラフィン包埋組織試料である。
【００４３】
検定
本発明の方法と共に使用するため、数多くの形式を適合化することができる。当該技術において一般に知られているその他の検定の中でも、例えばウエスタンブロット法、酵素免疫測定法、放射免疫測定、競合免疫測定、２重抗体サンドイッチ検定、免疫組織化学的染色検定、凝集検定、螢光免疫測定法、免疫金を用いた免疫電子及び走査顕微鏡法を用いて、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドの検出及び定量を実施することができる。かかる検定におけるＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の定量は、当該技術分野において既知の従来の方法により適合化させることができる。例えば検出方法が免疫組織化学的染色によるものである場合ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドの定量は、免疫反応性細胞の割合（％）及び／又は免疫反応性細胞の免疫染色の強度又は程度を判定することによって実施され得、さらに、これらの値の加算又は乗算、又はこれらの値を用いたその他の数学的計算を含むことができる。
【００４４】
免疫学的検定技術の当業者にとっては、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドに対する抗体を用いて、患者の体組織及び／又は細胞内のＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原を検出し定量ができるということは明白である。一実施形態においては、細胞外ドメインを含むＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はポリペプチドに対して作られた標識された抗体を使用できるイムノメトリック検定を用いることができる。かかる検定においては、抗原結合抗体と複合体形成する標識された抗体の量は、試料中のＣＡ ＩＸ抗原の量に正比例する。
【００４５】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質／ポリペプチドを同定するために本発明に従って有用であるモノクローナル抗体は、その他の標識のなかでも、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）といった酵素、螢光化合物、又は１２５Ｉといった放射性同位元素を用いて、任意の従来の要領で標識することができる。本発明に従った好ましい標識は、１２６Ｉであり、好ましい抗体標識方法はクロラミン−Ｔを使用するものである［４７］。同様に好ましいのは、ペルオキシダーゼを用いて抗体を標識する方法である。当業者にとって既知のＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を視覚化する数多くのその他の手段も同様に使用可能である。
【００４６】
免疫組織化学検査例
以下の実施例１中で記述されている免疫組織化学検定では、ＭＮ／ＣＡ ＩＸの分布及び発現パターンを調査するために抗体染色が使用されている。腎摘出術患者からのパラフィン包埋組織切片が脱パラフィン化され再水和され、その後ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体Ｍ７５で染色される。その後切片はマウスＩｇＧを認識するビオチニル化抗体と反応され、その後ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体と反応させられる。免疫ペルオキシダーゼ錯体はその後、四塩酸ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又は３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの色原体で視覚化される。
【００４７】
核酸ベースの検定
本発明のある実施形態においては、ＣＡ ＩＸタンパク質又はＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡが検出され、存在する場合には、ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを発現している試料中の細胞の割合（％）が判定され、かくして患者について予後診断と相関される。核酸ベースの方法の一例はノーザンブロット法であり、ここでＭＮ／ＣＡ９−特異的ｍＲＮＡ発現を検出するためのプローブとして用いられる核酸配列は、ＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡ配列の全て又は一部に相補的である。ＲＮＡの調製は、変性アガロースゲル上で実施され、活性化されたセルロース、ニトロセルロース又はガラス又はナイロン膜などの適切な支持体に移送される。ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するのに用いられる核酸は、放射性標識され、オートラジオグラフィによって分析される。非放射性標識例えばフルオロフォア又はリポータ基例えばジゴキシゲニンなども又、ＭＮ／ＣＡ９ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するために使用可能である。
【００４８】
ＣＡ ＩＸ特異的ｍＲＮＡ発現を測定するための代替的な好ましい方法としては、生物学的試料から単離されたＲＮＡから生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物に対するＭＮ／ＣＡ９ｃＤＮＡ配列から誘導された核酸プローブのハイブリダイゼーションを介したＣＡ９ｍＲＮＡ発現の検出がある。ＣＡ９遺伝子の２４０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを増幅するように設計されたＰＣＲプライマの例としては、センス５’−ＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡ−３’［配列番号１０］；アンチセンス５’−ＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’）［配列番号１１］がある。ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら及びウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは、患者の試料中のＲＴ−ＰＣＲによるＣＡ ＩＸの検出が免疫組織化学と充分相関することを報告している［１０，１１］。
【００４９】
ＭＮ遺伝子及びタンパク質
「ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」及び「ＭＮ／ＣＡ９」という用語はここでは、ＭＮと同義であるものと考えられている。同様にＧ２５０抗原はＭＮタンパク質／ポリペプチドを意味するものとして考えられている［２３］。
【００５０】
ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公開第９３／１８１５２号パンフレット及び／又は国際公開第９５／３４６５０号パンフレットは、ＭＮｃＤＮＡ配列［配列番号１］、ＭＮアミノ酸配列［配列番号２］及びＭＮゲノム配列［配列番号３］を開示している。ＭＮ遺伝子は１１のエキソンと１０のイントロンの形で組織される。
【００５１】
ＭＮｃＤＮＡ［配列番号１］のＯＲＦは、４９．７ｋｄの計算上の分子量をもつ４５９個のアミノ酸タンパク質に対するコード能力を有する。ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の全体的アミノ酸組成はむしろ酸性であり、４．３というｐＩを有することが予測される。２次元電気泳動とそれに続く免疫ブロット法によるＣＧＬ３細胞からの未変性ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の分析は、コンピュータ予測と合致して、ＭＮ／ＣＡ ＩＸが４．７〜６．３の範囲内のｐＩを有する複数の等電性形態で存在する酸性タンパク質である、ということを示した。［ＣＧＬ３細胞は、スタンブリッジ（Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５号、２５２〜２５９頁（１９８２年１月１５日）で報告されたヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ）型の突然変異体ＨｅＬａクローンであるＨｅＬａＤ９８／ＡＨ．２（ＨｅＬａＳとしても知られている）から誘導された発癌性のハイブリットＨｅＬａ線維芽細胞である］。
【００５２】
ＭＮタンパク質の最初の３７個のアミノ酸は、推定上のＭＮシグナルペプチドである［配列番号６］。ＭＮタンパク質は、細胞外ドメイン［アミノ酸（ａａ）３８−４１４；配列番号７］、膜貫通ドメイン［ａａ４１５〜４３４；配列番号８］及び細胞内ドメイン［ａａ４３５〜４５９；配列番号９］を有する。細胞外ドメインは、プロテオグリカン様ドメイン［ａａ５３−１１１；配列番号４］及び炭酸脱水酵素（ＣＡ）ドメイン［ａａ１３５−３９１；配列番号５］を含有する。
【００５３】
ＣＡドメインは、固定独立性の誘発のために不可欠であり、一方腫瘍アンカー及びＩＣテールはその生物学的効果については可欠である。ＭＮタンパク質は同様に、トランスフェクションを受けた細胞内での原形質膜の波打ち運動をひき起こす能力も有し、固体支持体に対するその付着に関与していると思われる。データは、細胞増殖、接着及び細胞内伝達の調節へのＭＮの関与をはっきりと表わしている。
【００５４】
ＭＮタンパク質及びポリペプチド
「ＭＮタンパク質及び／又はポリペプチド」（ＭＮタンパク質／ポリペプチド）という文言はここでは、ＭＮ遺伝子又はそのフラグメントによってコードされるタンパク質及び／又はポリペプチドを意味するものとして定義づけられる。本発明に従ったＭＮタンパク質の例及び好ましいＭＮタンパク質は、配列番号２により表わされている演繹されたアミノ酸配列を有する。好ましいＭＮ／ポリペプチドはＭＮと実質的相同性を有するタンパク質及び／又はポリペプチドである［配列２］。例えば、かかる実質的に相同なＭＮ／ポリペプチドは、好ましくはＭａｂＭ７５又はその等価物であるＭＮ特異的抗体と反応性をもつものである。Ｍ７５Ｍａｂを分泌するＶＵ−Ｍ７５ハイブリドーマは、１９９２年９月１７日付けでＨＢ１１１２８としてＡＴＣＣに寄託された。
【００５５】
「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、ペプチド連結によって共有結合されたアミノ酸鎖であり、ここでは５０個以下のアミノ酸で構成されると考えられている。「タンパク質」はここでは５０個超のアミノ酸から成るポリペプチドであるものとして定義されている。ポリペプチドという用語はペプチド及びオリゴペプチドという用語を包含する。
【００５６】
本明細書で使用される「低ＣＡ ＩＸ」又は「低ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」というのは、ＲＣＣ患者から採取した新生物試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子を発現するという判定を意味する。これに対して、「高ＣＡ ＩＸ」又は「高ＭＮ／ＣＡ ＩＸ」は、ＲＣＣ患者から採取した新生物試料中の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子を発現するという判定を意味する。
【００５７】
インビボで新生物細胞によって産生されるタンパク質又はポリペプチドの配列を、細胞培養中の腫瘍細胞又は形質転換された細胞によって産生されたものから改変させることができる、ということがわかる。かくして、制限無くそのアミノ酸置換、延長、欠失、トランケーション、補間及び組合せを含めた変動するアミノ酸配列をもつＭＮタンパク質及び／又はポリペプチドは、それらを含有するタンパク質又はポリペプチドが免疫原性であり、かかるポリペプチド又はタンパク質により惹起された抗体が、ワクチンとして投与された場合に防御免疫及び／又は抗腫瘍形成活性を提供するのに充分な程度まで天然に発生するＭＮ及びポリペプチドを交叉反応することを条件として、本発明の意図する範囲の中に入る。同様に、体液の中に現存しているタンパク質はタンパク質分解プロセスなどの分解性プロセスを受けるということもわかる。かくして、有意にトランケートされたＭＮ及びＭＮポリペプチドが血清などの体液中に見出される可能性がある。「ＭＮ抗原」という文言は、ここではＭＮ及び／又はポリペプチドを包含するものとして用いられている。
【００５８】
ＭＮ及びポリペプチドのアミノ酸配列を遺伝子技術により修飾できることがさらに理解されるであろう。１つ以上のアミノ酸を欠失又は置換させることが可能である。かかるアミノ酸変更が、タンパク質又はポリペプチドの生物活性の任意の測定可能な変化をひき起こし、本発明の範囲内にあるタンパク質又はポリペプチドならびにＭＮムテインを結果としてもたらす可能性は無い。
【００５９】
核酸プローブ
本発明の核酸プローブは、ＭＮｃＤＮＡ配列［配列番号１］又はその他のＭＮ遺伝子配列例えば完全ゲノム配列［配列番号３］に相補的であるか又は実質的に相補的である配列を含むプローブである。「実質的に相補的な」という文言は、ここでは当該技術分野においてそれが充分理解されている意味を有するものとして定義され、従って標準的ハイブリダイゼーション条件下で使用される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、相補性の精度を制御するように調整可能である。２つの核酸は例えば、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする場合に、互いに実質的に相補的である。
【００６０】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件はここでは当該技術分野においてストリンジェントであると理解されている標準的なハイブリダイゼーション条件に適合するものと考えられている。少なくとも８０〜９０％の相同性を有する非常に密な関係をもつｎｔ配列のみがストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることになる。
【００６１】
例えば、ストリンジェント条件は、例えば２０℃〜５５℃の範囲の温度で０．１５Ｍ〜０．９Ｍの塩などの、５０℃〜７０℃の温度で０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌにより提供されるもののような比較的低塩及び／又は高温条件を包含する。比較的ストリンジェンシーの低い条件は、例えば６５℃で０．１％のＳＳＰＥ及び０．１％のＳＤＳの最終洗浄液を伴う、４２℃の５０％ホルムアミドの存在下で０．１５Ｍ〜０．９ＭのＮａＣｌによって提供されるような、温度上昇が実現するようなハイブリッド２重鎖の不安定化に役立つ漸増量のホルムアミドの添加によって、比較的ストリンジェンシーの高い条件にすることができる。
【００６２】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１．９１及び９．４７〜９．５１頁（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３８７〜３８９頁、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８２年）；ツチヤ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ）ら、Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第７１（６）号、７２１〜７２５頁（１９９１年６月）；及び米国特許第５，９８９，８３８号明細書、米国特許第５，９７２，３５３号明細書、米国特許第５，９８１，７１１号明細書、米国特許第６，０５１，２２６号明細書の中で記述されている。
【００６３】
抗体
「抗体」という用語は、本明細書では、全抗体のみならず抗体の生物活性フラグメント、好ましくは抗原結合領域を含有するフラグメントを含むものとして定義されている。抗体の定義の中にさらに含まれるのは、ＭＮ及びもう１つの組織特異的抗原に対し特異的である２重特異性抗体である。
【００６４】
本発明の方法に従って有用である抗体は、従来の方法及び／又は遺伝子工学により調製してもよい。抗体は、超可変領域を含む軽及び／又は重鎖（ＶＨ及びＶＬ）の可変領域から、そしてさらに一層好ましくはＶＨ及びＶＬの両方の領域から遺伝子工学処理され得る。例えば、本明細書で使用される「抗体」という用語は、その他の可能性の中でも「一価の」抗体を含むポリクローナル及びモノクローナル抗体及びその生物活性フラグメント［４５］；共有結合的、又は非共有結合的のいずれの形で会合されていようとＦａｂ’及びＦ（ａｂ）２フラグメントを含むＦａｂタンパク質；単独の軽鎖又は重鎖、好ましくは可変的重鎖及び軽鎖領域（ＶＨ及びＶＬ）領域そしてより好ましくは超可変的領域を含む領域［その他の場合ＶＨ及びＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている］；Ｆｏタンパク質；複数の抗原を結合する能力をもつ「ハイブリッド」抗体；定常−可変領域キメラ；由来の異なる重鎖及び軽鎖を伴う「複合」免疫グロブリン；２重特異性抗体、好ましくは２重特異性ＭＡｂｓ；標準組換え型技術によってと同時にオリゴヌクレオチド誘導型突然変異誘発技術［４６］によっても調製されるような改善された特異性及びその他の特性をもつ「改変型」抗体、を含んでいる。
【００６５】
本発明に従ったＣＡ ＩＸタンパク質／ポリペプチドを同定するのに有用な抗体は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）といった酵素、螢光化合物、又はその他の標識の中でも１２６Ｉなどの放射性同位元素を用いて任意の従来の要領で標識され得る。本発明に従った好ましい標識は、１２５Ｉであり、抗体を標識する好ましい方法はクロラミン−Ｔを用いたものである［４７］。
【００６６】
本発明に従って有用な代表的モノクローナル抗体には、以前にザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの特許及び特許出願の中で記述されたＭａｂｓＭ７５、ＭＮ９、ＭＮ１２及びＭＮ７が含まれる［米国特許第６，２９７，０４１号明細書、米国特許第６，２０４，３７０号明細書；米国特許第６，０９３，５４８号明細書；米国特許第６，０５１，２２６号明細書；米国特許第６，００４，５３５号明細書；米国特許第５，９８９，８３８号明細書；米国特許第５，９８１，７１１号明細書；米国特許第５，９７２，３５３号明細書；米国特許第５，９５５，０７５号明細書；米国特許第５，３８７，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００３００４９８２８号明細書及び同第２００２０１３７９１０号明細書及び国際公報国際公開第０３／１０００２９号パンフレット］。本発明に従って有用なモノクローナル抗体は、例えば臨床試料中でさまざまな実験室予後診断試験においてＭＮ／ポリペプチドを同定するのに役立つ。例えばモノクローナル抗体Ｍ７５（ＭａｂＭ７５）は、米国組織標準培養収集機関［ＡＴＣＣ］において１９９２年９月１７日付けでＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１１２８として寄託されたマウスリンパ球ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５によって産生される。ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５の産生は、ザバダ（Ｚａｖａｄａ）らの国際公報国際公開第９３／１８１５２号パンフレット中に記述されている。ＭａｂＭ７５は、非グリコシル化ＧＳＴ−ＭＮ融合タンパク質及び非変性ＣＡ ＩＸタンパク質の両方を、ＣＧＬ３細胞中で発現される通りに同等にうまく認識する。Ｍ７５Ｍａｂは、ＣＡ ＩＸタンパク質の未変性形態及び変性形態の両方を認識する［１４］。
【００６７】
抗体の調製を含む本明細書で有用な付加的な分子生物学的技術を記述する一般的なテキストとしては、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）及びキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｎｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．；サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）、第１〜３巻；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．アウサベル（Ａｕｓａｂｅｌ）ら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（２０００年まで補完）；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）、ポール（Ｐａｕｌ）（編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９８年）、及びハーローら、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）が含まれる。
【００６８】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸ及び予後診断；ＲＣＣ療法の選択における使用
低レベルのＣＡ ＩＸ染色はさらに不良な転帰と相関したことから（実施例１）、アジュバント免疫療法及びＣＡ９標的療法を含む積極的療法を必要とするハイリスク患者を識別するために、ＣＡ ＩＸの検出及び定量を使用することができる。さまざまなアジュバント免疫療法に対する入念な患者の選択及び層化が、治療に応答する確率の最も高い患者を区別することができる。転移性ＲＣＣにおける、その他のサイトカインの中でも例えばＩＦＮ又はＩＬ−２などを用いた全身的サイトカイン療法に対する応答が、前途有望なものであった。ブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］からの予備データは、ＣＡ ＩＸと免疫療法応答の関係を示唆している。同様にして、ＣＡ ＩＸに対するモノクローナル抗体に基づく療法又はＣＡ ＩＸベースのＲＣＣワクチンでの免疫療法［１５，１９−２１］又はＣＡ９誘導型遺伝子療法も又、ＣＡ ＩＸの検出及び定量に従って考慮可能である。
【００６９】
さらに、本発明の予後診断方法は、腫瘍等級及び／又は腫瘍病期などの従来のマーカーと組合せてＣＡ ＩＸ検出及び定量を使用することができる。本明細書に開示されている免疫組織化学分析は、高い等級の腫瘍中に低いＣＡ ＩＸが存在する場合そして高い病期の腫瘍中に低いＣＡ ＩＸが存在する場合に、最も低い生存率が見られるということを明らかにした。かかる患者は、より積極的な療法レジメンに対する候補となると思われる。
【００７０】
ＭＮ特異的抗体の治療的使用：
モノクローナル及び／又はポリクローナル、好ましくはモノクローナルのＭＮ特異的抗体は、単独で又はリシンＡなどの化学療法薬及び毒性作用物質と組合せた形で、ＣＡ９発現腎細胞癌腫の治療において治療用に使用することができる。治療的使用のためにさらに好まれるのは、生物活性抗体フラグメントであると思われる。かかる治療的使用のための同じく好ましいＭＮ特異的抗体は、ＭＮ−特異的ヒト化モノクローナル抗体、完全ヒトモノクローナル抗体及び／又は２重特異的抗体であろう。
【００７１】
ＭＮ特異的抗体は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現する腎細胞癌腫に罹患する患者に対して、生理学的に受容可能な非毒性液体ビヒクル中に分散された状態で、治療上有効な量で投与され得る。ＭＮ特異的抗体は単独で、又は抗腫瘍薬の担体として投与され得る。ＭＮ特異的抗体に連結され得るさまざまな抗増殖性、抗新生物性又は細胞傷害性作用物質としては、代謝拮抗物質例えば葉酸拮抗剤、メトトレキサート又はプリン又はピリミジン類似体メルカプトプリン及びフルオロウラシルがある。その他のものとしては、抗生物質、レクチン例えばリジン及びアブリン、毒素例えばジフテリア毒素のサブユニット、放射性核種例えば２１１アスタテン及び１３１ヨウ素、放射線感受性増強物質例えばミザニダゾル又は中性子感受性増強物質例えばホウ素含有有機物質が含まれる。かかる作用物質は、グルタルアルデヒド架橋結合などの従来の技術によって抗体に付着され得る。
【００７２】
ＭＮ特異的抗体を、細胞傷害性細胞（例えばヒトＴ細胞、単球又はＮＫ細胞）をターゲティングするために使用することができる。細胞傷害性細胞は、ＭＮ特異的抗体のＦｃ部分を結合する細胞傷害性細胞上のＦｃレセプタを通して又は２重の特異性をもつ橋かけ抗体すなわちＭＮ及び細胞傷害性細胞に特異的な２重特異性抗体を介して、ＭＮを発現する腫瘍細胞に付着し得る。
【００７３】
細胞傷害性細胞は、２重特異性抗体がその細胞に結合できるようにすることによってターゲティングされ得る。ターゲティングの後、細胞を患者に投与できる。ターゲティングされた細胞での療法は、外科療法、放射線療法又は化学療法に対する補助として使用可能である。
【００７４】
腫瘍ワクチンとしての抗イディオタイプＭＮ特異的抗体及び免疫療法としての抗−抗イディオタイプ抗体血清：ＭＮ抗イディオタイプ抗体は、ＭＮ発現異常に付随する新生物性疾患のためのワクチンとしての治療上の有用性を有する。ＭＮ特異的抗−抗イディオタイプ抗体血清もまた治療的な抗腫瘍効力を有する。これらの治療上の有用性は、以下で記述する研究によって実証されているように、ＭＮ特異的Ｇ２５０ＭＡｂ及びそれに対する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）そしてさらなる抗−抗イディオタイプ血清（Ａｂ３）を用いて行なわれた調査によって実証されている。
【００７５】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｊａｐａｎ）、第１０（３）号、２４１〜２４４頁、（１９９６年）（英語要約）は抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を「免疫グロブリン分子の可変領域内部にある抗原決定基に対して向けられた抗体。正常な抗原を擬態するＡｂ２（いわゆる内部イメージＡｂ２）を公称抗原に対して特異的に宿主の免疫系を誘導するためのワクチン接種用代理抗原として使用することができる」と定義している。
【００７６】
以前にＧ２５０ＭＡｂ−ＮＵＨ３１、５１、７１、８２（ＩｇＧ１）及びＮＵＨ４４（ＩｇＧ２ａ）に対して向けられた６つの内部イメージマウスＡｂ２を単離したウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら（同文献）は、腫瘍ワクチンとしてのモノクローナルＡｂ２の応用について探究している。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは、「ＲＣＣ腫瘍関連抗原に関するイディオタイプワクチン接種が抗原特異的液性ならびに細胞応答を誘導し、・・・ＲＣＣ関連抗原・・・Ｇ２５０［ＭＮ］を擬態する・・・異なる内部イメージＡｂ２で免疫化されたマウスから得た抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）の抗腫瘍効力・・・２×１０５ＳＫ−ＲＣ−５２（Ｇ２５０＋）ＲＣＣ細胞の皮下注射を受けた・・・小さい立証済みの２×１０５のＮＵ１２ヒトＲＣＣ異種移植片（Ｇ２５０＋、２０ｍｍ３）を担持するＮｕ／ｎｕＢＡＬＢ／ｃマウスは、０．２ｍｌのＡｂ３血清の腹腔内注射により処置された。この処置の結果、腫瘍の完全な拒絶及び対照グループ（ｐ＜０．０１）と比べて有意な腫瘍成長阻害がもたらされたという以前の結果」を考慮して調査を行なった。ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）らは「Ａｂ２ｓでの免疫化が免疫応答性動物の体内で強力な抗腫瘍効果を惹起する」という結論を下した。
【００７７】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、第１５９（５）号、（追補）：要約７２４号（１９９８年５月）は、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）のための免疫療法標的としてのＭＮについて記述している。ＭＮ特異的ＭＡｂＧ２５０の治療上の潜在的可能性は、ＩＦＮ／ＩＬ−２／ＭＣＳＦ（インターフェロン、インターロイキン−２、マクロファージコロニー刺激因子）及びＡｂ２（ＮＵＨ８２）誘発マウス血清（Ａｂ３−８２）と組合せた形で評価された。Ａｂ２は、ＲＣＣのための腫瘍ワクチンとして有用であることが示されてきたＭＡｂＧ２５０に対し発生させたモノクローナル抗イデオタイプ抗体である。
【００７８】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）ら（同文献）は、ＮＵＲ−２ＲＣＣ異種移植片を有するマウスが、ＭＣＳＦを伴う／伴わない０．２ｍｌのＡｂ３血清又はサイトカイン及び／又はＭＡｂＧ２５０の腫瘍周囲注射により処置されたことを報告した。ＭＡｂＧ２５０で処置された動物の体内の腫瘍体積は、対照の体内に比べ有意な形で小さいものであった。ＩＦＮ又はＩＬ−２での処置は類似の有効性を示したが、ＭＣＳＦは有意な腫瘍阻害を全く示さない結果となった。ＩＦＮ／ＩＬ−２／ＭＡｂＧ２５０療法は、ＭＡｂＧ２５０又はサイトカイン単療法に比べて、抗腫瘍効果を有意な形で増大させた。さらにＡｂ３ベース（Ａｂ２誘発型）免疫療法は結果として、ＭＡｂＧ２５０又はその他のサイトカイン組合せ療法と比べて多大な腫瘍単剤療法成長阻害をもたらした。
【００７９】
遺伝子療法：さらに、抗−ＣＡ ＩＸモノクローナル抗体などのＣＡ ＩＸ特異的分子を、（例えば野生型フォン・ヒッペル−リンドラ遺伝子での）遺伝子療法用のＣＡ ＩＸ特異的発現細胞に対するターゲティングされた送達のため、又は細胞傷害性タンパク質の発現をもたらすためベクターにカップリングさせることができた。
【００８０】
かかる方法は、ＭＮ／ＣＡ９が低酸素状態が調節された遺伝子であることから、診断及び予後診断上特に重要なものであり得る。ＣＡ ＩＸ過剰圧力と組合された低酸素状態は、その試料を取った哺乳動物がより不良な予後診断を有するものと考えられるということを表わしており、前記哺乳動物のための治療についての決定が前記低酸素条件の存在を考慮して下される。低酸素状態マーカーとしてのＭＮ／ＣＡ ＩＸは一般に療法決定を行なう上で有用である。例えば、異常なほどに高レベルであるＭＮ／ＣＡ ＩＸを発現することがわかっている腫瘍を有する癌患者は、一部のタイプの化学療法及び放射線療法の候補ではなく低酸素状態選択的化学療法に対する候補であろう。
【００８１】
ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）［４８］は、１５７頁目で、「充実性腫瘍が正常の組織に比べて酸素化度がはるかに低い」ということを指摘している。このことから、放射線療法及び抗癌化学療法に対する耐性ならびに腫瘍転移の増加に対する素因が導かれる。ブラウンは、癌治療において腫瘍低酸素状態をいかに利用できるかを説明している。ブラウン［４８］が提案している癌治療のための腫瘍低酸素状態利用の１つの戦略は、低酸素状態下でのみ毒性を示す薬物を使用することにある。この戦略の下で使用可能な好ましい薬物及び薬物例としては、チラパザミン及びミトザントロンのジ−Ｎ−オキシド類似体であるＡＱ４Ｎが含まれる。
【００８２】
ブラウン［４８］によって提案されている低酸素状態の第２の様式は、ＨＩＦ−１の選択的誘発を利用するべく開発された遺伝子療法戦略によるものである。好ましくは、以上で言及されている遺伝子療法ベクターには、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ低酸素状態応答要素（ＨＲＥ）又はもう１つの遺伝子のＨＲＥを含むＭＮ／ＣＡ ＩＸプロモータ又はＭＮ／ＣＡ９プロモータフラグメントが含まれ、より好ましくはここでＣＡ ＩＸプロモータ又はＣＡ ＩＸプロモータフラグメントは２つ以上のＨＲＥを含み、ここで前記ＨＲＥは、ＭＮ／ＣＡ９のものであるかかつ／又はその他の遺伝子のものであるかかつ／又は好ましい状況下では遺伝子工学処理されたＨＲＥコンセンサス配列のもののいずれかである。
【００８３】
ブラウンは、ＨＩＦ−１に対する応答性がきわめて高いプロモータが低酸素状態ではあるものの正常有酸素状態である条件下で条件付きで致死的な遺伝子の発現を駆動することになるような腫瘍特異的送達系を開発することができると指摘している。ＭＮ／ＣＡ９プロモータはまさに、１つ以上のＨＲＥを含むＭＮ／ＣＡ９プロモータフラグメントと同様に、低酸素状態に対する高い応答性をもつこのようなプロモータである。「通常ヒトの体内に発見されない酵素の発現は、低酸素状態応答性プロモータ［ＭＮ／ＣＡ９プロモータ］の制御下で、腫瘍中で非毒性プロドラッグを毒性薬物へと転換することができた；［ブラウン［［４８］、１６０頁］。例としては、トリン（Ｔｒｉｎｈ）ら［４９］に対しブラウンにより引用された非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に転換する細菌シトシンデアミナーゼの使用がある。
【００８４】
ラットクリフ（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ）らの米国特許第５，９４２，４３４号明細書及び６，２６５，３９０号明細書は、低酸素状態の下で抗癌薬物がいかにして活性化された状態となるか（ただし、薬物を活性化させる酵素が低酸素状態の下で著しく増加するような薬物活性化系を使用した結果として、治療効果がはるかに増強される）を説明している。
【００８５】
コンピュータ化されたＭＮ／ＣＡ ＩＸデータ解析：
ＭＮ／ＣＡ９発現（例えばレベル及び／又は程度）とＲＣＣ予後診断の相関関係は、当業者にとって既知のあらゆる方法によって、例えばコンピュータプログラムによって分析可能である。かかるコンピュータプログラムは、確率の高い予後診断と腎細胞癌腫患者から誘導されたＣＡ９発現データを相関させるためのアルゴリズムを含むことができるであろう。
【００８６】
以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる形であれ本発明を限定する意図をもつものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１
以下の実験は、ＭＮ／ＣＡ ＩＸを予後診断用マーカーならびに診断マーカーとしてＲＣＣ特にＣＣＣにおいて使用できるか否かを調査するために設計された。９２名の患者からの腎摘出術標本をこの研究の中で使用した。これらのうちの８０例が腎細胞癌腫であり、１０例が腺腫であり、２例が好酸性顆粒細胞腫であった。腎細胞癌腫のうち６７が明細胞癌腫（ＣＣＣ）であった。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体（Ｍ７５）を用いた免疫組織化学的分析が、パラフィン包埋標本について実施された。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色を腫瘍病期、等級、リンパ節転移、遠隔転移及び累積生存期間と相関させた。
【００８８】
ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、明細胞癌腫の９１．２％に存在していた。低い染色は予後不良因子であり、逆に高い染色は良好予後因子であった。ＭＮ発現は、Ｔ病期及び等級と比べ最良予後因子であることがわかった。低等級・病期腫瘍においてさえ、低いＭＮ発現の存在は、生存期間の短縮と相関していた。
【００８９】
本明細書で開示されている研究からの結論は、ＭＮがＲＣＣ特にＣＣＣにおける有意な分子マーカーであるということである。ＭＮ発現の低下は低い生存率と独立して結びつけられる。ＭＮは、臨床的転帰を予測し、アジュバント免疫療法及びＭＮ標的療法を必要とするハイリスク患者を識別するために使用可能である。
【００９０】
材料と方法
Ｃｕｋｕｒｏｖａ大学病理学部の保管所から得た８０例のＲＣＣ症例、１０例の腎腺癌と２例の腎臓好酸性顆粒細胞腫症例に由来する腎摘出標本の試料を評価した。全ての患者は１９９６年〜２００３年の同じ大学病院の泌尿器科で手術を受けた。各症例の組織学的スライドを診断的に再度査定するべく再検討した。フールマン核等級付けシステム［１３］に従って等級付けを実施した。
【００９１】
ホルマリン固定させ、パラフィン包埋した組織試料の厚み５μｍの切片を脱パラフィン化し、一連の等級付けされたアルコールを通して再水和させた。マイクロ波オーブン内で１０分間、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で抗原検索を実施した。２０〜２５分間、これらを休ませて室温まで冷却させた。５分間ＰＢＳ中でスライドを洗浄した後、１０分間遮断用血清と共にインキュベーションを行なった。その後、室温で６０分間１／３００の濃度でＭＮ／ＣＡ ＩＸの外部ドメインに対して発生させたマウスモノクローナル抗ヒト抗体（Ｍ７５）を適用した［１４］。ＰＢＳ中で５分間スライドを洗浄した後、これらを２０分間、そのまま使用可能なビオチニル化された万能２次抗体の中で２５℃でインキュベートした（ＮＣＬ−ＲＴＵ−Ｄ、Ｎｏｖａｃａｓｒｔａ、英国）。その後スライドを５分間ＰＢＳ中で洗浄し、次に１０分間ＲＴＵトストプトアピジン／ベルオキシダーゼ複合試薬の中で２５℃でインキュベートした。インキュベーションの後、スライドを再び５分間ＰＢＳで２回洗浄した。免疫ペルオキシダーゼをＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾル；ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）で視覚化した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで切片を対比染色し、次にカバースリップを置いた。負の対照として全ての染色手順内でイソタイプ抗体を使用した。
【００９２】
単一切片の全フィールド内に見られる陽性細胞の割合（％）に基づいて、半定量的に免疫組織学的結果を評定した。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原は膜関連タンパク質である。従って、細胞が鮮明で明確な膜染色を示した時点で、それはＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性をもつものと解釈された。０〜２＋の尺度（リアオ（Ｌｉａｏ）ら［１２］により記述されている通り染色された場合、完全に陰性は０、５０％以上の細胞が染色された場合１＋焦束、５０％未満の細胞が染色された場合２＋拡散）。染色パターンは、それぞれ強度が０〜１＋及び２＋である場合に高及び低発現のものとみなされた。全ての標本が２名の病理学者によりブラインド検査された。２人の間の観測者間信頼度は８８％であった。
【００９３】
ウィンドウズ（登録商標）バージョン１０．０用のＳＰＳＳ（もとは「社会科学のための統計パッケージ」）を統計分析のために使用した。独立したグループ間のＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色レベルの差をカイ２重又はフィッシャの直接確率検定によって評価した。累積生存率を推定するためにはカプラン・マイヤー法を使用し層別生存率関数を比較するためには対数−順位検定を応用した。ＭＮ／ＣＡ ＩＸの統計的独立性及び有意性を試験するためには、コックス比例ハザードモデルを使用した（モデル内で、従属変数として年令、等級、Ｔ病期及びＭＮ／ＣＡ ＩＸを使用した）。平均ＩＳＤ（標準偏差）、ｎ（症例数）及び割合（％）としてデータを表現した。０．０５未満のｐ値は有意とみなされた。
【００９４】
結果
合計９２の標本のうち、８０はＲＣＣであり、ＲＣＣのうち６７は明細胞亜型（ＣＣＣ）、１０は乳頭癌、３は色素嫌性癌であった。残りの１２は、１０の腺癌及び２の好酸性顆粒細胞腫から成っていた。
【００９５】
８０のＲＣＣのうち、６例のＣＣＣを含めた１０例は染色を全く示さなかった。従ってＲＣＣ腫瘍標本内のＭＮ発現は８７．５％であった。染色を示したもののうち、３１例が５０％未満の染色を示し、そのうち２５例はＣＣＣであった。３９のＲＣＣつまり３６例のＣＣＣと３例の乳頭癌は５０％超の染色を示した。［免疫組織化学的染色例は、乳頭癌腫において高いＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色パターン（図１）をそして明細胞癌腫において強度の膜質染色（図２）を示した］。１０の腺癌のうちいずれも染色を示さなかった。２つの好酸性顆粒細胞腫のうち、１例は染色せず、その他は５０％未満の染色を示した（表１）。
【表１】
【００９６】
全体として、明細胞型を伴う６７のＲＣＣ患者が分析に含み入れられた。外科手術時の患者の年令は１８〜８１才の範囲であった（平均５４．８±１１．６才）。女性／男性比は１．９：１であり、男性患者が４４名（６５．７％）、女性患者が２３名（３４．３％）であった。６２名の患者（９２．５％）に対し根治的腎摘出術が実施され、５名（７．５％）に対し部分的腎摘出術が実施された。病理学的病期に関しては、２２名が病期Ｉ、３１名が病期ＩＩ、８名が病期ＩＩＩそして６名が病期ＩＶであった。病理学的等級に関しては、２４名が等級１（３５．８％）、２０名が等級２（２９．９％）、１６名が等級３（２３．９％）そして７名が等級４の症例であった（１０．４％）。表２は、患者と腫瘍の特徴を列挙している。
【表２】
【００９７】
ＣＣＣにおける染色パターンと腫瘍の病理学的Ｔ及びＮ病期、Ｍ病期及び等級の関係を評価し、結果は表３に示されている。低病期Ｔの腫瘍は６６％の症例において高いＣＡ ＩＸ染色を示し、一方高い病期Ｔの腫瘍は、大部分が低いＣＡ ＩＸ染色を示した（９２．９％）。いかなるリンパ節転移も存在しなかった場合、５７．１％の症例で高い染色パターンが存在した、一方リンパ節転移を伴う場合、低パターンのＣＡ ＩＸ染色が全（１００％）症例に見られた。全体のうち、６３名の患者が遠隔転移を全くもたず、そのうち３６（５７．１％）が高パターンのＣＡ ＩＸ染色を示した。遠隔転移を有する４名（１００％）の患者の全てが低パターンのＣＡ ＩＸ染色を示した。低等級（１又は２）の腫瘍は最も高いＣＡ ＩＸ染色（７１．１％）を有し、一方高等級（３又は４）の腫瘍は大部分が低いＣＡ ＩＸ染色（８１．８％）を有していた（表３）。
【表３】
【００９８】
ＣＣＣ患者のうち、６名は追跡調査ができなかった。Ｔ病期、等級及びＣＡ ＩＸ発現に従った６１名の残りの患者の平均及び中央値累積生存率が表４及び図３ａ、ｂ、ｃ、４及び５の中で詳細に記されている。高いＣＡ ＩＸ発現、平均累積生存率は６４．１カ月であった。等級が考慮された場合、低等級グループ内で平均累積期間は５３．５カ月であった；しかしながら低等級腫瘍内で低いＣＡ ＩＸ発現が存在した場合、生存率は２８．７カ月まで下降した。類似の要領で、低いＴ病期の腫瘍中の４９．４カ月という累積生存率は、かかる低等級腫瘍が低レベルのＣＡ ＩＸ染色を示した時点で２８．７カ月まで低下した。累積生存率は、腫瘍のＴ病期（ｐ＝０．０２）及び等級（ｐ＝０．００６）と共にＣＡ ＩＸ染色レベル（ｐ＝０．０００）と相関していた。
【表４】
【００９９】
逆に、高腫瘍等級患者は２２．６カ月の生存率を有していたが、高等級腫瘍内でＣＡ ＩＸ染色が高い場合、生存率は６１カ月にはね上った。高病期−高ＣＡ ＩＸ発現グループにおいては、１名の患者しかおらず、その患者は８カ月生存したことから、類似の結論に到達することはできなかった。
【０１００】
コックス比例ハザードモデルの結果は、表５に示されている。結果は、ＣＡ ＩＸがＲＣＣ患者中の生存速度と関係性をもつ独立した有意な因子であることを示している。
【表５】
【０１０１】
結論
８０例のＲＣＣのこの研究において、ＣＡ ＩＸ染色は８７．５％であったが、これは以前の報告書［７］と一貫性ある値である。ＣＣＣのグループでは、染色は９１％であったが、これはＣＡ ＩＸが特にＲＣＣの明細胞亜型について強いバイオマーカーであることを示唆している。ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら［１０］は、ＣＣＣ内のＣＡ ＩＸ発現が９２％であることを発見した。この率はブイ（Ｂｕｉ）ら［１５］によって９４％であるものと報告された。
【０１０２】
その予後診断値に関しては、低レベルのＣＡ ＩＸ染色は、さらに不良な転帰と相関していた。高いＴ病期腫瘍は低いＣＡ ＩＸ発現（９２．９％）を有していた。症例のうち４例のみがリンパ節転移を有していたとしても、これらの症例は全て低レベルのＣＡ ＩＸ染色を有していた。遠隔転移に関しては、全てが低いＣＡ ＩＸ発現を再び有し、一方、転移を、全く伴わない症例の４２．９％のみが同じパターンで染色した。再び高腫瘍等級で、高い率の低ＣＡ ＩＸ発現（８１．８％）が存在した。累積生存率を腫瘍等級、病期及びＣＡ ＩＸ発現と相関させた場合、ＣＡ ＩＸ発現は、少なくともＴ病期及び腫瘍等級と同じ位優れた生存率達成因子であった。患者の数が不充分であったことから、Ｎ及びＭ病期に起因する生存率は推定できなかった。
【０１０３】
対象研究グループ内の全体的生存率は、文献［１］中に報告されているものよりも低い。これも又、数の少なさならびに場合によっては患者の社会経済状態に起因している可能性がある。
【０１０４】
低いＣＡ ＩＸ、高い病期及び高い腫瘍等級のグループの全てにおいて、生存率は類似のものであった（それぞれ１９．３、２２．６、２３．６カ月）。しかしながら、高等級腫瘍内に低ＣＡ ＩＸ（１５．５カ月）及び高病期腫瘍内に低ＣＡ ＩＸ（２０．３カ月）が存在する場合、最低の生存率しか見られなかった。従って、より積極的な療法レジメンを立証するためにはこれらの患者サブセットを予測することがきわめて重要である。
【０１０５】
ＲＣＣは生物学的免疫療法に応答することが示されてきた。転移性ＲＣＣにおける全身的サイトカイン療法に対する応答は、全体的結果がなおも不適切であるものの、前途有望である。さまざまなアジュバント免疫療法に対する入念な患者の選択及び層化により、治療に応答する確率の最も高い患者を区別することができる。
【０１０６】
結論として、本明細書ではＭＮ／ＣＡ ＩＸはＲＣＣ／ＣＣＣの予後診断における有意でかつ前途有望な分子マーカーであることが示されている。ＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現の低下は低い生存率と独立して結びつけられる。臨床的帰結及び腫瘍の挙動を予測するためにＭＮ／ＣＡ ＩＸを使用することが可能である。ＭＮ／ＣＡ ＩＸは、上述のものによって例示されているように、その他の療法の中でもアジュバント免疫療法及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ標的療法の恩恵を受け得るハイリスク患者を識別することができる。
【０１０７】
ブダペスト条約寄託物
以下に列挙する材料は、現在１０８１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓｕｓ、バージニア州２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。該寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれた。成育可能な培養の維持は、寄託年月日から３０年間保証されている。ハイブリドーマ及びプラスミドは、ブダペスト条約の条項に基づいてＡＴＣＣによって利用可能となり、当該出願からの特許の付与の時点で寄託されたハイブリドーマ及びプラスミドの無制限の利用可能性を公衆に保証するＡＴＣＣと出願人らの間の合意の対象となる。寄託された菌株の利用可能性は、その特許法に従ってあらゆる政府の権限に基づき付与される権利を侵害して本発明を実施するための許諾としてみなされるべきものではない。
【表６】
【０１０８】
同様にして、Ｖ／１０のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系列Ｖ／１０−ＶＵは、受託番号ＬＭＢＰ６００９ＣＢの下でＵｎｉｖｅｒｓｅｉｔ Ｇｅｎｔ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５、Ｂ−９０００ Ｇｅｎｔ、ベルギーにあるＬａｂｅｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｉｅ （ＬＭＢＰ） Ｂｅｌｇｉｕｍ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＢＣＣＭ） ［ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ］の国際寄託当局（ＩＤＡ）にブダペスト条約に基づいて２００３年２月１９日付けで寄託された。
【０１０９】
本発明の前述の実施形態の記述は、例示及び説明を目的として提示された。これらは網羅的であるように又は本発明をまさに開示されている通りの形態に限定するように意図されておらず、明らかに上述の教示に照らして数多くの修正及び変更が可能である。実施形態は、本発明の原理及びその実践的応用を説明し、かくして当業者がさまざまな実施形態の中でかつ考慮されている特定の用途に適するようなさまざまな修正を伴って本発明を利用できるようにする目的で選択され記述されたものである。
【０１１０】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】腎臓乳頭癌腫における高パターンのＭＮ／ＣＡ ＩＸ染色を示す［ＭＮ／ＣＡ ＩＸ×１００］。
【図２】腎臓明細胞癌腫（ＣＣＣ）に見られる強度の膜質染色を示す［ＭＮ／ＣＡ ＩＸ×２００］。
【図３】Ｔ病期（ａ）、腫瘍等級（ｂ）及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現（ｃ）に基づく６１ＣＣＣ患者の累積生存率（ＣＳ）をグラフで示す。
【図４】Ｔ病期及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に基づく６１人のＣＣＣ患者のＣＳをグラフで示す。
【図５】腫瘍等級及びＭＮ／ＣＡ ＩＸ発現に基づく６１人のＣＣＣ患者のＣＳをグラフで示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物を冒す腎細胞癌腫の予後診断方法であって、該方法が、
（ａ）前記脊椎動物から採取した新生細胞を含む試料中におけるＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が前記試料中に存在する場合、前記試料中の細胞数に対する前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量する工程、及び
（ｃ）前記工程（ａ）及び（ｂ）で得たＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを示す場合に、前記脊椎動物がより不良な予後を有するものと判定する工程、を含み、
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が
（１）配列番号１のコード領域、
（２）配列番号１のコード領域の相補体に対して４２℃で５０％のホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
（３）遺伝子コードの縮重のためコドン配列において前記（２）のヌクレオチド配列又は配列番号１のコード領域と異なるヌクレオチド配列、より成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記腎細胞癌腫が、腎臓明細胞癌腫、乳頭細胞癌腫及び色素嫌性癌腫より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程（ａ）が、前記試料中のＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の有無を検出するためにＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的抗体を用いた免疫組織化学的染色の使用を含み、さらに、前記定量工程（ｂ）がＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）を判定する工程を含み、前記試料中の細胞の５０％以下が免疫反応性を有する場合に、前記脊椎動物は前記試料中の細胞の５０％超が免疫反応性を有する場合よりも不良な予後を有すると前記工程（ｃ）において結論付けることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチド、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、又は前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程（ａ）が、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有するハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されたモノクローナル抗体の使用を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程（ａ）が免疫組織化学的染色によるものであり、前記定量工程（ｂ）が免疫反応性細胞の割合（％）及び／又はその免疫染色の強度及び／又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記脊椎動物を冒す前記腎細胞癌腫に対する治療の選択を補助するものとして用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記脊椎動物における腫瘍Ｔ病期が３以上でありかつ／又はフールマン等級が３以上である場合でも、前記試料中の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合よりも良好な予後を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記脊椎動物における腫瘍Ｔ病期が２以下でありかつ／又はフールマン等級が２以下である場合でも、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合よりも不良な予後を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記腎細胞癌腫が３以上のＴ病期及び／又は３以上のフールマン等級を有する場合であって、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを前記定量工程（ｂ）が示した場合、前記脊椎動物はより積極的な治療レジメンで治療されるべきであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１】
脊椎動物を冒す腎細胞癌腫の予後診断方法であって、該方法が、
（ａ）前記脊椎動物から採取した新生細胞を含む試料中におけるＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物の有無を検出する工程、
（ｂ）ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が前記試料中に存在する場合、前記試料中の細胞数に対する前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度を定量する工程、及び
（ｃ）前記工程（ａ）及び（ｂ）で得たＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物のレベル及び／又は程度が、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを示す場合に、前記脊椎動物がより不良な予後を有するものと判定する工程、を含み、
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が
（１）配列番号１のコード領域、
（２）配列番号１のコード領域の相補体に対して４２℃で５０％のホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
（３）遺伝子コードの縮重のためコドン配列において前記（２）のヌクレオチド配列又は配列番号１のコード領域と異なるヌクレオチド配列、より成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記腎細胞癌腫が、腎臓明細胞癌腫、乳頭細胞癌腫及び色素嫌性癌腫より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程（ａ）が、前記試料中のＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質の有無を検出するためにＭＮ／ＣＡ ＩＸ特異的抗体を用いた免疫組織化学的染色の使用を含み、さらに、前記定量工程（ｂ）がＭＮ／ＣＡ ＩＸ免疫反応性細胞の割合（％）を判定する工程を含み、前記試料中の細胞の５０％以下が免疫反応性を有する場合に、前記脊椎動物は前記試料中の細胞の５０％超が免疫反応性を有する場合よりも不良な予後を有すると前記工程（ｃ）において結論付けることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物が、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチド、ＭＮ／ＣＡ ＩＸタンパク質又はＭＮ／ＣＡ ＩＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、又は前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程（ａ）が、受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１１２８を有するハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５により分泌されたモノクローナル抗体の使用を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程（ａ）が免疫組織化学的染色によるものであり、前記定量工程（ｂ）が免疫反応性細胞の割合（％）及び／又はその免疫染色の強度及び／又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記脊椎動物を冒す前記腎細胞癌腫に対する治療の選択を補助するものとして用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記脊椎動物における腫瘍Ｔ病期が３以上でありかつ／又はフールマン等級が３以上である場合でも、前記試料中の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合よりも良好な予後を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記脊椎動物における腫瘍Ｔ病期が２以下でありかつ／又はフールマン等級が２以下である場合でも、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合、前記脊椎動物は、前記試料内の細胞の５０％超がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現している場合よりも不良な予後を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記腎細胞癌腫が３以上のＴ病期及び／又は３以上のフールマン等級を有する場合であって、前記試料中の細胞の５０％以下がＭＮ／ＣＡ９遺伝子発現産物を発現することを前記定量工程（ｂ）が示した場合、前記脊椎動物はより積極的な治療レジメンで治療されるべきであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２８７３７（Ｐ２００７−５２８７３７Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０３１２２（Ｐ２００７−５０３１２２）
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５５８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８６２３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６３０７２３４）バイエル ヘルスケア (7)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月４日（２００５．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５５８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８６２３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６３０７２３４）バイエル ヘルスケア (7)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]