ＭＹＢＬ２ペプチドおよびそれを含むワクチン
本明細書では、がんに対するペプチドワクチンについて記載する。特に、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、ＭＹＢＬ２遺伝子に由来するエピトープペプチド、より具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するペプチドおよびその断片を提供する。本発明はさらに、前述のペプチドまたは断片に対して１個、２個、または数個のアミノ酸の、挿入、置換、または付加を含むペプチドにも、それらが細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を保持しているという条件で、拡大適用される。また、前述のペプチドのいずれかをコードする核酸、抗原提示細胞、およびそのようなペプチドを標的とする単離されたＣＴＬ、ならびに前述のペプチド、核酸、およびＡＰＣのいずれかを有効成分として含む薬学的な剤および組成物も提供される。本発明の構成要素は、がん（腫瘍）の治療および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（すなわち、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ））ならびに／または術後のその再発の予防に関連して特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２００９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２６６，８７１号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されており（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）、これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床開発の前進が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のペプチドを用いる、いくつかの臨床試験が報告されている。残念ながら、現在のがんワクチンの治験の大半では低い客観的奏功率しか観察されていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡの必要性が依然として存在している。
【０００５】
ｃ−ｍｙｂがん原遺伝子プローブを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、ＭＹＢＬ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、すなわちｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルスがん遺伝子ホモログ（鳥類）様２(ｖ−ｍｙｂ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇ (ａｖｉａｎ)−ｌｉｋｅ２)は、転写因子遺伝子のＭＹＢファミリーのメンバーとして同定された（非特許文献１４／Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089）。ＭＹＢＬ２は、細胞周期の進行ならびにＣＤＫ２−サイクリンＡおよびＣＤＫ２−サイクリンＥ複合体によるサイクリン駆動性のリン酸化を調節することが公知である（非特許文献１５／Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9):1855-64、非特許文献１６／Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53、非特許文献１７／Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536、非特許文献１８／Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17;274(51):36741-9）。最近の報告から、Ｍｉｐ／ＬＩＮ−９がＭＹＢＬ２の発現を調節すること、ならびに両タンパク質がＳ期およびＭ期のサイクリンの制御によって細胞周期進行の促進において重要な役割を果たすことが示された（非特許文献１９／Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5;282(1):168-75）。さらに、遺伝子２３，０４０個を含む網羅的ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイル解析によって、ＭＹＢＬ２は、例えば、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むいくつかのがんにおいて上方制御されている新規な分子として同定された（特許文献１／ＵＳ ６０／９３７，６１６、特許文献２／ＷＯ ２００４／０３１４１０）。ＭＹＢＬ２は新規な腫瘍抗原であり、ＭＹＢＬ２に由来するエピトープペプチドは、いくつかのタイプの腫瘍に罹患した患者のためのがん免疫療法に応用可能であり得るとみなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ ６０／９３７，６１６
【特許文献２】ＷＯ ２００４／０３１４１０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089
【非特許文献１５】Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9):1855-64
【非特許文献１６】Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53
【非特許文献１７】Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536
【非特許文献１８】Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17;274(51):36741-9
【非特許文献１９】Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5;282(1):168-75
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、免疫療法の適切な標的の発見に一部基づいている。一般にＴＡＡは「自己」として免疫系に認識され、したがって、免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的の発見は極めて重要である。上記のように、ＭＹＢＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の遺伝子にコードされるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんなどのがんの組織において上方制御されていることが確認されている。したがって、ＭＹＢＬ２はがん／腫瘍免疫療法の候補標的である。
【０００９】
本発明は、ＭＹＢＬ２に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を有する、ＭＹＢＬ２の特異的エピトープペプチドの同定に少なくとも一部基づいている。下記に詳述するように、健常なドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ２結合候補ペプチドを用いて刺激した。各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対して特異的な細胞傷害作用を有するＣＴＬ株を樹立した。したがって、これらの結果から、これらのペプチドが、ＭＹＢＬ２を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導できるＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証される。したがって、これらの結果から、ＭＹＢＬ２は免疫原性が強く、かつそのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが実証される。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチド、すなわちＭＹＢＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）またはその断片を提供することである。本発明のペプチドはＣＴＬ誘導能を有することが予測され、したがって、ＣＴＬをエクスビボで誘導するために用いることができ、または例として、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。好ましくは、ペプチドは、ノナペプチドまたはデカペプチド、およびより好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特に、特に強いＣＴＬ誘導能を有することが本明細書において示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するノナペプチドまたはデカペプチドである。
本発明は、改変ペプチドが本来のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列を有する改変ペプチドを意図する。さらに、本発明は、本発明のペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドと同様に、ＣＴＬ誘導能を有する抗原発現細胞（ＡＰＣ）を誘導するために用いることができ、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１１】
対象に投与された場合、本発明のペプチドはＡＰＣの表面に提示されて、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。したがって、本発明の１つの目的は、ＣＴＬを誘導するために本発明の任意のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む剤を提供することである。さらに、これらのペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む剤、物質、または組成物は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のために使用され得る。したがって、本発明のさらに別の目的は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む、がんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤を提供することである。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはそれらに加えて、本発明の剤または薬剤は、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを有効成分として含んでよい。
【００１２】
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面に提示するＡＰＣを誘導するために使用され得る。このようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法に有用である。したがって、本発明の別の目的は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそれらの方法によって得られるＡＰＣを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＣＤ８陽性細胞を、本発明のペプチドを自身の表面に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法を提供することである。このような方法によって得られるＣＴＬもまた、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防に使用される。したがって、本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られるＣＴＬを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ＭＹＢＬ２もしくはその断片、ＭＹＢＬ２をコードするポリヌクレオチドもしくはその断片、またはＭＹＢＬ２もしくはその断片を提示するエキソソームもしくはＡＰＣを含む剤または組成物を投与する段階を含む、がんに対する免疫応答を必要とする対象においてこれを誘導するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明の適用範囲は、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんを含む、ＭＹＢＬ２過剰発現に関係するか、またはＭＹＢＬ２過剰発現に起因するいくつかの疾患のいずれかに及ぶ。
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたオリゴペプチドであって、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、オリゴペプチド、
［２］ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたオリゴペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が挿入、置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたオリゴペプチド、
［３］以下の特徴の一方または両方を有する、［２］記載のオリゴペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンより選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンより選択される、
［４］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、［１］〜［３］のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド、
［５］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド、
［６］［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［７］ＣＴＬを誘導するための剤であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種または［６］記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、剤、
［８］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種または［６］記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、薬剤、
［９］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、［８］記載の薬剤、
［１０］がんを治療するために製剤化される、［８］または［９］記載の薬剤、
［１１］以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣと［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボで接触させる段階、または
（ｂ）［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１２］以下の段階のうちの少なくとも１つを含む方法のいずれかによって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階、
［１３］ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１４］［１１］記載の方法によって誘導される、［１３］記載のＡＰＣ、
［１５］［１］〜［５］のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ、
［１６］［１２］記載の方法によって誘導される、［１５］記載のＣＴＬ、ならびに
［１７］対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチド、免疫学的に活性なその断片、またはオリゴペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドを含む剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【００１５】
本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＭＹＢＬ２由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法の結果を示す一連の写真（ａ）および（ｂ）から構成される。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号８番のＣＴＬ（ａ）は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェルを囲む四角は、対応するウェルに由来する細胞を増殖させてＣＴＬ株を樹立したことを示す。一方、陰性データの典型的な例として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからは特異的なＩＦＮ−γ産生は検出されなかった（ｂ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２】図２は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法の結果を示す折れ線グラフである。結果から、ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈によって樹立したＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフである。結果から、ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】図４は、ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＭＹＢＬ２遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立したＣＴＬクローンは、ＭＹＢＬ２とＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒の菱形）。これに対して、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角形）またはＭＹＢＬ２（円）のいずれかを発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００１８】
本明細書において言及される出版物、特許、または特許出願それぞれの開示は、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示のためだけであり、制限することを意図するものではない。
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２０】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾された１個のＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００２１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
本明細書で互換的に使用する「剤」および「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。「薬学的剤」および「薬学的組成物」に関して使用される場合、そのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の文脈において、「薬学的剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の産物を指す。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、ポリファーマコフォアにスキャフォールドされた対象をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００２２】
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的または生理学的に活性である、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物において、「有効成分」とは、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防において使用するための薬学的な剤または組成物の場合、それらの剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／またはがん組織に対する少なくとも１種の生物学的作用または生理学的作用を、直接的にまたは間接的にもたらすことができる。好ましくは、そのような作用は、がん細胞の増殖を低減または阻害すること、がん細胞および／またはがん組織に傷害を与えるかまたは殺傷することなどを含んでよい。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識するか、または殺傷するＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「活性成分」は、「バルク」、「原薬」、または「原体」とも呼ばれる。
【００２３】
特記しない限り、「がん」という用語は、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されない、ＭＹＢＬ２遺伝子を過剰発現しているがんを指す。
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」と言う用語は本明細書において互換的に使用され、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
特記しない限り、「ＨＬＡ−Ａ０２」という用語は、ＨＬＡ−Ａ＊−０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊−０２０６などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２タイプを指す。
【００２４】
本発明の材料および方法ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＭＹＢＬ２遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００２５】
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが意図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
本明細書において対象または患者との関連において使用される場合、「ＨＬＡ−Ａ２陽性」という語句は、その対象または患者がホモ接合的またはヘテロ接合的にＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子を有し、ＨＬＡ−Ａ２抗原が対象または患者の細胞においてＨＬＡ抗原として発現されることを指す。
【００２６】
本発明の材料および方法ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられて、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
【００２７】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
【００２８】
ＩＩ．ペプチド
ＭＹＢＬ２由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＭＹＢＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）由来のペプチドを分析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＭＹＢＬ２由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドは、候補ペプチドであるとみなされる：
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−５９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、および
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−１０−５９６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【００２９】
これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によってＴ細胞をインビトロで刺激した後、次のペプチド：ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いてＣＴＬを樹立することに成功した。
【００３０】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、ＭＹＢＬ２がＣＴＬによって認識される抗原であること、およびこれらのペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＹＢＬ２のエピトープペプチドであることが実証される。
ＭＹＢＬ２遺伝子は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがん細胞およびがん組織において過剰発現されるが、大半の正常器官においては発現されないため、これは免疫療法のための好適な標的となる。したがって、本発明は、ＣＴＬに認識されるＭＹＢＬ２エピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個から構成されるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個から構成されるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチドが含まれる。
【００３１】
一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているものを用いて、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えば、参考文献Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75;およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に記載されているようにして測定することができる。結合親和性を決定するための方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、このようなソフトウェアプログラムを用いて、ＨＬＡ抗原との結合親和性が高いＭＹＢＬ２由来の断片を選択することができる。したがって、本発明は、このような公知のプログラムを用いて同定された、ＨＬＡ抗原と結合する任意のＭＹＢＬ２由来断片から構成されるペプチドを包含する。本発明のペプチドは、全長ＭＹＢＬ２から構成されるペプチドであってもよい。
【００３２】
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限りにおいて、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。本発明のペプチドに隣接させるアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成されてよい。したがって、本発明は、ＭＹＢＬ２に由来するペプチドを含み、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。このようなペプチドは、典型的には約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００３３】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能と、１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の中から選択されるアミノ酸配列と、の両方を有し得る。
【００３４】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存的であることが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton,Proteins 1984を参照されたい）。
【００３５】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドとみなされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含むことができる。さらに、改変ペプチドは、ＭＹＢＬ２の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、欠失、付加、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個、３個またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００３６】
さらに本発明のペプチドは、より高い結合親和性を達成するために、アミノ酸残基を挿入、置換または付加されることができ、あるいはアミノ酸残基を欠失される場合もある。免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入してもよい。
【００３７】
高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を有するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸としてロイシンまたはメチオニン残基を有し、Ｃ末端のアミノ酸としてバリンまたはロイシン残基を有する傾向にある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、かつ／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明に包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れていることができることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
本発明はまた、本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１個、２個、または数個のアミノ酸の付加を意図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００３８】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、まずは利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００３９】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００４０】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, に記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上のＩＦＮ−γを可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００４１】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、本明細書において示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によって示されるアミノ酸配列より選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を有することが発見された。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。
さらに、相同性解析の結果から、それらのペプチドが他のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を有していないことが示された。これにより、免疫療法のために使用される場合、未知または望まれない免疫応答が起こる可能性が低くなる。したがって、この局面からも、これらのペプチドは、ＭＹＢＬ２に対する免疫をがん患者において誘発するために使用される。したがって、本発明のペプチド、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチド。
【００４２】
上記の本発明のペプチドの改変に加えて、説明されるペプチドは、元のペプチドのＣＴＬ誘導能をそれらが保持する限り、およびより好ましくは、不可欠なＨＬＡ結合も保持する限りにおいて、他の物質にさらに連結されてよい。例示的な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。本発明のペプチドはさらに、グリコシル化、側鎖酸化、および／またはリン酸化などの改変を、それらの改変が元のペプチドの生物学的活性を損なわない限りにおいて含んでもよい。このような改変は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を与える場合があり、かつ／またはペプチドを安定化することができる。
【００４３】
例えば、ポリペプチドのインビボでの安定性を高めるために、Ｄ-アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知である；この概念は、本発明のポリペプチドにも採用することができる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法で分析することができる。例えば、ペプチダーゼならびにヒト血漿およびヒト血清などの様々な生物学的媒体を用いて安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
本発明の意図するペプチドがシステイン残基を含む場合、これらのペプチドはシステイン残基のＳＨ基間のジスルフィド結合を介して２量体を形成する傾向がある。したがって、本発明のペプチドの２量体もまた、本発明のペプチドに含まれる。
【００４４】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：産生されたペプチドの活性を決定する段階、および
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、アッセイする活性には、ＨＬＡ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＭＹＢＬ２ペプチド」または「ＭＹＢＬ２ポリペプチド」と記載することもできる。
【００４５】
ＩＩＩ．ＭＹＢＬ２ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００４６】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれるがこれに限定されない：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００４７】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.編) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００４８】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＭＹＢＬ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適当に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードできる。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供できる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含むことがある。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現されることができる。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００５０】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００５１】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２（特にＡ＊０２０１およびＡ＊０２０６もまた）が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましい。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＭＹＢＬ２部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または付加を行うことができる。
本発明のエキソソームに対するＡ２型ＨＬＡ抗原を使用する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有するペプチドが使用される。
【００５２】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来することができ、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導効果を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００５３】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００５４】
第１の対象および第２の対象は同じ個体であってよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られるＡＰＣは、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがんを治療および／または予防するためのワクチンとして投与することができる。
本発明はまた、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と混合または配合する段階を含む、ＡＰＣを誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程も提供する。
【００５５】
本発明の一局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はプロセシングされて、提示経路を経て本発明のペプチドが提示される。
【００５６】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、該対象からＣＴＬを回収すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後ＣＬＴを単離すること、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させ、その後ＣＴＬを単離すること、または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＴＬに導入することによって得ることができる。上述のＡＰＣおよびエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に詳述する。
【００５７】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来することができ、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＭＹＢＬ２を内因的に発現する細胞、またはＭＹＢＬ２遺伝子をトランスフェクトした細胞であり得、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となることができる。
【００５８】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＭＹＢＬ２を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１つまたは複数のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＭＹＢＬ２ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＭＹＢＬ２ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００５９】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に与えることができる受容体である。上記の複合体の特異的認識は、任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いる四量体解析ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法が含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を実施することによって、細胞表面でＴＣＲを発現するＴ細胞がＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。前述の複合体がＴ細胞表面に存在する場合に、Ｔ細胞に細胞傷害活性を与え得ることの確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイ法のような、ＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が含まれる。
【００６０】
また、本発明は、ＨＬＡ−Ａ０２との関係において、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＭＹＢＬ２ペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸の形質導入によって調製されるＣＴＬも提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要とする患者においてがんを治療または予防するのに有用な免疫原性組成物を形成させるために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００６１】
ＩＸ． 薬学的な剤または組成物
ＭＹＢＬ２発現は、正常組織と比較して、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがんにおいて特異的に上昇しているため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のために用いることができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種またはそれらのペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を防止するための薬学的な剤または組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として使用するために、前述のエキソソームまたはＡＰＣのような細胞のいずれかの表面で発現させることができる。さらに、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な剤または組成物の有効成分として使用することができる。
【００６２】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６３】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６４】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、有効成分としての以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６５】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６６】
あるいは、薬学的な組成物または剤または本発明は、がんまたは腫瘍の予防および術後のその再発の予防のいずれかまたは両方に使用され得る。
本発明の薬学的な剤または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒトならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されない他の任意の哺乳動物、特に商業的に重要な動物または家畜動物を含む対象または患者において、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために使用され得る。
【００６７】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のいずれか１つ、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたは候補であることが見出された。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤または組成物にも当てはまる。
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療すべきがんまたは腫瘍は限定されず、例えば、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含む、ＭＹＢＬ２が関与している（例えば、過剰発現している）あらゆる種類のがんまたは腫瘍を含む。
本発明の薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【００６８】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含むことができる。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法薬等を含むことができる。医薬自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的物質と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的物質の量は、例えば、使用する薬理学的物質の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の剤も含むことができることが理解されるべきである。
【００６９】
本発明の一態様において、本発明の薬学的な剤または組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含むことができる。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されることができる。容器上のラベルには、剤が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示すことができる。
本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含むことができる。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的剤または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【００７０】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することもできる。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００７１】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種類またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再度投与して、該対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【００７２】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、細胞性免疫を効率的に誘導することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な剤または組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒内への製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００７３】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。好ましい塩の例としては、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られる塩を指す。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【００７４】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【００７５】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００７６】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０も参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００７７】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００７８】
ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【００７９】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００８０】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に考察され説明されるように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【００８１】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階：、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【００８２】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面にタンパク質性抗原を提示することが公知であるＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣが、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、好ましくは使用され得る。本発明の任意のペプチドは、単独でまたは本発明の他のペプチドと組み合わせて、段階ｂのペプチドとして使用され得る。
あるいは、本発明のペプチドは、インビボでそれらのペプチドをＡＰＣと接触させるために対象に投与してもよい。その結果として、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導することができる。したがって、本発明はまた、インビボでＡＰＣを誘導するために本発明のペプチドを対象に投与する方法も意図する。また、本発明のペプチドが発現され、インビボでＡＰＣと接触し、その結果として、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導するように、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与することも可能である。したがって、本発明はまた、インビボでＡＰＣを誘導するために本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する方法も意図する。「発現可能な形態」という語句は、上記の「ＩＸ．薬学的な剤または組成物 （２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬剤」の項において定義される。
【００８３】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含む。例えば、この方法は、
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階
を含んでよい。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の項で前述したようにして実施することができる。
【００８４】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、もしくはエキソソーム、またはＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導する方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明は、ＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む方法もまた意図している。
【００８５】
あるいは、それらをエクスビボで用いることによってＣＴＬを誘導することができる。そのような場合には、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すことあると考えられる。例えば、ＣＴＬを誘導する本発明の方法は以下の段階を含むことができる：
ａ）対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ）段階ａ）のＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階、および
ｃ）段階ｂ）のＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【００８６】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームをＣＤ８陽性細胞と共培養する方法を意図している。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【００８７】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＭＹＢＬ２に関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を投与する段階を含む。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を意図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項、特に本発明の薬学的な剤および組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述されている。
【００８８】
本発明はさらに、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんなどのがんに対する免疫応答を対象において誘導するための方法も提供する。そのために、本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体と混合または配合する段階を含んでよい、免疫応答を誘導するための薬学的な剤、物質、または組成物を製造するための方法を包含する。あるいは、免疫応答を誘導するための方法は、本発明のワクチンを調製および投与する段階を含んでもよく、このようなワクチンは、以下を含む：
（ａ）本発明の１種もしくは複数種のエピトープペプチドもしくは免疫学的に活性なその断片；
（ｂ）（ａ）のエピトープペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明の１種もしくは複数種の単離されたＣＴＬ；または
（ｄ）本発明の１種もしくは複数種の単離された抗原提示細胞。
【００８９】
本発明との関連において、ＭＹＢＬ２を過剰発現するがんは、これらの有効成分を用いて治療することができる。このようながんの例には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべきがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して上昇しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＭＹＢＬ２を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供し、この方法は以下の段階を含み得る：
ｉ）治療すべきがんに罹患した対象から得られたがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＭＹＢＬ２の発現レベルを正常な対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）前述の（ａ）〜（ｄ）より選択される少なくとも１つの成分を、正常な対照と比較してＭＹＢＬ２を過剰発現するがんに罹患した対象に投与する段階。
【００９０】
あるいは、本発明はまた、ＭＹＢＬ２を過剰発現するがんに罹患した対象に投与する際に使用するための、前述の（ａ）〜（ｄ）より選択される少なくとも１種の成分を含むワクチンまたは薬学的組成物も提供する。言い換えると、本発明はさらに、本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療すべき対象を特定するための方法であって、対象由来のがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階を含み、その遺伝子の正常対照レベルと比較してレベルが上昇している場合、その対象が本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療され得るがんに罹患していることが示唆される方法も提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下により詳細に説明する。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明によれば、対象から採取された細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＭＹＢＬ２のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイにおいて行うことができる。アレイの使用は、ＭＹＢＬ２の発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ＭＹＢＬ２の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＭＹＢＬ２のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【００９２】
目的とするＭＹＢＬ２の転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＭＹＢＬ２発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを用いて、ＭＹＢＬ２の転写産物を定量してもまたよい。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【００９３】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＭＹＢＬ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
プローブまたはプライマーは、特定のサイズのものでよい。これらのサイズは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドからの範囲にわたってよく、プローブおよびプライマーのサイズは、５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドの範囲にわたってよい。
【００９４】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＭＹＢＬ２タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＹＢＬ２タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
ＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＭＹＢＬ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＭＹＢＬ２遺伝子の高発現レベルが示される。
【００９５】
がん細胞中の標的遺伝子、例えばＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に測定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から採取された正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＭＹＢＬ２遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生体試料中のＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【００９６】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生体試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
ＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有するかどうかを、診断するかまたは同定する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、当該方法は以下の段階を含む：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を、選択するかまたは同定する段階。
【００９８】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含む：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を、選択するかまたは同定する段階。
【００９９】
本発明はまた、がん免疫療法の有効性を評価および／またはモニターする際にも有用であり得る、本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療できるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供する。好ましくは、がんには、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。より具体的には、キットは、対象由来のがん細胞中のＭＹＢＬ２遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を好ましくは含み、この試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＭＹＢＬ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＭＹＢＬ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１００】
ＭＹＢＬ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１０１】
一方、ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するのに適した試薬の例には、ＭＹＢＬ２タンパク質に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＹＢＬ２タンパクへの結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１０２】
本発明の一態様において、試薬がＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性対照試料またはＭＹＢＬ２標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＭＹＢＬ２陽性試料を回収し、次にそれらのＭＹＢＬ２レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＭＹＢＬ２タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＭＹＢＬ２を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＭＹＢＬ２標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＭＹＢＬ２は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＭＹＢＬ２レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１０３】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本発明のタンパク質のペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドからなる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質を調製する方法およびペプチドは、上記の通りである。
抗ＭＹＢＬ２抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＭＹＢＬ２抗体の量との差を測定することにより、がんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＭＹＢＬ２）に対する抗体を含み、この抗ＭＹＢＬ２抗体の量が正常対照中の抗ＭＹＢＬ２抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１０４】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出する方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー多量体の複合体を調製することができる。当該複合体を用いて、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することによって、診断することができる。
【０１０５】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫応答を評価するための方法または診断用の剤を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ−Ａ−２拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）より選択され得る。このような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、ペプチドエピトープを認識し結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の剤が、試薬として使用され得る。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような分析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１０６】
例えば、本発明のペプチドを四量体多量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体多量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体多量体の試薬、例えば四量体の試薬は、次のように作製することができ：以下に記載する。
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような分析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１０７】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について分析される。ＰＢＭＣを培養し、当該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について分析することができる。
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて分析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、またはモニターするための試薬として有用であり得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１０８】
あるいは、本発明はいくつかの用途もまた提供し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＭＹＢＬ２免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。これらの方法は、生体試料中でのＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチド、またはＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体である。腫瘍生検材料などの生体試料中のＭＹＢＬ２の発現は、ＭＹＢＬ２プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＭＹＢＬ２増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１０９】
好ましくは、診断法は、対象から単離された生体試料をＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生体試料中のＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生体試料中に存在するＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生体試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般的に、剤と生体試料を接触させるための条件は、分子と生体試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Lowらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１１０】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生体試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生体試料はインビボの組織であってよく、かつＭＹＢＬ２免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生体試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生体試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から得られた腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１１１】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法によって、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。四量体多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はすべて、より慣例的なアッセイ法より少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＭＹＢＬ２ペプチドの少なくとも１種を投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）免疫原に特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で、免疫原を免疫担当細胞に接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）において誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または測定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答とＣＴＬ誘導レベルとの相関関係を明らかにする段階。
【０１１２】
本発明において、免疫原は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列より選択されるＭＹＢＬ２ペプチド、そのようなアミノ酸配列を有するペプチド、およびそのようなアミノ酸配列が１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換で改変されているペプチドのうちの少なくとも１つである。今のところ、免疫原に特異的なＣＴＬの誘導に適した条件は、当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞は、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するための免疫原の存在下、インビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
【０１１３】
いくつかの態様において、ペプチドがん療法で治療すべき対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療期間中、および／または治療後に実施してよい。一般に、がん療法のプロトコールの期間中、免疫原性ペプチドは、治療すべき対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドは、３〜１０週の間、毎週投与されてよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコールの期間中に評価またはモニターすることができる。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階は、療法プロトコールの完了時に行ってもよい。
本発明によれば、対照と比較して免疫原特異的ＣＴＬの誘導が強化されている場合、評価または診断しようとする対象が、投与された免疫原に免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するための適切な対照には、例えば、免疫担当細胞がペプチドに接触していない場合、または任意のＭＹＢＬ２ペプチド以外のアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドに接触した場合のＣＴＬ誘導レベルが含まれ得る。
好ましい態様において、対象の免疫学的応答は、対象に投与される各免疫原との免疫学的応答と比較して、配列特異的な様式で評価される。特に、いくつかの種類のＭＹＢＬ２ペプチドの混合物が対象に投与される場合でさえ、免疫学的応答はペプチドに応じて異なり得る。その場合、各ペプチド間の免疫学的応答を比較することにより、対象がより高い応答を示すペプチドを特定することができる。
【０１１４】
ＸＩ．抗体
本発明は、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないペプチドには結合しない（または結合が弱い）。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。
本発明のペプチドに対する抗体は、がん診断アッセイ法およびがん予後アッセイ法、ならびに画像診断方法論において使用することができる。同様に、このような抗体は、ＭＹＢＬ２ががん患者において同じく発現または過剰発現される限りにおいて、他のがんの治療、診断、および／または予後診断においても使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、単鎖抗体）は、ＭＹＢＬ２の発現が関与しているがんを治療する際に治療的に有用であり、このようながんの例には、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、びまん型胃がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＹＢＬ２タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法も提供する。このようなアッセイ法は、ＭＹＢＬ２タンパク質またはその断片を認識し結合できる１種または複数種の抗ＭＹＢＬ２抗体を適宜含んでよい。本発明との関連において、ＭＹＢＬ２ポリペプチドに結合する抗ＭＹＢＬ２抗体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験によって確認することができる。すなわち、解析しようとする抗体と全長ＭＹＢＬ２ポリペプチドとの結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害された場合、この抗体がその断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連おいて、このような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射性イムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィ技術、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ法（ＥＬＩＦＡ）などを含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の様々な免疫学的アッセイ法形式の範囲内で実施される。
【０１１６】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法はまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイ法を含む。さらに、ＭＹＢＬ２を発現するがんを検出できる免疫学的画像化法もまた、本発明によって提供され、本発明の標識抗体を用いた放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されるわけではない。このようなアッセイ法は、ＭＹＢＬ２を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に有用であり、このようながんの例には、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、びまん型胃がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本発明は、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態で使用されてよく、ウサギのような動物を本発明のペプチドで免疫化することによって得られる抗血清、あらゆるクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝的組換えによって作製されるヒト化抗体が含まれる。
【０１１７】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
本明細書では、抗体を、ＭＹＢＬ２ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４の中より選択されるアミノ酸配列を有するＭＹＢＬ２の断片ペプチドを認識する。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１１８】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用する。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１１９】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べる。
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１２０】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得る。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１２１】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
【０１２２】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開（ＪＰ−Ａ）昭６３−１７６８８号）。
【０１２３】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【０１２４】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１２５】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１２６】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１２７】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１２８】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１２９】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において有用であり得る。
【０１３０】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するのに有用であり得る。
【０１３１】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。
【０１３２】
例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１３３】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１３４】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１３５】
材料および方法
細胞株
Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢ−リンパ芽球様細胞株、およびＣＯＳ７、アフリカミドリザル腎臓細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。
ＭＹＢＬ２由来ペプチドの候補の選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合する、ＭＹＢＬ２由来の９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを、「ＮｅｔＭＨＣ ３．０」結合予測サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）を用いて予測した（Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003)、Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)）。ペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１３６】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３７】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３８】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３９】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０１４０】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための刺激細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０１４１】
結果
ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表１ａおよび１ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＭＹＢＬ２の９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ０２結合能を潜在的に有する合計４種のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた。
【０１４２】
（表１ａ）ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合９ｍｅｒペプチド
【０１４３】
（表１ｂ）ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合１０ｍｅｒペプチド
開始位置は、ＭＹＢＬ２のＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を示す。
結合解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は、「ＮｅｔＭＨＣ３．０」から導き出している。
【０１４４】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＭＹＢＬ２由来の予測ペプチドを用いたＣＴＬ誘導
ＭＹＢＬ２に由来するこれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」において説明したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法によって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１）。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃８（ａ）は、対照ウェルと比較した場合、強力なＩＦＮ−γ産生を示した。その一方で、表１に示す他のペプチドで刺激しても、これらのペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があったにもかかわらず、特異的ＣＴＬ活性は測定されなかった。陰性データの典型的な例として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからは特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｂ）。結果として、ＭＹＢＬ２に由来するＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、強力なＣＴＬを誘導できるペプチドとしてスクリーニングされることが示された。
【０１４５】
ＭＹＢＬ２特異的ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いたウェル番号＃８においてＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法によって検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、上記の「材料および方法」の項で説明した増殖手順によってＣＴＬ株を樹立した。このＣＴＬ株のＣＴＬ活性は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定した（図２）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスを行わなかった標的細胞と比較した場合、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、「材料および方法」で説明したようにＣＴＬ株から限界希釈することによってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定した。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図３）。
【０１４６】
ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長ＭＹＢＬ２遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＭＹＢＬ２遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて作製したＣＴＬクローンを応答細胞として用いることによって試験した。全長ＭＹＢＬ２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンは、ＭＹＢＬ２とＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。その一方で、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータから、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）はＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を有する標的細胞上で天然に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、ＭＹＢＬ２に由来するＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＭＹＢＬ２を発現する腫瘍を有する患者を治療するためのがんワクチンとして適している可能性があることが示される。
【０１４７】
抗原ペプチドの相同性解析
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが公知である他の分子に由来するペプチドに相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列は固有のものであり、したがって本発明者らの知る限りでは、この分子が、意図しない免疫学的応答を何らかの無関係な分子に対して引き起こす可能性はほとんどないことが示される。
結論として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ＭＹＢＬ２由来の新規なＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドとして同定された。本明細書における結果から、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）はがん免疫療法において使用するのに適している可能性があることが実証される。
【０１４８】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、幅広いがんのタイプに対する適用性を有する、ＭＹＢＬ２由来の新規ＴＡＡを説明する。このようなＴＡＡは、ＭＹＢＬ２に関連した疾患、例えば、がん、より具体的には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんに対するペプチドワクチンとしてさらなる発展を保証する。
【０１４９】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明するが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【０００２】
優先権
本出願は、２００９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２６６，８７１号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、免疫学的アプローチによって発見されており（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）、これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床開発の前進が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のペプチドを用いる、いくつかの臨床試験が報告されている。残念ながら、現在のがんワクチンの治験の大半では低い客観的奏功率しか観察されていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡの必要性が依然として存在している。
【０００５】
ｃ−ｍｙｂがん原遺伝子プローブを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、ＭＹＢＬ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、すなわちｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルスがん遺伝子ホモログ（鳥類）様２(ｖ−ｍｙｂ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇ (ａｖｉａｎ)−ｌｉｋｅ２)は、転写因子遺伝子のＭＹＢファミリーのメンバーとして同定された（非特許文献１４／Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089）。ＭＹＢＬ２は、細胞周期の進行ならびにＣＤＫ２−サイクリンＡおよびＣＤＫ２−サイクリンＥ複合体によるサイクリン駆動性のリン酸化を調節することが公知である（非特許文献１５／Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9):1855-64、非特許文献１６／Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53、非特許文献１７／Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536、非特許文献１８／Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17;274(51):36741-9）。最近の報告から、Ｍｉｐ／ＬＩＮ−９がＭＹＢＬ２の発現を調節すること、ならびに両タンパク質がＳ期およびＭ期のサイクリンの制御によって細胞周期進行の促進において重要な役割を果たすことが示された（非特許文献１９／Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5;282(1):168-75）。さらに、遺伝子２３，０４０個を含む網羅的ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイル解析によって、ＭＹＢＬ２は、例えば、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むいくつかのがんにおいて上方制御されている新規な分子として同定された（特許文献１／ＵＳ ６０／９３７，６１６、特許文献２／ＷＯ ２００４／０３１４１０）。ＭＹＢＬ２は新規な腫瘍抗原であり、ＭＹＢＬ２に由来するエピトープペプチドは、いくつかのタイプの腫瘍に罹患した患者のためのがん免疫療法に応用可能であり得るとみなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ ６０／９３７，６１６
【特許文献２】ＷＯ ２００４／０３１４１０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089
【非特許文献１５】Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9):1855-64
【非特許文献１６】Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53
【非特許文献１７】Sala et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536
【非特許文献１８】Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17;274(51):36741-9
【非特許文献１９】Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5;282(1):168-75
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、免疫療法の適切な標的の発見に一部基づいている。一般にＴＡＡは「自己」として免疫系に認識され、したがって、免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的の発見は極めて重要である。上記のように、ＭＹＢＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の遺伝子にコードされるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんなどのがんの組織において上方制御されていることが確認されている。したがって、ＭＹＢＬ２はがん／腫瘍免疫療法の候補標的である。
【０００９】
本発明は、ＭＹＢＬ２に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を有する、ＭＹＢＬ２の特異的エピトープペプチドの同定に少なくとも一部基づいている。下記に詳述するように、健常なドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ２結合候補ペプチドを用いて刺激した。各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対して特異的な細胞傷害作用を有するＣＴＬ株を樹立した。したがって、これらの結果から、これらのペプチドが、ＭＹＢＬ２を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導できるＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証される。したがって、これらの結果から、ＭＹＢＬ２は免疫原性が強く、かつそのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが実証される。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチド、すなわちＭＹＢＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）またはその断片を提供することである。本発明のペプチドはＣＴＬ誘導能を有することが予測され、したがって、ＣＴＬをエクスビボで誘導するために用いることができ、または例として、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。好ましくは、ペプチドは、ノナペプチドまたはデカペプチド、およびより好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特に、特に強いＣＴＬ誘導能を有することが本明細書において示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するノナペプチドまたはデカペプチドである。
本発明は、改変ペプチドが本来のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列を有する改変ペプチドを意図する。さらに、本発明は、本発明のペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドと同様に、ＣＴＬ誘導能を有する抗原発現細胞（ＡＰＣ）を誘導するために用いることができ、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１１】
対象に投与された場合、本発明のペプチドはＡＰＣの表面に提示されて、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。したがって、本発明の１つの目的は、ＣＴＬを誘導するために本発明の任意のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む剤を提供することである。さらに、これらのペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む剤、物質、または組成物は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のために使用され得る。したがって、本発明のさらに別の目的は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む、がんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤を提供することである。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはそれらに加えて、本発明の剤または薬剤は、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを有効成分として含んでよい。
【００１２】
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面に提示するＡＰＣを誘導するために使用され得る。このようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法に有用である。したがって、本発明の別の目的は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそれらの方法によって得られるＡＰＣを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＣＤ８陽性細胞を、本発明のペプチドを自身の表面に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法を提供することである。このような方法によって得られるＣＴＬもまた、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防に使用される。したがって、本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られるＣＴＬを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ＭＹＢＬ２もしくはその断片、ＭＹＢＬ２をコードするポリヌクレオチドもしくはその断片、またはＭＹＢＬ２もしくはその断片を提示するエキソソームもしくはＡＰＣを含む剤または組成物を投与する段階を含む、がんに対する免疫応答を必要とする対象においてこれを誘導するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明の適用範囲は、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがんを含む、ＭＹＢＬ２過剰発現に関係するか、またはＭＹＢＬ２過剰発現に起因するいくつかの疾患のいずれかに及ぶ。
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたオリゴペプチドであって、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、オリゴペプチド、
［２］ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたオリゴペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が挿入、置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたオリゴペプチド、
［３］以下の特徴の一方または両方を有する、［２］記載のオリゴペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンより選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンより選択される、
［４］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、［１］〜［３］のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド、
［５］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド、
［６］［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［７］ＣＴＬを誘導するための剤であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種または［６］記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、剤、
［８］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種または［６］記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、薬剤、
［９］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、［８］記載の薬剤、
［１０］がんを治療するために製剤化される、［８］または［９］記載の薬剤、
［１１］以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣと［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボで接触させる段階、または
（ｂ）［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１２］以下の段階のうちの少なくとも１つを含む方法のいずれかによって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階、
［１３］ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１４］［１１］記載の方法によって誘導される、［１３］記載のＡＰＣ、
［１５］［１］〜［５］のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ、
［１６］［１２］記載の方法によって誘導される、［１５］記載のＣＴＬ、ならびに
［１７］対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］〜［５］のいずれか一項記載のオリゴペプチド、免疫学的に活性なその断片、またはオリゴペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドを含む剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【００１５】
本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＭＹＢＬ２由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法の結果を示す一連の写真（ａ）および（ｂ）から構成される。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号８番のＣＴＬ（ａ）は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェルを囲む四角は、対応するウェルに由来する細胞を増殖させてＣＴＬ株を樹立したことを示す。一方、陰性データの典型的な例として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからは特異的なＩＦＮ−γ産生は検出されなかった（ｂ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２】図２は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法の結果を示す折れ線グラフである。結果から、ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈によって樹立したＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフである。結果から、ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いかなるペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図４】図４は、ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＭＹＢＬ２遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立したＣＴＬクローンは、ＭＹＢＬ２とＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒の菱形）。これに対して、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角形）またはＭＹＢＬ２（円）のいずれかを発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００１８】
本明細書において言及される出版物、特許、または特許出願それぞれの開示は、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示のためだけであり、制限することを意図するものではない。
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２０】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾された１個のＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００２１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
本明細書で互換的に使用する「剤」および「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。「薬学的剤」および「薬学的組成物」に関して使用される場合、そのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の文脈において、「薬学的剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の産物を指す。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、ポリファーマコフォアにスキャフォールドされた対象をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００２２】
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的または生理学的に活性である、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物において、「有効成分」とは、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防において使用するための薬学的な剤または組成物の場合、それらの剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／またはがん組織に対する少なくとも１種の生物学的作用または生理学的作用を、直接的にまたは間接的にもたらすことができる。好ましくは、そのような作用は、がん細胞の増殖を低減または阻害すること、がん細胞および／またはがん組織に傷害を与えるかまたは殺傷することなどを含んでよい。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識するか、または殺傷するＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「活性成分」は、「バルク」、「原薬」、または「原体」とも呼ばれる。
【００２３】
特記しない限り、「がん」という用語は、例として精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されない、ＭＹＢＬ２遺伝子を過剰発現しているがんを指す。
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」と言う用語は本明細書において互換的に使用され、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
特記しない限り、「ＨＬＡ−Ａ０２」という用語は、ＨＬＡ−Ａ＊−０２０１またはＨＬＡ−Ａ＊−０２０６などのサブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２タイプを指す。
【００２４】
本発明の材料および方法ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＭＹＢＬ２遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００２５】
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが意図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
本明細書において対象または患者との関連において使用される場合、「ＨＬＡ−Ａ２陽性」という語句は、その対象または患者がホモ接合的またはヘテロ接合的にＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子を有し、ＨＬＡ−Ａ２抗原が対象または患者の細胞においてＨＬＡ抗原として発現されることを指す。
【００２６】
本発明の材料および方法ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられて、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
【００２７】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
【００２８】
ＩＩ．ペプチド
ＭＹＢＬ２由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＭＹＢＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）由来のペプチドを分析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＭＹＢＬ２由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドは、候補ペプチドであるとみなされる：
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−５９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、および
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−１０−５９６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【００２９】
これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によってＴ細胞をインビトロで刺激した後、次のペプチド：ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いてＣＴＬを樹立することに成功した。
【００３０】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、ＭＹＢＬ２がＣＴＬによって認識される抗原であること、およびこれらのペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＹＢＬ２のエピトープペプチドであることが実証される。
ＭＹＢＬ２遺伝子は、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがこれらに限定されないがん細胞およびがん組織において過剰発現されるが、大半の正常器官においては発現されないため、これは免疫療法のための好適な標的となる。したがって、本発明は、ＣＴＬに認識されるＭＹＢＬ２エピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個から構成されるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個から構成されるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチドが含まれる。
【００３１】
一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているものを用いて、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えば、参考文献Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75;およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に記載されているようにして測定することができる。結合親和性を決定するための方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、このようなソフトウェアプログラムを用いて、ＨＬＡ抗原との結合親和性が高いＭＹＢＬ２由来の断片を選択することができる。したがって、本発明は、このような公知のプログラムを用いて同定された、ＨＬＡ抗原と結合する任意のＭＹＢＬ２由来断片から構成されるペプチドを包含する。本発明のペプチドは、全長ＭＹＢＬ２から構成されるペプチドであってもよい。
【００３２】
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限りにおいて、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。本発明のペプチドに隣接させるアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成されてよい。したがって、本発明は、ＭＹＢＬ２に由来するペプチドを含み、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。このようなペプチドは、典型的には約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００３３】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能と、１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の中から選択されるアミノ酸配列と、の両方を有し得る。
【００３４】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存的であることが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton,Proteins 1984を参照されたい）。
【００３５】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドとみなされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含むことができる。さらに、改変ペプチドは、ＭＹＢＬ２の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、欠失、付加、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個、３個またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００３６】
さらに本発明のペプチドは、より高い結合親和性を達成するために、アミノ酸残基を挿入、置換または付加されることができ、あるいはアミノ酸残基を欠失される場合もある。免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入してもよい。
【００３７】
高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を有するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸としてロイシンまたはメチオニン残基を有し、Ｃ末端のアミノ酸としてバリンまたはロイシン残基を有する傾向にある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、かつ／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明に包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れていることができることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
本発明はまた、本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１個、２個、または数個のアミノ酸の付加を意図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００３８】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、まずは利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００３９】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００４０】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, に記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上のＩＦＮ−γを可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００４１】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、本明細書において示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によって示されるアミノ酸配列より選択されるノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を有することが発見された。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。
さらに、相同性解析の結果から、それらのペプチドが他のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも有意な相同性を有していないことが示された。これにより、免疫療法のために使用される場合、未知または望まれない免疫応答が起こる可能性が低くなる。したがって、この局面からも、これらのペプチドは、ＭＹＢＬ２に対する免疫をがん患者において誘発するために使用される。したがって、本発明のペプチド、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチド。
【００４２】
上記の本発明のペプチドの改変に加えて、説明されるペプチドは、元のペプチドのＣＴＬ誘導能をそれらが保持する限り、およびより好ましくは、不可欠なＨＬＡ結合も保持する限りにおいて、他の物質にさらに連結されてよい。例示的な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。本発明のペプチドはさらに、グリコシル化、側鎖酸化、および／またはリン酸化などの改変を、それらの改変が元のペプチドの生物学的活性を損なわない限りにおいて含んでもよい。このような改変は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を与える場合があり、かつ／またはペプチドを安定化することができる。
【００４３】
例えば、ポリペプチドのインビボでの安定性を高めるために、Ｄ-アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知である；この概念は、本発明のポリペプチドにも採用することができる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法で分析することができる。例えば、ペプチダーゼならびにヒト血漿およびヒト血清などの様々な生物学的媒体を用いて安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
本発明の意図するペプチドがシステイン残基を含む場合、これらのペプチドはシステイン残基のＳＨ基間のジスルフィド結合を介して２量体を形成する傾向がある。したがって、本発明のペプチドの２量体もまた、本発明のペプチドに含まれる。
【００４４】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：産生されたペプチドの活性を決定する段階、および
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、アッセイする活性には、ＨＬＡ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＭＹＢＬ２ペプチド」または「ＭＹＢＬ２ポリペプチド」と記載することもできる。
【００４５】
ＩＩＩ．ＭＹＢＬ２ペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００４６】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれるがこれに限定されない：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００４７】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.編) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００４８】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＭＹＢＬ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適当に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードできる。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供できる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含むことがある。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現されることができる。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００５０】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００５１】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２（特にＡ＊０２０１およびＡ＊０２０６もまた）が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましい。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＭＹＢＬ２部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または付加を行うことができる。
本発明のエキソソームに対するＡ２型ＨＬＡ抗原を使用する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有するペプチドが使用される。
【００５２】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来することができ、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導効果を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００５３】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００５４】
第１の対象および第２の対象は同じ個体であってよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られるＡＰＣは、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがんを治療および／または予防するためのワクチンとして投与することができる。
本発明はまた、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と混合または配合する段階を含む、ＡＰＣを誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程も提供する。
【００５５】
本発明の一局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はプロセシングされて、提示経路を経て本発明のペプチドが提示される。
【００５６】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、該対象からＣＴＬを回収すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後ＣＬＴを単離すること、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させ、その後ＣＴＬを単離すること、または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＴＬに導入することによって得ることができる。上述のＡＰＣおよびエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に詳述する。
【００５７】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来することができ、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＭＹＢＬ２を内因的に発現する細胞、またはＭＹＢＬ２遺伝子をトランスフェクトした細胞であり得、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となることができる。
【００５８】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＭＹＢＬ２を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１つまたは複数のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲを分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＭＹＢＬ２ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＭＹＢＬ２ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００５９】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に与えることができる受容体である。上記の複合体の特異的認識は、任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いる四量体解析ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法が含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を実施することによって、細胞表面でＴＣＲを発現するＴ細胞がＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。前述の複合体がＴ細胞表面に存在する場合に、Ｔ細胞に細胞傷害活性を与え得ることの確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイ法のような、ＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が含まれる。
【００６０】
また、本発明は、ＨＬＡ−Ａ０２との関係において、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＭＹＢＬ２ペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸の形質導入によって調製されるＣＴＬも提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要とする患者においてがんを治療または予防するのに有用な免疫原性組成物を形成させるために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００６１】
ＩＸ． 薬学的な剤または組成物
ＭＹＢＬ２発現は、正常組織と比較して、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含むがんにおいて特異的に上昇しているため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のために用いることができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種またはそれらのペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を防止するための薬学的な剤または組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として使用するために、前述のエキソソームまたはＡＰＣのような細胞のいずれかの表面で発現させることができる。さらに、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な剤または組成物の有効成分として使用することができる。
【００６２】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６３】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６４】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、有効成分としての以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６５】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【００６６】
あるいは、薬学的な組成物または剤または本発明は、がんまたは腫瘍の予防および術後のその再発の予防のいずれかまたは両方に使用され得る。
本発明の薬学的な剤または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒトならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されない他の任意の哺乳動物、特に商業的に重要な動物または家畜動物を含む対象または患者において、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために使用され得る。
【００６７】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のいずれか１つ、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたは候補であることが見出された。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤または組成物にも当てはまる。
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療すべきがんまたは腫瘍は限定されず、例えば、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんを含む、ＭＹＢＬ２が関与している（例えば、過剰発現している）あらゆる種類のがんまたは腫瘍を含む。
本発明の薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【００６８】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含むことができる。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法薬等を含むことができる。医薬自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的物質と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的物質の量は、例えば、使用する薬理学的物質の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の剤も含むことができることが理解されるべきである。
【００６９】
本発明の一態様において、本発明の薬学的な剤または組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含むことができる。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されることができる。容器上のラベルには、剤が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示すことができる。
本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含むことができる。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的剤または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【００７０】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することもできる。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００７１】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種類またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再度投与して、該対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【００７２】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、細胞性免疫を効率的に誘導することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な剤または組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒内への製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００７３】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。好ましい塩の例としては、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られる塩を指す。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【００７４】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【００７５】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００７６】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０も参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００７７】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００７８】
ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【００７９】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【００８０】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に考察され説明されるように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【００８１】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階：、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【００８２】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面にタンパク質性抗原を提示することが公知であるＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣが、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、好ましくは使用され得る。本発明の任意のペプチドは、単独でまたは本発明の他のペプチドと組み合わせて、段階ｂのペプチドとして使用され得る。
あるいは、本発明のペプチドは、インビボでそれらのペプチドをＡＰＣと接触させるために対象に投与してもよい。その結果として、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導することができる。したがって、本発明はまた、インビボでＡＰＣを誘導するために本発明のペプチドを対象に投与する方法も意図する。また、本発明のペプチドが発現され、インビボでＡＰＣと接触し、その結果として、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを対象の体内で誘導するように、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与することも可能である。したがって、本発明はまた、インビボでＡＰＣを誘導するために本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する方法も意図する。「発現可能な形態」という語句は、上記の「ＩＸ．薬学的な剤または組成物 （２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬剤」の項において定義される。
【００８３】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入して、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含む。例えば、この方法は、
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階
を含んでよい。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の項で前述したようにして実施することができる。
【００８４】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、もしくはエキソソーム、またはＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導する方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明は、ＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む方法もまた意図している。
【００８５】
あるいは、それらをエクスビボで用いることによってＣＴＬを誘導することができる。そのような場合には、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すことあると考えられる。例えば、ＣＴＬを誘導する本発明の方法は以下の段階を含むことができる：
ａ）対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ）段階ａ）のＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階、および
ｃ）段階ｂ）のＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【００８６】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームをＣＤ８陽性細胞と共培養する方法を意図している。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【００８７】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＭＹＢＬ２に関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を投与する段階を含む。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を意図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項、特に本発明の薬学的な剤および組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述されている。
【００８８】
本発明はさらに、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんなどのがんに対する免疫応答を対象において誘導するための方法も提供する。そのために、本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体と混合または配合する段階を含んでよい、免疫応答を誘導するための薬学的な剤、物質、または組成物を製造するための方法を包含する。あるいは、免疫応答を誘導するための方法は、本発明のワクチンを調製および投与する段階を含んでもよく、このようなワクチンは、以下を含む：
（ａ）本発明の１種もしくは複数種のエピトープペプチドもしくは免疫学的に活性なその断片；
（ｂ）（ａ）のエピトープペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明の１種もしくは複数種の単離されたＣＴＬ；または
（ｄ）本発明の１種もしくは複数種の単離された抗原提示細胞。
【００８９】
本発明との関連において、ＭＹＢＬ２を過剰発現するがんは、これらの有効成分を用いて治療することができる。このようながんの例には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべきがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して上昇しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＭＹＢＬ２を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供し、この方法は以下の段階を含み得る：
ｉ）治療すべきがんに罹患した対象から得られたがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＭＹＢＬ２の発現レベルを正常な対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）前述の（ａ）〜（ｄ）より選択される少なくとも１つの成分を、正常な対照と比較してＭＹＢＬ２を過剰発現するがんに罹患した対象に投与する段階。
【００９０】
あるいは、本発明はまた、ＭＹＢＬ２を過剰発現するがんに罹患した対象に投与する際に使用するための、前述の（ａ）〜（ｄ）より選択される少なくとも１種の成分を含むワクチンまたは薬学的組成物も提供する。言い換えると、本発明はさらに、本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療すべき対象を特定するための方法であって、対象由来のがん細胞またはがん組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階を含み、その遺伝子の正常対照レベルと比較してレベルが上昇している場合、その対象が本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療され得るがんに罹患していることが示唆される方法も提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下により詳細に説明する。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明によれば、対象から採取された細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＭＹＢＬ２のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイにおいて行うことができる。アレイの使用は、ＭＹＢＬ２の発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ＭＹＢＬ２の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＭＹＢＬ２のｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【００９２】
目的とするＭＹＢＬ２の転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＭＹＢＬ２発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを用いて、ＭＹＢＬ２の転写産物を定量してもまたよい。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【００９３】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＭＹＢＬ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
プローブまたはプライマーは、特定のサイズのものでよい。これらのサイズは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドからの範囲にわたってよく、プローブおよびプライマーのサイズは、５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドの範囲にわたってよい。
【００９４】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＭＹＢＬ２タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＹＢＬ２タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
ＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＭＹＢＬ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＭＹＢＬ２遺伝子の高発現レベルが示される。
【００９５】
がん細胞中の標的遺伝子、例えばＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に測定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から採取された正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＭＹＢＬ２遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生体試料中のＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【００９６】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生体試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
ＭＹＢＬ２遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有するかどうかを、診断するかまたは同定する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、当該方法は以下の段階を含む：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を、選択するかまたは同定する段階。
【００９８】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含む：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＭＹＢＬ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＭＹＢＬ２の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を、選択するかまたは同定する段階。
【００９９】
本発明はまた、がん免疫療法の有効性を評価および／またはモニターする際にも有用であり得る、本発明のＭＹＢＬ２ポリペプチドを用いて治療できるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供する。好ましくは、がんには、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。より具体的には、キットは、対象由来のがん細胞中のＭＹＢＬ２遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を好ましくは含み、この試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＭＹＢＬ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＭＹＢＬ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１００】
ＭＹＢＬ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１０１】
一方、ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するのに適した試薬の例には、ＭＹＢＬ２タンパク質に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＭＹＢＬ２タンパクへの結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＭＹＢＬ２タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１０２】
本発明の一態様において、試薬がＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＭＹＢＬ２ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性対照試料またはＭＹＢＬ２標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＭＹＢＬ２陽性試料を回収し、次にそれらのＭＹＢＬ２レベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＭＹＢＬ２タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＭＹＢＬ２を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＭＹＢＬ２標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＭＹＢＬ２は組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＭＹＢＬ２レベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１０３】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
本発明のタンパク質のペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドからなる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質を調製する方法およびペプチドは、上記の通りである。
抗ＭＹＢＬ２抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＭＹＢＬ２抗体の量との差を測定することにより、がんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＭＹＢＬ２）に対する抗体を含み、この抗ＭＹＢＬ２抗体の量が正常対照中の抗ＭＹＢＬ２抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１０４】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出する方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー多量体の複合体を調製することができる。当該複合体を用いて、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することによって、診断することができる。
【０１０５】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫応答を評価するための方法または診断用の剤を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ−Ａ−２拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）より選択され得る。このような免疫担当細胞を回収または単離するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、ペプチドエピトープを認識し結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る任意の剤が、試薬として使用され得る。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような分析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１０６】
例えば、本発明のペプチドを四量体多量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体多量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体多量体の試薬、例えば四量体の試薬は、次のように作製することができ：以下に記載する。
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような分析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１０７】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について分析される。ＰＢＭＣを培養し、当該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について分析することができる。
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて分析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、またはモニターするための試薬として有用であり得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１０８】
あるいは、本発明はいくつかの用途もまた提供し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＭＹＢＬ２免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。これらの方法は、生体試料中でのＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチド、またはＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体である。腫瘍生検材料などの生体試料中のＭＹＢＬ２の発現は、ＭＹＢＬ２プライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＭＹＢＬ２増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１０９】
好ましくは、診断法は、対象から単離された生体試料をＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生体試料中のＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生体試料中に存在するＭＹＢＬ２ ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生体試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般的に、剤と生体試料を接触させるための条件は、分子と生体試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Lowらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１１０】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生体試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生体試料はインビボの組織であってよく、かつＭＹＢＬ２免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生体試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生体試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から得られた腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１１１】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法によって、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。四量体多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はすべて、より慣例的なアッセイ法より少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＭＹＢＬ２ペプチドの少なくとも１種を投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）免疫原に特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で、免疫原を免疫担当細胞に接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）において誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または測定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答とＣＴＬ誘導レベルとの相関関係を明らかにする段階。
【０１１２】
本発明において、免疫原は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４のアミノ酸配列より選択されるＭＹＢＬ２ペプチド、そのようなアミノ酸配列を有するペプチド、およびそのようなアミノ酸配列が１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換で改変されているペプチドのうちの少なくとも１つである。今のところ、免疫原に特異的なＣＴＬの誘導に適した条件は、当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞は、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するための免疫原の存在下、インビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
【０１１３】
いくつかの態様において、ペプチドがん療法で治療すべき対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療期間中、および／または治療後に実施してよい。一般に、がん療法のプロトコールの期間中、免疫原性ペプチドは、治療すべき対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドは、３〜１０週の間、毎週投与されてよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコールの期間中に評価またはモニターすることができる。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階は、療法プロトコールの完了時に行ってもよい。
本発明によれば、対照と比較して免疫原特異的ＣＴＬの誘導が強化されている場合、評価または診断しようとする対象が、投与された免疫原に免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するための適切な対照には、例えば、免疫担当細胞がペプチドに接触していない場合、または任意のＭＹＢＬ２ペプチド以外のアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドに接触した場合のＣＴＬ誘導レベルが含まれ得る。
好ましい態様において、対象の免疫学的応答は、対象に投与される各免疫原との免疫学的応答と比較して、配列特異的な様式で評価される。特に、いくつかの種類のＭＹＢＬ２ペプチドの混合物が対象に投与される場合でさえ、免疫学的応答はペプチドに応じて異なり得る。その場合、各ペプチド間の免疫学的応答を比較することにより、対象がより高い応答を示すペプチドを特定することができる。
【０１１４】
ＸＩ．抗体
本発明は、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないペプチドには結合しない（または結合が弱い）。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。
本発明のペプチドに対する抗体は、がん診断アッセイ法およびがん予後アッセイ法、ならびに画像診断方法論において使用することができる。同様に、このような抗体は、ＭＹＢＬ２ががん患者において同じく発現または過剰発現される限りにおいて、他のがんの治療、診断、および／または予後診断においても使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、単鎖抗体）は、ＭＹＢＬ２の発現が関与しているがんを治療する際に治療的に有用であり、このようながんの例には、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、びまん型胃がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＹＢＬ２タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法も提供する。このようなアッセイ法は、ＭＹＢＬ２タンパク質またはその断片を認識し結合できる１種または複数種の抗ＭＹＢＬ２抗体を適宜含んでよい。本発明との関連において、ＭＹＢＬ２ポリペプチドに結合する抗ＭＹＢＬ２抗体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験によって確認することができる。すなわち、解析しようとする抗体と全長ＭＹＢＬ２ポリペプチドとの結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害された場合、この抗体がその断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連おいて、このような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射性イムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィ技術、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ法（ＥＬＩＦＡ）などを含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の様々な免疫学的アッセイ法形式の範囲内で実施される。
【０１１６】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法はまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイ法を含む。さらに、ＭＹＢＬ２を発現するがんを検出できる免疫学的画像化法もまた、本発明によって提供され、本発明の標識抗体を用いた放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されるわけではない。このようなアッセイ法は、ＭＹＢＬ２を発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に有用であり、このようながんの例には、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、びまん型胃がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、膵がんが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本発明は、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態で使用されてよく、ウサギのような動物を本発明のペプチドで免疫化することによって得られる抗血清、あらゆるクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝的組換えによって作製されるヒト化抗体が含まれる。
【０１１７】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
本明細書では、抗体を、ＭＹＢＬ２ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４の中より選択されるアミノ酸配列を有するＭＹＢＬ２の断片ペプチドを認識する。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１１８】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用する。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１１９】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べる。
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１２０】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得る。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１２１】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
【０１２２】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開（ＪＰ−Ａ）昭６３−１７６８８号）。
【０１２３】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【０１２４】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１２５】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１２６】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１２７】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１２８】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１２９】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において有用であり得る。
【０１３０】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するのに有用であり得る。
【０１３１】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。
【０１３２】
例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１３３】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０１３４】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１３５】
材料および方法
細胞株
Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢ−リンパ芽球様細胞株、およびＣＯＳ７、アフリカミドリザル腎臓細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。
ＭＹＢＬ２由来ペプチドの候補の選択
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合する、ＭＹＢＬ２由来の９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを、「ＮｅｔＭＨＣ ３．０」結合予測サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）を用いて予測した（Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003)、Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)）。ペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１３６】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３７】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３８】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３９】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０１４０】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための刺激細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０１４１】
結果
ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表１ａおよび１ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２に結合するＭＹＢＬ２の９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ０２結合能を潜在的に有する合計４種のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた。
【０１４２】
（表１ａ）ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合９ｍｅｒペプチド
【０１４３】
（表１ｂ）ＭＹＢＬ２に由来するＨＬＡ−Ａ０２結合１０ｍｅｒペプチド
開始位置は、ＭＹＢＬ２のＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を示す。
結合解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は、「ＮｅｔＭＨＣ３．０」から導き出している。
【０１４４】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＭＹＢＬ２由来の予測ペプチドを用いたＣＴＬ誘導
ＭＹＢＬ２に由来するこれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」において説明したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法によって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１）。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃８（ａ）は、対照ウェルと比較した場合、強力なＩＦＮ−γ産生を示した。その一方で、表１に示す他のペプチドで刺激しても、これらのペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があったにもかかわらず、特異的ＣＴＬ活性は測定されなかった。陰性データの典型的な例として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−３５５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したＣＴＬからは特異的なＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（ｂ）。結果として、ＭＹＢＬ２に由来するＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、強力なＣＴＬを誘導できるペプチドとしてスクリーニングされることが示された。
【０１４５】
ＭＹＢＬ２特異的ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いたウェル番号＃８においてＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法によって検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、上記の「材料および方法」の項で説明した増殖手順によってＣＴＬ株を樹立した。このＣＴＬ株のＣＴＬ活性は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定した（図２）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスを行わなかった標的細胞と比較した場合、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、「材料および方法」で説明したようにＣＴＬ株から限界希釈することによってＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定した。ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図３）。
【０１４６】
ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＭＹＢＬ２およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長ＭＹＢＬ２遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＭＹＢＬ２遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて作製したＣＴＬクローンを応答細胞として用いることによって試験した。全長ＭＹＢＬ２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンは、ＭＹＢＬ２とＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。その一方で、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータから、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）はＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を有する標的細胞上で天然に発現され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、ＭＹＢＬ２に由来するＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＭＹＢＬ２を発現する腫瘍を有する患者を治療するためのがんワクチンとして適している可能性があることが示される。
【０１４７】
抗原ペプチドの相同性解析
ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが公知である他の分子に由来するペプチドに相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列は固有のものであり、したがって本発明者らの知る限りでは、この分子が、意図しない免疫学的応答を何らかの無関係な分子に対して引き起こす可能性はほとんどないことが示される。
結論として、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ＭＹＢＬ２由来の新規なＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドとして同定された。本明細書における結果から、ＭＹＢＬ２−Ａ０２−９−１４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）はがん免疫療法において使用するのに適している可能性があることが実証される。
【０１４８】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、幅広いがんのタイプに対する適用性を有する、ＭＹＢＬ２由来の新規ＴＡＡを説明する。このようなＴＡＡは、ＭＹＢＬ２に関連した疾患、例えば、がん、より具体的には、精巣腫瘍、膵がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、および食道がんに対するペプチドワクチンとしてさらなる発展を保証する。
【０１４９】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明するが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたオリゴペプチドであって、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、オリゴペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたオリゴペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列からなり、１個、２個、または数個のアミノ酸が挿入、置換、欠失、または付加されている、単離されたオリゴペプチド。
【請求項３】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項２記載のオリゴペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンより選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンより選択される。
【請求項４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項５】
ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＣＴＬを誘導するための剤であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種、または請求項６記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、剤。
【請求項８】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種、または請求項６記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、薬剤。
【請求項９】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
がんを治療するために製剤化される、請求項８または９記載の薬剤。
【請求項１１】
以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣと請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボで接触させる段階；または
（ｂ）請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１２】
以下の段階のうちの少なくとも１つを含む方法のいずれかによって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法によって誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
【請求項１７】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチド、免疫学的に活性なその断片、または該オリゴペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドを含む剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたオリゴペプチドであって、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、オリゴペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたオリゴペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜４より選択されるアミノ酸配列からなり、１個、２個、または数個のアミノ酸が挿入、置換、欠失、または付加されている、単離されたオリゴペプチド。
【請求項３】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項２記載のオリゴペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンより選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンより選択される。
【請求項４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項５】
ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項記載の単離されたオリゴペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＣＴＬを誘導するための剤であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種、または請求項６記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、剤。
【請求項８】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドの１種もしくは複数種、または請求項６記載のポリヌクレオチドの１種もしくは複数種を含む、薬剤。
【請求項９】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
がんを治療するために製剤化される、請求項８または９記載の薬剤。
【請求項１１】
以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣと請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボで接触させる段階；または
（ｂ）請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１２】
以下の段階のうちの少なくとも１つを含む方法のいずれかによって、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチドとの複合体を自身の表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法によって誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
【請求項１７】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のオリゴペプチド、免疫学的に活性なその断片、または該オリゴペプチドもしくは免疫学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドを含む剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５１２６５９（Ｐ２０１３−５１２６５９Ａ）
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５５５０（Ｐ２０１２−５２５５５０）
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００７０２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６７９３３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００７０２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６７９３３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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