ＮＥＬＬペプチドの発現系
本発明は、ＮＥＬＬペプチドの調製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援を受けた研究開発のもとで行われた発明の権利に関する声明
本研究は、ＮＩＨ／ＮＩＤＲ助成金番号ＤＥ９４００及びＣＲＣ／ＮＩＨ助成金番号ＲＲ００８６５による支援を受けた。米国政府は本発明に特定の権利を有しうる。
本願は、２００５年８月５日に米国に出願された米国出願番号１０／５４４，５５３の一部継続出願である。なお、米国出願番号１０／５４４，５５３は、２００４年２月９日に国際出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００４／００３８０８および２００６年２月１６日に国際出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３の米国への移行出願である。参照により上記出願にて教示される全内容が組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般にＮＥＬＬペプチド又は関連物質の発現および精製方法に関する。
【０００３】
成長因子は、生体内又は試験管内で規定された細胞集団の増殖及び分化に影響を及ぼすペプチド等の物質である。
【０００４】
骨形成は、長骨（軟骨内の骨形成）及び扁平骨（膜内の骨形成）の発達中に起きる。さらに、骨形成は、骨格の整合性を維持するために成人で継続して生じる骨再形成中にも起きる。また、骨形成は、骨折又は手術で骨創傷が生じた場合等の骨修復中にも起きる。長骨および扁平骨の胎生発育には、個々の骨形成メカニズムが関与すると考えられているが、修復には、膜内骨形成が関与すると考えられている。
【０００５】
いずれのメカニズムによる骨形成にも、成長因子により調節される骨芽細胞の活性が関与する。骨芽細胞は、骨髄間質細胞（間葉幹細胞：ＭＳＣとしても知られる）のプールに由来する。これらの細胞は種々の組織に存在するが、骨髄間質で優勢である。ＭＳＣは、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞及び脂肪細胞を含む多様な細胞種に分化することができる。成長因子は、骨形成性細胞の増殖、分化及び骨芽細胞の石灰化に影響を与えると考えられ、そのそれぞれが骨形成に影響を与える。
【０００６】
例えば、頭蓋骨癒合症の患者及び中裂移植の患者で骨を修復させる場合は、自家骨が用いられてきた。頭蓋縫合が早期に閉鎖してしまう頭蓋骨癒合症（ＣＳ）は、３，０００人に１人の乳児で起きており、最も一般的なヒトの頭蓋及び顔面の変形の１つである。縫合の閉鎖が早過ぎると、頭蓋の二形性を生じ、手術による矯正を必要とする可能性がある。ヒトのＣＳにおける早過ぎる縫合の閉鎖は、頭蓋冠の過形成及び骨融合という２つのおそらく別個の過程により生じる可能性がある。最近では、ＣＢＦＡ−１が介在する経路による頭蓋縫合の早過ぎる融合に線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）および線維芽細胞成長因子 受容体１（ＦＧＦＲｌ）が関与するとみなされている（８）。縫合の遅延閉鎖として現れる鎖骨頭蓋異形成症には、ＣＢＦＡ１のミスセンス変異が関連している。
【０００７】
例えば、腸骨稜又は頭蓋冠からの自家骨を利用して自家骨移植処置が行われている。これらの供給部位は、腸骨稜については、疼痛、歩行障害、大腿の知覚異常等の病的状態と無関係ではなく、頭蓋冠移植については、感染、神経障害及び血腫を含む病的状態と無関係ではない。さらに、供給部位は、容積が限定され、且つ手術時間及び入院期間を長くする可能性がある。
【０００８】
異種移植材料も利用されており、動物モデルでは成長因子も検討されている。例えば、ｂＦＧＦは骨の再生及び修復に使用可能である。骨形成性成長因子の別のファミリーには、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）がある。具体的には、ＢＭＰ−２組換えタンパク質が下顎連続性障害及び口蓋裂を再生し、自家骨微粒子及び骨髄と同等又はそれ以上の結果が得られたことが明らかにされている。ＢＭＰ及びその他の骨形成因子の臨床応用については研究が続けられている。しかしながら、最小の有効性を上げるのに使用するＢＭＰ投与量のコストが臨床での使用の限定要因になっている。
【０００９】
脊椎固定は、脊柱の１以上の椎骨をその間での動きがもはや生じないように一体化する手術法である。適応には、骨折（破壊）した椎骨の治療、変形の矯正、動きによる疼痛の除去、不安定性の治療、及び一部の頸椎椎間板ヘルニアの治療が挙げられる。手術には、椎骨間に骨移植片を留置して椎骨間のしっかりした結合を得ることが含まれる。その処置には、プレート、ネジ、ケージ及び最近では、骨形態形成タンパク質２及び７を留置して骨移植片の安定及び癒合を助けること等の補完治療も含まれる。自家骨移植は臨床的に好ましい方法ではあるが、未だに３０〜５０％の失敗率を有する。自家骨移植は別個の手術であり、重大な病的状態ももたらす。
【００１０】
軟骨は、密性結合組織の一種である。硬いゲル状の基質に分散された軟骨細胞からなる。軟骨は、無血管組織（血管が存在しない）であり、栄養素は基質を介して拡散する。軟骨は、関節、胸郭、耳、鼻、咽喉及び椎間板の間にみられる。軟骨には主に、硝子質（例えば、肋骨軟骨、鼻、気管及び気管支の軟骨、及び関節の関節軟骨）、弾性（例えば、外耳、外耳道、耳管の一部、喉頭蓋、及び喉頭部軟骨の一部）及び線維軟骨［例えば、半月板（例えば、手首の三角線維軟骨複合体、膝半月板）、椎間板、側頭下顎骨関節板、恥骨結合、及び骨と結合している腱及び靱帯の一部］の３種類がある。軟骨の主な目的の一つは、（軟骨内骨化中に）骨沈着が開始できるようなフレームワークを提供することである。軟骨のもう一つの重要な目的は、関節接合している骨を動かすための平滑表面を提供することである。例えば、関節軟骨（最も顕著には膝関節においてみられる関節軟骨）は、一般に非常に低摩擦で、耐摩耗性が高く、且つ再生性に乏しいことを特徴とする。軟骨は膝関節の耐圧縮性及び耐荷重性の大半に関与しており、軟骨がなければ、歩行には痛みを伴い、不可能である。さらに、軟骨のもう一つの重要な目的は、堅いが柔軟性のあるサポート（例えば、鼻軟骨、脊椎円板、気管軟骨、膝半月板、気管支軟骨）を提供することである。例えば、半月板等の軟骨は、関節の安定、潤滑、及び力伝達に極めて重要な役割を果たしている。体重の負荷を受けながら、半月板は、脛骨上の均衡のとれた位置に大腿骨を保持し、接触面を増やすことにより、圧縮力を分散させて、結果的に平均応力を２〜３倍縮小させている。しかも、半月板は関節液と相互に作用し、その摩擦係数は、氷上の氷の５倍も潤滑性に優れたものとしている。また、例えば、椎間板には、スペーサーとしての機能、緩衝装置としての機能、及び動作単位としての機能を含むいくつかの重要な機能がある。椎間板のゲル状の中央部は、髄核と呼ばれる。髄核の８０〜９０％が水で構成されている。核の固形部は、ＩＩ型コラーゲン及び非凝集性のプロテオグリカンである。髄核周辺の外側の靱帯の輪は、線維輪と呼ばれ、油圧式に核をシールし、椎間板が荷重されると、椎間板内圧力を上昇させる。線維輪は、ラジアルタイヤの層とは異なり重なり合う半径方向のバンド（ｒａｄｉａｌ ｂａｎｄ）を有し、これにより、線維輪を介して、垂直荷重下で破裂することなくねじり応力が分散される。椎間板は油圧シリンダーとして機能する。線維輪は核と相互作用する。核に圧力がかかると、輪状線維が封じ込め機能を発揮し、核の突出やヘルニアを防ぐ。
【００１１】
軟骨は、摩耗、損傷又は疾患により破損する。加齢に伴い、人体の軟骨中の水及びタンパク質の含有量が変化する。この変化により、軟骨がより弱く、より脆く薄くなる。変形性関節症は、軟骨障害の一般的状態であり、動作が限定され、骨損傷とともに常に疼痛を伴う。急性ストレスと慢性疲労が組み合わされることで、変形性関節症は、関節接合している表面の摩耗に直接的に現れ、極端な例では、骨が関節に露出することもある。また、例えば、保護安定化半月板の損失は、関節弛緩症の増加、又は関節の不安定化の原因となる異常な動きを引き起こす。過剰な動き及び接触面の狭小化により、早期の関節炎の病変を進める。細胞レベルでは、まず、関節軟骨の表層から細胞が失われた後に、軟骨が割れ、その後薄くなって、浸食が起き、最終的には下層の骨が剥き出しになる。最も初期の関節炎の病変は、半月板全体が損失してから３週間で現れる。また、例えば、半月板及び脊椎骨を束にする関節（面関節）の双方が部分的に軟骨で構成されるため、これらの面が、時間の経過に伴う摩耗及び裂傷の対象となる（退行性変化）。内部の核が水分を失うために、半月板のスペースが狭小化し、余剰の輪状靱帯が膨隆する。核の脱水が進むと、輪状線維に亀裂や裂傷が起きる。通常の軟組織の張力が失われることで、脊髄分節を、亜脱臼させる場合もあり（例えば、関節の部分的な脱臼）、骨棘形成（骨の突起）、大孔狭窄、機械的不安定、及び疼痛が引き起こされる。輪状線維が伸張又は破裂した場合、圧力を受けた核物質の隆起、又はヘルニアを生じさせ、且つ神経組織を圧迫し、疼痛及び脆弱性をもたらす可能性がある。この状態は、神経圧迫（ｐｉｎｃｈｅｄ ｎｅｒｖｅ）、椎間板脱出（ｓｌｉｐｐｅｄ ｄｉｓｃ）又は椎間板ヘルニア（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｄｉｓｃ）と呼ばれる。神経根障害は、脊椎骨間の板が損傷することにより起きる神経の刺激をいう。また、機械的機能障害は、椎間板変性及び疼痛（例えば椎間板変性疾患）の原因となる可能性がある。例えば、通過していく力の増加に耐えるために椎間板の限界を超える負荷をかける、ある外傷性傷害の結果として、椎間板が損傷を受ける可能性があり、輪状線維の内部又は外部が裂ける可能性もある。増大するストレスにさらされると、こうした裂けた線維が炎症反応の病巣になる可能性があり、直接的に又は深部傍脊柱筋群の補完的防御的な痙攣を介して、疼痛を引き起こすことがある。軟骨損傷又は障害に対し、いくつかの異なる治療の選択肢がある。
【００１２】
変形性関節症は、米国の高齢者において、第二番目の障害の原因である。一般に比較的穏やかに始まり、時間と摩耗により激しさを増す退行性疾患である。軽度から中等度の症状を経験する患者にとっては、いくつかの非外科的治療により対処可能な障害である。補装具の使用、及び抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン及びナプロキセン）、ＣＯＸ−２選択的阻害薬、ヒドロコルチゾン、グルコサミン、及びコンドロイチン硫酸等の薬物治療の利用により、軟骨の欠損による疼痛を緩和することが示されてきた。また、退行性過程を遅らせることができるという主張もある。
【００１３】
全関節置換を除く関節軟骨の外科治療のほとんどが、種々の治療群に分類できる。炎症及び疼痛を止めるために罹患し弱体化した軟骨を除去する治療には、切削（軟骨切除術）及び創面切除術（デブリドマン）が含まれる。別の治療グループとして、穿孔、マイクロフラクチャー術、軟骨形成術及びスポンジアリゼーション（ｓｐｏｎｇｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）等の軟骨形成を促すためのさまざまな研磨処置がある。研磨、穿孔、及びマイクロフラクチャーは、２０年前に始められた。骨の軟骨下板に対する血管損傷の後は、軟骨組織の自然治癒現象に頼る。また、現在試験的に行われているレーザー光治療は、別分類となり、罹患した軟骨の除去と軟骨再形成とを組合わせ、さらに軟骨増殖を誘導する。追加治療には、自己軟骨の移植（例えば、ジェンザイム社のカーティセル（Ｃａｒｔｉｃｅｌ）等）が含まれる。
【００１４】
半月板軟骨により適用可能な他の治療には、早期の外科的介入及び損傷した構造の縫合による修復、又は重度損傷の場合の半月板の同種移植が含まれる。
【００１５】
椎間板ヘルニア及び坐骨神経痛患者の大多数が外科手術を受けることなく治癒するが、もし外科手術が必要とされる場合、処置には椎間板ヘルニアの除去と、椎弓切開術（脊髄の周辺の脊柱の骨に小さな孔を形成する）、椎弓切除（神経組織に隣接する骨壁の除去）、経皮的な針技術（経皮的椎間板切除術）、椎間板の溶解処置（化学的髄核融解術）及びその他が含まれる。保存療法に反応せず、個人生活を送れない機械的な疼痛症候群患者では、脊椎固定術、椎間板内電熱凝固術（あるいは環状形成術）、後部動的安定化、人工椎間板技術又は、タンパク質、ペプチド、遺伝子治療、又は、ヌクレオチドを用いて行われる種々の分子療法による未だ試験的な椎間板再生療法により、その問題に対処可能である。軟骨疾患の治療としては、多くの方法が開示されてきたが、多くが人工的又は機械ベースの解決法であり、通常の軟骨組織生態の再形成を求めないのは明らかである。したがって、軟骨形成を促す方法が必要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、骨の発育、障害、又は、骨外傷性傷害において骨形成を誘導する組成物及び方法が必要とされる。
【００１７】
したがって、軟骨形成及び再生を誘導する組成物及び方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製方法に関する。その方法では、
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
ことが含まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。また、前記方法には、細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製することが含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、前記方法に、前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べることも含まれる。
【００２０】
ここで説明する発現系により産生されるＮＥＬＬタンパク質は、単独でも使用可能であるが、骨又は軟骨形成、又は再生に供する他の物質と併用することもできる。いくつかの実施形態では、ここで説明するＮＥＬＬタンパク質は、所望のあらゆる剤形の組成物を形成するために使用できる。ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。いくつかの実施形態では、前記組成物又は剤形には、キャリア、例えば医薬品としての条件を満たしたキャリアが含まれることがある。いくつかの実施形態では、基材に細胞及び／又はＮＥＬＬ１ペプチドが含まれることがあり、骨軟骨、円板又は、移植片の近傍のその他の組織の修復を促進できる。
【００２１】
本発明の実施形態には、各種の臨床的応用において骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び／又は骨形成を誘導する方法を含む。また、本発明には、各種の臨床的応用において軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を誘導する方法も含まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、既知の成長因子よりも大きな効果を与えることが可能であり、及び／又は他の成長因子の活性を強化することができる。したがって、より低用量の各成長因子を臨床的に使用可能である。これは少なくとも臨床治療がより安価になる点で意義深い。さらに、少なくともＮＥＬＬ１が骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点で、本発明は有利である。また、ＮＥＬＬ１が軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点においても、本発明は有利である。
【００２３】
ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１Ａ〜１Ｂは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
図２Ａ〜２Ｂは、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物を例示している。下線のアミノ酸配列は、メリチンシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンの間の結合は、ハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞による分泌の推定的切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧ−−−−からの残基は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
図３Ａ〜３ＤはＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の産生物を例示している。図３Ａは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞から産生した（産生率：約３ｍｇ／Ｌ培地）。図３Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。図３Ｃは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＣＯＳ７細胞から産生した（産生率：０．１ｍｇ／Ｌ培地より大きい）。図３Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。
図４Ａ〜４Ｃには、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を例示した。図４Ａは、本願実施例に使用したｃＤＮＡ構造の核酸配列及び３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。図４Ｂは、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロットである。抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後に、異なる構築物の形質転換によるＮＥＬＬ１分泌を検出している。図４Ｃは、抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットである。ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースを用いた免疫沈降後に、ＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【００２５】
本発明は、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製方法に関する。その方法では、
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
ことが含まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である。また、前記方法には、細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製することが含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、前記方法に、前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べることも含まれる。
【００２７】
ここで説明する発現系により産生されるＮＥＬＬタンパク質は、単独でも使用可能であるが、骨又は軟骨形成、又は再生に供する他の物質と併用することもできる。いくつかの実施形態では、ここで説明するＮＥＬＬタンパク質は、所望のあらゆる剤形の組成物を形成するために使用できる。いくつかの実施形態では、前記組成物又は剤形には、キャリア、例えば医薬品としての条件を満たしたキャリアが含まれることがある。いくつかの実施形態では、基質に細胞及び／又はＮＥＬＬ１ペプチドが含まれることがあり、骨軟骨、半月板又は、移植片の近傍のその他の組織の修復を促進できる。
【００２８】
本発明の実施形態には、各種の臨床的応用において骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び／又は骨形成を誘導する方法を含むものもある。また、本発明には、各種の臨床的応用において軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を誘導する方法も含まれる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、既知の成長因子よりも大きな効果を与えることが可能であり、及び／又は他の成長因子の活性を強化することができる。したがって、より低用量の各成長因子を臨床的に使用可能である。これは少なくとも臨床治療がより安価になる点で意義深い。さらに、少なくともＮＥＬＬ１が骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点で、本発明は有利である。また、ＮＥＬＬ１が軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点においても、本発明は有利である。
【００３０】
ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。
【００３１】
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では交換可能に使用してもよく、アミノ酸残基の重合体を言う。各用語は、天然に生じるアミノ酸重合体に適用されるのと同様に、１以上のアミノ酸残基が相当する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類縁体であるアミノ酸重合体にも適用されてもよい。
【００３２】
用語「抗体」は、例えば、未処理の免疫グロブリン、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域しか含有しないＦｖ断片、ジスルフィド結合で結合したＦｖ断片、可変領域及び定常領域の一部を含有するＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、単鎖抗体などのような種々の形態の改変抗体又は改造抗体を含んでもよい。抗体は、未処理の分子を含んでもよいのと同様にその断片、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２’、及び／又はエピトープ決定基に結合できる単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでもよい。抗体は、動物（例えば、マウス又はラット）又はヒト起源であってもよく、或いはキメラ抗体であってもよく、又はヒト化されてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、例えば、ＮＥＬＬ１タンパク質又はＮＥＬＬ２タンパク質によりエンコードされたポリペプチドに特異性を持つモノクローナル抗体であってもよい。
【００３３】
用語「捕捉剤」は、他の分子を特異的に結合し、例えば、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどのような結合複合体を形成する分子を言ってもよい。
【００３４】
用語「特異的に結合する」は、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を言ってもよく、異質集団の分子（例えば、タンパク質とその他の生物製剤）において存在する生体分子を同定するような結合反応を言う。従って、指定された条件下（例えば、抗体の場合は免疫アッセイ条件、核酸の場合はストリンジェントなハイブリッド形成条件等）で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合してもよく、試料に存在するそのほかの分子には有意な量では結合できない。
【００３５】
用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、共に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを言う。本発明の核酸は、場合によっては、例えば、リンアミド結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ｏ−メチルリンアミダイト結合、及び／又はペプチド核酸主鎖及び結合を含む代替主鎖を有してもよい核酸アナログを含んでもよいが、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよく、ホスホジエステル結合を含有してもよい。核酸アナログは正の主鎖及び／又は非リボースの主鎖を有してもよい。核酸はまた、１以上の炭素環式の糖を含んでもよい。リボース−リン酸の主鎖の修飾を行なって、例えば標識のような追加部分の付加を促進してもよいし、又は例えば、生理的環境におけるそのような分子の安定性高め、半減期を延ばしてもよい。
【００３６】
用語「特異的なハイブリッド形成」は、プローブがその標的の部分配列に優先的にハイブリッド形成し、他の配列により少ない程度にハイブリッド形成してもよい条件を含むストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の優先的な結合、二本鎖形成、又はハイブリッド形成を言う。
【００３７】
用語「ＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ」は、配列番号１、３及び５を指し、「ＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ」は、配列番号７、９、１１及び１３を指す。
【００３８】
ＮＥＬＬペプチド
ＮＥＬＬ１は主として骨に分布する８１０アミノ酸のペプチドである。成人では、ＮＥＬＬ１は頭蓋顔面の骨に高レベルで発現され、長骨では低レベルで発現される。骨芽細胞の分化、骨形成及び骨再生における役割については、これまでに研究されてきている。ＮＥＬＬ２は、神経細胞及び脳に分布する８１６アミノ酸のペプチドである。
【００３９】
ヒトのＮＥＬＬ１遺伝子は、プロモータ領域に少なくとも３つのＣｂｆａ１反応エレメントを含む。Ｃｂｆａ１はＮＥＬＬ１のプロモータにおけるこれらの反応エレメントに特異的に結合する。ＮＥＬＬ１の発現は、発達中及び成人の少なくとも前骨芽細胞、骨芽細胞及び肥大軟骨細胞で内生的に発現されるこの転写因子の制御下にあってもよい。鎖骨頭蓋骨形成不全症は、少なくとも部分的にはＣｂｆａの破壊により生じると考えられている発達上の頭蓋欠陥である。
【００４０】
ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＮＥＬＬ１遺伝子又はｃＤＮＡにより発現されるタンパク質であり、配列番号２、４及び６を含む。ＮＥＬＬ１ペプチドには、骨形成細胞の分化、骨芽細胞の分化又は骨形成を誘導する能力を保持するＮＥＬＬ１ペプチド断片が含まれてもよい。ＮＥＬＬ２ペプチドは、ＮＥＬＬ２遺伝子又はｃＤＮＡにより発現されるタンパク質であり、配列番号８、１０、１２及び１４を含む。ＮＥＬＬ２ペプチドには、ＮＥＬＬ２ペプチド配列全体と同様の活性を保持するＮＥＬＬ２ペプチド断片が含まれる場合がある。
【００４１】
ここで言う用語「誘導体」とは、ＮＥＬＬペプチド由来のあらゆる化合物もしくは生体化合物、又は化学物質もしくは生体物質、構造的にそれらと同等の物質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）又は立体配座がそれらと同等の物質（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ)を指す。例えば、こうした誘導体には、プロドラッグ型、ペグ化型、又は、ＮＥＬＬペプチドをより安定化し、又はより優れた親骨性又は親油性をもたせるその他のあらゆるＮＥＬＬペプチドの形態が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、誘導体は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（アミノ酸）、炭素数が１〜２０のヒドロカルビル短鎖、又は生体適合ポリマーと結合したＮＥＬＬペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、用語「誘導体」には、ＮＥＬＬペプチドミメティックスが含まれる可能性がある。ここで使用する用語「ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ；模倣物）」は、その主鎖に少なくとも１つの非ペプチド結合をもつペプチドを指す。ペプチド結合は、１つのアミノ酸分子のカルボン酸基と別のアミノ酸分子のアミノ基との間に形成される化学的結合である。
【００４２】
ペプチドミメティックスの合成については、この分野の文献に詳述されている。以下に、ペプチドミメティックスを含むペプチド合成の基本的手順の一例を説明する。
【００４３】
ペプチド合成を開始する前に、アミノ酸のアミン端末（出発物質）をＦＭＯＣ（９−フルオロメチルカーバメート）又は他の保護基で保護してもよく、開始剤としては、メリフィールド樹脂（遊離アミン）等の固形単体が使用される。次に、以下のステップ（１）〜（３）の反応を行い、所望のペプチドが得られるまでこれを繰り返す。（１）カルボジイミド化学を用いて、遊離アミンをカルボキシル末端と反応させ、（２）アミノ酸配列を精製し、且つ（３）ＦＭＯＣ保護基等の保護基を弱酸性条件で除去して遊離アミンを得る。その後、ペプチドを樹脂から切断して、独立のペプチド又はペプチドミメティックスを得ることができる。
【００４４】
１つの実施形態においては、その方法には分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸配列のあるフレーム内に、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を提供することが含まれる。１つの実施形態においては、分泌シグナルペプチドが、分泌されたハナバチタンパク質由来の分泌シグナルペプチドである。例えば、核酸配列は、メリチンシグナル配列、ドロスフィラ免疫グロブリン結合タンパク質シグナル配列、ウマインターフェロン−ガンマ（ｅＩＦＮ−ｇａｍｍａ）シグナルペプチド、ヘビホスホリパーゼＡ２阻害物質シグナルペプチド、ヒト及び／又はニワトリリゾチームシグナルペプチドを含むがこれら例示に限定されない群から選択できる。哺乳類発現系については、プロトリプシン先導配列も使用可能である。
【００４５】
１つの実施形態においては、その方法にはＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で昆虫細胞株を形質転換し；且つ、ＮＥＬＬペプチドを発現及び／又は分泌させる条件下で昆虫細胞株を培養することが含まれる。例えば、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物により、一時的に又は安定的にその細胞株を形質転換することができる。
【００４６】
ＮＥＬＬペプチド発現系
ＮＥＬＬペプチドは、あらゆる生物系で発現可能である。例えば、ＮＥＬＬペプチドの発現は、細菌系、酵母系、植物系又は動物系で可能である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、この技術分野で周知の無細胞発現系で発現される。例えば、大腸菌無細胞タンパク質翻訳系、又はコムギ胚芽無細胞タンパク質翻訳系が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、タバコ、トウモロコシ、コメ、又はダイズ由来のトランスジェニック植物細胞系において発現可能である。
【００４９】
このような発現系には、ウイルス性キャリア、又はウイルス性ベクター、ペプチドキャリア、又は短鎖ポリマー分子等のキャリアが含まれうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、昆虫細胞にて発現される。昆虫系で発現されるＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２ペプチドは、そのタンパク質の機能的形態である。
【００５１】
培地１リットルあたり約１０μｇ程度の低濃度のＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質を産生するのに、ＣＯＳ７細胞を使用することができるが、発現には、血清含有培地が必要となる。シグナルペプチドについては、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２内因性シグナルペプチドにより、ＣＯＳ７細胞での発現が可能になる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、昆虫細胞株を用いたＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等の機能的ＮＥＬＬペプチドを発現する方法が含まれる。１つの実施形態では、昆虫細胞はＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、Ｓｆ９及び他のＳｆ細胞であってもよい。
【００５３】
１つの実施形態では、その方法には、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等の機能的ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を提供することが含まれる。その核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、そのような核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含む非限定的な群から選択することができる。また、その核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれる。
【００５４】
さらに、その核酸には、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を発現する発現ベクターが含まれてもよい。例えば、そのような発現ベクターとしては、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）が挙げられ、選択マーカーには、ブラストサイジン及びネオマイシン等がある。
【００５５】
さらに、前記核酸配列には、遺伝子発現レベルをモニターするためのレポーター生成物をエンコードする付加的な核酸、又は、ペプチド発現レベルをモニターするため、この技術分野において公知の方法を用いて視覚化可能なペプチド標識をエンコードする付加的な核酸も含まれる可能性がある。付加的な配列は、前記核酸の発現又は発現されるペプチド産物の機能性を阻害しないように、選択可能である。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明には、昆虫細胞においてＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物が含まれる可能性がある。前記核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、前記核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含むが非限定的な群から選択できる。また、前記核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれてもよい。
【００５７】
本発明の１つの実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の哺乳類細胞においてＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物が含まれる。前記核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、前記核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含むが非限定的な群から選択できる。また、前記核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）におけるＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドの産生について、ＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２の発現系には、内因性シグナルペプチドを発現する核酸又はｃＤＮＡが含まれる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドの発現系には、ＮＥＬＬ２シグナルペプチドを発現する核酸又はｃＤＮＡが含まれる可能性がある。ＮＥＬＬ１ペプチドの発現系にＮＥＬＬ２シグナル核酸又はｃＤＮＡを取り込むことで、ＮＥＬＬ１ペプチドの産生をより効果的にできる。
【００５９】
前記核酸構築物には、シグナルペプチドをエンコードする核酸配列が含まれてもよい。前記核酸には、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を発現する発現ベクターが含まれてもよい。さらに、前記核酸配列には、遺伝子発現レベルをモニターするためのレポーター生成物をエンコードする付加的な核酸、又は、ペプチド発現レベルをモニターするため、この技術分野において公知の方法を用いて視覚化可能なペプチド標識をエンコードする付加的な核酸が含まれてもよい。
【００６０】
核酸構築物は、ベクターにより形質転換される宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をエンコードする遺伝子等の選択遺伝子（選択可能なマーカーとも言われる）を含有するのであれば、発現及びクローニングベクターから構成されてもよい。この遺伝子の存在により、前記ベクターを削除する宿主細胞は、形質転換宿主に対して、増殖又は複製において利点が得られないことが確認できる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリン等の抗生物質又は他の毒素に対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性の不良を補完するタンパク質をエンコードする。
【００６１】
また、核酸構築物には、宿主生物に認識されＮＥＬＬをエンコードする核酸に操作可能に結合されるプロモーターが含まれる可能性もある。プロモーターは、制御下にある核酸の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流に配置される非翻訳配列（一般に約１００〜１０００塩基対以内）であり、誘導及び構成的プロモーターを含む。誘導プロモーターは、例えば、栄養素の有無、又は温度変化等の培養条件の何らかの変化に対応して、制御下にあるＤＮＡからの転写レベルの上昇を開始させるプロモーターである。現時点で、各種の宿主細胞候補により認識される多数のプロモーターがよく知られている。
【００６２】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、操作可能に結合できる。例えば、プレ配列用のＤＮＡ、又は分泌リーダー配列は、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、操作可能に該ポリペプチド用ＤＮＡに結合する；プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に作用する場合、操作可能に該コード配列に結合する；又は、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するように配置されている場合、操作可能に該コード配列に結合する。
【００６３】
本発明の１つの実施形態では、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現する細胞が含まれる可能性がある。例えば、その細胞はＣＨＯ細胞であってもよい。１つの実施形態では、その細胞は、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で形質転換される可能性がある。例えば、その細胞株は、一時的又は安定的にＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で形質転換されてもよい。１つの実施形態では、ＮＥＬＬ発現性核酸（例えば、ｃＤＮＡなど）は、（昆虫細胞又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の）トランスフェクト細胞に対してコンピテントである遺伝子発現ベクター又はウイルス粒子にクローニングされる可能性がある。
【００６４】
また、その核酸配列には、昆虫分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸配列をもつフレーム内にＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列が含まれる可能性がある。
【００６５】
本発明の１つの実施形態では、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現する細胞が含まれ、機能タンパク質を分泌できる場合がある。
【００６６】
本発明の１つの実施形態では、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを有するポリペプチド（アミノ酸配列）が含まれ、分泌シグナルペプチドが含まれる可能性がある。
【００６７】
例えば、ＮＥＬＬペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号４）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号６）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）を含むが非限定的な群から選択できる。また、そのアミノ酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれる可能性もあり、又は、ＮＥＬＬ１ペプチドと同様の活性のある結合ドメインを含む可能性もある。
【００６８】
ペプチド精製
いくつかの実施形態では、本発明には、標準的なペプチド精製手順に準じて、培地に分泌されるＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドを精製する方法が含まれる。本発明の精製方法としては、非限定的な例として、以下が挙げられる。
【００６９】
また、その方法には、分泌されたＮＥＬＬペプチドを回収し、且つ／又は使用に際してＮＥＬＬペプチド精製することも含まれる可能性がある。ペプチド産物について、各種の機能性アッセイ又は発現アッセイにて活性試験を行う可能性がある。例えば、どのアッセイにおいても、もしＮＥＬＬペプチドが、所定のパラメータに関しコントロール物質に対して顕著な効果を有する場合、そのＮＥＬＬペプチドは、測定パラメータに作用する機能性を有すると言える。
【００７０】
１つの実施形態では、選択された細胞が選択された核酸配列を発現し、ＮＥＬＬペプチドを発現及び／又は分泌するか否かを検証する。１つの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの有無、量、及び／又は活性が検証される。
【００７１】
１つの実施形態では、その技術分野の当業者に周知の多くの方法のいずれかにより、ＮＥＬＬペプチドを検出及び定量した。これらには、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等の生化学的な分析方法、又は、流体又はゲル内沈降反応、（一元又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動法、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング等の各種の免疫学的方法等が含まれる。
【００７２】
１つの実施形態では、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析を使用して、選択されたサンプル中のＮＥＬＬペプチドの有無を検出及び定量する。この技法には、タンパク質サンプルをゲル電気泳動法により分子量ベースで分離し、分離したタンパク質を適切な固形単体（ニトロセルロース膜、ナイロン膜、又は、誘導体化ナイロン膜など）に転写し、且つそのサンプルを標的ペプチドに特異的に結合する抗体とともにインキュベートすること等が含まれる。
【００７３】
本発明の分析は、この技術分野の当業者に周知の標準的な方法に従って、（標的ポリペプチドの有無（陽性又は陰性）又は量で）評価してもよい。評価法は、分析形式及び標識の選択により決められる。例えば、ウェスタンブロット分析であれば、酵素標識により産生される着色生成物を可視化することにより評価される。正しい分子量で明瞭に可視化された着色のバンド又はスポットが、陽性結果として評価され、明瞭に可視化された着色のバンド又はスポットがない場合には、陰性として評価される。バンド強度又はスポット強度が、標的ポリペプチド濃度の定量的尺度となる。
【実施例】
【００７４】
組換えタンパク質の産生及び精製方法は、この分野の当業者に周知の技術であり、複数の営利企業がタンパク質産生サービスを提供している。以下の例は、本発明を説明するために提示するが、本発明を限定するものではない。一般的に、発現の宿主は、細菌類、酵母及び菌類、哺乳類細胞、植物、トランスジェニック動物（例えば、山羊乳）であってもよく、また、コムギ胚芽又は大腸菌抽出物等に基づく無細胞発現系であってもよい。一般的に、発現エレメントは、原核生物、酵母、哺乳類及び植物プロモーター、又はウイルス性プロモーターであってよい。タンパク質発現ストラテジーとしては、細胞内又は細胞外ストラテジー、融合タンパク質ストラテジー及びディスプレイストラテジーが挙げられる。組換えタンパク質の後処理プロセスには、集菌、溶菌、ろ過、限外ろ過、沈殿、及び／又は、タンパク質回収、中間精製、最終精製、及び最適化を包含するその他のタンパク質処理／精製ストラテジーが含まれてよい。
【００７５】
実施例１ ＮＥＬＬペプチドの発現
ｃＤＮＡ断片は、発現ベクターＰｉＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（３．４ｋｂ）（ＥｃｏＲＶ部位、インビトロジェン社）内にライゲーションされ、メリチンシグナルペプチド、ラット成人ＮＥＬＬ１及びＦＬＡＧ標識配列のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を含有した。図２Ａ〜２Ｂは、本実施例において使用したｃＤＮＡ構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示している。
【００７６】
ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）を、無血清培地に適応させ、細胞をＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターで形質転換した。ＮＥＬＬ１ＦＬＡＧ構築物を発現する細胞集団のみを選択するように、細胞をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）処理した。生存した細胞集団は、安定した形質転換細胞であることが確認された。細胞外培地を回収し、ＮＥＬＬ１ペプチドの有無を調べた。ＮＥＬＬ１ペプチドを精製して以下の機能分析に用いた。
【００７７】
図２Ａは、ＵｎｏＱ溶出液に含有される精製済みのＮＥＬＬ１ペプチドのＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。前記培地をＵｎｏＱカラム（バイオラッドラボラトリーズ社）に添加した。図２Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロットを示す。このウェスタンブロットにより、タンパク質ラダーを参照してＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現が示される。ペプチド：１４０ｋＤａ（細胞内前駆物質）、１３０ｋＤａ（成熟形態；９０ｋＤａペプチド）、４００ｋＤａ（分泌形態、ホモ三量体）。上記の例では、発現系の生産性は、約３ｍｇ ＮＥＬＬ１ペプチド／Ｌ培地だった。
【００７８】
ペプチドをまったく発現も分泌もしない（例えば、酵母を含む細菌発現）、又は、ペプチド産生が非常に低い（例えば、大腸菌融合ペプチド系、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞、＞１０ｍｃｇ／Ｌ）他の発現系と比較すると、上述の系（哺乳類及び昆虫細胞）での産生は、大量の機能タンパク質を産生する点で予想外に十分に効果的であった。
【００７９】
組換えラットＮＥＬＬ１タンパク質の発現及び精製
昆虫細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ１ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミド（黒田ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ参照）由来のＦＬＡＧエピトープ配列に融合しているラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを昆虫発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。さらに、ＰＣＲ法により、ＮＥＬＬ１オリジナル分泌シグナル配列をミツバチメリチンシグナル配列と置換した。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を、インビトロジェン社から購入し、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞用の無血清培地（インビトロジェン社）にて培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用いて、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞をｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドで形質転換した。形質転換から４８時間後に、４００ｍｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン社）により細胞を選択した。安定した発現細胞株が樹立されるまで、３〜４日ごとに選択培地を交換した。免疫沈降及びウェスタンブロット分析によりＮＥＬＬ１分泌を確認した。Ｈｉｇｈｆｉｖｅ細胞が培地においてＮＥＬＬ１ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現していることがわかった。
【００８０】
ＵＮＯ Ｑ−１カラム（バイオラッド社）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ゼオシン耐性ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞の培地から組換えラットＮＥＬＬ１−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ１ペプチドを５００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
【００８１】
ＣＯＳ７細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ１ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミド由来のＦＬＡＧエピトープ配列に結合したラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭでＣＯＳ７細胞を培養した。内因性ＮＥＬＬシグナルペプチドプラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣでＣＯＳ７細胞を形質転換した。形質転換から４８時間後に、ＮＥＬＬ１ペプチド検出のため、培地について免疫沈降及びウェスタンブロット分析を行った。
【００８２】
図３Ｃに、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ含有のＵｎｏＱ溶出液のＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。これらの発現分析により、ＣＯＳ細胞は、シグナル配列を含むようにする等、分泌効率を向上するためにＮＥＬＬのＮ末端を修飾しなければ、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現しないことが示された。図３Ｄは、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現を示す抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロットの結果である。
【００８３】
組換えラットＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製
昆虫細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ２ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ２−ＦＬＣプラスミド由来のＦＬＡＧエピトープ配列に融合したラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡを昆虫発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞をインビトロジェン社より購入し、ＨｉｇｈＦｉｖｅ無血清培地（インビトロジェン社）にて培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用いて、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドでＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を形質転換した。形質転換から４８時間後に、４００ｍｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン社）で細胞を選択した。安定した発現細胞株が樹立されるまで、３〜４日ごとに選択培地を置換した。免疫沈降及びウェスタンブロット分析により、培地でのＮＥＬＬ２発現を確認した。Ｈｉｇｈｆｉｖｅ細胞が培地においてＮＥＬＬ１ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現していることがわかった。
【００８４】
ＵＮＯ Ｑ−１カラム（バイオラッド社）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ゼオシン耐性ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞の培地から、組換えラットＮＥＬＬ２−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ２−ＦＬＣペプチドを５００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
【００８５】
実施例２ 哺乳類系でのＮＥＬＬ１の発現
本発明には、非ウイルス性ＤＮＡデリバリーによるｒｈＮＥＬＬ１産生に用いる哺乳類発現系が含まれてもよいが、該発現系は表１に挙げる一般的な安定した懸濁液系に限定されない。ベクター設計、宿主細胞株培養、形質転換、安定した細胞株の選択、及びＨＥＫ２９３やＣＨＯ系におけるｒｈＮｅｌｌ−１の精製を含む比較的詳細な手順を以下に示すが、該手順は、この技術分野において周知のものである。
【００８６】
表１に、ｒｈＮｅｌｌ１の産生に使用した哺乳類の発現系をまとめた。
【表１】
【００８７】
Ａ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃１
ベクター設計：
ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐ３ＸＦｌａｇ−ＣＭＶ（シグマ社）にライゲーションした。得られた発現構築物、ｐＣＭＶ−ｒｈＮＥＬＬ３Ｘｆｌａｇには、プレプロトリプシン先導配列、ヒト成人ＮＥＬＬ１コーディング領域のｃＤＮＡ断片及びＣ末端３Ｘｆｌａｇ配列が含まれる。
【００８８】
ホスト細胞株：
ＣＨＯ−Ｋ１は接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。ｐＣＭＶ−ｒｈＮｅｌｌ−１−３Ｘｆｌａｇの構築物を、リポフェクトアミン（インビトロジェン社）又はリン酸カルシウム処理して形質転換した。約２週間にわたってＧ４１８（４００〜６００μｇ／ｍｌ）を細胞培地に添加し、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るため、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００８９】
精製方法：
抗ｆｌａｇ抗体Ｍ２（シグマ社）アフィニティーカラムにより、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培地又は細胞溶解物を天然条件下で精製し、３Ｘｆｌａｇペプチドで溶出した。
【００９０】
Ｂ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃２
ベクター設計：
図４Ａに、ｃＤＮＡ構築物の核酸配列及び該構築物に用いられる３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００９１】
ホスト細胞株：
ＣＨＯ−Ｋ１は、接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。リポフェクトアミン（インビトロジェン社）又はリン酸カルシウム処理を行って、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＩＬ２−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ又はｐＮ２−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓの構築物を形質転換した。約２週間にわたってＧ４１８（４００〜６００μｇ／ｍｌ）を細胞培地に添加して、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るため、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９２】
精製方法：
抗ｃ−ｍｙｃアガロースによる免疫沈降により、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培養液又は細胞溶解物を精製した。図４Ｂは、抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後の異なる構築物の形質転換に起因する、ＮＥＬＬ１分泌を検出する抗ｃ−ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロットの結果である。図４Ｃは、ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースによる免疫沈降後のＮＥＬＬ１分泌を検出する抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットの結果である。
【００９３】
Ｃ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃３
ベクター設計：
ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２リーダーペプチド配列のいずれかを用いて独自開発のｃＤＮＡ構築物（Ａｒａｇｎｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）社又はサイトバンス（Ｃｙｔｏｖａｎｃｅ）社）を構築した。
【００９４】
ホスト細胞株：
独自開発のＣＨＯ細胞株は、接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。特許構築物を形質転換した。約２週間にわたって適切な因子を細胞培地に添加して、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るために、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９５】
精製方法：
この技術分野において周知の分析的・調製的タンパク質精製方法により、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培地又は細胞溶解物を精製した（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど）。
【００９６】
濃縮方法：
ｒｈＮＥＬＬ１を凍結乾燥又は限外ろ過法により濃縮した。
【００９７】
Ｄ．ＨＥＫ２９３系
ベクター設計：
ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ（インビトロジェン社）にライゲーションした。得られた発現構築物、ｐＳｅｃ−ｈＮｅｌｌ−１−Ｔａｇには、ネズミ免疫グロブリンκ鎖リーダー配列、ヒト成人ＮＥＬＬ１コーディング領域のｃＤＮＡ断片、及びＣ末端へのＭｙｃ及びＨｉｓ配列の二重修飾が含まれる。
【００９８】
ホスト細胞株：
無血清培地に適応させ、懸濁形態で成長させたヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ−２９３を、ＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターｐＳｅｃ−ｈＮｅｌｌ−１−Ｔａｇで形質転換した。ｒｈＮｅｌｌ−１精製のために馴化培地を回収する前に、細胞を一過性形質転換として数日間培養し、又は安定した発現細胞株を選択するためにゼオシン（２５０μｇ／ｍｌ）処理を行った。さらに、ｒｈＮｅｌｌ−１産生率の高い単一クローンを得るため、安定した形質転換細胞を限界希釈法で選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９９】
精製方法：
Ｎｉ２＋アフィニティーカラムにより、天然条件下でｒｈＮｅｌｌ−１ペプチド含有培地を精製し、１Ｍイミダゾールで溶出した。少なくとも１０００体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で２０時間の大規模な透析後、ｒｈＮｅｌｌ−１について、完全性、純度及びバイオ活性試験を行った。
【０１００】
また、既存のリーダー配列をラット血清アルブミン、ＣＤ３３、ｔＰＡ及びヒトインターロイキン−２リーダー配列等の新たなものと置換し、又は、ＤＨＦＲ又はＧＳ等の遺伝子増幅の標的を主鎖配列に添加するために、親ベクターの組換えを行い、結果として新たな発現ベクター及び発現系ができる。本発明では、ヒトＮｅｌｌ−１の天然シグナルペプチドはタンパク質分泌を導くには充分に効果的ではなく、外来の先導配列がよく機能しなかった場合すらある。したがって、タンパク質内にＨｉｓ標識及びタンパク質分解的切断部位「ＭＰＨＨＨＨＨＨＧＧＧＤＤＤＤＫＤＰＭ」を有するスペーサーによるヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の低分子の天然分泌タンパク質のフレーム内融合発現ベクターを構築する必要があった可能性もある。Ｎｅｌｌ−１精製に用いるエピトープ標識としては、６ＸＨｉｓｔｉｄｉｎｅｓ、３ＸＦｌａｇ、Ｍｙｃ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＥＧＦＰ又はＣＴＨＳ（ＳＵＭＯ（ユビキチン類似因子）のＣ末端側半分）などが挙げられるが、上記表１に示したプラスミドｐＳｅｃＴａｇのようにＨｉｓ及びＭｙｃの二重標識であってもよい。
【０１０１】
さらに、特定の条件下でのｒｈＮｅｌｌ−１の発現制御又は誘導を検証するために、ＩＲＥＳによるジシストロン又はマルチシストロンベクターを構築してもよかった。より継続的な増殖及びアポトーシスの遅延を得るための、又はＴｅｔ（テトラサイクリン）誘導系及びＦＩｐ−Ｉｎ特定部位統合系等の特別な要求に対応可能な宿主細胞株の遺伝子組換えは、ｒｈＮｅｌｌ−１産生を向上させると考えられる。
【０１０２】
上述したｒｈＮｅｌｌ−１産生のための安定した発現系の他に、我々は、予備的な代替手段又は安定した系に相互補完可能な手段として、数ミリグラムの精製済みのプラスミドベクター（ｐＲＥＰ４）を用いて、陽イオンポリマーＰＥＩでＨＥＫ２９３又はＢＨＫ懸濁細胞を形質転換する大規模な一過性トランスフェクション（ＬＳＴ）アプローチを確立するという可能性を除外しない。
【０１０３】
実施例３ 培養液中のＮＥＬＬ２タンパク質の精製
ｐＩＺＴ−ＦＬＣ−ＮＥＬＬ２を保有するＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を無血清培地（１Ｌ）で約３日間培養した。その培地を３０００ｘｇで５分間遠心し、上澄みを回収した。ＰＭＳＦを終濃度１ｍＭになるように添加した。飽和硫酸アンモニウム溶液（８０％飽和（ｖ／ｖ））を添加して、溶液を４℃で１時間静置した。その溶液を１５０００ｘｇで３０分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を４℃で５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、４℃で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーＵｎｏＱカラム（６ｍｌ、バイオラッド社）に添加した（速度１ｍｌ／分、ＦＰＬＣ（アマシャムファルマシア社）を使用）。そのカラムを同一バッファーで十分に洗浄した。
【０１０４】
次に、結合しているタンパク質を０Ｍ〜１．５ＭのＮａＣｌ勾配で同一バッファーにて溶出した。抗ＦｌａｇＭ２（シグマ社）抗体を用いて、ＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧ画分をウェスタンブロットで同定した。陽性の画分を１つの試験管に回収した。最終生成物をセルロース製のシームレスチューブ（和光純薬工業株式会社、カットオフ分子量１２０００）に１ＬのＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。得られた生成物を−７０℃で保存した。
【０１０５】
本発明の具体的な実施形態を示し、説明してきたが、本技術分野における当業者にとって、本発明から広義に逸脱しない限り変更及び修正を行うことが可能であることは自明である。したがって、添付の請求項は、本発明の真の精神及び範囲内に含まれるような全ての変更及び修正をその範囲内に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａに、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示す。下線のアミノ酸配列は、メリチンシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンの間の結合は、ハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞による分泌の推定的切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧ−−−−からの残基は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
【図２Ｂ】図２Ｂに、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄに、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の産生物を示す。図３Ａは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞から産生した（産生率：約３ｍｇ／Ｌ培地）。図３Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。図３Ｃは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＣＯＳ７細胞から産生した（産生率：０．１ｍｇ／Ｌ培地より大きい）。図３Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、本願実施例に使用したｃＤＮＡ構造の核酸配列及び３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロットである。抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後に、異なる構築物の形質転換に起因するＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットである。ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースを用いた免疫沈降後に、ＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援を受けた研究開発のもとで行われた発明の権利に関する声明
本研究は、ＮＩＨ／ＮＩＤＲ助成金番号ＤＥ９４００及びＣＲＣ／ＮＩＨ助成金番号ＲＲ００８６５による支援を受けた。米国政府は本発明に特定の権利を有しうる。
本願は、２００５年８月５日に米国に出願された米国出願番号１０／５４４，５５３の一部継続出願である。なお、米国出願番号１０／５４４，５５３は、２００４年２月９日に国際出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００４／００３８０８および２００６年２月１６日に国際出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３の米国への移行出願である。参照により上記出願にて教示される全内容が組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般にＮＥＬＬペプチド又は関連物質の発現および精製方法に関する。
【０００３】
成長因子は、生体内又は試験管内で規定された細胞集団の増殖及び分化に影響を及ぼすペプチド等の物質である。
【０００４】
骨形成は、長骨（軟骨内の骨形成）及び扁平骨（膜内の骨形成）の発達中に起きる。さらに、骨形成は、骨格の整合性を維持するために成人で継続して生じる骨再形成中にも起きる。また、骨形成は、骨折又は手術で骨創傷が生じた場合等の骨修復中にも起きる。長骨および扁平骨の胎生発育には、個々の骨形成メカニズムが関与すると考えられているが、修復には、膜内骨形成が関与すると考えられている。
【０００５】
いずれのメカニズムによる骨形成にも、成長因子により調節される骨芽細胞の活性が関与する。骨芽細胞は、骨髄間質細胞（間葉幹細胞：ＭＳＣとしても知られる）のプールに由来する。これらの細胞は種々の組織に存在するが、骨髄間質で優勢である。ＭＳＣは、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞及び脂肪細胞を含む多様な細胞種に分化することができる。成長因子は、骨形成性細胞の増殖、分化及び骨芽細胞の石灰化に影響を与えると考えられ、そのそれぞれが骨形成に影響を与える。
【０００６】
例えば、頭蓋骨癒合症の患者及び中裂移植の患者で骨を修復させる場合は、自家骨が用いられてきた。頭蓋縫合が早期に閉鎖してしまう頭蓋骨癒合症（ＣＳ）は、３，０００人に１人の乳児で起きており、最も一般的なヒトの頭蓋及び顔面の変形の１つである。縫合の閉鎖が早過ぎると、頭蓋の二形性を生じ、手術による矯正を必要とする可能性がある。ヒトのＣＳにおける早過ぎる縫合の閉鎖は、頭蓋冠の過形成及び骨融合という２つのおそらく別個の過程により生じる可能性がある。最近では、ＣＢＦＡ−１が介在する経路による頭蓋縫合の早過ぎる融合に線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）および線維芽細胞成長因子 受容体１（ＦＧＦＲｌ）が関与するとみなされている（８）。縫合の遅延閉鎖として現れる鎖骨頭蓋異形成症には、ＣＢＦＡ１のミスセンス変異が関連している。
【０００７】
例えば、腸骨稜又は頭蓋冠からの自家骨を利用して自家骨移植処置が行われている。これらの供給部位は、腸骨稜については、疼痛、歩行障害、大腿の知覚異常等の病的状態と無関係ではなく、頭蓋冠移植については、感染、神経障害及び血腫を含む病的状態と無関係ではない。さらに、供給部位は、容積が限定され、且つ手術時間及び入院期間を長くする可能性がある。
【０００８】
異種移植材料も利用されており、動物モデルでは成長因子も検討されている。例えば、ｂＦＧＦは骨の再生及び修復に使用可能である。骨形成性成長因子の別のファミリーには、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）がある。具体的には、ＢＭＰ−２組換えタンパク質が下顎連続性障害及び口蓋裂を再生し、自家骨微粒子及び骨髄と同等又はそれ以上の結果が得られたことが明らかにされている。ＢＭＰ及びその他の骨形成因子の臨床応用については研究が続けられている。しかしながら、最小の有効性を上げるのに使用するＢＭＰ投与量のコストが臨床での使用の限定要因になっている。
【０００９】
脊椎固定は、脊柱の１以上の椎骨をその間での動きがもはや生じないように一体化する手術法である。適応には、骨折（破壊）した椎骨の治療、変形の矯正、動きによる疼痛の除去、不安定性の治療、及び一部の頸椎椎間板ヘルニアの治療が挙げられる。手術には、椎骨間に骨移植片を留置して椎骨間のしっかりした結合を得ることが含まれる。その処置には、プレート、ネジ、ケージ及び最近では、骨形態形成タンパク質２及び７を留置して骨移植片の安定及び癒合を助けること等の補完治療も含まれる。自家骨移植は臨床的に好ましい方法ではあるが、未だに３０〜５０％の失敗率を有する。自家骨移植は別個の手術であり、重大な病的状態ももたらす。
【００１０】
軟骨は、密性結合組織の一種である。硬いゲル状の基質に分散された軟骨細胞からなる。軟骨は、無血管組織（血管が存在しない）であり、栄養素は基質を介して拡散する。軟骨は、関節、胸郭、耳、鼻、咽喉及び椎間板の間にみられる。軟骨には主に、硝子質（例えば、肋骨軟骨、鼻、気管及び気管支の軟骨、及び関節の関節軟骨）、弾性（例えば、外耳、外耳道、耳管の一部、喉頭蓋、及び喉頭部軟骨の一部）及び線維軟骨［例えば、半月板（例えば、手首の三角線維軟骨複合体、膝半月板）、椎間板、側頭下顎骨関節板、恥骨結合、及び骨と結合している腱及び靱帯の一部］の３種類がある。軟骨の主な目的の一つは、（軟骨内骨化中に）骨沈着が開始できるようなフレームワークを提供することである。軟骨のもう一つの重要な目的は、関節接合している骨を動かすための平滑表面を提供することである。例えば、関節軟骨（最も顕著には膝関節においてみられる関節軟骨）は、一般に非常に低摩擦で、耐摩耗性が高く、且つ再生性に乏しいことを特徴とする。軟骨は膝関節の耐圧縮性及び耐荷重性の大半に関与しており、軟骨がなければ、歩行には痛みを伴い、不可能である。さらに、軟骨のもう一つの重要な目的は、堅いが柔軟性のあるサポート（例えば、鼻軟骨、脊椎円板、気管軟骨、膝半月板、気管支軟骨）を提供することである。例えば、半月板等の軟骨は、関節の安定、潤滑、及び力伝達に極めて重要な役割を果たしている。体重の負荷を受けながら、半月板は、脛骨上の均衡のとれた位置に大腿骨を保持し、接触面を増やすことにより、圧縮力を分散させて、結果的に平均応力を２〜３倍縮小させている。しかも、半月板は関節液と相互に作用し、その摩擦係数は、氷上の氷の５倍も潤滑性に優れたものとしている。また、例えば、椎間板には、スペーサーとしての機能、緩衝装置としての機能、及び動作単位としての機能を含むいくつかの重要な機能がある。椎間板のゲル状の中央部は、髄核と呼ばれる。髄核の８０〜９０％が水で構成されている。核の固形部は、ＩＩ型コラーゲン及び非凝集性のプロテオグリカンである。髄核周辺の外側の靱帯の輪は、線維輪と呼ばれ、油圧式に核をシールし、椎間板が荷重されると、椎間板内圧力を上昇させる。線維輪は、ラジアルタイヤの層とは異なり重なり合う半径方向のバンド（ｒａｄｉａｌ ｂａｎｄ）を有し、これにより、線維輪を介して、垂直荷重下で破裂することなくねじり応力が分散される。椎間板は油圧シリンダーとして機能する。線維輪は核と相互作用する。核に圧力がかかると、輪状線維が封じ込め機能を発揮し、核の突出やヘルニアを防ぐ。
【００１１】
軟骨は、摩耗、損傷又は疾患により破損する。加齢に伴い、人体の軟骨中の水及びタンパク質の含有量が変化する。この変化により、軟骨がより弱く、より脆く薄くなる。変形性関節症は、軟骨障害の一般的状態であり、動作が限定され、骨損傷とともに常に疼痛を伴う。急性ストレスと慢性疲労が組み合わされることで、変形性関節症は、関節接合している表面の摩耗に直接的に現れ、極端な例では、骨が関節に露出することもある。また、例えば、保護安定化半月板の損失は、関節弛緩症の増加、又は関節の不安定化の原因となる異常な動きを引き起こす。過剰な動き及び接触面の狭小化により、早期の関節炎の病変を進める。細胞レベルでは、まず、関節軟骨の表層から細胞が失われた後に、軟骨が割れ、その後薄くなって、浸食が起き、最終的には下層の骨が剥き出しになる。最も初期の関節炎の病変は、半月板全体が損失してから３週間で現れる。また、例えば、半月板及び脊椎骨を束にする関節（面関節）の双方が部分的に軟骨で構成されるため、これらの面が、時間の経過に伴う摩耗及び裂傷の対象となる（退行性変化）。内部の核が水分を失うために、半月板のスペースが狭小化し、余剰の輪状靱帯が膨隆する。核の脱水が進むと、輪状線維に亀裂や裂傷が起きる。通常の軟組織の張力が失われることで、脊髄分節を、亜脱臼させる場合もあり（例えば、関節の部分的な脱臼）、骨棘形成（骨の突起）、大孔狭窄、機械的不安定、及び疼痛が引き起こされる。輪状線維が伸張又は破裂した場合、圧力を受けた核物質の隆起、又はヘルニアを生じさせ、且つ神経組織を圧迫し、疼痛及び脆弱性をもたらす可能性がある。この状態は、神経圧迫（ｐｉｎｃｈｅｄ ｎｅｒｖｅ）、椎間板脱出（ｓｌｉｐｐｅｄ ｄｉｓｃ）又は椎間板ヘルニア（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｄｉｓｃ）と呼ばれる。神経根障害は、脊椎骨間の板が損傷することにより起きる神経の刺激をいう。また、機械的機能障害は、椎間板変性及び疼痛（例えば椎間板変性疾患）の原因となる可能性がある。例えば、通過していく力の増加に耐えるために椎間板の限界を超える負荷をかける、ある外傷性傷害の結果として、椎間板が損傷を受ける可能性があり、輪状線維の内部又は外部が裂ける可能性もある。増大するストレスにさらされると、こうした裂けた線維が炎症反応の病巣になる可能性があり、直接的に又は深部傍脊柱筋群の補完的防御的な痙攣を介して、疼痛を引き起こすことがある。軟骨損傷又は障害に対し、いくつかの異なる治療の選択肢がある。
【００１２】
変形性関節症は、米国の高齢者において、第二番目の障害の原因である。一般に比較的穏やかに始まり、時間と摩耗により激しさを増す退行性疾患である。軽度から中等度の症状を経験する患者にとっては、いくつかの非外科的治療により対処可能な障害である。補装具の使用、及び抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン及びナプロキセン）、ＣＯＸ−２選択的阻害薬、ヒドロコルチゾン、グルコサミン、及びコンドロイチン硫酸等の薬物治療の利用により、軟骨の欠損による疼痛を緩和することが示されてきた。また、退行性過程を遅らせることができるという主張もある。
【００１３】
全関節置換を除く関節軟骨の外科治療のほとんどが、種々の治療群に分類できる。炎症及び疼痛を止めるために罹患し弱体化した軟骨を除去する治療には、切削（軟骨切除術）及び創面切除術（デブリドマン）が含まれる。別の治療グループとして、穿孔、マイクロフラクチャー術、軟骨形成術及びスポンジアリゼーション（ｓｐｏｎｇｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）等の軟骨形成を促すためのさまざまな研磨処置がある。研磨、穿孔、及びマイクロフラクチャーは、２０年前に始められた。骨の軟骨下板に対する血管損傷の後は、軟骨組織の自然治癒現象に頼る。また、現在試験的に行われているレーザー光治療は、別分類となり、罹患した軟骨の除去と軟骨再形成とを組合わせ、さらに軟骨増殖を誘導する。追加治療には、自己軟骨の移植（例えば、ジェンザイム社のカーティセル（Ｃａｒｔｉｃｅｌ）等）が含まれる。
【００１４】
半月板軟骨により適用可能な他の治療には、早期の外科的介入及び損傷した構造の縫合による修復、又は重度損傷の場合の半月板の同種移植が含まれる。
【００１５】
椎間板ヘルニア及び坐骨神経痛患者の大多数が外科手術を受けることなく治癒するが、もし外科手術が必要とされる場合、処置には椎間板ヘルニアの除去と、椎弓切開術（脊髄の周辺の脊柱の骨に小さな孔を形成する）、椎弓切除（神経組織に隣接する骨壁の除去）、経皮的な針技術（経皮的椎間板切除術）、椎間板の溶解処置（化学的髄核融解術）及びその他が含まれる。保存療法に反応せず、個人生活を送れない機械的な疼痛症候群患者では、脊椎固定術、椎間板内電熱凝固術（あるいは環状形成術）、後部動的安定化、人工椎間板技術又は、タンパク質、ペプチド、遺伝子治療、又は、ヌクレオチドを用いて行われる種々の分子療法による未だ試験的な椎間板再生療法により、その問題に対処可能である。軟骨疾患の治療としては、多くの方法が開示されてきたが、多くが人工的又は機械ベースの解決法であり、通常の軟骨組織生態の再形成を求めないのは明らかである。したがって、軟骨形成を促す方法が必要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、骨の発育、障害、又は、骨外傷性傷害において骨形成を誘導する組成物及び方法が必要とされる。
【００１７】
したがって、軟骨形成及び再生を誘導する組成物及び方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製方法に関する。その方法では、
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
ことが含まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。また、前記方法には、細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製することが含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、前記方法に、前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べることも含まれる。
【００２０】
ここで説明する発現系により産生されるＮＥＬＬタンパク質は、単独でも使用可能であるが、骨又は軟骨形成、又は再生に供する他の物質と併用することもできる。いくつかの実施形態では、ここで説明するＮＥＬＬタンパク質は、所望のあらゆる剤形の組成物を形成するために使用できる。ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。いくつかの実施形態では、前記組成物又は剤形には、キャリア、例えば医薬品としての条件を満たしたキャリアが含まれることがある。いくつかの実施形態では、基材に細胞及び／又はＮＥＬＬ１ペプチドが含まれることがあり、骨軟骨、円板又は、移植片の近傍のその他の組織の修復を促進できる。
【００２１】
本発明の実施形態には、各種の臨床的応用において骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び／又は骨形成を誘導する方法を含む。また、本発明には、各種の臨床的応用において軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を誘導する方法も含まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、既知の成長因子よりも大きな効果を与えることが可能であり、及び／又は他の成長因子の活性を強化することができる。したがって、より低用量の各成長因子を臨床的に使用可能である。これは少なくとも臨床治療がより安価になる点で意義深い。さらに、少なくともＮＥＬＬ１が骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点で、本発明は有利である。また、ＮＥＬＬ１が軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点においても、本発明は有利である。
【００２３】
ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１Ａ〜１Ｂは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
図２Ａ〜２Ｂは、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物を例示している。下線のアミノ酸配列は、メリチンシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンの間の結合は、ハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞による分泌の推定的切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧ−−−−からの残基は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
図３Ａ〜３ＤはＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の産生物を例示している。図３Ａは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞から産生した（産生率：約３ｍｇ／Ｌ培地）。図３Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。図３Ｃは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＣＯＳ７細胞から産生した（産生率：０．１ｍｇ／Ｌ培地より大きい）。図３Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。
図４Ａ〜４Ｃには、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を例示した。図４Ａは、本願実施例に使用したｃＤＮＡ構造の核酸配列及び３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。図４Ｂは、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロットである。抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後に、異なる構築物の形質転換によるＮＥＬＬ１分泌を検出している。図４Ｃは、抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットである。ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースを用いた免疫沈降後に、ＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【００２５】
本発明は、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製方法に関する。その方法では、
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
ことが含まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である。また、前記方法には、細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製することが含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、前記方法に、前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べることも含まれる。
【００２７】
ここで説明する発現系により産生されるＮＥＬＬタンパク質は、単独でも使用可能であるが、骨又は軟骨形成、又は再生に供する他の物質と併用することもできる。いくつかの実施形態では、ここで説明するＮＥＬＬタンパク質は、所望のあらゆる剤形の組成物を形成するために使用できる。いくつかの実施形態では、前記組成物又は剤形には、キャリア、例えば医薬品としての条件を満たしたキャリアが含まれることがある。いくつかの実施形態では、基質に細胞及び／又はＮＥＬＬ１ペプチドが含まれることがあり、骨軟骨、半月板又は、移植片の近傍のその他の組織の修復を促進できる。
【００２８】
本発明の実施形態には、各種の臨床的応用において骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び／又は骨形成を誘導する方法を含むものもある。また、本発明には、各種の臨床的応用において軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を誘導する方法も含まれる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、既知の成長因子よりも大きな効果を与えることが可能であり、及び／又は他の成長因子の活性を強化することができる。したがって、より低用量の各成長因子を臨床的に使用可能である。これは少なくとも臨床治療がより安価になる点で意義深い。さらに、少なくともＮＥＬＬ１が骨形成分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点で、本発明は有利である。また、ＮＥＬＬ１が軟骨細胞分化及び／又は軟骨細胞石灰化を向上し、臨床率及びＢＭＰ単独による治療効果を改善できる点においても、本発明は有利である。
【００３０】
ＮＥＬＬタンパク質組成物及び剤形については、ＵＳ１１／３９２，２９４及びＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４７３に例示されており、その教示は、そのまま本願明細書に包含される。
【００３１】
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では交換可能に使用してもよく、アミノ酸残基の重合体を言う。各用語は、天然に生じるアミノ酸重合体に適用されるのと同様に、１以上のアミノ酸残基が相当する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類縁体であるアミノ酸重合体にも適用されてもよい。
【００３２】
用語「抗体」は、例えば、未処理の免疫グロブリン、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域しか含有しないＦｖ断片、ジスルフィド結合で結合したＦｖ断片、可変領域及び定常領域の一部を含有するＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、単鎖抗体などのような種々の形態の改変抗体又は改造抗体を含んでもよい。抗体は、未処理の分子を含んでもよいのと同様にその断片、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２’、及び／又はエピトープ決定基に結合できる単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでもよい。抗体は、動物（例えば、マウス又はラット）又はヒト起源であってもよく、或いはキメラ抗体であってもよく、又はヒト化されてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、例えば、ＮＥＬＬ１タンパク質又はＮＥＬＬ２タンパク質によりエンコードされたポリペプチドに特異性を持つモノクローナル抗体であってもよい。
【００３３】
用語「捕捉剤」は、他の分子を特異的に結合し、例えば、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどのような結合複合体を形成する分子を言ってもよい。
【００３４】
用語「特異的に結合する」は、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を言ってもよく、異質集団の分子（例えば、タンパク質とその他の生物製剤）において存在する生体分子を同定するような結合反応を言う。従って、指定された条件下（例えば、抗体の場合は免疫アッセイ条件、核酸の場合はストリンジェントなハイブリッド形成条件等）で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合してもよく、試料に存在するそのほかの分子には有意な量では結合できない。
【００３５】
用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、共に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを言う。本発明の核酸は、場合によっては、例えば、リンアミド結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ｏ−メチルリンアミダイト結合、及び／又はペプチド核酸主鎖及び結合を含む代替主鎖を有してもよい核酸アナログを含んでもよいが、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよく、ホスホジエステル結合を含有してもよい。核酸アナログは正の主鎖及び／又は非リボースの主鎖を有してもよい。核酸はまた、１以上の炭素環式の糖を含んでもよい。リボース−リン酸の主鎖の修飾を行なって、例えば標識のような追加部分の付加を促進してもよいし、又は例えば、生理的環境におけるそのような分子の安定性高め、半減期を延ばしてもよい。
【００３６】
用語「特異的なハイブリッド形成」は、プローブがその標的の部分配列に優先的にハイブリッド形成し、他の配列により少ない程度にハイブリッド形成してもよい条件を含むストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の優先的な結合、二本鎖形成、又はハイブリッド形成を言う。
【００３７】
用語「ＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ」は、配列番号１、３及び５を指し、「ＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ」は、配列番号７、９、１１及び１３を指す。
【００３８】
ＮＥＬＬペプチド
ＮＥＬＬ１は主として骨に分布する８１０アミノ酸のペプチドである。成人では、ＮＥＬＬ１は頭蓋顔面の骨に高レベルで発現され、長骨では低レベルで発現される。骨芽細胞の分化、骨形成及び骨再生における役割については、これまでに研究されてきている。ＮＥＬＬ２は、神経細胞及び脳に分布する８１６アミノ酸のペプチドである。
【００３９】
ヒトのＮＥＬＬ１遺伝子は、プロモータ領域に少なくとも３つのＣｂｆａ１反応エレメントを含む。Ｃｂｆａ１はＮＥＬＬ１のプロモータにおけるこれらの反応エレメントに特異的に結合する。ＮＥＬＬ１の発現は、発達中及び成人の少なくとも前骨芽細胞、骨芽細胞及び肥大軟骨細胞で内生的に発現されるこの転写因子の制御下にあってもよい。鎖骨頭蓋骨形成不全症は、少なくとも部分的にはＣｂｆａの破壊により生じると考えられている発達上の頭蓋欠陥である。
【００４０】
ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＮＥＬＬ１遺伝子又はｃＤＮＡにより発現されるタンパク質であり、配列番号２、４及び６を含む。ＮＥＬＬ１ペプチドには、骨形成細胞の分化、骨芽細胞の分化又は骨形成を誘導する能力を保持するＮＥＬＬ１ペプチド断片が含まれてもよい。ＮＥＬＬ２ペプチドは、ＮＥＬＬ２遺伝子又はｃＤＮＡにより発現されるタンパク質であり、配列番号８、１０、１２及び１４を含む。ＮＥＬＬ２ペプチドには、ＮＥＬＬ２ペプチド配列全体と同様の活性を保持するＮＥＬＬ２ペプチド断片が含まれる場合がある。
【００４１】
ここで言う用語「誘導体」とは、ＮＥＬＬペプチド由来のあらゆる化合物もしくは生体化合物、又は化学物質もしくは生体物質、構造的にそれらと同等の物質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）又は立体配座がそれらと同等の物質（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ)を指す。例えば、こうした誘導体には、プロドラッグ型、ペグ化型、又は、ＮＥＬＬペプチドをより安定化し、又はより優れた親骨性又は親油性をもたせるその他のあらゆるＮＥＬＬペプチドの形態が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、誘導体は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（アミノ酸）、炭素数が１〜２０のヒドロカルビル短鎖、又は生体適合ポリマーと結合したＮＥＬＬペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、用語「誘導体」には、ＮＥＬＬペプチドミメティックスが含まれる可能性がある。ここで使用する用語「ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ；模倣物）」は、その主鎖に少なくとも１つの非ペプチド結合をもつペプチドを指す。ペプチド結合は、１つのアミノ酸分子のカルボン酸基と別のアミノ酸分子のアミノ基との間に形成される化学的結合である。
【００４２】
ペプチドミメティックスの合成については、この分野の文献に詳述されている。以下に、ペプチドミメティックスを含むペプチド合成の基本的手順の一例を説明する。
【００４３】
ペプチド合成を開始する前に、アミノ酸のアミン端末（出発物質）をＦＭＯＣ（９−フルオロメチルカーバメート）又は他の保護基で保護してもよく、開始剤としては、メリフィールド樹脂（遊離アミン）等の固形単体が使用される。次に、以下のステップ（１）〜（３）の反応を行い、所望のペプチドが得られるまでこれを繰り返す。（１）カルボジイミド化学を用いて、遊離アミンをカルボキシル末端と反応させ、（２）アミノ酸配列を精製し、且つ（３）ＦＭＯＣ保護基等の保護基を弱酸性条件で除去して遊離アミンを得る。その後、ペプチドを樹脂から切断して、独立のペプチド又はペプチドミメティックスを得ることができる。
【００４４】
１つの実施形態においては、その方法には分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸配列のあるフレーム内に、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を提供することが含まれる。１つの実施形態においては、分泌シグナルペプチドが、分泌されたハナバチタンパク質由来の分泌シグナルペプチドである。例えば、核酸配列は、メリチンシグナル配列、ドロスフィラ免疫グロブリン結合タンパク質シグナル配列、ウマインターフェロン−ガンマ（ｅＩＦＮ−ｇａｍｍａ）シグナルペプチド、ヘビホスホリパーゼＡ２阻害物質シグナルペプチド、ヒト及び／又はニワトリリゾチームシグナルペプチドを含むがこれら例示に限定されない群から選択できる。哺乳類発現系については、プロトリプシン先導配列も使用可能である。
【００４５】
１つの実施形態においては、その方法にはＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で昆虫細胞株を形質転換し；且つ、ＮＥＬＬペプチドを発現及び／又は分泌させる条件下で昆虫細胞株を培養することが含まれる。例えば、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物により、一時的に又は安定的にその細胞株を形質転換することができる。
【００４６】
ＮＥＬＬペプチド発現系
ＮＥＬＬペプチドは、あらゆる生物系で発現可能である。例えば、ＮＥＬＬペプチドの発現は、細菌系、酵母系、植物系又は動物系で可能である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、この技術分野で周知の無細胞発現系で発現される。例えば、大腸菌無細胞タンパク質翻訳系、又はコムギ胚芽無細胞タンパク質翻訳系が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、タバコ、トウモロコシ、コメ、又はダイズ由来のトランスジェニック植物細胞系において発現可能である。
【００４９】
このような発現系には、ウイルス性キャリア、又はウイルス性ベクター、ペプチドキャリア、又は短鎖ポリマー分子等のキャリアが含まれうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドは、昆虫細胞にて発現される。昆虫系で発現されるＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２ペプチドは、そのタンパク質の機能的形態である。
【００５１】
培地１リットルあたり約１０μｇ程度の低濃度のＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２タンパク質を産生するのに、ＣＯＳ７細胞を使用することができるが、発現には、血清含有培地が必要となる。シグナルペプチドについては、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２内因性シグナルペプチドにより、ＣＯＳ７細胞での発現が可能になる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、昆虫細胞株を用いたＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等の機能的ＮＥＬＬペプチドを発現する方法が含まれる。１つの実施形態では、昆虫細胞はＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、Ｓｆ９及び他のＳｆ細胞であってもよい。
【００５３】
１つの実施形態では、その方法には、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等の機能的ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を提供することが含まれる。その核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、そのような核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含む非限定的な群から選択することができる。また、その核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれる。
【００５４】
さらに、その核酸には、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を発現する発現ベクターが含まれてもよい。例えば、そのような発現ベクターとしては、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）が挙げられ、選択マーカーには、ブラストサイジン及びネオマイシン等がある。
【００５５】
さらに、前記核酸配列には、遺伝子発現レベルをモニターするためのレポーター生成物をエンコードする付加的な核酸、又は、ペプチド発現レベルをモニターするため、この技術分野において公知の方法を用いて視覚化可能なペプチド標識をエンコードする付加的な核酸も含まれる可能性がある。付加的な配列は、前記核酸の発現又は発現されるペプチド産物の機能性を阻害しないように、選択可能である。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明には、昆虫細胞においてＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物が含まれる可能性がある。前記核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、前記核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含むが非限定的な群から選択できる。また、前記核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれてもよい。
【００５７】
本発明の１つの実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の哺乳類細胞においてＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物が含まれる。前記核酸配列は、少なくともＮＥＬＬペプチドの機能部分をエンコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。例えば、前記核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含むが非限定的な群から選択できる。また、前記核酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）におけるＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドの産生について、ＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２の発現系には、内因性シグナルペプチドを発現する核酸又はｃＤＮＡが含まれる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドの発現系には、ＮＥＬＬ２シグナルペプチドを発現する核酸又はｃＤＮＡが含まれる可能性がある。ＮＥＬＬ１ペプチドの発現系にＮＥＬＬ２シグナル核酸又はｃＤＮＡを取り込むことで、ＮＥＬＬ１ペプチドの産生をより効果的にできる。
【００５９】
前記核酸構築物には、シグナルペプチドをエンコードする核酸配列が含まれてもよい。前記核酸には、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列を発現する発現ベクターが含まれてもよい。さらに、前記核酸配列には、遺伝子発現レベルをモニターするためのレポーター生成物をエンコードする付加的な核酸、又は、ペプチド発現レベルをモニターするため、この技術分野において公知の方法を用いて視覚化可能なペプチド標識をエンコードする付加的な核酸が含まれてもよい。
【００６０】
核酸構築物は、ベクターにより形質転換される宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をエンコードする遺伝子等の選択遺伝子（選択可能なマーカーとも言われる）を含有するのであれば、発現及びクローニングベクターから構成されてもよい。この遺伝子の存在により、前記ベクターを削除する宿主細胞は、形質転換宿主に対して、増殖又は複製において利点が得られないことが確認できる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリン等の抗生物質又は他の毒素に対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性の不良を補完するタンパク質をエンコードする。
【００６１】
また、核酸構築物には、宿主生物に認識されＮＥＬＬをエンコードする核酸に操作可能に結合されるプロモーターが含まれる可能性もある。プロモーターは、制御下にある核酸の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流に配置される非翻訳配列（一般に約１００〜１０００塩基対以内）であり、誘導及び構成的プロモーターを含む。誘導プロモーターは、例えば、栄養素の有無、又は温度変化等の培養条件の何らかの変化に対応して、制御下にあるＤＮＡからの転写レベルの上昇を開始させるプロモーターである。現時点で、各種の宿主細胞候補により認識される多数のプロモーターがよく知られている。
【００６２】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、操作可能に結合できる。例えば、プレ配列用のＤＮＡ、又は分泌リーダー配列は、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、操作可能に該ポリペプチド用ＤＮＡに結合する；プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に作用する場合、操作可能に該コード配列に結合する；又は、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するように配置されている場合、操作可能に該コード配列に結合する。
【００６３】
本発明の１つの実施形態では、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現する細胞が含まれる可能性がある。例えば、その細胞はＣＨＯ細胞であってもよい。１つの実施形態では、その細胞は、ＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で形質転換される可能性がある。例えば、その細胞株は、一時的又は安定的にＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸構築物で形質転換されてもよい。１つの実施形態では、ＮＥＬＬ発現性核酸（例えば、ｃＤＮＡなど）は、（昆虫細胞又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の）トランスフェクト細胞に対してコンピテントである遺伝子発現ベクター又はウイルス粒子にクローニングされる可能性がある。
【００６４】
また、その核酸配列には、昆虫分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸配列をもつフレーム内にＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドをエンコードする核酸配列が含まれる可能性がある。
【００６５】
本発明の１つの実施形態では、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現する細胞が含まれ、機能タンパク質を分泌できる場合がある。
【００６６】
本発明の１つの実施形態では、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチド等のＮＥＬＬペプチドを有するポリペプチド（アミノ酸配列）が含まれ、分泌シグナルペプチドが含まれる可能性がある。
【００６７】
例えば、ＮＥＬＬペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号４）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号６）を含むが非限定的な群、又は、ヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）を含むが非限定的な群から選択できる。また、そのアミノ酸配列には、充分な配列相似性を有するような配列、例えば、上記した配列のいずれかの部分との配列相似性が少なくとも約７５％であるような配列が含まれる可能性もあり、又は、ＮＥＬＬ１ペプチドと同様の活性のある結合ドメインを含む可能性もある。
【００６８】
ペプチド精製
いくつかの実施形態では、本発明には、標準的なペプチド精製手順に準じて、培地に分泌されるＮＥＬＬ１及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドを精製する方法が含まれる。本発明の精製方法としては、非限定的な例として、以下が挙げられる。
【００６９】
また、その方法には、分泌されたＮＥＬＬペプチドを回収し、且つ／又は使用に際してＮＥＬＬペプチド精製することも含まれる可能性がある。ペプチド産物について、各種の機能性アッセイ又は発現アッセイにて活性試験を行う可能性がある。例えば、どのアッセイにおいても、もしＮＥＬＬペプチドが、所定のパラメータに関しコントロール物質に対して顕著な効果を有する場合、そのＮＥＬＬペプチドは、測定パラメータに作用する機能性を有すると言える。
【００７０】
１つの実施形態では、選択された細胞が選択された核酸配列を発現し、ＮＥＬＬペプチドを発現及び／又は分泌するか否かを検証する。１つの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの有無、量、及び／又は活性が検証される。
【００７１】
１つの実施形態では、その技術分野の当業者に周知の多くの方法のいずれかにより、ＮＥＬＬペプチドを検出及び定量した。これらには、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等の生化学的な分析方法、又は、流体又はゲル内沈降反応、（一元又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動法、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング等の各種の免疫学的方法等が含まれる。
【００７２】
１つの実施形態では、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析を使用して、選択されたサンプル中のＮＥＬＬペプチドの有無を検出及び定量する。この技法には、タンパク質サンプルをゲル電気泳動法により分子量ベースで分離し、分離したタンパク質を適切な固形単体（ニトロセルロース膜、ナイロン膜、又は、誘導体化ナイロン膜など）に転写し、且つそのサンプルを標的ペプチドに特異的に結合する抗体とともにインキュベートすること等が含まれる。
【００７３】
本発明の分析は、この技術分野の当業者に周知の標準的な方法に従って、（標的ポリペプチドの有無（陽性又は陰性）又は量で）評価してもよい。評価法は、分析形式及び標識の選択により決められる。例えば、ウェスタンブロット分析であれば、酵素標識により産生される着色生成物を可視化することにより評価される。正しい分子量で明瞭に可視化された着色のバンド又はスポットが、陽性結果として評価され、明瞭に可視化された着色のバンド又はスポットがない場合には、陰性として評価される。バンド強度又はスポット強度が、標的ポリペプチド濃度の定量的尺度となる。
【実施例】
【００７４】
組換えタンパク質の産生及び精製方法は、この分野の当業者に周知の技術であり、複数の営利企業がタンパク質産生サービスを提供している。以下の例は、本発明を説明するために提示するが、本発明を限定するものではない。一般的に、発現の宿主は、細菌類、酵母及び菌類、哺乳類細胞、植物、トランスジェニック動物（例えば、山羊乳）であってもよく、また、コムギ胚芽又は大腸菌抽出物等に基づく無細胞発現系であってもよい。一般的に、発現エレメントは、原核生物、酵母、哺乳類及び植物プロモーター、又はウイルス性プロモーターであってよい。タンパク質発現ストラテジーとしては、細胞内又は細胞外ストラテジー、融合タンパク質ストラテジー及びディスプレイストラテジーが挙げられる。組換えタンパク質の後処理プロセスには、集菌、溶菌、ろ過、限外ろ過、沈殿、及び／又は、タンパク質回収、中間精製、最終精製、及び最適化を包含するその他のタンパク質処理／精製ストラテジーが含まれてよい。
【００７５】
実施例１ ＮＥＬＬペプチドの発現
ｃＤＮＡ断片は、発現ベクターＰｉＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（３．４ｋｂ）（ＥｃｏＲＶ部位、インビトロジェン社）内にライゲーションされ、メリチンシグナルペプチド、ラット成人ＮＥＬＬ１及びＦＬＡＧ標識配列のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を含有した。図２Ａ〜２Ｂは、本実施例において使用したｃＤＮＡ構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示している。
【００７６】
ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）を、無血清培地に適応させ、細胞をＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターで形質転換した。ＮＥＬＬ１ＦＬＡＧ構築物を発現する細胞集団のみを選択するように、細胞をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）処理した。生存した細胞集団は、安定した形質転換細胞であることが確認された。細胞外培地を回収し、ＮＥＬＬ１ペプチドの有無を調べた。ＮＥＬＬ１ペプチドを精製して以下の機能分析に用いた。
【００７７】
図２Ａは、ＵｎｏＱ溶出液に含有される精製済みのＮＥＬＬ１ペプチドのＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。前記培地をＵｎｏＱカラム（バイオラッドラボラトリーズ社）に添加した。図２Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロットを示す。このウェスタンブロットにより、タンパク質ラダーを参照してＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現が示される。ペプチド：１４０ｋＤａ（細胞内前駆物質）、１３０ｋＤａ（成熟形態；９０ｋＤａペプチド）、４００ｋＤａ（分泌形態、ホモ三量体）。上記の例では、発現系の生産性は、約３ｍｇ ＮＥＬＬ１ペプチド／Ｌ培地だった。
【００７８】
ペプチドをまったく発現も分泌もしない（例えば、酵母を含む細菌発現）、又は、ペプチド産生が非常に低い（例えば、大腸菌融合ペプチド系、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞、＞１０ｍｃｇ／Ｌ）他の発現系と比較すると、上述の系（哺乳類及び昆虫細胞）での産生は、大量の機能タンパク質を産生する点で予想外に十分に効果的であった。
【００７９】
組換えラットＮＥＬＬ１タンパク質の発現及び精製
昆虫細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ１ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミド（黒田ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ参照）由来のＦＬＡＧエピトープ配列に融合しているラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを昆虫発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。さらに、ＰＣＲ法により、ＮＥＬＬ１オリジナル分泌シグナル配列をミツバチメリチンシグナル配列と置換した。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を、インビトロジェン社から購入し、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞用の無血清培地（インビトロジェン社）にて培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用いて、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞をｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドで形質転換した。形質転換から４８時間後に、４００ｍｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン社）により細胞を選択した。安定した発現細胞株が樹立されるまで、３〜４日ごとに選択培地を交換した。免疫沈降及びウェスタンブロット分析によりＮＥＬＬ１分泌を確認した。Ｈｉｇｈｆｉｖｅ細胞が培地においてＮＥＬＬ１ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現していることがわかった。
【００８０】
ＵＮＯ Ｑ−１カラム（バイオラッド社）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ゼオシン耐性ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞の培地から組換えラットＮＥＬＬ１−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ１ペプチドを５００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
【００８１】
ＣＯＳ７細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ１ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミド由来のＦＬＡＧエピトープ配列に結合したラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭでＣＯＳ７細胞を培養した。内因性ＮＥＬＬシグナルペプチドプラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣでＣＯＳ７細胞を形質転換した。形質転換から４８時間後に、ＮＥＬＬ１ペプチド検出のため、培地について免疫沈降及びウェスタンブロット分析を行った。
【００８２】
図３Ｃに、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ含有のＵｎｏＱ溶出液のＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。これらの発現分析により、ＣＯＳ細胞は、シグナル配列を含むようにする等、分泌効率を向上するためにＮＥＬＬのＮ末端を修飾しなければ、機能性ＮＥＬＬペプチドを発現しないことが示された。図３Ｄは、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現を示す抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロットの結果である。
【００８３】
組換えラットＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製
昆虫細胞によるＣ末端ＦＬＡＧ標識ＮＥＬＬ２ペプチドの産生については、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ２−ＦＬＣプラスミド由来のＦＬＡＧエピトープ配列に融合したラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡを昆虫発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）に挿入することにより、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞をインビトロジェン社より購入し、ＨｉｇｈＦｉｖｅ無血清培地（インビトロジェン社）にて培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用いて、ｐＩＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドでＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を形質転換した。形質転換から４８時間後に、４００ｍｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン社）で細胞を選択した。安定した発現細胞株が樹立されるまで、３〜４日ごとに選択培地を置換した。免疫沈降及びウェスタンブロット分析により、培地でのＮＥＬＬ２発現を確認した。Ｈｉｇｈｆｉｖｅ細胞が培地においてＮＥＬＬ１ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現していることがわかった。
【００８４】
ＵＮＯ Ｑ−１カラム（バイオラッド社）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ゼオシン耐性ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞の培地から、組換えラットＮＥＬＬ２−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ２−ＦＬＣペプチドを５００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
【００８５】
実施例２ 哺乳類系でのＮＥＬＬ１の発現
本発明には、非ウイルス性ＤＮＡデリバリーによるｒｈＮＥＬＬ１産生に用いる哺乳類発現系が含まれてもよいが、該発現系は表１に挙げる一般的な安定した懸濁液系に限定されない。ベクター設計、宿主細胞株培養、形質転換、安定した細胞株の選択、及びＨＥＫ２９３やＣＨＯ系におけるｒｈＮｅｌｌ−１の精製を含む比較的詳細な手順を以下に示すが、該手順は、この技術分野において周知のものである。
【００８６】
表１に、ｒｈＮｅｌｌ１の産生に使用した哺乳類の発現系をまとめた。
【表１】
【００８７】
Ａ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃１
ベクター設計：
ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐ３ＸＦｌａｇ−ＣＭＶ（シグマ社）にライゲーションした。得られた発現構築物、ｐＣＭＶ−ｒｈＮＥＬＬ３Ｘｆｌａｇには、プレプロトリプシン先導配列、ヒト成人ＮＥＬＬ１コーディング領域のｃＤＮＡ断片及びＣ末端３Ｘｆｌａｇ配列が含まれる。
【００８８】
ホスト細胞株：
ＣＨＯ−Ｋ１は接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。ｐＣＭＶ−ｒｈＮｅｌｌ−１−３Ｘｆｌａｇの構築物を、リポフェクトアミン（インビトロジェン社）又はリン酸カルシウム処理して形質転換した。約２週間にわたってＧ４１８（４００〜６００μｇ／ｍｌ）を細胞培地に添加し、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るため、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００８９】
精製方法：
抗ｆｌａｇ抗体Ｍ２（シグマ社）アフィニティーカラムにより、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培地又は細胞溶解物を天然条件下で精製し、３Ｘｆｌａｇペプチドで溶出した。
【００９０】
Ｂ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃２
ベクター設計：
図４Ａに、ｃＤＮＡ構築物の核酸配列及び該構築物に用いられる３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００９１】
ホスト細胞株：
ＣＨＯ−Ｋ１は、接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。リポフェクトアミン（インビトロジェン社）又はリン酸カルシウム処理を行って、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＩＬ２−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ又はｐＮ２−ｈＮＥＬＬ１−ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓの構築物を形質転換した。約２週間にわたってＧ４１８（４００〜６００μｇ／ｍｌ）を細胞培地に添加して、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るため、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９２】
精製方法：
抗ｃ−ｍｙｃアガロースによる免疫沈降により、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培養液又は細胞溶解物を精製した。図４Ｂは、抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後の異なる構築物の形質転換に起因する、ＮＥＬＬ１分泌を検出する抗ｃ−ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロットの結果である。図４Ｃは、ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースによる免疫沈降後のＮＥＬＬ１分泌を検出する抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットの結果である。
【００９３】
Ｃ．チャイニーズハムスター卵巣細胞系＃３
ベクター設計：
ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２リーダーペプチド配列のいずれかを用いて独自開発のｃＤＮＡ構築物（Ａｒａｇｎｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）社又はサイトバンス（Ｃｙｔｏｖａｎｃｅ）社）を構築した。
【００９４】
ホスト細胞株：
独自開発のＣＨＯ細胞株は、接着細胞株であり、無血清培地の懸濁培地に適応可能である。特許構築物を形質転換した。約２週間にわたって適切な因子を細胞培地に添加して、安定した細胞株を選択した。さらに、ｒｈＮＥＬＬ１産生率の高い単一クローンを得るために、限界希釈法により安定した形質転換細胞を選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９５】
精製方法：
この技術分野において周知の分析的・調製的タンパク質精製方法により、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチド含有培地又は細胞溶解物を精製した（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど）。
【００９６】
濃縮方法：
ｒｈＮＥＬＬ１を凍結乾燥又は限外ろ過法により濃縮した。
【００９７】
Ｄ．ＨＥＫ２９３系
ベクター設計：
ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ（インビトロジェン社）にライゲーションした。得られた発現構築物、ｐＳｅｃ−ｈＮｅｌｌ−１−Ｔａｇには、ネズミ免疫グロブリンκ鎖リーダー配列、ヒト成人ＮＥＬＬ１コーディング領域のｃＤＮＡ断片、及びＣ末端へのＭｙｃ及びＨｉｓ配列の二重修飾が含まれる。
【００９８】
ホスト細胞株：
無血清培地に適応させ、懸濁形態で成長させたヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ−２９３を、ＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターｐＳｅｃ−ｈＮｅｌｌ−１−Ｔａｇで形質転換した。ｒｈＮｅｌｌ−１精製のために馴化培地を回収する前に、細胞を一過性形質転換として数日間培養し、又は安定した発現細胞株を選択するためにゼオシン（２５０μｇ／ｍｌ）処理を行った。さらに、ｒｈＮｅｌｌ−１産生率の高い単一クローンを得るため、安定した形質転換細胞を限界希釈法で選別した。選択された安定した細胞株は、ｒｈＮｅｌｌ−１産生のために、実験室規模又は工業規模のバイオリアクターに使用できる。
【００９９】
精製方法：
Ｎｉ２＋アフィニティーカラムにより、天然条件下でｒｈＮｅｌｌ−１ペプチド含有培地を精製し、１Ｍイミダゾールで溶出した。少なくとも１０００体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で２０時間の大規模な透析後、ｒｈＮｅｌｌ−１について、完全性、純度及びバイオ活性試験を行った。
【０１００】
また、既存のリーダー配列をラット血清アルブミン、ＣＤ３３、ｔＰＡ及びヒトインターロイキン−２リーダー配列等の新たなものと置換し、又は、ＤＨＦＲ又はＧＳ等の遺伝子増幅の標的を主鎖配列に添加するために、親ベクターの組換えを行い、結果として新たな発現ベクター及び発現系ができる。本発明では、ヒトＮｅｌｌ−１の天然シグナルペプチドはタンパク質分泌を導くには充分に効果的ではなく、外来の先導配列がよく機能しなかった場合すらある。したがって、タンパク質内にＨｉｓ標識及びタンパク質分解的切断部位「ＭＰＨＨＨＨＨＨＧＧＧＤＤＤＤＫＤＰＭ」を有するスペーサーによるヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の低分子の天然分泌タンパク質のフレーム内融合発現ベクターを構築する必要があった可能性もある。Ｎｅｌｌ−１精製に用いるエピトープ標識としては、６ＸＨｉｓｔｉｄｉｎｅｓ、３ＸＦｌａｇ、Ｍｙｃ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＥＧＦＰ又はＣＴＨＳ（ＳＵＭＯ（ユビキチン類似因子）のＣ末端側半分）などが挙げられるが、上記表１に示したプラスミドｐＳｅｃＴａｇのようにＨｉｓ及びＭｙｃの二重標識であってもよい。
【０１０１】
さらに、特定の条件下でのｒｈＮｅｌｌ−１の発現制御又は誘導を検証するために、ＩＲＥＳによるジシストロン又はマルチシストロンベクターを構築してもよかった。より継続的な増殖及びアポトーシスの遅延を得るための、又はＴｅｔ（テトラサイクリン）誘導系及びＦＩｐ−Ｉｎ特定部位統合系等の特別な要求に対応可能な宿主細胞株の遺伝子組換えは、ｒｈＮｅｌｌ−１産生を向上させると考えられる。
【０１０２】
上述したｒｈＮｅｌｌ−１産生のための安定した発現系の他に、我々は、予備的な代替手段又は安定した系に相互補完可能な手段として、数ミリグラムの精製済みのプラスミドベクター（ｐＲＥＰ４）を用いて、陽イオンポリマーＰＥＩでＨＥＫ２９３又はＢＨＫ懸濁細胞を形質転換する大規模な一過性トランスフェクション（ＬＳＴ）アプローチを確立するという可能性を除外しない。
【０１０３】
実施例３ 培養液中のＮＥＬＬ２タンパク質の精製
ｐＩＺＴ−ＦＬＣ−ＮＥＬＬ２を保有するＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を無血清培地（１Ｌ）で約３日間培養した。その培地を３０００ｘｇで５分間遠心し、上澄みを回収した。ＰＭＳＦを終濃度１ｍＭになるように添加した。飽和硫酸アンモニウム溶液（８０％飽和（ｖ／ｖ））を添加して、溶液を４℃で１時間静置した。その溶液を１５０００ｘｇで３０分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を４℃で５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、４℃で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーＵｎｏＱカラム（６ｍｌ、バイオラッド社）に添加した（速度１ｍｌ／分、ＦＰＬＣ（アマシャムファルマシア社）を使用）。そのカラムを同一バッファーで十分に洗浄した。
【０１０４】
次に、結合しているタンパク質を０Ｍ〜１．５ＭのＮａＣｌ勾配で同一バッファーにて溶出した。抗ＦｌａｇＭ２（シグマ社）抗体を用いて、ＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧ画分をウェスタンブロットで同定した。陽性の画分を１つの試験管に回収した。最終生成物をセルロース製のシームレスチューブ（和光純薬工業株式会社、カットオフ分子量１２０００）に１ＬのＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。得られた生成物を−７０℃で保存した。
【０１０５】
本発明の具体的な実施形態を示し、説明してきたが、本技術分野における当業者にとって、本発明から広義に逸脱しない限り変更及び修正を行うことが可能であることは自明である。したがって、添付の請求項は、本発明の真の精神及び範囲内に含まれるような全ての変更及び修正をその範囲内に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮＥＬＬペプチドの製造方法の１つを示すフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａに、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示す。下線のアミノ酸配列は、メリチンシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンの間の結合は、ハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞による分泌の推定的切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧ−−−−からの残基は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
【図２Ｂ】図２Ｂに、シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ核酸構築物の核酸配列及び対応するペプチド配列の予測を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄに、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の産生物を示す。図３Ａは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞から産生した（産生率：約３ｍｇ／Ｌ培地）。図３Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。図３Ｃは、ＵｎｏＱ溶出液含有の精製済みＮＥＬＬ１ペプチドを示すＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。このとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、無血清培地にてＣＯＳ７細胞から産生した（産生率：０．１ｍｇ／Ｌ培地より大きい）。図３Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、本願実施例に使用したｃＤＮＡ構造の核酸配列及び３つの異なるシグナルペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロットである。抗ｃ−ｍｙｃアガロースを用いた免疫沈降後に、異なる構築物の形質転換に起因するＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＣＨＯ発現系によるＮＥＬＬ１ペプチドの産生を示す、抗ｃ−ｍｙｃ又はマウス抗ヒトＮＥＬＬ１抗体によるウェスタンブロットである。ウサギ抗ヒトＮｅｌｌ−１抗体−ＮＨＳ活性セファロースを用いた免疫沈降後に、ＮＥＬＬ１分泌を検出している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
哺乳類細胞におけるペプチドの発現方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
前記分泌シグナルペプチドがＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項２の方法。
【請求項４】
前記核酸がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２をエンコードし、
ＮＥＬＬ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項５】
細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製する請求項２の方法。
【請求項６】
細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製する請求項３の方法。
【請求項７】
前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べる請求項５の方法。
【請求項８】
前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べる請求項６の方法。
【請求項９】
精製には、クロマトグラフィー精製が含まれる請求項１の方法。
【請求項１０】
精製には、クロマトグラフィー精製が含まれる請求項２の方法。
【請求項１１】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物であって、分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を有する核酸構築物。
【請求項１２】
前記昆虫分泌シグナルペプチドが、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項１１の核酸。
【請求項１３】
前記核酸がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２をエンコードし、
ＮＥＬＬ１が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項１１の核酸。
【請求項１４】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１１の核酸構築物。
【請求項１５】
ＮＥＬＬペプチドを発現する哺乳類細胞株であって、分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸からなる核酸構築物を含む哺乳類細胞株。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞株がチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる請求項１５の細胞。
【請求項１７】
前記ＣＨＯ細胞がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項１６の細胞。
【請求項１８】
前記分泌シグナルペプチドがＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項１６の細胞。
【請求項１９】
前記核酸がＮＥＬＬ又はＮＥＬＬ２ペプチドをエンコードし、
ＮＥＬＬ１が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項１６の細胞。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、およびその組合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組換えペプチドであって、請求項１６に記載の細胞株で生成される組換えペプチド。
【請求項２１】
さらにＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２分泌ペプチドを含む請求項２０の組換えペプチド。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換えペプチドを有効量含み、任意にキャリアを含む骨形成又は軟骨形成を誘導する組成物。
【請求項２３】
請求項２０に記載の組換えペプチドに対する抗体。
【請求項１】
分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物を提供し；
前記核酸構築物により哺乳類細胞を形質転換し；
前記ＮＥＬＬペプチドを発現させうる条件下で前記哺乳類細胞を培養する
哺乳類細胞におけるペプチドの発現方法。
【請求項２】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
前記分泌シグナルペプチドがＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項２の方法。
【請求項４】
前記核酸がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２をエンコードし、
ＮＥＬＬ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項５】
細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製する請求項２の方法。
【請求項６】
細胞株から分泌されるＮＥＬＬペプチドを回収し；かつ該ＮＥＬＬペプチドを実質的に精製する請求項３の方法。
【請求項７】
前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べる請求項５の方法。
【請求項８】
前記ＮＥＬＬペプチドの骨形成の誘導活性を調べる請求項６の方法。
【請求項９】
精製には、クロマトグラフィー精製が含まれる請求項１の方法。
【請求項１０】
精製には、クロマトグラフィー精製が含まれる請求項２の方法。
【請求項１１】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物であって、分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸を有する核酸構築物。
【請求項１２】
前記昆虫分泌シグナルペプチドが、ＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項１１の核酸。
【請求項１３】
前記核酸がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２をエンコードし、
ＮＥＬＬ１が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項１１の核酸。
【請求項１４】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１１の核酸構築物。
【請求項１５】
ＮＥＬＬペプチドを発現する哺乳類細胞株であって、分泌シグナルペプチドをエンコードする核酸を有するフレーム内に、少なくとも１つのＮＥＬＬペプチドをエンコードする少なくとも１つの核酸からなる核酸構築物を含む哺乳類細胞株。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞株がチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる請求項１５の細胞。
【請求項１７】
前記ＣＨＯ細胞がＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項１６の細胞。
【請求項１８】
前記分泌シグナルペプチドがＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２ペプチドのシグナル配列である請求項１６の細胞。
【請求項１９】
前記核酸がＮＥＬＬ又はＮＥＬＬ２ペプチドをエンコードし、
ＮＥＬＬ１が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６からなる群から選択され、
ＮＥＬＬ２が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される請求項１６の細胞。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、およびその組合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組換えペプチドであって、請求項１６に記載の細胞株で生成される組換えペプチド。
【請求項２１】
さらにＮＥＬＬ１又はＮＥＬＬ２分泌ペプチドを含む請求項２０の組換えペプチド。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換えペプチドを有効量含み、任意にキャリアを含む骨形成又は軟骨形成を誘導する組成物。
【請求項２３】
請求項２０に記載の組換えペプチドに対する抗体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５０９９１７（Ｐ２０１０−５０９９１７Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７２７７（Ｐ２００９−５３７２７７）
【出願日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４０７４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０９４１
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０８０８５７２９）ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１１１ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， １２ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｏａｋｌａｎｄ， ＣＡ， ９４６０７−５２００， ＵＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４０７４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０９４１
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０８０８５７２９）ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１１１ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， １２ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｏａｋｌａｎｄ， ＣＡ， ９４６０７−５２００， ＵＳ
【Ｆターム（参考）】
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