ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物、およびその作製方法を開示する。また、実質的に精製されたＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞集団と、他の細胞型からＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を豊富化、分離および精製する方法も開示する。さらに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞およびＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞などの内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法についても開示される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約２％がpancreatic-duodenal homoebox factor-1（ＰＤＸ１）陽性前腸内胚葉細胞であり、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物。
【請求項２】
前記ヒト細胞の少なくとも約５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項３】
前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項４】
前記ヒト細胞の少なくとも約２５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項５】
ヒト支持細胞（フィーダー細胞）が培養物中に存在し、当該ヒト支持細胞以外のヒト細胞の少なくとも約２％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項６】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）遺伝子を発現する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項７】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）遺伝子を発現する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項８】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７を発現する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項９】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１０】
臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および神経系細胞からなる群から選択される細胞を実質的に含んでいない請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１１】
当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約１０個ごとに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１２】
当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約５個ごとに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１３】
当該細胞培養物において、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約４個ごとに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約１個存在する請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１４】
胚性幹細胞をさらに含む請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１５】
前記胚性幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）および胚の生殖隆起からなる群から選択される組織に由来する請求項１４に記載の細胞培養物。
【請求項１６】
レチノイドをさらに含む請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１７】
前記レチノイドは、レチノイン酸（ＲＡ）である請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項１８】
ＦＧＦ−１０をさらに含む請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
Ｂ２７をさらに含む請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項２０】
ＲＡおよびＦＧＦ−１０の双方を含む請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
Ｂ２７をさらに含む請求項２０に記載の細胞培養物。
【請求項２２】
細胞を含む細胞集団であって、前記細胞の少なくとも約９０％が、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞であり、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞集団。
【請求項２３】
前記細胞の少なくとも約９５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
前記細胞の少なくとも約９８％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２５】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＨＯＸＡ１３遺伝子を発現する請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２６】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＨＯＸＣ６遺伝子を発現する請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２７】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７を発現する請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２８】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２９】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の作製方法であって、前記方法は、
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程と、
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを前記細胞集団に供給する工程とを含み、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の作製方法。
【請求項３０】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を与える工程を含み、前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を、前記細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより決定する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約２％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約１０％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約２５％が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化する請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の存在の検出が、ＰＤＸ１の発現を検出することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞において、ＰＤＸ１の発現が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１およびＮＦＭからなる群から選択されるマーカーの発現より高い請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＤＸ１の発現が、定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により決定される請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＤＸ１の発現が、免疫細胞化学により決定される請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記レチノイドはＲＡである請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＡは、約０．０１μＭから約５０μＭまでの範囲の濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＲＡは、約０．０４μＭから約２０μＭまでの範囲の濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＡは、約０．１μＭから約１０μＭまでの範囲の濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＡは、約０．２μＭから約２．５μＭまでの範囲の濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＡは、約０．５μＭから約１．５μＭまでの範囲の濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＡは、約１μＭの濃度で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＡは、培養開始後約４日で供給される請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｂ２７、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される因子を、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生を促進するのに十分な量で前記培養に供給することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記因子は、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡおよびアクチビンＢからなる群から選択される請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記因子は、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記因子は、約２０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記因子は、約２５ｎｇ／ｍｌから約７５ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で供給される請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記因子は、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記因子は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記因子はＢ２７である請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
Ｂ２７は、培地全体の約０．１％から約２０％までの範囲の濃度で供給される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｂ２７は、培地全体の約０．２％から約５％までの範囲の濃度で供給される請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
Ｂ２７は、培地全体の約０．５％から約２％までの範囲の濃度で供給される請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
Ｂ２７は、培地全体の約１％の濃度で供給される請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
Ｂ２７は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記因子は条件培地である請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
条件培地は、培地全体の約１０％から約１００％までの範囲の濃度で供給される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
条件培地は、培地全体の約２０％から約８０％までの範囲の濃度で供給される請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
条件培地は、培地全体の約４０％から約６０％までの範囲の濃度で供給される請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
条件培地は、培地全体の約５０％の濃度で供給される請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
条件培地は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
条件培地は、分化したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を約２４時間細胞培養培地に接触させることによって調製される請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させる請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項２９に記載の方法によって作製されたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞。
【請求項６９】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団を作製する方法であって、
多分化能細胞の集団を得る工程（当該多分化能細胞集団の少なくとも１つの細胞が、ＰＤＸ１プロモーターの制御下にある少なくと１コピーの核酸を含み、当該核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列またはその生物活性をもつ断片を有する）と、
前記多分化能細胞を分化させて、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を作製する工程と、
当該ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を、ＰＤＸ１陰性細胞から分離する工程とを含む方法。
【請求項７０】
前記細胞集団は、少なくとも約９５％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞集団は、少なくとも約９８％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記分化工程は、前記多分化能細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を、前記多分化能細胞集団に供給する工程と、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを、前記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給する工程とをさらに含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記レチノイドは、ＲＡである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項６９に記載の方法によって作製されたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団。
【請求項７５】
ＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高める方法であって、当該胚体内胚葉細胞に、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる工程を含む方法。
【請求項７６】
前記分化促進因子は、レチノイドである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記分化促進因子は、ＲＡである請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記分化促進因子は、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｂ２７、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、
候補分化促進因子を、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、
前記候補分化促進因子との接触後に、前記細胞集団でのＰＤＸ１発現が、当該接触前の細胞集団でのＰＤＸ１発現よりも増加したかどうかを決定する工程とを含み、
前記細胞集団でのＰＤＸ１発現の増加から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞から（腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である）ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつと判断する方法。
【請求項８０】
ＰＤＸ１発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのＨＯＸＡ１３遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのＨＯＸＣ６遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記候補分化促進因子は、低分子である請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記低分子は、レチノイドである請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記レチノイドは、ＲＡである請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記候補分化促進因子は、増殖因子である請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記候補分化促進因子は、ＦＧＦ−１０である請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む集団を得る工程と、
候補分化促進因子を、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、
前記候補分化促進因子との接触後に、前記集団でのマーカーの発現が、当該接触前の細胞集団での前記マーカーの発現よりも増加したか減少したかを決定する工程とを含み、
前記集団での前記マーカーの発現の増加または減少から、前記候補分化促進因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつと判断する方法。
【請求項９０】
前記マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより決定される請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記候補分化促進因子は、低分子である請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記候補分化促進因子は、増殖因子である請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含むベクター。
【請求項９５】
前記レポーター遺伝子は、ＥＧＦＰである請求項９４に記載のベクター。
【請求項９６】
請求項９４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９７】
ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含む細胞。
【請求項９８】
前記ＰＤＸ１制御領域と機能的に結合した前記レポーター遺伝子は、染色体に組み込まれている請求項９７に記載の細胞。
【請求項９９】
前記レポーター遺伝子は、ＥＧＦＰである請求項９７に記載の細胞。
【請求項１００】
前記細胞は、多分化能である請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０１】
前記細胞は、ｈＥＳＣである請求項１００に記載の細胞。
【請求項１０２】
前記細胞は、胚体内胚葉細胞である請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０３】
前記細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０４】
分化したｈＥＳＣ（当該ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させたもの）の集団を約２４時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したｈＥＳＣの集団を培地から除去する工程とによって調製された条件培地。
【請求項１０５】
前記新鮮細胞培養培地は、ＲＰＭＩである請求項１０４に記載の条件培地。
【請求項１０６】
前記ＲＰＭＩは、低血清ＲＰＭＩである請求項１０５に記載の条件培地。
【請求項１０７】
分化したｈＥＳＣ（当該ｈＥＳＣは、３％の血清を添加したＲＰＭＩ、アクチビンＡを添加した低血清ＲＰＭＩ、およびＢＭＰ４を添加した低血清ＲＰＭＩからなる群から選択される細胞培養培地で約５日間分化させたもの）の集団を約２４時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したｈＥＳＣの集団を培地から除去する工程とによって培地を条件付ける方法。
【請求項１０８】
前記新鮮細胞培養培地は、ＲＰＭＩである請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＲＰＭＩは、低血清ＲＰＭＩである請求項１０８に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図７】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４−１】

【図３４−２】

【図３４−３】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図４】

【図５】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図２５】

【図２９】

【図４４】

【公表番号】特表２００８−５０３２０３（Ｐ２００８−５０３２０３Ａ）
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１０８７９（Ｐ２００７−５１０８７９）
【出願日】平成１７年４月２６日（２００５．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４２３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１６０７３
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６２１３５６６）キテラ　インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｙｔｈｅｒａ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】３５５０　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｔｏｍｉｃｓ　Ｃｔ．Ｂｌｄｇ　２，Ｒｏｏｍ５０３　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　９２１２１　ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】