ＰＳＡの分析方法、及び前記分析方法を用いた前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法
前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができるＰＳＡの分析方法、及びＰＳＡの分析キットを提供する。
本発明の課題は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することによって解決することができる。この方法により、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法を提供することが可能である。
本発明の課題は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することによって解決することができる。この方法により、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法を提供することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＡの分析方法及びそれを用いた前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法、並びにＰＳＡの分析キットに関する。本発明によれば、前立腺癌の癌細胞から分泌されるＰＳＡに特異的に発現する糖鎖に結合するレクチンを用いることにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。特には、前立腺癌の癌細胞から分泌されるＰＳＡに特異的に発現する糖鎖に結合するレクチン、及びシアリダーゼを用いることにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。
更に、本発明は、生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法に関する。本発明によれば、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症とを鑑別することができる。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では、男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっている。前立腺癌の発生率は、１９７５年以降増加しているが、その理由の１つは、前立腺特異抗原（Prostate Specific Antigen：以下、ＰＳＡと称する）による診断方法の普及によるものである。このＰＳＡの測定により、従来の直腸指診では困難であった早期の癌が発見されるようになった。
【０００３】
ＰＳＡは、前立腺の腺細胞から前立腺の腺腔内に分泌されるタンパク質であり、前立腺に特異的に発現するタンパク質であるが、前立腺癌に特異的に発現するタンパク質ではない。従って、前立腺癌以外の前立腺肥大症及び前立腺炎などの疾患でも上昇することが知られている。
現在、広く使用されているＰＳＡ測定法は、α１−アンチキモトリプシンと結合した結合型ＰＳＡ（以下、ＰＳＡ−ＡＣＴと称することがある）及び遊離型ＰＳＡ（以下、フリーＰＳＡと称することがある）を測定するトータルＰＳＡの測定法であり、トータルＰＳＡの測定値が１０ｎｇ／ｍＬ以上の場合、５０％以上のヒトに前立腺癌が発見されるが、４〜１０ｎｇ／ｍＬのヒトで２５％、２〜４ｎｇ／ｍＬでも１５％のヒトに前立腺癌の発生が見られる。特に、トータルＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍＬの領域をグレーゾーンと呼んでいるが、前立腺肥大症の患者でも、このグレーゾーンのトータルＰＳＡ値を示す患者が多く、前立腺癌と前立腺肥大症の患者を鑑別することのできるＰＳＡの分析方法の開発が期待されている。
【０００４】
前記のグレーゾーンのトータルＰＳＡ値を示す患者において、前立腺肥大症と前立腺癌を鑑別するために、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合を測定することが行われている。前立腺癌患者では、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合が減少していることが報告されており、遊離型ＰＳＡのみを測定するフリーＰＳＡの測定法によりフリーＰＳＡ値を測定し、トータルＰＳＡ値に対するフリーＰＳＡ値（以下、「フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比」と称することがある）を求めると、この値が２５％以下を示す場合、前立腺癌の可能性が高いといわれている。しかしながら、グレーゾーンの検体において、前記フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が０〜１０％の範囲の場合、前立腺癌の可能性は５６％であるが、１０〜１５％では２８％、１５〜２０％では２０％、２０〜２５％では１６％であり、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比を用いても、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することは容易ではない。
【０００５】
トータルＰＳＡが１０ｎｇ／ｍＬ以上の患者、及びトータルＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬのグレーゾーンで、且つフリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が２５％以下を示す患者の場合、前立腺癌の確定診断のため、前立腺の生検を行う。しかしながら、特に後者においては、前立腺癌が発見される割合は、３０％程度であり、患者に過度の負担を強いており、この点からも、簡便に前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別する方法が開発されることが求められている。
【０００６】
ＰＳＡは１本のアスパラギン結合型糖鎖（以下、Ｎ−グリカン鎖と称することがある）を持つ糖タンパク質であるが、前立腺癌患者のＰＳＡは、高分岐化複合型糖鎖を持つことが知られており、また前立腺癌の患者に特異的な糖鎖を有しているのではないかと考えられていた。例えば、前立腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞から分泌されるＰＳＡのＮ−グリカン鎖を、質量分析機で分析したところ、正常精漿中のＰＳＡと比べてＮ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）及びフコースの含量が多く、シアル酸を欠如していることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このＬＮＣａＰ細胞のＰＳＡは、その糖鎖は、シアル酸を欠如していることなどから、生体内の前立腺癌患者の血清中のＰＳＡの糖鎖と異なっており、特殊なＰＳＡであると考えられた。
【０００７】
また、大山らは前立腺患者血清中のＰＳＡのＮ−グリカン鎖にシアル酸α（２，３）ガラクトース残基（Sialic acid alpha 2,3 Gal-Ｒ）を見出し、前立腺肥大症の患者と比較して、前立腺癌の患者のＰＳＡで、このシアル酸α（２，３）ガラクトース残基が多いことを報告した（特許文献１及び非特許文献２）。そして、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基に特異的に結合するイヌエンジュレクチン（Ｍ．amurensis agglutinin；以下、ＭＡＡと称する）と前立腺癌患者のＰＳＡを結合させ、ＭＡＡと結合したフリーＰＳＡの比率を測定することにより、前立腺癌と前立腺肥大症を鑑別することができることを見出した（特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基は、ＰＳＡ以外にα１−アンチキモトリプシンにも発現しており、従ってＭＡＡは、α１−アンチキモトリプシンにも親和性があるため、α１−アンチキモトリプシンとＰＳＡが結合している場合、すなわち、ＰＳＡ−ＡＣＴではシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡとシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を持たないＰＳＡとを分離することができない。従って、トータルＰＳＡの測定法では、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を鑑別することはできず、フリーＰＳＡを測定する必要があった。
【０００８】
更に、タジリらは、２人の前立腺癌患者の血清中のＰＳＡのＮ−グリカン鎖を、正常の精漿中ＰＳＡのＮ−グリカン鎖と質量分析により比較検討し、前立腺癌の患者のＰＳＡがシアル化及びフコース化されていることを報告している（非特許文献３）。しかしながら、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基以外に、実際に前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡを鑑別することのできる糖鎖は、報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−５５１０８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００３年（米国）第１３巻、ｐ．４５７〜４７０
【非特許文献２】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００４年（米国）第１４巻、ｐ．６７１〜６７９
【非特許文献３】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００８年（米国）第１８巻、ｐ．２〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、特願２００９−０２３５９７（未公開）において、以下の発明を開示した。
本発明者らは、前記特許文献１に記載のレクチンであるＭＡＡのカラムを用いて健常人のＰＳＡ及び前立腺癌患者のＰＳＡとを分別し、ＭＡＡに親和性のあるＰＳＡの測定を試みた。しかしながら、ＭＡＡカラムを用いてＰＳＡ分別した場合、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有しない正常なＰＳＡの回収率は７０％であり、ＰＳＡが非特異的に結合しているものと考えられた。また、前立腺癌患者のＰＳＡの回収率は４０％であり、ＭＡＡに対する非特異的な結合に加えて、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡが、ＭＡＡから溶出されないことも考えられた。従って、ＭＡＡカラムを用いた場合、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡの量を正確に測定できないことがわかった。
レクチンは、現在市販されているものだけでも１００種類以上あるが、本発明者らは、糖結合特異性の異なる複数の植物レクチンを組み合わせて、前立腺癌患者のＰＳＡに発現している糖鎖の同定を進め、前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することについて鋭意研究したところ、キカラスウリレクチン−ＩＩ（Trichosanthes japonica Agglutinin-II；以下、ＴＪＡ−ＩＩと称することがある）又はノダフジレクチン（Wisteria floribunda；以下、ＷＦＡと称することがある）に親和性のあるＰＳＡが、前立腺癌患者の血液中に存在していることを見出し、そして前記ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを用いることにより、前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することができることを見出した。すなわち、前立腺癌患者のＰＳＡの多くが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及び／又はフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）を有していることを見出した。
本発明者らは、更に前立腺癌患者のＰＳＡに発現している糖鎖の研究を進め、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のシアル酸も切断するシアリダーゼにより、前立腺癌患者ＰＳＡのシアル酸を除去することにより、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡと結合するＰＳＡが増加し、更に、効率よく前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することができることを見出した。すなわち、前立腺癌患者のＰＳＡの多くが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を有しており、シアリダーゼによりシアル酸を除去することにより、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）が露出し、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡと効率よく結合することを見出した。
本発明は、このような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本明細書は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階を含む。
本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法にも関する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡ量の判定が、分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定である。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記ＰＳＡ量の測定が、トータルＰＳＡ又はフリーＰＳＡの測定である。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の別の好ましい態様においては、前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである。
更に、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記試料が、前立腺癌の疑いのある患者から得られた試料である。
更に、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前立腺癌の診断用である。
【００１３】
本明細書は、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
更に、本明細書は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
更に、本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法に関する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
【００１４】
また、本発明は、前記ＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法にも関する。
また、本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む、ＰＳＡの分析キットにも関する。
本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、シアリダーゼを更に含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、抗ＰＳＡ抗体を更に含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである。
更に、本発明によるＰＳＡの分析キットの別の好ましい態様においては、前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである。
【００１５】
本発明は、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含む、ＰＳＡの分析キットに関する。
本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、シアリダーゼを更に含む。
【００１６】
本発明は、生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法に関する。
本発明による前立腺癌の検出方法の好ましい態様においては、フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの発現量を分析することを特徴とする。
本発明による前立腺癌の検出方法の好ましい態様においては、フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする。
本発明はフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キットに関する。
また、本発明はフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キットに関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＰＳＡの分析方法、及び前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法、並びにＰＳＡの分析キットによれば、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。また、本発明に用いることのできるレクチンであるＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡ、並びにＵＥＡ−Ｉと結合したＰＳＡは、ほぼ１００％の回収率で回収することが可能であり、前立腺癌が分泌する前立腺癌由来のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡの量を正確に測定することが可能である。更に、ＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡカラム並びにＵＥＡ−Ｉカラムは再生することが可能であり、再利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】精製したＴＪＡ−ＩＩを電気泳動した写真である。Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１は、還元したＴＪＡ−ＩＩを、レーン２は非還元のＴＪＡ−ＩＩを示している。
【図２】前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者の、ＴＪＡ−ＩＩカラムによる分別前の血清試料のＰＳＡ量（Ａ）とＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量（Ｂ）を示したグラフである。黒丸（●）が前立腺癌患者を、白丸（○）が前立腺肥大症患者を示している。
【図３】前立腺癌患者（ＰＣ：●）及び前立腺肥大症患者（ＢＨＰ：○）のＰＳＡの、ＴＪＡ−ＩＩ結合率を示したグラフである。
【図４】正常フリーＰＳＡ（Ａ）及び前立腺癌患者の血清（Ｂ）をＭＡＡカラムにより分画し、トータルＰＳＡの測定を行った結果を示したグラフである。
【図５】前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者の血清中のＰＳＡのシアリダーゼ処理前（Ａ）及びシアリダーゼ処理した後（Ｂ）の、ＴＪＡ−ＩＩへの結合率を示したグラフである。黒丸（●）が前立腺癌患者を、白丸（○）が前立腺肥大症患者を示している。
【図６】前立腺肥大症患者の血清中ＰＳＡ（ＢＰＨ ｓｅｒｕｍ ＰＳＡ）と、前立腺癌患者の血清中ＰＳＡ（ＰＣ ｓｅｒｕｍ ＰＳＡ）の糖鎖を示した図である。
【図７】前立腺の正常組織及び癌組織におけるＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡ発現を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［１］ＰＳＡの分析方法
本発明のＰＳＡの分析方法は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。より具体的には、本発明のＰＳＡの分析方法の別の態様においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。或いは、本発明のＰＳＡの分析方法の別の態様においては、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。
【００２０】
本発明に用いることのできるレクチンは、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンを挙げることができる。この場合、非還元末端のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミンが、シアル酸や硫酸基で置換されていないことが必須である。前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンは、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを挙げることができる。
【００２１】
また、本発明に用いることのできるレクチンとしては、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンを挙げることができる。フコースα（１，２）ガラクトース残基は、α−フコースがガラクトースに１，２結合した構造を有する末端糖鎖である。フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性の或るレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＵＥＡ−Ｉ又はＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
更に、本発明に用いることのできるレクチンとしては、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを挙げることができる。前立腺癌患者のＰＳＡ中には、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はフコースα（１，２）ガラクトース残基を単独で発現したＰＳＡが存在する可能性がある。また、前立腺癌患者によっては、そのＰＳＡにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はフコースα（１，２）ガラクトース残基のいずれかが、優位に発現している可能性も高い。従って、本発明のＰＳＡの分析方法においては、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを用いることが好ましい。前記非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
【００２２】
ＴＪＡ−ＩＩは、キカラスウリの塊根から抽出及び精製されるレクチンであり、非還元状態の電気泳動による分子量は６４ｋＤａであるが、Ｓ−Ｓ結合した２量体であり、還元状態の電気泳動による分子量は３２ｋＤａ及び２９ｋＤａを示す。ＴＪＡ−ＩＩは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）に強い親和性を示す。
【００２３】
ＷＦＡは、ノダフジの種子から抽出及び精製されるレクチンであり、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）そのものに強い親和性を示す。また、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ残基、及びＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ残基にも強い親和性を示す。
【００２４】
ＵＥＡ−Ｉ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１）は、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）から調製されるレクチンで、分子量は約２６，７００である。α−Ｌ−Ｆｕｃに糖特異性を持っており、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ→Ｒ）に強い親和性を示す。
【００２５】
本発明のＰＳＡの分析方法において、前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン、フコースα（１，２）ガラクトース残基に親和性のあるレクチン、並びにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンは、１つ又は２つ以上組み合わせても使用することができる。
【００２６】
本発明に用いるレクチンは、市販されているものを用いることもできるが、定法に従って精製することも可能である。植物体（例えば、葉、茎、花、根、又は種子など）を、細切、又は破砕し、緩衝液に溶解させる。遠心分離によって上清を回収し、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を用いて精製することができる。具体的には、ＴＪＡ−ＩＩの精製は、山下らの報告（Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992）に従って精製することが可能である。また、ＷＦＡは、豊島らの報告（Toyoshima et al., Biochemistry, 10, 4457-4463, 1971）に従って、精製することが可能である。また、ＵＥＡ−Ｉは、Hindsgaulらの報告（Hindsgaul et al., Carbohydr. Res., 109, 109-142, 1982）に従って、精製することができる。
【００２７】
本発明に用いることのできるシアリダーゼは、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるものであるならば、特に限定されることはない。前立腺癌患者のＰＳＡにおいては、シアル酸はα（２→６）結合により、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に、結合している。従って、シアル酸のα（２→６）結合を切断することにより、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基が露出し、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンと結合することができる。
シアル酸の結合には、α（２→３）結合、α（２→６）結合、及びα（２→８）結合があるが、本発明に用いることのできるシアリダーゼは、α（２→６）結合のみを切断するものでもよく、α（２→６）結合を含むいくつかの結合を切断するものでもよい。例えば、アリスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）由来のシアリダーゼは、α（２→３）結合、α（２→６）結合、及びα（２→８）結合を切断することができ、本発明のＰＳＡの分析方法に用いることができる。
【００２８】
シアリダーゼは、ノイラミニダーゼとも呼ばれ、哺乳動物もシアリダーゼを有しているが、細菌、ウイルス、及び原虫由来のシアリダーゼの研究が進んでいる。シアリダーゼとしては、アリスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどの由来のシアリダーゼが知られているが、これらのうち、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼとして、アリスロバクター・ウレアファシエンス、及びクロストリジウム・パーフリンゲンス由来のシアリダーゼを挙げることができる。
【００２９】
本明細書に記載のＰＳＡの分析方法は、前記レクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する限り、特に限定されるものではないが、（Ａ）レクチンにより、レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別し、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する分析方法（以下、分析方法（Ａ）と称することがある）、及び（Ｂ）レクチンと、レクチンに親和性のあるＰＳＡとが結合した状態でレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する分析方法（以下、分析方法（Ｂ）と称することがある）を挙げることができる。本発明のＰＳＡ分析方法として、（ｓＡ）前記分析方法（Ａ）において、試料として、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料を用いる分析方法（以下、分析方法（ｓＡ）と称することがある）、及び（ｓＢ）前記分析方法（Ｂ）において、試料として、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料を用いる、分析方法（以下、分析方法（ｓＢ）と称することがある）を挙げることができる。分析方法（ｓＡ）は分析方法（Ａ）に、分析方法（ｓＢ）は分析方法（Ｂ）に、それぞれ含まれるものである。
【００３０】
《分析方法（Ａ）》
前記分析方法（Ａ）は、
（ａ）本発明のレクチンとして例えばβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階（以下、「分別段階（ａ）」と称することがある）、及び
（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階（以下、「判定段階（ｂ）」と称することがある）
を含む。
【００３１】
《分析方法（ｓＡ）》
本発明の分析方法（ｓＡ）は、分析方法（Ａ）に含まれるものであり、前記分析方法（Ａ）における分別段階（ａ）の前に、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階（以下、「シアリダーゼ処理段階（ｓ）」と称することがある）を含むものである。
すなわち、前記分析方法（ｓＡ）は、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階を含む。
【００３２】
前記シアリダーゼ処理段階（ｓ）においては、ＰＳＡを含む可能性のある試料を、希釈せずに、又は適当な緩衝液で希釈し、そしてその試料に、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼを添加する。これによって、ＰＳＡからシアル酸を除去し、ＰＳＡのβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を露出させることができる。
試料を希釈する緩衝液は、シアリダーゼの活性を維持できるものであれば、限定されないが、例えば、前記レクチンカラムの平衡化に用いる０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液などを利用することができる。
シアリダーゼの使用量は、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができる。例えば、アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアルダーゼを用いる場合、２〜１０００ｍＵ、好ましくは１０〜５００ｍＵ、より好ましくは２０〜１００ｍＵのシアリダーゼを用いることにより、ＰＳＡのシアル酸のα（２→６）結合を切断することができる。
シアリダーゼの処理（反応）時間は、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができるが、１０分〜２４時間であり、好ましくは、１５分〜２時間であり、より好ましくは、３０分〜１時間である。また、反応温度も、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができるが、好ましくは２５℃〜４０℃である。
【００３３】
前記シアリダーゼ処理段階（ｓ）において得られたシアリダーゼ処理試料は、そのまま、又は更に希釈して、分別段階（ａ）に用いることができ、それに続いて、前記判定段階（ｂ）を行うことができる。
【００３４】
前記分別段階（ａ）においてレクチンに親和性のあるＰＳＡとレクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する方法は、レクチンとＰＳＡの親和性を利用する方法であれば、特に限定されるものではないが、例えば、担体にレクチンを結合させ、担体に結合したレクチン（以下、「レクチンアフィニティーカラム」と称することがある）にＰＳＡを含む可能性のある試料を接触させ、レクチンに結合したＰＳＡとレクチンに結合しないＰＳＡを分離することによって行うことができる。
【００３５】
担体としては、レクチンを結合させることのできるものであれば、限定されるものではないが、例えば、セファロース、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックスを挙げることができる。担体の形状も特に限定されるものではないが、粒子状のビーズ、プレート、及びゲルなどの形状の担体を用いることができる。例えば、レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとの分別に、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合は、担体はゲルの形状が好ましい。
【００３６】
レクチンアフィニティーカラムは、定法に従って作製することが可能である。例えば、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを用い、メーカーの推奨するプロトコールに従って、カップリングを行い、レクチンカラムを作製することが可能である。セファロースゲルへのレクチンの結合量は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【００３７】
レクチンアフィニティーカラムを用いて、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する方法は、通常のレクチンアフィニティーカラムを用いた糖タンパク質の分離方法に従って行うことができる。
レクチンアフィニティーカラムは、ＰＳＡを含む可能性のある試料をアプライする前に、緩衝液で平衡化させる。平衡化緩衝液としては、例えば、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液を用いることができる。
カラムを平衡化した後に、ＰＳＡを含む可能性のある試料を添加し、一定時間静置し、レクチンとＰＳＡとを接触させる。接触時間は、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＰＳＡの親和性によって、適宜決定することができるが、結合の速度と効率を考慮すると、通常１５分〜３０分で行うことが多い。
レクチンとＰＳＡとを接触させる温度も、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＰＳＡとの親和性によって、適宜決定することができるが、０℃〜４０℃で行うことが可能であり、好ましくは０℃〜３０℃である。０℃未満では、カラムが凍結してしまうことがあり、４０℃を超えるとレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合が起こることがある。例えば、ＴＪＡ−ＩＩとＰＳＡを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃〜１０℃で接触させるのが好ましい。また、ＷＦＡとＰＳＡとを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃〜１０℃で接触させるのが好ましい。
【００３８】
次に、レクチンに親和性のある結合画分（以下、「結合画分」と称することがある）と、レクチンに親和性のない非結合画分（以下、「非結合画分」と称することがある）を分別する。
レクチンへの非結合画分は、洗浄用緩衝液をカラムに添加し、素通り画分を回収することによって得ることができる。洗浄用緩衝液は、レクチンとＰＳＡの結合を解離させずに、非結合成分を流出させることのできる緩衝液であれば、限定されるものではないが、例えば、前記平衡化に用いた緩衝液を使用することができる。洗浄用緩衝液の容量は、レクチンの種類とＰＳＡとの親和性に応じて、適宜決定することができるが、好ましくはカラム容量の３〜７倍であり、より好ましくは５倍程度である。
レクチンへの結合画分は、溶出用緩衝液をカラムに添加し、溶出画分を回収することによって得ることができる。溶出用緩衝液は、ハプテン糖を含んでおり、それによりレクチンに結合したＰＳＡをレクチンから分離させることができる。ハプテン糖はレクチンの特異性によって適宜選択することが可能であるが、ＴＪＡ−ＩＩの場合は、ラクトースなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭラクトース、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。また、ＷＦＡの場合は、ＧａｌＮＡｃなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭＧａｌＮＡｃ、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。溶出用緩衝液の容量は、適宜選択することが可能であるが、好ましくはカラム容量の３〜７倍であり、より好ましくは５倍程度である。溶出の温度も特に限定されるものではないが、０℃〜４０℃、好ましくは２〜２５℃、より好ましくは４〜２０℃で行うことができる。０℃未満では、カラムが凍結してしまうことがあり、４０℃を超えるとレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合が起こることがある。例えば、ＴＪＡ−ＩＩからＰＳＡを溶出させる温度は、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。また、ＷＦＡからＰＳＡを溶出させる温度も、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。
【００３９】
前記判定段階（ｂ）における、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量の判定は、
（１）分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、
（２）分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は
（３）分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定
を挙げることができる。
【００４０】
前記分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定（１）は、前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量を定量的又は半定量的に測定することによって行うことができる。すなわち、患者の血液中に含まれているレクチンに親和性のあるＰＳＡの絶対量を測定することによって、判定を行うものである。
【００４１】
前記分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定（２）は、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）と前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量とを比較することによって行うことができる。具体的には、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）に対する、前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量の割合を計算することによって、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することが可能であり、例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／結合画分及び非結合画分のＰＳＡの合計量）×１００％
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／分別前の試料中のＰＳＡ量）×１００％
【００４２】
また、分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定（３）は、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）と前記レクチンへの非結合画分中のＰＳＡ量とを比較することによって行うことができる。具体的には、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）から、前記レクチンへの非結合画分中のＰＳＡ量を減算することによって、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することが可能である。例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
レクチン親和性ＰＳＡ量＝分別前の試料中のＰＳＡ量−非結合画分中のＰＳＡ量
レクチン親和性ＰＳＡ量＝結合画分及び非結合画分のＰＳＡの合計量−非結合画分中のＰＳＡ量
【００４３】
前記（１）及び（２）の判定では、レクチンに結合したＰＳＡをレクチンから分離してその量を測定するが、前記（３）の判定のうち、分別前の試料中のＰＳＡ量と非結合画分中のＰＳＡ量とからの判定では、レクチンに結合したＰＳＡ量を測定しないため、レクチンに結合したＰＳＡを分離せずに判定することもできる。
また、分取した結合画分及び非結合画分のＰＳＡ量は、すべての画分についてＰＳＡ量の測定を行うことが好ましいが、予めＰＳＡが含まれる分取画分を調べておき、その画分について測定を行い、ＰＳＡの分析を行うことも可能である。
【００４４】
前記判定段階（ｂ）において、レクチンに親和性のあるＰＳＡ量を判定するためのＰＳＡの測定方法としては、ＰＳＡを定量的又は半定量的に判定することのできる方法であれば、特に限定されるものではないが、トータルＰＳＡの測定方法又はフリーＰＳＡの測定方法を用いることができる。トータルＰＳＡの測定方法又はフリーＰＳＡの測定方法は、定法に従い、抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）によって測定することができ、ＰＳＡ測定キットとして市販されているものを使用することも可能である。
【００４５】
トータルＰＳＡの測定方法に免疫学的分析方法を用いる場合には、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びフリーＰＳＡの両方のＰＳＡに結合することのできるモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いる。一方、フリーＰＳＡの測定方法に免疫学的分析方法を用いる場合には、フリーＰＳＡのみに結合することのできるモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡを用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Nature 256 : 495-497, 1975）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡを単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００４６】
後述の実施例の解析により、本発明のＰＳＡの分析方法に用いることのできるＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを用いたレクチンアフィニティーカラムは、試料中のＰＳＡを約１００％（少なくとも、９７％以上）回収することが可能であることが分かった。これに対して、特許文献１に記載のＭＡＡの場合は、溶出液として乳糖含有リン酸緩衝液を用いた回収率は３０〜７０％であり、溶出液を、０．１Ｍ酢酸液に変更しても、回収率は改善されなかった。
【００４７】
《分析方法（Ｂ）》
前記分析方法（Ｂ）は、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＰＳＡを検出する方法であるが、具体的には、電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットを挙げることができる。どちらのレクチンブロットも、定法に従って行うことができるが、電気泳動によるレクチンブロットの場合、ＰＳＡを含む可能性のある試料を電気泳動し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜にＰＳＡを転写し、サンプルメンブレンとして用いる。ドットブロットによるレクチンブロットの場合、ドットブロッティング装置により、ＰＳＡを含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＰＶＤＦ膜などに吸着させ、サンプルメンブレンとして用いる。サンプルメンブレンは、ブロッキングバッファーでブロッキングを行い、ビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ−ＩＩを含む溶液中で接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンと接触させ、発色液又は発光液を接触させ、得られたシグナルを検出する。
【００４８】
更に、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＰＳＡを検出する方法（Ｂ）としては、イムノブロット及び酵素免疫法を一部変更して行うことができる。具体的には、前記ＰＳＡに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、ニトロセルロース膜など、又はＥＬＩＳＡプレートなどに固相化し、ブロッキングバッファーでブロッキングを行う。ＰＳＡを含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＥＬＩＳＡプレートなどに接触させ、次にビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ−ＩＩを接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンを結合させ、発色液又は発光液によりシグナルを検出することができる。
【００４９】
《分析方法（ｓＢ）》
本発明の分析方法（ｓＢ）は、分析方法（Ｂ）に含まれるものであり、前記電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットの前に、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階（すなわち、シアリダーゼ処理段階（ｓ））を含むものである。シアリダーゼ処理段階（ｓ）は、前記分析方法（ｓＡ）に記載の段階と同じように行うことができ、得られたシアリダーゼ処理試料は、そのまま、又は更に希釈して、レクチンブロットに用いることができる。
【００５０】
本発明のＰＳＡの分析方法に用いる被検試料としては、ＰＳＡを含む生体試料若しくは生体由来試料か、又はＰＳＡを含む可能性のある生体試料若しくは生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、前立腺の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は前立腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿が好ましい。健常人及び前立腺肥大症患者の血液、血清、又は血漿中には、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及び／又はフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは、ほとんど存在しておらず、前立腺癌患者においては、病期の初期から血液中に放出されるために、前立腺癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００５１】
前記尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液などの液性の試料は、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、それぞれの分析方法に応じて適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液又はその上清を、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
例えば、前記分析方法（Ａ）において、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合、前記液体試料、又は固形の試料の懸濁液若しくはその上清は、適当な緩衝液により希釈して用いることができる。希釈倍率は、レクチンとＰＳＡとの結合が阻害されなければ、特に限定されないが、好ましくは２〜４００倍であり、より好ましくは２〜３００倍であり、最も好ましくは４〜２００倍である。また、レクチンアフィニティーカラムにアプライする試料の容量は、カラムのベッドボリュームの４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下が、最も好ましい。例えば１ｍＬのベッドボリュームのレクチンアフィニティーカラムを用いる場合、４００μＬ以下が好ましく、３００μＬ以下がより好ましく、２００μＬ以下が最も好ましい。
【００５２】
［２］前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法
前記ＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することができる。
前記ＰＳＡの分析方法により、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を測定し、前立腺肥大症又は健常人から採取した血液等中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、前立腺肥大症又は健常人の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＰＳＡと比べて、前記患者の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＰＳＡが有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。
前記分析方法（Ａ）（分析方法（ｓＡ）を含む）においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を認識するＴＪＡ−ＩＩへの結合率と、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のみを認識するＷＦＡへの結合率が異なっている。従って、使用するレクチンの測定値によって、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することのできるカットオフ値を、それぞれ決定することが好ましい。カットオフ値は、前立腺癌患者の１００％を陽性と判定でき、前立腺肥大症患者の１００％を陰性と判定できる値が最も好ましい。もし、分析した前立腺癌と前立腺肥大症の母集団が増加することによって、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間の測定値が、オーバーラップした場合は、前立腺癌患者が１００％陽性と判断される値をカットオフ値として選択することが好ましいが、オーバーラップした範囲の任意の値をカットオフ値とすることも可能である。具体的には、後述の実施例のＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量を測定した場合、前立腺癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌患者のＰＳＡを検出することのできる値であれば、限定されないが、例えば２００ｐｇ／ｍＬを超え、２４０ｐｇ／ｍＬ未満に設定することが可能であり、好ましくは、２２０ｐｇ／ｍＬである。
また、後述の実施例のレクチンへのＰＳＡの結合率は、下記の式で得ることのできる百分率から決定することができる。
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／分別前の試料中のＰＳＡ量）×１００％
ＰＳＡの結合率のカットオフ値も、前立腺癌患者の１００％を陽性と判定でき、前立腺肥大症患者の１００％を陰性と判定できる値が最も好ましい。もし、分析した前立腺癌と前立腺肥大症の母集団の増加によって、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間で、レクチンへのＰＳＡの結合率が、オーバーラップする場合は、前立腺癌患者が１００％陽性と判断される値が好ましいが、オーバーラップした範囲の任意の値をカットオフ値とすることも可能である。具体的には、後述の実施例のＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率のカットオフ値は前立腺癌を検出することのできる値であれば、限定されないが、例えば１．８％を超え、３％未満に設定することが可能であり、好ましくは２．４％である。
【００５３】
［３］前立腺癌の診断キット
本発明の診断キットは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む。また、本発明の診断キットは、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性のあるレクチンを含むこともできる。更に、本発明の診断キットは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含むこともできる。本発明の診断キットに含まれるレクチンは、上記担体に結合させた状態のものも含まれる。
【００５４】
本発明の診断キットは、前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン、フコースα（１，２）ガラクトース残基に親和性のあるレクチン、並びにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンは、１つ又は２つ以上組み合わせて含むことができる。
【００５５】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡを挙げることができる。また、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性のあるレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＵＥＡ−１及びＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。更に、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとしては、ＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
【００５６】
本発明の診断キットは、シアリダーゼを含むこともできる。シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼであれば、特に限定されるものではないが、アリスロバクター・ウレアファシエンス、及びクロストリジウム・パーフリンゲンス由来のシアリダーゼを挙げることができる。
【００５７】
本発明の診断キットは、更に抗ＰＳＡ抗体（例えば、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡに特異的に結合する抗体）又はその断片を含むことができる。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡへの特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
【００５８】
前記レクチン及び抗ＰＳＡ抗体を含む、本発明の診断キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態で前記抗ＰＳＡ抗体、又はその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
【００５９】
《作用》
グレーゾーンのＰＳＡ値（トータルＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍＬ）を示す患者においては、前記のように血清試料のフリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比（Ｆ／Ｔ値）の測定が行われている。表１に示すように、前立腺肥大症患者９例中７例において、Ｆ／Ｔ値が２５％以下を示しており、これらの患者は、確定診断のための生検の対象となるが、実際には前立腺肥大症であり、患者にとって過度の負担となっている。
本発明に用いることのできるＴＪＡ−ＩＩは糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するレクチンである。ＷＦＡは糖鎖の非還元末端に存在するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するレクチンである。また、ＵＥＡ−Ｉは糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基を認識するレクチンである。本明細書によって、前立腺癌患者の体内にＴＪＡ−ＩＩ、ＷＦＡ又はＵＥＡ−Ｉと結合するＰＳＡが存在することが示され、すなわち、図６に示すように、癌化に伴ってＰＳＡ糖鎖に、これらの糖鎖構造が出現することが、初めて示されたものである。
更に、後述の実施例３に示すように、前立腺癌患者の血清ＰＳＡを、シアル酸α（２，６）結合を切断することのできるシアリダーゼで処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩと結合することのできるＰＳＡの量が増加することを見出した。このことは、シアリダーゼ処理により、シアル酸α（２，６）結合が切断され、シアル酸が結合していたβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基が露出することを示している。すなわち、図６に示すように、前立腺癌の患者の血清中に含まれるＰＳＡが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を、有していることを初めて見出したものである。
前記のように前立腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞のＰＳＡは、非還元末端側にＨｅｘＮＡｃβ１−ＨｅｘＮＡｃ残基を持つことが報告されている（非特許文献１）。ＨｅｘＮＡｃには、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃβ）及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃβ）が含まれるが、質量分析では分子量が同一となり、区別することができない。また、非特許文献１に記載のＬＮＣａＰ細胞から分泌されるＰＳＡは、その糖鎖は、シアル酸を欠如していることなどから、前立腺癌患者の生体のＰＳＡを反映していないと考えられていた。従って、本明細書において、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＷＦＡカラム及びＵＥＡ−Ｉカラムを用いることによって、前立腺癌患者の血清ＰＳＡにおける非還元末端β−Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を初めて同定できたものである。
癌化に伴うＰＳＡ糖鎖構造の変化、すなわちフコースα（１，２）ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の出現は、前立腺癌の発症によって、糖鎖の合成に関わる糖転移酵素活性量の変化が背景にあるものと考えられる。
【００６０】
また、特許文献１及び非特許文献２に記載のように、前立腺癌における糖鎖の構造変化をＮｅｕＡｃβ２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを特異的に認識するＭＡＡで検出しようとする場合に、一定の割合の血中ＰＳＡは、血清α１−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡ−ＡＣＴの状態で存在している。ＭＡＡはα１−アンチキモトリプシンとも結合するため、ＰＳＡの糖鎖構造が異なっていても、α１−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡは分別することができない。従って、ＭＡＡでＰＳＡを分別した場合は、フリーＰＳＡを測定する必要がある。
一方、本発明で用いることのできるＴＪＡ−ＩＩはＰＳＡ糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識し、ＷＦＡはＰＳＡ糖鎖の非還元末端に存在するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するが、これらの糖鎖構造は血清α１−アンチキモトリプシン上には存在しないため、トータルＰＳＡ測定キットを用いて定量することが可能である。一般的にフリーＰＳＡ量はトータルＰＳＡ量の２０％以下であり、本発明の分析方法においてはトータルＰＳＡ測定キットを用いることできるため、非特許文献２及び特許文献１に記載の発明と比較して感度の上で有利である。
【００６１】
［４］糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出方法
後述の実施例５に示すように、前立腺癌患者のＰＳＡにおけるフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の増加には、フコース転移酵素、すなわちフコース転移酵素１（以下、ＦＵＴ１と称することがある）の前立腺癌における発現の増加が強く関与している。また、前立腺癌患者のＰＳＡにおけるβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、及びシアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）の増加は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、すなわちβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４（以下、β４ＧＡＬＮＴ４と称することがある）の前立腺癌における発現の増加によるものであると考えられる。従って、前立腺癌患者由来の試料のＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４から選択される少なくとも１つの糖転移酵素を分析することによって、前立腺癌患者と、正常人又は前立腺肥大症患者とを鑑別することが可能である。以下に、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を、それぞれフコース転移酵素又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の例として、本発明の前立腺癌の検出法について説明する。
【００６２】
本発明の検出方法において、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を分析する方法としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法等）、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４に対する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、又は生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）などを挙げることができる。
【００６３】
《分子生物学的分析方法》
ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分子生物学的分析方法としては、試料中の遺伝子、例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなどと、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用い、ハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができるが、特にはリアルタイムＰＣＲ法が正確で且つ簡便であり、好ましい。
【００６４】
リアルタイムＰＣＲ法としては、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びに前記プライマーセットと、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等を挙げることができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００６５】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＦＵＴ１のフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号１で表されるＦＵＴ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００１４８）から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−ＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号３）を、リバースプライマーとして５’−ＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４）を挙げることができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４のフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号２で表されるβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７８５３７）から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−ＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）を、リバースプライマーとして５’−ＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）を挙げることができる。
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒである。
【００６６】
前記ＰＣＲ法、特にはリアルタイムＰＣＲ法は、
（１）生体由来の試料からｍＲＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、
（３）プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを用いてＤＮＡを増幅する工程、及び
（４）増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を含むことができる。
【００６７】
前立腺癌が疑われる患者の生体由来の試料中におけるＦＵＴ１のｍＲＮＡの発現量を、測定し、健常者生体由来試料中のＦＵＴ１の発現量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＦＵＴ１の発現量と比べて、前記患者のＦＵＴ１の発現量が有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４についても、同様に健常者と比較することにより、前立腺癌の判定が可能である。
例えば、後述の実施例におけるリアルタイムＰＣＲの場合、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００６８】
《免疫学的分析方法》
ＦＵＴ１の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＦＵＴ１に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β４ＧＡＬＮＴ４に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。
【００６９】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００７０】
免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、特にはサンドイッチ法を用いる場合には、以下のように行うことが可能である。例として、β４ＧＡＬＮＴ４に対する抗体を用いる場合について説明する。
まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、β４ＧＡＬＮＴ４に結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、β４ＧＡＬＮＴ４が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とβ４ＧＡＬＮＴ４を接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたβ４ＧＡＬＮＴ４と結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−β４ＧＡＬＮＴ４−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、２次抗体を直接標識せずに、２次抗体に結合する抗体を標識しシグナルを検出することも可能である。
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。
【００７１】
更に被検試料として前立腺の生検試料を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色法により、前立腺でのＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の発現を確認することにより、前立腺癌であるか否かを判定することができる。
【００７２】
また、被検試料として血液等を用いる場合、前立腺癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量を測定し、健常者から採取した血液等中のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量と比べて、前記患者のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量が有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。
例えば、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。前立腺癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌患者を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００７３】
《生化学的分析方法》
ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、Ｌａｒｓｅｎら〔Larsen RD, Ernst LK, Nair RP, Lowe JB. Proc. Natl Acad Sci USA, 87, 6674-6678 (1990)〕又はＧｏｔｏｈら〔Gotoh M, Sato T, Kiyohara K, Kameyama A, Kikuchi N, Kwon YD, Ishizuka Y, Iwai T, Nakanishi H, Narimatsu H. FEBS Lett., 562, 134-140 (2004)〕の方法に従って、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４酵素活性を測定することにより、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量又は存在の有無を分析することが可能である。
【００７４】
本発明の糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出方法において、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分析に用いる被検試料としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液等の体液試料、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、前立腺の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は前立腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）が好ましい。健常者又は前立腺肥大症患者の組織、血液、血清、又は血漿中には、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４は、ほとんど存在しておらず、前立腺癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００７５】
［５］糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出キット
本発明の分子生物学的分析による前立腺癌の検出用キットは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを含むことができる。本発明の検出用キットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムＰＣＲ法を行うのに必要な試薬及び／又は酵素を更に含むこともできる。更に、本発明のキットは、前立腺癌の検出又は測定用、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【００７６】
本発明の免疫学的分析による前立腺癌の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４に特異的に結合する抗体、またはその断片を含むことができる。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４への特異的結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
更に、本発明のキットは、前立腺癌の検出又は測定用、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００７８】
《ＴＪＡ−ＩＩ精製例》
キカラスウリ（Trichosanthes japonica）の根塊２０ｇより、既報（Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992）に従って、ＴＪＡ−ＩＩを精製した。具体的には、キカラスウリの塊根を細かく細断し、ワーリングブレンダーを用いて、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１６ｍＬでホモジェナイズした。１０００ｘｇで３０分遠心し、得られた上清の３５〜５５％飽和の硫安分画沈殿物を水に溶解し、蒸留水で透析した。凍結乾燥後、４３５ｍｇの３５〜５５％飽和の硫安沈殿物を６ｍＬのＰＢＳに溶解し、ＰＢＳで平衡化したporcine stomach mucinセファロース４Ｂ（１０ｍｇ／ｍＬゲル）カラム１０ｍＬにアプライした。カラムを洗浄した後、０．１Ｍラクトースを含むＰＢＳで溶出し、ＴＪＡ−ＩＩを得た。
【００７９】
《カラム作製例》
精製したＴＪＡ−ＩＩを用いて、セファロースカラムにカップリングさせ、ＴＪＡ−ＩＩカラム及びＷＦＡカラムを作製した。具体的には、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、ゲル容積１ｍＬあたり３ｍｇの密度でＴＪＡ−ＩＩ結合させ、ＴＪＡ−ＩＩカラムを作製した。
また、ＷＦＡ（ＥＹラボラトリー社製）及びＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、同様にＷＦＡカラムを作製した。
【００８０】
《実施例１：ＴＪＡ−ＩＩを用いたＰＳＡの分析》
本実施例では、前記カラム作製例において作製したＴＪＡ−ＩＩカラムを用いて、前立腺癌と診断された１５人の患者及び前立腺肥大症と診断されたトータルＰＳＡが４．０ｎｇ／ｍＬ以上の９人の患者について、本発明のＰＳＡの分析方法によりＰＳＡの量を測定した。
４℃の条件下で、ＴＪＡ−ＩＩカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１μＬ〜５０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＴＪＡ−ＩＩ非結合画分を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分を得た。ＴＪＡ−ＩＩカラムによる分別前の血清試料、ＴＪＡ−ＩＩ非結合画分、及びＴＪＡ−ＩＩ結合画分について、トータルＰＳＡ量を、アクセスハイブリテックトータルＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。ＴＪＡ−ＩＩカラムからのＰＳＡ回収率は常に９７％〜１００％であった。表１に分別前の血清試料のＰＳＡ量、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分のＰＳＡ量、及びＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率を示す。なお、ＴＪＡ−ＩＩ結合率は次の式により計算した。
ＴＪＡ−ＩＩ結合率＝（ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量／ＴＪＡ−ＩＩ非結合画分及びＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量）×１００％
また、分別前の血清試料のフリーＰＳＡを、アクセスハイブリテックフリーＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。前記トータルＰＳＡの量及びフリーＰＳＡの量から、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比を計算した。結果を表１、図２及び図３に示す。なお、癌患者の、年齢、病期（ステージ）、グリソンスコアは表２に示した。病期（ステージ）は、前立腺癌の進展度を示したものである。また、グリソンスコアは、前立腺癌の悪性度を、病理学上の分類によって５段階に分けたものである。「１」が最もおとなしい癌で、「５」が最も悪い癌を意味するが、前立腺癌の多くは、複数の、悪性度の異なる成分を有しているため、最も多い成分と次に多い成分を足し算してスコア化したものが、グリソンスコアである。例えば、最も多い成分が「３」で次に多い成分が「４」の場合、グリソンスコアは「３」＋「４」＝「７」となる。グリソンスコアが「６」以下は悪性度の低いもの、「７」は中程度の悪性度、「８」〜「１０」は悪性度の高い癌と考えられている。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
図２及び図３に示すように、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量、及びＴＪＡ−ＩＩ結合率は、いずれも前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間で重複することなく、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を鑑別することができることを示している。暫定的に、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量のカットオフ値を２５０ｐｇ／ｍＬ、ＴＪＡ−ＩＩ結合率のカットオフ値を２％とすると、１００％の精度で前立腺肥大症患者と前立腺癌患者を区別することが可能である。異なる臨床ステージ、グリソンスコアにおいても、ＴＪＡ−ＩＩ結合率とＴＪＡ−ＩＩ結合ＰＳＡ量には有意な差が認められなかった。
【００８４】
《実施例２》
本実施例では、前記カラム製造例で製造したＷＦＡカラムを用いて、前立腺癌と診断された３人の患者について、本発明のＰＳＡの分析方法によりＰＳＡの量を測定した。
具体的には、ＴＪＡ−ＩＩカラムと溶出液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）に代えて、ＷＦＡカラムと溶出緩衝液（１０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を用いたことを除いては、前記実施例１の操作を繰り返し、前立腺癌患者の３人の血清試料を分析し、ＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量及びＷＦＡ結合率を得た。ＷＦＡ結合率の結果を表３に示す。
なお、ＷＦＡ結合率は次の式により計算した。
ＷＦＡ結合率＝（ＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量／ＷＦＡ非結合画分及びＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量）×１００％
また、比較のためにＴＪＡ−ＩＩ結合率を表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】
ＷＦＡカラムからのＰＳＡ回収率は、９０％〜９８％であった。また、ＷＦＡの結合率は、ＴＪＡ−ＩＩ結合率とほぼ相関しており、ＷＦＡはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡと結合して、前立腺癌患者のＰＳＡを分別することが可能である。
但し、ＷＦＡ結合率は、ＴＪＡ−ＩＩ結合率よりやや低く、８４．０％〜９３．８％である。このことは、前立腺癌患者の血液中には、ＴＪＡ−ＩＩのみに親和性のあるＰＳＡが存在する可能性を示している。すなわち、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を有さず、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）のみを有しているＰＳＡが存在する可能性を示唆している。
【００８７】
《実施例３》
本実施例では、前立腺癌の患者の血清をシアリダーゼ処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩカラムと結合するＰＳＡが、増加することを確認した。
まず、前立腺癌と診断された患者の血清及び前立腺肥大症と診断された患者の血清を、それぞれ２０検体を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、それぞれのＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率を調べた。結果を図５Ａに示す。前立腺癌では、約２％以上のＴＪＡ−ＩＩ結合率を示し、前立腺肥大症では、約２％未満のＴＪＡ−ＩＩ結合率を示した。
次に、前立腺癌と診断された患者の血清及び前立腺肥大症と診断された患者の血清をそれぞれ５検体用いて、シアリダーゼ処理を行った。具体的には、血清試料１μＬ〜５０μＬを、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとした。得られた希釈試料に、アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼを５０ｍＵ添加し、３７℃で１時間反応させた。得られたシアリダーゼ処理試料を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図５Ｂに示す。
図５の矢印は、前立腺癌と診断された患者の５つの血清において、シアリダーゼ処理によって、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率が上昇したことを示している。一方、前立腺肥大症と診断された患者の血清では、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率の上昇は見られなかった。
【００８８】
更に、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアル酸α（２，３）特異的シアリダーゼを用いて、同様の操作を繰り返した。しかしながら、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアリダーゼでは、前立腺癌と診断された患者の血清においても、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率は上昇しなかった。
これらの結果は、以下のことを示している。アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼは、主としてシアル酸α（２，６）及びシアル酸α（２，３）結合を切断する。一方、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアリダーゼは、シアル酸α（２，３）結合を切断する。すなわち、前立腺癌患者の血清中のＰＳＡのシアル酸は、シアル酸α（２，３）結合でなく、シアル酸α（２，６）結合により、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に結合しているものと考えられる（図６）。
【００８９】
《実施例４》
本実施例では、前立腺肥大症の患者血清中のＰＳＡ、前立腺癌の患者血清中のＰＳＡ、及び精漿中のＰＳＡについて、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＵＥＡ−Ｉカラム、又はＷＦＡカラムへのそれぞれのＰＳＡの結合率を調べた。ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率については、シアリダーゼ処理を行った検体と、シアリダーゼ処理を行わない検体について、結合率を調べた。
ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率の測定は、実施例１に記載の方法に従った。ＷＦＡカラムへの結合率の測定は、実施例２に記載の操作に従った。シアリダーゼ処理を行った検体のＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率の測定は、実施例３に記載の操作に従った。
また、ＵＥＡ−Ｉカラムへの結合率の測定は、以下のように行った。ハリエニシダアグルチニンーＩ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１：ＵＥＡ−Ｉ）の結合したアガロース（ＵＥＡ−Ｉアガロース：Ｊオイルミルズ）を用いて、ＵＥＡ−Ｉに結合するＰＳＡの量を測定した。具体的には、ＴＪＡ−ＩＩカラムと溶出液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）に代えて、ＵＥＡ−Ｉアガロースと溶出緩衝液（５０ｍＭ ｆｕｃｏｓｅ、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を用いたことを除いては、前記実施例１の操作を繰り返し、ＵＥＡ−Ｉ結合率を測定した。結果を表４に示す。
【００９０】
【表４】
【００９１】
前立腺肥大症の患者血清中のＰＳＡは、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＵＥＡ−Ｉカラム、又はＷＦＡカラムにほとんど結合しない。一方、前立腺癌患者血清中のＰＳＡは、ＴＪＡ−ＩＩカラムに１６％のＰＳＡが結合し、ＵＥＡ−Ｉカラムに５％のＰＳＡが結合し、ＷＦＡカラムに１１％のＰＳＡが結合する。これらのデータは、前立腺癌患者血清中のＰＳＡは、非還元末端β−Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を有していることを示している。
更に、前立腺癌患者血清中のＰＳＡをアリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼで処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率が、１１％から５９％に上昇した。このデータは、前立腺癌患者血清中のＰＳＡが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有していることを示している。
【００９２】
《比較例１》
本比較例では、特許文献１に記載のレクチンであるＭＡＡを用いて、前立腺癌患者のＰＳＡの分別及び測定を行った。
ＭＡＡの精製は、既報（Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., 249, 2786-2792, 1974）の方法に従った。具体的には、イヌエンジュマメ（Maackia amurensis）の種子５０ｇを数百ｍＬのＰＢＳでホモジナイザーにより細かくなるまでホモジナイズし、更に一晩攪拌後、９０００ｒｐｍ３０分遠心分離にて沈殿物を除いた。この抽出液（２１０ｍＬ）の５０〜８０％の硫安分画画分をＰＢＳに透析し、遠心操作で沈殿を除いた後、一部（３０ｍＬ）をチログロブリンセファロース（１９ｍｇ／ｍＬ、１５ｍＬ）に添加し、ＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍラクトース、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１５Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出する。レクチン活性の高い部分をプールし濃縮後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に透析にて置換する。遠心操作で沈殿を除去後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファデックスＣ−５０（１００ｍＬ）に添加し、非吸着画分を集め濃縮し、精製ＭＡＡを得た。
【００９３】
精製したＭＡＡを用いて、セファロースカラムを作製した。ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、ゲル容積１ｍＬあたり３ｍｇの密度でＭＡＡを結合させ、ＭＡＡカラムを作製した。
【００９４】
まず、ＭＡＡカラムのシアル酸α（２，３）ガラクトース残基との結合特性を確認するため、シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖を用いて結合を確認した。４℃の条件下で、ＭＡＡカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で平衡化した。シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有する複合型３本鎖オリゴ糖を含む試料をカラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＭＡＡ非結合分画を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（４００ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＭＡＡ結合画分を得た。前記シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖は、カラムに結合せず、９５％以上がＭＡＡ非結合分画に回収された。
【００９５】
次に、このＭＡＡカラムを用いて、前立腺癌患者のＰＳＡのＭＡＡカラムへの結合を調べた。４℃の条件下で、ＭＡＡカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画して５つのＭＡＡ非結合分画を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（４００ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、５つのＭＡＡ結合画分を得た。それぞれの画分について、トータルＰＳＡ量を、アクセスハイブリテックトータルＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。対照として、精製した正常フリーＰＳＡ５ｎｇを用いて、同じ操作を繰り返し、トータルＰＳＡ量を測定した。前立腺癌患者のＰＳＡの結果を図４（Ｂ）に、正常フリーＰＳＡの結果を図４（Ａ）に示す。
【００９６】
正常フリーＰＳＡは、ほとんどが２番目のＭＡＡ非結合分画に検出された。しかしながら、すべての画分のＰＳＡの量を合計した正常フリーＰＳＡ量は、ＭＡＡカラムにアプライした、５ｎｇの正常フリーＰＳＡに対して、３．５ｎｇであり、回収率は７０％であり、３０％がカラムに結合したままであると考えられた。
一方、前立腺癌患者のＰＳＡは、２番目のＭＡＡ非結合分画に検出される未吸着のＰＳＡ、３番目のＭＡＡ非結合分画の肩の部分に検出されるわずかに吸着するＰＳＡ、及び４００ｍＭラクトースで溶出される吸着ＰＳＡに分かれた。すべての画分のＰＳＡ量を合計すると４ｎｇ／ｍＬであり、分別前の血清試料のＰＳＡ量である１０ｎｇ／ｍＬに対して、４０％程度しか回収されなかった。この回収率は、溶出溶液として、０．１Ｍ酢酸溶液を用いても改善されなかった。更に、用いた前立腺癌患者のＰＳＡは、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が３．６であり、９６．４％のＰＳＡがα−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡ−ＡＣＴの状態で存在している。α−アンチキモトリプシンは、１分子あたりシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を１残基有しているため、ＰＳＡ−ＡＣＴは、ＭＡＡカラムと結合するはずであるが、多くのＰＳＡが２番目のＭＡＡ非結合分画に検出される未吸着のＰＳＡ、及び３番目のＭＡＡ非結合分画の肩の部分に検出されるわずかに吸着するＰＳＡとして検出された。
【００９７】
すなわち、シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖が、ＭＡＡカラムに結合しないこと、及びＰＳＡ−ＡＣＴのうち結合しないものが存在することは、ＭＡＡレクチンカラムに対するＰＳＡの結合が弱いことを示している。しかしながら、ＰＳＡのＭＡＡへの結合が弱いにもかかわらず、ＰＳＡの回収率は悪く、ハプテン糖による溶出が困難であり、ＭＡＡで再現性よく正確に測定することは、困難であると考えられた。
【００９８】
《実施例５》
本実施例では、前立腺癌患者のＰＳＡにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を付加するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース残基を付加するフコース転移酵素及びシアル酸を付加するシアル酸転移酵素を特定し、それらの転移酵素の前立腺癌組織における発現を確認した。
【００９９】
まず、ヒト前立腺癌由来細胞及び正常ヒト前立腺組織における、フコース転移酵素１（ＦＵＴ１）、及びフコース転移酵素２（ＦＵＴ２）、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（β４ＧＡＬＮＴ２）、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素３（β４ＧＡＬＮＴ３）及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４（β４ＧＡＬＮＴ４）、並びにシアル酸転移酵素１（以下、ＳＴ６ＧＡＬ１と称する）及びシアル酸転移酵素２（以下、ＳＴ６ＧＡＬ２と称する）のｍＲＮＡの発現を、リアルタイムポリメレース重合反応（以下、リアルタイムＰＣＲと称する）法によって調べた。ヒト前立腺癌由来細胞として、ＤＵ１４５（ＲＣＢ２１４３；理研バイオリソースセンターから提供）及びＰＣ−３（ＪＣＲＢ９１１０；ヘルスサイエンスリサーチリソースバンクより提供）を用いた。ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて保存した、正常前立腺組織、並びに前記ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてトータルＲＮＡを調整し、クロロホルム・イソプロピルアルコール抽出を行った。抽出したＲＮＡは、エタノール沈殿の後、ジエチルカーボネート処理した蒸留水に溶解した。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（インビトロジェン社）を用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ライフテクノロジー社）、及びそれぞれの糖転移酵素の遺伝子特異的なプライマーを用いて、Ｄｉｃｅ（登録商標） ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＴＰ８００，タカラ）により行った。
【０１００】
用いたそれぞれの糖転移酵素のプライマーは、以下のとおりである。
ＦＵＴ１：５’−ＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号３）、及び５’−ＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００１４８）；
ＦＵＴ２：５’−ＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号５）、及び５’−ＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣ−３’（配列番号６）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００５１１）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ２：５’−ＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴ−３（配列番号７）’、及び５’−ＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＣＧＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号８）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１５３４４６）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ３：５’−ＡＧＧＴＣＡＣＧＣＧＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号９）、及び５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１０）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７３５９３）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ４：５’−ＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７８５３７）；
ＳＴ６ＧＡＬ１：５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＡＡＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１４）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００３０３３）；
ＳＴ６ＧＡＬ２：５’−ＴＣＣＴＴＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧ−３’（配列番号１５）、及び５’−ＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１６）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００６９２７）。
内部標準のプライマーとして、ＧＡＰＤＨ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００２０４６）を用いてｍＲＮＡの発現の補正を行った。
リアルタイムＰＣＲのプログラムは、９５℃、１０秒、６０℃、４０秒を４０サイクル繰り返した。それぞれのプライマーセットにより単一のシャープなピークが得られ、特異的なＰＣＲ産物が増幅されており、プライマーダイマーも見られなかった。すべてのサンプルは、３重で試験された。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５から明らかなように、ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４は、正常組織と比較して、前立腺癌由来細胞におけるｍＲＮＡの発現は、顕著に高かった。また、ＦＵＴ２、β４ＧＡＬＮＴ２、及びβ４ＧＡＬＮＴ３は、正常組織では内部標準のＧＡＰＤＨと同じ程度であったが、前立腺癌由来細胞において、発現が高い細胞が見られた。一方、前立腺癌由来細胞におけるＳＴ６ＧＡＬ１のｍＲＮＡのレベルは、正常組織とほとんど差が見られなかった。
【０１０３】
次に、ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡについて、前立腺の正常組織及び癌組織での発現を比較した。ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４の前記のプライマー、並びに前立腺の正常組織２検体及び癌組織２検体を用い、前記のリアルタイムＰＣＲの操作を繰り返した。結果を図７に示す。
ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡの発現は、正常組織と比較すると、癌組織において約７倍から２０倍増加していた。これらの結果は、前立腺癌患者のＰＳＡにおいて、β４ＧＡＬＮＴ４がβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びシアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）の増加に関与していること、並びにＦＵＴ１がフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の増加に関与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明のＰＳＡの分析方法及びＰＳＡの分析キットは、前立腺癌と前立腺肥大症の患者を確実に鑑別することが可能である。従って、健康診断において、前立腺癌を早期に発見することができる。また、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができるため、確定診断のために行う前立腺の生検の対象者を減少させることができ、患者の負担を軽減させることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＡの分析方法及びそれを用いた前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法、並びにＰＳＡの分析キットに関する。本発明によれば、前立腺癌の癌細胞から分泌されるＰＳＡに特異的に発現する糖鎖に結合するレクチンを用いることにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。特には、前立腺癌の癌細胞から分泌されるＰＳＡに特異的に発現する糖鎖に結合するレクチン、及びシアリダーゼを用いることにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。
更に、本発明は、生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法に関する。本発明によれば、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症とを鑑別することができる。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では、男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっている。前立腺癌の発生率は、１９７５年以降増加しているが、その理由の１つは、前立腺特異抗原（Prostate Specific Antigen：以下、ＰＳＡと称する）による診断方法の普及によるものである。このＰＳＡの測定により、従来の直腸指診では困難であった早期の癌が発見されるようになった。
【０００３】
ＰＳＡは、前立腺の腺細胞から前立腺の腺腔内に分泌されるタンパク質であり、前立腺に特異的に発現するタンパク質であるが、前立腺癌に特異的に発現するタンパク質ではない。従って、前立腺癌以外の前立腺肥大症及び前立腺炎などの疾患でも上昇することが知られている。
現在、広く使用されているＰＳＡ測定法は、α１−アンチキモトリプシンと結合した結合型ＰＳＡ（以下、ＰＳＡ−ＡＣＴと称することがある）及び遊離型ＰＳＡ（以下、フリーＰＳＡと称することがある）を測定するトータルＰＳＡの測定法であり、トータルＰＳＡの測定値が１０ｎｇ／ｍＬ以上の場合、５０％以上のヒトに前立腺癌が発見されるが、４〜１０ｎｇ／ｍＬのヒトで２５％、２〜４ｎｇ／ｍＬでも１５％のヒトに前立腺癌の発生が見られる。特に、トータルＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍＬの領域をグレーゾーンと呼んでいるが、前立腺肥大症の患者でも、このグレーゾーンのトータルＰＳＡ値を示す患者が多く、前立腺癌と前立腺肥大症の患者を鑑別することのできるＰＳＡの分析方法の開発が期待されている。
【０００４】
前記のグレーゾーンのトータルＰＳＡ値を示す患者において、前立腺肥大症と前立腺癌を鑑別するために、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合を測定することが行われている。前立腺癌患者では、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合が減少していることが報告されており、遊離型ＰＳＡのみを測定するフリーＰＳＡの測定法によりフリーＰＳＡ値を測定し、トータルＰＳＡ値に対するフリーＰＳＡ値（以下、「フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比」と称することがある）を求めると、この値が２５％以下を示す場合、前立腺癌の可能性が高いといわれている。しかしながら、グレーゾーンの検体において、前記フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が０〜１０％の範囲の場合、前立腺癌の可能性は５６％であるが、１０〜１５％では２８％、１５〜２０％では２０％、２０〜２５％では１６％であり、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比を用いても、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することは容易ではない。
【０００５】
トータルＰＳＡが１０ｎｇ／ｍＬ以上の患者、及びトータルＰＳＡが４〜１０ｎｇ／ｍＬのグレーゾーンで、且つフリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が２５％以下を示す患者の場合、前立腺癌の確定診断のため、前立腺の生検を行う。しかしながら、特に後者においては、前立腺癌が発見される割合は、３０％程度であり、患者に過度の負担を強いており、この点からも、簡便に前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別する方法が開発されることが求められている。
【０００６】
ＰＳＡは１本のアスパラギン結合型糖鎖（以下、Ｎ−グリカン鎖と称することがある）を持つ糖タンパク質であるが、前立腺癌患者のＰＳＡは、高分岐化複合型糖鎖を持つことが知られており、また前立腺癌の患者に特異的な糖鎖を有しているのではないかと考えられていた。例えば、前立腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞から分泌されるＰＳＡのＮ−グリカン鎖を、質量分析機で分析したところ、正常精漿中のＰＳＡと比べてＮ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）及びフコースの含量が多く、シアル酸を欠如していることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このＬＮＣａＰ細胞のＰＳＡは、その糖鎖は、シアル酸を欠如していることなどから、生体内の前立腺癌患者の血清中のＰＳＡの糖鎖と異なっており、特殊なＰＳＡであると考えられた。
【０００７】
また、大山らは前立腺患者血清中のＰＳＡのＮ−グリカン鎖にシアル酸α（２，３）ガラクトース残基（Sialic acid alpha 2,3 Gal-Ｒ）を見出し、前立腺肥大症の患者と比較して、前立腺癌の患者のＰＳＡで、このシアル酸α（２，３）ガラクトース残基が多いことを報告した（特許文献１及び非特許文献２）。そして、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基に特異的に結合するイヌエンジュレクチン（Ｍ．amurensis agglutinin；以下、ＭＡＡと称する）と前立腺癌患者のＰＳＡを結合させ、ＭＡＡと結合したフリーＰＳＡの比率を測定することにより、前立腺癌と前立腺肥大症を鑑別することができることを見出した（特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基は、ＰＳＡ以外にα１−アンチキモトリプシンにも発現しており、従ってＭＡＡは、α１−アンチキモトリプシンにも親和性があるため、α１−アンチキモトリプシンとＰＳＡが結合している場合、すなわち、ＰＳＡ−ＡＣＴではシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡとシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を持たないＰＳＡとを分離することができない。従って、トータルＰＳＡの測定法では、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を鑑別することはできず、フリーＰＳＡを測定する必要があった。
【０００８】
更に、タジリらは、２人の前立腺癌患者の血清中のＰＳＡのＮ−グリカン鎖を、正常の精漿中ＰＳＡのＮ−グリカン鎖と質量分析により比較検討し、前立腺癌の患者のＰＳＡがシアル化及びフコース化されていることを報告している（非特許文献３）。しかしながら、前記シアル酸α（２，３）ガラクトース残基以外に、実際に前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡを鑑別することのできる糖鎖は、報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−５５１０８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００３年（米国）第１３巻、ｐ．４５７〜４７０
【非特許文献２】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００４年（米国）第１４巻、ｐ．６７１〜６７９
【非特許文献３】「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」２００８年（米国）第１８巻、ｐ．２〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、特願２００９−０２３５９７（未公開）において、以下の発明を開示した。
本発明者らは、前記特許文献１に記載のレクチンであるＭＡＡのカラムを用いて健常人のＰＳＡ及び前立腺癌患者のＰＳＡとを分別し、ＭＡＡに親和性のあるＰＳＡの測定を試みた。しかしながら、ＭＡＡカラムを用いてＰＳＡ分別した場合、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有しない正常なＰＳＡの回収率は７０％であり、ＰＳＡが非特異的に結合しているものと考えられた。また、前立腺癌患者のＰＳＡの回収率は４０％であり、ＭＡＡに対する非特異的な結合に加えて、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡが、ＭＡＡから溶出されないことも考えられた。従って、ＭＡＡカラムを用いた場合、シアル酸α（２，３）ガラクトース残基を有するＰＳＡの量を正確に測定できないことがわかった。
レクチンは、現在市販されているものだけでも１００種類以上あるが、本発明者らは、糖結合特異性の異なる複数の植物レクチンを組み合わせて、前立腺癌患者のＰＳＡに発現している糖鎖の同定を進め、前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することについて鋭意研究したところ、キカラスウリレクチン−ＩＩ（Trichosanthes japonica Agglutinin-II；以下、ＴＪＡ−ＩＩと称することがある）又はノダフジレクチン（Wisteria floribunda；以下、ＷＦＡと称することがある）に親和性のあるＰＳＡが、前立腺癌患者の血液中に存在していることを見出し、そして前記ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを用いることにより、前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することができることを見出した。すなわち、前立腺癌患者のＰＳＡの多くが、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及び／又はフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）を有していることを見出した。
本発明者らは、更に前立腺癌患者のＰＳＡに発現している糖鎖の研究を進め、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のシアル酸も切断するシアリダーゼにより、前立腺癌患者ＰＳＡのシアル酸を除去することにより、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡと結合するＰＳＡが増加し、更に、効率よく前立腺癌患者のＰＳＡと前立腺肥大症のＰＳＡとを鑑別することができることを見出した。すなわち、前立腺癌患者のＰＳＡの多くが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を有しており、シアリダーゼによりシアル酸を除去することにより、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）が露出し、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡと効率よく結合することを見出した。
本発明は、このような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本明細書は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階を含む。
本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法にも関する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡ量の判定が、分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定である。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記ＰＳＡ量の測定が、トータルＰＳＡ又はフリーＰＳＡの測定である。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである。
また、本発明によるＰＳＡの分析方法の別の好ましい態様においては、前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである。
更に、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前記試料が、前立腺癌の疑いのある患者から得られた試料である。
更に、本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、前立腺癌の診断用である。
【００１３】
本明細書は、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
更に、本明細書は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法を開示する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ａ）前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
更に、本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法に関する。
本発明によるＰＳＡの分析方法の好ましい態様においては、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階、を含む。
【００１４】
また、本発明は、前記ＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法にも関する。
また、本発明は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む、ＰＳＡの分析キットにも関する。
本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、シアリダーゼを更に含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、抗ＰＳＡ抗体を更に含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである。
更に、本発明によるＰＳＡの分析キットの別の好ましい態様においては、前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである。
【００１５】
本発明は、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含む、ＰＳＡの分析キットに関する。
本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含む。
また、本発明によるＰＳＡの分析キットの好ましい態様においては、シアリダーゼを更に含む。
【００１６】
本発明は、生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法に関する。
本発明による前立腺癌の検出方法の好ましい態様においては、フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの発現量を分析することを特徴とする。
本発明による前立腺癌の検出方法の好ましい態様においては、フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする。
本発明はフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キットに関する。
また、本発明はフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キットに関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＰＳＡの分析方法、及び前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法、並びにＰＳＡの分析キットによれば、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができる。また、本発明に用いることのできるレクチンであるＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡ、並びにＵＥＡ−Ｉと結合したＰＳＡは、ほぼ１００％の回収率で回収することが可能であり、前立腺癌が分泌する前立腺癌由来のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡの量を正確に測定することが可能である。更に、ＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡカラム並びにＵＥＡ−Ｉカラムは再生することが可能であり、再利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】精製したＴＪＡ−ＩＩを電気泳動した写真である。Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１は、還元したＴＪＡ−ＩＩを、レーン２は非還元のＴＪＡ−ＩＩを示している。
【図２】前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者の、ＴＪＡ−ＩＩカラムによる分別前の血清試料のＰＳＡ量（Ａ）とＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量（Ｂ）を示したグラフである。黒丸（●）が前立腺癌患者を、白丸（○）が前立腺肥大症患者を示している。
【図３】前立腺癌患者（ＰＣ：●）及び前立腺肥大症患者（ＢＨＰ：○）のＰＳＡの、ＴＪＡ−ＩＩ結合率を示したグラフである。
【図４】正常フリーＰＳＡ（Ａ）及び前立腺癌患者の血清（Ｂ）をＭＡＡカラムにより分画し、トータルＰＳＡの測定を行った結果を示したグラフである。
【図５】前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者の血清中のＰＳＡのシアリダーゼ処理前（Ａ）及びシアリダーゼ処理した後（Ｂ）の、ＴＪＡ−ＩＩへの結合率を示したグラフである。黒丸（●）が前立腺癌患者を、白丸（○）が前立腺肥大症患者を示している。
【図６】前立腺肥大症患者の血清中ＰＳＡ（ＢＰＨ ｓｅｒｕｍ ＰＳＡ）と、前立腺癌患者の血清中ＰＳＡ（ＰＣ ｓｅｒｕｍ ＰＳＡ）の糖鎖を示した図である。
【図７】前立腺の正常組織及び癌組織におけるＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡ発現を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［１］ＰＳＡの分析方法
本発明のＰＳＡの分析方法は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。より具体的には、本発明のＰＳＡの分析方法の別の態様においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。或いは、本発明のＰＳＡの分析方法の別の態様においては、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする。
【００２０】
本発明に用いることのできるレクチンは、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンを挙げることができる。この場合、非還元末端のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミンが、シアル酸や硫酸基で置換されていないことが必須である。前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンは、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを挙げることができる。
【００２１】
また、本発明に用いることのできるレクチンとしては、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンを挙げることができる。フコースα（１，２）ガラクトース残基は、α−フコースがガラクトースに１，２結合した構造を有する末端糖鎖である。フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性の或るレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＵＥＡ−Ｉ又はＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
更に、本発明に用いることのできるレクチンとしては、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを挙げることができる。前立腺癌患者のＰＳＡ中には、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はフコースα（１，２）ガラクトース残基を単独で発現したＰＳＡが存在する可能性がある。また、前立腺癌患者によっては、そのＰＳＡにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はフコースα（１，２）ガラクトース残基のいずれかが、優位に発現している可能性も高い。従って、本発明のＰＳＡの分析方法においては、非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを用いることが好ましい。前記非還元末端に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
【００２２】
ＴＪＡ−ＩＩは、キカラスウリの塊根から抽出及び精製されるレクチンであり、非還元状態の電気泳動による分子量は６４ｋＤａであるが、Ｓ−Ｓ結合した２量体であり、還元状態の電気泳動による分子量は３２ｋＤａ及び２９ｋＤａを示す。ＴＪＡ−ＩＩは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）に強い親和性を示す。
【００２３】
ＷＦＡは、ノダフジの種子から抽出及び精製されるレクチンであり、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）そのものに強い親和性を示す。また、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ残基、及びＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ残基にも強い親和性を示す。
【００２４】
ＵＥＡ−Ｉ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１）は、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）から調製されるレクチンで、分子量は約２６，７００である。α−Ｌ−Ｆｕｃに糖特異性を持っており、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ→Ｒ）に強い親和性を示す。
【００２５】
本発明のＰＳＡの分析方法において、前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン、フコースα（１，２）ガラクトース残基に親和性のあるレクチン、並びにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンは、１つ又は２つ以上組み合わせても使用することができる。
【００２６】
本発明に用いるレクチンは、市販されているものを用いることもできるが、定法に従って精製することも可能である。植物体（例えば、葉、茎、花、根、又は種子など）を、細切、又は破砕し、緩衝液に溶解させる。遠心分離によって上清を回収し、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を用いて精製することができる。具体的には、ＴＪＡ−ＩＩの精製は、山下らの報告（Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992）に従って精製することが可能である。また、ＷＦＡは、豊島らの報告（Toyoshima et al., Biochemistry, 10, 4457-4463, 1971）に従って、精製することが可能である。また、ＵＥＡ−Ｉは、Hindsgaulらの報告（Hindsgaul et al., Carbohydr. Res., 109, 109-142, 1982）に従って、精製することができる。
【００２７】
本発明に用いることのできるシアリダーゼは、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるものであるならば、特に限定されることはない。前立腺癌患者のＰＳＡにおいては、シアル酸はα（２→６）結合により、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に、結合している。従って、シアル酸のα（２→６）結合を切断することにより、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基が露出し、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）と親和性のあるレクチンと結合することができる。
シアル酸の結合には、α（２→３）結合、α（２→６）結合、及びα（２→８）結合があるが、本発明に用いることのできるシアリダーゼは、α（２→６）結合のみを切断するものでもよく、α（２→６）結合を含むいくつかの結合を切断するものでもよい。例えば、アリスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）由来のシアリダーゼは、α（２→３）結合、α（２→６）結合、及びα（２→８）結合を切断することができ、本発明のＰＳＡの分析方法に用いることができる。
【００２８】
シアリダーゼは、ノイラミニダーゼとも呼ばれ、哺乳動物もシアリダーゼを有しているが、細菌、ウイルス、及び原虫由来のシアリダーゼの研究が進んでいる。シアリダーゼとしては、アリスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどの由来のシアリダーゼが知られているが、これらのうち、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼとして、アリスロバクター・ウレアファシエンス、及びクロストリジウム・パーフリンゲンス由来のシアリダーゼを挙げることができる。
【００２９】
本明細書に記載のＰＳＡの分析方法は、前記レクチンとＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する限り、特に限定されるものではないが、（Ａ）レクチンにより、レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別し、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する分析方法（以下、分析方法（Ａ）と称することがある）、及び（Ｂ）レクチンと、レクチンに親和性のあるＰＳＡとが結合した状態でレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する分析方法（以下、分析方法（Ｂ）と称することがある）を挙げることができる。本発明のＰＳＡ分析方法として、（ｓＡ）前記分析方法（Ａ）において、試料として、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料を用いる分析方法（以下、分析方法（ｓＡ）と称することがある）、及び（ｓＢ）前記分析方法（Ｂ）において、試料として、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料を用いる、分析方法（以下、分析方法（ｓＢ）と称することがある）を挙げることができる。分析方法（ｓＡ）は分析方法（Ａ）に、分析方法（ｓＢ）は分析方法（Ｂ）に、それぞれ含まれるものである。
【００３０】
《分析方法（Ａ）》
前記分析方法（Ａ）は、
（ａ）本発明のレクチンとして例えばβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階（以下、「分別段階（ａ）」と称することがある）、及び
（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階（以下、「判定段階（ｂ）」と称することがある）
を含む。
【００３１】
《分析方法（ｓＡ）》
本発明の分析方法（ｓＡ）は、分析方法（Ａ）に含まれるものであり、前記分析方法（Ａ）における分別段階（ａ）の前に、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階（以下、「シアリダーゼ処理段階（ｓ）」と称することがある）を含むものである。
すなわち、前記分析方法（ｓＡ）は、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階を含む。
【００３２】
前記シアリダーゼ処理段階（ｓ）においては、ＰＳＡを含む可能性のある試料を、希釈せずに、又は適当な緩衝液で希釈し、そしてその試料に、シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼを添加する。これによって、ＰＳＡからシアル酸を除去し、ＰＳＡのβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を露出させることができる。
試料を希釈する緩衝液は、シアリダーゼの活性を維持できるものであれば、限定されないが、例えば、前記レクチンカラムの平衡化に用いる０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液などを利用することができる。
シアリダーゼの使用量は、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができる。例えば、アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアルダーゼを用いる場合、２〜１０００ｍＵ、好ましくは１０〜５００ｍＵ、より好ましくは２０〜１００ｍＵのシアリダーゼを用いることにより、ＰＳＡのシアル酸のα（２→６）結合を切断することができる。
シアリダーゼの処理（反応）時間は、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができるが、１０分〜２４時間であり、好ましくは、１５分〜２時間であり、より好ましくは、３０分〜１時間である。また、反応温度も、特に限定されるものではなく、シアリダーゼの種類によって、適宜決定することができるが、好ましくは２５℃〜４０℃である。
【００３３】
前記シアリダーゼ処理段階（ｓ）において得られたシアリダーゼ処理試料は、そのまま、又は更に希釈して、分別段階（ａ）に用いることができ、それに続いて、前記判定段階（ｂ）を行うことができる。
【００３４】
前記分別段階（ａ）においてレクチンに親和性のあるＰＳＡとレクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する方法は、レクチンとＰＳＡの親和性を利用する方法であれば、特に限定されるものではないが、例えば、担体にレクチンを結合させ、担体に結合したレクチン（以下、「レクチンアフィニティーカラム」と称することがある）にＰＳＡを含む可能性のある試料を接触させ、レクチンに結合したＰＳＡとレクチンに結合しないＰＳＡを分離することによって行うことができる。
【００３５】
担体としては、レクチンを結合させることのできるものであれば、限定されるものではないが、例えば、セファロース、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックスを挙げることができる。担体の形状も特に限定されるものではないが、粒子状のビーズ、プレート、及びゲルなどの形状の担体を用いることができる。例えば、レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとの分別に、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合は、担体はゲルの形状が好ましい。
【００３６】
レクチンアフィニティーカラムは、定法に従って作製することが可能である。例えば、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂを用い、メーカーの推奨するプロトコールに従って、カップリングを行い、レクチンカラムを作製することが可能である。セファロースゲルへのレクチンの結合量は、２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【００３７】
レクチンアフィニティーカラムを用いて、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する方法は、通常のレクチンアフィニティーカラムを用いた糖タンパク質の分離方法に従って行うことができる。
レクチンアフィニティーカラムは、ＰＳＡを含む可能性のある試料をアプライする前に、緩衝液で平衡化させる。平衡化緩衝液としては、例えば、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液を用いることができる。
カラムを平衡化した後に、ＰＳＡを含む可能性のある試料を添加し、一定時間静置し、レクチンとＰＳＡとを接触させる。接触時間は、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＰＳＡの親和性によって、適宜決定することができるが、結合の速度と効率を考慮すると、通常１５分〜３０分で行うことが多い。
レクチンとＰＳＡとを接触させる温度も、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＰＳＡとの親和性によって、適宜決定することができるが、０℃〜４０℃で行うことが可能であり、好ましくは０℃〜３０℃である。０℃未満では、カラムが凍結してしまうことがあり、４０℃を超えるとレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合が起こることがある。例えば、ＴＪＡ−ＩＩとＰＳＡを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃〜１０℃で接触させるのが好ましい。また、ＷＦＡとＰＳＡとを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃〜１０℃で接触させるのが好ましい。
【００３８】
次に、レクチンに親和性のある結合画分（以下、「結合画分」と称することがある）と、レクチンに親和性のない非結合画分（以下、「非結合画分」と称することがある）を分別する。
レクチンへの非結合画分は、洗浄用緩衝液をカラムに添加し、素通り画分を回収することによって得ることができる。洗浄用緩衝液は、レクチンとＰＳＡの結合を解離させずに、非結合成分を流出させることのできる緩衝液であれば、限定されるものではないが、例えば、前記平衡化に用いた緩衝液を使用することができる。洗浄用緩衝液の容量は、レクチンの種類とＰＳＡとの親和性に応じて、適宜決定することができるが、好ましくはカラム容量の３〜７倍であり、より好ましくは５倍程度である。
レクチンへの結合画分は、溶出用緩衝液をカラムに添加し、溶出画分を回収することによって得ることができる。溶出用緩衝液は、ハプテン糖を含んでおり、それによりレクチンに結合したＰＳＡをレクチンから分離させることができる。ハプテン糖はレクチンの特異性によって適宜選択することが可能であるが、ＴＪＡ−ＩＩの場合は、ラクトースなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭラクトース、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。また、ＷＦＡの場合は、ＧａｌＮＡｃなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭＧａｌＮＡｃ、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。溶出用緩衝液の容量は、適宜選択することが可能であるが、好ましくはカラム容量の３〜７倍であり、より好ましくは５倍程度である。溶出の温度も特に限定されるものではないが、０℃〜４０℃、好ましくは２〜２５℃、より好ましくは４〜２０℃で行うことができる。０℃未満では、カラムが凍結してしまうことがあり、４０℃を超えるとレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合が起こることがある。例えば、ＴＪＡ−ＩＩからＰＳＡを溶出させる温度は、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。また、ＷＦＡからＰＳＡを溶出させる温度も、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。
【００３９】
前記判定段階（ｂ）における、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量の判定は、
（１）分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、
（２）分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は
（３）分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定
を挙げることができる。
【００４０】
前記分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定（１）は、前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量を定量的又は半定量的に測定することによって行うことができる。すなわち、患者の血液中に含まれているレクチンに親和性のあるＰＳＡの絶対量を測定することによって、判定を行うものである。
【００４１】
前記分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定（２）は、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）と前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量とを比較することによって行うことができる。具体的には、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）に対する、前記レクチンへの結合画分中のＰＳＡ量の割合を計算することによって、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することが可能であり、例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／結合画分及び非結合画分のＰＳＡの合計量）×１００％
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／分別前の試料中のＰＳＡ量）×１００％
【００４２】
また、分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定（３）は、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）と前記レクチンへの非結合画分中のＰＳＡ量とを比較することによって行うことができる。具体的には、分別前の試料中のＰＳＡ量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＰＳＡ量の合計量）から、前記レクチンへの非結合画分中のＰＳＡ量を減算することによって、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することが可能である。例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
レクチン親和性ＰＳＡ量＝分別前の試料中のＰＳＡ量−非結合画分中のＰＳＡ量
レクチン親和性ＰＳＡ量＝結合画分及び非結合画分のＰＳＡの合計量−非結合画分中のＰＳＡ量
【００４３】
前記（１）及び（２）の判定では、レクチンに結合したＰＳＡをレクチンから分離してその量を測定するが、前記（３）の判定のうち、分別前の試料中のＰＳＡ量と非結合画分中のＰＳＡ量とからの判定では、レクチンに結合したＰＳＡ量を測定しないため、レクチンに結合したＰＳＡを分離せずに判定することもできる。
また、分取した結合画分及び非結合画分のＰＳＡ量は、すべての画分についてＰＳＡ量の測定を行うことが好ましいが、予めＰＳＡが含まれる分取画分を調べておき、その画分について測定を行い、ＰＳＡの分析を行うことも可能である。
【００４４】
前記判定段階（ｂ）において、レクチンに親和性のあるＰＳＡ量を判定するためのＰＳＡの測定方法としては、ＰＳＡを定量的又は半定量的に判定することのできる方法であれば、特に限定されるものではないが、トータルＰＳＡの測定方法又はフリーＰＳＡの測定方法を用いることができる。トータルＰＳＡの測定方法又はフリーＰＳＡの測定方法は、定法に従い、抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）によって測定することができ、ＰＳＡ測定キットとして市販されているものを使用することも可能である。
【００４５】
トータルＰＳＡの測定方法に免疫学的分析方法を用いる場合には、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びフリーＰＳＡの両方のＰＳＡに結合することのできるモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いる。一方、フリーＰＳＡの測定方法に免疫学的分析方法を用いる場合には、フリーＰＳＡのみに結合することのできるモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡを用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Nature 256 : 495-497, 1975）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡを単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００４６】
後述の実施例の解析により、本発明のＰＳＡの分析方法に用いることのできるＴＪＡ−ＩＩ又はＷＦＡを用いたレクチンアフィニティーカラムは、試料中のＰＳＡを約１００％（少なくとも、９７％以上）回収することが可能であることが分かった。これに対して、特許文献１に記載のＭＡＡの場合は、溶出液として乳糖含有リン酸緩衝液を用いた回収率は３０〜７０％であり、溶出液を、０．１Ｍ酢酸液に変更しても、回収率は改善されなかった。
【００４７】
《分析方法（Ｂ）》
前記分析方法（Ｂ）は、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＰＳＡを検出する方法であるが、具体的には、電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットを挙げることができる。どちらのレクチンブロットも、定法に従って行うことができるが、電気泳動によるレクチンブロットの場合、ＰＳＡを含む可能性のある試料を電気泳動し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜にＰＳＡを転写し、サンプルメンブレンとして用いる。ドットブロットによるレクチンブロットの場合、ドットブロッティング装置により、ＰＳＡを含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＰＶＤＦ膜などに吸着させ、サンプルメンブレンとして用いる。サンプルメンブレンは、ブロッキングバッファーでブロッキングを行い、ビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ−ＩＩを含む溶液中で接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンと接触させ、発色液又は発光液を接触させ、得られたシグナルを検出する。
【００４８】
更に、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＰＳＡを検出する方法（Ｂ）としては、イムノブロット及び酵素免疫法を一部変更して行うことができる。具体的には、前記ＰＳＡに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、ニトロセルロース膜など、又はＥＬＩＳＡプレートなどに固相化し、ブロッキングバッファーでブロッキングを行う。ＰＳＡを含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＥＬＩＳＡプレートなどに接触させ、次にビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ−ＩＩを接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンを結合させ、発色液又は発光液によりシグナルを検出することができる。
【００４９】
《分析方法（ｓＢ）》
本発明の分析方法（ｓＢ）は、分析方法（Ｂ）に含まれるものであり、前記電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットの前に、（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階（すなわち、シアリダーゼ処理段階（ｓ））を含むものである。シアリダーゼ処理段階（ｓ）は、前記分析方法（ｓＡ）に記載の段階と同じように行うことができ、得られたシアリダーゼ処理試料は、そのまま、又は更に希釈して、レクチンブロットに用いることができる。
【００５０】
本発明のＰＳＡの分析方法に用いる被検試料としては、ＰＳＡを含む生体試料若しくは生体由来試料か、又はＰＳＡを含む可能性のある生体試料若しくは生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、前立腺の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は前立腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿が好ましい。健常人及び前立腺肥大症患者の血液、血清、又は血漿中には、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及び／又はフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは、ほとんど存在しておらず、前立腺癌患者においては、病期の初期から血液中に放出されるために、前立腺癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００５１】
前記尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液などの液性の試料は、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、それぞれの分析方法に応じて適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液又はその上清を、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
例えば、前記分析方法（Ａ）において、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合、前記液体試料、又は固形の試料の懸濁液若しくはその上清は、適当な緩衝液により希釈して用いることができる。希釈倍率は、レクチンとＰＳＡとの結合が阻害されなければ、特に限定されないが、好ましくは２〜４００倍であり、より好ましくは２〜３００倍であり、最も好ましくは４〜２００倍である。また、レクチンアフィニティーカラムにアプライする試料の容量は、カラムのベッドボリュームの４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下が、最も好ましい。例えば１ｍＬのベッドボリュームのレクチンアフィニティーカラムを用いる場合、４００μＬ以下が好ましく、３００μＬ以下がより好ましく、２００μＬ以下が最も好ましい。
【００５２】
［２］前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法
前記ＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することにより、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することができる。
前記ＰＳＡの分析方法により、レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を測定し、前立腺肥大症又は健常人から採取した血液等中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、前立腺肥大症又は健常人の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＰＳＡと比べて、前記患者の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＰＳＡが有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。
前記分析方法（Ａ）（分析方法（ｓＡ）を含む）においては、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を認識するＴＪＡ−ＩＩへの結合率と、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のみを認識するＷＦＡへの結合率が異なっている。従って、使用するレクチンの測定値によって、前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別することのできるカットオフ値を、それぞれ決定することが好ましい。カットオフ値は、前立腺癌患者の１００％を陽性と判定でき、前立腺肥大症患者の１００％を陰性と判定できる値が最も好ましい。もし、分析した前立腺癌と前立腺肥大症の母集団が増加することによって、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間の測定値が、オーバーラップした場合は、前立腺癌患者が１００％陽性と判断される値をカットオフ値として選択することが好ましいが、オーバーラップした範囲の任意の値をカットオフ値とすることも可能である。具体的には、後述の実施例のＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量を測定した場合、前立腺癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌患者のＰＳＡを検出することのできる値であれば、限定されないが、例えば２００ｐｇ／ｍＬを超え、２４０ｐｇ／ｍＬ未満に設定することが可能であり、好ましくは、２２０ｐｇ／ｍＬである。
また、後述の実施例のレクチンへのＰＳＡの結合率は、下記の式で得ることのできる百分率から決定することができる。
ＰＳＡの結合率＝（結合画分中のＰＳＡ量／分別前の試料中のＰＳＡ量）×１００％
ＰＳＡの結合率のカットオフ値も、前立腺癌患者の１００％を陽性と判定でき、前立腺肥大症患者の１００％を陰性と判定できる値が最も好ましい。もし、分析した前立腺癌と前立腺肥大症の母集団の増加によって、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間で、レクチンへのＰＳＡの結合率が、オーバーラップする場合は、前立腺癌患者が１００％陽性と判断される値が好ましいが、オーバーラップした範囲の任意の値をカットオフ値とすることも可能である。具体的には、後述の実施例のＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率のカットオフ値は前立腺癌を検出することのできる値であれば、限定されないが、例えば１．８％を超え、３％未満に設定することが可能であり、好ましくは２．４％である。
【００５３】
［３］前立腺癌の診断キット
本発明の診断キットは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む。また、本発明の診断キットは、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性のあるレクチンを含むこともできる。更に、本発明の診断キットは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンを含むこともできる。本発明の診断キットに含まれるレクチンは、上記担体に結合させた状態のものも含まれる。
【００５４】
本発明の診断キットは、前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン、フコースα（１，２）ガラクトース残基に親和性のあるレクチン、並びにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンは、１つ又は２つ以上組み合わせて含むことができる。
【００５５】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＴＪＡ−ＩＩ及びＷＦＡを挙げることができる。また、フコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性のあるレクチンとしては、特に限定されるものではないが、ＵＥＡ−１及びＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。更に、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンとしては、ＴＪＡ−ＩＩを挙げることができる。
【００５６】
本発明の診断キットは、シアリダーゼを含むこともできる。シアル酸のα（２→６）結合を切断することができるシアリダーゼであれば、特に限定されるものではないが、アリスロバクター・ウレアファシエンス、及びクロストリジウム・パーフリンゲンス由来のシアリダーゼを挙げることができる。
【００５７】
本発明の診断キットは、更に抗ＰＳＡ抗体（例えば、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡに特異的に結合する抗体）又はその断片を含むことができる。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＰＳＡ−ＡＣＴ又はフリーＰＳＡへの特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
【００５８】
前記レクチン及び抗ＰＳＡ抗体を含む、本発明の診断キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態で前記抗ＰＳＡ抗体、又はその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
【００５９】
《作用》
グレーゾーンのＰＳＡ値（トータルＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍＬ）を示す患者においては、前記のように血清試料のフリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比（Ｆ／Ｔ値）の測定が行われている。表１に示すように、前立腺肥大症患者９例中７例において、Ｆ／Ｔ値が２５％以下を示しており、これらの患者は、確定診断のための生検の対象となるが、実際には前立腺肥大症であり、患者にとって過度の負担となっている。
本発明に用いることのできるＴＪＡ−ＩＩは糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するレクチンである。ＷＦＡは糖鎖の非還元末端に存在するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するレクチンである。また、ＵＥＡ−Ｉは糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基を認識するレクチンである。本明細書によって、前立腺癌患者の体内にＴＪＡ−ＩＩ、ＷＦＡ又はＵＥＡ−Ｉと結合するＰＳＡが存在することが示され、すなわち、図６に示すように、癌化に伴ってＰＳＡ糖鎖に、これらの糖鎖構造が出現することが、初めて示されたものである。
更に、後述の実施例３に示すように、前立腺癌患者の血清ＰＳＡを、シアル酸α（２，６）結合を切断することのできるシアリダーゼで処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩと結合することのできるＰＳＡの量が増加することを見出した。このことは、シアリダーゼ処理により、シアル酸α（２，６）結合が切断され、シアル酸が結合していたβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基が露出することを示している。すなわち、図６に示すように、前立腺癌の患者の血清中に含まれるＰＳＡが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を、有していることを初めて見出したものである。
前記のように前立腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞のＰＳＡは、非還元末端側にＨｅｘＮＡｃβ１−ＨｅｘＮＡｃ残基を持つことが報告されている（非特許文献１）。ＨｅｘＮＡｃには、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃβ）及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃβ）が含まれるが、質量分析では分子量が同一となり、区別することができない。また、非特許文献１に記載のＬＮＣａＰ細胞から分泌されるＰＳＡは、その糖鎖は、シアル酸を欠如していることなどから、前立腺癌患者の生体のＰＳＡを反映していないと考えられていた。従って、本明細書において、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＷＦＡカラム及びＵＥＡ−Ｉカラムを用いることによって、前立腺癌患者の血清ＰＳＡにおける非還元末端β−Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を初めて同定できたものである。
癌化に伴うＰＳＡ糖鎖構造の変化、すなわちフコースα（１，２）ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の出現は、前立腺癌の発症によって、糖鎖の合成に関わる糖転移酵素活性量の変化が背景にあるものと考えられる。
【００６０】
また、特許文献１及び非特許文献２に記載のように、前立腺癌における糖鎖の構造変化をＮｅｕＡｃβ２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを特異的に認識するＭＡＡで検出しようとする場合に、一定の割合の血中ＰＳＡは、血清α１−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡ−ＡＣＴの状態で存在している。ＭＡＡはα１−アンチキモトリプシンとも結合するため、ＰＳＡの糖鎖構造が異なっていても、α１−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡは分別することができない。従って、ＭＡＡでＰＳＡを分別した場合は、フリーＰＳＡを測定する必要がある。
一方、本発明で用いることのできるＴＪＡ−ＩＩはＰＳＡ糖鎖の非還元末端に存在するフコースα（１，２）ガラクトース残基又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識し、ＷＦＡはＰＳＡ糖鎖の非還元末端に存在するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を認識するが、これらの糖鎖構造は血清α１−アンチキモトリプシン上には存在しないため、トータルＰＳＡ測定キットを用いて定量することが可能である。一般的にフリーＰＳＡ量はトータルＰＳＡ量の２０％以下であり、本発明の分析方法においてはトータルＰＳＡ測定キットを用いることできるため、非特許文献２及び特許文献１に記載の発明と比較して感度の上で有利である。
【００６１】
［４］糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出方法
後述の実施例５に示すように、前立腺癌患者のＰＳＡにおけるフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の増加には、フコース転移酵素、すなわちフコース転移酵素１（以下、ＦＵＴ１と称することがある）の前立腺癌における発現の増加が強く関与している。また、前立腺癌患者のＰＳＡにおけるβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、及びシアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）の増加は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、すなわちβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４（以下、β４ＧＡＬＮＴ４と称することがある）の前立腺癌における発現の増加によるものであると考えられる。従って、前立腺癌患者由来の試料のＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４から選択される少なくとも１つの糖転移酵素を分析することによって、前立腺癌患者と、正常人又は前立腺肥大症患者とを鑑別することが可能である。以下に、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を、それぞれフコース転移酵素又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の例として、本発明の前立腺癌の検出法について説明する。
【００６２】
本発明の検出方法において、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を分析する方法としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法等）、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４に対する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、又は生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）などを挙げることができる。
【００６３】
《分子生物学的分析方法》
ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分子生物学的分析方法としては、試料中の遺伝子、例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなどと、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用い、ハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができるが、特にはリアルタイムＰＣＲ法が正確で且つ簡便であり、好ましい。
【００６４】
リアルタイムＰＣＲ法としては、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びに前記プライマーセットと、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等を挙げることができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００６５】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＦＵＴ１のフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号１で表されるＦＵＴ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００１４８）から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−ＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号３）を、リバースプライマーとして５’−ＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４）を挙げることができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４のフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号２で表されるβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７８５３７）から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−ＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）を、リバースプライマーとして５’−ＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）を挙げることができる。
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒである。
【００６６】
前記ＰＣＲ法、特にはリアルタイムＰＣＲ法は、
（１）生体由来の試料からｍＲＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、
（３）プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを用いてＤＮＡを増幅する工程、及び
（４）増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を含むことができる。
【００６７】
前立腺癌が疑われる患者の生体由来の試料中におけるＦＵＴ１のｍＲＮＡの発現量を、測定し、健常者生体由来試料中のＦＵＴ１の発現量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＦＵＴ１の発現量と比べて、前記患者のＦＵＴ１の発現量が有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４についても、同様に健常者と比較することにより、前立腺癌の判定が可能である。
例えば、後述の実施例におけるリアルタイムＰＣＲの場合、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００６８】
《免疫学的分析方法》
ＦＵＴ１の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＦＵＴ１に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、β４ＧＡＬＮＴ４の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β４ＧＡＬＮＴ４に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。
【００６９】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００７０】
免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、特にはサンドイッチ法を用いる場合には、以下のように行うことが可能である。例として、β４ＧＡＬＮＴ４に対する抗体を用いる場合について説明する。
まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、β４ＧＡＬＮＴ４に結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、β４ＧＡＬＮＴ４が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とβ４ＧＡＬＮＴ４を接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたβ４ＧＡＬＮＴ４と結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−β４ＧＡＬＮＴ４−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、２次抗体を直接標識せずに、２次抗体に結合する抗体を標識しシグナルを検出することも可能である。
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。
【００７１】
更に被検試料として前立腺の生検試料を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色法により、前立腺でのＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の発現を確認することにより、前立腺癌であるか否かを判定することができる。
【００７２】
また、被検試料として血液等を用いる場合、前立腺癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量を測定し、健常者から採取した血液等中のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量と比較することにより、前記患者が前立腺癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量と比べて、前記患者のＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量が有意に多い場合に前記患者は前立腺癌であると判定することができる。
例えば、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。前立腺癌患者の検出のためのカットオフ値は、前立腺癌患者を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００７３】
《生化学的分析方法》
ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、Ｌａｒｓｅｎら〔Larsen RD, Ernst LK, Nair RP, Lowe JB. Proc. Natl Acad Sci USA, 87, 6674-6678 (1990)〕又はＧｏｔｏｈら〔Gotoh M, Sato T, Kiyohara K, Kameyama A, Kikuchi N, Kwon YD, Ishizuka Y, Iwai T, Nakanishi H, Narimatsu H. FEBS Lett., 562, 134-140 (2004)〕の方法に従って、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４酵素活性を測定することにより、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の量又は存在の有無を分析することが可能である。
【００７４】
本発明の糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出方法において、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４の分析に用いる被検試料としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４を含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液等の体液試料、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、前立腺の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は前立腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）が好ましい。健常者又は前立腺肥大症患者の組織、血液、血清、又は血漿中には、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４は、ほとんど存在しておらず、前立腺癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００７５】
［５］糖転移酵素の分析による前立腺癌の検出キット
本発明の分子生物学的分析による前立腺癌の検出用キットは、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを含むことができる。本発明の検出用キットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムＰＣＲ法を行うのに必要な試薬及び／又は酵素を更に含むこともできる。更に、本発明のキットは、前立腺癌の検出又は測定用、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【００７６】
本発明の免疫学的分析による前立腺癌の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４に特異的に結合する抗体、またはその断片を含むことができる。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＦＵＴ１又はβ４ＧＡＬＮＴ４への特異的結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
更に、本発明のキットは、前立腺癌の検出又は測定用、前立腺癌と健常人又は前立腺肥大症との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００７８】
《ＴＪＡ−ＩＩ精製例》
キカラスウリ（Trichosanthes japonica）の根塊２０ｇより、既報（Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992）に従って、ＴＪＡ−ＩＩを精製した。具体的には、キカラスウリの塊根を細かく細断し、ワーリングブレンダーを用いて、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１６ｍＬでホモジェナイズした。１０００ｘｇで３０分遠心し、得られた上清の３５〜５５％飽和の硫安分画沈殿物を水に溶解し、蒸留水で透析した。凍結乾燥後、４３５ｍｇの３５〜５５％飽和の硫安沈殿物を６ｍＬのＰＢＳに溶解し、ＰＢＳで平衡化したporcine stomach mucinセファロース４Ｂ（１０ｍｇ／ｍＬゲル）カラム１０ｍＬにアプライした。カラムを洗浄した後、０．１Ｍラクトースを含むＰＢＳで溶出し、ＴＪＡ−ＩＩを得た。
【００７９】
《カラム作製例》
精製したＴＪＡ−ＩＩを用いて、セファロースカラムにカップリングさせ、ＴＪＡ−ＩＩカラム及びＷＦＡカラムを作製した。具体的には、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、ゲル容積１ｍＬあたり３ｍｇの密度でＴＪＡ−ＩＩ結合させ、ＴＪＡ−ＩＩカラムを作製した。
また、ＷＦＡ（ＥＹラボラトリー社製）及びＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、同様にＷＦＡカラムを作製した。
【００８０】
《実施例１：ＴＪＡ−ＩＩを用いたＰＳＡの分析》
本実施例では、前記カラム作製例において作製したＴＪＡ−ＩＩカラムを用いて、前立腺癌と診断された１５人の患者及び前立腺肥大症と診断されたトータルＰＳＡが４．０ｎｇ／ｍＬ以上の９人の患者について、本発明のＰＳＡの分析方法によりＰＳＡの量を測定した。
４℃の条件下で、ＴＪＡ−ＩＩカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１μＬ〜５０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＴＪＡ−ＩＩ非結合画分を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分を得た。ＴＪＡ−ＩＩカラムによる分別前の血清試料、ＴＪＡ−ＩＩ非結合画分、及びＴＪＡ−ＩＩ結合画分について、トータルＰＳＡ量を、アクセスハイブリテックトータルＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。ＴＪＡ−ＩＩカラムからのＰＳＡ回収率は常に９７％〜１００％であった。表１に分別前の血清試料のＰＳＡ量、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分のＰＳＡ量、及びＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率を示す。なお、ＴＪＡ−ＩＩ結合率は次の式により計算した。
ＴＪＡ−ＩＩ結合率＝（ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量／ＴＪＡ−ＩＩ非結合画分及びＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量）×１００％
また、分別前の血清試料のフリーＰＳＡを、アクセスハイブリテックフリーＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。前記トータルＰＳＡの量及びフリーＰＳＡの量から、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比を計算した。結果を表１、図２及び図３に示す。なお、癌患者の、年齢、病期（ステージ）、グリソンスコアは表２に示した。病期（ステージ）は、前立腺癌の進展度を示したものである。また、グリソンスコアは、前立腺癌の悪性度を、病理学上の分類によって５段階に分けたものである。「１」が最もおとなしい癌で、「５」が最も悪い癌を意味するが、前立腺癌の多くは、複数の、悪性度の異なる成分を有しているため、最も多い成分と次に多い成分を足し算してスコア化したものが、グリソンスコアである。例えば、最も多い成分が「３」で次に多い成分が「４」の場合、グリソンスコアは「３」＋「４」＝「７」となる。グリソンスコアが「６」以下は悪性度の低いもの、「７」は中程度の悪性度、「８」〜「１０」は悪性度の高い癌と考えられている。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
図２及び図３に示すように、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量、及びＴＪＡ−ＩＩ結合率は、いずれも前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間で重複することなく、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を鑑別することができることを示している。暫定的に、ＴＪＡ−ＩＩ結合画分中のＰＳＡ量のカットオフ値を２５０ｐｇ／ｍＬ、ＴＪＡ−ＩＩ結合率のカットオフ値を２％とすると、１００％の精度で前立腺肥大症患者と前立腺癌患者を区別することが可能である。異なる臨床ステージ、グリソンスコアにおいても、ＴＪＡ−ＩＩ結合率とＴＪＡ−ＩＩ結合ＰＳＡ量には有意な差が認められなかった。
【００８４】
《実施例２》
本実施例では、前記カラム製造例で製造したＷＦＡカラムを用いて、前立腺癌と診断された３人の患者について、本発明のＰＳＡの分析方法によりＰＳＡの量を測定した。
具体的には、ＴＪＡ−ＩＩカラムと溶出液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）に代えて、ＷＦＡカラムと溶出緩衝液（１０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を用いたことを除いては、前記実施例１の操作を繰り返し、前立腺癌患者の３人の血清試料を分析し、ＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量及びＷＦＡ結合率を得た。ＷＦＡ結合率の結果を表３に示す。
なお、ＷＦＡ結合率は次の式により計算した。
ＷＦＡ結合率＝（ＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量／ＷＦＡ非結合画分及びＷＦＡ結合画分中のＰＳＡ量）×１００％
また、比較のためにＴＪＡ−ＩＩ結合率を表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】
ＷＦＡカラムからのＰＳＡ回収率は、９０％〜９８％であった。また、ＷＦＡの結合率は、ＴＪＡ−ＩＩ結合率とほぼ相関しており、ＷＦＡはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡと結合して、前立腺癌患者のＰＳＡを分別することが可能である。
但し、ＷＦＡ結合率は、ＴＪＡ−ＩＩ結合率よりやや低く、８４．０％〜９３．８％である。このことは、前立腺癌患者の血液中には、ＴＪＡ−ＩＩのみに親和性のあるＰＳＡが存在する可能性を示している。すなわち、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）を有さず、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）のみを有しているＰＳＡが存在する可能性を示唆している。
【００８７】
《実施例３》
本実施例では、前立腺癌の患者の血清をシアリダーゼ処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩカラムと結合するＰＳＡが、増加することを確認した。
まず、前立腺癌と診断された患者の血清及び前立腺肥大症と診断された患者の血清を、それぞれ２０検体を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、それぞれのＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率を調べた。結果を図５Ａに示す。前立腺癌では、約２％以上のＴＪＡ−ＩＩ結合率を示し、前立腺肥大症では、約２％未満のＴＪＡ−ＩＩ結合率を示した。
次に、前立腺癌と診断された患者の血清及び前立腺肥大症と診断された患者の血清をそれぞれ５検体用いて、シアリダーゼ処理を行った。具体的には、血清試料１μＬ〜５０μＬを、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとした。得られた希釈試料に、アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼを５０ｍＵ添加し、３７℃で１時間反応させた。得られたシアリダーゼ処理試料を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図５Ｂに示す。
図５の矢印は、前立腺癌と診断された患者の５つの血清において、シアリダーゼ処理によって、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率が上昇したことを示している。一方、前立腺肥大症と診断された患者の血清では、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率の上昇は見られなかった。
【００８８】
更に、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアル酸α（２，３）特異的シアリダーゼを用いて、同様の操作を繰り返した。しかしながら、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアリダーゼでは、前立腺癌と診断された患者の血清においても、ＰＳＡのＴＪＡ−ＩＩ結合率は上昇しなかった。
これらの結果は、以下のことを示している。アリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼは、主としてシアル酸α（２，６）及びシアル酸α（２，３）結合を切断する。一方、サルモネラ・チフィムリウム由来のシアリダーゼは、シアル酸α（２，３）結合を切断する。すなわち、前立腺癌患者の血清中のＰＳＡのシアル酸は、シアル酸α（２，３）結合でなく、シアル酸α（２，６）結合により、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に結合しているものと考えられる（図６）。
【００８９】
《実施例４》
本実施例では、前立腺肥大症の患者血清中のＰＳＡ、前立腺癌の患者血清中のＰＳＡ、及び精漿中のＰＳＡについて、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＵＥＡ−Ｉカラム、又はＷＦＡカラムへのそれぞれのＰＳＡの結合率を調べた。ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率については、シアリダーゼ処理を行った検体と、シアリダーゼ処理を行わない検体について、結合率を調べた。
ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率の測定は、実施例１に記載の方法に従った。ＷＦＡカラムへの結合率の測定は、実施例２に記載の操作に従った。シアリダーゼ処理を行った検体のＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率の測定は、実施例３に記載の操作に従った。
また、ＵＥＡ−Ｉカラムへの結合率の測定は、以下のように行った。ハリエニシダアグルチニンーＩ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１：ＵＥＡ−Ｉ）の結合したアガロース（ＵＥＡ−Ｉアガロース：Ｊオイルミルズ）を用いて、ＵＥＡ−Ｉに結合するＰＳＡの量を測定した。具体的には、ＴＪＡ−ＩＩカラムと溶出液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）に代えて、ＵＥＡ−Ｉアガロースと溶出緩衝液（５０ｍＭ ｆｕｃｏｓｅ、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を用いたことを除いては、前記実施例１の操作を繰り返し、ＵＥＡ−Ｉ結合率を測定した。結果を表４に示す。
【００９０】
【表４】
【００９１】
前立腺肥大症の患者血清中のＰＳＡは、ＴＪＡ−ＩＩカラム、ＵＥＡ−Ｉカラム、又はＷＦＡカラムにほとんど結合しない。一方、前立腺癌患者血清中のＰＳＡは、ＴＪＡ−ＩＩカラムに１６％のＰＳＡが結合し、ＵＥＡ−Ｉカラムに５％のＰＳＡが結合し、ＷＦＡカラムに１１％のＰＳＡが結合する。これらのデータは、前立腺癌患者血清中のＰＳＡは、非還元末端β−Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びフコースα（１，２）ガラクトース残基を有していることを示している。
更に、前立腺癌患者血清中のＰＳＡをアリスロバクター・ウレアファシエンス由来のシアリダーゼで処理することにより、ＴＪＡ−ＩＩカラムへの結合率が、１１％から５９％に上昇した。このデータは、前立腺癌患者血清中のＰＳＡが、シアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有していることを示している。
【００９２】
《比較例１》
本比較例では、特許文献１に記載のレクチンであるＭＡＡを用いて、前立腺癌患者のＰＳＡの分別及び測定を行った。
ＭＡＡの精製は、既報（Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., 249, 2786-2792, 1974）の方法に従った。具体的には、イヌエンジュマメ（Maackia amurensis）の種子５０ｇを数百ｍＬのＰＢＳでホモジナイザーにより細かくなるまでホモジナイズし、更に一晩攪拌後、９０００ｒｐｍ３０分遠心分離にて沈殿物を除いた。この抽出液（２１０ｍＬ）の５０〜８０％の硫安分画画分をＰＢＳに透析し、遠心操作で沈殿を除いた後、一部（３０ｍＬ）をチログロブリンセファロース（１９ｍｇ／ｍＬ、１５ｍＬ）に添加し、ＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍラクトース、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１５Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出する。レクチン活性の高い部分をプールし濃縮後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に透析にて置換する。遠心操作で沈殿を除去後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファデックスＣ−５０（１００ｍＬ）に添加し、非吸着画分を集め濃縮し、精製ＭＡＡを得た。
【００９３】
精製したＭＡＡを用いて、セファロースカラムを作製した。ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、ゲル容積１ｍＬあたり３ｍｇの密度でＭＡＡを結合させ、ＭＡＡカラムを作製した。
【００９４】
まず、ＭＡＡカラムのシアル酸α（２，３）ガラクトース残基との結合特性を確認するため、シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖を用いて結合を確認した。４℃の条件下で、ＭＡＡカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で平衡化した。シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有する複合型３本鎖オリゴ糖を含む試料をカラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＭＡＡ非結合分画を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（４００ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＭＡＡ結合画分を得た。前記シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖は、カラムに結合せず、９５％以上がＭＡＡ非結合分画に回収された。
【００９５】
次に、このＭＡＡカラムを用いて、前立腺癌患者のＰＳＡのＭＡＡカラムへの結合を調べた。４℃の条件下で、ＭＡＡカラム（１ｍＬ容量）を０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画して５つのＭＡＡ非結合分画を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（４００ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、５つのＭＡＡ結合画分を得た。それぞれの画分について、トータルＰＳＡ量を、アクセスハイブリテックトータルＰＳＡ（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。対照として、精製した正常フリーＰＳＡ５ｎｇを用いて、同じ操作を繰り返し、トータルＰＳＡ量を測定した。前立腺癌患者のＰＳＡの結果を図４（Ｂ）に、正常フリーＰＳＡの結果を図４（Ａ）に示す。
【００９６】
正常フリーＰＳＡは、ほとんどが２番目のＭＡＡ非結合分画に検出された。しかしながら、すべての画分のＰＳＡの量を合計した正常フリーＰＳＡ量は、ＭＡＡカラムにアプライした、５ｎｇの正常フリーＰＳＡに対して、３．５ｎｇであり、回収率は７０％であり、３０％がカラムに結合したままであると考えられた。
一方、前立腺癌患者のＰＳＡは、２番目のＭＡＡ非結合分画に検出される未吸着のＰＳＡ、３番目のＭＡＡ非結合分画の肩の部分に検出されるわずかに吸着するＰＳＡ、及び４００ｍＭラクトースで溶出される吸着ＰＳＡに分かれた。すべての画分のＰＳＡ量を合計すると４ｎｇ／ｍＬであり、分別前の血清試料のＰＳＡ量である１０ｎｇ／ｍＬに対して、４０％程度しか回収されなかった。この回収率は、溶出溶液として、０．１Ｍ酢酸溶液を用いても改善されなかった。更に、用いた前立腺癌患者のＰＳＡは、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が３．６であり、９６．４％のＰＳＡがα−アンチキモトリプシンと結合したＰＳＡ−ＡＣＴの状態で存在している。α−アンチキモトリプシンは、１分子あたりシアル酸α（２，３）ガラクトース残基を１残基有しているため、ＰＳＡ−ＡＣＴは、ＭＡＡカラムと結合するはずであるが、多くのＰＳＡが２番目のＭＡＡ非結合分画に検出される未吸着のＰＳＡ、及び３番目のＭＡＡ非結合分画の肩の部分に検出されるわずかに吸着するＰＳＡとして検出された。
【００９７】
すなわち、シアル酸α（２，３）ガラクトースを３残基有するオリゴ糖が、ＭＡＡカラムに結合しないこと、及びＰＳＡ−ＡＣＴのうち結合しないものが存在することは、ＭＡＡレクチンカラムに対するＰＳＡの結合が弱いことを示している。しかしながら、ＰＳＡのＭＡＡへの結合が弱いにもかかわらず、ＰＳＡの回収率は悪く、ハプテン糖による溶出が困難であり、ＭＡＡで再現性よく正確に測定することは、困難であると考えられた。
【００９８】
《実施例５》
本実施例では、前立腺癌患者のＰＳＡにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を付加するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース残基を付加するフコース転移酵素及びシアル酸を付加するシアル酸転移酵素を特定し、それらの転移酵素の前立腺癌組織における発現を確認した。
【００９９】
まず、ヒト前立腺癌由来細胞及び正常ヒト前立腺組織における、フコース転移酵素１（ＦＵＴ１）、及びフコース転移酵素２（ＦＵＴ２）、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（β４ＧＡＬＮＴ２）、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素３（β４ＧＡＬＮＴ３）及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４（β４ＧＡＬＮＴ４）、並びにシアル酸転移酵素１（以下、ＳＴ６ＧＡＬ１と称する）及びシアル酸転移酵素２（以下、ＳＴ６ＧＡＬ２と称する）のｍＲＮＡの発現を、リアルタイムポリメレース重合反応（以下、リアルタイムＰＣＲと称する）法によって調べた。ヒト前立腺癌由来細胞として、ＤＵ１４５（ＲＣＢ２１４３；理研バイオリソースセンターから提供）及びＰＣ−３（ＪＣＲＢ９１１０；ヘルスサイエンスリサーチリソースバンクより提供）を用いた。ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて保存した、正常前立腺組織、並びに前記ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてトータルＲＮＡを調整し、クロロホルム・イソプロピルアルコール抽出を行った。抽出したＲＮＡは、エタノール沈殿の後、ジエチルカーボネート処理した蒸留水に溶解した。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（インビトロジェン社）を用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ライフテクノロジー社）、及びそれぞれの糖転移酵素の遺伝子特異的なプライマーを用いて、Ｄｉｃｅ（登録商標） ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＴＰ８００，タカラ）により行った。
【０１００】
用いたそれぞれの糖転移酵素のプライマーは、以下のとおりである。
ＦＵＴ１：５’−ＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号３）、及び５’−ＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００１４８）；
ＦＵＴ２：５’−ＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号５）、及び５’−ＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣ−３’（配列番号６）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０００５１１）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ２：５’−ＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴ−３（配列番号７）’、及び５’−ＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＣＧＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号８）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１５３４４６）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ３：５’−ＡＧＧＴＣＡＣＧＣＧＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号９）、及び５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１０）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７３５９３）；
Ｂ４ＧＡＬＮＴ４：５’−ＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１２）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿１７８５３７）；
ＳＴ６ＧＡＬ１：５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＡＡＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１４）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００３０３３）；
ＳＴ６ＧＡＬ２：５’−ＴＣＣＴＴＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧ−３’（配列番号１５）、及び５’−ＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１６）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００６９２７）。
内部標準のプライマーとして、ＧＡＰＤＨ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００２０４６）を用いてｍＲＮＡの発現の補正を行った。
リアルタイムＰＣＲのプログラムは、９５℃、１０秒、６０℃、４０秒を４０サイクル繰り返した。それぞれのプライマーセットにより単一のシャープなピークが得られ、特異的なＰＣＲ産物が増幅されており、プライマーダイマーも見られなかった。すべてのサンプルは、３重で試験された。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５から明らかなように、ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４は、正常組織と比較して、前立腺癌由来細胞におけるｍＲＮＡの発現は、顕著に高かった。また、ＦＵＴ２、β４ＧＡＬＮＴ２、及びβ４ＧＡＬＮＴ３は、正常組織では内部標準のＧＡＰＤＨと同じ程度であったが、前立腺癌由来細胞において、発現が高い細胞が見られた。一方、前立腺癌由来細胞におけるＳＴ６ＧＡＬ１のｍＲＮＡのレベルは、正常組織とほとんど差が見られなかった。
【０１０３】
次に、ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡについて、前立腺の正常組織及び癌組織での発現を比較した。ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４の前記のプライマー、並びに前立腺の正常組織２検体及び癌組織２検体を用い、前記のリアルタイムＰＣＲの操作を繰り返した。結果を図７に示す。
ＦＵＴ１及びβ４ＧＡＬＮＴ４のｍＲＮＡの発現は、正常組織と比較すると、癌組織において約７倍から２０倍増加していた。これらの結果は、前立腺癌患者のＰＳＡにおいて、β４ＧＡＬＮＴ４がβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）及びシアル酸α（２，６）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）の増加に関与していること、並びにＦＵＴ１がフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の増加に関与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明のＰＳＡの分析方法及びＰＳＡの分析キットは、前立腺癌と前立腺肥大症の患者を確実に鑑別することが可能である。従って、健康診断において、前立腺癌を早期に発見することができる。また、前立腺癌と前立腺肥大症とを確実に鑑別することができるため、確定診断のために行う前立腺の生検の対象者を減少させることができ、患者の負担を軽減させることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法。
【請求項２】
（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、
（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び
（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階
を含む、請求項１に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項３】
前記レクチンに親和性のあるＰＳＡ量の判定が、
分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、
分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は
分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定
である請求項２に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項４】
前記ＰＳＡ量の測定が、トータルＰＳＡ又はフリーＰＳＡの測定である、請求項３に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項５】
前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項６】
前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項７】
前記試料が、前立腺癌の疑いのある患者から得られた試料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項８】
前立腺癌の診断用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項９】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法。
【請求項１０】
（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、
（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び
（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階
を含む、請求項９に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法。
【請求項１２】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む、ＰＳＡの分析キット。
【請求項１３】
シアリダーゼを更に含む、請求項１２に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１４】
抗ＰＳＡ抗体を更に含む、請求項１２又は１３に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１５】
前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１６】
前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１７】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、シアリダーゼとを含む、ＰＳＡの分析キット。
【請求項１８】
生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法。
【請求項１９】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの発現量を分析する、請求項１８に記載の前立腺癌の検出方法。
【請求項２０】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項１８に記載の前立腺癌の検出方法。
【請求項２１】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キット。
【請求項２２】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キット。
【請求項１】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと、
ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法。
【請求項２】
（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、
（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンと前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び
（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階
を含む、請求項１に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項３】
前記レクチンに親和性のあるＰＳＡ量の判定が、
分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、
分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＰＳＡ量の測定による判定、又は
分別前の試料中のＰＳＡ量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＰＳＡ量の測定による判定
である請求項２に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項４】
前記ＰＳＡ量の測定が、トータルＰＳＡ又はフリーＰＳＡの測定である、請求項３に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項５】
前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項６】
前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項７】
前記試料が、前立腺癌の疑いのある患者から得られた試料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項８】
前立腺癌の診断用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項９】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加することによって得られたシアリダーゼ処理試料とを接触させ、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定することを特徴とする、ＰＳＡの分析方法。
【請求項１０】
（ｓ）ＰＳＡを含む可能性のある試料にシアリダーゼを添加し、シアリダーゼ処理試料を得る段階、
（ａ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、前記シアリダーゼ処理試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＰＳＡと前記レクチンに親和性のないＰＳＡとを分別する段階、及び
（ｂ）前記レクチンに親和性のあるＰＳＡの量を判定する段階
を含む、請求項９に記載のＰＳＡの分析方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＰＳＡの量を分析することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法。
【請求項１２】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチンを含む、ＰＳＡの分析キット。
【請求項１３】
シアリダーゼを更に含む、請求項１２に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１４】
抗ＰＳＡ抗体を更に含む、請求項１２又は１３に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１５】
前記レクチンが、キカラスウリレクチン−ＩＩ又はノダフジレクチンである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１６】
前記レクチンが、更にフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のＰＳＡの分析キット。
【請求項１７】
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に親和性のあるレクチン及びフコースα（１，２）ガラクトース残基と親和性を有するレクチンと、シアリダーゼとを含む、ＰＳＡの分析キット。
【請求項１８】
生体由来の試料中のフコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４の発現を分析することを特徴とする、前立腺癌の検出方法。
【請求項１９】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの発現量を分析する、請求項１８に記載の前立腺癌の検出方法。
【請求項２０】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項１８に記載の前立腺癌の検出方法。
【請求項２１】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キット。
【請求項２２】
フコース転移酵素１又はβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、前立腺癌の検出用キット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５０９５６５（Ｐ２０１３−５０９５６５Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０６０９（Ｐ２０１２−５２０６０９）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５４０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５２２４４
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５４０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５２２４４
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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