ＲＮＡ免疫において免疫応答を強化するためのＦｌｔ３リガンドの使用
本発明は、細胞へのワクチンＲＮＡの供給に関する。特に、本発明は、（人も含めて）動物に投与する際に免疫応答を誘導、惹起または強化するために、ワクチンＲＮＡとＦｌｔ３リガンドを共に使用することに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ、特に、例えば感染症またはがんのような悪性疾患に関連する一つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡを使用することによる、ワクチン接種および免疫刺激の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、非特異的免疫も特異的免疫も示すことができる。一般的に、特異的免疫はＢリンパ球およびＴリンパ球によって起こり、これらのリンパ球はその細胞表面に、ある特定の抗原に対する特異的受容体を有する。免疫系は、異なる抗原に対して二通りの仕方で応答することができる。つまり、（ｉ）Ｂ細胞の刺激および抗体または免疫グロブリンの産生を含む体液性免疫、および（ｉｉ）該して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も含めたＴ細胞を含む、細胞関与性免疫である。
【０００３】
抗原特異的なＴ細胞応答は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の糖タンパク質の結合溝に結合する抗原ペプチドによって、免疫系機構の一部として引き起こされ、それにより外来抗原が同定され、外来抗原に対する反応が起こる。結合した抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体と反応し、免疫応答を調節する。抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパク質結合溝の多型性残基によって形成される、特定の「結合ポケット」に非共有結合で結合している。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体の糖タンパク質である。この分子のα１ドメインとβ２ドメインが一緒にフォールディングされ、ペプチド結合溝を形成する。抗原ペプチドは、ペプチド上のアンカーアミノ酸とα１ドメインおよびβ１ドメインとの相互作用によってＭＨＣ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とは異なるドメイン構造をもつが、一般的に、膜ドメインから離れた位置にあるペプチド結合部位または結合溝を有する類似した構造をもつ。
【０００５】
外来タンパク質抗原を提示する際の最初のステップは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのネイティブ抗原の結合である。ＡＰＣに結合後、食作用、受容体仲介エンドサイトーシス、または飲作用のいずれか一つにより抗原が細胞内に侵入する。このような、取り込まれた抗原は、エンドソームと呼ばれる膜結合性細胞内小胞上に局在する。エンドソームとリソソームとの融合後、リソソーム中の細胞プロテアーゼによって抗原は小ペプチドにプロセシングされる。ペプチドは、このリソソーム内でＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖およびβ鎖と結合する。前もって粗面小胞体で合成されていたこのＭＨＣクラスＩＩ分子は、順にゴルジ体へ、続いてリソソームコンパートメントへ輸送される。Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化するために、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＡＰＣの表面上に提示される。
【０００６】
非特異的免疫は、マクロファージまたは顆粒球による食作用およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の活性など、様々な細胞および機構を包含している。非特異的免疫は、進化上あまり進歩していない機構に基づいており、特異的免疫応答の重要な特徴である、特異性および記憶能に関する諸性質を有していない。
【０００７】
組換えワクチンは、感染症およびがん疾患の予防および治療用の作用物質および医薬品として人間医学および獣医学において特に重要である。組換えワクチンによる予防接種の目的は、特定の疾患に対して予防上または治療上有効な特異的免疫応答を、ある同定された抗原に対して誘導することである。
【０００８】
プラスミドＤＮＡの直接筋注が、コードされる遺伝子の、細胞表面上での長期的発現をもたらすことが示されて以来（Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247、1465〜1468頁（非特許文献１））、ＤＮＡベースのワクチンは、新たな、将来性のある免疫化戦略であるように思われてきた。これらの観察は、核酸ベースのワクチンを開発するための重要な刺激であった。まず最初に、感染性病原体に対するＤＮＡベースのワクチンが試されたが（Cox, G.J. et al. (1993) J. Virol. 67、5664〜5667頁（非特許文献２）、Davis, H.L. et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2、1847〜1851頁（非特許文献３）、Ulmer, J.B. (1993) Science 259、1745〜1749頁（非特許文献４）、Wang, B. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90、4156〜4160頁（非特許文献５））、間もなく腫瘍に対する遺伝子療法においても特異的な抗腫瘍免疫性を誘導するためにさらに研究がなされた（Conry, R. M. et al. (1994) Cancer Res. 54、1164〜1168頁（非特許文献６）、Conry, R.M. et al. (1995) Gene Ther. 2、59〜65頁（非特許文献７）、Spooner, R.A. et al. (1995) Gene Ther. 2、173〜180頁（非特許文献８）、Wang, B. et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6、407〜418頁（非特許文献９））。腫瘍免疫のこの戦略は一連の決定的な利点をもつ。核酸ベースのワクチンは、製造の点で容易であり、比較的低コストである。その上、核酸ベースのワクチンは少数の細胞から増幅することができる。
【０００９】
ＤＮＡはＲＮＡよりも安定であるが、抗ＤＮＡ抗体の誘導（Gilkeson, G. S. et al. (1995) J. Clin. Invest 95、1398〜1402頁（非特許文献１０））および宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込みなど、安全性に対するいくつかの潜在的なリスクを抱えている。これにより、細胞性遺伝子の不活性化、導入遺伝子の無制御長期発現、または腫瘍誘発が起こりかねず、それゆえ、例えばｅｒｂ−Ｂ２（Bargmann, C.I. et al. (1986) Nature 319、226〜230頁（非特許文献１１））、およびｐ５３（Greenblatt, M.S. et al. (1994) Cancer Res. 54、4855〜4878頁（非特許文献１２））などの、発がん能をもつ腫瘍関連抗原については一般的に使用できない。この潜在的なリスクを回避するためには、ＲＮＡの使用が興味をそそる代案を提供する。
【００１０】
可逆的な遺伝子療法の一種としてのＲＮＡの利点には、一過性発現および非形質転換特性が挙げられる。ＲＮＡは、トランスジェニックに発現するために核に到達する必要がない上、宿主ゲノムに取り込まれることもできないため、腫瘍誘発のリスクがない。ＤＮＡと同様に（Condon, C. et al. (1996) Nat. Med. 2、1122〜1128頁（非特許文献１３）、Tang, D.C. et al. (1992) Nature 356、152〜154頁（非特許文献１４））、ＲＮＡを注入することによっても細胞性免疫応答も体液性免疫応答もｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができる（Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁（非特許文献１５）、Ying, H. et al. (1999) Nat. Med. 5、823〜827頁（非特許文献１６））。
【００１１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ＲＮＡを用いた免疫療法については、２つの異なる戦略がとられ、その両方が異なる動物モデルにおける試験で成功を収めることができ、ヒトではじめて使用された。
【００１２】
樹状細胞（ＤＣ）がリポフェクションもしくは電気穿孔法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡでトランスフェクションされてから投与されるか（Heiser, A. (2000) J. Immunol. 164、5508〜5514頁（非特許文献１７））、またはＲＮＡが様々な免疫経路で直接注入される（Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁（非特許文献１５）、Granstein, R.D. et al. (2000) Journal of Investigative Dermatology 114、632〜636頁（非特許文献１８）、Conry, R.M. (1995) Cancer Research 55、1397〜1400頁（非特許文献１９））。ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣによる免疫化がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的なＣＴＬを誘導することが証明できた（Su, Z. (2003) Cancer Res. 63、2127〜2133頁（非特許文献２０）、Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁（非特許文献２１））。ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞を腫瘍ワクチンとして使用する最初の臨床データは、２００１年と２００２年のものであり、腫瘍患者において抗原特異的T細胞が誘導可能であることを証明できた（Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁（非特許文献２１）、Rains, N. (2001) Hepato-Gastroenterology 48、347〜351頁（非特許文献２２））。患者へのＲＮＡの直接皮内注射に関しては、これまでに黒色腫患者のフェーズＩ／ＩＩ治験の最初のデータがある（Weide, B. (2008) Journal of Immunotherapy 31、180〜188頁（非特許文献２３））。ここでは、ネイキッドＲＮＡ注入の安全性およびわずかな毒性が示された。ＧＭ−ＣＳＦ投与後のＴＨ−１免疫性の改善を示した前臨床データをもとに、ＧＭ−ＣＳＦがアジュバントとして使用された（Carralot, J. P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献２４））。しかしながら、治療を受けた黒色腫患者において臨床的な効果は見られなかった。
【００１３】
それゆえ、その発現が免疫応答を刺激するタンパク質抗原をコードするＲＮＡで細胞を一過性にトランスフェクトするために、ＲＮＡワクチンを使用することができる。この抗原の細胞内での産生、および内在性の経路によるそのプロセシングに基づき、ＲＮＡワクチンは、体液性免疫、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生しながらのＴ細胞免疫を引き起こす。
【００１４】
上記の性質により、ＲＮＡは臨床での使用に特に適しているように思われる。しかしながら、特に、細胞質内でのＲＮＡの半減期の短さゆえ、ＲＮＡの使用はきわめて制限される。というのも、酵素によって分子が迅速に分解されるため、わずかなタンパク質発現しかもたらさないからである。したがって、作用物質としてのＲＮＡの免疫原能を増幅することが大きな関心の的である。
【００１５】
予防接種の作用を増強するために、以前からアジュバントが使用されている（Aguilar, J.C. et al. (2007) Vaccine 25、3752〜3762頁（非特許文献２５）、Chiarella, P. et al. (2007) Expert Opinion on Biological Therapy 7、1551〜1562頁（非特許文献２６））。ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、またはモノホスホリルリピッドＡのような様々な作用物質が、前臨床研究および初期臨床研究においてすでに、腫瘍ワクチン接種戦略の枠内で、その効力に関して研究されてきた（Speiser, D.E. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115、739〜746頁（非特許文献２７）、Cui, Z.R. et al. (2006) Cancer Immunology Immunotherapy 55、1267〜1279頁（非特許文献２８）、Jaffee, E.M. (2001) Journal of Clinical Oncology 19、145〜156頁（非特許文献２９）、Shackleton M. et al. (2004) Cancer Immunity 4、9〜20頁 （非特許文献３０）、Neidhart, J. et al. (2004) Vaccine 22、773〜780頁（非特許文献３１））。ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞によるワクチン接種後の免疫応答を強化するために、前臨床研究では様々なアジュバント（ＩＬ−１２、ＣＤ４０−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、４−１ＢＢＬ）がコトランスフェクトされた（Dannull, J. et al. (2005) Blood 105、3206〜3213頁（非特許文献３２）、Bontkes, H.J. et al. (2007) Gene Therapy 14、366〜375頁（非特許文献３３）、Grunebach, F. (2005) Cancer Gene Therapy 12、749〜756頁（非特許文献３４））。別法として、二重鎖ＲＮＡ（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）も抗原をコードするＲＮＡと共にコトランスフェクトされた（Michiels, A. (2006) Gene Therapy 13、1027〜1036頁（非特許文献３５））。
【００１６】
ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡによるワクチン接種に関連したアジュバントの使用についての研究の枠内で、これまではＧＭ−ＣＳＦの皮下投与のみが試験され、それは前臨床研究においてＴＨ−１免疫性の誘導をわずかに高めた（Carralot, J. P. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献２４））。ネイキッドＲＮＡの直接投与の枠内で使用されるアジュバントに課される要件は、ペプチドベース、ＤＮＡベースまたは細胞ベースワクチンの枠内で使用されるアジュバントに対する要件とは根本的に異なる。その原因は、細胞外空間から細胞内にＲＮＡを取り込むための機構にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，５５４，５１２号
【特許文献２】米国特許第６，２９１，６６１号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８
【特許文献４】米国特許第４，２３５，８７１号
【特許文献５】米国特許第４，５０１，７２８号
【特許文献６】米国特許第４，８３７，０２８号
【特許文献７】米国特許第５，０１９，３６９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247、1465〜1468頁
【非特許文献２】Cox, G.J. et al. (1993) J. Virol. 67、5664〜5667頁
【非特許文献３】Davis, H.L. et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2、1847〜1851頁
【非特許文献４】Ulmer, J.B. (1993) Science 259、1745〜1749頁
【非特許文献５】Wang, B. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90、4156〜4160頁
【非特許文献６】Conry, R. M. et al. (1994) Cancer Res. 54、1164〜1168頁
【非特許文献７】Conry, R.M. et al. (1995) Gene Ther. 2、59〜65頁
【非特許文献８】Spooner, R.A. et al. (1995) Gene Ther. 2、173〜180頁
【非特許文献９】Wang, B. et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6、407〜418頁
【非特許文献１０】Gilkeson, G. S. et al. (1995) J. Clin. Invest 95、1398〜1402頁
【非特許文献１１】Bargmann, C.I. et al. (1986) Nature 319、226〜230頁
【非特許文献１２】Greenblatt, M.S. et al. (1994) Cancer Res. 54、4855〜4878頁
【非特許文献１３】Condon, C. et al. (1996) Nat. Med. 2、1122〜1128頁
【非特許文献１４】Tang, D.C. et al. (1992) Nature 356、152〜154頁
【非特許文献１５】Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁
【非特許文献１６】Ying, H. et al. (1999) Nat. Med. 5、823〜827頁
【非特許文献１７】Heiser, A. (2000) J. Immunol. 164、5508〜5514頁
【非特許文献１８】Granstein, R.D. et al. (2000) Journal of Investigative Dermatology 114、632〜636頁
【非特許文献１９】Conry, R.M. (1995) Cancer Research 55、1397〜1400頁
【非特許文献２０】Su, Z. (2003) Cancer Res. 63、2127〜2133頁
【非特許文献２１】Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁
【非特許文献２２】Rains, N. (2001) Hepato-Gastroenterology 48、347〜351頁
【非特許文献２３】Weide, B. (2008) Journal of Immunotherapy 31、180〜188頁
【非特許文献２４】Carralot, J. P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁
【非特許文献２５】Aguilar, J.C. et al. (2007) Vaccine 25、3752〜3762頁
【非特許文献２６】Chiarella, P. et al. (2007) Expert Opinion on Biological Therapy 7、1551〜1562頁
【非特許文献２７】Speiser, D.E. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115、739〜746頁
【非特許文献２８】Cui, Z.R. et al. (2006) Cancer Immunology Immunotherapy 55、1267〜1279頁
【非特許文献２９】Jaffee, E.M. (2001) Journal of Clinical Oncology 19、145〜156頁
【非特許文献３０】Shackleton M. et al. (2004) Cancer Immunity 4、9〜20頁
【非特許文献３１】Neidhart, J. et al. (2004) Vaccine 22、773〜780頁
【非特許文献３２】Dannull, J. et al. (2005) Blood 105、3206〜3213頁
【非特許文献３３】Bontkes, H.J. et al. (2007) Gene Therapy 14、366〜375頁
【非特許文献３４】Grunebach, F. (2005) Cancer Gene Therapy 12、749〜756頁
【非特許文献３５】Michiels, A. (2006) Gene Therapy 13、1027〜1036頁
【非特許文献３６】Steinman, R.M.、Annu. Rev. Immunol. 9、271〜296頁 (1991)
【非特許文献３７】Shimonkevitz, R. et al.、1983、J. Exp. Med. 158、303頁
【非特許文献３８】SmithおよびWaterman、1981、Ads App. Math. 2、482
【非特許文献３９】NeddlemanおよびWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443
【非特許文献４０】PearsonおよびLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444
【非特許文献４１】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrook et al.編、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献４２】Current Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubel et al.編、John Wiley & Sons, Inc.、New York
【非特許文献４３】Science 268、1432〜1434頁、1995
【非特許文献４４】Szoka et al.（1980）、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9、467頁
【非特許文献４５】Percutaneous Penetration Enhancers, Smith et al.編 (CRC Press, 1995)
【非特許文献４６】Lyman, S.D. et al. (1994) Blood 83、2795〜2801頁
【非特許文献４７】Hannum, C. et al. (1994) Nature 368、643〜648頁
【非特許文献４８】Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁
【非特許文献４９】McNeel, D.G. et al. (2003) Journal of Clinical Immunology 23、62〜72頁
【非特許文献５０】Freedman, R.S. et al. (2003) Clinical Cancer Research 9、5228〜5237頁
【非特許文献５１】Maraskovsky, E. et al. (2000) Blood 96、878〜884頁
【非特許文献５２】Carralot, J.P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁
【非特許文献５３】Robinson et al.、2003、BMT、31、361〜369頁
【非特許文献５４】Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、ＲＮＡワクチンを投与する際に、免疫刺激の程度を増強させる薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この課題は、本発明において、各請求項の対象によって解決される。
【００２１】
本発明は、抗原提示細胞の細胞質ゾルへのＲＮＡの取り込みをサポートする、および／またはワクチンＲＮＡを投与する際により効果的な免疫応答を起こすことができる、化合物を記載することによってこの必要に対応する。
【００２２】
本発明者等は、ワクチン接種および治療に使用可能な抗原をコードするＲＮＡ分子を、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）の投与とともに投与すると、この抗原に特異的な免疫応答を効果的に起こせることを確認した。
【００２３】
本発明によると、公知の様々なアジュバントは、ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡを用いた直接免疫化後にＴ細胞プライミング効果を上昇させないのみならず、傾向的にはＴ細胞の応答を低下させることが確認された。この知見は、意外であり、抗原提示細胞へのＲＮＡの取り込みに及ぼすアジュバントの影響によってしか説明できない。ここで問題となるのは、本発明者によってはじめて記載される方法で長鎖リボ核酸の取り込みをつかさどる機構である。この取り込み機構は、様々なアジュバントによって、その効果が阻害される。Ｆｌｔ３リガンドのみが、ＲＮＡ免疫化において有意なアジュバント効果を示すことができた。ここで示す研究は、特に、抗原をコードするＲＮＡと一緒にＦｌｔ３リガンドを投与した際に、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大幅な増加を確認できたことを示す。
【００２４】
本発明は、概して、細胞へのワクチンＲＮＡの供給に関する。特に、本発明は、（ヒトも含めた）動物に投与する際に免疫応答を誘導、惹起または強化するために、ワクチンＲＮＡとＦｌｔ３リガンドを共に使用することに関する。
【００２５】
本発明によると、Ｆｌｔ３リガンドは、好ましくはＲＮＡワクチンと共に使用する際に、ＲＮＡワクチンの使用によって産生される特異的抗原に対する動物の免疫応答を強化する。この調合物中で使用される典型的なワクチンは、インフルエンザワクチン、ヘルペスワクチン、サイトメガロウイルスワクチン、ＨＩＶ−１ワクチン、ＨＴＬＶ−１ワクチン、ＦＩＶワクチンなどのウイルス性ワクチン、細菌性ワクチン、がんワクチン、および寄生虫ワクチンである。
【００２６】
好ましくは、本発明によると、Ｆｌｔ３リガンドと、抗原をコードするＲＮＡとを動物に導入することにより、動物が免疫化される。ＲＮＡは、動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞または別の細胞）に取り込まれる。ＲＮＡの抗原性翻訳産物が形成され、この産物が場合によってはプロセシングされ、主要組織適合遺伝子複合体との関連の下で細胞によって提示され、その結果、この抗原に対する免疫応答が起こる。つまり、ＲＮＡは翻訳の際に抗原を産生する。
【００２７】
特定の実施形態では、ＲＮＡワクチンの投与前、投与と同時、および／または投与後にＦｌｔ３リガンドを投与する。好ましくは、ＲＮＡワクチンの投与前にＦｌｔ３リガンドを投与する。
【００２８】
一態様では、本発明は、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを含む免疫原性調製物に関する。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドは、本発明の免疫原性調製物において、共通の組成物、つまり混合物として存在してもよい。さらに、本発明によると、ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドが共通に存在するものの同一組成物中には存在しない実施形態も企図される。そのような実施形態は、特に、少なくとも２つの容器を備え、一つの容器にはＲＮＡを含む組成物を収容し、別の容器にはＦｌｔ３リガンドを含む組成物を収容した、キットに関するものである。
【００２９】
本発明の免疫原性調製物においては、ＲＮＡは好ましくはｍＲＮＡである。好ましくは、ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られたものである。
【００３０】
本発明の免疫原性調製物は、さらに、ＲＮＡを安定化するためのＲＮアーゼインヒビターなど少なくとも一つのＲＮＡ安定化因子を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の免疫原性調製物は、好ましくは、治療上の使用のために調合された調製物である。本発明によると、用語「治療上の使用」は、疾患の治療または予防を包含する。この態様では、本発明は、本発明の免疫原性調製物を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
典型的には、本発明の免疫原性調製物、または本発明の医薬組成物は、さらに溶媒、例えば水性溶媒またはＲＮＡ無傷性の維持を可能にするあらゆる溶媒；水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、ＣｐＧモチーフをもつオリゴヌクレオチド、または当業者に公知の他のあらゆるアジュバントなどのアジュバント；および、プロタミンなどのあらゆる安定化剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な希釈剤、および／または薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。
【００３３】
さらに、一つまたは複数の別のアジュバントの添加により本発明の調製物の免疫原性を高めることが可能である。さらに、本発明の免疫原性調製物のＲＮＡを、カチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性化合物、例えばカチオン性またはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質と複合化することによって安定化させることが可能である。本発明の免疫原性調製物の好ましい一実施形態によると、ＲＮＡと複合化するペプチドまたはタンパク質は、プロタミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、またはヒストンである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、生物のワクチン接種に適した形態で存在する。
【００３５】
好ましくは、本発明の免疫原性調製物、または本発明の医薬組成物、または少なくともそのうちのＲＮＡを含む成分は、リンパ節内投与用の製剤の形態で存在する。
【００３６】
上記の調製物および組成物は、ここで記載される方法、特に免疫化法において使用可能である。
【００３７】
別の一態様では、本発明は、細胞を、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドと接触させることを含む、少なくとも一つの抗原を細胞に供給するための方法に関する。好ましくは、細胞は、生物中にｉｎ ｖｉｖｏで存在し、本方法は、この生物にＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドを投与することを含んでいる。好ましい一実施形態では、細胞は抗原提示細胞であり、さらに好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、またはマクロファージである。
【００３８】
この態様では、本発明は、細胞、特に抗原提示細胞、さらに好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、またはマクロファージ内のＭＨＣ／ペプチド複合体の量を増大させる方法であって、細胞を、ペプチドまたはそのペプチドを含む発現産物をコードするＲＮＡと接触させること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法にも関する。ペプチドを含む発現産物は、細胞によって好ましくはペプチドにプロセシングされる。
【００３９】
好ましくは、本方法はｉｎ ｖｉｖｏで行なわれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体量の増大が、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の一次活性化を増強する。
【００４０】
別の一態様では、本発明は、個体中において免疫応答を惹起または強化するための方法であって、免疫応答の対象となる抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法に関する。好ましくは、免疫応答は、個体に対して保護および／または治療作用を有し、好ましくは、抗原特異的なＴ細胞免疫応答を含む。
【００４１】
別の一態様では、本発明は、個体中における抗原特異的エフェクター細胞、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の量を増大させるための方法であって、抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法に関する。
【００４２】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、がんの予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき腫瘍抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてがんを予防および／または治療するための方法に関する。
【００４３】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、ウイルス感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべきウイルス抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてウイルス感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４４】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、細菌感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき細菌抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において細菌感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４５】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、単細胞生物による感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき単細胞生物抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において単細胞生物による感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４６】
別の一態様は、アレルゲン特異的免疫療法と併せたＦｌｔ３リガンドの投与を含む、患者におけるアレルギーの予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、アレルギーに関連するアレルゲンをコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてアレルギーを予防および／または治療するための方法に関する。
【００４７】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルであって、ワクチンの有効性、抗原の免疫原性、または抗原および／またはワクチンに対する保護免疫応答が試験動物において検査および評価される、免疫化プロトコルに関する。
【００４８】
ここに記載される戦略を使用して疾患または感染を治療および／または予防することの利点は、とりわけ、組換え抗原のような弱免疫原性の抗原の免疫原性を高められること、使用される抗原またはその抗原をコードするＲＮＡの量を低下させることが可能であること、追加免疫のための要件が軽減されること、および免疫化の効率が高まることである。
【００４９】
ＲＮＡワクチンと共にＦｌｔ３リガンドを使用すると、通常は弱い免疫応答を引き起こす特定のウイルスタンパク質およびがん特異的抗原の免疫原性を強化することができる。このワクチン接種技術は、例えば、弱免疫原性ウイルスタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用できる。本発明のＲＮＡワクチンでは、タンパク質抗原は、血清抗体にさらされることが決してなく、トランスフェクトされた細胞自体によってｍＲＮＡの翻訳後に産生される。そのため、アナフィラキシーが問題となることはないはずである。したがって、本発明は、アレルギー反応のリスクなしに患者を繰り返し免疫化することを可能にする。
【００５０】
本発明の免疫化戦略は、ＲＮＡベースの免疫化後の抗原特異的Ｔリンパ球頻度の量的上昇も可能にする。この効率上昇は、臨床的有効性の向上という意味で、または同じ有効性におけるワクチン用量または投与頻度の軽減という意味で、患者の免疫療法に有用となり得る。
【００５１】
ＨＬＡトランスジェニックマウスでは、本発明による、ヒト腫瘍関連抗原をコードするＲＮＡワクチンを用いた免疫化により、ヒトＨＬＡ分子との関連の下で天然にプロセシングされたエピトープを認識する、Ｔ細胞クローンまたはＴ細胞受容体を単離することができる。本発明の免疫化戦略により、より高い確率で抗原特異的Ｔ細胞を産生することができる。さらに、本発明の免疫化戦略により、前駆体頻度が低い抗原特異的Ｔ細胞を大幅に増幅することも可能である。この効率上昇は、ナイーブなレパートリーで存在する抗原特異的Ｔ細胞を、より包括的に単離することを可能にする。さらに、記載される免疫化法による効率上昇はコスト削減を伴う。
【００５２】
本発明によると、動物から細胞を取り出し、その細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＦｌｔ３リガンド／ＲＮＡでトランスフェクトすることも企図されている。ＲＮＡを細胞内に導入し、ポリヌクレオチドの抗原性翻訳産物を形成させる。トランスフェクション後、抗原を発現する細胞を、好ましくは注入によって動物に導入すると、いまや内在性となった抗原に対して免疫系が応答することができ、免疫原に対する免疫応答が引き起こされる。本発明のこの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、好ましくは、リンパ球様細胞、特に動物から取り出された抗原提示細胞である。
【００５３】
動物由来の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトする場合、クラスＩ−ＭＨＣ分子ならびにクラスＩＩ−ＭＨＣ分子を含む細胞の供給源を提供するには、細胞の供給源は、全血から迅速に単離可能な末梢血細胞でよい。これらの細胞は、さらに、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、またはマクロファージ／単球に分画することもできる。骨髄細胞は、あまり分化していないリンパ球様細胞の供給源を提供することができる。
【００５４】
別の一態様では、本発明によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは生物中においてＴ細胞、特にＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球を刺激または活性化するための方法であって、Ｔ細胞を準備すること、またはＴ細胞が特異性をもつはずの少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを生物に投与することを含む方法が提供される。このような刺激または活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖、細胞傷害性の反応性、および／またはサイトカイン放出として現れる。
【００５５】
上記の方法は、特に、例えば細菌またはウイルスによって惹起される感染性疾患の治療または予防に適している。特定の実施形態では、本発明に従って使用される抗原は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、マイコバクテリウム属、マラリア病原体、ＳＡＲＳ病原体、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスなどの感染性病原体、またはクラミジア属およびマイコバクテリウム属などの細菌性病原体から誘導されたものである。本発明の特に有益な適用分野は、がん免疫療法またはがんワクチン接種にあり、その場合、特に、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞の活性化が高められ、その結果、腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫療法またはＴ細胞ワクチン接種の展望が改善される。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明に従って使用される抗原は、以下の抗原からなる群から選ばれる：ｐ５３ ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｓｓ−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−６、クローディン−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂＬ Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明によると、組換え核酸の作成、細胞の培養、および細胞への核酸の導入は、標準法を使用できる。酵素反応は、メーカの記載に基づき、またはそれ自体公知の方法で行なわれる。
【００５８】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」または「Ｆｌｔ３−Ｌ」は、「Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド」に関する。Ｆｌｔ３は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、未熟な造血前駆細胞によって発現される。Ｆｌｔ３のリガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質であり、造血細胞および骨髄間質細胞を含む多数の細胞によって発現される。別の成長因子と組み合わせると、このリガンドは、幹細胞、骨髄系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞、樹状細胞、およびＮＫ細胞を含む様々な細胞タイプの増殖および成長を刺激する。受容体の活性化は、造血細胞における増殖、生存、および他のプロセスを制御する様々なシグナル伝達経路に関与することが公知である様々な鍵になるアダプタータンパク質のチロシンリン酸化をもたらす。
【００５９】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、Ｆｌｔ３受容体に結合し、好ましくは、結合したＦｌｔ３受容体を介して刺激シグナルを細胞に伝達する生物活性を示す、あらゆる分子、特にペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００６０】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、細胞によって自然に発現される、またはＦｌｔ３リガンドをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、Ｆｌｔ３リガンドのあらゆる変異体、特にスプライス変異体、および翻訳後修飾された変異体、立体配座、アイソフォーム、および種ホモログを包含する。さらに、用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、組換えにより作成された、および作成可能なすべての形態のＦｌｔ３リガンドを包含する。
【００６１】
用語「Ｆｌｔ３リガンドをコードする核酸」は、好ましくは、（ｉ）配列プロトコルの配列番号３および４、（ｉｉ）（ｉ）に基づく核酸配列から誘導された配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に基づく核酸配列の一部からなる群から選ばれる核酸配列を含む核酸に関する。
【００６２】
Ｆｌｔ３リガンドは、好ましい一実施形態では、（ｉ）配列プロトコルの配列番号３および４、（ｉｉ）（ｉ）に基づく核酸配列から誘導された配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に基づく核酸配列の一部からなる群から選ばれる核酸配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を包含する。別の好ましい一実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは、配列プロトコルの配列番号１および２、それらの配列から誘導された配列、またはその配列の一部からなる群から選ばれるアミノ酸配列を包含する。
【００６３】
本発明に従って使用可能なＦｌｔ３リガンドの形態としては、それだけに限定されるものではないが、配列プロトコルの配列番号１および２、ならびにそれらの配列から誘導された配列を有するポリペプチドに示されるような、マウスおよびヒトに由来するＦｌｔ３リガンドが含まれる。
【００６４】
好ましくは、配列番号１および２に関する用語「それから誘導された配列」は、配列番号１および２に関して短縮され、主にタンパク質の細胞外部分を含む、配列に関するものである。このような配列は、好ましくは、膜貫通部分および細胞内部分を含まない。用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５５４，５１２号（特許文献１）および米国特許第６，２９１，６６１号（特許文献２）に記載されるようなポリペプチドを包含する。
【００６５】
Ｆｌｔ３リガンドの特に好ましい形態は、生物活性のある可溶型であり、特に細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一つまたは複数の断片を含む形態である。このような形態は、好ましくはＦｌｔ３リガンドの膜貫通部分および細胞内部分、つまり細胞質部分を含まない。Ｆｌｔ３リガンドの可溶型は、そのポリペプチドが発現される細胞から分泌可能なポリペプチドである。そのような型では、ポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメイン、またはその一部が欠失しているため、そのポリペプチドを発現する細胞から、ポリペプチドが完全に分泌される。ポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインは、本発明によると、配列情報を手がかりにそのようなドメインを決定するための公知の方法によって、それ自体公知の仕方で決定することができる。配列番号１に関しては、細胞内ドメインはアミノ酸２０６〜２３５と、膜貫通ドメインはアミノ酸１８５〜２０５または１８３〜２０５と定義できる。
【００６６】
ヒトＦｌｔ３リガンドは、配列番号１のアミノ酸１〜Ｘ、２７〜Ｘもしくは２８〜Ｘ、またはそれから誘導された配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよく、Ｘは１６０〜２３５のうちの一アミノ酸、好ましくは１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４または１８５である。
【００６７】
マウスＦｌｔ３リガンドは、配列番号２のアミノ酸１〜Ｙ、２７〜Ｙもしくは２８〜Ｙ、またはそれから誘導された配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよく、Ｙは１６３〜２３２のうちの一アミノ酸である。
【００６８】
可溶性ヒトＦｌｔ３リガンドの実施形態は、配列番号１の残基１〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基１〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基1〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基１〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基１〜２３５（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜２３５（両端を含む）、および配列番号１の残基２８〜２３５（両端を含む）のアミノ酸配列を包含する。
【００６９】
可溶性マウスＦｌｔ３リガンドの実施形態は、配列番号２の残基１〜１６３のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基２８〜１６３のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基１〜１８８のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基２８〜１８８のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基１〜２３２のアミノ酸配列（両端を含む）、および配列番号２の残基２８〜２３２のアミノ酸配列（両端を含む）を包含する。
【００７０】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、本発明によると、好ましくは共有結合による融合体の形で、一つまたは複数の異種ペプチドまたはタンパク質と連結され、場合によってはリンカーによって隔てられた、上記の配列を含む分子をも包含する。なお、ペプチドまたはタンパク質が天然ではない方式で配列と連結している場合には、ペプチドまたはタンパク質は、それが連結されている配列に対して異種である。例えば、天然Ｆｌｔ３リガンドから誘導された配列と、抗体から誘導された配列とは異種配列である。これら異種ペプチドまたはタンパク質は、例えば、上記配列の宿主細胞からの分泌を制御すること、上記配列を細胞内の特定の小器官にコンパートメント化すること、前記配列の安定性を高めること、および／または精製を可能にしまたは容易にすることができる。一実施形態では、異種ペプチドまたはタンパク質は、抗体、好ましくは抗体の重鎖、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２クラスの抗体、好ましくはＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、好ましくはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥから誘導されたものである。好ましくは、異種ペプチドまたはタンパク質は、抗体の定常領域から誘導され、好ましくはこの領域またはこの一部を含む。好ましくは、異種ペプチドまたはタンパク質は、配列番号５に示す配列またはそれから誘導された配列を含む。一実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは、本発明によると、配列番号６に示す配列またはそれから誘導された配列を含む。
【００７１】
さらに、用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、本発明によると、ここで特に記載される配列から誘導されたアミノ酸配列を含むあらゆるポリペプチドを包含する。
【００７２】
用語「免疫応答」は、ここではその従来の意味で用いられ、体液性免疫および細胞性免疫を包含する。免疫応答は、抗原に対する抗体の発生、および様々な増殖試験またはサイトカイン産生試験によりｉｎ ｖｉｔｒｏで検出可能な抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、さらに好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖から選ばれる一つまたは複数の応答が起きることで明らかになる。
【００７３】
用語「免疫療法」は、特異的免疫応答の活性化に基づく治療に関する。
【００７４】
「保護する」、「予防の」、「保護用の」などの用語は、ここでは、生物における腫瘍または病原体の出現および／または増加の阻止または処置またはその両方を意味する。ワクチンの予防的投与は、腫瘍成長の起こり、または病原体による感染からレシピエントを守ることができる。ワクチンの治療的投与または免疫療法は、例えば、現存する腫瘍の蔓延または転移からレシピエントを守ることができ、あるいは現存する腫瘍の腫瘍量の低下を引き起こすことができる。
【００７５】
ここで用いられる抗原提示細胞またはＡＰＣは、タンパク質抗原のペプチド断片を、ＭＨＣ分子との関連の下でその細胞表面に提示する細胞である。多くのＡＰＣが抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【００７６】
ＡＰＣの例は、それだけに限定されるものではないが、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞などである。
【００７７】
用語「ＭＨＣ／ペプチド複合体」は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の結合ドメインと、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとの非共有結合性複合体に関する。
【００７８】
用語「ＭＨＣ結合ペプチド」または「結合ペプチド」は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しているペプチドに関する。クラスＩ−ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８〜１０アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドも有効となり得る。クラスＩＩ−ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０〜２５アミノ酸長、特に１３〜１８アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドも有効となり得る。
【００７９】
用語「主要組織適合遺伝子複合体」およびその略語「ＭＨＣ」は、あらゆる脊椎動物に現れる遺伝子複合体に関する。ＭＨＣタンパク質およびＭＨＣ分子は、通常の免疫応答におけるリンパ球と抗原提示細胞との間のシグナル伝達において、ペプチドと結合し、それをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が認識できるように提示することで機能を果たす。ＭＨＣ分子は、細胞内のプロセシングコンパートメントにおいてペプチドと結合し、このペプチドを、抗原提示細胞の表面上でＴ細胞に提示する。ＨＬＡとも呼ばれるヒトＭＨＣ領域は、第６染色体上に存在し、クラスＩ領域およびクラスＩＩ領域を含む。
【００８０】
用語「ＭＨＣクラスＩ」または「クラスＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩタンパク質またはクラスＩ遺伝子に関する。ＭＨＣクラスＩ領域内には、ヒトではＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−Ｅ−、ＨＬＡ−Ｆ−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１ｂ−、およびＣＤ１ｃ亜領域が存在する。
【００８１】
クラスＩのα鎖は、分子量約４４ｋＤａの糖タンパク質である。ポリペプチド鎖の長さは３５０アミノ酸残基よりいくぶん長い。このポリペプチド鎖は、３つの機能領域に分けることができ、つまり細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域である。細胞外領域は、２８３アミノ酸残基長であり、３つのドメイン、α１、α２およびα３に分けられる。これらのドメインおよび領域は、通常は、クラスＩ遺伝子の別々のエクソンによってコードされる。膜貫通領域は、原形質膜の脂質二重層を貫通する。膜貫通領域は、大部分は、αへリックスに配列される疎水性の２３個のアミノ酸残基からなる。細胞質領域、つまり細胞質側を向いた、膜貫通領域に隣接する部分は、典型的には３２アミノ酸残基長であり、細胞骨格の諸要素と相互作用する能力をもつ。α鎖は、β２−ミクログロブリンと相互作用し、細胞表面でα−β２−二量体を形成する。
【００８２】
用語「ＭＨＣクラスＩＩ」または「クラスＩＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩＩタンパク質またはクラスＩＩ遺伝子に関する。ＭＨＣクラスＩＩ領域内には、ヒトではクラスＩＩα鎖およびクラスＩＩβ鎖遺伝子のＤＰ−、ＤＱ−、およびＤＲ亜領域（つまりＤＰα、ＤＰβ、ＤＱα、ＤＱβ、ＤＲαおよびＤＲβ）が存在する。
【００８３】
クラスＩＩ分子は、それぞれα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体である。両鎖とも糖タンパク質であり、分子量３１〜３４ｋＤａ（α）または２６〜２９ｋＤａ（β）である。α鎖の全長は２２９〜２３３アミノ酸残基であり、β鎖の全長は２２５〜２３８残基である。α鎖もβ鎖も、細胞外領域、結合ペプチド、膜貫通領域、および細胞質側末端からなる。細胞外領域は、２つのドメイン、α１およびα２、またはβ１およびβ２からなる。結合ペプチドは、α鎖およびβ鎖でそれぞれ１３残基および９残基長である。結合ペプチドは、２番目のドメインを、α鎖においてもβ鎖においても２３アミノ酸残基からなる膜貫通領域と結びつける。細胞質領域、つまり細胞質側を向いた、膜貫通領域に隣接する部分の長さは、α鎖では、３〜１６残基であり、β鎖では８〜２０残基である。
【００８４】
用語「ＭＨＣ結合ドメイン」は、「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」および「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」に関する。
【００８５】
用語「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩ鎖の、抗原ペプチドへの結合に必要な領域に関する。ＭＨＣクラスＩ結合ドメインは、主に、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１ドメインとα２ドメインによって形成される。α鎖のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンは、結合ドメインの必須部分ではないものの、おそらく、ＭＨＣクラスＩ分子の全体構造の安定化に重要であり、したがって、用語「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」は好ましくはこの領域も含む。ＭＨＣクラスＩ結合ドメインは、本質的には、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞外ドメインとしても定義可能であり、それにより、膜貫通領域および細胞質領域から区別される。
【００８６】
用語「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ鎖の、抗原ペプチドへの結合に必要な領域に関する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメインは、主に、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびβ鎖のα１ドメインおよびβ１ドメインによって形成される。しかしながら、このタンパク質のα２ドメインおよびβ２ドメインも、おそらく、ＭＨＣ結合溝の全体構造の安定化に重要であり、したがって、用語「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」は、本発明によると好ましくはこの領域も含む。ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメインは、本質的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外ドメインとしても定義可能であり、それにより、膜貫通領域および細胞質領域から区別される。
【００８７】
本発明によると、用語「抗原」は、少なくとも一つのエピトープを含むあらゆる分子を包含する。本発明によると、好ましくは、抗原は、場合によってはプロセシング後に、好ましくはこの抗原に特異的である免疫応答を引き起こし得る分子である。本発明によると、免疫応答を起こしそうなあらゆる適切な抗原が使用可能であり、その際、免疫応答は体液性のものでも細胞性でのものでもよい。本発明の実施形態では、抗原またはそのプロセシングされた形態が、好ましくは、ある細胞によってＭＨＣ分子との関連の下で提示され、その結果、抗原またはそのプロセシングされた形態に対して免疫応答が引き起こされる。
【００８８】
用語「抗原」は、特にタンパク質、ペプチド、核酸、特にＲＮＡ、ならびにヌクレオチドを包含する。抗原は、好ましくは、アレルゲン、ウイルス、細菌、菌類、寄生生物、他の感染性因子および病原体または腫瘍抗原から誘導された産物である。抗原は、本発明によると、天然に出現する産物、例えばウイルスタンパク質に対応するものでもよく、または、特に免疫原性を高めるために、特に配列の順序および／または長さを変化させる、さらなる配列を付加するまたは挿入するなどによって天然の産物から誘導したものでもよい。しかしながら、使用される抗原は、好ましくは、その抗原が誘導された元の天然物に対しても免疫応答を起こす。したがって、用語「抗原」は、本発明によると、タンパク質、ペプチド、多量体タンパク質、または多量体ペプチド、合成ペプチドなどの形で存在してもよいタンパク質全体またはペプチド全体のうちの免疫原性部分またはエピトープをも包含する。用語「免疫原性」は、抗原の、免疫応答を起こす相対的有効性に関する。
【００８９】
用語「抗原」は、誘導体化された抗原、つまり変換により（例えば、分子内で中間的に体内タンパクの補完により）はじめて抗原性に、および感作性に、なる二次的物質も包含する。
【００９０】
好ましい一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、つまり細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得るがん細胞の構成要素であり、特に細胞内に、または表面抗原として腫瘍細胞上に好ましくは多量に生じる抗原である。その例は、がん胎児性抗原、α１−胎児タンパク質、イソフェリチンおよび胎児硫酸糖タンパク質（Ｓｕｌｆｏｇｌｙｋｏｐｒｏｔｅｉｎ）、α２−Ｈ−フェロプロテイン（Ｆｅｒｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびγ−胎児タンパク質、および様々なウイルス腫瘍抗原である。別の一実施形態では、抗原は、ウイルスのリボ核タンパク質または外殻タンパク質（Ｈｕｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎｅ）のようなウイルス抗原である。特に、そのうちの抗原またはペプチドは、ＭＨＣ分子によって提示され、それにより、特にＴ細胞受容体の活性調節を介して、免疫系細胞、好ましくはＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球を調節、特に活性化することができ、その結果、好ましくはＴ細胞の増殖を誘発することになる。
【００９１】
本発明によると、腫瘍抗原としては、好ましくは、種類および／または量に関して、腫瘍またはがん、ないしは腫瘍細胞またはがん細胞に特徴的な、あらゆる抗原が含まれる。
【００９２】
Ｆｌｔ３リガンドは、アレルギーの治療においても使用可能である。ここに記載される、Ｆｌｔ３リガンドを使用する免疫化プロトコルは、アレルゲン特異的なアレルギー免疫療法において使用可能である。アレルゲン特異的免疫療法とは、原因となるアレルゲンにその後さらされることに伴う症状が鎮まった状態を達成するために、一つまたは複数のアレルギーをもつ生物に、アレルゲンワクチンを好ましくは用量を増加させながら投与することと定義される。Ｆｌｔ３リガンドを使用するアレルゲン特異的免疫療法の有効性は、患者に由来するアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体およびＩｇＥ抗体の測定など、公知の標準法により評価することができる。
【００９３】
免疫原とは、生物において免疫応答を誘導する抗原である。
【００９４】
本発明に従って使用される組成物は、ＲＮＡ分子がコードする抗原の種類および数に関して、限定されない。
【００９５】
本発明によると、定義された配列をもつ単独のＲＮＡ種を投与することが可能だが、配列の異なる複数の様々なＲＮＡを投与することも可能である。一実施形態では、本発明によると、ＲＮＡ分子のプールが投与される。ＲＮＡが、本発明による、様々な配列のＲＮＡ分子を含む場合、これらのＲＮＡをコードする配列は、同一または異なる抗原から誘導されたものでよい。
【００９６】
用語「病原体」は、病原性微生物に関するものであり、ウイルス、細菌、単細胞生物および寄生虫を包含する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウィルス、およびヒトＴリンパ好性ウイルス（ｈｕｍａｎｅｓ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｓｃｈｅｓ Ｖｉｒｕｓ：ＨＴＬＶ）が病原性ウイルスの例である。単細胞生物としては、マラリア原虫、トリパノゾーマ、アメーバなどが含まれる。
【００９７】
ここで用いられる用語「ワクチン」は、一つまたは複数の抗原、またはそれをコードする核酸を含む、組成物に関する。さらに、ワクチンは、一つまたは複数のアジュバント、希釈剤、担体物質などを含んでもよく、抗原に対する保護免疫応答および／または治療免疫応答を起こさせるために、あらゆる適切な方法で生物に投与される。したがって、ワクチンは疾患の予防に使用することができ、例えば感染前に投与してもよく、疾患の発生後に投与してもよい。ワクチンは、天然抗原、誘導体化抗原、合成抗原、組換え抗原、または非組換え抗原、またはそれをコードする核酸を含むことができる。本発明によると、ワクチンは、一つまたは複数の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡであってもよく、遺伝子導入用のリポソームもしくは別の粒子に挿入されていてもよい。投与を容易にするためにワクチンに挿入可能な別の物質は、ポリペプチド、ペプチド、多糖類結合体（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ−Ｋｏｎｊｕｇａｔｅ）、脂質などである。
【００９８】
免疫生物学およびワクチン接種の原理は、治療すべき疾患に関して免疫学上関連のある抗原を用いて生物を免疫化することによって、疾患に対する免疫保護応答が生じるということに基づくことを、当業者は認識するであろう。したがって、本発明の、がん、感染症などの治療法においては、予防または治療すべき疾患に関して免疫学上関連のある抗原を含むワクチンを使用すべきであることが理解される。例を挙げると、がんワクチンは、一つまたは複数のがん抗原を含むであろう。
【００９９】
ＲＮＡワクチンの場合、免疫原性ペプチドまたはタンパク質を作動可能にコードし、好ましくは薬学的に許容可能な担体中に存在するＲＮＡを、例えばがんまたは病原性感染に罹患した動物の細胞に投与するが、その際、ＲＮＡは細胞内に導入され、場合によってはプロセシング後に、保護または治療上有効な免疫応答を起こさせる能力のある、ある量の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が産生される。
【０１００】
細胞に供給されるＲＮＡ材料は、免疫原性ペプチドまたはタンパク質の全配列または一部だけを含んでよい。別のポリペプチド配列をコードする配列を含んでいてもよい。さらに、遺伝子発現の調節に関わる因子（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、５’−ＵＴＲ配列または３’−ＵＴＲ配列など）を含んでいてもよい。ＲＮＡは、ある特定の遺伝子産物の免疫原性を増強する免疫刺激性配列を含んでいてもよく、および／またはポリヌクレオチドの取り込みを強化する配列を含んでいてもよい。
【０１０１】
なお、本発明のワクチンは、有効性に関しては、集団の一部においてしか免疫を引き起こせないことに留意されたい。というのは、強い免疫応答または保護免疫応答を起こさせる能力、または多くのケースではワクチンに対してそれぞれの免疫応答を起こさせる能力をもたないかもしれない個体が相当数あるからである。この能力欠如の原因は、個体の遺伝的背景、または免疫不全状態（後天性または先天性）、または免疫抑制（例えば、拒絶反応を妨げるため、または自己免疫状態を抑制するための、免疫抑制剤による治療）にあるかもしれない。
【０１０２】
ここで記載されるようなエフェクター細胞は、免疫応答中にエフェクター機能を行なう細胞である。そのような細胞は、例えば、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を殺し、感染または変性した細胞を認識し、場合によっては殺し、抗体を分泌する。その例は、それだけに限定されるものではないが、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞である。
【０１０３】
樹状細胞は、特定の形態および広い組織内分布をもつ異種細胞集団を包含する。樹状細胞系、および免疫系におけるその役割は、Steinman, R.M.、Annu. Rev. Immunol. 9、271〜296頁 (1991) （非特許文献３６）に記載されており、その開示が参照により本明細書に組み込まれている。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する能力をもち、Ｔ細胞に抗原を提示する際にきわめて有効である。用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる、形態的に類似する種々の細胞型の雑多な集団のメンバーに関する。樹状細胞は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞の１グループであり、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する能力をもつ。それぞれの系統および成熟度に応じて、樹状細胞は、機能または表現型、特に細胞表面表現型により識別可能である。この細胞は、ある特定の形態、食作用／エンドサイトーシス能力、表面のＭＨＣクラスＩＩの高い発現度、およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力を特徴とする。機能的には、樹状細胞は、抗原提示能力を確認する試験によって同定することができる。そのような試験は、ある試験用抗原の提示によりＴ細胞を刺激する能力の評価、および場合によってはＴ細胞増殖の定量、ＩＬ−２の放出などを含み得る。
【０１０４】
本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡにさらされたリンパ系樹状細胞は、抗原提示細胞として、ＲＮＡがコードする抗原に対する免疫応答の誘導に使用することができる。
【０１０５】
免疫アジュバントまたはアジュバントとは、個体に投与した場合、抗原のみを投与した試験用個体と比べて、抗原に対する免疫応答を上昇させるか、免疫系細胞の特定の活性を強化させる化合物である。
【０１０６】
本発明によると、一つまたは複数の抗原をコードするＲＮＡは、あらゆるアジュバントと一緒に投与することができる。その際、用語「アジュバント」は、抗原およびＦｌｔ３リガンドとは異なる上、ワクチンに組み込むと、抗原に対する宿主の免疫応答を促進、延長、または強化するあらゆる物質に関する。Ｆｌｔ３リガンドは、本発明によると、ここで定義されるようなアジュバントとは見なされないが、それにもかかわらず、記載されるその、免疫応答を強化する作用に基づき、アジュバントと見なすこともできる。しかしながら、明確性のためにＦｌｔ３リガンドはここではアジュバントとは呼ばない。アジュバントは、抗原表面の上昇、体内における抗原の滞留の延長、抗原放出の減速、マクロファージへの抗原のターゲティング、抗原の取り込み上昇、抗原プロセシングの増加、サイトカイン放出の促進、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞のような免疫細胞の刺激および活性化、および、他の方法による、免疫系細胞の非特異的活性化の惹起を含めた一つまたは複数の機構により、その生物作用を発揮すると推測される。アジュバントは、油エマルジョン（例えば、フロイントアジュバント）、鉱物性化合物（ミョウバンのような）、細菌産物（例えば百日咳菌毒素）、リポソームおよび免疫刺激複合体のような異種の化合物群を包含する。
【０１０７】
ここで定義される「補助分子」は、抗原に対する生物の免疫応答を促進、延長、または強化するために、場合によっては生物に投与される分子である。例えば、サイトカイン、成長因子などは、免疫応答を強化または調節する際に使用することができる。サイトカインには、それだけに限定されるものではないが、インターロイキン−１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、１５、１８および２３のようなインターロイキン、ケモカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンαおよびインターフェロンγ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βのようなＴＮＦファミリーのメンバー、ＣｐＧ配列などが含まれる。
【０１０８】
細胞に供給されるＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでもよい。したがって、本発明によると、ここで記載されるＦｌｔ３リガンドを用いて、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをターゲット細胞に供給することができる。
【０１０９】
Ｔ細胞受容体の活性を調節する組成物の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって簡単に定量することができる。典型的には、試験用のＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマ、またはヒトのような哺乳類またはマウスのようなげっ歯類から単離されたＴ細胞のような、形質転換されたＴ細胞株によって供給される。適切なＴ細胞ハイブリドーマは、自由に入手可能であり、あるいはそれ自体公知の方法で作製できる。Ｔ細胞は、それ自体公知の方法で哺乳類から単離することができる。例えば、Shimonkevitz, R. et al.、1983、J. Exp. Med. 158、303頁（非特許文献３７）を参照のこと。
【０１１０】
組成物がＴ細胞の活性を調節する能力をもつかどうかを決定するのに適した試験は、以下のステップ１〜４により、次のように行なわれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の活性化、または活性化に続くＴ細胞活性の調節を示す、試験可能なマーカーを、適切な方法で発現する。したがって、活性化の際にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。組成物が、このＴ細胞ハイブリドーマの活性を調節する能力があるかどうかを決定するために、ＩＬ−２濃度を測定することが可能である。このような適切な試験は、以下のステップにより行なわれる。
【０１１１】
1．例えば興味のあるＴ細胞ハイブリドーマから、または単離により哺乳類から、Ｔ細胞を獲得する。
【０１１２】
2．増殖を可能にする条件下でＴ細胞を培養する。
【０１１３】
3．成長するＴ細胞を、抗原とまたはその抗原をコードする核酸と接触させた抗原提示細胞と接触させる。
【０１１４】
4．Ｔ細胞のマーカーを試験する、例えばＩＬ−２産生を測定する。
【０１１５】
試験に使用されるＴ細胞を、増殖に適した条件下で培養する。例えば、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞ハイブリドーマを約３７℃、５％ＣＯ２において完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および５ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０）中で培養するのが適切である。適切な抗原ペプチドを加えた抗原提示細胞によってＴ細胞活性化シグナルが供給される。
【０１１６】
ＩＬ−２のような発現タンパク質を測定する代わりに、公知の放射性標識法によって測定されるような、適切な方法で、抗原依存性Ｔ細胞の増殖の変化により、Ｔ細胞活性化の調節を決定することができる。例えば、標識化（トリチウム化）されたヌクレオチドを試験用培地に導入してもよい。このような標識化されたヌクレオチドのＤＮＡへの導入が、Ｔ細胞の増殖に関する測定量として使用される。この試験は、Ｔ細胞ハイブリドーマのような、その成長に抗原提示を必要としないＴ細胞には適さない。この試験は、哺乳類から単離された、形質転換されていないＴ細胞の場合に、Ｔ細胞活性化の調節を測定するのに適している。
【０１１７】
標的疾患に対するワクチン接種を可能にすることも含めた免疫応答を誘導する能力は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験によって容易に決定することができる。例えば、組成物をマウスのような哺乳類に投与し、最初の投与の時点、およびその後、定期的な間隔で数回にわたり（投与後、１、２、５および８週間というように）、その哺乳類から血液サンプルを採血することができる。血液サンプルから血清を獲得し、免疫化により生成した抗体の出現を試験する。抗体濃度を定量することが可能である。それに加えて、血液ないしリンパ性器官からＴリンパ球を単離し、抗原または抗原から誘導されたエピトープに対する反応性を機能的に試験してもよい。ここでは当業者に公知のすべての「読み出し（リードアウト）」系、特に増殖アッセイ、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、テトラマー解析を使用できる。
【０１１８】
核酸分子または核酸配列は、本発明によると、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸に関する。核酸は、本発明によると、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え分子および化学合成された分子を包含する。核酸は、本発明によると、一本鎖または二本鎖、および線状のまたは共有結合で閉環した分子であってよい。
【０１１９】
用語「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース基の２’−位に水酸基をもつヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡのような単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えＲＮＡ、ならびに、一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを包含する。そのような改変としては、ＲＮＡの末端またはその内部において、例えばＲＮＡの一つまたは複数のヌクレオチドにおいて非ヌクレオチド材料を付加することが含まれ得る。ＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天然には存在しないヌクレオチド、または化学合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドのような非標準的ヌクレオチドも包含することができる。この改変ＲＮＡは、アナログ体、または天然に存在するＲＮＡのアナログ体と呼ばれることがある。
【０１２０】
「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡを鋳型として使用しながら産生され、それ自体はペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。ｍＲＮＡは、典型的には、５’−非翻訳領域、タンパク質コード領域、および３’−非翻訳領域を含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびｉｎ ｖｉｔｒｏで、限られた半減期をもつ。本発明によると、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により鋳型ＤＮＡから作製することができる。
【０１２１】
本発明によると、ＲＮＡは、例えばＲＮＡの安定性および／またはＲＮＡの翻訳効率を高める改変を含んでいてもよい。したがって、ＲＮＡには、例えば、ポリ（Ａ）配列、特に開放末端（ｏｆｆｅｎ ｅｎｄｅｎｄｅｎ）のポリ（Ａ）配列が付与されていてもよい。開放末端のポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡは、遮蔽末端（ｖｅｒｄｅｃｋｔ ｅｎｄｅｎｄｅｎ）のポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡよりも効率よく翻訳されることが証明できた。さらに、長いポリ（Ａ）配列、特に約１２０ｂｐの配列が、ＲＮＡの転写産物安定性および翻訳効率の最適化をもたらすことが確認された。二重の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、特にヒトβグロビン遺伝子のＵＴＲが、ＲＮＡ分子内において、２つの単独のＵＴＲを用いた場合に期待される加法的効果を明らかに上回る翻訳効率の改善をもたらすことも証明できた。前記の改変の組み合わせが、ＲＮＡの安定化および翻訳の上昇に相乗的な影響を及ぼす可能性がある。このような改変は、ここでは参照により含まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８（特許文献３）に記載されており、本発明により考慮されている。
【０１２２】
本発明によると、好ましくは、ＲＮＡの改変、そしてそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の上昇が、好ましくはＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用される発現ベクターを遺伝子工学的に改変することによって達成される。
【０１２３】
そのようなベクターは、特に、ポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡの転写を可能にするべきであり、その際、ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＲＮＡ中で開放末端を示す、つまりＡヌクレオチド以外のいずれのヌクレオチドもポリ（Ａ）配列にその３’末端で隣接していない。ＲＮＡ中の開放末端ポリ（Ａ）配列は、５’に位置するＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にＲＮＡの転写を可能にし、そしてポリアデニルカセット（ポリ（Ａ）配列）を含む発現ベクター中に、タイプＩＩｓの制限酵素切断部位を導入することによって達成され、その際、認識配列はポリ（Ａ）配列の３’に位置し、切断部位は上流側に、したがってポリ（Ａ）配列内に存在する。タイプＩＩｓの制限酵素切断部位における制限酵素切断により、プラスミドの場合、ポリ（Ａ）配列内でプラスミドを直線化することが可能である。直線化されたプラスミドは、鋳型としてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用でき、生じる転写産物は遮蔽されていないポリ（Ａ）配列を末端にもつ。
【０１２４】
さらに、または別法として、本発明によると、２つ以上の３’非翻訳領域をその３’末端に、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間にもつＲＮＡの転写を可能にするように、発現ベクターを遺伝子工学的に改変することによって、ＲＮＡの改変、およびそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の上昇を達成することができる。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、本発明によると、ＲＮＡは、適切な鋳型ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られる。転写を制御するためのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ用のいかなるプロモーターでもよい。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７−、Ｔ３−、ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、本発明によると、Ｔ７−またはＳＰ６−プロモーターによって制御される。
【０１２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型ＤＮＡは、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、その核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したベクターに導入することによって製造される。
【０１２７】
本発明によると、用語「コードするＲＮＡ」は、抗原に関して、ＲＮＡが適切な環境、好ましくは細胞内にある場合に、抗原を産生するために発現可能であることを意味する。好ましくは、ＲＮＡは、それがコードする抗原を供給するために細胞の翻訳機構と相互作用する能力がある。
【０１２８】
本発明によると、ＲＮＡが複数の抗原を発現するという場合、ＲＮＡは、これら複数の抗原のうちの様々な抗原を発現する様々なＲＮＡ分子を含むことが可能である。しかしながら、本発明は、一つのＲＮＡ分子が、場合によっては互いに連結された様々な抗原を発現する場合も包含する。
【０１２９】
本発明によると、ＲＮＡを細胞内に導入するためには、細胞へのＲＮＡ導入に適したあらゆる技術を使用することができる。好ましくは、ＲＮＡは、標準技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、電気穿孔法、リポフェクション、およびマイクロインジェクションが含まれる。好ましくは、抗原をコードするＲＮＡを細胞に導入すると、細胞内での抗原の発現が引き起こされる。
【０１３０】
さらに、用語「核酸」は、ヌクレオチドの塩基、糖、またはホスフェートにおける核酸の化学的誘導体化、ならびに天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ体を含む核酸のような、核酸または核酸配列の誘導体も包含する。
【０１３１】
「核酸の３’末端」は、本発明によると、遊離の水酸基が存在する末端に関する。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、３’末端は常に右側に存在する。「核酸の５’末端」は、本発明によると、遊離のリン酸基が存在する末端に関する。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、５’末端は常に左側に存在する。
【０１３２】
５’末端 ５’−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３’ ３’末端
３’−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５’
【０１３３】
「機能的な連結」または「機能的に連結されている」は、本発明によると、機能的な関係での連結に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列と機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には、互いに隣接しており、場合によっては別の核酸配列によって隔てられている。
【０１３４】
本発明により記載される核酸は、好ましくは単離されている。用語「単離された核酸」は、本発明によると、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたこと、（ｉｉ）組換え技術でクローニングによって作製されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製されたこと、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作のために使用できる核酸である。
【０１３５】
本発明によると、「ある核酸配列から誘導された核酸配列」は、その核酸が誘導された元の核酸と比べて単独または多重のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、および／またはヌクレオチド付加が存在する核酸であり、その際、核酸間にはある程度の相同性が存在する、つまり、核酸どうしが、ヌクレオチドの配列順序の点で有意な直接的または相補的な一致を示す。ある核酸から誘導された核酸は、本発明によると、その核酸が誘導された元の核酸の機能特性を示す。そのような特性は、特に、核酸の発現産物の特性によって定義される。Ｆｌｔ３リガンドの場合は、特に、Ｆｌｔ３受容体に結合し好ましくは生物活性を示す、結合したＦｌｔ３受容体を介して細胞に刺激性シグナルを伝達する、および／またはワクチンＲＮＡと共に投与した場合にＲＮＡが引き起こす免疫応答を強化できる特性に関する。抗原の場合は、匹敵する特異性および／または反応性で免疫応答を惹起できる特性に関する。「ある核酸配列から誘導された核酸配列」の一例は、その核酸が誘導された元の核酸と比較して、例えば、ある特定の宿主生物またはある特定の宿主細胞中での発現が改善されるようにコドンが最適化された核酸である。
【０１３６】
ある核酸配列から誘導された配列、または用語「ある核酸配列から誘導された配列」は、好ましくは相同配列に関する。
【０１３７】
相同な核酸間の同一性の程度は、本発明によると、好ましくは、少なくとも７０％、特に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％である。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドの領域に関して記述される。好ましい実施形態では、同一性の程度が、配列プロトコルに挙げられる核酸配列のような参照用核酸の全長に関して記述される。
【０１３８】
用語「〜％同一性」は、最適なアラインメントにおいて、比較されるべき２つの配列間で同一のヌクレオチドのパーセント値を意味するもので、その際、このパーセント値は、純粋に統計的なものであり、２配列間の差異はランダムかつ配列の全長にわたり分布してよく、比較される配列は、２配列間で最適のアラインメントが達成されるように、参照用配列と比べて付加または欠失を含んでもよい。２配列間の配列比較は、一般的には、局所的な配列一致領域を同定するために、セグメントまたは「比較用ウィンドウ（Ｖｅｒｇｌｅｉｃｈｓｆｅｎｓｔｅｒ）」に関する最適アラインメントに基づきこれらの配列を比較することにより行なわれる。比較用の最適アラインメントは、手動で、またはSmithおよびWaterman、1981、Ads App. Math. 2、482（非特許文献３８）による局所相同性アルゴリズム、NeddlemanおよびWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443（非特許文献３９）による局所相同性アルゴリズム、PearsonおよびLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444（非特許文献４０）による類似性検索アルゴリズム、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ）を使用して行なうことができる。
【０１３９】
パーセントによる同一性は、比較される配列がその位置で一致する同一位置の数を求め、この数を、比較した位置数で割り、この結果を１００倍することで得られる。
【０１４０】
例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgiから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用してもよい。
【０１４１】
核酸は、特に、相補鎖の両配列が互いにハイブリダイズし、安定した二重構造をとることができる場合、別の核酸と「相同」であり、その際、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下（ストリンジェントな条件）でハイブリダイゼーションが行なわれる。ストリンジェントな条件は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrook et al.編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989（非特許文献４１）またはCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubel et al.編、John Wiley & Sons, Inc.、New York（非特許文献４２）に記載され、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中での６５℃におけるハイブリダイゼーションに関する。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡが転写された膜を、例えば、２ｘＳＳＣ中で室温におき洗浄してから、０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳ中で６８℃までの温度において洗浄する。
【０１４２】
パーセントによる相補性は、ある核酸中において、第２の核酸と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対により）を形成し得る連続ヌクレオチドのパーセント値を示す。相補性核酸は、本発明によると、好ましくは、少なくとも４０％、特に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相補性ヌクレオチドを示す。好ましくは、相補性ヌクレオチドは、完全に相補性であり、それは、すべての連続ヌクレオチドが第２の核酸中の同数の連続ヌクレオチドと水素結合することを意味する。
【０１４３】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセント値を示す。２ポリペプチド間または２核酸間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセント値を示す。
【０１４４】
核酸の「誘導体」とは、本発明によると、単独または多重のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、および／またはヌクレオチド付加が核酸中に存在することを意味する。さらに、用語「誘導体」は、ヌクレオチドの塩基、糖、またはホスフェートにおける核酸の化学的誘導体化も意味する。用語「誘導体」は、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ体を含む核酸も包含する。
【０１４５】
ある特定の核酸の誘導体には、特に、核酸の変異体、とりわけ、核酸のスプライス変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、特に天然の方法で発現されるようなものが含まれる。
【０１４６】
核酸は、本発明によると、スプライス変異体のような変異体に関して、それ自体公知の方法で分析することができる。スプライス変異体の分析技術には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロッティング、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１４７】
「ＲＮＡｓｅプロテクション」と呼ばれる技術もまた、選択的にスプライスされたｍＲＮＡを同定するために使用可能である。ＲＮＡｓｅプロテクションは、合成ＲＮＡへの遺伝子配列の転写を包含し、この合成ＲＮＡは、例えば別の細胞から誘導されたＲＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイズしたＲＮＡを、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのミスマッチを認識する酵素とインキュベートする。予想されるよりも小さい断片は、異なってスプライスされたｍＲＮＡが存在することを示す。異なってスプライスされたと推定されるｍＲＮＡは、公知の方法でクローニングし配列決定することができる。
【０１４８】
異なってスプライスされたｍＲＮＡを同定するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することもできる。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写酵素によりそれ自体公知の方法でｍＲＮＡがｃＤＮＡに変換される。次いでｃＤＮＡのコード配列全体が、３’非翻訳領域内にある順方向プライマー、および５’非翻訳領域内にある逆方向プライマーを用いてＰＣＲにより増幅される。増幅産物は、選択的スプライス型に関して、例えば、増幅産物のサイズを、正常にスプライスされたｍＲＮＡから予想される産物のサイズと、例えばアガロースゲル電気泳動によって比較することにより分析可能である。増幅産物サイズに関するいかなる変化も、選択的スプライシングを示す可能性がある。
【０１４９】
突然変異遺伝子から誘導されたｍＲＮＡも、選択的スプライス型を同定するための前記技術により容易に同定できる。したがって、例えば、遺伝子の対立型、およびそれにより産生される、本発明によると「変異体」と見なされるｍＲＮＡを同定することができる。
【０１５０】
核酸は、本発明によると、単独で、または、同種もしくは異種であってもよい別の核酸との組み合わせで存在することが可能である。特定の実施形態では、ある核酸は、本発明によると、その核酸に対して同種もしくは異種であってもよい発現制御配列と機能的に連結して存在する。用語「同種」は、ある核酸が、その核酸が組み合わされて存在する核酸と天然の様式で機能的に連結していることを意味し、用語「異種」は、ある核酸が、その核酸が組み合わされて存在する核酸と天然ではない様式で機能的に連結していることを意味する。
【０１５１】
転写可能な核酸、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸と発現制御配列は、転写可能な核酸、特にコードされた核酸の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下に置かれるように互いに共有結合されている場合には、「機能的に」互いに連結している。核酸が、機能ペプチドまたは機能タンパク質に翻訳される場合、発現制御配列がコード配列と機能的に連結していれば、コード配列内でのリーディングフレームのずれが生じることも、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されないこともなく、発現制御配列の誘導が、コード配列の転写をもたらす。
【０１５２】
用語「発現制御配列」は、本発明によると、プロモーター、リボゾーム結合配列、および、遺伝子の転写またはその遺伝子から誘導されたＲＮＡの翻訳を制御するその他の制御因子を包含する。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節可能である。発現制御配列の詳細な構造は、種または細胞型に応じて変わり得るが、一般的には、転写または翻訳の開始に関与するＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５’−非転写配列、および５’−および３’−非翻訳配列が含まれる。特に、５’−非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写を制御するためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流の適当なアクチベーター配列を含んでもよい。
【０１５３】
用語「プロモーター」または「プロモーター領域」は、遺伝子のコード配列の上流（５’）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および結合部位を提供することによりコード配列の発現を制御する、ＤＮＡ配列に関する。プロモーター領域は、遺伝子の転写調節に関与するさらなる因子用の別の認識部位または結合部位を含んでいてもよい。プロモーターは、原核生物または真核生物の遺伝子転写を制御できる。プロモーターは、「誘導可能」であり誘導剤に反応して転写を開始できるものでもよく、または転写が誘導剤によって制御されない場合は「構成的」であってもよい。誘導型プロモーターは、誘導剤が欠けている場合、全くまたはわずかな量しか発現されない。誘導剤の存在下で、遺伝子が「スイッチオン」され、または転写レベルが上昇する。これは、従来の方法により、特異的な転写因子の結合によって仲介される。
【０１５４】
本発明によると、好ましいプロモーターは、例えば、ＳＰ６−、Ｔ３−またはＴ７−ポリメラーゼ用のプロモーターである。
【０１５５】
用語「発現」は、本発明によると、そのきわめて一般的な意味で用いられ、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡおよびタンパク質の産生を包含する。この用語は、核酸の部分的発現も包含する。ＲＮＡに関しては、用語「発現」または「翻訳」は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性に起こっても、また安定に起こってもよい。
【０１５６】
タンパク質またはペプチドをコードする核酸は、本発明によると、あるペプチド配列をコードする別の核酸と連結して存在してよく、このペプチド配列は、例えば、核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの、宿主細胞からの分泌を制御し、または核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの免疫原性を高める。さらに、核酸は、本発明によると、コードされるタンパク質またはペプチドを宿主細胞の細胞膜に固定させる、またはこの細胞の特定の細胞小器官にそれをコンパートメント化させる、ペプチド配列をコードする別の核酸と連結して存在してもよい。
【０１５７】
同様に、レポーター遺伝子または任意の「タグ」である核酸との連結であることができる。
【０１５８】
用語「転写」は、本発明によると、ＤＮＡ配列中の遺伝コードがＲＮＡに転写されるプロセスであり、続いてＲＮＡはタンパク質に翻訳可能である。本発明によると、用語「転写」は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」を包含し、ここで、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞で、つまり好ましくは、相応に処理された細胞抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される方法に関する。好ましくは、転写産物を製造するためにクローニングベクターが使用され、このベクターは一般的には転写ベクターと呼ばれ、本発明によると、これも用語「ベクター」に含まれる。
【０１５９】
用語「翻訳」は、本発明によると、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組み合わせを制御してタンパク質またはペプチドを製造する、リボゾーム上でのプロセスに関する。
【０１６０】
３’非翻訳領域は、遺伝子の３’末端でタンパク質コード領域の終止コドンの下流に位置し、転写はされるもののアミノ酸配列には翻訳されない領域に関する。
【０１６１】
本発明によると、第１ポリヌクレオチド領域の５’末端が、第１ポリヌクレオチド領域のうち第２ポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近くにある部分である場合に、第１ポリヌクレオチド領域は、第２ポリヌクレオチド領域の下流に位置すると見なされる。
【０１６２】
３’非翻訳領域は、典型的には、翻訳産物の終止コドンから、通常の方法で転写プロセス後に付加されるポリ（Ａ）配列まで及ぶ。哺乳類ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的には、相同領域を示し、これはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知である。この配列は、おそらくポリ（Ａ）付加シグナルである。このシグナルは、ポリ（Ａ）付加部位から１０〜３０塩基上流に位置することが多い。
【０１６３】
３’非翻訳領域は、一つまたは複数の逆向きの繰り返しを含んでいてよく、この繰り返しは、ステムループ構造に折りたたまれることが可能であり、エキソリボヌクレアーゼへのバリアとして機能し、またはＲＮＡ安定性を高めることが公知であるタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用する。
【０１６４】
５’−および／または３’非翻訳領域は、本発明によると、転写可能な核酸と、特にコードされた核酸と機能的に連結していてよく、その結果、この領域は、転写可能な核酸から転写されるＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるようにその核酸と関係している。
【０１６５】
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、別の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。
【０１６６】
本発明によると、３’非翻訳領域またはそれから誘導された核酸配列を、ある遺伝子の３’非翻訳領域に挿入し、この挿入により、合成されるタンパク質の量が増加するかどうかを測定することによって、３’非翻訳領域またはそれから誘導された核酸配列がＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるかどうかを確定することができる。
【０１６７】
前記のことは、本発明によると核酸が２つ以上の３’非翻訳領域を含み、好ましくはそれらの３’非翻訳領域がその間にリンカーを挟んでまたは挟まずに連続して、好ましくは「ヘッド−テールの関係（Ｋｏｐｆ−ａｎ−Ｓｃｈｗａｎｚ−Ｂｅｚｉｅｈｕｎｇ）」（つまり、３’非翻訳領域が同じ向き、好ましくは核酸中で天然に存在する向きを示す）で連結されている場合にも同様に当てはまる。
【０１６８】
用語「遺伝子」は、本発明によると、一つまたは複数の細胞産物の産生および／または一つまたは複数の細胞間または細胞内機能の達成を担う、ある特定の核酸配列に関する。特に、この用語は、特定のタンパク質を、または機能性もしくは構造性ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡ断片に関する。
【０１６９】
用語「ポリアデニルカセット」または「ポリ（Ａ）配列」は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル残基配列に関する。本発明によると、そのような配列は、コード鎖と相補な鎖中の繰り返しチミジル残基をもとに、ＲＮＡ転写の際に鋳型ＤＮＡによって付加されることが企図されている。他方、通常は、そのような配列はＤＮＡ中にはコードされておらず、鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、転写後に細胞核内でＲＮＡの遊離３’末端に付加される。本発明によると、少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００の、そして好ましくは５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドがそのようなポリ（Ａ）配列と理解され、用語「Ａヌクレオチド」はアデニル残基を意味する。
【０１７０】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、ＤＮＡ分子の両鎖において特異的塩基配列内でホスホジエステル結合を切断する一群の酵素を意味する。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子上で、認識配列と呼ばれる特異的な結合部位を認識する。ＤＮＡ内のホスホジエステル結合が酵素によって切断される部位は、切断部位と呼ばれる。タイプＩＩｓの酵素では、切断部位は、ＤＮＡ結合部位から定められた間隔だけ離れた位置にある。用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、本発明によると、例えば、酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩを包含する。
【０１７１】
「半減期」は、分子の活性、量または数を半分だけ除去するのに必要とされる時間に関する。
【０１７２】
好ましい一実施形態では、核酸分子は、本発明によるとベクターである。用語「ベクター」は、ここでは、その最も一般的な意味で用いられ、例えば、原核生物および／または真核生物の宿主細胞に核酸を導入し、そして場合によってはゲノムに組み込むことを可能にする、核酸用のあらゆる仲介媒体を包含する。そのようなベクターは、好ましくは、細胞内で複製および／または発現される。ベクターには、プラスミド、ファージミド、またはウイルスゲノムが含まれる。ここで用いられる用語「プラスミド」は、一般的には染色体外の遺伝子材料からなるコンストラクトであり、通常は、染色体ＤＮＡに依存せずに複製できる環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１７３】
用語「宿主細胞」は、本発明によると、外来核酸で、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡで形質転換またはトランスフェクション可能なあらゆる細胞に関する。用語「宿主細胞」は、本発明によると、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物の細胞（例えば、哺乳類細胞、特にヒト由来の細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を包含する。特に好ましいのは、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、および霊長類由来の細胞のような哺乳類細胞である。細胞は、多数の組織型から誘導されたものでよく、初代細胞および細胞株も含まれる。特定の例としては、表皮細胞、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞がある。別の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞であり、ここでは、用語「抗原提示細胞」は、本発明によると、樹状細胞、単球、およびマクロファージを包含する。核酸は、宿主細胞中において唯一のまたは複数のコピーで存在してよく、一実施形態では宿主細胞内で発現される。
【０１７４】
用語「ペプチド」は、２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは８つ以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上で、そして好ましくは５０個まで、好ましくは１００個まで、または好ましくは１５０個までの連続する、ペプチド結合で相互に結合されたアミノ酸を含む物質に関する。用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸をもつペプチドに関するが、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ここでは一般的に同義語として用いられる。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本発明によると、アミノ酸成分のみならず糖およびリン酸構造のような非アミノ酸成分も含む物質を包含し、エステル結合、チオエーテル結合またはジスルフィド結合のような結合を含む物質も包含する。
【０１７５】
あるアミノ酸配列から誘導された配列、または用語「あるアミノ酸配列から誘導された配列」は、本発明によると、第1の配列の相同配列および誘導体に関する。
【０１７６】
あるアミノ酸配列から誘導された配列は、本発明によると、その配列が誘導された元のアミノ酸配列の機能特性を示す。Ｆｌｔ３リガンドの場合は、特に、Ｆｌｔ３受容体に結合し好ましくは生物活性を示し、結合したＦｌｔ３受容体を介して細胞に刺激性シグナルを伝達し、および／またはワクチンＲＮＡと共に投与した場合にＲＮＡが引き起こす免疫応答を強化することのできできる特性に関する。抗原の場合は、匹敵する特異性および／または反応性で免疫応答を惹起できる特性に関する。
【０１７７】
タンパク質またはポリペプチドまたはアミノ酸配列の「ホモログ」または「誘導体」は、本発明の趣旨においては、アミノ酸の挿入変異体、アミノ酸の欠失変異体および／またはアミノ酸の置換変異体を包含する。
【０１７８】
アミノ酸の挿入変異体は、ある特定のアミノ酸配列におけるアミノ末端および／またはカルボキシ末端側での融合、ならびに、単独または複数のアミノ酸の挿入を含んでいる。挿入を伴うアミノ酸配列変異体では、アミノ酸配列中のあらかじめ決められた位置に一つまたは複数のアミノ酸残基が導入されるが、生じた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸の欠失変異体は、配列から一つまたは複数のアミノ酸が除去されることを特徴とする。アミノ酸の置換変異体は、配列中の少なくとも１残基が除去され、その位置に別の１残基が挿入されることを特徴とする。好ましくは、アミノ酸配列中の、相同タンパク質または相同ペプチド間で保存されない位置で改変が生じる。好ましくは、アミノ酸が、疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の大きさなど類似の特性をもつ別のアミノ酸で置換される（保存的置換）。保存的置換は、例えば、アミノ酸が別のアミノ酸で交換されるものであり、その際、両方のアミノ酸とも以下で同一グループに挙げられているものである。
【０１７９】
１．小さな、非極性または弱極性の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな非極性の脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１８０】
３つの残基は、タンパク質構造に対するその特別な役割から括弧に入れてある。Ｇｌｙは、側鎖をもたない唯一の残基であり、したがって鎖に可撓性を与える。Ｐｒｏは、鎖を強く制限する特異な幾何形状をもつ。Ｃｙｓはジスルフィド結合を形成できる。
【０１８１】
前記のアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術、例えば「固相合成」（Merrifield、1964）および類似法により、または組換えＤＮＡ操作により容易に製造できる。公知または部分的に公知の配列をもつＤＮＡのあらかじめ定められた位置に置換変異を導入する技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３突然変異誘発が含まれる。置換、挿入または欠失をもつタンパク質を製造するためのＤＮＡ配列の操作、およびタンパク質を、例えば生物系（哺乳類系、昆虫系、植物系、およびウイルス系）で発現するための一般的な組換え法は、例えばSambrook et al.（1989）（非特許文献４１）に詳細に記載されている。
【０１８２】
タンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、本発明によると、そのタンパク質またはポリペプチドと結合している、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはポリペプチドなどあらゆる分子の単独または多重の置換、欠失、および／または付加も包含する。
【０１８３】
一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解的切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合によって生じる改変アナログ体を包含する。タンパク質またはポリペプチドの誘導体は、例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ２を用いた化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元のような別の方法によっても、またはツニカマイシン存在下に代謝合成することによっても製造できる。
【０１８４】
さらに、用語「誘導体」は、タンパク質またはポリペプチドのあらゆる機能性化学的等価物にも拡張される。
【０１８５】
ある特定のタンパク質またはペプチドの誘導体は、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾された変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、特に天然の方法で発現するようなものにも関する。
【０１８６】
本発明により記載されるタンパク質およびペプチドは、好ましくは単離されている。用語「単離タンパク質」または「単離ペプチド」は、タンパク質またはペプチドがその自然環境から単離されたことを意味する。単離タンパク質または単離ペプチドは、本質的に精製された状態で存在してよい。用語「本質的に精製された」とは、タンパク質またはペプチドが、天然またはｉｎ ｖｉｖｏでは結合している別の物質を本質的に含まないことを意味する。
【０１８７】
本発明により記載されるタンパク質またはペプチドは、組織ホモジネートまたは細胞ホモジネートのような生物サンプルから単離することができ、または多数の原核生物および真核生物発現系で発現させることができる。
【０１８８】
好ましくは、ここで記載されるアミノ酸配列とそのアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、または少なくとも約３００個の連続するアミノ酸領域に関して記述される。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照用アミノ酸配列の全長に関して記述される。
【０１８９】
アミノ酸配列の同一性に関しては、核酸配列の同一性に関して前記したことが、同様に当てはまる。
【０１９０】
タンパク質またはペプチドの一部分つまり断片、または誘導体は、本発明によると、好ましくは、それが誘導された元のタンパク質またはペプチドの機能特性を示す。そのような機能特性は、Ｆｌｔ３リガンドおよび抗原に関して先に述べたが、例えば、免疫反応性、特に抗体との相互作用、または別のペプチドもしくはタンパク質との相互作用がそれに含まれる。重要な特性は、ＭＨＣ分子もしくはＦｌｔ３受容体と複合体を形成する能力、および場合によっては、例えば細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞を刺激または阻害することにより免疫反応を起こすもしくは阻止する能力、または細胞反応を引き起こす能力である。タンパク質またはペプチドの一部分は、好ましくは、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個で、そして好ましくは８個まで、１０個まで、１２個まで、１５個まで、２０個まで、３０個まで、または５０個までの、タンパク質またはペプチドに由来する連続するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、タンパク質またはペプチドの一部は、本発明によると、完全なペプチドまたはタンパク質に由来する一つまたは複数のエピトープに関し、その際、複数のエピトープが、天然の結合状態で存在してもよく、または人工的、つまり天然には存在しない結合を示してもよく、つまり、エピトープが、例えば人工的リンカーによって互いに隔てられていてもよい。好ましくは、タンパク質またはペプチドの一部分は、本発明によると、患者における免疫応答の標的、特にエピトープであるような配列に関する。好ましい実施形態では、この配列は、抗体および／またはＴ細胞が仲介する免疫応答の標的である。本発明により使用されるペプチド、タンパク質または誘導体は、その上、抗体またはＴ細胞用のエピトープであるような配列を複数含んでいてもよい。
【０１９１】
タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部分つまり断片は、本発明によると、好ましくは、少なくとも、タンパク質またはペプチドおよび／または前記で定義されるような、タンパク質またはペプチドの一部分をコードする核酸部分に関する。タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部分は、好ましくは、オープンリーディングフレームに対応する核酸部分に関する。
【０１９２】
本発明により記載される医薬調製物および組成物は、既存の疾患を治療するために治療上、またはここに記載される疾患を阻止するための免疫化用のワクチンとして予防上、使用することができる。
【０１９３】
腫瘍関連抗原を抗原として使用する際に、例えばがんに対する免疫化作用の試験用に、動物モデルを使用することができる。その際、腫瘍を生み出すために、例えば、ヒトがん細胞をマウスに導入し、腫瘍関連抗原をコードするＲＮＡを含む、本発明の調製物または本発明の組成物を投与することが可能である。がん細胞に対する作用（例えば、腫瘍サイズの減少）を、免疫化の有効性の尺度として測定することが可能である。
【０１９４】
免疫化用組成物の一部分として、一つまたは複数のワクチンＲＮＡを、免疫応答を誘導するまたは高めるための一つまたは複数のアジュバントと共に投与することができる。
【０１９５】
患者の免疫応答を刺激する別の物質も投与可能である。例えば、リンパ球に対するその調節特性の故に、ワクチン接種の際に、サイトカインを使用することができる。そのようなサイトカインには、例えば、ワクチンの保護作用を強化することが示されたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（Science 268、1432〜1434頁、1995（非特許文献４３）を参照）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１８が含まれる。
【０１９６】
哺乳類で免疫応答を誘導するための本発明の方法は、一般的には、Ｆｌｔ３リガンドと共に投与すると、好ましくは予防上および／または治療上の免疫応答を引き起こす、ある量のワクチンＲＮＡを投与することを含む。
【０１９７】
用語「トランスフェクション」は、本発明によると、生物または宿主細胞への一つまたは複数の核酸の導入に関する。本発明によると、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入するためには、様々な方法が使用できる。そのような方法としては、核酸ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに結合した核酸のトランスフェクション、興味のある核酸を運ぶウイルスを用いたトランスフェクションまたは感染、リポソーム仲介トランスフェクションなどが含まれる。特定の実施形態では、特定細胞に核酸を導くことが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合されたターゲティング分子を有する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドのような分子を核酸担体に挿入するか結合させることが可能である。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、ターゲティングおよび／または取り込みを可能にするためには、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合しているタンパク質をリポソーム調合物に組み込んでもよい。そのようなタンパク質としては、ある特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、内在化するタンパク質に対する抗体、細胞内の部位をめざすタンパク質などが含まれる。
【０１９８】
本発明によると、核酸の投与は、ネイキッド核酸としてまたは投与用試薬と共に行うことができる。例えば、本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏでのターゲットリポソームを使用した核酸の投与も企図されている。
【０１９９】
核酸の投与には、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）またはヘルペスウイルスから誘導されたベクターなどが使用可能である。ウイルス性ベクターの向性は、別のウイルスからの外殻タンパク質または別の表面抗原によるベクターのシュードタイプにより、または様々なウイルスキャプシドタンパク質の置換により適切に改変できる。
【０２００】
リポソームは、ある特定の組織への核酸の供給を支援し、核酸の半減期を延ばすこともできる。本発明によると、適切なリポソームは、一般的には中性または負に荷電したリン脂質を含む標準の小胞形成脂質、およびコレステロールのようなステロールから形成される。脂質の選択は、一般的には、所望のリポソームサイズ、およびリポソームの半減期のような要因によって決定される。リポソームを調製する多数の方法が公知である。例えば、Szoka et al.（1980）、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9、467頁（非特許文献４４）、および米国特許第４，２３５，８７１号（特許文献４）、米国特許第４，５０１，７２８号（特許文献５）、米国特許第４，８３７，０２８号（特許文献６）、米国特許第５，０１９，３６９号（特許文献７）を参照のこと。
【０２０１】
特定の実施形態では、特定細胞に核酸を導くことが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合されたターゲティング分子を有する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を核酸担体に挿入するか結合させることが可能である。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、ターゲティングおよび／または取り込みを可能にするためには、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム調合物に組み込んでもよい。そのようなタンパク質としては、ある特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、内在化するタンパク質に対する抗体、細胞内の部位をめざすタンパク質などが含まれる。
【０２０２】
好ましくは、ＲＮａｓｅインヒビターのような安定化物質と共にＲＮＡを投与する。
【０２０３】
ポリペプチドおよびペプチドの投与は、それ自体公知の方法で行なうことができる。
【０２０４】
用語「患者」、「個体」または「生物」は、哺乳類に関する。例を挙げると、本発明に考慮される哺乳類は、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなどのようなペット、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどのような家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどのような実験動物、ならびに動物園で飼育されている動物のようなおりに入れられた動物である。ここで用いられるように、用語「動物」は、ヒトを含む。
【０２０５】
「高まった」、「増す」または「強化する」のような用語は、好ましくは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％の、あるいは非存在および／または検出不可能状態から存在および／または検出可能状態への上昇、増加、強化に関する。
【０２０６】
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、ここでは交換可能に用いられ、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞のような細胞溶解性Ｔ細胞を包含する。
【０２０７】
「減少する」または「阻害する」は、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の低下といった低下をもたらす能力に関する。
【０２０８】
Ｆｌｔ３リガンドを使用する免疫化プロトコルは、疾患または感染を予防および／または治療する目的で、Ｆｌｔ３リガンドとＲＮＡを、混合物中でまたは互いに別々に、場合によっては一つまたは複数の補助物質、ならびに別の付随する分子および／または調合物（希釈剤、担体、賦形剤など）と組み合わせて、生物に投与することに関する。Ｆｌｔ３リガンドおよびＲＮＡ、およびここで記載される他のあらゆる成分は、いかなる用量、順序、頻度、および時間的手順でも投与可能である。治療を最適化する目的で、このパラメータを当業者が通例通り変更してもかまわないことを当業者は認めるであろう。
【０２０９】
本発明による、ワクチンＲＮＡ、Ｆｌｔ３リガンドまたはその両方を含む医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な組成物中で投与される。そのような組成物は、通常、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝物質、保存料、担体、アジュバント（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサイトカインのような補助的な免疫増強物質、および場合によっては治療上の作用物質を含んでもよい。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、注射または注入を含めたあらゆる通常の方法で投与可能である。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、皮内、経皮、リンパ内に、好ましくはリンパ節、特に鼠径リンパ節、リンパ管および／または脾臓への注射によって行なうことができる。
【０２１１】
ＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドの投与は、互いに別々に、つまり異なる組成物により、または共通の組成物により行なってよい。投与が互いに別々に行なわれる場合、ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与は同時に、または異なる時点に行なってもよく、その際、ＲＮＡおよび／またはＦｌｔ３リガンドの投与は複数回行なってもよい。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与が異なる時点で行なわれる場合、投与間の時間間隔、あるいは複数回の投与の場合は、ＲＮＡまたはＦｌｔ３リガンドの最終投与と残りのそれぞれの成分の最初の投与との時間間隔は、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、５日以上、７日以上、または９日以上でよい。好ましくは、投与間の時間間隔は、２４時間、２日、４日、８日または１０日を超えない。好ましくは、ＲＮＡを投与する前にＦｌｔ３リガンドを投与する。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与が互いに別々に行なわれる場合は、ＲＮＡの投与は好ましくはリンパ内、さらに好ましくはリンパ節内に、そしてＦｌｔ３リガンドの投与は、好ましくは静脈内、腹腔内、筋内、皮下、皮内、または経皮、好ましくは腹腔内または皮下に行なわれる。
【０２１２】
本発明の組成物は、有効な量で投与される。「有効な量」は、単独でまたは別の用量と合わせて所望の応答または所望の作用を達成する量に関する。ある特定の疾患またはある特定の状態を治療する場合、所望の応答とは、病気の進行阻害に関するものである。それには、病気の進行減速、および特に病気の進行妨害が含まれる。ある疾患または状態を治療する際の所望の応答は、疾患または状態の発生の遅延でもまたは発生の阻止でもよい。
【０２１３】
本発明の組成物の有効量は、治療される状態、病気の重篤さ、患者の個々のパラメータ（年齢、生理状態、身長および体重を含む）、治療期間、付随治療の種類（付随治療がある場合）、特殊な投与法および類似の要因に依存する。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の応答または所望の作用を起こすために有効な量の有効物質を含む。
【０２１５】
本発明の組成物の投与量は、投与法、患者の状態、所望の投与期間などのような様々なパラメータに依存し得る。初期用量における患者の応答が不十分である場合には、より高い用量（または別の、強く局在化された投与法によって達成される実質的に高い用量）を使用することが可能である。
【０２１６】
一般的には、治療のため、または免疫応答を惹起または上昇するために、好ましくは、１ｎｇ〜７００μｇ、１ｎｇ〜５００μｇ、１ｎｇ〜３００μｇ、１ｎｇ〜２００μｇ、または１ｎｇ〜１００μｇの用量のＲＮＡを処方し投与する。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、一般的には、薬学的に許容可能な量かつ薬学的に許容可能な組成で投与される。そのような組成物は、通常の塩、緩衝物質、保存料、担体、および場合によっては治療上の作用物質を含んでいてもよい。医薬品中で使用する場合、塩は、薬学的に許容可能なものであるべきである。しかしながら、薬学的に許容されない塩を、その薬学的に許容可能な塩を調製するために使用してもよく、これも本発明に包含される。そのような薬理学的および薬学的に許容可能な塩としては、それだけに限定されるものではないが、以下の酸、つまり塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製してもよい。
【０２１８】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。用語「薬学的に許容可能な担体」は、本発明によると、一つまたは複数の、適合性のある固体または液体増量剤、希釈剤、またはヒトに投与する際に適したカプセル物質に関する。用語「担体」は、使用を容易にするために、その中で活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機成分または無機成分に関する。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の薬学的な効果を本質的に損なう相互作用が起こらないものである。
【０２１９】
好ましくは、担体は、無菌の液体、例えば水または油（石油、動物もしくは植物に由来するまたは合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ごま油、ヒマワリ油などを含む）である。塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も水性担体物質として使用可能である。
【０２２０】
補助物質および担体物質の例は、アクリル誘導体、メタクリル誘導体、アルギン酸、α−オクタデシル−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）−５−ソルビン酸のようなソルビン酸誘導体、アミノ酸およびその誘導体、特にコリン、レシチンおよびホスファチジルコリンのようなアミン化合物、アラビアゴム、矯味剤、アスコルビン酸；炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム；ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのリン酸水素塩およびリン酸塩、カルメロースナトリウム、ジメチコン、染料、調味料、緩衝物質、保存料、増粘剤、可塑剤、ゼラチン、グルコースシロップ、麦芽、高分散シリカ、ヒドロメロース、安息香酸塩、特に安息香酸ナトリウムおよびカリウム、マクロゴール、脱脂粉乳、酸化マグネシウム、脂肪酸ならびにその誘導体および塩、例えば、ステアリン酸およびステアリン酸塩、特にステアリン酸マグネシウムおよびカルシウム、脂肪酸エステルならびに食用脂肪酸のモノおよびジグリセリド、天然および合成ろう、例えば、蜜ろう、黄ろうおよびモンタングリコールろう、塩化物、特に塩化ナトリウム、ポリビドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン；油、例えば、ヒマシ油、ダイズ油、ヤシ油、パーム核油；糖および糖誘導体、特に単糖および二糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、スクロース、デキストロースおよびセルロースならびにその誘導体、シェラック、デンプンおよびデンプン誘導体、特にコーンスターチ；獣脂、タルク、二酸化チタン、酒石酸；糖アルコール、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールならびにその誘導体；グリコール、エタノールおよびその混合物である。
【０２２１】
また、医薬組成物は好ましくは、湿潤剤、乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤をさらに含んでもよい。
【０２２２】
さらなる一実施形態において、医薬組成物は吸収増強剤を含んでもよい。所望の場合、組成物中において等モル量の担体物質をこの吸収増強剤で置き換えてもよい。そのような吸収増強剤の例としては、それだけに限定されるものではないが、オイカリプトール、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、ポリオキシアルキレンアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ミリスチン酸イソプロピル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、尿素、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどが挙げられる（例えば、Percutaneous Penetration Enhancers, Smith et al.編 (CRC Press, 1995)（非特許文献４５）を参照）。組成物中の吸収増強剤の量は、達成しようとする所望の作用に依存し得る。
【０２２３】
ペプチドまたはタンパク質作用物質の分解を予防し、バイオアベイラビリティを高めるために、プロテアーゼインヒビターを本発明の組成物、特にＦｌｔ３リガンドを含む組成物に組み込むことができる。プロテアーゼインヒビターの例としては、それだけに限定されるものではないが、アプロチニン、ロイペプシン、ペプスタチン、α２マクログロブリンおよびトリプシンインヒビターが含まれる。これらのインヒビターは、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【０２２４】
本発明の医薬組成物には一つまたは複数のコーティングを施すことができる。好ましくは、固形経口剤形は、胃液に耐性のコーティングを施されるか、または胃液に耐性の硬化軟ゼラチンカプセルの形態にある。
【０２２５】
本発明の医薬組成物は、酢酸の塩、クエン酸の塩、ホウ酸の塩およびリン酸の塩のような適切な緩衝物質を含んでいてもよい。
【０２２６】
医薬組成物はまた、場合によっては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールのような適切な保存料を含んでもよい。
【０２２７】
医薬組成物は通常、単位剤形で提供され、それ自体公知の方法で製造することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジ、液剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤の形態であるか、または乳濁液であってもよい。
【０２２８】
通常、非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張の、水性または非水性の無菌調製物を含む。許容可能な担体および溶剤は、例えば、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常は、無菌の不揮発性油を溶解媒体または懸濁媒体として用いる。
【０２２９】
以下の実施例および図面により本発明を詳細に記載する。これらはもっぱら説明のためのものであり、限定と理解すべきでない。説明および実施例に基づいて、当業者は本発明の範囲および添付の請求項の範囲を逸脱しないさらなる実施形態に至ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３〜９）に１０μｇのＦｌｔ３Ｌを異なる時点（１日目〜３日目または１日目、１日目、３日目、または０日目、３日目）で腹腔内投与した。１０日目にリンパ節（ＬＫ）ならびに脾臓を調製し、細胞数を決定した。データは、リンパ節の平均細胞数＋標準誤差を示す。*：チューキーの多重比較検定においてｐ＜０．０５。
【図２】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に１０μｇのＦｌｔ３Ｌを２度（０日目、３日目）腹腔内投与した。１０日目に鼠径リンパ節を調製し、適切な抗体で細胞を染色し、樹状細胞の亜集団をフローサイトメトリーで定量した。データは、亜集団の平均細胞数＋標準誤差を示す。両側独立ｔ検定において*：ｐ＜０．０５および**：ｐ＜０．００１。
【図３】麻酔をかけたＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）にそれぞれ２０μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを２度（０日目、３日目）鼠径リンパ節に投与した。マウスに様々なアジュバントを投与した（ＭＰＬＡ ０日目＋３日目、２０μｇ皮下；Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ０日目＋３日目、２０μｇ皮下；アルダラクリーム ０日目＋３日目、５μｇ経皮；ＧＭ−ＣＳＦ −２日目、−１日目、１日目、２日目、５μｇ皮下；ＩＬ−２（プロロイキン）１日目〜６日目、８００００ＩＵ皮下；Ｆｌｔ３Ｌ ｄ−７とｄ−４、１０μｇ腹腔内）。８日目にマウスから採血し、ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーおよび抗ＣＤ８抗体で染色した後、フローサイトメトリーでエピトープ特異的Ｔリンパ球の頻度を定量した。データは、２度の実験によるテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の平均頻度＋標準誤差を示す。チューキーの多重比較検定において*：ｐ＜０．０５および**：ｐ＜０．００１。
【図４】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）に１０μｇのＦｌｔ３ＬまたはＩｇＧ４を２度（０日目、３日目）腹腔内投与した。７日目と１０日目に、麻酔をかけたマウスにそれぞれ２０μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを鼠径リンパ節に投与した。１５日目に脾臓および鼠径リンパ節を調製した。（ａ）ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーおよび抗ＣＤ８抗体で染色した後、フローサイトメトリーでエピトープ特異的Ｔリンパ球の頻度を定量した。示したデータは、テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の平均数および平均頻度＋標準誤差を表す。（ｂ）ＩＦＮ−γを産生するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔリンパ球を測定するために、脾臓細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは対照ペプチドと共に６時間インキュベートした。１．５時間後にブレフェルジンＡを添加した［１０μｇ／ｍｌ］。サンプルを固定・透過処理後、抗ＣＤ８抗体および抗ＩＦＮγ抗体で染色した。示したデータは、非特異的なバックグラウンドを差し引いた、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度＋標準誤差を表す。*：両側独立ｔ検定においてｐ＜０．０５。（ｃ）典型的なドットプロット。記載のパーセントは、テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球のそれぞれの頻度を示す。
【図５】（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に１０μｇのＣｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（赤色）または純粋なＣｙ３リボヌクレオチド（対照）をリンパ節内注入した。５分後および３０分後にそれぞれリンパ節標本を作成し、パラホルムアルデヒドで固定し、薄切した。対照リンパ節が最小限のバックグラウンドを示すのに対して、他方は細胞のＲＮＡシグナルが認められ、そのシグナルは５分から３０分へと明瞭になる。それは、細胞間に存在するＲＮＡの破壊に起因する。（ｂ）ヒト未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｃｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（５μｇ、赤色）およびＦＩＴＣ−デキストラン（１μｇ／μｌ、緑色）と１０分間コインキュベートし、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。時間動特性は、ＲＮＡがＦＩＴＣ−デキストランと最大限に共局在しながら、最初は細胞周辺部に局在し、次いで小胞が細胞質全体に見られるようになり、最後により大きい構造に合流する様子を示す。
【図６】（ａ）ヒトｉＤＣ（ｎ＝３）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な温度においてルシフェラーゼＲＮＡ（２０μｇ）と１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。その結果は、能動的エネルギー消費プロセスを示唆する。（ｂ〜ｃ）ヒトｉＤＣを様々なインヒビター（ジメチルアミロリド、サイトカラシンＤ、ＬＹ２９４００２、ロットレリン）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。特異性の高いマクロ飲作用インヒビター、ロットレリンにより９０％を超えるまでのＲＮＡ取り込み阻害が起こることが示された。（ｄ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの鼠径リンパ節をｉｎ ｖｉｖｏでロットレリン（１０μｌ［１０μＭ］）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡ（１０μｇ）をリンパ節内注入した。マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏでの阻害後、リンパ節でのＲＮＡ取り込みは劇的に低下した。（ｅ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に、０日目および３日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ節内投与し免疫化した。どちらの日にも、リンパ節を前記のようにロットレリンで前処理した。８日目に、末梢血中のテトラマー測定により免疫化の成功を定量的に確認した。リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化の成功は、マクロ飲作用により細胞がＲＮＡを取り込む能力と直接の相関関係にある。*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１；***、ｐ＜０．００１；（ＡＮＯＶＡとチューキーの多重比較検定）。
【図７】（ａ〜ｄ）ヒト（ａ、ｃ）およびマウス（ｂ、ｄ）樹状細胞を様々な薬剤（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４０Ｌ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）、成熟用混合物（ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１０００Ｕ／ｍｌ））で４０時間成熟化させた。その後、細胞をルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。Ｃｙ３−ＲＮＡ取り込みを定量するために、細胞を、ＲＮＡとのインキュベーションから０．５時間後に洗浄し固定した。続いて、Ｃｙ３が仲介する蛍光を免疫蛍光顕微鏡を用いて定量した（Ｔｉｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ４．０、Ｔｉｌｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）。ｉＤＣの成熟後、ＲＮＡの取り込みは９０％超低下した。（ｅ）Ｐｏｌｙ Ｉ：ＣがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）にＰＢＳまたはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μｇ）を皮下注射し、２時間または２４時間後にルシフェラーゼＲＮＡをリンパ節内投与した。２４時間後に、標準的な生物発光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。アジュバント投与後の時間間隔に応じて、ＲＮＡ取り込みの激しい低下が起こる。*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１；***、ｐ＜０．００１；（ＡＮＯＶＡとチューキーの多重比較検定）。（ｆ）Ｆｌｔ３−ＬがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）を、０日目と３日目に、Ｆｌｔ３−Ｌ１０μｇで腹腔内処理し、対照群では処理しなかった。１０日目にルシフェラーゼＲＮＡ２０μｇをマウスにリンパ節内投与した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光によりルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｆｌｔ３−Ｌ投与は、リンパ節でのＲＮＡ取り込みを阻害する作用を示さない。
【図８】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に、０日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、またはヒトＩｇＧ４を腹腔内投与した。１０日目にマウスリンパ節を調製し、フローサイトメトリーで特徴づけた。樹状細胞（ＤＣ（マーカー：ＣＤ１１ｃ＋／ＮＫ１．１−））、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ４−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（マーカー：ＣＤ１９＋／ＣＤ３−／ＮＫ１．１−）。
【図９】ナイーブなＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７）に、０日目、３日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））、またはヒトＩｇＧ４を腹腔内投与した。７日目、１０日目には、このマウスにＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ内投与し免疫化した。対照群は処理しなかった（ｎ＝２）。 １５日目に、ＭＨＣ多量体測定を使用して、末梢血から抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度を測定した。
【図１０】マウス血清中Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４ の時間動特性（ｚｅｉｔｋｉｎｅｔｉｋ）。（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、２０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。半減期は、２．１４日（＝５１時間）である。（ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。半減期は、１．６６７日（＝４０時間）である。
【図１１】Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療のためのワクチン接種。Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種の併用の相乗作用を調べるために、治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１０μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１１日目、１４日目、１７日目、２４日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。マウス生存率のカプラン・マイヤープロットを示す。マウスは、腫瘍直径が一つの軸方向で＞１．５ｃｍの場合に屠殺した。
【図１２】Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療のためのワクチン接種。腫瘍成長に関する検査。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１０日目、１４日目、１８日目、２１日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。腫瘍接種の後定期的に（７日目、１０日目、１３日目、１６日目、１９日目、２２日目）腫瘍体積を求めた。腫瘍接種後日数［日数］における平均腫瘍体積［ｍｍ３］を示す。
【実施例】
【０２３１】
実施例１
この実施例および以下の実施例で使用した組換えヒトＦｌｔ３リガンドは、ＩｇＧ４との融合タンパク質として調製し、配列番号６の配列を有する。そのために、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターにクローニングした。作成されたプラスミドをリポフェクションによりＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｒ． ＣＲＬ−１５７３）にトランスフェクトした。上清を集め、プロテインＡカラム（ＧＥ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により製造元の記載に従って精製した。産物をＰＢＳで透析し、等量に分け、使用するまで凍結した。
【０２３２】
ヒトＦｌｔ３リガンドの投与がＲＮＡベースの免疫化の効率に及ぼす影響をテストするために、まずマウスモデルで、リンパ節および脾臓の細胞組成の変化を調査した。そのために、組換えＦｌｔ３−Ｌの様々な投与レジメン（２ｘ、３ｘ、５ｘ１０μｇ）を腹腔内投与し、最初の注入から１０〜１２日後に細胞数（Ｚｅｌｌｕｌａｒｉｔａｅｔ）を決定した。マウス系に関する文献に記載されているように、脾臓およびリンパ節で細胞数の増加を示すことができた（図１）（Lyman, S.D. et al. (1994) Blood 83、2795〜2801頁（非特許文献４６）、Hannum, C. et al. (1994) Nature 368、643〜648頁（非特許文献４７）、Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁（非特許文献４８））。さらに、マウスおよびヒトに関して発表されたデータと一致して、Ｆｌｔ３−Ｌを様々な用量で投与すると樹状細胞が増加することが示された（図２）（Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁（非特許文献４８）、McNeel, D.G. et al. (2003) Journal of Clinical Immunology 23、62〜72頁（非特許文献４９）、Freedman, R.S. et al. (2003) Clinical Cancer Research 9、5228〜5237頁（非特許文献５０）、Maraskovsky, E. et al. (2000) Blood 96、878〜884頁（非特許文献５１））。脾臓およびリンパ節中の樹状細胞のすべての関連する亜集団についてこの増加を示すことができた（図２）。
【０２３３】
実施例２
以下では、様々な公知のアジュバント（アルダラ、モノホスホリルリピッドＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＬ２）およびＦｌｔ３−Ｌが、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後に、末梢血でのナイーブＴ細胞のプライミングおよびその頻度にどのように影響するかを調査した。このために、アジュバントを皮下投与または腹腔内投与し（詳細は図３のキャプションを参照）、３日おきに２度、Ｈ−２Ｋｂ拘束ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープをコードするＲＮＡでマウスを免疫化した。２度目の免疫化から５日後に、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、血中のテトラマー測定により定量した。意外なことに、この分析により、Ｆｌｔ３−Ｌを除くすべてのアジュバントはＴ細胞プライミングの効率を低下させることが示された（図３）。ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡの投与の設定におけるアジュバントの使用に関しては、前述の研究のみがこれまで発表されており、その中では、ＲＮＡ皮内注射後のＧＭ−ＣＳＦの投与のみが、ＲＮＡ注射に先立つ投与とは対照的にＲＮＡ単独注射と比べて利点をもたらすことが示された（Carralot, J.P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献５２））。このデータは、ＧＭ−ＣＳＦがＲＮＡ免疫化前（−４８時間、−２４時間）に投与された、我々の実験と一致する。その上、我々のデータによりはじめて、既成のアジュバントは傾向的にＴ細胞プライミング効率を悪化させるのに対して、Ｆｌｔ３−Ｌは有意な上昇を誘導することが示される（図３）。最後の免疫化から７日目の末梢血を材料としたさらなるテトラマー分析は、似かよった結果を示す（データは示さない）。
【０２３４】
実施例３
さらなる実験では、ヒトＦｌｔ３−Ｌの投与が、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後に、別の器官（脾臓）においても抗原特異的機能性Ｔ細胞の頻度を有意に上昇させることを証明できた。このために、０日目と３日目に、それぞれ１０μｇのＦｌｔ３−ＬまたはヒトＩｇＧ４をマウスに腹腔内注射した。次いで、７日目と１０日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを用いてリンパ節内免疫化を行なった。１５日目に、テトラマー測定および細胞内サイトカイン測定により、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を定量した（図４）。その際、テトラマー定量化により、Ｆｌｔ３−Ｌで前処理した群における、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の有意な上昇が示された（脾臓：８．２％対２．５％）。機能レベルでは、これらの細胞はＩＦＮγを分泌する能力ももつことが示された（図４）。さらなる調査は、２ｘ１０μｇ用量を超えるＦｌｔ３−Ｌの用量上昇が免疫応答の強化を伴わないことを示した（データは示さない）。
【０２３５】
実施例４
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に１０μｇのＣｙ３蛍光標識されたＲＮＡまたは純粋なＣｙ３リボヌクレオチド（対照）をリンパ節内注入した。５分後および３０分後にリンパ節標本を作成し、パラホルムアルデヒド固定後にクリオスタット切片を免疫蛍光顕微鏡で評価した。図５に示す典型的な切片は、対照リンパ節における最小限のバックグラウンド、および細胞のＲＮＡシグナル（赤色）を示し、そのシグナルは５分から３０分へと明瞭になる。これは、細胞間に存在するＲＮＡの破壊に起因する。
【０２３６】
さらに、ヒト未成熟樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（５μｇ、赤色）およびＦＩＴＣ−デキストラン（１μｇ／μｌ、緑色）と１０分間コインキュベートし、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。時間動特性は、ＲＮＡがＦＩＴＣ−デキストランと最大限に共局在しながら、最初は細胞周辺部に局在し、次いで小胞が細胞質全体に見られるようになり、最後により大きい構造に合流する様子を示す。
【０２３７】
したがって、ネイキッドＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも細胞に取り込まれることが証明できた。
【０２３８】
実施例５
いくつもの公知のアジュバントについてアジュバント作用の欠如という現象を詳細に調査した。
【０２３９】
ネイキッドＲＮＡ（つまり液体、例えばＰＢＳに溶解）が、例えばリンパ節に注入後、ほとんど樹状細胞によってのみ取り込まれることを確認した。その際、この取り込みは非常に効率がよい。取り込まれたＲＮＡは続いて翻訳される。
【０２４０】
ネイキッドＲＮＡ の取り込みプロセスを特徴づけるために、ヒトｉＤＣ（ｎ＝３）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な温度においてルシフェラーゼＲＮＡ（２０μｇ）と１５分間コインキュベートした。さらに２２時間３７℃で培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡ の取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。図６（ａ）に示す結果は、能動的エネルギー消費プロセスを示唆する。
【０２４１】
ｉＤＣ中で保存的に活性なマクロ飲作用がネイキッドＲＮＡの取り込みに重要であるかを調査するために、ヒトｉＤＣを様々なインヒビター（ジメチルアミロリド、サイトカラシンＤ、ＬＹ２９４００２、ロットレリン）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。さらに２２時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡの取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。Ｃｙ３−ＲＮＡ（赤色）とコインキュベートしたｉＤＣを、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。特異性の高いマクロ飲作用インヒビター、ロットレリンにより９０％超までのＲＮＡ取り込み阻害が起こることが示された。図６（ｂ〜ｃ）を参照。
【０２４２】
マクロ飲作用が、リンパ節におけるＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの重要な取り込み機構でもあるかどうかを解明するために、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの鼠径リンパ節をロットレリン（ｎ＝４、１０μＭ）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡ（１０μｇ）をリンパ節内注入した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光シグナルを測定した。図６（ｄ）には平均値＋標準誤差を示す。マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏ阻害後、リンパ節でのＲＮＡ取り込みが劇的に低下することを証明できた。
【０２４３】
マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏ阻害が、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後のＴ細胞プライミング効率に影響するかどうかを調査するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に、０日目および３日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ節内投与し免疫化した。どちらの日にも、リンパ節を前記のようにロットレリンで前処理した。ＣＤ８＋抗原特異的Ｔリンパ球の頻度の平均値＋標準誤差を示す。リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化の成功は、マクロ飲作用により細胞がＲＮＡを取り込む能力と直接の相関関係にあることを証明できた。図６（ｅ）を参照。
【０２４４】
ＲＮＡを取り込む主要取り込み機構はマクロ飲作用である。例えば、マクロ飲作用を阻害する化学物質（例えばロットレリン）でマクロ飲作用を阻害すると、ワクチン作用はほぼ完全に失われる。
【０２４５】
実施例６
次に、マクロ飲作用のダウンレギュレーションを伴う、ｉＤＣの成熟が、ＲＮＡの取り込みをどの程度低下させるかを調査した。結果を図７に示す。
【０２４６】
ヒト（図７（ａ、ｃ））およびマウス（図７（ｂ、ｄ））樹状細胞を様々な薬剤（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４０Ｌ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）、成熟用混合物（ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１０００Ｕ／ｍｌ））で４０時間成熟化させた。その後、細胞をルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。さらに２２時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡの取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。Ｃｙ３−ＲＮＡ（赤色）とコインキュベートしたｉＤＣを、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。Ｃｙ３蛍光の定量化でもルシフェラーゼアッセイでも、ｉＤＣの成熟後、ＲＮＡの取り込みが９０％超低下することが示された。このデータは、ＤＣの成熟はマクロ飲作用をダウンレギュレーションさせることを示す発表データと一致する。
【０２４７】
成熟させるアジュバントがｉｎ ｖｉｖｏでもどの程度ＲＮＡの取り込みを低下させるかを調査するために、Ｐｏｌｙ Ｉ：ＣがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果をテストした。図７（ｅ）を参照のこと。このために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）にＰＢＳまたはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μｇ）を皮下注射し、２時間または２４時間後にルシフェラーゼＲＮＡをリンパ節内投与した。さらに２４時間たってから、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光を測定した。平均値＋標準誤差を示す。アジュバント投与後の時間間隔に応じて、ＲＮＡ取り込みの激しい低下が起こることを証明できた。このデータは、ＤＣの完全な成熟化には約２４時間が必要とされるという観察と一致する。
【０２４８】
それとは対照的に、Ｆｌｔ３−Ｌ投与は、リンパ節でのＲＮＡ取り込みを阻害する作用を示さない。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）を、０日目と３日目に、Ｆｌｔ３−Ｌ１０μｇで腹腔内処理し、対照群では処理しなかった。１０日目にルシフェラーゼＲＮＡ２０μｇをマウスにリンパ節内投与した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光によりルシフェラーゼシグナルを測定した。図７（ｆ）は、個々の各マウスの測定結果を示す。バーは、一群の全測定値の平均値を示す。この実験は、３つの独立した実験を代表するものである。統計：スチューデントのｔ検定。
【０２４９】
さらに、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３〜７）にＦｌｔ３Ｌを２度（０日目と３日目に、それぞれ１０μｇ）投与した。１０日目にリンパ節の標本を作製し、樹状細胞の活性化状態（ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０）をフローサイトメトリーで決定した。Ｆｌｔ３Ｌ投与は、リンパ節内の樹状細胞を成熟化させないことが証明できた。
【０２５０】
実施例７
様々なＦｌｔ３Ｌがリンパ節の細胞組成に及ぼす影響
この実験では、マウスリンパ節の様々な細胞集団に及ぼす影響に関して、市販のＦｌｔ３調製物と共に、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−ＩｇＧ４）を調査した。市販のＦｌｔ３調製物としては、細菌内で組換え発現された産物（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｆｌｔ３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびヒトＨＥＫ２９３細胞で発現された産物（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ Ｆｌｔ３Ｌ、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社、Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ、Ｕ.Ｓ.Ａ）を使用した。対照としてはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【０２５１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、０日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、またはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腹腔内投与した。１０日目にマウス鼠径リンパ節の両方ともを調製し、細胞数をノイバウアーチャンバ（Ｎｅｕｂａｕｅｒｋａｍｍｅｒ）でカウントし、細胞集団をフローサイトメトリーで特徴づけた。
【０２５２】
様々な細胞集団を以下のマーカー組み合わせにより定義した：樹状細胞（ＤＣ（マーカー：ＣＤ１１ｃ＋／ＮＫ１．１−）、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ４−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（マーカー：ＣＤ１９＋／ＣＤ３−／ＮＫ１．１−）。表面マーカーを検出するための抗体は、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から取り寄せた。図８には、樹状細胞（全ＤＣ）、ＣＤ４ 陽性、ＣＤ８ 陽性およびＣＤ１９ 陽性細胞の頻度を、リンパ節の調製された細胞の総数に対して示す。
【０２５３】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４によって引き起こされる効果は、市販のＦｌｔ３Ｌ産物によって誘導される効果に類似することが示された。樹状細胞の増殖に関して、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４と Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社のＦｌｔ３Ｌとは高い類似性を示し、この点でＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社のＦｌｔ３Ｌは、わずかな能力しか示さなかった。リンパ球集団の増殖に関しては、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の効果が傾向的には最も著しかった。
【０２５４】
実施例８
様々なＦｌｔ３ＬがナイーブＴ細胞の刺激に及ぼす影響
この実験では、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４のアジュバント機能が市販のＦｌｔ３Ｌ産物とどの程度同等であるかを調査した。このために選ばれたのは、細菌内で組換え発現された産物（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｆｌｔ３Ｌ）、およびヒトＨＥＫ２９３細胞で発現された産物（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ Ｆｌｔ３Ｌ）であった。例７を参照のこと。対照としてはヒトＩｇＧ４を使用した。
【０２５５】
ナイーブなＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７）に、０日目、３日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、またはＦｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、またはＦｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））、またはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ社）を腹腔内投与した。７日目、１０日目にこのマウスにＳＩIＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ内投与し免疫化した。対照群は処理しなかった（ｎ＝２）。１５日目に、ＭＨＣ多量体測定（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して、末梢血から抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度をフローサイトメトリーで測定した。
【０２５６】
Ｆｌｔ３Ｌを、等モル量でマウスに腹腔内投与した（０日目、３日目）。加えて、マウスに２度、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡをリンパ節内投与し免疫化した（７日目、１０日目）。１５日目にテトラマー染色により、免疫化の成功をフローサイトメトリーで定量した。
【０２５７】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４も市販のＦｌｔ３Ｌ産物も明らかなアジュバント効果をもつことが示された。免疫化されなかった対照群は、テトラマー陽性Ｔ細胞の有意な頻度を示さなかった。Ｆｌｔ３Ｌを投与せずに免疫化されたマウスと比べて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度は、２〜３倍に上昇した。傾向的には、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を使用した際に最も強力な効果が観察できた（図９）。
【０２５８】
実施例９
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４ の血清半減期の算定
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の血清半減期を算定するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）の２群に、２０μｇまたは５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。我々のコンストラクトではヒトＩｇＧ４ がＦｌｔ３Ｌに融合されているため、マウス血清中のヒトＩｇＧを定量することでＦｌｔ３Ｌ濃度を算出することができる。データは、初期最大値に続き、Ｆｌｔ３Ｌが注入から５日後までマウス血清中に検出可能であることを示す。算出された半減期は、５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の場合４０時間であり、２０μｇの半減期（ＨＷＺ）は５１時間である。
【０２５９】
これらの値は、Ｆｌｔ３Ｌの半減期として発表された値５時間（Robinson et al.、2003、BMT、31、361〜369頁（非特許文献５３））と比べると、ＩｇＧ４ 融合部分を伴わないＦｌｔ３Ｌに対してＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の安定性が上昇していることを示す（図１０）。
【０２６０】
実施例１０
Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療上のワクチン接種
Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種との併用の相乗作用を調べるために、治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した（Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁（非特許文献５４））。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１０μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１１日目、１４日目、１７日目、２４日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。
【０２６１】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４とリンパ節内へのＲＮＡワクチン接種との併用は相乗的に作用することが示された。Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を伴わないＲＮＡワクチン接種では１／３のマウスしか長期的に生存しないのに対して、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４との組み合わせにより、長期的に生存するマウスの割合は約８０％に上昇することができる。ＲＮＡワクチン接種を伴わないＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４は、腫瘍成長に対して最小の治療効果を示し、１０％の動物の長期生存しかもたらさない（図１１）。
【０２６２】
実施例１１
Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療上のワクチン接種
Ｆｌｔ３ＬとＲＮＡワクチンの併用投与の相乗効果を証明するために、さらにもう一つの治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した（Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁（非特許文献５４））。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１０日目、１４日目、１８日目、２１日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４（Ｆｌｔ３Ｌ）を投与した。腫瘍接種後の以下の日に腫瘍体積を求めた：ｄ７、ｄ１０、ｄ１３、ｄ１６、ｄ１９およびｄ２２（ｄ＝日）。
【０２６３】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４とリンパ節内へのＲＮＡワクチン接種との併用は相乗的に作用することが示された。Ｆｌｔ３Ｌを単独で投与すると、腫瘍成長のわずかな遅延しか見られず、ＲＮＡワクチンを単独接種した場合も、減速はしたものの進行性の腫瘍成長があった。Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種を組み合わせてはじめて腫瘍成長の完全な停止が認められた（図１２）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ、特に、例えば感染症またはがんのような悪性疾患に関連する一つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡを使用することによる、ワクチン接種および免疫刺激の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、非特異的免疫も特異的免疫も示すことができる。一般的に、特異的免疫はＢリンパ球およびＴリンパ球によって起こり、これらのリンパ球はその細胞表面に、ある特定の抗原に対する特異的受容体を有する。免疫系は、異なる抗原に対して二通りの仕方で応答することができる。つまり、（ｉ）Ｂ細胞の刺激および抗体または免疫グロブリンの産生を含む体液性免疫、および（ｉｉ）該して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も含めたＴ細胞を含む、細胞関与性免疫である。
【０００３】
抗原特異的なＴ細胞応答は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の糖タンパク質の結合溝に結合する抗原ペプチドによって、免疫系機構の一部として引き起こされ、それにより外来抗原が同定され、外来抗原に対する反応が起こる。結合した抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体と反応し、免疫応答を調節する。抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパク質結合溝の多型性残基によって形成される、特定の「結合ポケット」に非共有結合で結合している。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体の糖タンパク質である。この分子のα１ドメインとβ２ドメインが一緒にフォールディングされ、ペプチド結合溝を形成する。抗原ペプチドは、ペプチド上のアンカーアミノ酸とα１ドメインおよびβ１ドメインとの相互作用によってＭＨＣ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とは異なるドメイン構造をもつが、一般的に、膜ドメインから離れた位置にあるペプチド結合部位または結合溝を有する類似した構造をもつ。
【０００５】
外来タンパク質抗原を提示する際の最初のステップは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのネイティブ抗原の結合である。ＡＰＣに結合後、食作用、受容体仲介エンドサイトーシス、または飲作用のいずれか一つにより抗原が細胞内に侵入する。このような、取り込まれた抗原は、エンドソームと呼ばれる膜結合性細胞内小胞上に局在する。エンドソームとリソソームとの融合後、リソソーム中の細胞プロテアーゼによって抗原は小ペプチドにプロセシングされる。ペプチドは、このリソソーム内でＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖およびβ鎖と結合する。前もって粗面小胞体で合成されていたこのＭＨＣクラスＩＩ分子は、順にゴルジ体へ、続いてリソソームコンパートメントへ輸送される。Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化するために、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＡＰＣの表面上に提示される。
【０００６】
非特異的免疫は、マクロファージまたは顆粒球による食作用およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の活性など、様々な細胞および機構を包含している。非特異的免疫は、進化上あまり進歩していない機構に基づいており、特異的免疫応答の重要な特徴である、特異性および記憶能に関する諸性質を有していない。
【０００７】
組換えワクチンは、感染症およびがん疾患の予防および治療用の作用物質および医薬品として人間医学および獣医学において特に重要である。組換えワクチンによる予防接種の目的は、特定の疾患に対して予防上または治療上有効な特異的免疫応答を、ある同定された抗原に対して誘導することである。
【０００８】
プラスミドＤＮＡの直接筋注が、コードされる遺伝子の、細胞表面上での長期的発現をもたらすことが示されて以来（Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247、1465〜1468頁（非特許文献１））、ＤＮＡベースのワクチンは、新たな、将来性のある免疫化戦略であるように思われてきた。これらの観察は、核酸ベースのワクチンを開発するための重要な刺激であった。まず最初に、感染性病原体に対するＤＮＡベースのワクチンが試されたが（Cox, G.J. et al. (1993) J. Virol. 67、5664〜5667頁（非特許文献２）、Davis, H.L. et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2、1847〜1851頁（非特許文献３）、Ulmer, J.B. (1993) Science 259、1745〜1749頁（非特許文献４）、Wang, B. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90、4156〜4160頁（非特許文献５））、間もなく腫瘍に対する遺伝子療法においても特異的な抗腫瘍免疫性を誘導するためにさらに研究がなされた（Conry, R. M. et al. (1994) Cancer Res. 54、1164〜1168頁（非特許文献６）、Conry, R.M. et al. (1995) Gene Ther. 2、59〜65頁（非特許文献７）、Spooner, R.A. et al. (1995) Gene Ther. 2、173〜180頁（非特許文献８）、Wang, B. et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6、407〜418頁（非特許文献９））。腫瘍免疫のこの戦略は一連の決定的な利点をもつ。核酸ベースのワクチンは、製造の点で容易であり、比較的低コストである。その上、核酸ベースのワクチンは少数の細胞から増幅することができる。
【０００９】
ＤＮＡはＲＮＡよりも安定であるが、抗ＤＮＡ抗体の誘導（Gilkeson, G. S. et al. (1995) J. Clin. Invest 95、1398〜1402頁（非特許文献１０））および宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込みなど、安全性に対するいくつかの潜在的なリスクを抱えている。これにより、細胞性遺伝子の不活性化、導入遺伝子の無制御長期発現、または腫瘍誘発が起こりかねず、それゆえ、例えばｅｒｂ−Ｂ２（Bargmann, C.I. et al. (1986) Nature 319、226〜230頁（非特許文献１１））、およびｐ５３（Greenblatt, M.S. et al. (1994) Cancer Res. 54、4855〜4878頁（非特許文献１２））などの、発がん能をもつ腫瘍関連抗原については一般的に使用できない。この潜在的なリスクを回避するためには、ＲＮＡの使用が興味をそそる代案を提供する。
【００１０】
可逆的な遺伝子療法の一種としてのＲＮＡの利点には、一過性発現および非形質転換特性が挙げられる。ＲＮＡは、トランスジェニックに発現するために核に到達する必要がない上、宿主ゲノムに取り込まれることもできないため、腫瘍誘発のリスクがない。ＤＮＡと同様に（Condon, C. et al. (1996) Nat. Med. 2、1122〜1128頁（非特許文献１３）、Tang, D.C. et al. (1992) Nature 356、152〜154頁（非特許文献１４））、ＲＮＡを注入することによっても細胞性免疫応答も体液性免疫応答もｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができる（Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁（非特許文献１５）、Ying, H. et al. (1999) Nat. Med. 5、823〜827頁（非特許文献１６））。
【００１１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅ＲＮＡを用いた免疫療法については、２つの異なる戦略がとられ、その両方が異なる動物モデルにおける試験で成功を収めることができ、ヒトではじめて使用された。
【００１２】
樹状細胞（ＤＣ）がリポフェクションもしくは電気穿孔法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡでトランスフェクションされてから投与されるか（Heiser, A. (2000) J. Immunol. 164、5508〜5514頁（非特許文献１７））、またはＲＮＡが様々な免疫経路で直接注入される（Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁（非特許文献１５）、Granstein, R.D. et al. (2000) Journal of Investigative Dermatology 114、632〜636頁（非特許文献１８）、Conry, R.M. (1995) Cancer Research 55、1397〜1400頁（非特許文献１９））。ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣによる免疫化がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的なＣＴＬを誘導することが証明できた（Su, Z. (2003) Cancer Res. 63、2127〜2133頁（非特許文献２０）、Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁（非特許文献２１））。ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞を腫瘍ワクチンとして使用する最初の臨床データは、２００１年と２００２年のものであり、腫瘍患者において抗原特異的T細胞が誘導可能であることを証明できた（Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁（非特許文献２１）、Rains, N. (2001) Hepato-Gastroenterology 48、347〜351頁（非特許文献２２））。患者へのＲＮＡの直接皮内注射に関しては、これまでに黒色腫患者のフェーズＩ／ＩＩ治験の最初のデータがある（Weide, B. (2008) Journal of Immunotherapy 31、180〜188頁（非特許文献２３））。ここでは、ネイキッドＲＮＡ注入の安全性およびわずかな毒性が示された。ＧＭ−ＣＳＦ投与後のＴＨ−１免疫性の改善を示した前臨床データをもとに、ＧＭ−ＣＳＦがアジュバントとして使用された（Carralot, J. P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献２４））。しかしながら、治療を受けた黒色腫患者において臨床的な効果は見られなかった。
【００１３】
それゆえ、その発現が免疫応答を刺激するタンパク質抗原をコードするＲＮＡで細胞を一過性にトランスフェクトするために、ＲＮＡワクチンを使用することができる。この抗原の細胞内での産生、および内在性の経路によるそのプロセシングに基づき、ＲＮＡワクチンは、体液性免疫、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生しながらのＴ細胞免疫を引き起こす。
【００１４】
上記の性質により、ＲＮＡは臨床での使用に特に適しているように思われる。しかしながら、特に、細胞質内でのＲＮＡの半減期の短さゆえ、ＲＮＡの使用はきわめて制限される。というのも、酵素によって分子が迅速に分解されるため、わずかなタンパク質発現しかもたらさないからである。したがって、作用物質としてのＲＮＡの免疫原能を増幅することが大きな関心の的である。
【００１５】
予防接種の作用を増強するために、以前からアジュバントが使用されている（Aguilar, J.C. et al. (2007) Vaccine 25、3752〜3762頁（非特許文献２５）、Chiarella, P. et al. (2007) Expert Opinion on Biological Therapy 7、1551〜1562頁（非特許文献２６））。ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、またはモノホスホリルリピッドＡのような様々な作用物質が、前臨床研究および初期臨床研究においてすでに、腫瘍ワクチン接種戦略の枠内で、その効力に関して研究されてきた（Speiser, D.E. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115、739〜746頁（非特許文献２７）、Cui, Z.R. et al. (2006) Cancer Immunology Immunotherapy 55、1267〜1279頁（非特許文献２８）、Jaffee, E.M. (2001) Journal of Clinical Oncology 19、145〜156頁（非特許文献２９）、Shackleton M. et al. (2004) Cancer Immunity 4、9〜20頁 （非特許文献３０）、Neidhart, J. et al. (2004) Vaccine 22、773〜780頁（非特許文献３１））。ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞によるワクチン接種後の免疫応答を強化するために、前臨床研究では様々なアジュバント（ＩＬ−１２、ＣＤ４０−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、４−１ＢＢＬ）がコトランスフェクトされた（Dannull, J. et al. (2005) Blood 105、3206〜3213頁（非特許文献３２）、Bontkes, H.J. et al. (2007) Gene Therapy 14、366〜375頁（非特許文献３３）、Grunebach, F. (2005) Cancer Gene Therapy 12、749〜756頁（非特許文献３４））。別法として、二重鎖ＲＮＡ（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）も抗原をコードするＲＮＡと共にコトランスフェクトされた（Michiels, A. (2006) Gene Therapy 13、1027〜1036頁（非特許文献３５））。
【００１６】
ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡによるワクチン接種に関連したアジュバントの使用についての研究の枠内で、これまではＧＭ−ＣＳＦの皮下投与のみが試験され、それは前臨床研究においてＴＨ−１免疫性の誘導をわずかに高めた（Carralot, J. P. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献２４））。ネイキッドＲＮＡの直接投与の枠内で使用されるアジュバントに課される要件は、ペプチドベース、ＤＮＡベースまたは細胞ベースワクチンの枠内で使用されるアジュバントに対する要件とは根本的に異なる。その原因は、細胞外空間から細胞内にＲＮＡを取り込むための機構にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，５５４，５１２号
【特許文献２】米国特許第６，２９１，６６１号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８
【特許文献４】米国特許第４，２３５，８７１号
【特許文献５】米国特許第４，５０１，７２８号
【特許文献６】米国特許第４，８３７，０２８号
【特許文献７】米国特許第５，０１９，３６９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247、1465〜1468頁
【非特許文献２】Cox, G.J. et al. (1993) J. Virol. 67、5664〜5667頁
【非特許文献３】Davis, H.L. et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2、1847〜1851頁
【非特許文献４】Ulmer, J.B. (1993) Science 259、1745〜1749頁
【非特許文献５】Wang, B. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90、4156〜4160頁
【非特許文献６】Conry, R. M. et al. (1994) Cancer Res. 54、1164〜1168頁
【非特許文献７】Conry, R.M. et al. (1995) Gene Ther. 2、59〜65頁
【非特許文献８】Spooner, R.A. et al. (1995) Gene Ther. 2、173〜180頁
【非特許文献９】Wang, B. et al. (1995) Hum. Gene Ther. 6、407〜418頁
【非特許文献１０】Gilkeson, G. S. et al. (1995) J. Clin. Invest 95、1398〜1402頁
【非特許文献１１】Bargmann, C.I. et al. (1986) Nature 319、226〜230頁
【非特許文献１２】Greenblatt, M.S. et al. (1994) Cancer Res. 54、4855〜4878頁
【非特許文献１３】Condon, C. et al. (1996) Nat. Med. 2、1122〜1128頁
【非特許文献１４】Tang, D.C. et al. (1992) Nature 356、152〜154頁
【非特許文献１５】Hoerr, I. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30、1〜7頁
【非特許文献１６】Ying, H. et al. (1999) Nat. Med. 5、823〜827頁
【非特許文献１７】Heiser, A. (2000) J. Immunol. 164、5508〜5514頁
【非特許文献１８】Granstein, R.D. et al. (2000) Journal of Investigative Dermatology 114、632〜636頁
【非特許文献１９】Conry, R.M. (1995) Cancer Research 55、1397〜1400頁
【非特許文献２０】Su, Z. (2003) Cancer Res. 63、2127〜2133頁
【非特許文献２１】Heiser, A. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109、409〜417頁
【非特許文献２２】Rains, N. (2001) Hepato-Gastroenterology 48、347〜351頁
【非特許文献２３】Weide, B. (2008) Journal of Immunotherapy 31、180〜188頁
【非特許文献２４】Carralot, J. P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁
【非特許文献２５】Aguilar, J.C. et al. (2007) Vaccine 25、3752〜3762頁
【非特許文献２６】Chiarella, P. et al. (2007) Expert Opinion on Biological Therapy 7、1551〜1562頁
【非特許文献２７】Speiser, D.E. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115、739〜746頁
【非特許文献２８】Cui, Z.R. et al. (2006) Cancer Immunology Immunotherapy 55、1267〜1279頁
【非特許文献２９】Jaffee, E.M. (2001) Journal of Clinical Oncology 19、145〜156頁
【非特許文献３０】Shackleton M. et al. (2004) Cancer Immunity 4、9〜20頁
【非特許文献３１】Neidhart, J. et al. (2004) Vaccine 22、773〜780頁
【非特許文献３２】Dannull, J. et al. (2005) Blood 105、3206〜3213頁
【非特許文献３３】Bontkes, H.J. et al. (2007) Gene Therapy 14、366〜375頁
【非特許文献３４】Grunebach, F. (2005) Cancer Gene Therapy 12、749〜756頁
【非特許文献３５】Michiels, A. (2006) Gene Therapy 13、1027〜1036頁
【非特許文献３６】Steinman, R.M.、Annu. Rev. Immunol. 9、271〜296頁 (1991)
【非特許文献３７】Shimonkevitz, R. et al.、1983、J. Exp. Med. 158、303頁
【非特許文献３８】SmithおよびWaterman、1981、Ads App. Math. 2、482
【非特許文献３９】NeddlemanおよびWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443
【非特許文献４０】PearsonおよびLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444
【非特許文献４１】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrook et al.編、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献４２】Current Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubel et al.編、John Wiley & Sons, Inc.、New York
【非特許文献４３】Science 268、1432〜1434頁、1995
【非特許文献４４】Szoka et al.（1980）、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9、467頁
【非特許文献４５】Percutaneous Penetration Enhancers, Smith et al.編 (CRC Press, 1995)
【非特許文献４６】Lyman, S.D. et al. (1994) Blood 83、2795〜2801頁
【非特許文献４７】Hannum, C. et al. (1994) Nature 368、643〜648頁
【非特許文献４８】Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁
【非特許文献４９】McNeel, D.G. et al. (2003) Journal of Clinical Immunology 23、62〜72頁
【非特許文献５０】Freedman, R.S. et al. (2003) Clinical Cancer Research 9、5228〜5237頁
【非特許文献５１】Maraskovsky, E. et al. (2000) Blood 96、878〜884頁
【非特許文献５２】Carralot, J.P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁
【非特許文献５３】Robinson et al.、2003、BMT、31、361〜369頁
【非特許文献５４】Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、ＲＮＡワクチンを投与する際に、免疫刺激の程度を増強させる薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この課題は、本発明において、各請求項の対象によって解決される。
【００２１】
本発明は、抗原提示細胞の細胞質ゾルへのＲＮＡの取り込みをサポートする、および／またはワクチンＲＮＡを投与する際により効果的な免疫応答を起こすことができる、化合物を記載することによってこの必要に対応する。
【００２２】
本発明者等は、ワクチン接種および治療に使用可能な抗原をコードするＲＮＡ分子を、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）の投与とともに投与すると、この抗原に特異的な免疫応答を効果的に起こせることを確認した。
【００２３】
本発明によると、公知の様々なアジュバントは、ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡを用いた直接免疫化後にＴ細胞プライミング効果を上昇させないのみならず、傾向的にはＴ細胞の応答を低下させることが確認された。この知見は、意外であり、抗原提示細胞へのＲＮＡの取り込みに及ぼすアジュバントの影響によってしか説明できない。ここで問題となるのは、本発明者によってはじめて記載される方法で長鎖リボ核酸の取り込みをつかさどる機構である。この取り込み機構は、様々なアジュバントによって、その効果が阻害される。Ｆｌｔ３リガンドのみが、ＲＮＡ免疫化において有意なアジュバント効果を示すことができた。ここで示す研究は、特に、抗原をコードするＲＮＡと一緒にＦｌｔ３リガンドを投与した際に、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大幅な増加を確認できたことを示す。
【００２４】
本発明は、概して、細胞へのワクチンＲＮＡの供給に関する。特に、本発明は、（ヒトも含めた）動物に投与する際に免疫応答を誘導、惹起または強化するために、ワクチンＲＮＡとＦｌｔ３リガンドを共に使用することに関する。
【００２５】
本発明によると、Ｆｌｔ３リガンドは、好ましくはＲＮＡワクチンと共に使用する際に、ＲＮＡワクチンの使用によって産生される特異的抗原に対する動物の免疫応答を強化する。この調合物中で使用される典型的なワクチンは、インフルエンザワクチン、ヘルペスワクチン、サイトメガロウイルスワクチン、ＨＩＶ−１ワクチン、ＨＴＬＶ−１ワクチン、ＦＩＶワクチンなどのウイルス性ワクチン、細菌性ワクチン、がんワクチン、および寄生虫ワクチンである。
【００２６】
好ましくは、本発明によると、Ｆｌｔ３リガンドと、抗原をコードするＲＮＡとを動物に導入することにより、動物が免疫化される。ＲＮＡは、動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞または別の細胞）に取り込まれる。ＲＮＡの抗原性翻訳産物が形成され、この産物が場合によってはプロセシングされ、主要組織適合遺伝子複合体との関連の下で細胞によって提示され、その結果、この抗原に対する免疫応答が起こる。つまり、ＲＮＡは翻訳の際に抗原を産生する。
【００２７】
特定の実施形態では、ＲＮＡワクチンの投与前、投与と同時、および／または投与後にＦｌｔ３リガンドを投与する。好ましくは、ＲＮＡワクチンの投与前にＦｌｔ３リガンドを投与する。
【００２８】
一態様では、本発明は、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを含む免疫原性調製物に関する。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドは、本発明の免疫原性調製物において、共通の組成物、つまり混合物として存在してもよい。さらに、本発明によると、ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドが共通に存在するものの同一組成物中には存在しない実施形態も企図される。そのような実施形態は、特に、少なくとも２つの容器を備え、一つの容器にはＲＮＡを含む組成物を収容し、別の容器にはＦｌｔ３リガンドを含む組成物を収容した、キットに関するものである。
【００２９】
本発明の免疫原性調製物においては、ＲＮＡは好ましくはｍＲＮＡである。好ましくは、ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られたものである。
【００３０】
本発明の免疫原性調製物は、さらに、ＲＮＡを安定化するためのＲＮアーゼインヒビターなど少なくとも一つのＲＮＡ安定化因子を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の免疫原性調製物は、好ましくは、治療上の使用のために調合された調製物である。本発明によると、用語「治療上の使用」は、疾患の治療または予防を包含する。この態様では、本発明は、本発明の免疫原性調製物を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
典型的には、本発明の免疫原性調製物、または本発明の医薬組成物は、さらに溶媒、例えば水性溶媒またはＲＮＡ無傷性の維持を可能にするあらゆる溶媒；水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、ＣｐＧモチーフをもつオリゴヌクレオチド、または当業者に公知の他のあらゆるアジュバントなどのアジュバント；および、プロタミンなどのあらゆる安定化剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な希釈剤、および／または薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。
【００３３】
さらに、一つまたは複数の別のアジュバントの添加により本発明の調製物の免疫原性を高めることが可能である。さらに、本発明の免疫原性調製物のＲＮＡを、カチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性化合物、例えばカチオン性またはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質と複合化することによって安定化させることが可能である。本発明の免疫原性調製物の好ましい一実施形態によると、ＲＮＡと複合化するペプチドまたはタンパク質は、プロタミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、またはヒストンである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、生物のワクチン接種に適した形態で存在する。
【００３５】
好ましくは、本発明の免疫原性調製物、または本発明の医薬組成物、または少なくともそのうちのＲＮＡを含む成分は、リンパ節内投与用の製剤の形態で存在する。
【００３６】
上記の調製物および組成物は、ここで記載される方法、特に免疫化法において使用可能である。
【００３７】
別の一態様では、本発明は、細胞を、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドと接触させることを含む、少なくとも一つの抗原を細胞に供給するための方法に関する。好ましくは、細胞は、生物中にｉｎ ｖｉｖｏで存在し、本方法は、この生物にＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドを投与することを含んでいる。好ましい一実施形態では、細胞は抗原提示細胞であり、さらに好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、またはマクロファージである。
【００３８】
この態様では、本発明は、細胞、特に抗原提示細胞、さらに好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、またはマクロファージ内のＭＨＣ／ペプチド複合体の量を増大させる方法であって、細胞を、ペプチドまたはそのペプチドを含む発現産物をコードするＲＮＡと接触させること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法にも関する。ペプチドを含む発現産物は、細胞によって好ましくはペプチドにプロセシングされる。
【００３９】
好ましくは、本方法はｉｎ ｖｉｖｏで行なわれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体量の増大が、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の一次活性化を増強する。
【００４０】
別の一態様では、本発明は、個体中において免疫応答を惹起または強化するための方法であって、免疫応答の対象となる抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法に関する。好ましくは、免疫応答は、個体に対して保護および／または治療作用を有し、好ましくは、抗原特異的なＴ細胞免疫応答を含む。
【００４１】
別の一態様では、本発明は、個体中における抗原特異的エフェクター細胞、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の量を増大させるための方法であって、抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む方法に関する。
【００４２】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、がんの予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき腫瘍抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてがんを予防および／または治療するための方法に関する。
【００４３】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、ウイルス感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべきウイルス抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてウイルス感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４４】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、細菌感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき細菌抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において細菌感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４５】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルを使用する、単細胞生物による感染の予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、免疫応答を向けさせるべき単細胞生物抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において単細胞生物による感染を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４６】
別の一態様は、アレルゲン特異的免疫療法と併せたＦｌｔ３リガンドの投与を含む、患者におけるアレルギーの予防および／または治療に関する。この態様では、本発明は、特に、アレルギーに関連するアレルゲンをコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中においてアレルギーを予防および／または治療するための方法に関する。
【００４７】
別の一態様は、Ｆｌｔ３リガンドの使用を含む免疫化プロトコルであって、ワクチンの有効性、抗原の免疫原性、または抗原および／またはワクチンに対する保護免疫応答が試験動物において検査および評価される、免疫化プロトコルに関する。
【００４８】
ここに記載される戦略を使用して疾患または感染を治療および／または予防することの利点は、とりわけ、組換え抗原のような弱免疫原性の抗原の免疫原性を高められること、使用される抗原またはその抗原をコードするＲＮＡの量を低下させることが可能であること、追加免疫のための要件が軽減されること、および免疫化の効率が高まることである。
【００４９】
ＲＮＡワクチンと共にＦｌｔ３リガンドを使用すると、通常は弱い免疫応答を引き起こす特定のウイルスタンパク質およびがん特異的抗原の免疫原性を強化することができる。このワクチン接種技術は、例えば、弱免疫原性ウイルスタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用できる。本発明のＲＮＡワクチンでは、タンパク質抗原は、血清抗体にさらされることが決してなく、トランスフェクトされた細胞自体によってｍＲＮＡの翻訳後に産生される。そのため、アナフィラキシーが問題となることはないはずである。したがって、本発明は、アレルギー反応のリスクなしに患者を繰り返し免疫化することを可能にする。
【００５０】
本発明の免疫化戦略は、ＲＮＡベースの免疫化後の抗原特異的Ｔリンパ球頻度の量的上昇も可能にする。この効率上昇は、臨床的有効性の向上という意味で、または同じ有効性におけるワクチン用量または投与頻度の軽減という意味で、患者の免疫療法に有用となり得る。
【００５１】
ＨＬＡトランスジェニックマウスでは、本発明による、ヒト腫瘍関連抗原をコードするＲＮＡワクチンを用いた免疫化により、ヒトＨＬＡ分子との関連の下で天然にプロセシングされたエピトープを認識する、Ｔ細胞クローンまたはＴ細胞受容体を単離することができる。本発明の免疫化戦略により、より高い確率で抗原特異的Ｔ細胞を産生することができる。さらに、本発明の免疫化戦略により、前駆体頻度が低い抗原特異的Ｔ細胞を大幅に増幅することも可能である。この効率上昇は、ナイーブなレパートリーで存在する抗原特異的Ｔ細胞を、より包括的に単離することを可能にする。さらに、記載される免疫化法による効率上昇はコスト削減を伴う。
【００５２】
本発明によると、動物から細胞を取り出し、その細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＦｌｔ３リガンド／ＲＮＡでトランスフェクトすることも企図されている。ＲＮＡを細胞内に導入し、ポリヌクレオチドの抗原性翻訳産物を形成させる。トランスフェクション後、抗原を発現する細胞を、好ましくは注入によって動物に導入すると、いまや内在性となった抗原に対して免疫系が応答することができ、免疫原に対する免疫応答が引き起こされる。本発明のこの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、好ましくは、リンパ球様細胞、特に動物から取り出された抗原提示細胞である。
【００５３】
動物由来の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトする場合、クラスＩ−ＭＨＣ分子ならびにクラスＩＩ−ＭＨＣ分子を含む細胞の供給源を提供するには、細胞の供給源は、全血から迅速に単離可能な末梢血細胞でよい。これらの細胞は、さらに、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、またはマクロファージ／単球に分画することもできる。骨髄細胞は、あまり分化していないリンパ球様細胞の供給源を提供することができる。
【００５４】
別の一態様では、本発明によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは生物中においてＴ細胞、特にＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球を刺激または活性化するための方法であって、Ｔ細胞を準備すること、またはＴ細胞が特異性をもつはずの少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを生物に投与することを含む方法が提供される。このような刺激または活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖、細胞傷害性の反応性、および／またはサイトカイン放出として現れる。
【００５５】
上記の方法は、特に、例えば細菌またはウイルスによって惹起される感染性疾患の治療または予防に適している。特定の実施形態では、本発明に従って使用される抗原は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、マイコバクテリウム属、マラリア病原体、ＳＡＲＳ病原体、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスなどの感染性病原体、またはクラミジア属およびマイコバクテリウム属などの細菌性病原体から誘導されたものである。本発明の特に有益な適用分野は、がん免疫療法またはがんワクチン接種にあり、その場合、特に、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞の活性化が高められ、その結果、腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫療法またはＴ細胞ワクチン接種の展望が改善される。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明に従って使用される抗原は、以下の抗原からなる群から選ばれる：ｐ５３ ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｓｓ−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−６、クローディン−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂＬ Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明によると、組換え核酸の作成、細胞の培養、および細胞への核酸の導入は、標準法を使用できる。酵素反応は、メーカの記載に基づき、またはそれ自体公知の方法で行なわれる。
【００５８】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」または「Ｆｌｔ３−Ｌ」は、「Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド」に関する。Ｆｌｔ３は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、未熟な造血前駆細胞によって発現される。Ｆｌｔ３のリガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質であり、造血細胞および骨髄間質細胞を含む多数の細胞によって発現される。別の成長因子と組み合わせると、このリガンドは、幹細胞、骨髄系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞、樹状細胞、およびＮＫ細胞を含む様々な細胞タイプの増殖および成長を刺激する。受容体の活性化は、造血細胞における増殖、生存、および他のプロセスを制御する様々なシグナル伝達経路に関与することが公知である様々な鍵になるアダプタータンパク質のチロシンリン酸化をもたらす。
【００５９】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、Ｆｌｔ３受容体に結合し、好ましくは、結合したＦｌｔ３受容体を介して刺激シグナルを細胞に伝達する生物活性を示す、あらゆる分子、特にペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００６０】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、細胞によって自然に発現される、またはＦｌｔ３リガンドをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、Ｆｌｔ３リガンドのあらゆる変異体、特にスプライス変異体、および翻訳後修飾された変異体、立体配座、アイソフォーム、および種ホモログを包含する。さらに、用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、組換えにより作成された、および作成可能なすべての形態のＦｌｔ３リガンドを包含する。
【００６１】
用語「Ｆｌｔ３リガンドをコードする核酸」は、好ましくは、（ｉ）配列プロトコルの配列番号３および４、（ｉｉ）（ｉ）に基づく核酸配列から誘導された配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に基づく核酸配列の一部からなる群から選ばれる核酸配列を含む核酸に関する。
【００６２】
Ｆｌｔ３リガンドは、好ましい一実施形態では、（ｉ）配列プロトコルの配列番号３および４、（ｉｉ）（ｉ）に基づく核酸配列から誘導された配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に基づく核酸配列の一部からなる群から選ばれる核酸配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を包含する。別の好ましい一実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは、配列プロトコルの配列番号１および２、それらの配列から誘導された配列、またはその配列の一部からなる群から選ばれるアミノ酸配列を包含する。
【００６３】
本発明に従って使用可能なＦｌｔ３リガンドの形態としては、それだけに限定されるものではないが、配列プロトコルの配列番号１および２、ならびにそれらの配列から誘導された配列を有するポリペプチドに示されるような、マウスおよびヒトに由来するＦｌｔ３リガンドが含まれる。
【００６４】
好ましくは、配列番号１および２に関する用語「それから誘導された配列」は、配列番号１および２に関して短縮され、主にタンパク質の細胞外部分を含む、配列に関するものである。このような配列は、好ましくは、膜貫通部分および細胞内部分を含まない。用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５５４，５１２号（特許文献１）および米国特許第６，２９１，６６１号（特許文献２）に記載されるようなポリペプチドを包含する。
【００６５】
Ｆｌｔ３リガンドの特に好ましい形態は、生物活性のある可溶型であり、特に細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一つまたは複数の断片を含む形態である。このような形態は、好ましくはＦｌｔ３リガンドの膜貫通部分および細胞内部分、つまり細胞質部分を含まない。Ｆｌｔ３リガンドの可溶型は、そのポリペプチドが発現される細胞から分泌可能なポリペプチドである。そのような型では、ポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメイン、またはその一部が欠失しているため、そのポリペプチドを発現する細胞から、ポリペプチドが完全に分泌される。ポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインは、本発明によると、配列情報を手がかりにそのようなドメインを決定するための公知の方法によって、それ自体公知の仕方で決定することができる。配列番号１に関しては、細胞内ドメインはアミノ酸２０６〜２３５と、膜貫通ドメインはアミノ酸１８５〜２０５または１８３〜２０５と定義できる。
【００６６】
ヒトＦｌｔ３リガンドは、配列番号１のアミノ酸１〜Ｘ、２７〜Ｘもしくは２８〜Ｘ、またはそれから誘導された配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよく、Ｘは１６０〜２３５のうちの一アミノ酸、好ましくは１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４または１８５である。
【００６７】
マウスＦｌｔ３リガンドは、配列番号２のアミノ酸１〜Ｙ、２７〜Ｙもしくは２８〜Ｙ、またはそれから誘導された配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよく、Ｙは１６３〜２３２のうちの一アミノ酸である。
【００６８】
可溶性ヒトＦｌｔ３リガンドの実施形態は、配列番号１の残基１〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１６０（両端を含む）、配列番号１の残基１〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１７９（両端を含む）、配列番号１の残基1〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１８２（両端を含む）、配列番号１の残基１〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基２８〜１８５（両端を含む）、配列番号１の残基１〜２３５（両端を含む）、配列番号１の残基２７〜２３５（両端を含む）、および配列番号１の残基２８〜２３５（両端を含む）のアミノ酸配列を包含する。
【００６９】
可溶性マウスＦｌｔ３リガンドの実施形態は、配列番号２の残基１〜１６３のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基２８〜１６３のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基１〜１８８のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基２８〜１８８のアミノ酸配列（両端を含む）、配列番号２の残基１〜２３２のアミノ酸配列（両端を含む）、および配列番号２の残基２８〜２３２のアミノ酸配列（両端を含む）を包含する。
【００７０】
用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、本発明によると、好ましくは共有結合による融合体の形で、一つまたは複数の異種ペプチドまたはタンパク質と連結され、場合によってはリンカーによって隔てられた、上記の配列を含む分子をも包含する。なお、ペプチドまたはタンパク質が天然ではない方式で配列と連結している場合には、ペプチドまたはタンパク質は、それが連結されている配列に対して異種である。例えば、天然Ｆｌｔ３リガンドから誘導された配列と、抗体から誘導された配列とは異種配列である。これら異種ペプチドまたはタンパク質は、例えば、上記配列の宿主細胞からの分泌を制御すること、上記配列を細胞内の特定の小器官にコンパートメント化すること、前記配列の安定性を高めること、および／または精製を可能にしまたは容易にすることができる。一実施形態では、異種ペプチドまたはタンパク質は、抗体、好ましくは抗体の重鎖、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２クラスの抗体、好ましくはＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、好ましくはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥから誘導されたものである。好ましくは、異種ペプチドまたはタンパク質は、抗体の定常領域から誘導され、好ましくはこの領域またはこの一部を含む。好ましくは、異種ペプチドまたはタンパク質は、配列番号５に示す配列またはそれから誘導された配列を含む。一実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは、本発明によると、配列番号６に示す配列またはそれから誘導された配列を含む。
【００７１】
さらに、用語「Ｆｌｔ３リガンド」は、本発明によると、ここで特に記載される配列から誘導されたアミノ酸配列を含むあらゆるポリペプチドを包含する。
【００７２】
用語「免疫応答」は、ここではその従来の意味で用いられ、体液性免疫および細胞性免疫を包含する。免疫応答は、抗原に対する抗体の発生、および様々な増殖試験またはサイトカイン産生試験によりｉｎ ｖｉｔｒｏで検出可能な抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、さらに好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖から選ばれる一つまたは複数の応答が起きることで明らかになる。
【００７３】
用語「免疫療法」は、特異的免疫応答の活性化に基づく治療に関する。
【００７４】
「保護する」、「予防の」、「保護用の」などの用語は、ここでは、生物における腫瘍または病原体の出現および／または増加の阻止または処置またはその両方を意味する。ワクチンの予防的投与は、腫瘍成長の起こり、または病原体による感染からレシピエントを守ることができる。ワクチンの治療的投与または免疫療法は、例えば、現存する腫瘍の蔓延または転移からレシピエントを守ることができ、あるいは現存する腫瘍の腫瘍量の低下を引き起こすことができる。
【００７５】
ここで用いられる抗原提示細胞またはＡＰＣは、タンパク質抗原のペプチド断片を、ＭＨＣ分子との関連の下でその細胞表面に提示する細胞である。多くのＡＰＣが抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【００７６】
ＡＰＣの例は、それだけに限定されるものではないが、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞などである。
【００７７】
用語「ＭＨＣ／ペプチド複合体」は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の結合ドメインと、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとの非共有結合性複合体に関する。
【００７８】
用語「ＭＨＣ結合ペプチド」または「結合ペプチド」は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しているペプチドに関する。クラスＩ−ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８〜１０アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドも有効となり得る。クラスＩＩ−ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０〜２５アミノ酸長、特に１３〜１８アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドも有効となり得る。
【００７９】
用語「主要組織適合遺伝子複合体」およびその略語「ＭＨＣ」は、あらゆる脊椎動物に現れる遺伝子複合体に関する。ＭＨＣタンパク質およびＭＨＣ分子は、通常の免疫応答におけるリンパ球と抗原提示細胞との間のシグナル伝達において、ペプチドと結合し、それをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が認識できるように提示することで機能を果たす。ＭＨＣ分子は、細胞内のプロセシングコンパートメントにおいてペプチドと結合し、このペプチドを、抗原提示細胞の表面上でＴ細胞に提示する。ＨＬＡとも呼ばれるヒトＭＨＣ領域は、第６染色体上に存在し、クラスＩ領域およびクラスＩＩ領域を含む。
【００８０】
用語「ＭＨＣクラスＩ」または「クラスＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩタンパク質またはクラスＩ遺伝子に関する。ＭＨＣクラスＩ領域内には、ヒトではＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−Ｅ−、ＨＬＡ−Ｆ−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１ｂ−、およびＣＤ１ｃ亜領域が存在する。
【００８１】
クラスＩのα鎖は、分子量約４４ｋＤａの糖タンパク質である。ポリペプチド鎖の長さは３５０アミノ酸残基よりいくぶん長い。このポリペプチド鎖は、３つの機能領域に分けることができ、つまり細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域である。細胞外領域は、２８３アミノ酸残基長であり、３つのドメイン、α１、α２およびα３に分けられる。これらのドメインおよび領域は、通常は、クラスＩ遺伝子の別々のエクソンによってコードされる。膜貫通領域は、原形質膜の脂質二重層を貫通する。膜貫通領域は、大部分は、αへリックスに配列される疎水性の２３個のアミノ酸残基からなる。細胞質領域、つまり細胞質側を向いた、膜貫通領域に隣接する部分は、典型的には３２アミノ酸残基長であり、細胞骨格の諸要素と相互作用する能力をもつ。α鎖は、β２−ミクログロブリンと相互作用し、細胞表面でα−β２−二量体を形成する。
【００８２】
用語「ＭＨＣクラスＩＩ」または「クラスＩＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩＩタンパク質またはクラスＩＩ遺伝子に関する。ＭＨＣクラスＩＩ領域内には、ヒトではクラスＩＩα鎖およびクラスＩＩβ鎖遺伝子のＤＰ−、ＤＱ−、およびＤＲ亜領域（つまりＤＰα、ＤＰβ、ＤＱα、ＤＱβ、ＤＲαおよびＤＲβ）が存在する。
【００８３】
クラスＩＩ分子は、それぞれα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体である。両鎖とも糖タンパク質であり、分子量３１〜３４ｋＤａ（α）または２６〜２９ｋＤａ（β）である。α鎖の全長は２２９〜２３３アミノ酸残基であり、β鎖の全長は２２５〜２３８残基である。α鎖もβ鎖も、細胞外領域、結合ペプチド、膜貫通領域、および細胞質側末端からなる。細胞外領域は、２つのドメイン、α１およびα２、またはβ１およびβ２からなる。結合ペプチドは、α鎖およびβ鎖でそれぞれ１３残基および９残基長である。結合ペプチドは、２番目のドメインを、α鎖においてもβ鎖においても２３アミノ酸残基からなる膜貫通領域と結びつける。細胞質領域、つまり細胞質側を向いた、膜貫通領域に隣接する部分の長さは、α鎖では、３〜１６残基であり、β鎖では８〜２０残基である。
【００８４】
用語「ＭＨＣ結合ドメイン」は、「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」および「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」に関する。
【００８５】
用語「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩ鎖の、抗原ペプチドへの結合に必要な領域に関する。ＭＨＣクラスＩ結合ドメインは、主に、ＭＨＣクラスＩα鎖のα１ドメインとα２ドメインによって形成される。α鎖のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンは、結合ドメインの必須部分ではないものの、おそらく、ＭＨＣクラスＩ分子の全体構造の安定化に重要であり、したがって、用語「ＭＨＣクラスＩ結合ドメイン」は好ましくはこの領域も含む。ＭＨＣクラスＩ結合ドメインは、本質的には、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞外ドメインとしても定義可能であり、それにより、膜貫通領域および細胞質領域から区別される。
【００８６】
用語「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ鎖の、抗原ペプチドへの結合に必要な領域に関する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメインは、主に、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびβ鎖のα１ドメインおよびβ１ドメインによって形成される。しかしながら、このタンパク質のα２ドメインおよびβ２ドメインも、おそらく、ＭＨＣ結合溝の全体構造の安定化に重要であり、したがって、用語「ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメイン」は、本発明によると好ましくはこの領域も含む。ＭＨＣクラスＩＩ結合ドメインは、本質的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外ドメインとしても定義可能であり、それにより、膜貫通領域および細胞質領域から区別される。
【００８７】
本発明によると、用語「抗原」は、少なくとも一つのエピトープを含むあらゆる分子を包含する。本発明によると、好ましくは、抗原は、場合によってはプロセシング後に、好ましくはこの抗原に特異的である免疫応答を引き起こし得る分子である。本発明によると、免疫応答を起こしそうなあらゆる適切な抗原が使用可能であり、その際、免疫応答は体液性のものでも細胞性でのものでもよい。本発明の実施形態では、抗原またはそのプロセシングされた形態が、好ましくは、ある細胞によってＭＨＣ分子との関連の下で提示され、その結果、抗原またはそのプロセシングされた形態に対して免疫応答が引き起こされる。
【００８８】
用語「抗原」は、特にタンパク質、ペプチド、核酸、特にＲＮＡ、ならびにヌクレオチドを包含する。抗原は、好ましくは、アレルゲン、ウイルス、細菌、菌類、寄生生物、他の感染性因子および病原体または腫瘍抗原から誘導された産物である。抗原は、本発明によると、天然に出現する産物、例えばウイルスタンパク質に対応するものでもよく、または、特に免疫原性を高めるために、特に配列の順序および／または長さを変化させる、さらなる配列を付加するまたは挿入するなどによって天然の産物から誘導したものでもよい。しかしながら、使用される抗原は、好ましくは、その抗原が誘導された元の天然物に対しても免疫応答を起こす。したがって、用語「抗原」は、本発明によると、タンパク質、ペプチド、多量体タンパク質、または多量体ペプチド、合成ペプチドなどの形で存在してもよいタンパク質全体またはペプチド全体のうちの免疫原性部分またはエピトープをも包含する。用語「免疫原性」は、抗原の、免疫応答を起こす相対的有効性に関する。
【００８９】
用語「抗原」は、誘導体化された抗原、つまり変換により（例えば、分子内で中間的に体内タンパクの補完により）はじめて抗原性に、および感作性に、なる二次的物質も包含する。
【００９０】
好ましい一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、つまり細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得るがん細胞の構成要素であり、特に細胞内に、または表面抗原として腫瘍細胞上に好ましくは多量に生じる抗原である。その例は、がん胎児性抗原、α１−胎児タンパク質、イソフェリチンおよび胎児硫酸糖タンパク質（Ｓｕｌｆｏｇｌｙｋｏｐｒｏｔｅｉｎ）、α２−Ｈ−フェロプロテイン（Ｆｅｒｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびγ−胎児タンパク質、および様々なウイルス腫瘍抗原である。別の一実施形態では、抗原は、ウイルスのリボ核タンパク質または外殻タンパク質（Ｈｕｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎｅ）のようなウイルス抗原である。特に、そのうちの抗原またはペプチドは、ＭＨＣ分子によって提示され、それにより、特にＴ細胞受容体の活性調節を介して、免疫系細胞、好ましくはＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球を調節、特に活性化することができ、その結果、好ましくはＴ細胞の増殖を誘発することになる。
【００９１】
本発明によると、腫瘍抗原としては、好ましくは、種類および／または量に関して、腫瘍またはがん、ないしは腫瘍細胞またはがん細胞に特徴的な、あらゆる抗原が含まれる。
【００９２】
Ｆｌｔ３リガンドは、アレルギーの治療においても使用可能である。ここに記載される、Ｆｌｔ３リガンドを使用する免疫化プロトコルは、アレルゲン特異的なアレルギー免疫療法において使用可能である。アレルゲン特異的免疫療法とは、原因となるアレルゲンにその後さらされることに伴う症状が鎮まった状態を達成するために、一つまたは複数のアレルギーをもつ生物に、アレルゲンワクチンを好ましくは用量を増加させながら投与することと定義される。Ｆｌｔ３リガンドを使用するアレルゲン特異的免疫療法の有効性は、患者に由来するアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体およびＩｇＥ抗体の測定など、公知の標準法により評価することができる。
【００９３】
免疫原とは、生物において免疫応答を誘導する抗原である。
【００９４】
本発明に従って使用される組成物は、ＲＮＡ分子がコードする抗原の種類および数に関して、限定されない。
【００９５】
本発明によると、定義された配列をもつ単独のＲＮＡ種を投与することが可能だが、配列の異なる複数の様々なＲＮＡを投与することも可能である。一実施形態では、本発明によると、ＲＮＡ分子のプールが投与される。ＲＮＡが、本発明による、様々な配列のＲＮＡ分子を含む場合、これらのＲＮＡをコードする配列は、同一または異なる抗原から誘導されたものでよい。
【００９６】
用語「病原体」は、病原性微生物に関するものであり、ウイルス、細菌、単細胞生物および寄生虫を包含する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウィルス、およびヒトＴリンパ好性ウイルス（ｈｕｍａｎｅｓ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｓｃｈｅｓ Ｖｉｒｕｓ：ＨＴＬＶ）が病原性ウイルスの例である。単細胞生物としては、マラリア原虫、トリパノゾーマ、アメーバなどが含まれる。
【００９７】
ここで用いられる用語「ワクチン」は、一つまたは複数の抗原、またはそれをコードする核酸を含む、組成物に関する。さらに、ワクチンは、一つまたは複数のアジュバント、希釈剤、担体物質などを含んでもよく、抗原に対する保護免疫応答および／または治療免疫応答を起こさせるために、あらゆる適切な方法で生物に投与される。したがって、ワクチンは疾患の予防に使用することができ、例えば感染前に投与してもよく、疾患の発生後に投与してもよい。ワクチンは、天然抗原、誘導体化抗原、合成抗原、組換え抗原、または非組換え抗原、またはそれをコードする核酸を含むことができる。本発明によると、ワクチンは、一つまたは複数の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡであってもよく、遺伝子導入用のリポソームもしくは別の粒子に挿入されていてもよい。投与を容易にするためにワクチンに挿入可能な別の物質は、ポリペプチド、ペプチド、多糖類結合体（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ−Ｋｏｎｊｕｇａｔｅ）、脂質などである。
【００９８】
免疫生物学およびワクチン接種の原理は、治療すべき疾患に関して免疫学上関連のある抗原を用いて生物を免疫化することによって、疾患に対する免疫保護応答が生じるということに基づくことを、当業者は認識するであろう。したがって、本発明の、がん、感染症などの治療法においては、予防または治療すべき疾患に関して免疫学上関連のある抗原を含むワクチンを使用すべきであることが理解される。例を挙げると、がんワクチンは、一つまたは複数のがん抗原を含むであろう。
【００９９】
ＲＮＡワクチンの場合、免疫原性ペプチドまたはタンパク質を作動可能にコードし、好ましくは薬学的に許容可能な担体中に存在するＲＮＡを、例えばがんまたは病原性感染に罹患した動物の細胞に投与するが、その際、ＲＮＡは細胞内に導入され、場合によってはプロセシング後に、保護または治療上有効な免疫応答を起こさせる能力のある、ある量の免疫原性ペプチドまたはタンパク質が産生される。
【０１００】
細胞に供給されるＲＮＡ材料は、免疫原性ペプチドまたはタンパク質の全配列または一部だけを含んでよい。別のポリペプチド配列をコードする配列を含んでいてもよい。さらに、遺伝子発現の調節に関わる因子（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、５’−ＵＴＲ配列または３’−ＵＴＲ配列など）を含んでいてもよい。ＲＮＡは、ある特定の遺伝子産物の免疫原性を増強する免疫刺激性配列を含んでいてもよく、および／またはポリヌクレオチドの取り込みを強化する配列を含んでいてもよい。
【０１０１】
なお、本発明のワクチンは、有効性に関しては、集団の一部においてしか免疫を引き起こせないことに留意されたい。というのは、強い免疫応答または保護免疫応答を起こさせる能力、または多くのケースではワクチンに対してそれぞれの免疫応答を起こさせる能力をもたないかもしれない個体が相当数あるからである。この能力欠如の原因は、個体の遺伝的背景、または免疫不全状態（後天性または先天性）、または免疫抑制（例えば、拒絶反応を妨げるため、または自己免疫状態を抑制するための、免疫抑制剤による治療）にあるかもしれない。
【０１０２】
ここで記載されるようなエフェクター細胞は、免疫応答中にエフェクター機能を行なう細胞である。そのような細胞は、例えば、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を殺し、感染または変性した細胞を認識し、場合によっては殺し、抗体を分泌する。その例は、それだけに限定されるものではないが、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞である。
【０１０３】
樹状細胞は、特定の形態および広い組織内分布をもつ異種細胞集団を包含する。樹状細胞系、および免疫系におけるその役割は、Steinman, R.M.、Annu. Rev. Immunol. 9、271〜296頁 (1991) （非特許文献３６）に記載されており、その開示が参照により本明細書に組み込まれている。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する能力をもち、Ｔ細胞に抗原を提示する際にきわめて有効である。用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる、形態的に類似する種々の細胞型の雑多な集団のメンバーに関する。樹状細胞は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞の１グループであり、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する能力をもつ。それぞれの系統および成熟度に応じて、樹状細胞は、機能または表現型、特に細胞表面表現型により識別可能である。この細胞は、ある特定の形態、食作用／エンドサイトーシス能力、表面のＭＨＣクラスＩＩの高い発現度、およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力を特徴とする。機能的には、樹状細胞は、抗原提示能力を確認する試験によって同定することができる。そのような試験は、ある試験用抗原の提示によりＴ細胞を刺激する能力の評価、および場合によってはＴ細胞増殖の定量、ＩＬ−２の放出などを含み得る。
【０１０４】
本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡにさらされたリンパ系樹状細胞は、抗原提示細胞として、ＲＮＡがコードする抗原に対する免疫応答の誘導に使用することができる。
【０１０５】
免疫アジュバントまたはアジュバントとは、個体に投与した場合、抗原のみを投与した試験用個体と比べて、抗原に対する免疫応答を上昇させるか、免疫系細胞の特定の活性を強化させる化合物である。
【０１０６】
本発明によると、一つまたは複数の抗原をコードするＲＮＡは、あらゆるアジュバントと一緒に投与することができる。その際、用語「アジュバント」は、抗原およびＦｌｔ３リガンドとは異なる上、ワクチンに組み込むと、抗原に対する宿主の免疫応答を促進、延長、または強化するあらゆる物質に関する。Ｆｌｔ３リガンドは、本発明によると、ここで定義されるようなアジュバントとは見なされないが、それにもかかわらず、記載されるその、免疫応答を強化する作用に基づき、アジュバントと見なすこともできる。しかしながら、明確性のためにＦｌｔ３リガンドはここではアジュバントとは呼ばない。アジュバントは、抗原表面の上昇、体内における抗原の滞留の延長、抗原放出の減速、マクロファージへの抗原のターゲティング、抗原の取り込み上昇、抗原プロセシングの増加、サイトカイン放出の促進、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞のような免疫細胞の刺激および活性化、および、他の方法による、免疫系細胞の非特異的活性化の惹起を含めた一つまたは複数の機構により、その生物作用を発揮すると推測される。アジュバントは、油エマルジョン（例えば、フロイントアジュバント）、鉱物性化合物（ミョウバンのような）、細菌産物（例えば百日咳菌毒素）、リポソームおよび免疫刺激複合体のような異種の化合物群を包含する。
【０１０７】
ここで定義される「補助分子」は、抗原に対する生物の免疫応答を促進、延長、または強化するために、場合によっては生物に投与される分子である。例えば、サイトカイン、成長因子などは、免疫応答を強化または調節する際に使用することができる。サイトカインには、それだけに限定されるものではないが、インターロイキン−１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、１５、１８および２３のようなインターロイキン、ケモカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンαおよびインターフェロンγ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βのようなＴＮＦファミリーのメンバー、ＣｐＧ配列などが含まれる。
【０１０８】
細胞に供給されるＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでもよい。したがって、本発明によると、ここで記載されるＦｌｔ３リガンドを用いて、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをターゲット細胞に供給することができる。
【０１０９】
Ｔ細胞受容体の活性を調節する組成物の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって簡単に定量することができる。典型的には、試験用のＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマ、またはヒトのような哺乳類またはマウスのようなげっ歯類から単離されたＴ細胞のような、形質転換されたＴ細胞株によって供給される。適切なＴ細胞ハイブリドーマは、自由に入手可能であり、あるいはそれ自体公知の方法で作製できる。Ｔ細胞は、それ自体公知の方法で哺乳類から単離することができる。例えば、Shimonkevitz, R. et al.、1983、J. Exp. Med. 158、303頁（非特許文献３７）を参照のこと。
【０１１０】
組成物がＴ細胞の活性を調節する能力をもつかどうかを決定するのに適した試験は、以下のステップ１〜４により、次のように行なわれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の活性化、または活性化に続くＴ細胞活性の調節を示す、試験可能なマーカーを、適切な方法で発現する。したがって、活性化の際にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。組成物が、このＴ細胞ハイブリドーマの活性を調節する能力があるかどうかを決定するために、ＩＬ−２濃度を測定することが可能である。このような適切な試験は、以下のステップにより行なわれる。
【０１１１】
1．例えば興味のあるＴ細胞ハイブリドーマから、または単離により哺乳類から、Ｔ細胞を獲得する。
【０１１２】
2．増殖を可能にする条件下でＴ細胞を培養する。
【０１１３】
3．成長するＴ細胞を、抗原とまたはその抗原をコードする核酸と接触させた抗原提示細胞と接触させる。
【０１１４】
4．Ｔ細胞のマーカーを試験する、例えばＩＬ−２産生を測定する。
【０１１５】
試験に使用されるＴ細胞を、増殖に適した条件下で培養する。例えば、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞ハイブリドーマを約３７℃、５％ＣＯ２において完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および５ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０）中で培養するのが適切である。適切な抗原ペプチドを加えた抗原提示細胞によってＴ細胞活性化シグナルが供給される。
【０１１６】
ＩＬ−２のような発現タンパク質を測定する代わりに、公知の放射性標識法によって測定されるような、適切な方法で、抗原依存性Ｔ細胞の増殖の変化により、Ｔ細胞活性化の調節を決定することができる。例えば、標識化（トリチウム化）されたヌクレオチドを試験用培地に導入してもよい。このような標識化されたヌクレオチドのＤＮＡへの導入が、Ｔ細胞の増殖に関する測定量として使用される。この試験は、Ｔ細胞ハイブリドーマのような、その成長に抗原提示を必要としないＴ細胞には適さない。この試験は、哺乳類から単離された、形質転換されていないＴ細胞の場合に、Ｔ細胞活性化の調節を測定するのに適している。
【０１１７】
標的疾患に対するワクチン接種を可能にすることも含めた免疫応答を誘導する能力は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験によって容易に決定することができる。例えば、組成物をマウスのような哺乳類に投与し、最初の投与の時点、およびその後、定期的な間隔で数回にわたり（投与後、１、２、５および８週間というように）、その哺乳類から血液サンプルを採血することができる。血液サンプルから血清を獲得し、免疫化により生成した抗体の出現を試験する。抗体濃度を定量することが可能である。それに加えて、血液ないしリンパ性器官からＴリンパ球を単離し、抗原または抗原から誘導されたエピトープに対する反応性を機能的に試験してもよい。ここでは当業者に公知のすべての「読み出し（リードアウト）」系、特に増殖アッセイ、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、テトラマー解析を使用できる。
【０１１８】
核酸分子または核酸配列は、本発明によると、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸に関する。核酸は、本発明によると、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え分子および化学合成された分子を包含する。核酸は、本発明によると、一本鎖または二本鎖、および線状のまたは共有結合で閉環した分子であってよい。
【０１１９】
用語「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース基の２’−位に水酸基をもつヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡのような単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えＲＮＡ、ならびに、一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを包含する。そのような改変としては、ＲＮＡの末端またはその内部において、例えばＲＮＡの一つまたは複数のヌクレオチドにおいて非ヌクレオチド材料を付加することが含まれ得る。ＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天然には存在しないヌクレオチド、または化学合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドのような非標準的ヌクレオチドも包含することができる。この改変ＲＮＡは、アナログ体、または天然に存在するＲＮＡのアナログ体と呼ばれることがある。
【０１２０】
「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡを鋳型として使用しながら産生され、それ自体はペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。ｍＲＮＡは、典型的には、５’−非翻訳領域、タンパク質コード領域、および３’−非翻訳領域を含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびｉｎ ｖｉｔｒｏで、限られた半減期をもつ。本発明によると、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により鋳型ＤＮＡから作製することができる。
【０１２１】
本発明によると、ＲＮＡは、例えばＲＮＡの安定性および／またはＲＮＡの翻訳効率を高める改変を含んでいてもよい。したがって、ＲＮＡには、例えば、ポリ（Ａ）配列、特に開放末端（ｏｆｆｅｎ ｅｎｄｅｎｄｅｎ）のポリ（Ａ）配列が付与されていてもよい。開放末端のポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡは、遮蔽末端（ｖｅｒｄｅｃｋｔ ｅｎｄｅｎｄｅｎ）のポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡよりも効率よく翻訳されることが証明できた。さらに、長いポリ（Ａ）配列、特に約１２０ｂｐの配列が、ＲＮＡの転写産物安定性および翻訳効率の最適化をもたらすことが確認された。二重の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、特にヒトβグロビン遺伝子のＵＴＲが、ＲＮＡ分子内において、２つの単独のＵＴＲを用いた場合に期待される加法的効果を明らかに上回る翻訳効率の改善をもたらすことも証明できた。前記の改変の組み合わせが、ＲＮＡの安定化および翻訳の上昇に相乗的な影響を及ぼす可能性がある。このような改変は、ここでは参照により含まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８（特許文献３）に記載されており、本発明により考慮されている。
【０１２２】
本発明によると、好ましくは、ＲＮＡの改変、そしてそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の上昇が、好ましくはＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用される発現ベクターを遺伝子工学的に改変することによって達成される。
【０１２３】
そのようなベクターは、特に、ポリ（Ａ）配列をもつＲＮＡの転写を可能にするべきであり、その際、ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＲＮＡ中で開放末端を示す、つまりＡヌクレオチド以外のいずれのヌクレオチドもポリ（Ａ）配列にその３’末端で隣接していない。ＲＮＡ中の開放末端ポリ（Ａ）配列は、５’に位置するＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にＲＮＡの転写を可能にし、そしてポリアデニルカセット（ポリ（Ａ）配列）を含む発現ベクター中に、タイプＩＩｓの制限酵素切断部位を導入することによって達成され、その際、認識配列はポリ（Ａ）配列の３’に位置し、切断部位は上流側に、したがってポリ（Ａ）配列内に存在する。タイプＩＩｓの制限酵素切断部位における制限酵素切断により、プラスミドの場合、ポリ（Ａ）配列内でプラスミドを直線化することが可能である。直線化されたプラスミドは、鋳型としてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用でき、生じる転写産物は遮蔽されていないポリ（Ａ）配列を末端にもつ。
【０１２４】
さらに、または別法として、本発明によると、２つ以上の３’非翻訳領域をその３’末端に、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間にもつＲＮＡの転写を可能にするように、発現ベクターを遺伝子工学的に改変することによって、ＲＮＡの改変、およびそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の上昇を達成することができる。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、本発明によると、ＲＮＡは、適切な鋳型ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られる。転写を制御するためのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ用のいかなるプロモーターでもよい。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７−、Ｔ３−、ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、本発明によると、Ｔ７−またはＳＰ６−プロモーターによって制御される。
【０１２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型ＤＮＡは、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、その核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したベクターに導入することによって製造される。
【０１２７】
本発明によると、用語「コードするＲＮＡ」は、抗原に関して、ＲＮＡが適切な環境、好ましくは細胞内にある場合に、抗原を産生するために発現可能であることを意味する。好ましくは、ＲＮＡは、それがコードする抗原を供給するために細胞の翻訳機構と相互作用する能力がある。
【０１２８】
本発明によると、ＲＮＡが複数の抗原を発現するという場合、ＲＮＡは、これら複数の抗原のうちの様々な抗原を発現する様々なＲＮＡ分子を含むことが可能である。しかしながら、本発明は、一つのＲＮＡ分子が、場合によっては互いに連結された様々な抗原を発現する場合も包含する。
【０１２９】
本発明によると、ＲＮＡを細胞内に導入するためには、細胞へのＲＮＡ導入に適したあらゆる技術を使用することができる。好ましくは、ＲＮＡは、標準技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、電気穿孔法、リポフェクション、およびマイクロインジェクションが含まれる。好ましくは、抗原をコードするＲＮＡを細胞に導入すると、細胞内での抗原の発現が引き起こされる。
【０１３０】
さらに、用語「核酸」は、ヌクレオチドの塩基、糖、またはホスフェートにおける核酸の化学的誘導体化、ならびに天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ体を含む核酸のような、核酸または核酸配列の誘導体も包含する。
【０１３１】
「核酸の３’末端」は、本発明によると、遊離の水酸基が存在する末端に関する。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、３’末端は常に右側に存在する。「核酸の５’末端」は、本発明によると、遊離のリン酸基が存在する末端に関する。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、５’末端は常に左側に存在する。
【０１３２】
５’末端 ５’−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３’ ３’末端
３’−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５’
【０１３３】
「機能的な連結」または「機能的に連結されている」は、本発明によると、機能的な関係での連結に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列と機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には、互いに隣接しており、場合によっては別の核酸配列によって隔てられている。
【０１３４】
本発明により記載される核酸は、好ましくは単離されている。用語「単離された核酸」は、本発明によると、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたこと、（ｉｉ）組換え技術でクローニングによって作製されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製されたこと、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作のために使用できる核酸である。
【０１３５】
本発明によると、「ある核酸配列から誘導された核酸配列」は、その核酸が誘導された元の核酸と比べて単独または多重のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、および／またはヌクレオチド付加が存在する核酸であり、その際、核酸間にはある程度の相同性が存在する、つまり、核酸どうしが、ヌクレオチドの配列順序の点で有意な直接的または相補的な一致を示す。ある核酸から誘導された核酸は、本発明によると、その核酸が誘導された元の核酸の機能特性を示す。そのような特性は、特に、核酸の発現産物の特性によって定義される。Ｆｌｔ３リガンドの場合は、特に、Ｆｌｔ３受容体に結合し好ましくは生物活性を示す、結合したＦｌｔ３受容体を介して細胞に刺激性シグナルを伝達する、および／またはワクチンＲＮＡと共に投与した場合にＲＮＡが引き起こす免疫応答を強化できる特性に関する。抗原の場合は、匹敵する特異性および／または反応性で免疫応答を惹起できる特性に関する。「ある核酸配列から誘導された核酸配列」の一例は、その核酸が誘導された元の核酸と比較して、例えば、ある特定の宿主生物またはある特定の宿主細胞中での発現が改善されるようにコドンが最適化された核酸である。
【０１３６】
ある核酸配列から誘導された配列、または用語「ある核酸配列から誘導された配列」は、好ましくは相同配列に関する。
【０１３７】
相同な核酸間の同一性の程度は、本発明によると、好ましくは、少なくとも７０％、特に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％である。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００の連続ヌクレオチドの領域に関して記述される。好ましい実施形態では、同一性の程度が、配列プロトコルに挙げられる核酸配列のような参照用核酸の全長に関して記述される。
【０１３８】
用語「〜％同一性」は、最適なアラインメントにおいて、比較されるべき２つの配列間で同一のヌクレオチドのパーセント値を意味するもので、その際、このパーセント値は、純粋に統計的なものであり、２配列間の差異はランダムかつ配列の全長にわたり分布してよく、比較される配列は、２配列間で最適のアラインメントが達成されるように、参照用配列と比べて付加または欠失を含んでもよい。２配列間の配列比較は、一般的には、局所的な配列一致領域を同定するために、セグメントまたは「比較用ウィンドウ（Ｖｅｒｇｌｅｉｃｈｓｆｅｎｓｔｅｒ）」に関する最適アラインメントに基づきこれらの配列を比較することにより行なわれる。比較用の最適アラインメントは、手動で、またはSmithおよびWaterman、1981、Ads App. Math. 2、482（非特許文献３８）による局所相同性アルゴリズム、NeddlemanおよびWunsch、1970、J. Mol. Biol. 48、443（非特許文献３９）による局所相同性アルゴリズム、PearsonおよびLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA 85、2444（非特許文献４０）による類似性検索アルゴリズム、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ）を使用して行なうことができる。
【０１３９】
パーセントによる同一性は、比較される配列がその位置で一致する同一位置の数を求め、この数を、比較した位置数で割り、この結果を１００倍することで得られる。
【０１４０】
例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgiから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用してもよい。
【０１４１】
核酸は、特に、相補鎖の両配列が互いにハイブリダイズし、安定した二重構造をとることができる場合、別の核酸と「相同」であり、その際、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下（ストリンジェントな条件）でハイブリダイゼーションが行なわれる。ストリンジェントな条件は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrook et al.編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989（非特許文献４１）またはCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M. Ausubel et al.編、John Wiley & Sons, Inc.、New York（非特許文献４２）に記載され、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中での６５℃におけるハイブリダイゼーションに関する。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡが転写された膜を、例えば、２ｘＳＳＣ中で室温におき洗浄してから、０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳ中で６８℃までの温度において洗浄する。
【０１４２】
パーセントによる相補性は、ある核酸中において、第２の核酸と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対により）を形成し得る連続ヌクレオチドのパーセント値を示す。相補性核酸は、本発明によると、好ましくは、少なくとも４０％、特に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相補性ヌクレオチドを示す。好ましくは、相補性ヌクレオチドは、完全に相補性であり、それは、すべての連続ヌクレオチドが第２の核酸中の同数の連続ヌクレオチドと水素結合することを意味する。
【０１４３】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセント値を示す。２ポリペプチド間または２核酸間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセント値を示す。
【０１４４】
核酸の「誘導体」とは、本発明によると、単独または多重のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、および／またはヌクレオチド付加が核酸中に存在することを意味する。さらに、用語「誘導体」は、ヌクレオチドの塩基、糖、またはホスフェートにおける核酸の化学的誘導体化も意味する。用語「誘導体」は、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ体を含む核酸も包含する。
【０１４５】
ある特定の核酸の誘導体には、特に、核酸の変異体、とりわけ、核酸のスプライス変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、特に天然の方法で発現されるようなものが含まれる。
【０１４６】
核酸は、本発明によると、スプライス変異体のような変異体に関して、それ自体公知の方法で分析することができる。スプライス変異体の分析技術には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロッティング、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１４７】
「ＲＮＡｓｅプロテクション」と呼ばれる技術もまた、選択的にスプライスされたｍＲＮＡを同定するために使用可能である。ＲＮＡｓｅプロテクションは、合成ＲＮＡへの遺伝子配列の転写を包含し、この合成ＲＮＡは、例えば別の細胞から誘導されたＲＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイズしたＲＮＡを、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのミスマッチを認識する酵素とインキュベートする。予想されるよりも小さい断片は、異なってスプライスされたｍＲＮＡが存在することを示す。異なってスプライスされたと推定されるｍＲＮＡは、公知の方法でクローニングし配列決定することができる。
【０１４８】
異なってスプライスされたｍＲＮＡを同定するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することもできる。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、逆転写酵素によりそれ自体公知の方法でｍＲＮＡがｃＤＮＡに変換される。次いでｃＤＮＡのコード配列全体が、３’非翻訳領域内にある順方向プライマー、および５’非翻訳領域内にある逆方向プライマーを用いてＰＣＲにより増幅される。増幅産物は、選択的スプライス型に関して、例えば、増幅産物のサイズを、正常にスプライスされたｍＲＮＡから予想される産物のサイズと、例えばアガロースゲル電気泳動によって比較することにより分析可能である。増幅産物サイズに関するいかなる変化も、選択的スプライシングを示す可能性がある。
【０１４９】
突然変異遺伝子から誘導されたｍＲＮＡも、選択的スプライス型を同定するための前記技術により容易に同定できる。したがって、例えば、遺伝子の対立型、およびそれにより産生される、本発明によると「変異体」と見なされるｍＲＮＡを同定することができる。
【０１５０】
核酸は、本発明によると、単独で、または、同種もしくは異種であってもよい別の核酸との組み合わせで存在することが可能である。特定の実施形態では、ある核酸は、本発明によると、その核酸に対して同種もしくは異種であってもよい発現制御配列と機能的に連結して存在する。用語「同種」は、ある核酸が、その核酸が組み合わされて存在する核酸と天然の様式で機能的に連結していることを意味し、用語「異種」は、ある核酸が、その核酸が組み合わされて存在する核酸と天然ではない様式で機能的に連結していることを意味する。
【０１５１】
転写可能な核酸、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸と発現制御配列は、転写可能な核酸、特にコードされた核酸の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下に置かれるように互いに共有結合されている場合には、「機能的に」互いに連結している。核酸が、機能ペプチドまたは機能タンパク質に翻訳される場合、発現制御配列がコード配列と機能的に連結していれば、コード配列内でのリーディングフレームのずれが生じることも、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されないこともなく、発現制御配列の誘導が、コード配列の転写をもたらす。
【０１５２】
用語「発現制御配列」は、本発明によると、プロモーター、リボゾーム結合配列、および、遺伝子の転写またはその遺伝子から誘導されたＲＮＡの翻訳を制御するその他の制御因子を包含する。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節可能である。発現制御配列の詳細な構造は、種または細胞型に応じて変わり得るが、一般的には、転写または翻訳の開始に関与するＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５’−非転写配列、および５’−および３’−非翻訳配列が含まれる。特に、５’−非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写を制御するためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流の適当なアクチベーター配列を含んでもよい。
【０１５３】
用語「プロモーター」または「プロモーター領域」は、遺伝子のコード配列の上流（５’）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および結合部位を提供することによりコード配列の発現を制御する、ＤＮＡ配列に関する。プロモーター領域は、遺伝子の転写調節に関与するさらなる因子用の別の認識部位または結合部位を含んでいてもよい。プロモーターは、原核生物または真核生物の遺伝子転写を制御できる。プロモーターは、「誘導可能」であり誘導剤に反応して転写を開始できるものでもよく、または転写が誘導剤によって制御されない場合は「構成的」であってもよい。誘導型プロモーターは、誘導剤が欠けている場合、全くまたはわずかな量しか発現されない。誘導剤の存在下で、遺伝子が「スイッチオン」され、または転写レベルが上昇する。これは、従来の方法により、特異的な転写因子の結合によって仲介される。
【０１５４】
本発明によると、好ましいプロモーターは、例えば、ＳＰ６−、Ｔ３−またはＴ７−ポリメラーゼ用のプロモーターである。
【０１５５】
用語「発現」は、本発明によると、そのきわめて一般的な意味で用いられ、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡおよびタンパク質の産生を包含する。この用語は、核酸の部分的発現も包含する。ＲＮＡに関しては、用語「発現」または「翻訳」は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性に起こっても、また安定に起こってもよい。
【０１５６】
タンパク質またはペプチドをコードする核酸は、本発明によると、あるペプチド配列をコードする別の核酸と連結して存在してよく、このペプチド配列は、例えば、核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの、宿主細胞からの分泌を制御し、または核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの免疫原性を高める。さらに、核酸は、本発明によると、コードされるタンパク質またはペプチドを宿主細胞の細胞膜に固定させる、またはこの細胞の特定の細胞小器官にそれをコンパートメント化させる、ペプチド配列をコードする別の核酸と連結して存在してもよい。
【０１５７】
同様に、レポーター遺伝子または任意の「タグ」である核酸との連結であることができる。
【０１５８】
用語「転写」は、本発明によると、ＤＮＡ配列中の遺伝コードがＲＮＡに転写されるプロセスであり、続いてＲＮＡはタンパク質に翻訳可能である。本発明によると、用語「転写」は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」を包含し、ここで、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞で、つまり好ましくは、相応に処理された細胞抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される方法に関する。好ましくは、転写産物を製造するためにクローニングベクターが使用され、このベクターは一般的には転写ベクターと呼ばれ、本発明によると、これも用語「ベクター」に含まれる。
【０１５９】
用語「翻訳」は、本発明によると、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組み合わせを制御してタンパク質またはペプチドを製造する、リボゾーム上でのプロセスに関する。
【０１６０】
３’非翻訳領域は、遺伝子の３’末端でタンパク質コード領域の終止コドンの下流に位置し、転写はされるもののアミノ酸配列には翻訳されない領域に関する。
【０１６１】
本発明によると、第１ポリヌクレオチド領域の５’末端が、第１ポリヌクレオチド領域のうち第２ポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近くにある部分である場合に、第１ポリヌクレオチド領域は、第２ポリヌクレオチド領域の下流に位置すると見なされる。
【０１６２】
３’非翻訳領域は、典型的には、翻訳産物の終止コドンから、通常の方法で転写プロセス後に付加されるポリ（Ａ）配列まで及ぶ。哺乳類ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的には、相同領域を示し、これはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知である。この配列は、おそらくポリ（Ａ）付加シグナルである。このシグナルは、ポリ（Ａ）付加部位から１０〜３０塩基上流に位置することが多い。
【０１６３】
３’非翻訳領域は、一つまたは複数の逆向きの繰り返しを含んでいてよく、この繰り返しは、ステムループ構造に折りたたまれることが可能であり、エキソリボヌクレアーゼへのバリアとして機能し、またはＲＮＡ安定性を高めることが公知であるタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用する。
【０１６４】
５’−および／または３’非翻訳領域は、本発明によると、転写可能な核酸と、特にコードされた核酸と機能的に連結していてよく、その結果、この領域は、転写可能な核酸から転写されるＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるようにその核酸と関係している。
【０１６５】
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、別の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。
【０１６６】
本発明によると、３’非翻訳領域またはそれから誘導された核酸配列を、ある遺伝子の３’非翻訳領域に挿入し、この挿入により、合成されるタンパク質の量が増加するかどうかを測定することによって、３’非翻訳領域またはそれから誘導された核酸配列がＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるかどうかを確定することができる。
【０１６７】
前記のことは、本発明によると核酸が２つ以上の３’非翻訳領域を含み、好ましくはそれらの３’非翻訳領域がその間にリンカーを挟んでまたは挟まずに連続して、好ましくは「ヘッド−テールの関係（Ｋｏｐｆ−ａｎ−Ｓｃｈｗａｎｚ−Ｂｅｚｉｅｈｕｎｇ）」（つまり、３’非翻訳領域が同じ向き、好ましくは核酸中で天然に存在する向きを示す）で連結されている場合にも同様に当てはまる。
【０１６８】
用語「遺伝子」は、本発明によると、一つまたは複数の細胞産物の産生および／または一つまたは複数の細胞間または細胞内機能の達成を担う、ある特定の核酸配列に関する。特に、この用語は、特定のタンパク質を、または機能性もしくは構造性ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡ断片に関する。
【０１６９】
用語「ポリアデニルカセット」または「ポリ（Ａ）配列」は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル残基配列に関する。本発明によると、そのような配列は、コード鎖と相補な鎖中の繰り返しチミジル残基をもとに、ＲＮＡ転写の際に鋳型ＤＮＡによって付加されることが企図されている。他方、通常は、そのような配列はＤＮＡ中にはコードされておらず、鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、転写後に細胞核内でＲＮＡの遊離３’末端に付加される。本発明によると、少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００の、そして好ましくは５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドがそのようなポリ（Ａ）配列と理解され、用語「Ａヌクレオチド」はアデニル残基を意味する。
【０１７０】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、ＤＮＡ分子の両鎖において特異的塩基配列内でホスホジエステル結合を切断する一群の酵素を意味する。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子上で、認識配列と呼ばれる特異的な結合部位を認識する。ＤＮＡ内のホスホジエステル結合が酵素によって切断される部位は、切断部位と呼ばれる。タイプＩＩｓの酵素では、切断部位は、ＤＮＡ結合部位から定められた間隔だけ離れた位置にある。用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、本発明によると、例えば、酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩを包含する。
【０１７１】
「半減期」は、分子の活性、量または数を半分だけ除去するのに必要とされる時間に関する。
【０１７２】
好ましい一実施形態では、核酸分子は、本発明によるとベクターである。用語「ベクター」は、ここでは、その最も一般的な意味で用いられ、例えば、原核生物および／または真核生物の宿主細胞に核酸を導入し、そして場合によってはゲノムに組み込むことを可能にする、核酸用のあらゆる仲介媒体を包含する。そのようなベクターは、好ましくは、細胞内で複製および／または発現される。ベクターには、プラスミド、ファージミド、またはウイルスゲノムが含まれる。ここで用いられる用語「プラスミド」は、一般的には染色体外の遺伝子材料からなるコンストラクトであり、通常は、染色体ＤＮＡに依存せずに複製できる環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１７３】
用語「宿主細胞」は、本発明によると、外来核酸で、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡで形質転換またはトランスフェクション可能なあらゆる細胞に関する。用語「宿主細胞」は、本発明によると、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物の細胞（例えば、哺乳類細胞、特にヒト由来の細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を包含する。特に好ましいのは、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、および霊長類由来の細胞のような哺乳類細胞である。細胞は、多数の組織型から誘導されたものでよく、初代細胞および細胞株も含まれる。特定の例としては、表皮細胞、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞がある。別の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞であり、ここでは、用語「抗原提示細胞」は、本発明によると、樹状細胞、単球、およびマクロファージを包含する。核酸は、宿主細胞中において唯一のまたは複数のコピーで存在してよく、一実施形態では宿主細胞内で発現される。
【０１７４】
用語「ペプチド」は、２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは８つ以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上で、そして好ましくは５０個まで、好ましくは１００個まで、または好ましくは１５０個までの連続する、ペプチド結合で相互に結合されたアミノ酸を含む物質に関する。用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸をもつペプチドに関するが、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ここでは一般的に同義語として用いられる。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本発明によると、アミノ酸成分のみならず糖およびリン酸構造のような非アミノ酸成分も含む物質を包含し、エステル結合、チオエーテル結合またはジスルフィド結合のような結合を含む物質も包含する。
【０１７５】
あるアミノ酸配列から誘導された配列、または用語「あるアミノ酸配列から誘導された配列」は、本発明によると、第1の配列の相同配列および誘導体に関する。
【０１７６】
あるアミノ酸配列から誘導された配列は、本発明によると、その配列が誘導された元のアミノ酸配列の機能特性を示す。Ｆｌｔ３リガンドの場合は、特に、Ｆｌｔ３受容体に結合し好ましくは生物活性を示し、結合したＦｌｔ３受容体を介して細胞に刺激性シグナルを伝達し、および／またはワクチンＲＮＡと共に投与した場合にＲＮＡが引き起こす免疫応答を強化することのできできる特性に関する。抗原の場合は、匹敵する特異性および／または反応性で免疫応答を惹起できる特性に関する。
【０１７７】
タンパク質またはポリペプチドまたはアミノ酸配列の「ホモログ」または「誘導体」は、本発明の趣旨においては、アミノ酸の挿入変異体、アミノ酸の欠失変異体および／またはアミノ酸の置換変異体を包含する。
【０１７８】
アミノ酸の挿入変異体は、ある特定のアミノ酸配列におけるアミノ末端および／またはカルボキシ末端側での融合、ならびに、単独または複数のアミノ酸の挿入を含んでいる。挿入を伴うアミノ酸配列変異体では、アミノ酸配列中のあらかじめ決められた位置に一つまたは複数のアミノ酸残基が導入されるが、生じた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸の欠失変異体は、配列から一つまたは複数のアミノ酸が除去されることを特徴とする。アミノ酸の置換変異体は、配列中の少なくとも１残基が除去され、その位置に別の１残基が挿入されることを特徴とする。好ましくは、アミノ酸配列中の、相同タンパク質または相同ペプチド間で保存されない位置で改変が生じる。好ましくは、アミノ酸が、疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の大きさなど類似の特性をもつ別のアミノ酸で置換される（保存的置換）。保存的置換は、例えば、アミノ酸が別のアミノ酸で交換されるものであり、その際、両方のアミノ酸とも以下で同一グループに挙げられているものである。
【０１７９】
１．小さな、非極性または弱極性の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな非極性の脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１８０】
３つの残基は、タンパク質構造に対するその特別な役割から括弧に入れてある。Ｇｌｙは、側鎖をもたない唯一の残基であり、したがって鎖に可撓性を与える。Ｐｒｏは、鎖を強く制限する特異な幾何形状をもつ。Ｃｙｓはジスルフィド結合を形成できる。
【０１８１】
前記のアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術、例えば「固相合成」（Merrifield、1964）および類似法により、または組換えＤＮＡ操作により容易に製造できる。公知または部分的に公知の配列をもつＤＮＡのあらかじめ定められた位置に置換変異を導入する技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３突然変異誘発が含まれる。置換、挿入または欠失をもつタンパク質を製造するためのＤＮＡ配列の操作、およびタンパク質を、例えば生物系（哺乳類系、昆虫系、植物系、およびウイルス系）で発現するための一般的な組換え法は、例えばSambrook et al.（1989）（非特許文献４１）に詳細に記載されている。
【０１８２】
タンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、本発明によると、そのタンパク質またはポリペプチドと結合している、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはポリペプチドなどあらゆる分子の単独または多重の置換、欠失、および／または付加も包含する。
【０１８３】
一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解的切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合によって生じる改変アナログ体を包含する。タンパク質またはポリペプチドの誘導体は、例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ２を用いた化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元のような別の方法によっても、またはツニカマイシン存在下に代謝合成することによっても製造できる。
【０１８４】
さらに、用語「誘導体」は、タンパク質またはポリペプチドのあらゆる機能性化学的等価物にも拡張される。
【０１８５】
ある特定のタンパク質またはペプチドの誘導体は、タンパク質またはペプチドの翻訳後修飾された変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、特に天然の方法で発現するようなものにも関する。
【０１８６】
本発明により記載されるタンパク質およびペプチドは、好ましくは単離されている。用語「単離タンパク質」または「単離ペプチド」は、タンパク質またはペプチドがその自然環境から単離されたことを意味する。単離タンパク質または単離ペプチドは、本質的に精製された状態で存在してよい。用語「本質的に精製された」とは、タンパク質またはペプチドが、天然またはｉｎ ｖｉｖｏでは結合している別の物質を本質的に含まないことを意味する。
【０１８７】
本発明により記載されるタンパク質またはペプチドは、組織ホモジネートまたは細胞ホモジネートのような生物サンプルから単離することができ、または多数の原核生物および真核生物発現系で発現させることができる。
【０１８８】
好ましくは、ここで記載されるアミノ酸配列とそのアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、または少なくとも約３００個の連続するアミノ酸領域に関して記述される。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照用アミノ酸配列の全長に関して記述される。
【０１８９】
アミノ酸配列の同一性に関しては、核酸配列の同一性に関して前記したことが、同様に当てはまる。
【０１９０】
タンパク質またはペプチドの一部分つまり断片、または誘導体は、本発明によると、好ましくは、それが誘導された元のタンパク質またはペプチドの機能特性を示す。そのような機能特性は、Ｆｌｔ３リガンドおよび抗原に関して先に述べたが、例えば、免疫反応性、特に抗体との相互作用、または別のペプチドもしくはタンパク質との相互作用がそれに含まれる。重要な特性は、ＭＨＣ分子もしくはＦｌｔ３受容体と複合体を形成する能力、および場合によっては、例えば細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞を刺激または阻害することにより免疫反応を起こすもしくは阻止する能力、または細胞反応を引き起こす能力である。タンパク質またはペプチドの一部分は、好ましくは、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個で、そして好ましくは８個まで、１０個まで、１２個まで、１５個まで、２０個まで、３０個まで、または５０個までの、タンパク質またはペプチドに由来する連続するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、タンパク質またはペプチドの一部は、本発明によると、完全なペプチドまたはタンパク質に由来する一つまたは複数のエピトープに関し、その際、複数のエピトープが、天然の結合状態で存在してもよく、または人工的、つまり天然には存在しない結合を示してもよく、つまり、エピトープが、例えば人工的リンカーによって互いに隔てられていてもよい。好ましくは、タンパク質またはペプチドの一部分は、本発明によると、患者における免疫応答の標的、特にエピトープであるような配列に関する。好ましい実施形態では、この配列は、抗体および／またはＴ細胞が仲介する免疫応答の標的である。本発明により使用されるペプチド、タンパク質または誘導体は、その上、抗体またはＴ細胞用のエピトープであるような配列を複数含んでいてもよい。
【０１９１】
タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部分つまり断片は、本発明によると、好ましくは、少なくとも、タンパク質またはペプチドおよび／または前記で定義されるような、タンパク質またはペプチドの一部分をコードする核酸部分に関する。タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部分は、好ましくは、オープンリーディングフレームに対応する核酸部分に関する。
【０１９２】
本発明により記載される医薬調製物および組成物は、既存の疾患を治療するために治療上、またはここに記載される疾患を阻止するための免疫化用のワクチンとして予防上、使用することができる。
【０１９３】
腫瘍関連抗原を抗原として使用する際に、例えばがんに対する免疫化作用の試験用に、動物モデルを使用することができる。その際、腫瘍を生み出すために、例えば、ヒトがん細胞をマウスに導入し、腫瘍関連抗原をコードするＲＮＡを含む、本発明の調製物または本発明の組成物を投与することが可能である。がん細胞に対する作用（例えば、腫瘍サイズの減少）を、免疫化の有効性の尺度として測定することが可能である。
【０１９４】
免疫化用組成物の一部分として、一つまたは複数のワクチンＲＮＡを、免疫応答を誘導するまたは高めるための一つまたは複数のアジュバントと共に投与することができる。
【０１９５】
患者の免疫応答を刺激する別の物質も投与可能である。例えば、リンパ球に対するその調節特性の故に、ワクチン接種の際に、サイトカインを使用することができる。そのようなサイトカインには、例えば、ワクチンの保護作用を強化することが示されたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（Science 268、1432〜1434頁、1995（非特許文献４３）を参照）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１８が含まれる。
【０１９６】
哺乳類で免疫応答を誘導するための本発明の方法は、一般的には、Ｆｌｔ３リガンドと共に投与すると、好ましくは予防上および／または治療上の免疫応答を引き起こす、ある量のワクチンＲＮＡを投与することを含む。
【０１９７】
用語「トランスフェクション」は、本発明によると、生物または宿主細胞への一つまたは複数の核酸の導入に関する。本発明によると、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入するためには、様々な方法が使用できる。そのような方法としては、核酸ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに結合した核酸のトランスフェクション、興味のある核酸を運ぶウイルスを用いたトランスフェクションまたは感染、リポソーム仲介トランスフェクションなどが含まれる。特定の実施形態では、特定細胞に核酸を導くことが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合されたターゲティング分子を有する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドのような分子を核酸担体に挿入するか結合させることが可能である。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、ターゲティングおよび／または取り込みを可能にするためには、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合しているタンパク質をリポソーム調合物に組み込んでもよい。そのようなタンパク質としては、ある特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、内在化するタンパク質に対する抗体、細胞内の部位をめざすタンパク質などが含まれる。
【０１９８】
本発明によると、核酸の投与は、ネイキッド核酸としてまたは投与用試薬と共に行うことができる。例えば、本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏでのターゲットリポソームを使用した核酸の投与も企図されている。
【０１９９】
核酸の投与には、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルスなど）またはヘルペスウイルスから誘導されたベクターなどが使用可能である。ウイルス性ベクターの向性は、別のウイルスからの外殻タンパク質または別の表面抗原によるベクターのシュードタイプにより、または様々なウイルスキャプシドタンパク質の置換により適切に改変できる。
【０２００】
リポソームは、ある特定の組織への核酸の供給を支援し、核酸の半減期を延ばすこともできる。本発明によると、適切なリポソームは、一般的には中性または負に荷電したリン脂質を含む標準の小胞形成脂質、およびコレステロールのようなステロールから形成される。脂質の選択は、一般的には、所望のリポソームサイズ、およびリポソームの半減期のような要因によって決定される。リポソームを調製する多数の方法が公知である。例えば、Szoka et al.（1980）、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9、467頁（非特許文献４４）、および米国特許第４，２３５，８７１号（特許文献４）、米国特許第４，５０１，７２８号（特許文献５）、米国特許第４，８３７，０２８号（特許文献６）、米国特許第５，０１９，３６９号（特許文献７）を参照のこと。
【０２０１】
特定の実施形態では、特定細胞に核酸を導くことが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合されたターゲティング分子を有する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を核酸担体に挿入するか結合させることが可能である。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、ターゲティングおよび／または取り込みを可能にするためには、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム調合物に組み込んでもよい。そのようなタンパク質としては、ある特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、内在化するタンパク質に対する抗体、細胞内の部位をめざすタンパク質などが含まれる。
【０２０２】
好ましくは、ＲＮａｓｅインヒビターのような安定化物質と共にＲＮＡを投与する。
【０２０３】
ポリペプチドおよびペプチドの投与は、それ自体公知の方法で行なうことができる。
【０２０４】
用語「患者」、「個体」または「生物」は、哺乳類に関する。例を挙げると、本発明に考慮される哺乳類は、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなどのようなペット、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどのような家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどのような実験動物、ならびに動物園で飼育されている動物のようなおりに入れられた動物である。ここで用いられるように、用語「動物」は、ヒトを含む。
【０２０５】
「高まった」、「増す」または「強化する」のような用語は、好ましくは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％の、あるいは非存在および／または検出不可能状態から存在および／または検出可能状態への上昇、増加、強化に関する。
【０２０６】
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、ここでは交換可能に用いられ、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞のような細胞溶解性Ｔ細胞を包含する。
【０２０７】
「減少する」または「阻害する」は、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の低下といった低下をもたらす能力に関する。
【０２０８】
Ｆｌｔ３リガンドを使用する免疫化プロトコルは、疾患または感染を予防および／または治療する目的で、Ｆｌｔ３リガンドとＲＮＡを、混合物中でまたは互いに別々に、場合によっては一つまたは複数の補助物質、ならびに別の付随する分子および／または調合物（希釈剤、担体、賦形剤など）と組み合わせて、生物に投与することに関する。Ｆｌｔ３リガンドおよびＲＮＡ、およびここで記載される他のあらゆる成分は、いかなる用量、順序、頻度、および時間的手順でも投与可能である。治療を最適化する目的で、このパラメータを当業者が通例通り変更してもかまわないことを当業者は認めるであろう。
【０２０９】
本発明による、ワクチンＲＮＡ、Ｆｌｔ３リガンドまたはその両方を含む医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な組成物中で投与される。そのような組成物は、通常、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝物質、保存料、担体、アジュバント（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサイトカインのような補助的な免疫増強物質、および場合によっては治療上の作用物質を含んでもよい。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、注射または注入を含めたあらゆる通常の方法で投与可能である。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、皮内、経皮、リンパ内に、好ましくはリンパ節、特に鼠径リンパ節、リンパ管および／または脾臓への注射によって行なうことができる。
【０２１１】
ＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドの投与は、互いに別々に、つまり異なる組成物により、または共通の組成物により行なってよい。投与が互いに別々に行なわれる場合、ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与は同時に、または異なる時点に行なってもよく、その際、ＲＮＡおよび／またはＦｌｔ３リガンドの投与は複数回行なってもよい。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与が異なる時点で行なわれる場合、投与間の時間間隔、あるいは複数回の投与の場合は、ＲＮＡまたはＦｌｔ３リガンドの最終投与と残りのそれぞれの成分の最初の投与との時間間隔は、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、５日以上、７日以上、または９日以上でよい。好ましくは、投与間の時間間隔は、２４時間、２日、４日、８日または１０日を超えない。好ましくは、ＲＮＡを投与する前にＦｌｔ３リガンドを投与する。ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドの投与が互いに別々に行なわれる場合は、ＲＮＡの投与は好ましくはリンパ内、さらに好ましくはリンパ節内に、そしてＦｌｔ３リガンドの投与は、好ましくは静脈内、腹腔内、筋内、皮下、皮内、または経皮、好ましくは腹腔内または皮下に行なわれる。
【０２１２】
本発明の組成物は、有効な量で投与される。「有効な量」は、単独でまたは別の用量と合わせて所望の応答または所望の作用を達成する量に関する。ある特定の疾患またはある特定の状態を治療する場合、所望の応答とは、病気の進行阻害に関するものである。それには、病気の進行減速、および特に病気の進行妨害が含まれる。ある疾患または状態を治療する際の所望の応答は、疾患または状態の発生の遅延でもまたは発生の阻止でもよい。
【０２１３】
本発明の組成物の有効量は、治療される状態、病気の重篤さ、患者の個々のパラメータ（年齢、生理状態、身長および体重を含む）、治療期間、付随治療の種類（付随治療がある場合）、特殊な投与法および類似の要因に依存する。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の応答または所望の作用を起こすために有効な量の有効物質を含む。
【０２１５】
本発明の組成物の投与量は、投与法、患者の状態、所望の投与期間などのような様々なパラメータに依存し得る。初期用量における患者の応答が不十分である場合には、より高い用量（または別の、強く局在化された投与法によって達成される実質的に高い用量）を使用することが可能である。
【０２１６】
一般的には、治療のため、または免疫応答を惹起または上昇するために、好ましくは、１ｎｇ〜７００μｇ、１ｎｇ〜５００μｇ、１ｎｇ〜３００μｇ、１ｎｇ〜２００μｇ、または１ｎｇ〜１００μｇの用量のＲＮＡを処方し投与する。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、一般的には、薬学的に許容可能な量かつ薬学的に許容可能な組成で投与される。そのような組成物は、通常の塩、緩衝物質、保存料、担体、および場合によっては治療上の作用物質を含んでいてもよい。医薬品中で使用する場合、塩は、薬学的に許容可能なものであるべきである。しかしながら、薬学的に許容されない塩を、その薬学的に許容可能な塩を調製するために使用してもよく、これも本発明に包含される。そのような薬理学的および薬学的に許容可能な塩としては、それだけに限定されるものではないが、以下の酸、つまり塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製してもよい。
【０２１８】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。用語「薬学的に許容可能な担体」は、本発明によると、一つまたは複数の、適合性のある固体または液体増量剤、希釈剤、またはヒトに投与する際に適したカプセル物質に関する。用語「担体」は、使用を容易にするために、その中で活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機成分または無機成分に関する。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の薬学的な効果を本質的に損なう相互作用が起こらないものである。
【０２１９】
好ましくは、担体は、無菌の液体、例えば水または油（石油、動物もしくは植物に由来するまたは合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ごま油、ヒマワリ油などを含む）である。塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も水性担体物質として使用可能である。
【０２２０】
補助物質および担体物質の例は、アクリル誘導体、メタクリル誘導体、アルギン酸、α−オクタデシル−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）−５−ソルビン酸のようなソルビン酸誘導体、アミノ酸およびその誘導体、特にコリン、レシチンおよびホスファチジルコリンのようなアミン化合物、アラビアゴム、矯味剤、アスコルビン酸；炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム；ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムのリン酸水素塩およびリン酸塩、カルメロースナトリウム、ジメチコン、染料、調味料、緩衝物質、保存料、増粘剤、可塑剤、ゼラチン、グルコースシロップ、麦芽、高分散シリカ、ヒドロメロース、安息香酸塩、特に安息香酸ナトリウムおよびカリウム、マクロゴール、脱脂粉乳、酸化マグネシウム、脂肪酸ならびにその誘導体および塩、例えば、ステアリン酸およびステアリン酸塩、特にステアリン酸マグネシウムおよびカルシウム、脂肪酸エステルならびに食用脂肪酸のモノおよびジグリセリド、天然および合成ろう、例えば、蜜ろう、黄ろうおよびモンタングリコールろう、塩化物、特に塩化ナトリウム、ポリビドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン；油、例えば、ヒマシ油、ダイズ油、ヤシ油、パーム核油；糖および糖誘導体、特に単糖および二糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、スクロース、デキストロースおよびセルロースならびにその誘導体、シェラック、デンプンおよびデンプン誘導体、特にコーンスターチ；獣脂、タルク、二酸化チタン、酒石酸；糖アルコール、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールならびにその誘導体；グリコール、エタノールおよびその混合物である。
【０２２１】
また、医薬組成物は好ましくは、湿潤剤、乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤をさらに含んでもよい。
【０２２２】
さらなる一実施形態において、医薬組成物は吸収増強剤を含んでもよい。所望の場合、組成物中において等モル量の担体物質をこの吸収増強剤で置き換えてもよい。そのような吸収増強剤の例としては、それだけに限定されるものではないが、オイカリプトール、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、ポリオキシアルキレンアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ミリスチン酸イソプロピル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、尿素、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどが挙げられる（例えば、Percutaneous Penetration Enhancers, Smith et al.編 (CRC Press, 1995)（非特許文献４５）を参照）。組成物中の吸収増強剤の量は、達成しようとする所望の作用に依存し得る。
【０２２３】
ペプチドまたはタンパク質作用物質の分解を予防し、バイオアベイラビリティを高めるために、プロテアーゼインヒビターを本発明の組成物、特にＦｌｔ３リガンドを含む組成物に組み込むことができる。プロテアーゼインヒビターの例としては、それだけに限定されるものではないが、アプロチニン、ロイペプシン、ペプスタチン、α２マクログロブリンおよびトリプシンインヒビターが含まれる。これらのインヒビターは、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【０２２４】
本発明の医薬組成物には一つまたは複数のコーティングを施すことができる。好ましくは、固形経口剤形は、胃液に耐性のコーティングを施されるか、または胃液に耐性の硬化軟ゼラチンカプセルの形態にある。
【０２２５】
本発明の医薬組成物は、酢酸の塩、クエン酸の塩、ホウ酸の塩およびリン酸の塩のような適切な緩衝物質を含んでいてもよい。
【０２２６】
医薬組成物はまた、場合によっては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールのような適切な保存料を含んでもよい。
【０２２７】
医薬組成物は通常、単位剤形で提供され、それ自体公知の方法で製造することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジ、液剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル剤の形態であるか、または乳濁液であってもよい。
【０２２８】
通常、非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張の、水性または非水性の無菌調製物を含む。許容可能な担体および溶剤は、例えば、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常は、無菌の不揮発性油を溶解媒体または懸濁媒体として用いる。
【０２２９】
以下の実施例および図面により本発明を詳細に記載する。これらはもっぱら説明のためのものであり、限定と理解すべきでない。説明および実施例に基づいて、当業者は本発明の範囲および添付の請求項の範囲を逸脱しないさらなる実施形態に至ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３〜９）に１０μｇのＦｌｔ３Ｌを異なる時点（１日目〜３日目または１日目、１日目、３日目、または０日目、３日目）で腹腔内投与した。１０日目にリンパ節（ＬＫ）ならびに脾臓を調製し、細胞数を決定した。データは、リンパ節の平均細胞数＋標準誤差を示す。*：チューキーの多重比較検定においてｐ＜０．０５。
【図２】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に１０μｇのＦｌｔ３Ｌを２度（０日目、３日目）腹腔内投与した。１０日目に鼠径リンパ節を調製し、適切な抗体で細胞を染色し、樹状細胞の亜集団をフローサイトメトリーで定量した。データは、亜集団の平均細胞数＋標準誤差を示す。両側独立ｔ検定において*：ｐ＜０．０５および**：ｐ＜０．００１。
【図３】麻酔をかけたＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）にそれぞれ２０μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを２度（０日目、３日目）鼠径リンパ節に投与した。マウスに様々なアジュバントを投与した（ＭＰＬＡ ０日目＋３日目、２０μｇ皮下；Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ０日目＋３日目、２０μｇ皮下；アルダラクリーム ０日目＋３日目、５μｇ経皮；ＧＭ−ＣＳＦ −２日目、−１日目、１日目、２日目、５μｇ皮下；ＩＬ−２（プロロイキン）１日目〜６日目、８００００ＩＵ皮下；Ｆｌｔ３Ｌ ｄ−７とｄ−４、１０μｇ腹腔内）。８日目にマウスから採血し、ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーおよび抗ＣＤ８抗体で染色した後、フローサイトメトリーでエピトープ特異的Ｔリンパ球の頻度を定量した。データは、２度の実験によるテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の平均頻度＋標準誤差を示す。チューキーの多重比較検定において*：ｐ＜０．０５および**：ｐ＜０．００１。
【図４】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）に１０μｇのＦｌｔ３ＬまたはＩｇＧ４を２度（０日目、３日目）腹腔内投与した。７日目と１０日目に、麻酔をかけたマウスにそれぞれ２０μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを鼠径リンパ節に投与した。１５日目に脾臓および鼠径リンパ節を調製した。（ａ）ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーおよび抗ＣＤ８抗体で染色した後、フローサイトメトリーでエピトープ特異的Ｔリンパ球の頻度を定量した。示したデータは、テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の平均数および平均頻度＋標準誤差を表す。（ｂ）ＩＦＮ−γを産生するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔリンパ球を測定するために、脾臓細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは対照ペプチドと共に６時間インキュベートした。１．５時間後にブレフェルジンＡを添加した［１０μｇ／ｍｌ］。サンプルを固定・透過処理後、抗ＣＤ８抗体および抗ＩＦＮγ抗体で染色した。示したデータは、非特異的なバックグラウンドを差し引いた、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度＋標準誤差を表す。*：両側独立ｔ検定においてｐ＜０．０５。（ｃ）典型的なドットプロット。記載のパーセントは、テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔリンパ球のそれぞれの頻度を示す。
【図５】（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に１０μｇのＣｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（赤色）または純粋なＣｙ３リボヌクレオチド（対照）をリンパ節内注入した。５分後および３０分後にそれぞれリンパ節標本を作成し、パラホルムアルデヒドで固定し、薄切した。対照リンパ節が最小限のバックグラウンドを示すのに対して、他方は細胞のＲＮＡシグナルが認められ、そのシグナルは５分から３０分へと明瞭になる。それは、細胞間に存在するＲＮＡの破壊に起因する。（ｂ）ヒト未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｃｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（５μｇ、赤色）およびＦＩＴＣ−デキストラン（１μｇ／μｌ、緑色）と１０分間コインキュベートし、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。時間動特性は、ＲＮＡがＦＩＴＣ−デキストランと最大限に共局在しながら、最初は細胞周辺部に局在し、次いで小胞が細胞質全体に見られるようになり、最後により大きい構造に合流する様子を示す。
【図６】（ａ）ヒトｉＤＣ（ｎ＝３）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な温度においてルシフェラーゼＲＮＡ（２０μｇ）と１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。その結果は、能動的エネルギー消費プロセスを示唆する。（ｂ〜ｃ）ヒトｉＤＣを様々なインヒビター（ジメチルアミロリド、サイトカラシンＤ、ＬＹ２９４００２、ロットレリン）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。特異性の高いマクロ飲作用インヒビター、ロットレリンにより９０％を超えるまでのＲＮＡ取り込み阻害が起こることが示された。（ｄ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの鼠径リンパ節をｉｎ ｖｉｖｏでロットレリン（１０μｌ［１０μＭ］）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡ（１０μｇ）をリンパ節内注入した。マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏでの阻害後、リンパ節でのＲＮＡ取り込みは劇的に低下した。（ｅ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に、０日目および３日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ節内投与し免疫化した。どちらの日にも、リンパ節を前記のようにロットレリンで前処理した。８日目に、末梢血中のテトラマー測定により免疫化の成功を定量的に確認した。リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化の成功は、マクロ飲作用により細胞がＲＮＡを取り込む能力と直接の相関関係にある。*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１；***、ｐ＜０．００１；（ＡＮＯＶＡとチューキーの多重比較検定）。
【図７】（ａ〜ｄ）ヒト（ａ、ｃ）およびマウス（ｂ、ｄ）樹状細胞を様々な薬剤（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４０Ｌ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）、成熟用混合物（ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１０００Ｕ／ｍｌ））で４０時間成熟化させた。その後、細胞をルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。２４時間後に、標準的な蛍光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。Ｃｙ３−ＲＮＡ取り込みを定量するために、細胞を、ＲＮＡとのインキュベーションから０．５時間後に洗浄し固定した。続いて、Ｃｙ３が仲介する蛍光を免疫蛍光顕微鏡を用いて定量した（Ｔｉｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ４．０、Ｔｉｌｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）。ｉＤＣの成熟後、ＲＮＡの取り込みは９０％超低下した。（ｅ）Ｐｏｌｙ Ｉ：ＣがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）にＰＢＳまたはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μｇ）を皮下注射し、２時間または２４時間後にルシフェラーゼＲＮＡをリンパ節内投与した。２４時間後に、標準的な生物発光アッセイによりルシフェラーゼシグナルを定量した。アジュバント投与後の時間間隔に応じて、ＲＮＡ取り込みの激しい低下が起こる。*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１；***、ｐ＜０．００１；（ＡＮＯＶＡとチューキーの多重比較検定）。（ｆ）Ｆｌｔ３−ＬがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）を、０日目と３日目に、Ｆｌｔ３−Ｌ１０μｇで腹腔内処理し、対照群では処理しなかった。１０日目にルシフェラーゼＲＮＡ２０μｇをマウスにリンパ節内投与した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光によりルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｆｌｔ３−Ｌ投与は、リンパ節でのＲＮＡ取り込みを阻害する作用を示さない。
【図８】Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に、０日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、またはヒトＩｇＧ４を腹腔内投与した。１０日目にマウスリンパ節を調製し、フローサイトメトリーで特徴づけた。樹状細胞（ＤＣ（マーカー：ＣＤ１１ｃ＋／ＮＫ１．１−））、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ４−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（マーカー：ＣＤ１９＋／ＣＤ３−／ＮＫ１．１−）。
【図９】ナイーブなＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７）に、０日目、３日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））、またはヒトＩｇＧ４を腹腔内投与した。７日目、１０日目には、このマウスにＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ内投与し免疫化した。対照群は処理しなかった（ｎ＝２）。 １５日目に、ＭＨＣ多量体測定を使用して、末梢血から抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度を測定した。
【図１０】マウス血清中Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４ の時間動特性（ｚｅｉｔｋｉｎｅｔｉｋ）。（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、２０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。半減期は、２．１４日（＝５１時間）である。（ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。半減期は、１．６６７日（＝４０時間）である。
【図１１】Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療のためのワクチン接種。Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種の併用の相乗作用を調べるために、治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１０μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１１日目、１４日目、１７日目、２４日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。マウス生存率のカプラン・マイヤープロットを示す。マウスは、腫瘍直径が一つの軸方向で＞１．５ｃｍの場合に屠殺した。
【図１２】Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療のためのワクチン接種。腫瘍成長に関する検査。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１０日目、１４日目、１８日目、２１日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。腫瘍接種の後定期的に（７日目、１０日目、１３日目、１６日目、１９日目、２２日目）腫瘍体積を求めた。腫瘍接種後日数［日数］における平均腫瘍体積［ｍｍ３］を示す。
【実施例】
【０２３１】
実施例１
この実施例および以下の実施例で使用した組換えヒトＦｌｔ３リガンドは、ＩｇＧ４との融合タンパク質として調製し、配列番号６の配列を有する。そのために、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４融合タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターにクローニングした。作成されたプラスミドをリポフェクションによりＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｒ． ＣＲＬ−１５７３）にトランスフェクトした。上清を集め、プロテインＡカラム（ＧＥ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により製造元の記載に従って精製した。産物をＰＢＳで透析し、等量に分け、使用するまで凍結した。
【０２３２】
ヒトＦｌｔ３リガンドの投与がＲＮＡベースの免疫化の効率に及ぼす影響をテストするために、まずマウスモデルで、リンパ節および脾臓の細胞組成の変化を調査した。そのために、組換えＦｌｔ３−Ｌの様々な投与レジメン（２ｘ、３ｘ、５ｘ１０μｇ）を腹腔内投与し、最初の注入から１０〜１２日後に細胞数（Ｚｅｌｌｕｌａｒｉｔａｅｔ）を決定した。マウス系に関する文献に記載されているように、脾臓およびリンパ節で細胞数の増加を示すことができた（図１）（Lyman, S.D. et al. (1994) Blood 83、2795〜2801頁（非特許文献４６）、Hannum, C. et al. (1994) Nature 368、643〜648頁（非特許文献４７）、Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁（非特許文献４８））。さらに、マウスおよびヒトに関して発表されたデータと一致して、Ｆｌｔ３−Ｌを様々な用量で投与すると樹状細胞が増加することが示された（図２）（Maraskovsky, E. et al. (1996) Journal of Experimental Medicine 184、1953〜1962頁（非特許文献４８）、McNeel, D.G. et al. (2003) Journal of Clinical Immunology 23、62〜72頁（非特許文献４９）、Freedman, R.S. et al. (2003) Clinical Cancer Research 9、5228〜5237頁（非特許文献５０）、Maraskovsky, E. et al. (2000) Blood 96、878〜884頁（非特許文献５１））。脾臓およびリンパ節中の樹状細胞のすべての関連する亜集団についてこの増加を示すことができた（図２）。
【０２３３】
実施例２
以下では、様々な公知のアジュバント（アルダラ、モノホスホリルリピッドＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＬ２）およびＦｌｔ３−Ｌが、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後に、末梢血でのナイーブＴ細胞のプライミングおよびその頻度にどのように影響するかを調査した。このために、アジュバントを皮下投与または腹腔内投与し（詳細は図３のキャプションを参照）、３日おきに２度、Ｈ−２Ｋｂ拘束ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープをコードするＲＮＡでマウスを免疫化した。２度目の免疫化から５日後に、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、血中のテトラマー測定により定量した。意外なことに、この分析により、Ｆｌｔ３−Ｌを除くすべてのアジュバントはＴ細胞プライミングの効率を低下させることが示された（図３）。ネイキッドＩＶＴ−ＲＮＡの投与の設定におけるアジュバントの使用に関しては、前述の研究のみがこれまで発表されており、その中では、ＲＮＡ皮内注射後のＧＭ−ＣＳＦの投与のみが、ＲＮＡ注射に先立つ投与とは対照的にＲＮＡ単独注射と比べて利点をもたらすことが示された（Carralot, J.P. et al. (2004) Cell Mol. Life Sci. 61、2418〜2424頁（非特許文献５２））。このデータは、ＧＭ−ＣＳＦがＲＮＡ免疫化前（−４８時間、−２４時間）に投与された、我々の実験と一致する。その上、我々のデータによりはじめて、既成のアジュバントは傾向的にＴ細胞プライミング効率を悪化させるのに対して、Ｆｌｔ３−Ｌは有意な上昇を誘導することが示される（図３）。最後の免疫化から７日目の末梢血を材料としたさらなるテトラマー分析は、似かよった結果を示す（データは示さない）。
【０２３４】
実施例３
さらなる実験では、ヒトＦｌｔ３−Ｌの投与が、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後に、別の器官（脾臓）においても抗原特異的機能性Ｔ細胞の頻度を有意に上昇させることを証明できた。このために、０日目と３日目に、それぞれ１０μｇのＦｌｔ３−ＬまたはヒトＩｇＧ４をマウスに腹腔内注射した。次いで、７日目と１０日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡを用いてリンパ節内免疫化を行なった。１５日目に、テトラマー測定および細胞内サイトカイン測定により、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を定量した（図４）。その際、テトラマー定量化により、Ｆｌｔ３−Ｌで前処理した群における、エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の有意な上昇が示された（脾臓：８．２％対２．５％）。機能レベルでは、これらの細胞はＩＦＮγを分泌する能力ももつことが示された（図４）。さらなる調査は、２ｘ１０μｇ用量を超えるＦｌｔ３−Ｌの用量上昇が免疫応答の強化を伴わないことを示した（データは示さない）。
【０２３５】
実施例４
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に１０μｇのＣｙ３蛍光標識されたＲＮＡまたは純粋なＣｙ３リボヌクレオチド（対照）をリンパ節内注入した。５分後および３０分後にリンパ節標本を作成し、パラホルムアルデヒド固定後にクリオスタット切片を免疫蛍光顕微鏡で評価した。図５に示す典型的な切片は、対照リンパ節における最小限のバックグラウンド、および細胞のＲＮＡシグナル（赤色）を示し、そのシグナルは５分から３０分へと明瞭になる。これは、細胞間に存在するＲＮＡの破壊に起因する。
【０２３６】
さらに、ヒト未成熟樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃｙ３蛍光標識されたＲＮＡ（５μｇ、赤色）およびＦＩＴＣ−デキストラン（１μｇ／μｌ、緑色）と１０分間コインキュベートし、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。時間動特性は、ＲＮＡがＦＩＴＣ−デキストランと最大限に共局在しながら、最初は細胞周辺部に局在し、次いで小胞が細胞質全体に見られるようになり、最後により大きい構造に合流する様子を示す。
【０２３７】
したがって、ネイキッドＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも細胞に取り込まれることが証明できた。
【０２３８】
実施例５
いくつもの公知のアジュバントについてアジュバント作用の欠如という現象を詳細に調査した。
【０２３９】
ネイキッドＲＮＡ（つまり液体、例えばＰＢＳに溶解）が、例えばリンパ節に注入後、ほとんど樹状細胞によってのみ取り込まれることを確認した。その際、この取り込みは非常に効率がよい。取り込まれたＲＮＡは続いて翻訳される。
【０２４０】
ネイキッドＲＮＡ の取り込みプロセスを特徴づけるために、ヒトｉＤＣ（ｎ＝３）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な温度においてルシフェラーゼＲＮＡ（２０μｇ）と１５分間コインキュベートした。さらに２２時間３７℃で培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡ の取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。図６（ａ）に示す結果は、能動的エネルギー消費プロセスを示唆する。
【０２４１】
ｉＤＣ中で保存的に活性なマクロ飲作用がネイキッドＲＮＡの取り込みに重要であるかを調査するために、ヒトｉＤＣを様々なインヒビター（ジメチルアミロリド、サイトカラシンＤ、ＬＹ２９４００２、ロットレリン）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。さらに２２時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡの取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。Ｃｙ３−ＲＮＡ（赤色）とコインキュベートしたｉＤＣを、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。特異性の高いマクロ飲作用インヒビター、ロットレリンにより９０％超までのＲＮＡ取り込み阻害が起こることが示された。図６（ｂ〜ｃ）を参照。
【０２４２】
マクロ飲作用が、リンパ節におけるＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの重要な取り込み機構でもあるかどうかを解明するために、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの鼠径リンパ節をロットレリン（ｎ＝４、１０μＭ）で前処理してから、ルシフェラーゼＲＮＡ（１０μｇ）をリンパ節内注入した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光シグナルを測定した。図６（ｄ）には平均値＋標準誤差を示す。マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏ阻害後、リンパ節でのＲＮＡ取り込みが劇的に低下することを証明できた。
【０２４３】
マクロ飲作用のｉｎ ｖｉｖｏ阻害が、リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化後のＴ細胞プライミング効率に影響するかどうかを調査するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）に、０日目および３日目に、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ節内投与し免疫化した。どちらの日にも、リンパ節を前記のようにロットレリンで前処理した。ＣＤ８＋抗原特異的Ｔリンパ球の頻度の平均値＋標準誤差を示す。リンパ節内投与によるＲＮＡ免疫化の成功は、マクロ飲作用により細胞がＲＮＡを取り込む能力と直接の相関関係にあることを証明できた。図６（ｅ）を参照。
【０２４４】
ＲＮＡを取り込む主要取り込み機構はマクロ飲作用である。例えば、マクロ飲作用を阻害する化学物質（例えばロットレリン）でマクロ飲作用を阻害すると、ワクチン作用はほぼ完全に失われる。
【０２４５】
実施例６
次に、マクロ飲作用のダウンレギュレーションを伴う、ｉＤＣの成熟が、ＲＮＡの取り込みをどの程度低下させるかを調査した。結果を図７に示す。
【０２４６】
ヒト（図７（ａ、ｃ））およびマウス（図７（ｂ、ｄ））樹状細胞を様々な薬剤（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４０Ｌ（１．０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）、成熟用混合物（ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（１０００Ｕ／ｍｌ））で４０時間成熟化させた。その後、細胞をルシフェラーゼＲＮＡまたはＣｙ３−ＲＮＡと１５分間コインキュベートした。さらに２２時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイによりＲＮＡの取り込みを定量した。平均値＋標準誤差を示す。Ｃｙ３−ＲＮＡ（赤色）とコインキュベートしたｉＤＣを、パラホルムアルデヒドで固定し、対比染色（ヘキスト３３３４２、青色）した。Ｃｙ３蛍光の定量化でもルシフェラーゼアッセイでも、ｉＤＣの成熟後、ＲＮＡの取り込みが９０％超低下することが示された。このデータは、ＤＣの成熟はマクロ飲作用をダウンレギュレーションさせることを示す発表データと一致する。
【０２４７】
成熟させるアジュバントがｉｎ ｖｉｖｏでもどの程度ＲＮＡの取り込みを低下させるかを調査するために、Ｐｏｌｙ Ｉ：ＣがＲＮＡ取り込みに及ぼす効果をテストした。図７（ｅ）を参照のこと。このために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）にＰＢＳまたはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（２０μｇ）を皮下注射し、２時間または２４時間後にルシフェラーゼＲＮＡをリンパ節内投与した。さらに２４時間たってから、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光を測定した。平均値＋標準誤差を示す。アジュバント投与後の時間間隔に応じて、ＲＮＡ取り込みの激しい低下が起こることを証明できた。このデータは、ＤＣの完全な成熟化には約２４時間が必要とされるという観察と一致する。
【０２４８】
それとは対照的に、Ｆｌｔ３−Ｌ投与は、リンパ節でのＲＮＡ取り込みを阻害する作用を示さない。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）を、０日目と３日目に、Ｆｌｔ３−Ｌ１０μｇで腹腔内処理し、対照群では処理しなかった。１０日目にルシフェラーゼＲＮＡ２０μｇをマウスにリンパ節内投与した。２４時間後に、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光によりルシフェラーゼシグナルを測定した。図７（ｆ）は、個々の各マウスの測定結果を示す。バーは、一群の全測定値の平均値を示す。この実験は、３つの独立した実験を代表するものである。統計：スチューデントのｔ検定。
【０２４９】
さらに、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３〜７）にＦｌｔ３Ｌを２度（０日目と３日目に、それぞれ１０μｇ）投与した。１０日目にリンパ節の標本を作製し、樹状細胞の活性化状態（ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０）をフローサイトメトリーで決定した。Ｆｌｔ３Ｌ投与は、リンパ節内の樹状細胞を成熟化させないことが証明できた。
【０２５０】
実施例７
様々なＦｌｔ３Ｌがリンパ節の細胞組成に及ぼす影響
この実験では、マウスリンパ節の様々な細胞集団に及ぼす影響に関して、市販のＦｌｔ３調製物と共に、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−ＩｇＧ４）を調査した。市販のＦｌｔ３調製物としては、細菌内で組換え発現された産物（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｆｌｔ３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびヒトＨＥＫ２９３細胞で発現された産物（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ Ｆｌｔ３Ｌ、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社、Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ、Ｕ.Ｓ.Ａ）を使用した。対照としてはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
【０２５１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、０日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、またはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腹腔内投与した。１０日目にマウス鼠径リンパ節の両方ともを調製し、細胞数をノイバウアーチャンバ（Ｎｅｕｂａｕｅｒｋａｍｍｅｒ）でカウントし、細胞集団をフローサイトメトリーで特徴づけた。
【０２５２】
様々な細胞集団を以下のマーカー組み合わせにより定義した：樹状細胞（ＤＣ（マーカー：ＣＤ１１ｃ＋／ＮＫ１．１−）、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（マーカー：ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ４−／ＮＫ１．１−）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（マーカー：ＣＤ１９＋／ＣＤ３−／ＮＫ１．１−）。表面マーカーを検出するための抗体は、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から取り寄せた。図８には、樹状細胞（全ＤＣ）、ＣＤ４ 陽性、ＣＤ８ 陽性およびＣＤ１９ 陽性細胞の頻度を、リンパ節の調製された細胞の総数に対して示す。
【０２５３】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４によって引き起こされる効果は、市販のＦｌｔ３Ｌ産物によって誘導される効果に類似することが示された。樹状細胞の増殖に関して、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４と Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社のＦｌｔ３Ｌとは高い類似性を示し、この点でＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社のＦｌｔ３Ｌは、わずかな能力しか示さなかった。リンパ球集団の増殖に関しては、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の効果が傾向的には最も著しかった。
【０２５４】
実施例８
様々なＦｌｔ３ＬがナイーブＴ細胞の刺激に及ぼす影響
この実験では、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４のアジュバント機能が市販のＦｌｔ３Ｌ産物とどの程度同等であるかを調査した。このために選ばれたのは、細菌内で組換え発現された産物（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｆｌｔ３Ｌ）、およびヒトＨＥＫ２９３細胞で発現された産物（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ Ｆｌｔ３Ｌ）であった。例７を参照のこと。対照としてはヒトＩｇＧ４を使用した。
【０２５５】
ナイーブなＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７）に、０日目、３日目に、０．４モル量のＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４、またはＦｌｔ３Ｌ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社）、またはＦｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））、またはヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ社）を腹腔内投与した。７日目、１０日目にこのマウスにＳＩIＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡ（２０μｇ）をリンパ内投与し免疫化した。対照群は処理しなかった（ｎ＝２）。１５日目に、ＭＨＣ多量体測定（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して、末梢血から抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度をフローサイトメトリーで測定した。
【０２５６】
Ｆｌｔ３Ｌを、等モル量でマウスに腹腔内投与した（０日目、３日目）。加えて、マウスに２度、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡをリンパ節内投与し免疫化した（７日目、１０日目）。１５日目にテトラマー染色により、免疫化の成功をフローサイトメトリーで定量した。
【０２５７】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４も市販のＦｌｔ３Ｌ産物も明らかなアジュバント効果をもつことが示された。免疫化されなかった対照群は、テトラマー陽性Ｔ細胞の有意な頻度を示さなかった。Ｆｌｔ３Ｌを投与せずに免疫化されたマウスと比べて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度は、２〜３倍に上昇した。傾向的には、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を使用した際に最も強力な効果が観察できた（図９）。
【０２５８】
実施例９
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４ の血清半減期の算定
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の血清半減期を算定するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）の２群に、２０μｇまたは５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を腹腔内投与した。定められた時点（投与前；３時間、２４時間、４８時間、３日、５日、７日、９日、１４日、２１日）にマウスの血清サンプルを保管した。ヒトＩｇＧを定量するために、このサンプルをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。我々のコンストラクトではヒトＩｇＧ４ がＦｌｔ３Ｌに融合されているため、マウス血清中のヒトＩｇＧを定量することでＦｌｔ３Ｌ濃度を算出することができる。データは、初期最大値に続き、Ｆｌｔ３Ｌが注入から５日後までマウス血清中に検出可能であることを示す。算出された半減期は、５０μｇのＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の場合４０時間であり、２０μｇの半減期（ＨＷＺ）は５１時間である。
【０２５９】
これらの値は、Ｆｌｔ３Ｌの半減期として発表された値５時間（Robinson et al.、2003、BMT、31、361〜369頁（非特許文献５３））と比べると、ＩｇＧ４ 融合部分を伴わないＦｌｔ３Ｌに対してＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４の安定性が上昇していることを示す（図１０）。
【０２６０】
実施例１０
Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療上のワクチン接種
Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種との併用の相乗作用を調べるために、治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した（Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁（非特許文献５４））。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１０μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１７日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１１日目、１４日目、１７日目、２４日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を投与した。
【０２６１】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４とリンパ節内へのＲＮＡワクチン接種との併用は相乗的に作用することが示された。Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４を伴わないＲＮＡワクチン接種では１／３のマウスしか長期的に生存しないのに対して、Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４との組み合わせにより、長期的に生存するマウスの割合は約８０％に上昇することができる。ＲＮＡワクチン接種を伴わないＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４は、腫瘍成長に対して最小の治療効果を示し、１０％の動物の長期生存しかもたらさない（図１１）。
【０２６２】
実施例１１
Ｂ１６ Ｏｖａ腫瘍に対する治療上のワクチン接種
Ｆｌｔ３ＬとＲＮＡワクチンの併用投与の相乗効果を証明するために、さらにもう一つの治療上の腫瘍実験を行なった。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる４群（ｎ＝１０）を形成した。０日目に全マウスにＢ１６ Ｏｖａ腫瘍細胞（２ｘ１０５）を皮下注射した（Bellone et al.、J. Immunol.、2000、165、2651〜2656頁（非特許文献５４））。このうち一つの対照群はＩｇＧ４注射でのみ処理した（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。第２の対照群にはＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４注射のみ行なった（１５μｇ；３日目、７日目、１４日目、１８日目）。最初の治療群は、ＳＩＩＮＦＥＫＬをコードするＲＮＡのリンパ節内注入（２０μｇ；１０日目、１４日目、１８日目、２１日目）とＩｇＧ４投与とを組み合わせて治療し、第２の治療群には、ＲＮＡ免疫化に加えて、前記のようにＦｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４（Ｆｌｔ３Ｌ）を投与した。腫瘍接種後の以下の日に腫瘍体積を求めた：ｄ７、ｄ１０、ｄ１３、ｄ１６、ｄ１９およびｄ２２（ｄ＝日）。
【０２６３】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＩｇＧ４とリンパ節内へのＲＮＡワクチン接種との併用は相乗的に作用することが示された。Ｆｌｔ３Ｌを単独で投与すると、腫瘍成長のわずかな遅延しか見られず、ＲＮＡワクチンを単独接種した場合も、減速はしたものの進行性の腫瘍成長があった。Ｆｌｔ３Ｌ投与とＲＮＡワクチン接種を組み合わせてはじめて腫瘍成長の完全な停止が認められた（図１２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを含む免疫原性調製物。
【請求項２】
ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１に記載の免疫原性調製物。
【請求項３】
ＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られた、請求項１または２に記載の免疫原性調製物。
【請求項４】
少なくとも一つのＲＮＡ安定化因子をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の免疫原性調製物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の免疫原性調製物を含む医薬組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な希釈剤および／または薬学的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物。
【請求項７】
ワクチンとしての製剤形態にある、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
リンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｅ）投与用の製剤形態にある、請求項１〜４のいずれか一つに記載の免疫原性調製物または請求項５〜７のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞を、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドと接触させることを含む、少なくとも一つの抗原を細胞に供給するための方法。
【請求項１０】
免疫応答を向けさせるべき少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体において免疫応答を惹起または強化するための方法。
【請求項１１】
前記免疫応答が、個体に対して保護および／または治療作用を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が抗原特異的なＴ細胞免疫応答を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において抗原特異的エフェクター細胞の量を上昇させるための方法。
【請求項１４】
前記抗原特異的エフェクター細胞が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫応答を向けさせるべき腫瘍抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのがんを予防および／または治療するための方法。
【請求項１６】
免疫応答を向けさせるべきウイルス抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのウイルス感染を予防および／または治療するための方法。
【請求項１７】
免疫応答を向けさせるべき細菌性抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中での細菌感染を予防および／または治療するための方法。
【請求項１８】
アレルギーに関連するアレルゲンをコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのアレルギーを予防および／または治療するための方法。
【請求項１９】
個体の細胞へのＲＮＡの取り込みを促進するのに適した量でＦｌｔ３リガンドが投与される、請求項１０〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
個体がヒトである、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドが互いに独立に、静脈内、筋内、皮下、経皮、鼻腔内、およびリンパ内投与からなる群から選択される一つの経路で投与される、請求項１０〜２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ワクチンＲＮＡの免疫原性を高めるためのＦｌｔ３リガンドの使用。
【請求項１】
少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡとＦｌｔ３リガンドとを含む免疫原性調製物。
【請求項２】
ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１に記載の免疫原性調製物。
【請求項３】
ＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られた、請求項１または２に記載の免疫原性調製物。
【請求項４】
少なくとも一つのＲＮＡ安定化因子をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の免疫原性調製物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の免疫原性調製物を含む医薬組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な希釈剤および／または薬学的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物。
【請求項７】
ワクチンとしての製剤形態にある、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
リンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｅ）投与用の製剤形態にある、請求項１〜４のいずれか一つに記載の免疫原性調製物または請求項５〜７のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞を、少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡおよびＦｌｔ３リガンドと接触させることを含む、少なくとも一つの抗原を細胞に供給するための方法。
【請求項１０】
免疫応答を向けさせるべき少なくとも一つの抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体において免疫応答を惹起または強化するための方法。
【請求項１１】
前記免疫応答が、個体に対して保護および／または治療作用を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が抗原特異的なＴ細胞免疫応答を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中において抗原特異的エフェクター細胞の量を上昇させるための方法。
【請求項１４】
前記抗原特異的エフェクター細胞が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫応答を向けさせるべき腫瘍抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのがんを予防および／または治療するための方法。
【請求項１６】
免疫応答を向けさせるべきウイルス抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのウイルス感染を予防および／または治療するための方法。
【請求項１７】
免疫応答を向けさせるべき細菌性抗原をコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中での細菌感染を予防および／または治療するための方法。
【請求項１８】
アレルギーに関連するアレルゲンをコードするＲＮＡを投与すること、およびＦｌｔ３リガンドを投与することを含む、個体中でのアレルギーを予防および／または治療するための方法。
【請求項１９】
個体の細胞へのＲＮＡの取り込みを促進するのに適した量でＦｌｔ３リガンドが投与される、請求項１０〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
個体がヒトである、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡとＦｌｔ３リガンドが互いに独立に、静脈内、筋内、皮下、経皮、鼻腔内、およびリンパ内投与からなる群から選択される一つの経路で投与される、請求項１０〜２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ワクチンＲＮＡの免疫原性を高めるためのＦｌｔ３リガンドの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５１１５２８（Ｐ２０１２−５１１５２８Ａ）
【公表日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９９４７（Ｐ２０１１−５３９９４７）
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００８８１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６６４１８
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５１０１６４２６７）ビオエヌテヒ・アクチエンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５０６２６１５２３）ヨハネス グーテンベルク ウニベルジテート マインツ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００８８１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６６４１８
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５１０１６４２６７）ビオエヌテヒ・アクチエンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５０６２６１５２３）ヨハネス グーテンベルク ウニベルジテート マインツ (6)
【Ｆターム（参考）】
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