ＲＮＡ合成に有用な水酸基の新規保護基を有する化合物
【課題】 安価な導入試薬を用いてリボヌクレオシドの２’−水酸基に導入可能でかつ、リン酸ジエステルの転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能な２’−水酸基の保護基を提供する。
【解決手段】 一般式（Ｉ）
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基などを表わし、Ｒ３は水素原子などを表わし、Ｒ４は水素原子などを表わし、Ｘは酸素原子などを表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【解決手段】 一般式（Ｉ）
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基などを表わし、Ｒ３は水素原子などを表わし、Ｒ４は水素原子などを表わし、Ｘは酸素原子などを表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２’−水酸基に保護基もしくは修飾基として用いうる基を有するヌクレオシドおよびそのホスホロアミダイト誘導体、それらを用いたオリゴヌクレオチドの合成法、その合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド、並びに前記保護基等を導入するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでにオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の合成法が盛んに開発されてきた。その中でも、２’−水酸基の保護基は効率的なＲＮＡ合成のために最も重要なもののひとつである。これまでに数多くの２’−水酸基の保護基が報告されているが、現在の核酸化学で実用化されているものは数種類しかない。ＲＮＡ合成に適した２’−水酸基の保護基には以下の性質が要求される。１）保護基の導入試薬が安価である。２）２’−水酸基に容易に高収率で導入できる。３）オリゴヌクレオチド合成の条件下で安定であること。４）容易かつ選択的に脱保護できること。
【０００３】
現在用いられている代表的な２’−水酸基の保護基としては非特許文献１に記載のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、非特許文献２に記載のトリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基などケイ素を利用したものがある。しかし、一般にケイ素を含む保護基はその導入試薬が高価であり、経済的な観点からは最良のものとはいえない。また非特許文献３にはＴＢＤＭＳ基の脱保護時に、３’位のリン酸ジエステル結合が遊離になった２’−水酸基に転位した問題も報告されており、これらの問題の解決が必要である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ編 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ−， Ｃｈａｐｔｅｒ ５ Ｍａｓａｄ，Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋｅｌｖｉｎ，Ｋ Ｏｇｉｌｖｉｅ著 Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
【非特許文献２】Ｓ． Ｐｉｔｓｃｈ，Ｐ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ｊｅｎｎｙ，Ａ．Ｓｔｕｔｚ，Ｘ．Ｗｕ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ８４巻 ３７７３ページ ２００１年
【非特許文献３】Ｍ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｓ．Ａ．Ｋａｚａｋｏｖ，Ｓ．Ｍ．Ｈｅｃｈｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３巻 ３９４９ページ １９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、安価な導入試薬を用いてリボヌクレオシドの２’−水酸基に導入可能でかつ、リン酸ジエステルの転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能な２’−水酸基の保護基を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ジオキソラン−もしくはジチオラン−４,５−ジカルボン酸誘導体からなる基をリボヌクレオシドの２’−水酸基の保護基として用いることに思い至り、これによって本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供するものである。
【０００８】
（１）一般式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わし、Ｒ４は水素原子、又は一般式（II）
【００１０】
【化２】
（式（II）中、Ｒ５はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、又はふたつのＲ６が互いに結合して環を形成した基を表わす。）
で表わされる基を表わし、Ｘは酸素原子、又は硫黄原子を表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【００１１】
（２）一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする（１）記載の化合物。
【００１２】
（３）一般式（Ｉ）におけるＲ３が、水素原子、又は４,４’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする（１）又は（２）記載の化合物。
【００１３】
（４）一般式（II）におけるＲ５が、２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、又はメチル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか記載の化合物。
【００１４】
（５）一般式（II）におけるＲ６が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（４）のいずれか記載の化合物。
【００１５】
（６）一般式（Ｉ）におけるＸが、酸素原子を表わすことを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか記載の化合物。
【００１６】
（７）一般式（Ｉ）におけるＹが、保護基を有してもよいウラシル−１−イル基、チミン−１−イル基、アデニン−９−イル基、又はグアニン−９−イル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか記載の化合物。
【００１７】
（８）（１）乃至（７）のいずれか記載の化合物を用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。
【００１８】
（９）（８）記載の合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド。
【００１９】
（１０）一般式（III）
【００２０】
【化３】
〔式（III）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ７はアルキル基を表わす。〕
で表わされる化合物からなることを特徴とする水酸基への保護基導入試薬。
【００２１】
（１１）一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする（１０）記載の水酸基への保護基導入試薬。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の化合物は、安価な導入試薬を用いてリボヌクレオシドの２’−水酸基に保護基を導入することで容易に得られ、かつその保護基はリン酸ジエステルの転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能であることからリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド合成に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【化４】
【００２５】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わす。ここでアルコキシ基とは、例えば、炭素数１から５のアルコキシ基を表わし、イソプロピル基のように分岐したものも含まれる。アルキルアミノ基とは、例えば、窒素原子上に炭素数１から５のアルキル基がひとつ結合したアルキルアミノ基を表わし、ジアルキルアミノ基とは、例えば、窒素原子上に炭素数１から５のアルキル基がふたつ結合したジアルキルアミノ基を表わす。Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わす。置換基を有してもよいトリチル基とは、例えば、４,４’−ジメトキシトリチル基、４−メトキシトリチル基などをさす。置換基を有してもよいシリル基とは、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基などを表わす。Ｒ４は水素原子または一般式（II）で表わされる基を表わす。
【００２６】
【化５】
【００２７】
ここで、一般式（II）中、Ｒ５は２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、メチル基などのリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などを表わす。また、ふたつのＲ６が互いに結合して環を形成して、ピペリジン、モルホリン、ピロリジンなどの環を形成してもよい。
【００２８】
Ｘは、酸素原子、硫黄原子を表わし、酸素原子が好ましい。
【００２９】
Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。ここで保護基とはＤＮＡおよびＲＮＡの合成において核酸塩基部の保護基として用いうるものであれば特に限定されないが、例えばベンゾイル基、アセチル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキシアセチル基、（４−イソプロピルフェニル）オキシアセチル基などのアシル基や、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン基、（ピロリジン−１−イル）メチレン基などのメチレン基などを例示することができる。
【００３０】
核酸塩基とは、天然の生物のＤＮＡおよびＲＮＡに含まれるヌクレオチドの塩基部部分全般を示すが、特にアデニン−９−イル、グアニン−９−イル、シトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、チミン−１−イルなどの基が挙げられる。また、これらの保護基が核酸塩基に導入された例としては、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン−９−イル、６−Ｎ−フェノキシアセチルアデニン−９−イル、２−Ｎ−イソブチリルグアニン−９−イル、２−Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキシアセチルグアニン−９−イル、４−Ｎ−アセチルシトシン−１−イル、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イルなどを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３１】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、例えば、ウリジンの５’及び３’水酸基を保護した誘導体から、式（III)で表される保護基導入試薬を用いて、カンファースルホン酸やトシル酸などの酸触媒またはBF3やTiCl4などのルイス酸を用いてオルトエステル交換反応によって合成できる。触媒としてはカンファースルホン酸が好ましい。
【００３２】
【化６】
【００３３】
上記一般式（III）において、Ｒ１、Ｒ２は、一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２と同様の基を表わす。Ｒ７は、例えば、炭素数１から５のアルキル基を表わす。一般式（III）で表わされる化合物は、水酸基（主にリボヌクレオシドの２’−水酸基）への保護基導入試薬として利用することができる。
【００３４】
次に、本発明のオリゴヌクレオチド合成法について説明する。ここで述べるオリゴヌクレオチドとは、例えば、リボヌクレオチドの２から１００量体からなるオリゴマー、リボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドが任意の配分および任意の配列で重合した２から１００量体からなるオリゴマーなどを指す。リボヌクレオチドやデオキシヌクレオチドとしてはアデニル酸、デオキシアデニル酸、グアニル酸、デオキシグアニル酸、シチジル酸、デオキシシチジル酸、ウリジル酸、チミジル酸を例示することができるが、それらに限定されるものでない。また、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する工程の途中に得られる、２’−水酸基に一般式（III）で表わされる化合物によって導入された保護基を有した状態の化合物も含む。
【００３５】
これらのオリゴヌクレオチドは、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のうち、Ｒ３が水素原子以外であり、Ｒ４が一般式（II）で表わされる基である化合物（ホスホロアミダイト化合物）を用い、当業者に公知の固相条件もしくは液相条件でのホスホロアミダイト法により合成が可能である。ホスホロアミダイト法としては、例えばホスホロアミダイトと１Ｈ−テトラゾールを用いて、ヌクレオシドやオリゴヌクレオチドの５’水酸基にヌクレオチドユニットを伸長する縮合反応、未反応の水酸基を無水酢酸などを用いてアセチル化するキャップ化反応、縮合反応により生成したホスファイトトリエステルを酸化する酸化反応、５’末端の４,４−ジメトキシトリチル基などを酸性条件下で除去するデブロック反応の四つの工程を繰り返し、オリゴヌクレオチドを伸長する反応を指し、最後に濃アンモニアなどによる核酸塩基部とリン酸部の脱保護を行う。完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する際には、さらに引き続き、本発明の保護基をｐＨ２〜５の条件下除去することで得ることができる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドは例えばＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチド医薬品素材（アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを利用した遺伝子修復用の資材）および遺伝子解析プローブ、人工酵素、アプタマーなどとして用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下本発明品を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００３８】
〔原料合成例１〕
２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル
【００３９】
【化７】
【００４０】
Ｄ,Ｌ−酒石酸ジエチル（１０ ｇ, ４８ ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ ｍL）に溶解し、オルトギ酸トリエチル （１９．４ ｇ,１３１ ｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（２０ ｍｇ, ０．０８６ ｍｍｏｌ）を加え、エタノールの留去が終了するまで９５℃で反応させた。反応系をピリジン（１ ｍL）を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物（１２ ｇ, ９５％）を得た。
【００４１】
Ｄ体: 1H MNR (CD3Cl; 500MHz) δ(ppm): 1.19-1.29 (t, 3H); 1.3-1.35 (m, 6H); 3.66-3.70 (m, 2H);4.27-4.32 (m, 4H); 4.726-4.734 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.05-5.06 (d, 1H, J-4.151Hz);6.09 (s, 1H).
Ｌ体: 1H MNR (CD3Cl; 500MHz) δ(ppm): 1.2-1.23 (t, 3H); 1.3-1.35 (m, 6H); 3.67-3.7 (m, 2H);4.28-4.3 (m, 4H); 4.71-4.72 (d, 1H, J-4.395Hz); 5.04-5.05 (d, 1H, J-4.395Hz); 6.083 (s, 1H)
【００４２】
〔原料合成例２〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン
【００４３】
【化８】
【００４４】
３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン （１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体８５％、L体８０％で得た。
【００４５】
Ｄ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 0.93-1.09 (m, 28H); 1.28-1.34 (m, 6H); 3.94-4.06 (d.m,2H);4.21-4.29 (m, 4H); 4.45-4.46 (d, 1H, J-4.639Hz); 4.74-4.76 (d, 1H, J-5,372Hz);5.09-5.1 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.67-5.68 (d, 1H, J-7.787Hz); 5.81 (s, 1H); 6.495 (s, 1H); 7.8-7.81 (d, 1H, J-8.057Hz); 9.45 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12,62-14.34; 17.02; 17.17--17.7; 59.6; 62.29; 62.36;
67.57; 75.74; 76.57; 76.97; 89.62; 101.79; 116.49; 140.13; 150.07;164.15; 168.68; 168.93
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 0.93-1.1 (m, 28H); 1.29-1.35 (m, 6H); 3.95-3.98 (d.m,2H);4.15-4.33 (m, 4H); 4.39-4.41 (d, 1H, J-3.349Hz); 4.78-4.79 (d, 1H, J-5.127Hz);5.02-5.21 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.64(s, 1H,); 5.65-5.67 (d, 1H, J-8.057); 6.52 (s, 1H); 7.8-7.81 (d, 1H, J-8.301Hz); 8.90 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12.74-14.37; 17.02-17.67; 59.49; 62.37;62.68; 68.86,
72.3; 75.28; 76.81; 81.83; 89.5; 101.74; 115.55; 139.61; 149.85; 163.63; 168.73;168.16
【００４６】
〔原料合成例３〕
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン
【００４７】
【化９】
【００４８】
６−Ｎ−ベンゾイル−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン（１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を７４％で得た。
【００４９】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.03-1.1(m, 28H); 1.26-1.33(m, 6H); 4.19-4.29 (m, 6H);
4.77-4.78 (d, 1H, J-4.883); 4.88-(m, 3H); 5.18-5.19(d, 1H, J-4.883); 60.3 (s, 1H); 6.53 (s, 1H); 7.49-7.5 (d.m, 3H,); 8.03-8.85 (d, 2H, J-7.324); 8.27 (s, 1H); 8.73 (s, 1H); 9.45 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12.79-14.33; 17.08-17.62; 59.99; 61.92; 62.21; 62.38;
62.45; 62.47; 62.52; 69.56; 72.33; 74.1; 75.37; 76.24; 76.34; 76.66;7.76; 81.75; 89.12; 115.97; 116.88; 123.9, 128.17; 128.95; 132.872; 133.93, 141.79; 149.82; 151.18; 152;78; 168;67; 168.71
【００５０】
〔実施例１〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００５１】
【化１０】
【００５２】
Ｄ体もしくはＬ体の２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン（１ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体９５％、Ｌ体９８％で得た。
【００５３】
Ｄ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.30-1.35 (m, 6H); 3.0-3.04 (b, signals 2H); 3.82-3.97
(d.m, 2H); 4.06-4.08 (m, 1H); 4.26-4.31 (m, 4H); 4.45-4.47 (m, 1H); 4.73-4.74 (d, 1H, J-3.906Hz); 4.75-4.78 (m, 1H); 4.97-4.98 (d, 1H, J-3.906Hz); 5.7-5.72 (d, 1H, J-8.057Hz); 5.85-5.86 (d, 1H, J- 4.639Hz); 6.32 (s, 1H); 7.69-7.71 (d, 1H, J-8.057Hz); 8.61-8.63 (m, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.28; 14.31; 61.96; 62.95; 63.03; 69.79; 75.72; 76.48; 76.52;85.37; 91.02; 102.49; 117.01; 124.05; 136.38; 142.76; 149.9; 150.67; 163.74;168.62; 169.44
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.29-1.34 (m, 6H); 3.25 (b, signals 2H); 3.7-3.75
(d.m, 2H); 4.02-4.02 (m, 1H); 4.24-4.29 (m, 4H); 4.3-4.45 (m, 1H); 4.799-4.808 (d, 1H, J-4.151Hz); 5.041-5.049 (d, 1H, J-4.151); 5.60-5.62 (d, 1H, J-8.057Hz);6.01-6.02 (d, 1H, J-5.616Hz); 6.27 (s, 1H); 7.98-7.99 (d, 1H, J-8.057Hz)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 13.89; 13.92; 39.49-39.99; 40.16; 61.02; 61.93; 62.33;69.74; 75.83; 76.29; 85.23; 85.99; 102.17; 117.17; 140.4;150.76; 163.512;168.05; 169.23
【００５４】
〔実施例２〕
４−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）シチジン
【００５５】
【化１１】
【００５６】
４−Ｎ−ベンゾイル−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）シチジン（１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物の粗精製物を得た。このうち１ ｍｍｏｌをＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を６０％で得た。
【００５７】
1H MNR (CDCl3;500MHz) δ(ppm): 1.2- 1.28 (m, 6H); 3.77-3.96 (d.m, 2H); 4.13-4.195
(m, 4H); 4.21-4.25 (m, 1H); 4.35-4.46 (m, 1H); 4.71-4.72 (d, 1H, J-3.662Hz);4.79-4.82 (t, 1H); 4.93-4.94 (d, 1H, J-3.663); 5.66-5.67 (d, 1H, J-4.395); 6.35 (s. 1H); 7.39-7.53 (d.m, 3H); 7.81-78.3 (m, 2H); 9.0 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.29-14.55; 17.4; 17.46; 61.68; 62.76; 63.25; 69.65;
76.36; 77.91; 78.2; 86.23; 93.15; 118.79; 124.03; 127.96; 129.19; 133.22;133.39; 147.74; 149.98; 163.05; 168.37; 170.48
【００５８】
〔実施例３〕
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）アデノシン
【００５９】
【化１２】
【００６０】
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン（１ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を定量的収率で得た。
【００６１】
1H MNR (DMSO; 500MHz) δ(ppm): 1.2-1.27 (m, 6H); 3.65-3.68 (m, 1H); 3.67-3.79 (m,1H);3.95-4.14 (d.m, 1H); 4.16-201 (m, 4H); 4.40-4.45(m,1H); 4.94-4.95 (d. J-4.151Hz); 4.99-5.04 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.08-5.09 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.16-5.17 (d, 1H,J-4.151Hz); 5.23-5.32 (group m, 2H); 5.96-5.97 and 6.2-6.23 (d.d, 1H J-3.907Hz and J-6.348Hz); 6.3 and 6.44 (d.s. 1H); 7.52-7.68 (d.m, 3H); 8.03-8.09 (d,d. 2H, J- 7.324Hz, J-7.568Hz); 8.34 (s, 1H); 8.76-8.78 (d.s, 1H);11.25-11.33 (d.s, 1H)
13C MNR (DMSO; 500MHz)δ(ppm): 14.52-14.62; 60.58; 62.0; 62.33; 62.54; 62.59; 68.97;
70.55; 76.03; 76.08; 76.28; 76.73; 77.97;79.9; 85.46; 85.74; 86.95; 88.49;96.98; 116.68; 116.74; 126.38; 129.17; 129.19; 133,19; 133.48; 133.83; 134.07;143.71; 145.98; 151.17; 152.46; 153.05; 166.31; 168.94; 16912; 169.67; 169.71
【００６２】
〔実施例４〕
５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００６３】
【化１３】
【００６４】
実施例１で得られたＤまたはＬ体の２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体９４％、Ｌ体９６％で得た。
【００６５】
Ｄ体1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.29-1.33 (m, 6H); 3.0 (b.d, 1H); 3.52-3.53 (m, 2H);3.793-3.796 (d, 6H, J-1.465Hz); 4.01-4.02 (m, 1H); 4.24-4.3 (m, 4H); 4.53-4.55 (m, 2H); 4.77-4.78 (d, 1H, J-4.151Hz); 5.05-5.06 (d, 1H, J-4.395Hz); 5.31-5.32 (d, 1H, J-9.766Hz); 6.051-6.054 (d, 1H, J-1.465); 6.44 (s, 1H); 6.83-6.86 (d, 4H, 9.033Hz); 7.23-7.31 (m, 8H); 3.38-3.74 (m, 2H); 7.92-7.93 (d, 1H, J-8.301);9.08 (b,s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.03-14.09; 55.249; 61.50; 62.43; 62.75; 68.53; 75.86;
76.52; 83.33; 86.99; 88.05; 102.05; 113.27; 113.29; 116.43; 123.75;127.11; 127.99; 128.15; 130.11; 130.19; 135.13; 135.35; 136.01; 140.17; 144.39;149.79; 150.05; 158.66; 158.66; 158.69; 163.26; 168.26; 169.38
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.31-1.36 (m, 6H); 3.51-3.53 (m, 2H); 3.785-3.794 (d,6Hz, 4.639Hz); 4.14-4.15 (t, 1H); 4.27-4.33 (m, 4H); 4.44-4.6 (m, 1H); 4.46-4.51 (m, 1H); 4.83-4.84 (d, 1H, J-3.906Hz); 5.02-5.03 (d, 1H, 3.907Hz); 5.29-5.31 (d, 1H, 8.301Hz); 6.02-6.03 (d, 1H, J-3.418Hz); 6.38 (s, 1H); 6.8-6.85 (m, 4H,);7.19-7.45 (m, 10H); 7.88-7.89 (d, 1H, J-8.057Hz); 8.85 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.32; 14.36; 55.44; 55.50; 59.44; 62.27; 62.7; 6.28;
63.33; 69.54;76.42; 79.97; 83.81; 86.09; 87.35; 87.53; 102.48; 113.21; 113.55;113.56; 118.61; 126.8; 127.41;127.96; 128.28; 128.38; 130.19; 130.34; 130.43;135.28; 135.52; 137.0; 140.24; 144.67; 150.02; 150.37; 158.53; 158.91; 158.96;163.33; 168.3; 170.33
【００６６】
〔実施例５〕
４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル)シチジン
【００６７】
【化１４】
【００６８】
実施例２で得られた４−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）シチジン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を９０％で得た。
【００６９】
1H MNR (CDCl3;500MHz) δ(ppm):1.3-1.73 (m, 6H); 3.58-3.59 (m, 2H); 3.826-3.828 (d, 6H,J-1.221Hz); 4.14-4.16 (m, 1H);4.19-4.21 (m, 1H); 4.29-4.31 (m, 4H); 4.46-4.5 (d.m, 2H); 4.83-4.84 (d, 1H;3.906Hz); 5.02-5.03 (d. 1H, 3.662Hz); 5.96 (s, 1H); 6.69-6.89 (m, 4H);7.25-7.35 (m, 8H); 7.43-7.45 (m, 2H); 7.5-7.59 (m, 2H); 7.6-7.68 (d.m, 2H); 7.88-7.89 (b.d, 1H, J-7.324Hz); 8.61-8.62 (b.d, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.31; 14.34; 55.43; 59.43; 62.72; 63.15; 76.41; 78.11;
79.95; 83.43; 87.24; 113.22; 113.59; 118.54; 123.99; 126.79; 127.382;127.83; 127.95; 128.31; 128.39; 128.53; 129.25; 129.25; 130.19; 130.31; 133.36;135.61; 135.95; 136.25; 137.01; 144.43; 150.03; 158.54; 158.92; 168.38; 170.66
【００７０】
〔実施例６〕
６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル)アデノシン
【００７１】
【化１５】
【００７２】
実施例３で得られた６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）アデノシン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を９８％で得た。
【００７３】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.22-1.34 (m, 6H); 3.58-3.59 (m, 2H); 3.77-3.82 (d,6H); 4.14-4.16 (m, 5H); 4.22-4.46 (m, 2H); 4.83-4.84 (d, 1H, J-3.907Hz); 5.02-5.03 (d, 1H, J-3.096Hz); 5.42-5.44 (m, 1H); 5.97 (s, 1H); 6.22-6.24 (s,d, 1H); 6.68 (s, 1H); 6.78-6.88 )m, 4H); 7.16-7.67 (g m, 14H); 7.88-7.9 (d, 1H); 8.6 (d, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.29; 14.14.32; 55.42; 55.46; 61.19; 62.71; 62.81;
63.13; 63.41; 76.4; 78.89; 79.93; 83.42; 84.91; 87.23; 113.20-113.578; 118.533;118.99; 123.961; 127.37-129.39; 130.18; 130.29; 130.39; 133.34; 135.61; 135.9;136.19; 144.42; 150.1; 158.79; 158.9; 168.37; 170.64
【００７４】
〔実施例７〕
５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
【００７５】
【化１６】
【００７６】
実施例４で合成した５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（０．７６ ｇ,１ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ ｍＬ）に溶解し、ここにＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２５ ｍｇ, １．１ ｍｍｏｌ）とクロロ（２−シアノエトキシ）（Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（２８０ ｍｇ, １．２ ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、標題化合物（５７０ ｍｇ,６０％）を得た。
【００７７】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.02-1.35 (d.m, 20H); 2.63-2.72 (m, 2H); 3.52-3.87(m,
11H); 4.19-4.31 (m, 4H); 4.55-5.6 (m,1H); 5.563-5.66 (m, 1H); 4.69-4.74 (d.d, 1H, J1-4.634; J1-5.127 Hz); 5.00-5.04 (d.d, 1H, J1-4.639;J1-5.127 Hz); 5.27-5.34 (d.d, 1H, J1-8.056; J1-8.057Hz);6.02-6.03 (d.d, 1H, J-2.442), 6.27-6.34 (d.s, 1H); 6.83-6.86 (m, 4H); 7.24-7.75 (m, 8H); 7.28-7.42 (m, 2H); 7.77-7.81 (d.d, 1H J-8.301)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 13.35; 14.30; 14.34; 17.35; 17.37; 20.53; 20.58; 23.09;
13.11; 23.18; 24.7; 24.75; 24.81; 24.87; 43.38; 43.61; 45.50; 45.55; 55.44;59.16; 59.29; 62.42; 62.48; 75.46; 75.9; 76.67; 76.97; 83.15; 83.19; 87.32;87.56; 102.58; 113.48; 115.94; 118.28; 123.98; 127.36; 128.17; 128.17-128.54;130.43; 130.48; 135.2; 135.41; 135.45; 136.29; 140.38; 144.36; 149.9; 150.61;158.92; 163.69; 168.46; 168.59
31P NMR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm):152.157; 151.205 (64.98; 35.02)
ESI-MS (ES+) m/z calcd. for C48H59N4O15P 962.97362; found (M+Na) 987.17017
【００７８】
〔実施例８〕
ウリジンジヌクレオチド
【００７９】
【化１７】
【００８０】
実施例７で合成した５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２３２ ｍｇ,０．２８ ｍｍｏｌ）、２’,３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（７６ ｍｇ, ０．５７ ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（４０ ｍｇ,０．５７ ｍｍｏｌ）を減圧下６０℃で６時間乾燥し、乾燥塩化メチレン（５ ｍＬ）に溶解した。１０分後、１％ヨウ素（水−ピリジン,１：９,ｖ／ｖ）を２ ｍＬ加え、室温で５分間反応させた。反応を３ ｍＬの飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて停止したのち、塩化メチレン（２５ ｍＬ）で希釈後、水（１０ ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、濃アンモニア水を加え２時間反応させた後、溶媒を減圧下留去した。残渣を２５％酢酸／メタノールで処理し濃アンモニア水を加え中和したのち、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、標題化合物を得た。
【００８１】
ESI-MS (ES-) m/z calcd. for C26H33N6O18P 747.53599; found 747.79985 31P NMR (D2O; 500MHz)δ(ppm): -0.299
【００８２】
〔実施例９〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（カルバモイル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００８３】
【化１８】
【００８４】
実施例１で合成した、２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（４６０ ｍｇ, １.０ ｍｍｏｌ）をメタノール（５ ｍＬ）に溶解し、そこに濃アンモニア水（５ ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を定量的に得た。
【００８５】
1H MNR (DMSO ; 500MHz) δ(ppm): 3.52-3.64 (d.m, 2H); 3.81-3.83 (m,1H); 4.09-4.12 (m,1H);4.41-4.45 (m, 3H); 4.64-4.65 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.15 (b.s, 1H); 5.32 (b.s, 1H); 5.62-5.64 (d, 1H, J-5.056); 5.84-5.85 (d, 1H, J-4.883); 6.199 (s, 1H); 7.491-7.497 (d, 2H); 7.59 (b,s. 1H); 7.69 (b.s, 1H); 7.87-7.89 (d, 1H, J-8.322Hz)
13C MNR (DMSO; 500MHz)δ(ppm): 61.0; 67.02; 69.35; 76.57; 77.29; 78.13; 85.49; 86.97;
102.54; 116.94; 141,13; 151.47; 163.82; 171.01; 171.49.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２’−水酸基に保護基もしくは修飾基として用いうる基を有するヌクレオシドおよびそのホスホロアミダイト誘導体、それらを用いたオリゴヌクレオチドの合成法、その合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド、並びに前記保護基等を導入するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでにオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の合成法が盛んに開発されてきた。その中でも、２’−水酸基の保護基は効率的なＲＮＡ合成のために最も重要なもののひとつである。これまでに数多くの２’−水酸基の保護基が報告されているが、現在の核酸化学で実用化されているものは数種類しかない。ＲＮＡ合成に適した２’−水酸基の保護基には以下の性質が要求される。１）保護基の導入試薬が安価である。２）２’−水酸基に容易に高収率で導入できる。３）オリゴヌクレオチド合成の条件下で安定であること。４）容易かつ選択的に脱保護できること。
【０００３】
現在用いられている代表的な２’−水酸基の保護基としては非特許文献１に記載のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、非特許文献２に記載のトリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基などケイ素を利用したものがある。しかし、一般にケイ素を含む保護基はその導入試薬が高価であり、経済的な観点からは最良のものとはいえない。また非特許文献３にはＴＢＤＭＳ基の脱保護時に、３’位のリン酸ジエステル結合が遊離になった２’−水酸基に転位した問題も報告されており、これらの問題の解決が必要である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ編 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ−， Ｃｈａｐｔｅｒ ５ Ｍａｓａｄ，Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋｅｌｖｉｎ，Ｋ Ｏｇｉｌｖｉｅ著 Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
【非特許文献２】Ｓ． Ｐｉｔｓｃｈ，Ｐ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ｊｅｎｎｙ，Ａ．Ｓｔｕｔｚ，Ｘ．Ｗｕ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ８４巻 ３７７３ページ ２００１年
【非特許文献３】Ｍ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｓ．Ａ．Ｋａｚａｋｏｖ，Ｓ．Ｍ．Ｈｅｃｈｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３巻 ３９４９ページ １９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、安価な導入試薬を用いてリボヌクレオシドの２’−水酸基に導入可能でかつ、リン酸ジエステルの転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能な２’−水酸基の保護基を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ジオキソラン−もしくはジチオラン−４,５−ジカルボン酸誘導体からなる基をリボヌクレオシドの２’−水酸基の保護基として用いることに思い至り、これによって本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供するものである。
【０００８】
（１）一般式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わし、Ｒ４は水素原子、又は一般式（II）
【００１０】
【化２】
（式（II）中、Ｒ５はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、又はふたつのＲ６が互いに結合して環を形成した基を表わす。）
で表わされる基を表わし、Ｘは酸素原子、又は硫黄原子を表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【００１１】
（２）一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする（１）記載の化合物。
【００１２】
（３）一般式（Ｉ）におけるＲ３が、水素原子、又は４,４’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする（１）又は（２）記載の化合物。
【００１３】
（４）一般式（II）におけるＲ５が、２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、又はメチル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか記載の化合物。
【００１４】
（５）一般式（II）におけるＲ６が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（４）のいずれか記載の化合物。
【００１５】
（６）一般式（Ｉ）におけるＸが、酸素原子を表わすことを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか記載の化合物。
【００１６】
（７）一般式（Ｉ）におけるＹが、保護基を有してもよいウラシル−１−イル基、チミン−１−イル基、アデニン−９−イル基、又はグアニン−９−イル基を表わすことを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか記載の化合物。
【００１７】
（８）（１）乃至（７）のいずれか記載の化合物を用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。
【００１８】
（９）（８）記載の合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド。
【００１９】
（１０）一般式（III）
【００２０】
【化３】
〔式（III）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ７はアルキル基を表わす。〕
で表わされる化合物からなることを特徴とする水酸基への保護基導入試薬。
【００２１】
（１１）一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする（１０）記載の水酸基への保護基導入試薬。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の化合物は、安価な導入試薬を用いてリボヌクレオシドの２’−水酸基に保護基を導入することで容易に得られ、かつその保護基はリン酸ジエステルの転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能であることからリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド合成に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【化４】
【００２５】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わす。ここでアルコキシ基とは、例えば、炭素数１から５のアルコキシ基を表わし、イソプロピル基のように分岐したものも含まれる。アルキルアミノ基とは、例えば、窒素原子上に炭素数１から５のアルキル基がひとつ結合したアルキルアミノ基を表わし、ジアルキルアミノ基とは、例えば、窒素原子上に炭素数１から５のアルキル基がふたつ結合したジアルキルアミノ基を表わす。Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わす。置換基を有してもよいトリチル基とは、例えば、４,４’−ジメトキシトリチル基、４−メトキシトリチル基などをさす。置換基を有してもよいシリル基とは、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基などを表わす。Ｒ４は水素原子または一般式（II）で表わされる基を表わす。
【００２６】
【化５】
【００２７】
ここで、一般式（II）中、Ｒ５は２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、メチル基などのリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などを表わす。また、ふたつのＲ６が互いに結合して環を形成して、ピペリジン、モルホリン、ピロリジンなどの環を形成してもよい。
【００２８】
Ｘは、酸素原子、硫黄原子を表わし、酸素原子が好ましい。
【００２９】
Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。ここで保護基とはＤＮＡおよびＲＮＡの合成において核酸塩基部の保護基として用いうるものであれば特に限定されないが、例えばベンゾイル基、アセチル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキシアセチル基、（４−イソプロピルフェニル）オキシアセチル基などのアシル基や、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン基、（ピロリジン−１−イル）メチレン基などのメチレン基などを例示することができる。
【００３０】
核酸塩基とは、天然の生物のＤＮＡおよびＲＮＡに含まれるヌクレオチドの塩基部部分全般を示すが、特にアデニン−９−イル、グアニン−９−イル、シトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、チミン−１−イルなどの基が挙げられる。また、これらの保護基が核酸塩基に導入された例としては、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン−９−イル、６−Ｎ−フェノキシアセチルアデニン−９−イル、２−Ｎ−イソブチリルグアニン−９−イル、２−Ｎ−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキシアセチルグアニン−９−イル、４−Ｎ−アセチルシトシン−１−イル、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イルなどを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３１】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、例えば、ウリジンの５’及び３’水酸基を保護した誘導体から、式（III)で表される保護基導入試薬を用いて、カンファースルホン酸やトシル酸などの酸触媒またはBF3やTiCl4などのルイス酸を用いてオルトエステル交換反応によって合成できる。触媒としてはカンファースルホン酸が好ましい。
【００３２】
【化６】
【００３３】
上記一般式（III）において、Ｒ１、Ｒ２は、一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２と同様の基を表わす。Ｒ７は、例えば、炭素数１から５のアルキル基を表わす。一般式（III）で表わされる化合物は、水酸基（主にリボヌクレオシドの２’−水酸基）への保護基導入試薬として利用することができる。
【００３４】
次に、本発明のオリゴヌクレオチド合成法について説明する。ここで述べるオリゴヌクレオチドとは、例えば、リボヌクレオチドの２から１００量体からなるオリゴマー、リボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドが任意の配分および任意の配列で重合した２から１００量体からなるオリゴマーなどを指す。リボヌクレオチドやデオキシヌクレオチドとしてはアデニル酸、デオキシアデニル酸、グアニル酸、デオキシグアニル酸、シチジル酸、デオキシシチジル酸、ウリジル酸、チミジル酸を例示することができるが、それらに限定されるものでない。また、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する工程の途中に得られる、２’−水酸基に一般式（III）で表わされる化合物によって導入された保護基を有した状態の化合物も含む。
【００３５】
これらのオリゴヌクレオチドは、一般式（Ｉ）で表わされる化合物のうち、Ｒ３が水素原子以外であり、Ｒ４が一般式（II）で表わされる基である化合物（ホスホロアミダイト化合物）を用い、当業者に公知の固相条件もしくは液相条件でのホスホロアミダイト法により合成が可能である。ホスホロアミダイト法としては、例えばホスホロアミダイトと１Ｈ−テトラゾールを用いて、ヌクレオシドやオリゴヌクレオチドの５’水酸基にヌクレオチドユニットを伸長する縮合反応、未反応の水酸基を無水酢酸などを用いてアセチル化するキャップ化反応、縮合反応により生成したホスファイトトリエステルを酸化する酸化反応、５’末端の４,４−ジメトキシトリチル基などを酸性条件下で除去するデブロック反応の四つの工程を繰り返し、オリゴヌクレオチドを伸長する反応を指し、最後に濃アンモニアなどによる核酸塩基部とリン酸部の脱保護を行う。完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する際には、さらに引き続き、本発明の保護基をｐＨ２〜５の条件下除去することで得ることができる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドは例えばＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチド医薬品素材（アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを利用した遺伝子修復用の資材）および遺伝子解析プローブ、人工酵素、アプタマーなどとして用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下本発明品を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００３８】
〔原料合成例１〕
２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル
【００３９】
【化７】
【００４０】
Ｄ,Ｌ−酒石酸ジエチル（１０ ｇ, ４８ ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ ｍL）に溶解し、オルトギ酸トリエチル （１９．４ ｇ,１３１ ｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（２０ ｍｇ, ０．０８６ ｍｍｏｌ）を加え、エタノールの留去が終了するまで９５℃で反応させた。反応系をピリジン（１ ｍL）を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物（１２ ｇ, ９５％）を得た。
【００４１】
Ｄ体: 1H MNR (CD3Cl; 500MHz) δ(ppm): 1.19-1.29 (t, 3H); 1.3-1.35 (m, 6H); 3.66-3.70 (m, 2H);4.27-4.32 (m, 4H); 4.726-4.734 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.05-5.06 (d, 1H, J-4.151Hz);6.09 (s, 1H).
Ｌ体: 1H MNR (CD3Cl; 500MHz) δ(ppm): 1.2-1.23 (t, 3H); 1.3-1.35 (m, 6H); 3.67-3.7 (m, 2H);4.28-4.3 (m, 4H); 4.71-4.72 (d, 1H, J-4.395Hz); 5.04-5.05 (d, 1H, J-4.395Hz); 6.083 (s, 1H)
【００４２】
〔原料合成例２〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン
【００４３】
【化８】
【００４４】
３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン （１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体８５％、L体８０％で得た。
【００４５】
Ｄ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 0.93-1.09 (m, 28H); 1.28-1.34 (m, 6H); 3.94-4.06 (d.m,2H);4.21-4.29 (m, 4H); 4.45-4.46 (d, 1H, J-4.639Hz); 4.74-4.76 (d, 1H, J-5,372Hz);5.09-5.1 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.67-5.68 (d, 1H, J-7.787Hz); 5.81 (s, 1H); 6.495 (s, 1H); 7.8-7.81 (d, 1H, J-8.057Hz); 9.45 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12,62-14.34; 17.02; 17.17--17.7; 59.6; 62.29; 62.36;
67.57; 75.74; 76.57; 76.97; 89.62; 101.79; 116.49; 140.13; 150.07;164.15; 168.68; 168.93
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 0.93-1.1 (m, 28H); 1.29-1.35 (m, 6H); 3.95-3.98 (d.m,2H);4.15-4.33 (m, 4H); 4.39-4.41 (d, 1H, J-3.349Hz); 4.78-4.79 (d, 1H, J-5.127Hz);5.02-5.21 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.64(s, 1H,); 5.65-5.67 (d, 1H, J-8.057); 6.52 (s, 1H); 7.8-7.81 (d, 1H, J-8.301Hz); 8.90 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12.74-14.37; 17.02-17.67; 59.49; 62.37;62.68; 68.86,
72.3; 75.28; 76.81; 81.83; 89.5; 101.74; 115.55; 139.61; 149.85; 163.63; 168.73;168.16
【００４６】
〔原料合成例３〕
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン
【００４７】
【化９】
【００４８】
６−Ｎ−ベンゾイル−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン（１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を７４％で得た。
【００４９】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.03-1.1(m, 28H); 1.26-1.33(m, 6H); 4.19-4.29 (m, 6H);
4.77-4.78 (d, 1H, J-4.883); 4.88-(m, 3H); 5.18-5.19(d, 1H, J-4.883); 60.3 (s, 1H); 6.53 (s, 1H); 7.49-7.5 (d.m, 3H,); 8.03-8.85 (d, 2H, J-7.324); 8.27 (s, 1H); 8.73 (s, 1H); 9.45 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 12.79-14.33; 17.08-17.62; 59.99; 61.92; 62.21; 62.38;
62.45; 62.47; 62.52; 69.56; 72.33; 74.1; 75.37; 76.24; 76.34; 76.66;7.76; 81.75; 89.12; 115.97; 116.88; 123.9, 128.17; 128.95; 132.872; 133.93, 141.79; 149.82; 151.18; 152;78; 168;67; 168.71
【００５０】
〔実施例１〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００５１】
【化１０】
【００５２】
Ｄ体もしくはＬ体の２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）ウリジン（１ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体９５％、Ｌ体９８％で得た。
【００５３】
Ｄ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.30-1.35 (m, 6H); 3.0-3.04 (b, signals 2H); 3.82-3.97
(d.m, 2H); 4.06-4.08 (m, 1H); 4.26-4.31 (m, 4H); 4.45-4.47 (m, 1H); 4.73-4.74 (d, 1H, J-3.906Hz); 4.75-4.78 (m, 1H); 4.97-4.98 (d, 1H, J-3.906Hz); 5.7-5.72 (d, 1H, J-8.057Hz); 5.85-5.86 (d, 1H, J- 4.639Hz); 6.32 (s, 1H); 7.69-7.71 (d, 1H, J-8.057Hz); 8.61-8.63 (m, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.28; 14.31; 61.96; 62.95; 63.03; 69.79; 75.72; 76.48; 76.52;85.37; 91.02; 102.49; 117.01; 124.05; 136.38; 142.76; 149.9; 150.67; 163.74;168.62; 169.44
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.29-1.34 (m, 6H); 3.25 (b, signals 2H); 3.7-3.75
(d.m, 2H); 4.02-4.02 (m, 1H); 4.24-4.29 (m, 4H); 4.3-4.45 (m, 1H); 4.799-4.808 (d, 1H, J-4.151Hz); 5.041-5.049 (d, 1H, J-4.151); 5.60-5.62 (d, 1H, J-8.057Hz);6.01-6.02 (d, 1H, J-5.616Hz); 6.27 (s, 1H); 7.98-7.99 (d, 1H, J-8.057Hz)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 13.89; 13.92; 39.49-39.99; 40.16; 61.02; 61.93; 62.33;69.74; 75.83; 76.29; 85.23; 85.99; 102.17; 117.17; 140.4;150.76; 163.512;168.05; 169.23
【００５４】
〔実施例２〕
４−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）シチジン
【００５５】
【化１１】
【００５６】
４−Ｎ−ベンゾイル−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）シチジン（１０ ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ ｍL）に溶解し、Ｄ体もしくはＬ体の２−エトキシ-１,３−ジオキソラン-４,５−ジカルボン酸ジエチル（５０ ｍｍｍｏｌ）とカンファースルホン酸（５ ｍｍｍｏｌ）を加え、１０５℃から１１５℃に保ち、エタノールの留去が終了するまで撹拌した。反応系にピリジン（１ ｍL)を加えて中和し、溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルム（５０ ｍL）に溶解し、水（５０ ｍL)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物の粗精製物を得た。このうち１ ｍｍｏｌをＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を６０％で得た。
【００５７】
1H MNR (CDCl3;500MHz) δ(ppm): 1.2- 1.28 (m, 6H); 3.77-3.96 (d.m, 2H); 4.13-4.195
(m, 4H); 4.21-4.25 (m, 1H); 4.35-4.46 (m, 1H); 4.71-4.72 (d, 1H, J-3.662Hz);4.79-4.82 (t, 1H); 4.93-4.94 (d, 1H, J-3.663); 5.66-5.67 (d, 1H, J-4.395); 6.35 (s. 1H); 7.39-7.53 (d.m, 3H); 7.81-78.3 (m, 2H); 9.0 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.29-14.55; 17.4; 17.46; 61.68; 62.76; 63.25; 69.65;
76.36; 77.91; 78.2; 86.23; 93.15; 118.79; 124.03; 127.96; 129.19; 133.22;133.39; 147.74; 149.98; 163.05; 168.37; 170.48
【００５８】
〔実施例３〕
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）アデノシン
【００５９】
【化１２】
【００６０】
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）−３’,５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１,３−ジイル）アデノシン（１ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ ｍL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（５ ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を定量的収率で得た。
【００６１】
1H MNR (DMSO; 500MHz) δ(ppm): 1.2-1.27 (m, 6H); 3.65-3.68 (m, 1H); 3.67-3.79 (m,1H);3.95-4.14 (d.m, 1H); 4.16-201 (m, 4H); 4.40-4.45(m,1H); 4.94-4.95 (d. J-4.151Hz); 4.99-5.04 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.08-5.09 (d, 1H, J-4.15Hz); 5.16-5.17 (d, 1H,J-4.151Hz); 5.23-5.32 (group m, 2H); 5.96-5.97 and 6.2-6.23 (d.d, 1H J-3.907Hz and J-6.348Hz); 6.3 and 6.44 (d.s. 1H); 7.52-7.68 (d.m, 3H); 8.03-8.09 (d,d. 2H, J- 7.324Hz, J-7.568Hz); 8.34 (s, 1H); 8.76-8.78 (d.s, 1H);11.25-11.33 (d.s, 1H)
13C MNR (DMSO; 500MHz)δ(ppm): 14.52-14.62; 60.58; 62.0; 62.33; 62.54; 62.59; 68.97;
70.55; 76.03; 76.08; 76.28; 76.73; 77.97;79.9; 85.46; 85.74; 86.95; 88.49;96.98; 116.68; 116.74; 126.38; 129.17; 129.19; 133,19; 133.48; 133.83; 134.07;143.71; 145.98; 151.17; 152.46; 153.05; 166.31; 168.94; 16912; 169.67; 169.71
【００６２】
〔実施例４〕
５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００６３】
【化１３】
【００６４】
実施例１で得られたＤまたはＬ体の２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物をＤ体９４％、Ｌ体９６％で得た。
【００６５】
Ｄ体1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.29-1.33 (m, 6H); 3.0 (b.d, 1H); 3.52-3.53 (m, 2H);3.793-3.796 (d, 6H, J-1.465Hz); 4.01-4.02 (m, 1H); 4.24-4.3 (m, 4H); 4.53-4.55 (m, 2H); 4.77-4.78 (d, 1H, J-4.151Hz); 5.05-5.06 (d, 1H, J-4.395Hz); 5.31-5.32 (d, 1H, J-9.766Hz); 6.051-6.054 (d, 1H, J-1.465); 6.44 (s, 1H); 6.83-6.86 (d, 4H, 9.033Hz); 7.23-7.31 (m, 8H); 3.38-3.74 (m, 2H); 7.92-7.93 (d, 1H, J-8.301);9.08 (b,s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.03-14.09; 55.249; 61.50; 62.43; 62.75; 68.53; 75.86;
76.52; 83.33; 86.99; 88.05; 102.05; 113.27; 113.29; 116.43; 123.75;127.11; 127.99; 128.15; 130.11; 130.19; 135.13; 135.35; 136.01; 140.17; 144.39;149.79; 150.05; 158.66; 158.66; 158.69; 163.26; 168.26; 169.38
Ｌ体：1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.31-1.36 (m, 6H); 3.51-3.53 (m, 2H); 3.785-3.794 (d,6Hz, 4.639Hz); 4.14-4.15 (t, 1H); 4.27-4.33 (m, 4H); 4.44-4.6 (m, 1H); 4.46-4.51 (m, 1H); 4.83-4.84 (d, 1H, J-3.906Hz); 5.02-5.03 (d, 1H, 3.907Hz); 5.29-5.31 (d, 1H, 8.301Hz); 6.02-6.03 (d, 1H, J-3.418Hz); 6.38 (s, 1H); 6.8-6.85 (m, 4H,);7.19-7.45 (m, 10H); 7.88-7.89 (d, 1H, J-8.057Hz); 8.85 (s, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.32; 14.36; 55.44; 55.50; 59.44; 62.27; 62.7; 6.28;
63.33; 69.54;76.42; 79.97; 83.81; 86.09; 87.35; 87.53; 102.48; 113.21; 113.55;113.56; 118.61; 126.8; 127.41;127.96; 128.28; 128.38; 130.19; 130.34; 130.43;135.28; 135.52; 137.0; 140.24; 144.67; 150.02; 150.37; 158.53; 158.91; 158.96;163.33; 168.3; 170.33
【００６６】
〔実施例５〕
４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル)シチジン
【００６７】
【化１４】
【００６８】
実施例２で得られた４−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）シチジン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を９０％で得た。
【００６９】
1H MNR (CDCl3;500MHz) δ(ppm):1.3-1.73 (m, 6H); 3.58-3.59 (m, 2H); 3.826-3.828 (d, 6H,J-1.221Hz); 4.14-4.16 (m, 1H);4.19-4.21 (m, 1H); 4.29-4.31 (m, 4H); 4.46-4.5 (d.m, 2H); 4.83-4.84 (d, 1H;3.906Hz); 5.02-5.03 (d. 1H, 3.662Hz); 5.96 (s, 1H); 6.69-6.89 (m, 4H);7.25-7.35 (m, 8H); 7.43-7.45 (m, 2H); 7.5-7.59 (m, 2H); 7.6-7.68 (d.m, 2H); 7.88-7.89 (b.d, 1H, J-7.324Hz); 8.61-8.62 (b.d, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.31; 14.34; 55.43; 59.43; 62.72; 63.15; 76.41; 78.11;
79.95; 83.43; 87.24; 113.22; 113.59; 118.54; 123.99; 126.79; 127.382;127.83; 127.95; 128.31; 128.39; 128.53; 129.25; 129.25; 130.19; 130.31; 133.36;135.61; 135.95; 136.25; 137.01; 144.43; 150.03; 158.54; 158.92; 168.38; 170.66
【００７０】
〔実施例６〕
６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル)アデノシン
【００７１】
【化１５】
【００７２】
実施例３で得られた６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）アデノシン（１ ｍｍｏｌ）をピリジン（３５ ｍＬ）に溶解し、ここに４,４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．５ ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、塩化メチレン−水（５０ ｍＬ−５０ ｍＬ）で希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を９８％で得た。
【００７３】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.22-1.34 (m, 6H); 3.58-3.59 (m, 2H); 3.77-3.82 (d,6H); 4.14-4.16 (m, 5H); 4.22-4.46 (m, 2H); 4.83-4.84 (d, 1H, J-3.907Hz); 5.02-5.03 (d, 1H, J-3.096Hz); 5.42-5.44 (m, 1H); 5.97 (s, 1H); 6.22-6.24 (s,d, 1H); 6.68 (s, 1H); 6.78-6.88 )m, 4H); 7.16-7.67 (g m, 14H); 7.88-7.9 (d, 1H); 8.6 (d, 1H)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 14.29; 14.14.32; 55.42; 55.46; 61.19; 62.71; 62.81;
63.13; 63.41; 76.4; 78.89; 79.93; 83.42; 84.91; 87.23; 113.20-113.578; 118.533;118.99; 123.961; 127.37-129.39; 130.18; 130.29; 130.39; 133.34; 135.61; 135.9;136.19; 144.42; 150.1; 158.79; 158.9; 168.37; 170.64
【００７４】
〔実施例７〕
５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
【００７５】
【化１６】
【００７６】
実施例４で合成した５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（０．７６ ｇ,１ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ ｍＬ）に溶解し、ここにＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２５ ｍｇ, １．１ ｍｍｏｌ）とクロロ（２−シアノエトキシ）（Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（２８０ ｍｇ, １．２ ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、標題化合物（５７０ ｍｇ,６０％）を得た。
【００７７】
1H MNR (CDCl3; 500MHz) δ(ppm): 1.02-1.35 (d.m, 20H); 2.63-2.72 (m, 2H); 3.52-3.87(m,
11H); 4.19-4.31 (m, 4H); 4.55-5.6 (m,1H); 5.563-5.66 (m, 1H); 4.69-4.74 (d.d, 1H, J1-4.634; J1-5.127 Hz); 5.00-5.04 (d.d, 1H, J1-4.639;J1-5.127 Hz); 5.27-5.34 (d.d, 1H, J1-8.056; J1-8.057Hz);6.02-6.03 (d.d, 1H, J-2.442), 6.27-6.34 (d.s, 1H); 6.83-6.86 (m, 4H); 7.24-7.75 (m, 8H); 7.28-7.42 (m, 2H); 7.77-7.81 (d.d, 1H J-8.301)
13C MNR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm): 13.35; 14.30; 14.34; 17.35; 17.37; 20.53; 20.58; 23.09;
13.11; 23.18; 24.7; 24.75; 24.81; 24.87; 43.38; 43.61; 45.50; 45.55; 55.44;59.16; 59.29; 62.42; 62.48; 75.46; 75.9; 76.67; 76.97; 83.15; 83.19; 87.32;87.56; 102.58; 113.48; 115.94; 118.28; 123.98; 127.36; 128.17; 128.17-128.54;130.43; 130.48; 135.2; 135.41; 135.45; 136.29; 140.38; 144.36; 149.9; 150.61;158.92; 163.69; 168.46; 168.59
31P NMR (CDCl3; 500MHz)δ(ppm):152.157; 151.205 (64.98; 35.02)
ESI-MS (ES+) m/z calcd. for C48H59N4O15P 962.97362; found (M+Na) 987.17017
【００７８】
〔実施例８〕
ウリジンジヌクレオチド
【００７９】
【化１７】
【００８０】
実施例７で合成した５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２３２ ｍｇ,０．２８ ｍｍｏｌ）、２’,３’−Ｏ−イソプロピリデンウリジン（７６ ｍｇ, ０．５７ ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（４０ ｍｇ,０．５７ ｍｍｏｌ）を減圧下６０℃で６時間乾燥し、乾燥塩化メチレン（５ ｍＬ）に溶解した。１０分後、１％ヨウ素（水−ピリジン,１：９,ｖ／ｖ）を２ ｍＬ加え、室温で５分間反応させた。反応を３ ｍＬの飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて停止したのち、塩化メチレン（２５ ｍＬ）で希釈後、水（１０ ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、濃アンモニア水を加え２時間反応させた後、溶媒を減圧下留去した。残渣を２５％酢酸／メタノールで処理し濃アンモニア水を加え中和したのち、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、標題化合物を得た。
【００８１】
ESI-MS (ES-) m/z calcd. for C26H33N6O18P 747.53599; found 747.79985 31P NMR (D2O; 500MHz)δ(ppm): -0.299
【００８２】
〔実施例９〕
２’−Ｏ−（３，４−ビス（カルバモイル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン
【００８３】
【化１８】
【００８４】
実施例１で合成した、２’−Ｏ−（３，４−ビス（エトキシカルボニル）−１,３−ジオキソラン−２−イル）ウリジン（４６０ ｍｇ, １.０ ｍｍｏｌ）をメタノール（５ ｍＬ）に溶解し、そこに濃アンモニア水（５ ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を定量的に得た。
【００８５】
1H MNR (DMSO ; 500MHz) δ(ppm): 3.52-3.64 (d.m, 2H); 3.81-3.83 (m,1H); 4.09-4.12 (m,1H);4.41-4.45 (m, 3H); 4.64-4.65 (d, 1H, J-5.127Hz); 5.15 (b.s, 1H); 5.32 (b.s, 1H); 5.62-5.64 (d, 1H, J-5.056); 5.84-5.85 (d, 1H, J-4.883); 6.199 (s, 1H); 7.491-7.497 (d, 2H); 7.59 (b,s. 1H); 7.69 (b.s, 1H); 7.87-7.89 (d, 1H, J-8.322Hz)
13C MNR (DMSO; 500MHz)δ(ppm): 61.0; 67.02; 69.35; 76.57; 77.29; 78.13; 85.49; 86.97;
102.54; 116.94; 141,13; 151.47; 163.82; 171.01; 171.49.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わし、Ｒ４は水素原子、又は一般式（II）
【化２】
（式（II）中、Ｒ５はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、又はふたつのＲ６が互いに結合して環を形成した基を表わす。）
で表わされる基を表わし、Ｘは酸素原子、又は硫黄原子を表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【請求項２】
一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）におけるＲ３が、水素原子、又は４,４’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
一般式（II）におけるＲ５が、２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、又はメチル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
一般式（II）におけるＲ６が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
一般式（Ｉ）におけるＸが、酸素原子を表わすことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
一般式（Ｉ）におけるＹが、保護基を有してもよいウラシル−１−イル基、チミン−１−イル基、アデニン−９−イル基、又はグアニン−９−イル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項記載の化合物を用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。
【請求項９】
請求項８記載の合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
一般式（III）
【化３】
〔式（III）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ７はアルキル基を表わす。〕
で表わされる化合物からなることを特徴とする水酸基への保護基導入試薬。
【請求項１１】
一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする請求項１０記載の水酸基への保護基導入試薬。
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
〔式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ３は水素原子、置換基を有してもよいトリチル基、又は置換基を有してもよいシリル基を表わし、Ｒ４は水素原子、又は一般式（II）
【化２】
（式（II）中、Ｒ５はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、又はふたつのＲ６が互いに結合して環を形成した基を表わす。）
で表わされる基を表わし、Ｘは酸素原子、又は硫黄原子を表わし、Ｙは保護基を有してもよい核酸塩基を表わす。〕
で表わされる化合物。
【請求項２】
一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）におけるＲ３が、水素原子、又は４,４’−ジメトキシトリチル基を表わすことを特徴とする請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
一般式（II）におけるＲ５が、２−シアノエチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、２−トリメチルシリルエチル基、又はメチル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
一般式（II）におけるＲ６が、イソプロピル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
一般式（Ｉ）におけるＸが、酸素原子を表わすことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
一般式（Ｉ）におけるＹが、保護基を有してもよいウラシル−１−イル基、チミン−１−イル基、アデニン−９−イル基、又はグアニン−９−イル基を表わすことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項記載の化合物を用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。
【請求項９】
請求項８記載の合成法によって合成されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
一般式（III）
【化３】
〔式（III）中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なってアルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基を表わし、Ｒ７はアルキル基を表わす。〕
で表わされる化合物からなることを特徴とする水酸基への保護基導入試薬。
【請求項１１】
一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２が、アルコキシ基、又はアミノ基を表わすことを特徴とする請求項１０記載の水酸基への保護基導入試薬。
【公開番号】特開２００６−７７０１３（Ｐ２００６−７７０１３Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６０５６４（Ｐ２００５−２６０５６４）
【出願日】平成１７年９月８日（２００５．９．８）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月８日（２００５．９．８）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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