ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡ
【課題】レチノイン酸受容体の提供。
【解決手段】ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離された核酸、精製されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５をコードする核酸を含むベクター、そのようなベクターを含む細胞、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５に対する抗体、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を検出するために有用な核酸プローブ、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸に固有の配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、正常または変異哺乳物ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック、非ヒト動物、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体を単離する方法。
【解決手段】ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離された核酸、精製されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５をコードする核酸を含むベクター、そのようなベクターを含む細胞、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５に対する抗体、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を検出するために有用な核酸プローブ、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸に固有の配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、正常または変異哺乳物ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック、非ヒト動物、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[発明の背景]
本出願は、１９９９年２月２２日に提出された米国特許明細書番号第０９／２５５，３７６号の部分継続である、１９９９年８月１３日に提出された、米国特許明細書番号第０９／３８７，６９９号の優先権を主張し、それらの内容は本出願内に参照文献に援用される。
【０００２】
本出願を通して、さまざまな刊行物が、括弧内の部分的引用によって参照されている。これらの刊行物に関する全引用は、明細書の最後に見ることができるであろう。これらの刊行物の開示は、その全文を、さらに本発明に関連する技術分野の状態を完全に記述するために、本出願の参照文献に援用される。
【０００３】
神経調整物質には、神経系において伝達をｓｕｂｖｅｒｓｅまたは調節する天然産物の種々の群が含まれる。これらは、神経ペプチド、アミノ酸、生物起源アミノ酸、脂質、および脂質代謝物、ならびに他の代謝副産物を含むが、限定されない。これらの神経調整物質の多くは、細胞の内部から外部にシグナルを伝達する特定の細胞表面受容体と相互作用する。Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）は、多くの神経伝達物質が相互作用してそれらの効果を媒介する細胞表面受容体の主要な種類を表している。ＧＰＣＲｓは、７回膜貫通領域によって特徴付けられ、アデニルシクラーゼの刺激のような細胞内の生化学的続発症をもつＧ−タンパク質結合受容体を介してそのエフェクターと結合する。
【０００４】
ビタミンＡ１（全−トランス−レチノール）はアルコールデヒドロゲナーゼによってビタミンＡ１アルデヒド（全−トランス−レチナール）に酸化される。全−トランス−レチナールは、網膜細胞内でのロドプシンの合成に重要であり、そこで視覚系における鍵となる役割を果たす。全−トランス−レチナールはまた、他の細胞タイプにおいては、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼによって全−トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）に変換されうる（Ｂｏｗｍａｎ，Ｗ．Ｃ．およびＲａｎｄ、Ｍ．Ｊ．，１９８０）。
【０００５】
歴史的に、ＡＴＲＡおよびビタミンＡの他の活性代謝物である９−シス−レチノイン酸（９ＣＲＡ）は、核レチノイン酸受容体（ＲＡＲα、β、γ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲα、β、γ）の活性を介してのみその細胞の効果を仲介すると考えられた（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９４）。これらの受容体は、リガンド依存的転写因子のスーパーファミリーのメンバーであり、このスーパーファミリーには、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、およびペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）を含む。これらは、リガンドがない状態ではＤＮＡ応答エレメントに結合するヘテロダイマーおよびホモダイマーを形成する。リガンド結合に対する応答において、前記ダイマーは、細胞タイプ特異的な遺伝子の組のトランスアクチベーションおよび転写の調節を引き起こすコンホメーションを変化する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９４、Ｈｏｆｍａｎ，Ｃ．およびＥｉｃｈｅｌｅ，Ｇ．，１９９４、およびＧｕｄａｓ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９４）。
【０００６】
レチノイン酸は、幅広い生物学的効果を生じるので、さまざまな生理学的および病態生理学的工程において重要な役割を果たすことが提案されることは驚くことではない。レチノイド類は、さまざまな組織において細胞増殖、分化、再生産、代謝および造血を含む重大な生理学的事象を調節する。細胞レベルでは、レチノイド類は、細胞増殖を阻害し、分化を誘導し、アポトーシスを誘導することができる（Ｂｒｅｉｔｍａｎ，Ｔ．ら、１９８０、Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，１９８４、およびＭａｒｔｉｎ，Ｓ．ら、１９９０）。レチノイド処置によるこれらの多様な効果によって、癌の化学療法および癌の化学的予防に関してレチノイド類を評価する一連の調査が促進された。臨床的には、レチノイド類は、急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）、皮膚Ｔ細胞悪性腫瘍、皮膚化学腫瘍、皮膚および頸の扁平上皮癌および神経芽細胞種を含む広範囲の悪性疾患の処置に使用される（総論としてＲｅｄｆｅｒｎ，Ｃ．Ｐ．ら、１９９５）。レチノイド類はまた、その癌化を抑制し、浸潤性癌の発達を防止する能力を調査されてきた。１３−シスレチノイン酸は、口消化管の最も普通の前癌状態領域である口内白斑症を逆向させ、また前立腺癌の化学予防で使用される（総論としてＳａｂｉｃｈｉ，Ａ．Ｌ．ら、１９９８）。また、頭頸癌での手術および放射線投射後のアジュバント治療として、１３−シスレチノイン酸の処置は、二次原発性癌の発生に対して有意に遅延を引き起こす（総論として、Ｇｏｔｔａｒｄｉｓ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９６）。
【０００７】
興味深いことに、レチノイド類は、膵臓機能に対する効果も持つ。レチノイン酸（またはレチノール）が、単離した島(isolated ilets)（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８７）およびＲＩＮｍ５Ｆラットインスリノーマ細胞（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８９）からのインスリン分泌に必要であることが示唆されてきた。レチノイン酸はまた、細胞−細胞の接着および凝集に対して効果を持つ可能性がある（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８３）。さらに、（ＡＴＲＡではなくて）９ＣＲＡの単一胃内投与が膵臓腺房細胞および腎臓の近位尿細管上皮細胞におけるＤＮＡ合成の波を誘導した（Ｏｈｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９９７）。したがって、レチノイン酸は、正常の膵臓機能、およびおそらくは糖尿病の発達において役割を果たす可能性がある。また、レチノイド類が膵臓悪性腫瘍の治療において有用である可能性があるといういくつかの証拠が存在する（Ｅｌ−Ｍｅｔｗａｌｌｙ，Ｔ．Ｈ．ら、１９９９、Ｒｏｓｅｎｗｉｃｚ，Ｓ．ら、１９９７、およびＲｏｓｅｎｗｉｃｚ，Ｓ．ら、１９９５）。
【０００８】
レチノイド類は、上皮細胞増殖および分化、さらに脂腺活性に影響を与えること、および免疫調節および坑炎症性質を表すことが示されてきた。したがって、レチノイド類は、乾癬および他の角質増殖性および錯角化皮膚疾患、角質化遺伝性皮膚症、重症挫瘡および挫瘡関連皮膚病を含むさまざまな皮膚疾患の治療、およびまた皮膚癌、他の腫瘍の治療および／または化学的予防にだんだんと使用されてきた（総論として、Ｏｒｆａｎｏｓ，Ｃ．Ｅ．ら、１９９７）。
【０００９】
レチノイド類はまた、肺発達に関連する。肺胞樹の発達を導く胎児肺分枝は、レチノイン酸によって加速される。現在、未成熟の肺を持つ早産幼児はビタミンＡにて処置されているが、しかし他の適応は、さらなる調査が必要である可能性がある（Ｃｈｙｔｉｌ，Ｆ．，１９９６）。
【００１０】
最後に、レチノイド類が精神分裂病（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａ．Ｂ．１９９８）およびアルツハイマー病（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｉｄｅｌｌ，Ｎ．，１９９７）で役割を果たしている可能性があることを示唆するいくつかの証拠がある。
【００１１】
レチノイドを介した効果の詳細にわたるリストは、レチノイン酸受容体（非核）がいくつかの疾患に対する治療的処置の標的として魅力的であり、さまざまな疾患に対して、より高い特異性およびより少ない副作用を持つ薬剤の開発に有用である可能性があることが示唆される。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体をコードする単離された核酸を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、精製されたほ乳動物ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質を提供する。
【００１４】
本発明はまた、本発明にしたがって核酸を含むベクターを提供する。
【００１５】
本発明はまたさらに、本発明にしたがってベクターを含む細胞を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明に従って細胞から単離した膜プレパレーションを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００１９】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＲＮＡの翻訳を防止するために、そのようなＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするゲノムDNAの転写を阻害するために、このようなゲノムDNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は、本発明にしたがった核酸によってコードされたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合可能な抗体も提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に対する本発明にしたがった抗体の結合を競合的に阻害可能な薬剤を提供する。
【００２３】
本発明はまたさらに、（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、本発明によるオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な本発明にしたがったの抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、本発明にしたがったほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現しているトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。
【００２６】
本発明はまたさらに、天然のほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、本発明にしたがったほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類。を提供する。
【００２８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、本発明の方法の１つによって同定された化合物を提供する。
【００３３】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを本発明にしたがった核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と本発明にしたがった抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法を提供する。
【００３７】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、前述の方法によって同定されたアンタゴニストを提供する。
【００４１】
本発明はさらに、本発明にしたがったアンタゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【００４２】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明にしたがった医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。
【００４４】
本発明はさらに、前述の方法によって同定されたアゴニストを提供する。
【００４５】
本発明はまたさらに、本発明にしたがったアゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 本発明にしたがったほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法を提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【００５１】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明による方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００５２】
また、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の請求項109に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアをを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法を提供する。
【００５４】
本発明はまたさらに、化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、例えば本発明にしたがった方法によって決定した化合物、および組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を増加させるのに効果的な、本発明の方法などによって決定されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体アゴニスト、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む化合物および組成物を提供する。
【００５６】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を減少させるのに効果的な、本発明の方法などによって決定されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体アンタゴニスト、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００５７】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００５８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を増加するために有効な量の本発明の方法によって同定された化合物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００６０】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を減少するために有効な量の本発明の方法によって同定された化合物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００６１】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、本発明にしたがった方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、組成物、たとえば医薬組成物を調製する方法であって、キャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリア、並びに薬学的に有効な量の本発明にしたがった方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置６１〜６３）および終止コドン（位置１０６６〜１０６８）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図１Ｂ】ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置６１〜６３）および終止コドン（位置１０６６〜１０６８）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図２Ａ】図１Ａで示したヌクレオチド配列（配列番号：１）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図２Ｂ】図１Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：１）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図３Ａ】ラットＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置４９〜５１）および終止コドン（位置１０５４〜１０５６）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図３Ｂ】ラットＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置４９〜５１）および終止コドン（位置１０５４〜１０５６）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図４Ａ】図３Ａ〜３Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：３）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図４Ｂ】図３Ａ〜３Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：３）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図５】ＳＮＯＲＦ２５−およびモック−トランスフェクトＣＨＯ細胞の基礎ｃＡＭＰレベルの比較図。ＳＮＯＲＦ２５またはからベクター（モック）ＤＮＡを材料と方法で記述したようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、ｃＡＭＰ放出に関して記述したようにアッセイした。代表的な実験の結果を示す。
【図６】ＳＮＯＲＦ２５発現モックトランスフェクトＣＨＯ細胞でのＡＴＲＡ、ビタミンＡおよびフォルスコリンによるｃＡＭＰ放出の調節を示す図。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、１０μＭ濃度の薬物で感作し、記述したようにｃＡＭＰ放出に関してアッセイした。公知のシクラーゼ刺激受容体を含む代表的な実験の結果を示す。結果は、１点であるビタミンＡを除き、３重測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。結果は５基礎ｃＡＭＰ放出に対して正規化している。
【図７】Ｃｏｓ−７細胞でのＡＴＲＡ ｃＡＭＰ応答の特異性。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、１０μＭ濃度のＡＴＲＡで感作し、記述したようにｃＡＭＰ放出に関してアッセイした図。代表的な実験の結果を示す。結果は、３重測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。
【図８】一過性トランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞でのＡＴＲＡ用量応答曲線を示す図。ＳＮＯＲＦ２５およびモック−トランスフェクト細胞でのｃＡＭＰを増加させるＡＴＲＡの用量応答効果の代表例。
【図９】ＳＮＯＲＦ２５を発現している卵母細胞でのＡＴＲによるＣＦＴＲの刺激を示した図。先にＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡとＣＦＴＲを注入した卵母細胞からの電圧クランプ記録図（図９Ａ）、及び、対照（ＣＦＴＲのみ）卵母細胞（図９Ｂ）からの電圧クランプ記録。エピネフリン（１μＭ）の投与は、Ｂ２アドレナリン作動性受容体（Ｂ２ＡＲ）およびＣＦＴＲ（図９Ｃ）を発現している他の卵母細胞において、同様の電流を引き起こす。保持電位はすべての記録に対して−７０ｍＶであった。
【図１０】対照（ＣＦＴＲのみ）卵母細胞（ｎ＝１６）およびＳＮＯＲＦ２５およびＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを注入した卵母細胞（ｎ＝１７）でのＡＴＲＡ（１０μＭ）で刺激した平均電流振幅を示す図。
【発明の詳細な記述】
【００６６】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ほ乳類受容体をコードする核酸は、
（ａ）ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードし、かつプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸の配列と同一の配列を持つ核酸、または
（ｂ）ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードし、かつプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸の配列と同一の配列を持つ核酸
と高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする組換え核酸を提供する。
【００６７】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体は、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示した最も短いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む組換え核酸を提供する。
【００６８】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ラットＳＮＯＲＦ２５受容体は、図3Ａ〜3Ｂ（配列番号：3）に示した最も短いオープンリーディングフレームによってコードされるラットＳＮＯＲＦ２５受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む組換え核酸を提供する。
【００６９】
プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５、およびプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５は両方とも、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅによるブタベスト条約の条項によりアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に１９９８年１１月２４日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号、および第２０３４９４号が与えられた。
【００７０】
ハイブリダイゼーション法は当業者に周知である。本発明の目的のために、高いストリンジェンシー条件下におけるハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、１×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、２５μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、４０℃にて行い；０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃にて洗浄するハイブリダイゼーションを意味する。
【００７１】
本明細書を通して、以下の標準略語を特定のヌクレオチド塩基を示すために使用する。
【００７２】
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン
Ｍ＝アデニンまたはシトシン
Ｒ＝アデニンまたはグアニン
Ｗ＝アデニンまたはチミン
Ｓ＝シトシンまたはグアニン
Ｙ＝シトシンまたはチミン
Ｋ＝グアニンまたはチミン
Ｖ＝アデニン、シトシンまたはグアニン（チミンではない）
Ｈ＝アデニン、シトシンまたはチミン（シトシンではない）
Ｂ＝シトシン、グアニンまたはチミン（アデニンではない）
Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン（またはイノシンなどの他の修飾された塩基）
Ｉ＝イノシン
さらに、「アゴニスト」の用語は、本発明の任意のポリペプチドの活性を増加させる任意のペプチド、または非ペプチジル化合物を示すために、本明細書を通して使用される。「アンタゴニスト」の用語は、本発明の任意のポリペプチドの活性を減少させる任意のペプチド、または非ペプチジル化合物を示すために、本明細書を通して使用される。
【００７３】
さらに、本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能なキャリア」の用語は、任意の標準的な薬学的に許容可能なキャリアを意味する。例には、リン酸緩衝食塩水、生理学的食塩水、水、および油／水エマルジョンなどのエマルジョンが含まれるが、限定されない。
【００７４】
ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子はイントロンを含み、さらに付加的なイントロンがコードまたは非コード領域に存在する可能性がある。さらに、ｍＲＮＡのスプライスされた形態が、一般に定義された開始メチオニンの上流またはコード領域内のどちらかにおいて、さらなるアミノ酸をコードする可能性がある。さらに、他のエキソンの存在、および使用の可能性があり、これにより前記ｍＲＮＡは、エキソンを含む領域内で異なるアミノ酸をコードする可能性がある。さらに、単一のアミノ酸置換が、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が本来の遺伝子によってコードされたものと異なるようなＲＮＡ編集の機構を介して生じる可能性がある（Ｂｕｒｎｓら、１９９６、Ｃｈｕら、１９９６）。そのような変異体は、本来の遺伝子によってコードされたポリペプチドとは異なった薬学的特性を示す可能性がある。
【００７５】
本発明は、本明細書で開示したほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体のスプライスバリアントを提供する。本発明はさらに、選択的(alternate)翻訳開始部位、および選択的(alternate)スプライスされたか、または編集された、本発明にしたがったＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸のバリアントを提供する。
【００７６】
本発明はまた、本明細書で開示したＳＮＯＲＦ２５受容体の天然に存在する対立バリアントをコードする核酸を含む組換え核酸を企図する。
【００７７】
また本発明の核酸は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体を含む。このヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図１Ａ〜１Ｂに示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれる核酸配列を含む。ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体は、一以上の核酸塩基の同一性または位置に関して、本明細書に記載されたヒトSNORF25受容体遺伝子と異なり（図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる全長の核酸塩基よりも少なく含む欠失類似体）、図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、核酸配列の末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、これらのヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸配列によってコードされたタンパク質のいくつか、またはすべての特性を共有するタンパク質をコードする。本発明の一つの態様において、前記核酸類似体は、図２Ａ〜２Ｂに示したか、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸配列によってコードされるものと同一のアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする。もう一つの態様において、前記核酸類似体は図２Ａ〜２Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸によってコードされたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持っているタンパク質をコードする。さらなる態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質は、図２Ａ〜２Ｂで示したアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能と同様の機能を有する。もう一つの態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質の機能は、図２Ａ〜２Ｂに示されたアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能とは異なる。もう一つの態様において、前記核酸配列の変化は、タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域内で起こる。さらなる態様において、前記核酸配列の変化はＴＭ領域の外側で起こる。
【００７８】
また本発明の核酸は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体を含む。このラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図３Ａ〜３Ｂに示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれる核酸配列を含む。ラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体は、一以上の核酸塩基の同一性または位置に関して、本明細書に記載されたラットSNORF25受容体遺伝子と異なり（図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる全長の核酸塩基よりも少なく含む欠失類似体）、図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、核酸配列の末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、これらのヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸配列によってコードされたタンパク質のいくつか、またはすべての特性を共有するタンパク質をコードする。本発明の一つの態様において、前記核酸類似体は、図4Ａ〜4Ｂに示したか、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸配列によってコードされるものと同一のアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする。もう一つの態様において、前記核酸類似体は図4Ａ〜4Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸によってコードされたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持っているタンパク質をコードする。さらなる態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質は、図4Ａ〜4Ｂで示したアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能と同様の機能を有する。もう一つの態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質の機能は、図4Ａ〜4Ｂに示されたアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能とは異なる。もう一つの態様において、前記核酸配列の変化は、タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域内で起こる。さらなる態様において、前記核酸配列の変化はＴＭ領域の外側で起こる。
【００７９】
本発明は、上述した単離した核酸であって、前記核酸はＤＮＡである核酸を提供する。一態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。またもう一つの態様において、前記核酸はＲＮＡである。核酸分子の作製および操作の方法は、本技術分野において周知である。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書で記述した任意のポリペプチドをコードするＤＮＡに関して、縮重した核酸を提供する。一態様において、核酸は図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示したヌクレオチド配列、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるヌクレオチド配列に関して縮重したヌクレオチド配列、すなわち同一のアミノ酸配列に翻訳されるヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書で記述した任意のポリペプチドをコードするＤＮＡに関して縮重した核酸を提供する。態様において、核酸は図３Ａ〜３Ｂ（配列番号：３）に示したヌクレオチド配列またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるヌクレオチド配列に関して縮重したヌクレオチド配列、すなわち同一のアミノ酸配列に翻訳されるヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
本発明はまた、本発明にしたがったポリペプチドの物とは異なるが、表現系に変化は起こさないであろうアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。あるいは、本発明はまた、本発明にしたがったＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡも包含する。ハイブリダイゼーション方法は当業者に周知である。
【００８３】
また本発明にしたがった核酸は、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類似体、断片、または、誘導体をコードする核酸分子を含む。これらの核酸分子は、一以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して、天然に存在する型とは異なり（タンパク質を特定する残基の全長より短い欠失類似体、特定された一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、ポリペプチドの末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、天然に存在する型のいくつか、またはすべての特性を共有する。これらの分子には、選択された非ほ乳類宿主に発現するために「好ましい」コドンの挿入；制限エンドヌクレアーゼ酵素によって開裂するための部位の供給；および簡単に発現ベクターを構築することを容易にする、付加的な開始、終止、または中間ＤＮＡ配列の供給、が含まれる。ポリペプチド類似体の作製は、当業者に周知である（Ｓｐｕｒｎｅｙ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９７）、Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９５）、Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９４）、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９６）、Ｇｕａｎ Ｘ．Ｍ．ら（１９９５））。
【００８４】
本発明にしたがった修飾ポリペプチドは、本技術分野で周知の、たとえば本明細書で開示したものを使用して一過性に、または安定に、どちらかで細胞にトランスフェクトしてもよい。本発明はまた、修飾ポリペプチド（ポリペプチドは一過性または安定細胞株のどちらかで発現される）を使用した結合アッセイを提供する。本発明はさらに、本明細書に記載された結合アッセイなどの結合アッセイにおいて、修飾ポリペプチドを使用して同定された化合物を提供する。
【００８５】
本明細書で記載され、請求された核酸は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してそれらが提供する情報として、およびさまざまな組換え技術によってポリペプチドを大規模に合成するための産物として有用である。本核酸分子は、新規クローニングおよび発現ベクター、形質転換されおよびトランスフェクトされた真核および原核細胞宿主、並びにポリペプチドおよび関連産物の発現が可能な宿主細胞などを培養増殖するための新規で有用な方法を作成するために有用である。
【００８６】
本発明はまた、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示した核酸配列によってコードされる、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされるＳＮＯＲＦ２５受容体の種相同体をコードする単離された核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体が有するものと本質的に同一のアミノ酸配列を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の相同体をコードする。もう一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と７５％より高いアミノ酸の一致性、好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と８５％より高いアミノ酸の一致性、最も好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と９５％より高いアミノ酸の一致性を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体をコードする。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して７０％より高い核酸の一致性、好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して８０％より高い核酸の一致性、より好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して９０％より高い核酸の一致性を有する。種相同体を単離し、精製するための方法の例は、他に記載されている。（たとえば米国特許第５，６０２，０２４号、第ＷＯ９４／１４９５７号、第ＷＯ９７／２６８５３号、第ＷＯ９８／１５５７０号）。
【００８７】
また本発明は、図３Ａ〜３Ｂ（配列番号：３）に示した、核酸配列によってコードされる、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされるＳＮＯＲＦ２５受容体の種相同体をコードする単離された核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸は、本質的にプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体が有するものと本質的に同一のアミノ酸配列を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の相同体をコードする。もう一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と７５％より高いアミノ酸の一致性、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と８５％より高いアミノ酸の一致性、最も好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と９５％より高いアミノ酸の一致性を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体動動物をコードする。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して７０％より高い核酸の一致性、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して８０％より高い核酸の一致性、より好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して９０％より高い核酸の一致性を有する。
【００８８】
本発明は、修飾されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離された核酸を提供する。この核酸は第三細胞内領域にアミノ酸欠失、置換または添加を有することにより、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体とは異なる。
【００８９】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離した核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸はＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体はプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたものと同一のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体は、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
【００９０】
一態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様においてラットＳＮＯＲＦ２５受容体はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたものと同一のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、前記ラットＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を持つ。
【００９１】
本発明は、精製されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質を提供する。一つの態様において、前記ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質である。さらなる態様において、前記ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質である。
【００９２】
本発明は、本発明にしたがった核酸を含むベクターを提供する。本発明はさらに、その発現が可能なように、前記受容体をコードする核酸に動作可能に連結された核酸を細胞内（前記細胞は細菌、両生類、酵母、昆虫またはほ乳類細胞である）で発現するために必要な調節エレメントを含む、細胞内で発現するために適応されたベクターを提供する。一つの態様において、前記ベクターはバキュロウイルスである。もう一つの態様において、前記ベクターはプラスミドである。
【００９３】
本発明は、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）と命名されたプラスミドを提供する。本発明はまた、ｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）と命名されたプラスミドを提供する。
【００９４】
本発明はさらに、修飾された非翻訳配列を含む任意のベクターまたはプラスミドを提供する。これらは、望ましい宿主細胞に発現するために、または結合または機能アッセイにおいて使用するために有益である。たとえば、さまざまな長さの非翻訳配列を有するベクターまたはプラスミドは、使用した宿主細胞に依存して、異なる量のポリペプチドを発現するであろう。一態様において、前記ベクターまたはプラスミドは、ポリペプチドのコード配列および宿主細胞で発現するために必要な調節エレメントを含む。
【００９５】
本発明は、本発明にしたがったベクターを含む細胞を提供する。一つの態様において、前記細胞は非ほ乳類細胞である。一つの態様において、前記非ほ乳類細胞は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、またはアフリカツメガエルメラニン保有細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、またはＣＨＯ細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、昆虫細胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ５Ｂ−４細胞である。
【００９６】
本発明は、本発明にしたがって細胞から単離された膜プレパレーションを提供する。
【００９７】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００９８】
本発明はさらに、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。本発明はまた、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図3A-3B（配列番号3）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。一つの態様において、前記核酸はＤＮＡである。もう一つの態様において、前記核酸はＲＮＡである。
【００９９】
本明細書で使用するものとして、「特異的にハイブリズする」の用語は、その核酸自身に相補的な核酸配列を認識し、かつ相補的な塩基対との間で水素結合を介して二重らせん部分を形成する核酸分子の能力を意味する。
【０１００】
本発明にしたがった核酸は、他の種から相同性のある核酸を得るための、および試料中に相補的な配列を有する核酸の存在することを検出するためのプローブとして使用してよい。
【０１０１】
また前記核酸は、その核酸がコードする受容体をトランスフェクトした細胞内に発現するために使用してもよい。
【０１０２】
さらなる修飾をされずに天然に存在するか、または適切な点変異導入、欠失などの後であるか、いずれかであるＳＮＯＲＦ２５によってコードされる持続的に活性な受容体を使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでアンタゴニストをスクリーニングすること、および内因性リガンドについて先行知識を持たずに、受容体ＳＮＯＲＦ２５に起因する役割を担うためのにこのようなアンタゴニストを使用することが可能になる。
【０１０３】
前記核酸の使用はさらに、受容体の多様性の可能性、およびＳＮＯＲＦ２５がメンバーである受容体ファミリー内に多数のサブタイプが存在することの解明を可能にする。
【０１０４】
最後に、数ある中で、慢性および急性炎症、関節炎、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患、細菌性、真菌性、原虫およびウイルス感染、敗血症、ＡＩＤＳ、痛み、不安、鬱病、分裂病、痴呆、精神遅延、記憶喪失、てんかんを含む精神病性および神経学的障害、神経学的障害、運動神経障害、呼吸障害、喘息、肥満、過食症、糖尿病、食欲不振を含む食事／体重障害、悪心、高血圧、低血圧、血管および心臓血管障害、虚血、発作、癌、腫瘍、尿失禁、性／生殖障害、日周期障害、腎臓障害、骨粗鬆症を含む骨疾患、良性前立腺肥大症、胃消化管障害、鼻うっ血、乾癬のような皮膚障害、アレルギー、パーキンソン病、アルツハイマー病、急性心不全、アンギナ障害、せん妄、ハンティングトン病またはギレズ デラ ツレット症候群のような運動障害、などのさまざまな病態生理学的な症状を治療するため、およびそのような症状を診断するアッセイする薬剤を設計するための貴重なツールとして、本発明が役に立つ可能性があると考えられる。また本受容体は、化学予防のための薬剤を設計するための貴重なツールとして、役に立つ可能性がある。
【０１０５】
前記受容体が細胞表面上に発現している細胞を得るために、細胞、たとえばほ乳類細胞に、このような核酸をトランスフェクトする方法は、本技術分野において周知である（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０６】
また、このようなトランスフェクトされた細胞は、ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合する化合物、並びにこのような細胞において機能的応答を活性化するか、または活性化を阻害する化合物を得るために、化合物をテストし、および化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用してよく、したがってｉｎ ｖｉｖｏでそのようになる可能性がある（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０７】
本発明はさらに、ほ乳類受容体をコードする核酸によってコードされたほ乳類受容体に結合可能な抗体を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類受容体はヒト受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類受容体はラット受容体である。本発明はまた、ほ乳類受容体に対する抗体の結合を競合的に阻害することができる薬剤を提供する。一つの態様において、前記抗体はモノクローナル抗体または抗血清である。
【０１０８】
ＳＮＯＲＦ２５受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、核酸プローブ、トランスジェニック動物を調製し、使用する方法は本技術分野において周知ある（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０９】
本発明はまた、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＲＮＡの翻訳を防ぐために、このようなＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするゲノムＤＮＡの転写を防ぐために、このようなゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一つの態様において、前記オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含む。
【０１１０】
本発明は、本発明による核酸によってコードされたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合することが可能な抗体を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１１１】
さらに、本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に対する、本発明による抗体の結合を競合的に阻害することができる抗体を提供する。一つの態様において、前記抗体はモノクローナル抗体または抗血清である。
【０１１２】
本発明はまたさらに、
（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、請求項36に記載のオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１３】
一つの態様において、前記オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する基質と結合する。もう一つの態様において、前記ｍＲＮＡを不活性化する基質はリボザイムである。もう一つの態様において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、細胞のほ乳類SNORF25受容体と結合する構造物を含み、前記受容体は該構造物と結合した後に、前記細胞に取り込まれることが可能な医薬組成物である。もう一つの態様において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、選択した細胞タイプに特異的なほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合することが可能である。
【０１１４】
本発明はまた、医薬組成物であって、リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な、本発明による抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明によるほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現しているトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。本発明は、天然のほ乳類SNORF25受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。本発明はさらに、トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、請求項1に記載のほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡは、さらに、誘導可能なプロモーターを含む。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡは、さらに、組織特異的調節成分を含む。もう一つの態様において、トランスジェニック非ヒトほ乳類は、マウスである。
【０１１６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【０１１７】
一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体はヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は本質的に、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体と同様のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は本質的に図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）で示したのと同様のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、ほ乳類のＳＮＯＲＦ２５受容体は、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）で示したアミノ酸配列を持つ。
【０１１８】
もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体と本質的に同様のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）で示した配列と本質的に同様のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ほ乳類のＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）で示したアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は非ニューロン起源である。もう一つの態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である。本発明は本発明の前記工程によって同定された化合物を提供する。
【０１２０】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【０１２１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【０１２２】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体はヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は非ニューロン起源である。もう一つの態様において、非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。本発明は本発明の前記工程によって同定された化合物を提供する。
【０１２３】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法提供する。
【０１２５】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞は、非ニューロン起源である。さらなる態様において、非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ１細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１２６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを本発明による核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法を提供する。
【０１２７】
本発明は、細胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と本発明による抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法を提供する。
【０１２８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、さらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法を提供する。
【０１３０】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法を提供する。
【０１３１】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。本発明は、本発明に方法によって同定されたアンタゴニストを提供する。本発明は、本発明によるアンタゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明による医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【０１３２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。本発明は、本発明によって同定されたアゴニストを提供する。本発明は、本発明によって同定されたアゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【０１３３】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明による医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【０１３４】
本発明は、ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 請求項1に記載のほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法を提供する。
【０１３５】
一つの態様において、前記疾患は、特定のほ乳類対立遺伝子の活性に関連する疾患である。
【０１３６】
本発明はまた、本発明に従って精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明は、本発明に従って精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法を提供する。
【０１３８】
本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【０１３９】
本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【０１４０】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１４１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば薬学的組成物を提供する。一つ態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない。
【０１４２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば薬学的組成物を提供する。一つ態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない。
【０１４３】
本発明はさらに、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法を提供する。
【０１４４】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は内部塩素電流のレベルの増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は細胞内カルシウムの測定の増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、イノシトールリン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はイノシトールリン酸レベルの増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはアラキドン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はアラキドン酸濃度の増加である。またもう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ＧＴＰγＳリガンドの結合が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化はＧＴＰγＳリガンドの結合の増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ＭＡＰキナーゼの活性化が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化はＭＡＰキナーゼ活性の増加である。さらなる態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ｃＡＭＰの蓄積が含まれ、前記二次メッセンジャー応答の変化はｃＡＭＰ蓄積の増加である。
【０１４５】
本発明は、化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法。
【０１４６】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししか内部塩素電流レベルを増加しないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少し細胞内カルシウムレベルの測定を増加しないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答はイノシトールリン酸の放出を含み前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししかイノシトールリン酸レベルを増加しないことである。
【０１４７】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはＭＡＰキナーゼの活性化が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのＭＡＰキナーゼのレベルの増加が少ないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはｃＡＭＰレベルの変化が含まれ、前記二次メッセンジャー応答の変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのｃＡＭＰのレベルの変化が少ないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはアラキドン酸の放出が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのアラキドン酸のレベルの増加が少ないことである。さらなる態様において、前記二次メッセンジャー応答にはＧＴＰγＳリガンド結合が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのＧＴＰγＳリガンド結合のレベルの増加が少ないことである。
【０１４８】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である。もう一つの態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。
【０１４９】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない。
【０１５０】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を低下させるために効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない。
【０１５１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１５２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【０１５３】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である。さらなる態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１５４】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に有効な量の、本発明に従った方法によって同定された化合物、およびキャリアたとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【０１５５】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に有効な量の、本発明に従った方法によって同定された化合物、およびキャリアたとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【０１５６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記異常は、ステロイドホルモン障害、エピネフリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管障害、電解質バランス障害、高血圧、糖尿病、呼吸障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋骨格障害、神経内分泌障害、認識障害、記憶障害、体性感覚および神経伝達障害、運動協調障害、知覚統合障害、ドーパミン機能障害、食欲不振または肥満のような食欲障害、感覚伝達障害、嗅覚障害、自律神経系障害、痛み、精神病行動、感情障害、偏頭痛、癌、増殖疾患、傷治癒、組織再生、血液凝固関連障害、発達障害または虚血再灌流傷関連疾患の調節である。
【０１５７】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法提供する。一つの態様において、前記異常は、ステロイドホルモン障害、エピネフリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管障害、電解質バランス障害、高血圧、糖尿病、呼吸障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋骨格障害、神経内分泌障害、認識障害、記憶障害、体性感覚および神経伝達障害、運動協調障害、知覚統合障害、ドーパミン機能障害、食欲不振または肥満のような食欲障害、感覚伝達障害、嗅覚障害、自律神経系障害、痛み、精神病行動、感情障害、偏頭痛、癌、増殖疾患、傷治癒、組織再生、血液凝固関連障害、発達障害または虚血再灌流傷関連疾患の調節である。
【０１５８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、本発明に従った方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１５９】
本発明は、組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の本発明に従った方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１６０】
従って、いったん標的受容体のサブタイプの遺伝子がクローン化されたならば、それは前記標的受容体サブタイプをその表面上に発現するレシピエント細胞内に配置される。次いで、標的ヒト受容体サブタイプの単一集団を発現しているこの細胞を増殖させ、細胞株の樹立させる。薬物発見系を構成するこの細胞株を、２つの異なる型のアッセイで使用する：結合アッセイおよび機能性アッセイである。結合アッセイにおいて、特定の薬物発見プログラムの標的である受容体サブタイプと、副作用に関連する可能性のある他の受容体サブタイプの両方の化合物の親和性を測定する。これらの測定により、化合物の効力、並びに化合物が他の受容体サブタイプよりも標的受容体サブタイプ対して有する選択性の程度を予測することができる。結合アッセイから得たデータにより、適切であれば、化学者は最適な治療効果のために、一以上の関連性のあるサブタイプに近づけるかまたは遠ざけて化合物を設計することもできる。機能性アッセイにおいては、化合物に対する受容体サブタイプの応答の性質を測定する。機能性アッセイからのデータは、化合物が受容体サブタイプの活性を阻害するために働いているのか、促進するために働いているのかを示し、したがって薬理学者は、それらの最終的な標的ヒト受容体サブタイプにおいて迅速に化合物を評価することができ、化学者は、現存している薬物より有効であり、重度な副作用がより少なく本質的にはほとんどないであろう薬物を合理的に設計することができる、。
【０１６１】
受容体サブタイプ選択的な化合物を設計すること、および合成することへのアプローチは周知であり、伝統的な医薬化学、およびより新しいコンビナトリアルケミストリーの技術が含まれ、その両方がコンピュータ補助による分子モデリングによって支持される。このようなアプローチによって、化学者および薬理学者は、標的とした受容体サブタイプの構造、並びに受容体サブタイプに結合するおよび／または活性化するまたは活性化を阻害すると決定された化合物に対する知識を使用して、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有する可能性のある構造を設計し、かつ合成する。
【０１６２】
コンビナトリアルケミストリーは、化学構築ブロックの様々な組合せを用いて組み立てることによって、さまざまな新規の化合物を自動化合成することが含まれる。コンビナトリアルケミストリーを使用することにより、化合物を合成する工程は非常に加速した。得られた化合物の配列（アレイ）はライブラリーと呼ばれ、目的の受容体に対して十分なレベルの活性を示す化合物（「リード化合物」）をスクリーニングするために使用される。コンビナトリアルケミストリーを使用して、目的の標的受容体に非常に偏っていると予想される化合物の「特定化（ｆｏｃｕｓｅｄ）」ライブラリーを合成することが可能である。
【０１６３】
いったんリード化合物が同定されたならば、コンビナトリアルケミストリーまたは伝統的な医薬化学またはそれ以外のいずれかを使用することによって、化学構造と、生物学的または機能的活性との関係を容易に理解するために、さまざまな相同体および類似体が調製される。これらの研究は、構造活性の関係を明確にする。この関係は、効力、選択性および薬物動力学的特性が改善された薬剤を設計するために使用される。また、リードを最適化するために、コンビナトリアルケミストリーを使用して、さまざまな構造が迅速に作製される。一つずつ化合物の合成することを含む伝統的な医薬化学は、さらに精製するため、および自動化技術によって利用できない化合物を作製するために使用される。いったんこのような薬剤が限定されたならば、製薬および化学工業において利用されている標準的な製造技術を使用して、前記産物をスケールアップする。
【０１６４】
本発明は、以下の実験の詳細によって、より理解されるであろう。しかしながら、特定の方法および考察される結果が、上記特許請求の範囲がより完全に記載されるように、本発明を単に例示しただけであることは当業者にすぐに理解されるであろう。
【実施例】
【０１６５】
材料と方法
ｃＤＮＡの混合オリゴヌクレオチドプライムド増幅（ＭＯＰＡＣ）
ｃＤＮＡの混合オリゴヌクレオチド増幅（ＭＯＰＡＣ）を、ラットゲノムＤＮＡ、ＧＨ１細胞株およびＲｉｎ１４ｂ細胞株から単離したｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを含むいくつかのＤＮＡテンプレートに対して実施した。ＭＯＰＡＣ反応はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、および以下の縮重オリゴヌクレオチド、ガラニン、ソマトスタチン、および阿片受容体ファミリーのの第３膜貫通領域に基づいて設計されたＪＡＢ５５、およびガラニン受容体ファミリーの第７膜貫通領域に基づいて設計されたＴＬ１０２０を用いて実施した。
【０１６６】
ＭＯＰＡＣ ＰＣＲ反応の条件は以下のように行った。９４℃で３分間保持、９４℃で１分間、４４℃で１分４５秒間、７２℃で２分間を１０サイクル、９４℃で１分間、４９℃で１分４５秒間、７２℃で２分間を３０サイクル、アガロースゲル電気泳動の準備ができるまで４℃で保持。
【０１６７】
前記産物を１％アガロースＴＡＥゲル上で泳動し、予想される大きさ（〜５００〜６００ｂｐ）のバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製して、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にサブクローン化した。白色の（挿入物を含んだ）コロニーを取り上げ、以下のプロトコルを用いてｐＣＲ２．１ベクタープライマーのＪＡＢ１およびＪＡＢ２を用いたＰＣＲにかけた。９４℃で３分間保持、９４℃で１分間、６８℃で１分４５秒間、６８℃で２分間を３５サイクル、精製の準備ができるまで４℃で保持。ＰＣＲ産物をイソプロパノール沈殿（１０μｌ ＰＣＲ産物、１８μｌ 低ＴＥ、１０．５μｌ ２Ｍ ＮａＣｌＯ４、２１．５μｌ イソプロパノール）によって精製し、ＡＢＩ Ｂｉｇ ＤｙｅサイクルシークエンシングプロトコルおよびＡＢＩ ３７７シークエンサー（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を決定した。後にＳＮＯＲＦ２５と命名した、これらのＰＣＲ産物の１つは、データベース検索に基づいて新規のＧタンパク質結合受容体様配列であり、他の既知のＧタンパク質結合受容体との相同性を持つと決定された（既知の受容体ドーパミンＤ１、β−アドレナリン作動性２ｂおよび５−ＨＴ１ｆに対して−２９％同一、５−ＨＴ４ｌ受容体に対して３４％同一）。
【０１６８】
５’および３’ＲＡＣＥ
ＳＮＯＲＦ２５の全長コード配列を決定するために、５’／３’ｃＤＮＡ末端急速増幅（ＲＡＣＥ）のためのクローンテックマラソンｃＤＮＡアンプリフィケーション（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。Ｒｉｎ１４ｂ細胞由来のトータルＲＮＡをファストトラックｍＲＮＡアイソレーションキット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｏｌｙＡ＋選択した。５’ＲＡＣＥのためには、上述したＰＣＲ断片（ＳＮＯＲＦ２５）の推定第５膜貫通領域に由来するリバースプライマーであるプライマーＪＡＢ７３を用いて、１μｇのｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。アドバンテージクレンタックポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋｌｅｎｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、マラソンｃＤＮＡアンプリフィケーションプロトコルにしたがって、アダプターのライゲーションおよびネスティッドＰＣＲを実施した。供給業者のアダプタープライマー１（Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ １）と上述したＰＣＲ断片の第５膜貫通領域の５’末端に由来するリバースプライマーであるＪＡＢ７１を用いて、ライゲーションされたｃＤＮＡの５０倍希釈に対して第一ＰＣＲを実施した。アダプタープライマー２（Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ ２）と第四膜間通領域のすぐ下流のリバースプライマーであるＪＡＢ６９を用いて、この第一ＰＣＲ反応液の１μｌを再び増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間、９４℃で１５秒間、７２℃で１分３０秒間を５サイクル、９４℃で１５秒間および７０℃で１分３０秒間を５サイクル、９４℃で１５秒間、６８℃で１分３０秒間を２２サイクル、６８℃で５分間保持し、および解析の準備ができるまで４℃に保持した。ネスティッドＰＣＲ由来の６００ｂｐ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫキットを用いて１％アガロースＴＡＥゲルから単離して、上述したようにＡＢＩ３７７シークエンサーおよびＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定した。ウイスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）（ＧＣＧ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてシーケンスした。
【０１６９】
３’ＲＡＣＥのためには、二本鎖ｃＤＮＡをマラソンｃＤＮＡアンプリフィケーションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に付属するｃＤＮＡ合成プライマーＣＤＳを用いて、１μｇのｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡより合成した。３’ＲＡＣＥ反応のＰＣＲ条件は、上述したＭＯＰＡＣからの新規ＰＣＲ断片の第５と第６膜貫通領域の間に位置する配列に由来するフォワードプライマーであるＪＡＢ７４およびＪＡＢ７２を、それぞれＪＡＢ７１およびＪＡＢ７３の代わりに使用することを除いて、５’ＲＡＣＥ反応と同様である。ネスティッドＰＣＲ由来の１．４ｋｂ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて１％アガロースＴＡＥゲルより単離して、上記のようにシーケンスした。
【０１７０】
本受容体配列の全長コード配列を決定した後に、全コード領域を、エクスパンド ロング ＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ ＰＣＲ）システム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、Ｒｉｎ１４ｂ細胞株ｃＤＮＡ、およびラットゲノムＤＮＡから増幅した。この反応のためのプライマーは、それぞれ５’（ＪＡＢ８６）および３’（ＪＡＢ８４）プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込んだＳＮＯＲＦ２５の５’および３’非翻訳領域に特異的である。次いで、この反応由来の産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローン化し、ベクター−および遺伝子−特異的プライマーを用いて両方向をシーケンスした。Ｒｉｎ１４ｂ−クローン化ＳＮＯＲＦ２５産物由来の二本鎖配列は、ラットゲノムＤＮＡから増幅した同様の遺伝子の配列と一致した。ｐｃＤＮＡ３．１（−）内のラットＳＮＯＲＦ２５のこの受容体／発現ベクター構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５と名付けた。
【０１７１】
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体の相同性クローニング
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体をクローン化するために、ラットＳＮＯＲＦ２５配列の第２（ＢＢ４２６）および第５（ＢＢ４２７）膜貫通領域（ＴＭｓ）に基づいて２つのオリゴヌクレオチドを設計し、ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブするために使用した。両方のプライマーをα３２Ｐ−ｄＡＴＰおよび末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって末端標識化した。中程度にストリンジェントな条件下：３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）、１×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％ウシ胎児アルブミン）、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、および２５μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、においてハイブリダイゼーションを行った。濾液を２０分間室温にて、２×ＳＳＣ／０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む緩衝液中で３回、０．１×ＳＳＣ／０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む緩衝液中で２０分間２回洗浄し、−７０℃にて、増感スクリーンの存在下でコダック バイオマックス ＭＳ（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳ）フィルムに露光した。
【０１７２】
プローブとハイブリダイゼーションしたコスミドクローンを拾い、プレートに画線し、個々の陽性コロニーを確認して、単離するために同一の条件下で同一のプローブを用いて二回選別した。陽性コロニー由来のコスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに写し、３２Ｐ−標識化ＢＢ４２６でプローブした。前記プローブとハイブリダイズしたクローン＃４５ａ（ＣＯＳ４ライブラリー）由来のおよそ１．９ｋｂの断片を、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローン化し（ｐｃＥＸＶ（ミラー アンド ジャーマン（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｍａｎ）、１９８６）をＢｓｔＸＩおよび他のさらなる制限部位、並びにＴ３、Ｔ７プロモーターを含むように改変した岡山およびベルグ（Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ）発現ベクターである）、上述のように両方の鎖をシーケンスした。このベクター内のヒトＳＮＯＲＦ２５受容体構築物をｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５と名付けた。ヒトＳＮＯＲＦ２５は、ＧＣＧソフトウェアを用いて解析し、ヒトＳＮＯＲＦ２５の全長配列を含み、ラット受容体と８０％アミノ酸同一性および８３％ヌクレオチド同一性を持つことをむことを確認した。
【０１７３】
オリゴヌクレオチドプライマー
以下は、これらの受容体のクローニングに使用したプライマーとその関連配列のリストである。
【０１７４】
ＪＡＢ５５：５’−ＴＢＤＳＹＶＹＩＧＡＹＭＧＩＴＡＹＶＴＫＧ−３’（配列番号：５）
ＴＬ１０２０：５’−ＧＡＩＲＳＩＡＲＩＧＭＲＴＡＩＡＹＩＡＫＩＧＧＲＴＴ−３’（配列番号：６）
ＪＡＢ１：５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号：７）
ＪＡＢ２：５’−ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号：８）
ＪＡＢ６９：５’−ＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号：９）
ＪＡＢ７１：５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：１０）
ＪＡＢ７２：５’−ＡＴＧＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号：１１）
ＪＡＢ７３：５’−ＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１２）
ＪＡＢ７４：５’−ＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：１３）
ＪＡＢ８４：５’−ＡＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：１４）
ＪＡＢ８６：５’−ＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１５）
ＢＢ４２６：５’−ＴＴＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＡＧ−３’（配列番号：１６）
ＢＢ４２７：５’−ＧＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号：１７）
ＳＮＯＲＦ２５受容体ｃＤＮＡの他の種の相同体の単離
他の種に由来するＳＮＯＲＦ２５受容体ｃＤＮＡをコードする核酸配列を、標準的分子生物学技術および以下で記述したものなどのアプローチをしようして単離できるであろう。
【０１７５】
アプローチ＃１：ゲノムクローンを単離するために、対象の種から作製されたゲノムライブラリー（例えばコスミド、ファージ、Ｐ１、ＢＡＣ、ＹＡＣ）を、その配列が図１Ａ〜１Ｂおよび３Ａ〜３Ｂに示されたヒトまたはラットＳＮＯＲＦ２５受容体の断片に対応する３２Ｐ−標識されたオリゴヌクレオチドでスクリーニングすればよい。全長配列は、このゲノムクローンのシークエンスすることによって得ることができる。１以上のイントロンが遺伝子内に存在する場合、イントロンのない全長遺伝子は、標準的な分子生物学技術を用いてｃＤＮＡより得ることができる。例えば、５’ＵＴで設計されたフォワードＰＣＲプライマー、および３’ＵＴで設計されたリバースＰＣＲプライマーを使用して、全長、イントロンのない受容体をｃＤＮＡから増幅してもよい。ほ乳類発現ベクター内にこの遺伝子をサブクローンするために、標準的な分子生物学的技術が使用できる。
【０１７６】
アプローチ＃２：標準的な分子生物学技術を使用して、図１Ａ〜１Ｂおよび３Ａ〜３Ｂに示された配列の断片に対応する３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ストリンジェンシーを減少させた条件下でハイブリダイゼーションすることによって市販されている対象の種のｃＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングするために使用してよい。ラムダライブラリーに由来するプラーク精製クローンを得ることによって、全長ＳＮＯＲＦ２５受容体を単離し、次いでクローンを直接ＤＮＡシークエンスにかけてもよい。あるいは、部分的種相同的配列に対して設計したプライマーを使用してライブラリープールをＰＣＲ増幅することにより、ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをスクリーニングするために、標準の分子生物学技術が使用できるであろう。全長クローンは、３２Ｐオリゴヌクレオチドプローブに陽性なプールのコロニーを拾って、サザンハイブリダイゼーションすることによって単離すればよい。
【０１７７】
アプローチ＃３：３’および５’ＲＡＣＥを、ＳＮＯＲＦ２５の付加的な配列を含むＳＮＯＲＦ２５を発現している対象の種に由来するｃＤＮＡからＰＣＲ産物を作製するために使用してもよい。次いで、これらのＲＡＣＥ ＰＣＲ産物をシーケンスして、付加的な配列を決定してよい。次いで、この新規の配列を５’ＵＴ内のフォワードＰＣＲプライマーに、３’ＵＴ内の３’リバースＰＣＲプライマーを設計するために使用する。次いで、これらのプライマーはｃＤＮＡから全長ＳＮＯＲＦ２５クローンを増幅するのに使用される。
【０１７８】
他の種の例には、マウス、イヌ、サル、ハムスターおよびモルモットが限定はしないが含まれる。
【０１７９】
宿主細胞
異種性に発現しているタンパク質を研究するために、広範囲の様々な宿主細胞を使用できる。これらの細胞には、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＬＭ（ｔｋ−）、ＨＥＫ２９３などのようなほ乳類細胞株、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞株、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞のような両生類細胞、多彩な酵母株、多彩な細菌株細胞などが含まれるが、限定されない。これらの細胞タイプのそれぞれに対する培養条件は特異的であり、当業者に公知である。ＳＮＯＲＦ２５受容体を発現するために使用した細胞はＣｏｓ−７とチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であった。
【０１８０】
補充物を含むＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ グルタミン、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン／１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地）中、１５０ｍｍプレート内で、３７℃、５％ＣＯ２にてＣｏｓ−７細胞を増殖させる。Ｃｏｓ−７細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分割する。
【０１８１】
補給物（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００ユニット／ｍｌ ペニシリン／１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＨＡＭのＦ−１２培地にて、１５０ｍｍプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２にてＣＨＯ細胞を増殖させる。ＣＨＯ細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：８に分割する。
【０１８２】
一過性発現
研究するためのタンパク質をコードするＤＮＡは、リン酸カルシウムを介して、ＤＥＡＥ−デキストランを介して、リポソームを介して、ウイルスを介して、エレクトロポレーションを介してねおよびマイクロインジェクション伝送のような様々な方法によって、さまざまなほ乳類、昆虫、両生類、酵母、細菌および他の細胞株に一過性に発現させることができる。これらの方法は、それぞれＤＮＡ、細胞株、および本質的に使用するアッセイのタイプに依存している多彩な実験的パラメータの最適化を必要とする可能性がある。ＳＮＯＲＦ２５ ｃＤＮＡをさまざまな細胞株に一過性にトランスフェクトするために、エレクトロポレーション法を使用した。
【０１８３】
Ｃｏｓ−７細胞に適用したようなエレクトロポレーション法の典型的なプロトコルは、以下に記述する。トランスフェクションに使用する細胞をトランスフェクションの２４時間前に分割し、トランスフェクション時にサブコンフルエントなフラスコを用意する。細胞をトリプシン処理によって回収し、その増殖培地内に再び懸濁して計数する。５×１０６細胞を３００μｌのＤＭＥＭに懸濁させ、エレクトロポレーションキュベット内に入れる。８μｇの受容体ＤＮＡ＋８μｇの必要な任意の追加ＤＮＡ（例えばＧタンパク質発現ベクター、レポーター構築物、抗生物質抵抗性マーカー、モックベクターなど）を細胞懸濁液に添加し、キュベットをバイオラッド ジーン パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）に入れ、電気パルスを与える（ジーン パルサー設定：０．２５ｋＶ 電圧、９５０μＦ 電気容量）。パルスの後、８００μｌの完全ＤＭＥＭをそれぞれのキュベットに加え、懸濁液を滅菌チューブに移した。それぞれのチューブに、最終濃度が１×１０５細胞／１００μｌとなるまで完全培地を加える。次いで実施するアッセイのタイプに依存して必要なように細胞をプレートにまく。
【０１８４】
安定発現
異種性ＤＮＡを宿主細胞内に安定に組み込むことができ、これにより細胞に外来タンパク質を永久に発現させることになる。ＤＮＡを細胞内に運搬する方法は、一過性発現に関して上述したものと同様であるが、標的とした宿主細胞に薬物抵抗性を与えるための補助遺伝子を共トランスフェクションすることが必要である。その結果得られる薬物抵抗性は、ＤＮＡを取り込んだ細胞を選択し、保持するために活用することができる。利用可能な抵抗性遺伝子の種類には、ネオマイシン、カナマイシンおよびハイグロマイシンを含むが、限定しない。本発明の受容体に関する研究を目的として、異種性受容体タンパク質の安定発現は一般的に、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＬＭ（ｔｋ−）などを含むほ乳類で実施するが、限定する必要はない。
【０１８５】
さらに、前記受容体に対する核酸配列を天然に持ち、発現する野生細胞株を、受容体の補完を遺伝子工学的に作製する必要なしに使用してよい。
【０１８６】
膜プレパレーション
本発明にしたがった受容体タンパク質を発現する細胞膜は、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ−γ−Ｓ結合アッセイなどを含むアッセイ型に関して有用であるが、限定しない。そのような細胞膜を調製するための特性は、いくつかの場合、次のアッセイの特性によって決めてもよいが、しかし一般的には、全細胞の回収および氷冷緩衝液（たとえば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の調音波処理による細胞ペレットの粉砕を含む。得られた未精製細胞溶解物を、４℃において２００×ｇで５分間の低速遠心することによって細胞残骸を除去する。次いで除去された上清を４０，０００×ｇにて２０分間、４℃で遠心し、氷冷緩衝液中に再び懸濁すること、および高速遠心工程を繰り返すことによって、得られた膜ペレットを洗浄する。最終洗浄膜ペレットをアッセイ緩衝液に再び懸濁する。牛血清アルブミンを標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）法によって、タンパク質濃度を決定する。膜は、すぐに使用するか、または後で使用するために凍結してよい。
【０１８７】
バキュウロウイルスの作製
ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩの、存在する制限部位またはポリペプチドのコード領域に対して５’および３’の配列内に作製した部位内に、本明細書で開示したヒト受容体をコードするＤＮＡのコード領域をサブクローン化してよい。バキュウロウイルスを作製するために、０．５μｇのウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）および３μｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ構造物を（「バキュロウイルス発現ベクターシステム：手順および方法マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ）」にて）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎによって概略されたように、リン酸カルシウム共沈殿法によって２×１０６のスポドテラ フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫Ｓｆ９細胞内に共トランスフェクトしてよい。次いで細胞を２７℃にて５日間インキュベートする。
【０１８８】
共トランスフェクトプレートの上清を遠心によって回収し、組換えウイルスプラークを精製してもよい。ウイルスストックを調整するため、およびウイルスストックのタイターを調べるために、細胞にウイルスを感染させる手順はファーミンゲンのマニュアルに記述されたものである。
【０１８９】
標識化リガンド結合アッセイ
例えば標識化リガンド結合アッセイによって、前記受容体対するリガンドをスクリーニングするために、本発明にしたがった受容体を発現している細胞を使用してよい。いったんリガンドが同定されたならば、同一のアッセイを、さまざまな治療的目的のために使用してよい受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに使用してよい。
【０１９０】
１つの実施様態において、標識化リガンドは、多重ウェルマイクロタイタープレート内で受容体を発現している膜プレパレーションまたは昆虫細胞のどちらかと、非標識化化合物、および結合緩衝液を共に接触させて配置する。別の平衡結合アッセイで最適であると決定した時間、および温度において、結合反応混合液をインキュベートする。細胞ハーベスターを使用してＧＦ／Ｂフィルターを通す濾過によって、または直接結合リガンドを測定することによって、反応を停止させる。リガンドが３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射活性アイソトープで標識化されている場合、結合リガンドを液体シンチレーション計数、シンチレーション近似、または放射活性アイソトープを検出するための任意の他の方法を用いることにより検出してもよい。リガンドが蛍光化合物で標識されている場合、結合標識化リガンドは、蛍光強度、時間分解蛍光、蛍光極性、蛍光伝送、または蛍光相関分光測定などの方法によって測定してよいが、限定はしない。この方法において、受容体と結合するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、受容体を発現している膜タンパク質または昆虫細胞と標識化リガンドの結合を阻害することにより同定されるであろう。非特異的結合は、高濃度の非標識化リガンド（例えば１００〜１０００×ＫＤ）の存在下における膜タンパク質をインキュベーションした後に残っている標識化リガンドの量として定義する。平衡飽和結合アッセイでは、標識化化合物の濃度を増加させて膜プレパレーションまたは受容体をトランスフェクトした昆虫細胞をインキュベートし、標識化リガンドの結合親和性を測定する。非標識化化合物の結合親和性は、多様な濃度の置換リガンドの存在下において標識化化合物の濃度を固定して使用する、平衡競合結合アッセイによって決定してよい。
【０１９１】
機能性アッセイ
ＳＮＯＲＦ２５受容体ＤＮＡを発現している細胞を、機能性アッセイを使用してＳＮＯＲＦ２５受容体に対するリガンドをスクリーニングするために使用してよい。いったんリガンドが同定されたならば、さまざまな治療目的のために使用されるであろう受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、同一のアッセイを使用してもよい。ＧＰＣＲの過剰発現が結果として細胞内シグナル伝達経路の競合的活性化となりうることは、当業者に周知である。同様の方法で、上述したような任意の細胞株におけるＳＮＯＲＦ２５受容体の過剰発現が、以下に記述した機能的応答を活性化することができ、ここに記述したアッセイのどれもが、ＳＮＯＲＦ２５受容体のアゴニストおよびアンタゴニストリガンド両方をスクリーニングするために使用できる。
【０１９２】
ＳＮＯＲＦ２５受容体リガンドの存在をスクリーニングするために、広範囲のアッセイを使用できる。これらのアッセイは、たとえば総イノシトールリン酸の蓄積、ｃＡＭＰレベル、細胞内カルシウム流動、およびカリウム電流などの店頭的な測定から；これらの同じ二次メッセンジャーを測定する（より高い処理量となるように修飾または適合された）系まで；代謝変化、分化、細胞分裂／増殖などの受容体の活性化により生じるより一般的な細胞事象をレポートする細胞に基づいたアッセイまで範囲が及ぶ。このようなアッセイに関するいくつかの記述を以下に示す。
【０１９３】
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ
受容体を介した刺激または環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の阻害は、受容体を発現している細胞内でアッセイしてもよい。細胞を９６ウェルプレートまたは他の容器に入れ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（たとえば、典型的な阻害剤カクテルは、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチンおよび１０μｇ／ｍｌ ホスホラミドンを含む）の存在下、または非存在下において、５ｍＭ チオフィリンんどのホスホジエステラーゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ））などの緩衝液内で、２０分間３７℃、５％ＣＯ２内でプレインキュベートする。試験化合物を１０ｍＭ ホルスコリンと共にまたはなしで添加して、さらに１０分間、３７℃でインキュベートする。次いで培地を吸い取り、１００ｍＭ ＨＣｌの添加または他の方法によって反応を停止させる。プレートを４℃にて１５分間保存し、停止溶液内のｃＡＭＰ含量を放射免疫アッセイによって測定する。放射活性は、データ変換ソフトウェアを備えたガンマ計数器を使用して定量してよい。受容体に対するアッセイを最適化するため、またはｃＡＭＰの検出方法を変更するために、特定の改変を実施してもよい。
【０１９４】
アラキドン酸放出アッセイ
受容体を発現している細胞を９６ウェルプレートまたは他の容器内にまき、補充物を含む培地内で３日間増殖させる。３Ｈ−アラキドン酸（特異的活性＝０．７５μＣｉ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに１００μＬ量で伝送し、試料を３７℃、５％ＣＯ２にて１８時間インキュベートする。標識化された細胞を培地で３回洗浄する。次いでウェルを培地で満たし、総容量２５０μＬでの試験化合物または緩衝液を添加して、アッセイを開始する。細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートする。上清をマイクロタイタープレートに移し、乾燥するまで７５℃にて、吸引オーブン内で蒸発させる。次いで試料を２５μＬの滅菌水に溶解し、かつ再び懸濁させる。シンチラント（３００μＬ）をそれぞれのウェルに添加して、試料をトリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）プレート測定器内で３Ｈを計測する。データを非線形回帰およびＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍパッケージ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で利用可能な統計学的技術を用いて解析する。
【０１９５】
イノシトールリン酸アッセイ
ＳＮＯＲＦ２５受容体を介したイノシトールリン酸（ＩＰ）二次メッセンジャー経路の活性化は、ＩＰ産物を放射分析測定することによって査定できる。
【０１９６】
９６ウェルマイクロプレート形式のアッセイにおいて、細胞を７０，０００細胞／ウェルの密度でおき、２４時間インキュベートする。次いで０．５μＣｉの［３Ｈ］−ミオ−イノシトールで３７℃、５％ＣＯ２にて一晩、細胞を標識化する。アッセイの直前に培地を取り除き、９０μＬの１０ｍＭ ＬｉＣｌ含有ＰＢＳに置き換える。次いでプレートを３７℃で１５分間、５％ＣＯ２にてインキュベートする。インキュベーションの後、細胞をアゴニスト（１０μｌ／ウェル、１０×濃度）で３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて感作する。１００μＬの５０％ｖ／ｖ トリクロロ酢酸の添加して感作を終了させ、続いて３０分以上の間の４℃でのインキュベーションする。総ＩＰｓをイオン交換クロマトグラフィーにて溶解物から単離する。簡単には、溶解したウェルの含有物を、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８（２００〜４００メッシュ、フォーマット形態）を含むマルチスクリーン ＨＶ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＶ）フィルタープレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移す。それぞれのウェルに対して１００μＬのＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液（５０％ｖ／ｖ、水：樹脂）を加えて、フィルタープレートを調製する。フィルタープレートをバキュームマニホルド上に置いて、樹脂ベットを洗浄または溶出する。まず２００μｌの５ｍＭ ミオ−イノシトールでそれぞれのウェルを２回洗浄する。総［３Ｈ］リン酸イノシトールを７５μｌの１．２Ｍギ酸アンモニウム／０．１Ｍ ギ酸溶液で９６ウェルプレートに溶出する。２００μＬのシンチレーションカクテルをそれぞれのウェルに加え、放射活性を液体シンチレーション計数管にて測定する。
【０１９７】
細胞内カルシウム流動アッセイ
細胞内遊離カルシウム濃度は、蛍光指示色素Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｂｕｓｈら、１９９１）を使用して微量分光蛍光計によって測定しうる。カバーガラス挿入物を含む３５ｍｍ培養ディッシュ上に、受容体を発現している細胞をまき、一晩接着させる。次いで細胞をＨＢＳにて洗浄し、１００μＬのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）で２０〜４０分間ロードする。細胞をＨＢＳで洗浄してＦｕｒａ−２／ＡＭ溶液を除去した後、細胞をＨＢＳで１０〜２０分間平衡化する。次いで細胞をライツ フルオバート ＦＳ（Ｌｅｉｔｚ Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳ）顕微鏡の４０×対物レンズ下で視覚化し、励起波長を３４０ｎＭ〜３８０ｎＭの間で変化させて５１０ｎＭで蛍光放出を測定する。生の蛍光データを標準カルシウム濃度曲線およびソフトウェア解析技術を用いてカルシウム濃度に変換する。
【０１９８】
他の方法において、細胞内カルシウムの測定はまた、９６−ウェル（またはそれ以上）形式にて他のカルシウム感受性指示薬で実施でき、そのような指示薬の好ましい例は、エクオリン、フルオ−３（Ｆｌｕｏ−３）、フルオ−４、フルオ−５、カルシウム グリーン−１（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ−１）、オレゴン グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）、および４８８ＢＡＰＴＡである。受容体をアゴニストリガンドで活性化した後、細胞内カルシウム濃度の変化によって誘発される放射を照度計、または蛍光イメージャーによって測定してもよく、この好ましい例は、蛍光イメージャープレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）である。
【０１９９】
対象の受容体を発現する細胞を、８０，０００〜１５０，０００細胞／ウェルの密度で透き通った平底黒色壁９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上にプレートし、５％ＣＯ２、３７℃にて４８時間インキュベートさせる。培養液を吸引し、１００μｌのフルオ−３色素を含むローディング緩衝液をそれぞれのウェルに添加する。ローディング培地は、ハンクスＢＳＳ（フェノールレッドなし）（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．１または１％ＢＳＡ（シグマ）、色素／プルロン酸混合液（たとえば、１ｍＭ Ｆｌｕｏ−３、ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）および１０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用直前に混合する）、および２．５ｍＭプロベネシッド（シグマ）（新鮮に調製する）を含む。細胞を５％ＣＯ２、３７℃にて約１時間インキュベートする。
【０２００】
色素ローディングインキュベーションの間、化合物プレートを調製する。化合物を洗浄緩衝液（ハンクスＢＳＳ（フェノールレッドなし）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ プロベネシッド）中に４×最終濃度まで希釈し、透き通ったｖ底プレート（Ｎｕｎｃ）内に分液する。インキュベーションに続いて、過剰な色素を取り除くために細胞を洗浄する。穏やかに細胞を洗浄するためにＤｅｎｌｅｙプレート洗浄機を４回使用し、それぞれのウェルに１００μｌの最終容量の洗浄緩衝液を残す。細胞プレートをＦＬＩＰＲの中心トレーにおき、化合物プレートをＦＬＩＰＲの右トレーにおく。実験のためにＦＬＩＰＲソフトウェアを準備し、実験を行い、データを回収する。次いでエクセル表計算プログラムを用いてデータを解析する。
【０２０１】
アンタゴニストリガンドは、アゴニストリガンドによって誘発されたシグナルの阻害によって同定する。
【０２０２】
ＧＴＰγＳ機能性アッセイ
受容体を発現する細胞由来の膜を、プロテアーゼ阻害剤（たとえば０．１％バシトラシン）の存在下または非存在下において、アッセイ緩衝液（たとえば、５０ｍ ＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ ＧＤＰ、ｐＨ７．４）中に懸濁させる。膜を氷上で２０分間インキュベートし、９６−ウェル ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マイクロタイターＧＦ／Ｃフィルタープレートに移し、ＧＴＰγ３５Ｓ（たとえば、２５０，０００ｃｐｍ／試料、特異的活性−１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）プラスまたはマイナス非標識ＧＴＰγＳ（最終濃度＝１００μＭ）と混合する。最終膜タンパク質濃度＝９０μｇ／ｍｌ。試料を室温にて３０分間、試験化合物の存在または非存在下でインキュベートし、次いでミリポアバキュームマニホールドで濾過し、冷（４℃）アッセイ緩衝液にて３回洗浄する。試料をフィルタープレートに回収し、シンチラントで処理し、トリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）（Ｗａｌｌａｃ）液体シンチレーション計数管で３５Ｓを計測する。受容体膜プレパレーションが適切に作製された外来発現系、すなわち受容体を高レベルで発現する結果となる、および／または高い代謝率を持つＧ−タンパク質（ＧＤＰのＧＴＰへの変換のため）を発現する発現系に由来する場合、最適な結果がえられることが予測される。ＧＴＰγＳアッセイは当業者に周知であり、Ｔｉａｎら（１９９４）またはＬａｚａｒｅｎｏ ａｎｄ Ｂｉｒｄｓａｌｌ（１９９３）などに記述された上記方法の変法を使用してもよいと思われる。
【０２０３】
微小生理学的測定アッセイ
細胞代謝は、（多重メッセンジャー経路による受容体活性化を含む）広範囲の細胞事象に複雑に関わっているので、細胞代謝の微小生理学的測定を使用により、原則として、受容体のシグナル伝達系路の特性に関わらず、任意の受容体の活性化によって生じる細胞の活性化に対する一般的なアッセイが提供される。
【０２０４】
一過性受容体発現、細胞プレパレーション、および微小生理学的測定記録に関する一般的なガイドラインは他（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＯｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．，１９９６）に記載されている。一般的に、受容体を発現する細胞を回収し、実験の２４時間前に、３×１０５細胞あたり微小生理学的測定計カプセルとして完全培地中にまく。培地を記録の１６時間前に無血清培地に置き換えて、多種類かつ病気を定義する血清因子による非特異的代謝刺激を最小化する。実験の日に、細胞カプセルを微小生理学的測定計に移し、記録培地（０．１％脂肪酸なしＢＳＡを含む低緩衝ＲＰＭＩ １６４０、重炭素酸なし、血清なし（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中で平衡化し、その間、基準代謝活性の基準線測定を確立する。
【０２０５】
標準記録プロトコルは、酸性化の速度測定を行う際に、３０秒間の流速中断を含む２分間の総ポンプサイクルを使用し、１００μｌ／分流速により特定する。リガンド感作は、最初の感作後速度測定を行う直前に、試料に１分２０秒間曝露することを含み、続いて試料を合計５分２０秒間の曝露する２回のさらなるポンプサイクルを含む。一般的に、一次スクリーニングにおける薬物は、１０μＭ最終濃度にて細胞に提示する。次いで、活性な化合物の濃度依存性を試験するための実験の経過観察は、閾値から最大レベルまでの範囲における応答を作製するのに必要な量を超える薬物濃度範囲で、細胞を連続的に感作することにより行われる。次いでリガンド試料を洗い流し、報告された酸性化速度を、感作直前に観察した基準線速度に対するピーク応答の増加割合として表す。
【０２０６】
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）を、受容体の活性化を評価するためにモニターしてよい。ＭＡＰキナーゼは、細胞内で多数の経路によって活性化される。活性化の初期様式には、ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ経路が含まれる。成長因子（チロシンキナーゼ）受容体は、ＳＨＣ／Ｇｒｂ−２／ＳＯＳ／ｒａｓを介してこの経路内に入る。Ｇｉ共役受容体はまた、ｒａｓを活性化することが知られており、その後ＭＡＰキナーゼの活性化を産出することが知られている。ホスホリパーゼＣ（Ｇｑ／Ｇｌｌ−共役のような）を活性化する受容体は、ホスファチジルイノシトールを加水分解した結果としてジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産出する。ＤＡＧは、次にＭＡＰキナーゼをリン酸化するタンパク質キナーゼＣを活性化する。
【０２０７】
ＭＡＰキナーゼ活性化は、さまざまなアプローチによって検出できる。１つのアプローチは、リン酸化されていない（不活性）、またはリン酸化されている（活性）かいずれかをリン酸化状態を評価することに基づく。リン酸化されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、よりゆっくりした移動度を持つので、ウエスタンブロッティングを用いて未刺激タンパク質と比較できる。あるいは、リン酸化タンパク質に特異的な抗体が入手可能であり（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、リン酸化されたキナーゼの増加を検出するために使用できる。他の方法では、細胞を試験化合物で刺激し、次いでＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、電気泳動によってニトロセルロース、またはＩｍｍｂｉｌｏｎにタンパク質を転写する。標準的なウエスタンブロッティング技術によって免疫活性バンドを検出する。可視または化学蛍光シグナルをフィルム上に記録し、濃度計によって定量してよい。
【０２０８】
他のアプローチは、リン酸化アッセイを介したＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細胞を試験化合物で刺激し、可溶性抽出物を調製する。ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生成系、およびインスリンまたはＰＨＡＳ−Ｉによって調節される熱および酸に安定なリン酸化タンパク質などのＭＡＰキナーゼに特異的な基質と共に、抽出物を３０℃で１０分間インキュベートする。
【０２０９】
Ｈ３ＰＯ４の添加によって反応を停止し、試料を氷に移した。一部分をＷｈａｔｍａｎ ＰＢ１ クロマトグラフィー紙（リン酸化タンパク質を保持する）上にスポットした。クロマトグラフィー紙を洗浄し、液体シンチレーション計数管で３２Ｐを計数する。あるいは、細胞抽出物をガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生成系、ストレプトアビジンによってフィルター支持体に結合させたビオチン化ミエリン塩基性タンパク質と共にインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は活性化したＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応を３０℃で１０分間実施する。次いでミエリン塩基性タンパク質を保持するフィルターを通して抽出物を吸引した。フィルターを洗浄し、液体シンチレーション計数管にて３２Ｐを計数する。
【０２１０】
細胞増殖アッセイ
前記受容体の受容体活性化は、分裂促進または増殖応答を引き起こす可能性がある。これは、３Ｈ−チミジン取り込みを介してモニタできる。培養した細胞を３Ｈ−チミジンと共にインキュベートすると、チミジンは核内に移動し、そこでチミジン三リン酸にリン酸化される。次いでヌクレオチド三リン酸は、細胞増殖の速度に比例した速度で細胞のＤＮＡに取り込まれる。一般的に、細胞は１〜３日間、培養液中で増殖させる。２４時間血清を取り除くことによって細胞を静止させる。次いで分裂促進剤を培地に加える。２４時間後、１〜１０μＣｉ／ｍｌの範囲の特異的活性の３Ｈ−チミジンとともに、細胞を２〜６時間インキュベートする。回収手順は、トリプシン処理、およびＴＣＡと前インキュベーションして、またはせずにＧＦ／Ｃフィルターで濾過することによって細胞をトラップして、可溶性チミジンを抽出することを含んでもよい。フィルターをシンチラントで処理し、液体シンチレーション計数管によって３Ｈに関して計数する。あるいは、接着細胞をＭｅＯＨまたはＴＣＡで固定てし、水で洗浄し、０．０５％デオキシクロレート／０．１Ｎ ＮａＯＨで可溶化する。可溶性抽出物をシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーション計数管にて３Ｈに関して計数する。
【０２１１】
あるいは、受容体をトランスフェクトするのに使用した細胞株に発現された内因性または外因性遺伝子産物の発現を測定することによって、細胞増殖をアッセイすることができる。この測定は、蛍光強度、酵素的活性、免疫応答性、ＤＮＡハイブリット形成、ポリメラーゼ連鎖反応など方法によって検出できるが、限定されない。
【０２１２】
乱交雑二次メッセンジャーアッセイ
前記細胞の任意の与えられた受容体における多くの異なったシグナル伝達のいずれを通常使用するかを、推測的に、およびＧＰＣＲ配列に基づいただけで予測することは不可能である。しかしながら、乱交雑なＧαサブユニットを使用することにより、事前に選択された経路を介して、機能的分類の異なった受容体にシグナルを誘導することは可能である。たとえば、Ｇα１５またはＧα１６のような乱交雑Ｇｉサブユニット、またはＧαｑｚのようなキメラＧαサブユニット、ＧＰＣＲ（これらは特異的なシグナル伝達（たとえばＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ０など）を介して結合することが通常好まれるであろう）は、これらを内因性に供給する細胞に基づいた受容体アッセイ系を提供することによって、乱交雑なＧαサブユニットによって限定された経路を介して結合して、アゴニスト活性化において、そのサブユニットの経路に付随する二次メッセンジャーを産出するることが可能である。Ｇα１５、Ｇα１６および／またはＧαｑｚの場合、Ｇｑ経路の活性化および二次メッセンジャーＩＰ３の産出は、これを含むかもしれない。同様の戦略および材料を使用することにより、たとえばＣａ＋＋、ｃＡＭＰおよびＫ＋電流などの他の二次メッセンジャーを産出している経路を介した受容体シグナル伝達に偏らせることが可能である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９９）。
【０２１３】
外因的に供給したＧαサブユニットと受容体の乱交雑な相互作用は、可能性のあるそれぞれのシグナル伝達経路に対して異なるアッセイを実施する必要性を減らし、受容体活性化における機能的なシグナルを検出する機会を増加させる。
【０２１４】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞の電流を記録するための方法
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）より卵母細胞を回収し、すでに記述したようにｍＲＮＡ転写物を注入する（Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｌｅｓｔｅｒ，１９９４、Ｓｍｉｔｈら、１９９７）。本発明の試験受容体およびＧαサブユニットＲＮＡ転写物は、遺伝子の完全コード領域を含む直線化したプラスミド、またはＰＣＲ産物からＴ７ポリメラーゼ（「メッセージ マシーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｃｈｉｎｅ）」 Ａｍｂｉｏｎ）を用いて合成する。卵母細胞に１０ｎｇの合成受容体ＲＮＡを注入し、１７℃にて３〜８日間インキュベートする。結合してＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流を観察するために、記録する３〜８時間前に卵母細胞に５００ｐｇの乱交雑なＧαサブユニットｍＲＮＡを注入する。１〜２ＭＯｈｍの抵抗を持つ３Ｍ ＫＣｌ充填ガラスマイクロ電極を使用して、二電極電流クランプ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）が実施される。他に特定しない限り、卵母細胞は−８０ｍＶの保持電位で電圧固定する。記録の間、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５（ＮＤ９６）を含む連続的に流れる（１〜３ｍｌ／分）培地中に卵母細胞を浸す。薬物を、卵母細胞から０．５ｍｍの距離に固定された１０μｌのガラスキャピラリーチューブによる局所散布によって、または連続した重力供給散布ラインからスイッチングすることによって、いずれかによって供給される。
【０２１５】
受容体ｍＲＮＡと、Ｇ−タンパク質で活性化される内向整流チャネル（ＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ４、米国特許第５，７３４，０２１号および第５，７２８，５３５号、またはＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ２）の遺伝子をコードする合成ｍＲＮＡとの混合物、または任意の他の好ましい組合せ（たとえばＩｎａｎｏｂｅら、１９９９を参照のこと）を他の卵母細胞に注入してもよい。Ｇ−タンパク質内向整流Ｋ＋（ＧＩＲＫ）チャネル１、２および４（ＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ２およびＧＩＲＫ４）をコードする遺伝子は、適切な５’および３’プライマーを駆使するために、公表されている配列を用いたＰＣＲによって得てもよい（Ｋｕｂｏら、１９９３、Ｄａｓｃａｌら、１９９３、Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら、１９９５および１９９５ｂ）。ヒト心臓または脳ｃＤＮＡを、適切なプライマーと共にテンプレートとして使用してよい。
【０２１６】
アフリカツメガエル卵母細胞においてＧＰＣＲｓを外因性に発現することは、アゴニスト刺激によって活性化されるシグナル伝達系路を同定するために広く使用されてきた（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、１９８３、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８７）。ＳＮＯＲＦ２５受容体に対するｍＲＮＡが先に注入された卵母細胞に、ＮＤ９６溶液中の試験化合物を添加して、約−８０ｍＶの保持電位における内向電流を観察することによって、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路の活性化をアッセイする。−２５ｍＶで逆転し、Ｃａ＋＋で活性化されたＣｌ−チャネルに他の特性を示す電流が出現することにより、ＰＬＣの受容体活性化およびＩＰ３および細胞内Ｃａ＋＋の放出が示される。このような活性化は、ＧｑまたはＧ１１と結合するＧＰＣＲｓによって示される。
【０２１７】
ＧＰＣＲ刺激によるＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流に、Ｇ−タンパク質のＧｉ／０クラスが関与することを、Ｇｉ／ｏ Ｇ−タンパク質を不活性化する毒素であるＰＴＸを使用して評価する。卵母細胞に２５ｎｇのＰＴＸ／卵母細胞を注入して、ＳＮＯＲＦ２５受容体によってＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流が調節されることを２〜５時間連続的に評価する。
【０２１８】
細胞内ｃＡＭＰの上昇は、卵母細胞内に嚢胞性線維症膜伝導性レギュレーター（ＣＦＴＲ）（そのＣｌ−選択的な孔が、タンパク質キナーゼＡによるリン酸化に応答して開く（Ｒｉｏｅｄａｎ，１９９３））が発現することよってモニターできる。卵母細胞に発現するＲＮＡ転写物を調製するために、ＣＦＴＲ遺伝子の公表された配列（Ｒｉｏｒｄａｎ，１９９３）に由来する５’および３’プライマーを使用したＰＣＲによりテンプレートを作製した。５’プライマーは、Ｔ７ポリメラーゼをコードする配列を含んでいたため、転写物はクローニングせずにＰＣＲ産物から直接、作製されるであろう。１０〜１５ｎｇのＳＮＯＲＦ２５のｍＲＮＡに加えて１０ｎｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡを卵母細胞に注入した。１８℃にて、２〜３日間のインキュベーションした後に、ＮＤ９６中で電気生理学的記録を行った。１〜２ＭＯｈｍの抵抗を持つ３Ｍ ＫＣｌ充填ガラスマイクロ電極を持つデュアル電極電圧クランプ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）の下で電流を記録する。他に特定しない限り、卵母細胞は−８０ｍＶの保持電位に電圧固定する。記録の間、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５（ＮＤ９６）を含む連続的に流れる（１〜３ｍｌ／分）培地中に卵母細胞を浸す。薬物を、卵母細胞から０．５ｍｍの距離に固定された１０μｌのガラスキャピラリーチューブによる局所散布によって、または連続した重力供給散布ラインからスイッチングすることによって、いずれかによって供給される。
【０２１９】
Ｇタンパク質ＧｉおよびＧｏの活性化は、内向整流Ｋ＋（カリウム）チャネル（ＧＩＲＫｓ）の活性を測定することでモニタできる。活性は、ほ乳類受容体＋ＧＩＲＫサブユニットをコードするｍＲＮＡを共注入した卵母細胞でモニターしてもよい。ＧＩＲＫ遺伝子産物は、共−集合して、ＧｉまたはＧｏと結合する多くのＧＰＣＲによって活性化される（すなわち刺激される）ことが知られている（Ｋｕｂｏら、１９９３、Ｄａｓｃａｌら、１９９３）Ｇタンパク質活性化カリウムチャネルを形成する。ほ乳類受容体＋ＧＩＲＫサブユニットを発現している卵母細胞では、４９ｍＭのＫ＋を含む上昇Ｋ＋溶液中のＫ＋電流を測定することによって、試験化合物に対する応答性をが試験される。
【０２２０】
ヒトおよびラットＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの局在
方法：蛍光遺伝子プローブのリアルタイム検出を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＳＮＯＲＦ２５ラットおよびヒトＲＮＡの局在を特徴づけるために、蛍光遺伝子プローブおよびヒト、ラット組織から抽出したｍＲＮＡのパネルを用いた定量性ＲＴ−ＰＣＲを使用した。
【０２２１】
本アッセイは、従来のＰＣＲ増幅における２種のオリゴヌクレオチド、並びにオリゴヌクレオチドの５’末端がレポーターで、および３’末端がクエンサーで標識された第３の特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する。本発明において、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）およびＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメチオキシフルオレセイン）が利用した二種のレポーターであり、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−４，７，２，７’−テトラメチルローダミン）がクエンサーである。増幅が進行することにより、標識したオリゴヌクレオチドプローブが、増幅に使用した２種のオリゴヌクレオチド間の遺伝子配列とハイブリダイゼーションする。標識化プローブを開裂させるために、Ｔａｑ、またはｒＴｔｈ温度安定ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用する。これは、レポーターからクエンサーを引き離し、生成したアンプリコンの量に直接的に比例する蛍光シグナルを生成する。この標識化プローブは、高い程度で特異性を付与する。標識化プローブがハイブリダイズしないので、非特異的増幅は検出されない。すべての実験を、ＰＥ７７００ シークエンス検出系（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実施した。
【０２２２】
定量性ＲＴ−ＰＣＲ
ＳＮＯＲＦ２５をコードするＲＮＡを検出するために、組織から抽出したｍＲＮＡで定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｒＴｔｈ温度安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、５０μｌ容量で逆転写およびＰＣＲ反応を実施した。以下の配列を持つプライマーを使用した：
ＳＮＯＲ２５ ヒト
フォワードプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−７６５Ｆ
５’−ＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧ−３’（配列番号：１８）
リバースプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−８６８Ｒ
５’−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号：１９）
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ：
ＳＮＯＲＦ２５−８１４Ｔ
５’（６−ＦＡＭ）−ＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号：２０）
ＳＮＯＲＦ２５ ラット
フォワードプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−２３１Ｆ
５’−ＧＴＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＡ−−３’（配列番号：２１）
リバースプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−３２９Ｒ
５’−ＧＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：２２）
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ：
ＳＮＯＲＦ２５−２７８Ｔ
５’（６−ＦＡＭ）−ＴＣＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号：２３）
これらのプライマー対を使用し、アンプリコンの長さは、ヒトＳＮＯＲＦ２５では１０４ｂｐ、ラットＳＮＯＲＦ２５では９９ｂｐである。それぞれのＲＴ−ＰＣＲ反応には５０ｎｇのｍＲＮＡが含んだ。オリゴヌクレオチド濃度は：フォワードおよびリバースプライマーが５００ｎＭ、蛍光プローブが２００ｎＭであった。各反応液中の試薬の濃度は、３００μＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、６００μＭ ＵＴＰ、３．０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２、５０ｍＭ ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、１１５ｍＭ 酢酸カリウム、８％ユニット ウラシルＮ−グリコシラーゼであった。ＲＴ−ＰＣＲ反応のための緩衝液も、受動参照として使用した蛍石を含んだ（ＲＯＸ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ特許登録受動参照Ｉ）。（ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを除く）ＲＴ−ＰＣＲに関するすべての試薬はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より得た。反応は、以下の温度循環器特性を用いて実施した。５０℃で２分間、６０℃で３０秒間、９５℃で５分間、続いて９４℃で２０秒間、６２℃で１分間を４０サイクル。
【０２２３】
ＰＣＲ反応に対するポジティブコントロールは、プラスミド構築物に由来する標的配列の増幅からなった。定量のための標準曲線は、プラスミドベクター内のヒトＳＮＯＲＦ２５遺伝子、または膵臓から抽出したＲＮＡを増幅のためのテンプレートとして使用いて構築した。ネガティブコントロールはｍＲＮＡブランク、並びにプライマーとｍＲＮＡブランクからなった。ｍＲＮＡがゲノムＤＮＡに混入していないことを確認するために、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転をせずに、ＲＣＲ反応を行った。ＲＮＡの完全性を、シクロフィリンまたはグリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡを増幅することによって査定した。逆転写およびＰＣＲ増幅に続いて、データをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ配列検出ソフトウェアを用いて解析した。それぞれのウェルからの蛍光シグナルを、内部受動参照を用いて正規化し、データを標準曲線に当てはめ、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡ発現の相対的量を得た。
【０２２４】
結果と考察
ＳＮＯＲＦ２５の全長配列のクローニング
ＧＨ１細胞およびＲｉｎ１４ｂ細胞を含む様々な組織から調整したゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを、ガラ二ン、ソマトスタチン、およびオピオイド受容体ファミリーのメンバーの第三膜貫通領域、およびガラニン受容体ファミリーのメンバーの第七膜貫通領域に基づいて設計した２つの縮重プライマーを用いたＭＯＰＡＫ ＰＣＲにかけた。この反応による３つの産物は、いずれの向きでも（前方向または逆方向）同一のクローンであった。このクローンは、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓ、ＧＳＳ、ＥＳＴ、またはＳＴＳデータベースでは見いだせない新規配列であることが分かった。それは他の既知Ｇタンパク質結合受容体と有意な相同性を含んでいた（既知受容体領域Ｄ１、ベータ−アドレナリン作用性２ｂおよび５−ＨＴ１Ｆと−２９％の同一性、５−ＨＴ受容体と３４％の同一性）。この受容体配列は後にＳＮＯＲＦ２５と命名され、上記の方法の節に記載のように５’および３’のｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）のプライマーを設計するために用いた。５’ＲＡＣＥ反応は、第一膜貫通領域、およびコザックコンセンサス配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）に囲まれた推定インフレームの開始メチオニンをコードする配列を通して配列情報を与えた。
【０２２５】
３’ＲＡＣＥ反応では、アガロースゲル電気泳動によって、６００ｂｐのバンドを得た。このバンドをＴＡクローニングキット内にサブクローニングし、単離したコロニーの配列を決定した。これらの産物の配列は、第七膜貫通領域をコードする領域の下流にインフレームの終止コドンが存在することを明らかにした。ＳＮＯＲＦ２５のコード配列全体の大きさは、１００５ｂｐであり、３３５のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると決定された。２つのプライマー、ＪＡＢ８６とＪＡＢ８４は、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ ＰＣＲ系を用いて、Ｒｉｎ１４ｂ細胞系ｃＤＮＡおよびラットゲノムＤＮＡ由来のコード配列全体を増幅するために使用した。この反応のためのプライマーは、５’および３’プライマーそれぞれの５’末端に組み込まれたＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を持つＳＮＯＲＦ２５の５’および３’非翻訳領域に特異的であった。これらの反応産物をｐｃＤＮＡ３．１（−）にサブクローン化し、配列を決定したところ、Ｒｉｎ１４ｂクローンおよびゲノムクローンの配列が同一であることが分かり、ラットＳＮＯＲＦ２５を含むベクター構築物をｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５と命名した。
【０２２６】
全長クローンのアミノ酸配列の疎水性（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）分析では、７つの疎水性領域が存在することを示し、それはＧタンパク質結合受容体の７つの膜貫通領域と一致する。予想される７つの膜貫通領域を図４に示す。ラットＳＮＯＲＦ２５ヌクレオチドおよびペプチド配列とＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓデータベースに含まれる配列との比較により、この受容体のアミノ酸配列がヒスタミン、アデノシン、セロトニン、ベータアドレナリン作用性、およびドーパミン受容体ファミリーに最も関連性があることを示し、これらの受容体は全体にわたり２５−３０％一致性の示しす。Ｎ−およびＣ−末端は比較的短く、アデノシン受容体ファミリーにより似ている。しかしながら、膜貫通領域の解析では、この受容体が、他のＧＰＣＲの膜貫通領域内と有意な程度の同一性を共有することを示す。ＳＮＯＲＦ２５の全ての膜貫通領域と、ＧＰＣＲ膜貫通領域の総合的なリストとの同時比較では、ＳＮＯＲＦ２５の膜貫通領域が、ベータアドレナリン作用性受容体１および２とそれぞれ３１％および３２％、並びに５−ＨＴおよび５−ＨＴ５８受容体とそれぞれ３２％および３６．６％の最も高い程度で同一性を持つことを示唆しうる。膜貫通領域をＦＡＳＴＡ検索により個々に分析すると、ＳＮＯＲＦ２５は、様々な既知Ｇタンパク質結合受容体とかなりの類似性を示す。
【０２２７】
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体をクローン化するために、ラットＳＮＯＲＦ２５の第二および第五膜貫通領域に基づいて設計した標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒトゲノムコスミドライブラリーをストリンジェントな培地でスクリーニングした。およそ２２５，０００のスクリーニングされたコロニーの中から、２つのコロニーをプローブとハイブリダイゼーションさせた。それぞれのコロニーを単離、解析後、これらの２つのコロニーがＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体を含む同一のコスミドであると決定した。このコスミドのいくつかの制限切断物によるサザンブロット解析、およびその後の陽性バンドのシーケンスにより、このコスミドのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断物が、このヒトクローンの全長コード配列を含む１．９ｋｂの断片として得られたことが示された。ｐＥＸＪＴ３Ｔ７ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローン化したヒト受容体の構築物は、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５と命名した。ヒトＳＮＯＲＦ２５は、ラットＳＮＯＲＦ２５に対して８０％のＤＮＡ一致性および８３％のアミノ酸一致性を示した。ラット受容体と同様に、ヒトＳＮＯＲＦ２５のタンパク質コード領域は、１００５ヌクレオチド（図１Ａ〜１Ｂ）であり、３３５のアミノ酸からなるタンパク質をコードする（図２Ａ〜２Ｂ）。ラットＳＮＯＲＦ２５のＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれぞれ図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂに示す。
【０２２８】
ＧｅｎＥＭＢＬ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓ、ＥＳＴ，ＳＴＳ、およびＧＳＳデータベースの検索により、ヒトＳＮＯＲＦ２５もまた固有の新規配列であることが確かめられた。ラットＳＮＯＲＦ２５との一致性の他に、アデノシン２ａ、５−ＨＴ４Ｌ、５−ＨＴ４Ｓ、５−ＨＴ６、および５−ＨＴ７、ドーパミンＤ１およびＤ３、そしてソマトスタチン５受容体と全体で２８〜３０％の一致性を共有する。また、アデノシンＡ１、ヒスタミンＨ１および２、ベータアドレナリン作用性１、およびソマトスタチン２および３受容体と２５−２６％の一致性を持つ。ヒトＳＮＯＲＦ２５の全ての膜貫通領域と、ＧＰＣＲ膜貫通領域の総合的なリストを同時に比較することにより、ヒトＳＮＯＲＦ２５の膜貫通領域がベータ１および２アドレナリン作用性受容体（それぞれ２９％および３２％）および５−ＨＴ４に対して最も高い程度の一致性を持つことが示唆されうる。ヒトＳＮＯＲＦ２５の個々の膜貫通領域は、他のいくつかのＧタンパク質結合受容体に由来する膜貫通領域と有意な一致性を持つ。
【０２２９】
ラットおよびヒト両方のＳＮＯＲＦ２５は、それらのアミノ酸配列中にいくつかの潜在的タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化モチーフを持つ。どちらの受容体においても、スレオニン７３、セリン７９、およびセリン３０９が潜在的ＰＫＣリン酸化部位である。ヒト受容体は、セリン２１４にさらなる推定ＰＫＣリン酸化部位を持つ（それはラットＳＮＯＲＦ２５ではプロリンである）。両方の受容体が、セリン３２９に潜在的カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）リン酸化部位を共有する。またヒトＳＮＯＲＦ２５は、さらに２つの潜在的ＣＫＩＩリン酸化部位、スレオニン２１７およびセリン３３１を持ち、それらはラット受容体には存在しない。逆に、ラットＳＮＯＲＦ２５はチロシン３２３に潜在的チロシンリン酸化部位を持ち、それはヒト受容体には存在しない。
【０２３０】
ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞のｃＡＭＰ応答
エレクトロポレーションを用いて、ＣＨＯ細胞内にＳＮＯＲＦ２５ ｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ）をトランスフェクトした。プレーティングした後、これらのリガンドの受容体とＳＮＯＲＦ２５の相同性（上記参照）に基づいて、その他の物質中にヒスタミン、アデノシン、セロトニン、ノルエピネフリン、およびドーパミンなどの在来の神経伝達物質のいくつかを含むリガンドライブラリーで前記トランスフェクタントを感作し、上記のモックがトランスフェクトされた細胞がｃＡＭＰまたはＩＰ放出を刺激する能力を試験した。興味深いことに、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞の基礎ｃＡＭＰレベルは、モックがトランスフェクトされた細胞よりも有意に高かった（＞１０倍）（図５）。この観察結果は、ＳＮＯＲＦ２５受容体が機能的にｃＡＭＰ刺激経路に結合しうることを示唆する。試験したリガンドの中で、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）だけが、モックがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中においてこれらの要素に影響を与えずに、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞のｃＡＭＰを有意に増加させたが、ＩＰ放出は増加させなかった。ＡＴＲＡ濃度１０μＭで起こった応答（上記基礎の２〜５倍）は、アデニルシクラーゼの強力な直接的刺激物質であるホルスコリンによって産生されるものに匹敵する（図６）（ｎ＝３）。
【０２３１】
モックおよびＳＮＯＲＦ２５がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞におけるホルスコリンに対する応答は、ほとんど同一であることから（図６）、ＳＮＯＲＦ２５を発現する細胞において観察されたＡＴＲＡに対する増強された最大応答（モックＤＮＡトランスフェクト細胞に比べて）が、細胞密度または細胞固有の性質が変化したためではないことが示唆される。ＡＴＲＡに近い類似体である全トランスレチノール（ビタミンＡ１）は、１０μＭでｃＡＭＰを増加させなかった（図６）。
【０２３２】
続く実験では、Ｃｏｓ−７細胞においても観察されたので、ＡＴＲＡで誘導されるｃＡＭＰ形成の増加が、宿主細胞に依存しないことを実証された（ｎ＝３）（図７）。全トランスレチノイン酸が、ドーパミンＤ１、Ｄ５、セロトニン５−ＨＴ４および５−ＨＴ６受容体を含むほかの既知シクラーゼ刺激性受容体がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞において、何の応答も起こさなかったことから、ＡＴＲＡで観察された応答が、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞に特有であることを示している(図７)。
【０２３３】
Ｃｏｓ−７細胞におけるＡＴＲＡに対するｃＡＭＰ応答は、ＥＣ５０値がおよそ０．２〜１μＭであり、およびＥｍａｘがおよそ２００〜３００％であり濃度依存的である（図８）。
【０２３４】
ＳＮＯＲＦ２５を発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵細胞におけるカルシウムで活性化されるＣＩ−流動の活性化
細胞内ｃＡＭＰの増加は、嚢胞性繊維症膜貫通伝導性レギュレーター（ＣＦＴＲ）（タンパク質キナーゼＡによるリン酸化に応答して、そのＣＩ−選択的な孔が開く）の発現により卵細胞中で観測することができる（Ｒｉｏｒｄａｎ，１９９３）。従って、ＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡ、およびＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを共に注入した卵細胞において、ＳＮＯＲＦ２５の活性を試験した。これらの卵母細胞３９個のうち１７個において、１０μＭの全トランスレチノイン酸の投与に応答して、内部ＣＩ−の流動（１０５±２０ｎＡ）が測定された（図９Ａ〜９Ｃおよび１０を参照のこと）。
【０２３５】
ＣＦＴＲチャンネルをコードするｍＲＮＡのみを注入した他の卵細胞では、そのような流動が観察されなかったので、この応答はＳＮＯＲＦ２５の発現に特異的であった。β２−アドレナリン作用性受容体（Ｂ２ＡＲ）を注入した卵細胞において、同様の流動が観察されたが（図９Ｃ参照）、ＳＮＯＲＦ２５発現卵細胞により生じる流動は大体２〜３倍遅く、少なかった。全トランスレチノイン酸は、ＣＦＴＲ欠損卵細胞におけるＣｌ−流動を刺激しないことから、Ｇｑ−を介したホスホリパーゼＣ経路が活性化されなかったことを示している。ＧＰＣＲ結合ＧｉおよびＧｏをホスホリパーゼＣ経路に結合させることができるキメラＧタンパク質を発現する卵細胞においても、応答は引き起こされなかった。総合すると、これらの観察結果は、ＳＮＯＲＦ２５が全トランスレチノイン酸に結合し、（おそらくＧｓの活性化を経由して）ｃＡＭＰの産生を刺激するＧＰＣＲをコードするという仮説が支持される。
【０２３６】
他の系において、全トランスレチノイン酸は、いくつかの核受容体の１つを刺激する（背景を参照のこと）。これにより１以上の遺伝子の転写が増強される。卵母細胞におけるＳＮＯＲＦ２５の発現は、通常の非注入卵細胞には存在しない、全トランスレチノイン酸の核受容体（刺激された時に、ｃＡＭＰの増大を生じる）を発現させる。この場合、レチノイン酸は必ずしもＳＮＯＲＦ２５受容体に結合しないが、レチノイン酸の既知または新規核受容体に作用するであろう。このようなレチノイン酸が間接的に作用する機構は、なぜリガンドが卵細胞の６群のうち３群でＣＦＴＲ応答を誘発しなかったか（３９の卵細胞中１７）、またなぜＢ２アドレナリン作用性受容体などのよく特徴づけられたＧＰＣＲの活性化によって、応答が引き起こされた条件下で観察されるものよりもＣＦＴＲの活性化速度が２〜３倍遅かったかを説明しうる（図９Ｃ）。それにもかかわらず、レチノイン酸によるＣＦＴＲの活性化の遅延は約１０秒でのオーダーであり、核受容体の活性化は、一般的に数分から数時間の範囲である。したがって、我々は、レチノイン酸活性化の間接的機構を除外できないが、ＳＮＯＲＦ２５を発現する卵細胞の応答における相対的に急速な開始が、そのような機構があり得ないことを示唆している。
【０２３７】
ヒトＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの検出
多数の組織（表１に一覧してある）からｍＲＮＡを単離し、記載したように分析した。
【０２３８】
蛍光遺伝子プローブを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、アッセイしたほとんどの組織で、ヒトＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡが発現していることが実証された（表１）。ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの最高レベルは、膵臓、胃、小腸および胎児の肝臓で見られ、他の場所ではそれよりも低いレベルであった。ほとんどの神経系の構成体では末梢の器官に比べＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの発現が少なかった。
【０２３９】
ＳＮＯＲＦ２５発現の最高レベルは膵臓で見られた。膵臓は、様々な普遍的活性物質（インスリンなど）を分泌しており、このことはＳＮＯＲＦ２５が、内分泌機構を経由しうる多様な代謝機能の調節に役割を果たしている可能性を示唆している。ＳＮＯＲＦ２５は、ラットインスリノーマ細胞株においても発現していることから、膵臓においてＳＮＯＲＦ２５が発現していることに不思議はない。この発見は、肝臓におけるＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの検出、並びにグルコースレベルの調節および糖尿病において役割をはたす可能性を示す。
【０２４０】
ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが高レベルである他の組織は、胃と小腸である。これらの組織構造に分布することは、胃腸内の運動性または吸収に関する機能と一致する。現時点では、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが平滑筋に局在するのか、または粘膜／粘膜下層に局在するのかは分からない。
【０２４１】
非常に低いレベルで検出されたが、視床および海馬構造（ＣＮＳの中で最もレベルが高い部位）を含むＣＮＳの多様な領域、およびその他の機能的で多様な領域に、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが存在することにより、この受容体の広い調節機能、または局所的機能性が示される。
【０２４２】
ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、発生時に調節されていると思われる。胎児の肝臓におけるｍＲＮＡのレベルは、成人膵臓の測定値とほぼ等しい（８３％）。しかしながら、成人の組織では、膵臓で見られた量の１％以下に低下している。発生を通じて、ＳＮＯＲＦ２５ｍＲＮＡの甚大な変化は、肝臓の成熟における役割、または発生中のグルコース要求量／レベルを調節する役割があることを意味している。この増加に対する時間経過は調査されておらず、この受容体の機能を理解することが重要だと思われる。
【０２４３】
要約すると、ＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡの分布は、中枢神経系はもちろん、多様な器官系、内分泌機構を含む広範な調節機能に関係する。
【０２４４】
ラットＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの検出
ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの限定された分布と違って、ラットにおけるＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、広く分布している。ラットとヒトの分布における一つの著しい違いは、ラット中枢神経系で検出される高レベルのＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡである。ヒトでは、最高濃度のＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、膵臓でみられ、ＣＮＳ構造では、非常に低いレベルであった。ラットでは、最高レベルのＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが海馬構造でみられ、次いで大脳皮質、小脳、視床下部、脈絡脈叢および骨髄において、高レベルに検出された。ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡはまた、背根および三叉神経節においても検出された。ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、ラット膵臓、およびその他の末梢器官において検出されたが、ＣＮＳにおけるレベルよりもはるかに低いレベルで存在する。
【０２４５】
ラットＳＮＯＲＦ２５は、アッセイしたほとんどの組織で検出された。膵臓に加え、肺、結腸、十二指腸、卵巣、腎臓および副腎においてもかなりの量で発現した。表２に示すように、その他の組織でも少ない量で検出された。
【０２４６】
要約すると、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡの広い分布は、中枢神経系はもちろん、多様な器官系、内分泌機構を含む広い調節機構を意味している。ヒトとラットで見られる分布パターンの違いは、ラットではこの受容体がヒトと比較して異なった役割を持つ可能性を示唆している。
【表１】
【表２】
【参照文献】
【０２４７】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[発明の背景]
本出願は、１９９９年２月２２日に提出された米国特許明細書番号第０９／２５５，３７６号の部分継続である、１９９９年８月１３日に提出された、米国特許明細書番号第０９／３８７，６９９号の優先権を主張し、それらの内容は本出願内に参照文献に援用される。
【０００２】
本出願を通して、さまざまな刊行物が、括弧内の部分的引用によって参照されている。これらの刊行物に関する全引用は、明細書の最後に見ることができるであろう。これらの刊行物の開示は、その全文を、さらに本発明に関連する技術分野の状態を完全に記述するために、本出願の参照文献に援用される。
【０００３】
神経調整物質には、神経系において伝達をｓｕｂｖｅｒｓｅまたは調節する天然産物の種々の群が含まれる。これらは、神経ペプチド、アミノ酸、生物起源アミノ酸、脂質、および脂質代謝物、ならびに他の代謝副産物を含むが、限定されない。これらの神経調整物質の多くは、細胞の内部から外部にシグナルを伝達する特定の細胞表面受容体と相互作用する。Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）は、多くの神経伝達物質が相互作用してそれらの効果を媒介する細胞表面受容体の主要な種類を表している。ＧＰＣＲｓは、７回膜貫通領域によって特徴付けられ、アデニルシクラーゼの刺激のような細胞内の生化学的続発症をもつＧ−タンパク質結合受容体を介してそのエフェクターと結合する。
【０００４】
ビタミンＡ１（全−トランス−レチノール）はアルコールデヒドロゲナーゼによってビタミンＡ１アルデヒド（全−トランス−レチナール）に酸化される。全−トランス−レチナールは、網膜細胞内でのロドプシンの合成に重要であり、そこで視覚系における鍵となる役割を果たす。全−トランス−レチナールはまた、他の細胞タイプにおいては、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼによって全−トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）に変換されうる（Ｂｏｗｍａｎ，Ｗ．Ｃ．およびＲａｎｄ、Ｍ．Ｊ．，１９８０）。
【０００５】
歴史的に、ＡＴＲＡおよびビタミンＡの他の活性代謝物である９−シス−レチノイン酸（９ＣＲＡ）は、核レチノイン酸受容体（ＲＡＲα、β、γ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲα、β、γ）の活性を介してのみその細胞の効果を仲介すると考えられた（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９４）。これらの受容体は、リガンド依存的転写因子のスーパーファミリーのメンバーであり、このスーパーファミリーには、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、およびペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）を含む。これらは、リガンドがない状態ではＤＮＡ応答エレメントに結合するヘテロダイマーおよびホモダイマーを形成する。リガンド結合に対する応答において、前記ダイマーは、細胞タイプ特異的な遺伝子の組のトランスアクチベーションおよび転写の調節を引き起こすコンホメーションを変化する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９４、Ｈｏｆｍａｎ，Ｃ．およびＥｉｃｈｅｌｅ，Ｇ．，１９９４、およびＧｕｄａｓ，Ｌ．Ｊ．ら、１９９４）。
【０００６】
レチノイン酸は、幅広い生物学的効果を生じるので、さまざまな生理学的および病態生理学的工程において重要な役割を果たすことが提案されることは驚くことではない。レチノイド類は、さまざまな組織において細胞増殖、分化、再生産、代謝および造血を含む重大な生理学的事象を調節する。細胞レベルでは、レチノイド類は、細胞増殖を阻害し、分化を誘導し、アポトーシスを誘導することができる（Ｂｒｅｉｔｍａｎ，Ｔ．ら、１９８０、Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，１９８４、およびＭａｒｔｉｎ，Ｓ．ら、１９９０）。レチノイド処置によるこれらの多様な効果によって、癌の化学療法および癌の化学的予防に関してレチノイド類を評価する一連の調査が促進された。臨床的には、レチノイド類は、急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）、皮膚Ｔ細胞悪性腫瘍、皮膚化学腫瘍、皮膚および頸の扁平上皮癌および神経芽細胞種を含む広範囲の悪性疾患の処置に使用される（総論としてＲｅｄｆｅｒｎ，Ｃ．Ｐ．ら、１９９５）。レチノイド類はまた、その癌化を抑制し、浸潤性癌の発達を防止する能力を調査されてきた。１３−シスレチノイン酸は、口消化管の最も普通の前癌状態領域である口内白斑症を逆向させ、また前立腺癌の化学予防で使用される（総論としてＳａｂｉｃｈｉ，Ａ．Ｌ．ら、１９９８）。また、頭頸癌での手術および放射線投射後のアジュバント治療として、１３−シスレチノイン酸の処置は、二次原発性癌の発生に対して有意に遅延を引き起こす（総論として、Ｇｏｔｔａｒｄｉｓ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９６）。
【０００７】
興味深いことに、レチノイド類は、膵臓機能に対する効果も持つ。レチノイン酸（またはレチノール）が、単離した島(isolated ilets)（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８７）およびＲＩＮｍ５Ｆラットインスリノーマ細胞（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８９）からのインスリン分泌に必要であることが示唆されてきた。レチノイン酸はまた、細胞−細胞の接着および凝集に対して効果を持つ可能性がある（Ｃｈｅｒｔｏｗ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８３）。さらに、（ＡＴＲＡではなくて）９ＣＲＡの単一胃内投与が膵臓腺房細胞および腎臓の近位尿細管上皮細胞におけるＤＮＡ合成の波を誘導した（Ｏｈｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９９７）。したがって、レチノイン酸は、正常の膵臓機能、およびおそらくは糖尿病の発達において役割を果たす可能性がある。また、レチノイド類が膵臓悪性腫瘍の治療において有用である可能性があるといういくつかの証拠が存在する（Ｅｌ−Ｍｅｔｗａｌｌｙ，Ｔ．Ｈ．ら、１９９９、Ｒｏｓｅｎｗｉｃｚ，Ｓ．ら、１９９７、およびＲｏｓｅｎｗｉｃｚ，Ｓ．ら、１９９５）。
【０００８】
レチノイド類は、上皮細胞増殖および分化、さらに脂腺活性に影響を与えること、および免疫調節および坑炎症性質を表すことが示されてきた。したがって、レチノイド類は、乾癬および他の角質増殖性および錯角化皮膚疾患、角質化遺伝性皮膚症、重症挫瘡および挫瘡関連皮膚病を含むさまざまな皮膚疾患の治療、およびまた皮膚癌、他の腫瘍の治療および／または化学的予防にだんだんと使用されてきた（総論として、Ｏｒｆａｎｏｓ，Ｃ．Ｅ．ら、１９９７）。
【０００９】
レチノイド類はまた、肺発達に関連する。肺胞樹の発達を導く胎児肺分枝は、レチノイン酸によって加速される。現在、未成熟の肺を持つ早産幼児はビタミンＡにて処置されているが、しかし他の適応は、さらなる調査が必要である可能性がある（Ｃｈｙｔｉｌ，Ｆ．，１９９６）。
【００１０】
最後に、レチノイド類が精神分裂病（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａ．Ｂ．１９９８）およびアルツハイマー病（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｉｄｅｌｌ，Ｎ．，１９９７）で役割を果たしている可能性があることを示唆するいくつかの証拠がある。
【００１１】
レチノイドを介した効果の詳細にわたるリストは、レチノイン酸受容体（非核）がいくつかの疾患に対する治療的処置の標的として魅力的であり、さまざまな疾患に対して、より高い特異性およびより少ない副作用を持つ薬剤の開発に有用である可能性があることが示唆される。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体をコードする単離された核酸を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、精製されたほ乳動物ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質を提供する。
【００１４】
本発明はまた、本発明にしたがって核酸を含むベクターを提供する。
【００１５】
本発明はまたさらに、本発明にしたがってベクターを含む細胞を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明に従って細胞から単離した膜プレパレーションを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００１９】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＲＮＡの翻訳を防止するために、そのようなＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするゲノムDNAの転写を阻害するために、このようなゲノムDNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は、本発明にしたがった核酸によってコードされたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合可能な抗体も提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に対する本発明にしたがった抗体の結合を競合的に阻害可能な薬剤を提供する。
【００２３】
本発明はまたさらに、（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、本発明によるオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な本発明にしたがったの抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、本発明にしたがったほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現しているトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。
【００２６】
本発明はまたさらに、天然のほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、本発明にしたがったほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類。を提供する。
【００２８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、本発明の方法の１つによって同定された化合物を提供する。
【００３３】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを本発明にしたがった核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と本発明にしたがった抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法を提供する。
【００３７】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、前述の方法によって同定されたアンタゴニストを提供する。
【００４１】
本発明はさらに、本発明にしたがったアンタゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【００４２】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明にしたがった医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、本発明にしたがったトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。
【００４４】
本発明はさらに、前述の方法によって同定されたアゴニストを提供する。
【００４５】
本発明はまたさらに、本発明にしたがったアゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 本発明にしたがったほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法を提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【００５１】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明による方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００５２】
また、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の請求項109に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアをを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法を提供する。
【００５４】
本発明はまたさらに、化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、例えば本発明にしたがった方法によって決定した化合物、および組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を増加させるのに効果的な、本発明の方法などによって決定されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体アゴニスト、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む化合物および組成物を提供する。
【００５６】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を減少させるのに効果的な、本発明の方法などによって決定されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体アンタゴニスト、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００５７】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００５８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を増加するために有効な量の本発明の方法によって同定された化合物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００６０】
本発明はまた、組成物、たとえば医薬組成物であって、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の活性を減少するために有効な量の本発明の方法によって同定された化合物、およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００６１】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、本発明にしたがった方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、組成物、たとえば医薬組成物を調製する方法であって、キャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリア、並びに薬学的に有効な量の本発明にしたがった方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置６１〜６３）および終止コドン（位置１０６６〜１０６８）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図１Ｂ】ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置６１〜６３）および終止コドン（位置１０６６〜１０６８）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図２Ａ】図１Ａで示したヌクレオチド配列（配列番号：１）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図２Ｂ】図１Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：１）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図３Ａ】ラットＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置４９〜５１）および終止コドン（位置１０５４〜１０５６）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図３Ｂ】ラットＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す図。最も短いオープンリーディングフレームを含む予想されるオープンリーディングフレームは開始（ＡＴＧ）コドン（位置４９〜５１）および終止コドン（位置１０５４〜１０５６）の下線によって示される。さらに部分的５’および３’非翻訳配列を示す。
【図４Ａ】図３Ａ〜３Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：３）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図４Ｂ】図３Ａ〜３Ｂで示したヌクレオチド配列（配列番号：３）で示した最も長いオープンリーディングフレームによってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体の予想されるアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図。７つの予想される膜貫通（ＴＭ）領域に下線を引く。
【図５】ＳＮＯＲＦ２５−およびモック−トランスフェクトＣＨＯ細胞の基礎ｃＡＭＰレベルの比較図。ＳＮＯＲＦ２５またはからベクター（モック）ＤＮＡを材料と方法で記述したようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、ｃＡＭＰ放出に関して記述したようにアッセイした。代表的な実験の結果を示す。
【図６】ＳＮＯＲＦ２５発現モックトランスフェクトＣＨＯ細胞でのＡＴＲＡ、ビタミンＡおよびフォルスコリンによるｃＡＭＰ放出の調節を示す図。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、１０μＭ濃度の薬物で感作し、記述したようにｃＡＭＰ放出に関してアッセイした。公知のシクラーゼ刺激受容体を含む代表的な実験の結果を示す。結果は、１点であるビタミンＡを除き、３重測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。結果は５基礎ｃＡＭＰ放出に対して正規化している。
【図７】Ｃｏｓ−７細胞でのＡＴＲＡ ｃＡＭＰ応答の特異性。トランスフェクタントを９６ウェルプレート内にまき、１０μＭ濃度のＡＴＲＡで感作し、記述したようにｃＡＭＰ放出に関してアッセイした図。代表的な実験の結果を示す。結果は、３重測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。
【図８】一過性トランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞でのＡＴＲＡ用量応答曲線を示す図。ＳＮＯＲＦ２５およびモック−トランスフェクト細胞でのｃＡＭＰを増加させるＡＴＲＡの用量応答効果の代表例。
【図９】ＳＮＯＲＦ２５を発現している卵母細胞でのＡＴＲによるＣＦＴＲの刺激を示した図。先にＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡとＣＦＴＲを注入した卵母細胞からの電圧クランプ記録図（図９Ａ）、及び、対照（ＣＦＴＲのみ）卵母細胞（図９Ｂ）からの電圧クランプ記録。エピネフリン（１μＭ）の投与は、Ｂ２アドレナリン作動性受容体（Ｂ２ＡＲ）およびＣＦＴＲ（図９Ｃ）を発現している他の卵母細胞において、同様の電流を引き起こす。保持電位はすべての記録に対して−７０ｍＶであった。
【図１０】対照（ＣＦＴＲのみ）卵母細胞（ｎ＝１６）およびＳＮＯＲＦ２５およびＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを注入した卵母細胞（ｎ＝１７）でのＡＴＲＡ（１０μＭ）で刺激した平均電流振幅を示す図。
【発明の詳細な記述】
【００６６】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ほ乳類受容体をコードする核酸は、
（ａ）ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードし、かつプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸の配列と同一の配列を持つ核酸、または
（ｂ）ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードし、かつプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸の配列と同一の配列を持つ核酸
と高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする組換え核酸を提供する。
【００６７】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体は、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示した最も短いオープンリーディングフレームによってコードされるヒトＳＮＯＲＦ２５受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む組換え核酸を提供する。
【００６８】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸を含む組換え核酸であって、前記ラットＳＮＯＲＦ２５受容体は、図3Ａ〜3Ｂ（配列番号：3）に示した最も短いオープンリーディングフレームによってコードされるラットＳＮＯＲＦ２５受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む組換え核酸を提供する。
【００６９】
プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５、およびプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５は両方とも、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅによるブタベスト条約の条項によりアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に１９９８年１１月２４日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号、および第２０３４９４号が与えられた。
【００７０】
ハイブリダイゼーション法は当業者に周知である。本発明の目的のために、高いストリンジェンシー条件下におけるハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、１×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、２５μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、４０℃にて行い；０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃にて洗浄するハイブリダイゼーションを意味する。
【００７１】
本明細書を通して、以下の標準略語を特定のヌクレオチド塩基を示すために使用する。
【００７２】
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン
Ｍ＝アデニンまたはシトシン
Ｒ＝アデニンまたはグアニン
Ｗ＝アデニンまたはチミン
Ｓ＝シトシンまたはグアニン
Ｙ＝シトシンまたはチミン
Ｋ＝グアニンまたはチミン
Ｖ＝アデニン、シトシンまたはグアニン（チミンではない）
Ｈ＝アデニン、シトシンまたはチミン（シトシンではない）
Ｂ＝シトシン、グアニンまたはチミン（アデニンではない）
Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン（またはイノシンなどの他の修飾された塩基）
Ｉ＝イノシン
さらに、「アゴニスト」の用語は、本発明の任意のポリペプチドの活性を増加させる任意のペプチド、または非ペプチジル化合物を示すために、本明細書を通して使用される。「アンタゴニスト」の用語は、本発明の任意のポリペプチドの活性を減少させる任意のペプチド、または非ペプチジル化合物を示すために、本明細書を通して使用される。
【００７３】
さらに、本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能なキャリア」の用語は、任意の標準的な薬学的に許容可能なキャリアを意味する。例には、リン酸緩衝食塩水、生理学的食塩水、水、および油／水エマルジョンなどのエマルジョンが含まれるが、限定されない。
【００７４】
ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子はイントロンを含み、さらに付加的なイントロンがコードまたは非コード領域に存在する可能性がある。さらに、ｍＲＮＡのスプライスされた形態が、一般に定義された開始メチオニンの上流またはコード領域内のどちらかにおいて、さらなるアミノ酸をコードする可能性がある。さらに、他のエキソンの存在、および使用の可能性があり、これにより前記ｍＲＮＡは、エキソンを含む領域内で異なるアミノ酸をコードする可能性がある。さらに、単一のアミノ酸置換が、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が本来の遺伝子によってコードされたものと異なるようなＲＮＡ編集の機構を介して生じる可能性がある（Ｂｕｒｎｓら、１９９６、Ｃｈｕら、１９９６）。そのような変異体は、本来の遺伝子によってコードされたポリペプチドとは異なった薬学的特性を示す可能性がある。
【００７５】
本発明は、本明細書で開示したほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体のスプライスバリアントを提供する。本発明はさらに、選択的(alternate)翻訳開始部位、および選択的(alternate)スプライスされたか、または編集された、本発明にしたがったＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする核酸のバリアントを提供する。
【００７６】
本発明はまた、本明細書で開示したＳＮＯＲＦ２５受容体の天然に存在する対立バリアントをコードする核酸を含む組換え核酸を企図する。
【００７７】
また本発明の核酸は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体を含む。このヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図１Ａ〜１Ｂに示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれる核酸配列を含む。ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体は、一以上の核酸塩基の同一性または位置に関して、本明細書に記載されたヒトSNORF25受容体遺伝子と異なり（図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる全長の核酸塩基よりも少なく含む欠失類似体）、図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、核酸配列の末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、これらのヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図１Ａ〜１Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸配列によってコードされたタンパク質のいくつか、またはすべての特性を共有するタンパク質をコードする。本発明の一つの態様において、前記核酸類似体は、図２Ａ〜２Ｂに示したか、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸配列によってコードされるものと同一のアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする。もう一つの態様において、前記核酸類似体は図２Ａ〜２Ｂで示したか、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）に含まれる核酸によってコードされたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持っているタンパク質をコードする。さらなる態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質は、図２Ａ〜２Ｂで示したアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能と同様の機能を有する。もう一つの態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質の機能は、図２Ａ〜２Ｂに示されたアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能とは異なる。もう一つの態様において、前記核酸配列の変化は、タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域内で起こる。さらなる態様において、前記核酸配列の変化はＴＭ領域の外側で起こる。
【００７８】
また本発明の核酸は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体を含む。このラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図３Ａ〜３Ｂに示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれる核酸配列を含む。ラットＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子の核酸類似体は、一以上の核酸塩基の同一性または位置に関して、本明細書に記載されたラットSNORF25受容体遺伝子と異なり（図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる全長の核酸塩基よりも少なく含む欠失類似体）、図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、核酸配列の末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、これらのヒトＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子は、図3Ａ〜3Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸配列によってコードされたタンパク質のいくつか、またはすべての特性を共有するタンパク質をコードする。本発明の一つの態様において、前記核酸類似体は、図4Ａ〜4Ｂに示したか、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸配列によってコードされるものと同一のアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする。もう一つの態様において、前記核酸類似体は図4Ａ〜4Ｂで示したか、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれる核酸によってコードされたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持っているタンパク質をコードする。さらなる態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質は、図4Ａ〜4Ｂで示したアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能と同様の機能を有する。もう一つの態様において、前記核酸類似体によってコードされたタンパク質の機能は、図4Ａ〜4Ｂに示されたアミノ酸配列を持つ受容体タンパク質の機能とは異なる。もう一つの態様において、前記核酸配列の変化は、タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域内で起こる。さらなる態様において、前記核酸配列の変化はＴＭ領域の外側で起こる。
【００７９】
本発明は、上述した単離した核酸であって、前記核酸はＤＮＡである核酸を提供する。一態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。またもう一つの態様において、前記核酸はＲＮＡである。核酸分子の作製および操作の方法は、本技術分野において周知である。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書で記述した任意のポリペプチドをコードするＤＮＡに関して、縮重した核酸を提供する。一態様において、核酸は図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示したヌクレオチド配列、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるヌクレオチド配列に関して縮重したヌクレオチド配列、すなわち同一のアミノ酸配列に翻訳されるヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書で記述した任意のポリペプチドをコードするＤＮＡに関して縮重した核酸を提供する。態様において、核酸は図３Ａ〜３Ｂ（配列番号：３）に示したヌクレオチド配列またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるヌクレオチド配列に関して縮重したヌクレオチド配列、すなわち同一のアミノ酸配列に翻訳されるヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
本発明はまた、本発明にしたがったポリペプチドの物とは異なるが、表現系に変化は起こさないであろうアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。あるいは、本発明はまた、本発明にしたがったＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡも包含する。ハイブリダイゼーション方法は当業者に周知である。
【００８３】
また本発明にしたがった核酸は、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類似体、断片、または、誘導体をコードする核酸分子を含む。これらの核酸分子は、一以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して、天然に存在する型とは異なり（タンパク質を特定する残基の全長より短い欠失類似体、特定された一以上の核酸塩基が他の核酸によって置換される置換類似体、ポリペプチドの末端または中央部分に一以上の核酸塩基が添加される添加類似体）、天然に存在する型のいくつか、またはすべての特性を共有する。これらの分子には、選択された非ほ乳類宿主に発現するために「好ましい」コドンの挿入；制限エンドヌクレアーゼ酵素によって開裂するための部位の供給；および簡単に発現ベクターを構築することを容易にする、付加的な開始、終止、または中間ＤＮＡ配列の供給、が含まれる。ポリペプチド類似体の作製は、当業者に周知である（Ｓｐｕｒｎｅｙ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９７）、Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９５）、Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９４）、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９６）、Ｇｕａｎ Ｘ．Ｍ．ら（１９９５））。
【００８４】
本発明にしたがった修飾ポリペプチドは、本技術分野で周知の、たとえば本明細書で開示したものを使用して一過性に、または安定に、どちらかで細胞にトランスフェクトしてもよい。本発明はまた、修飾ポリペプチド（ポリペプチドは一過性または安定細胞株のどちらかで発現される）を使用した結合アッセイを提供する。本発明はさらに、本明細書に記載された結合アッセイなどの結合アッセイにおいて、修飾ポリペプチドを使用して同定された化合物を提供する。
【００８５】
本明細書で記載され、請求された核酸は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してそれらが提供する情報として、およびさまざまな組換え技術によってポリペプチドを大規模に合成するための産物として有用である。本核酸分子は、新規クローニングおよび発現ベクター、形質転換されおよびトランスフェクトされた真核および原核細胞宿主、並びにポリペプチドおよび関連産物の発現が可能な宿主細胞などを培養増殖するための新規で有用な方法を作成するために有用である。
【００８６】
本発明はまた、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：１）に示した核酸配列によってコードされる、またはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされるＳＮＯＲＦ２５受容体の種相同体をコードする単離された核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体が有するものと本質的に同一のアミノ酸配列を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の相同体をコードする。もう一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と７５％より高いアミノ酸の一致性、好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と８５％より高いアミノ酸の一致性、最も好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と９５％より高いアミノ酸の一致性を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体をコードする。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体は、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して７０％より高い核酸の一致性、好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して８０％より高い核酸の一致性、より好ましくはプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して９０％より高い核酸の一致性を有する。種相同体を単離し、精製するための方法の例は、他に記載されている。（たとえば米国特許第５，６０２，０２４号、第ＷＯ９４／１４９５７号、第ＷＯ９７／２６８５３号、第ＷＯ９８／１５５７０号）。
【００８７】
また本発明は、図３Ａ〜３Ｂ（配列番号：３）に示した、核酸配列によってコードされる、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされるＳＮＯＲＦ２５受容体の種相同体をコードする単離された核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸は、本質的にプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体が有するものと本質的に同一のアミノ酸配列を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体の相同体をコードする。もう一つの態様において、前記核酸は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と７５％より高いアミノ酸の一致性、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と８５％より高いアミノ酸の一致性、最も好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたＳＮＯＲＦ２５受容体と９５％より高いアミノ酸の一致性を有するほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体動動物をコードする。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体相同体は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して７０％より高い核酸の一致性、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して８０％より高い核酸の一致性、より好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）内に含まれるＳＮＯＲＦ２５受容体遺伝子に対して９０％より高い核酸の一致性を有する。
【００８８】
本発明は、修飾されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離された核酸を提供する。この核酸は第三細胞内領域にアミノ酸欠失、置換または添加を有することにより、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体とは異なる。
【００８９】
本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードする単離した核酸を提供する。一つの態様において、前記核酸はＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体はプラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたものと同一のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体は、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
【００９０】
一態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様においてラットＳＮＯＲＦ２５受容体はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたものと同一のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、前記ラットＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を持つ。
【００９１】
本発明は、精製されたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質を提供する。一つの態様において、前記ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質である。さらなる態様において、前記ＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体タンパク質である。
【００９２】
本発明は、本発明にしたがった核酸を含むベクターを提供する。本発明はさらに、その発現が可能なように、前記受容体をコードする核酸に動作可能に連結された核酸を細胞内（前記細胞は細菌、両生類、酵母、昆虫またはほ乳類細胞である）で発現するために必要な調節エレメントを含む、細胞内で発現するために適応されたベクターを提供する。一つの態様において、前記ベクターはバキュロウイルスである。もう一つの態様において、前記ベクターはプラスミドである。
【００９３】
本発明は、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）と命名されたプラスミドを提供する。本発明はまた、ｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）と命名されたプラスミドを提供する。
【００９４】
本発明はさらに、修飾された非翻訳配列を含む任意のベクターまたはプラスミドを提供する。これらは、望ましい宿主細胞に発現するために、または結合または機能アッセイにおいて使用するために有益である。たとえば、さまざまな長さの非翻訳配列を有するベクターまたはプラスミドは、使用した宿主細胞に依存して、異なる量のポリペプチドを発現するであろう。一態様において、前記ベクターまたはプラスミドは、ポリペプチドのコード配列および宿主細胞で発現するために必要な調節エレメントを含む。
【００９５】
本発明は、本発明にしたがったベクターを含む細胞を提供する。一つの態様において、前記細胞は非ほ乳類細胞である。一つの態様において、前記非ほ乳類細胞は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、またはアフリカツメガエルメラニン保有細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、またはＣＨＯ細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、昆虫細胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ５Ｂ−４細胞である。
【００９６】
本発明は、本発明にしたがって細胞から単離された膜プレパレーションを提供する。
【００９７】
さらに、本発明は、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）、またはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブを提供する。
【００９８】
本発明はさらに、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。本発明はまた、少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図3A-3B（配列番号3）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブを提供する。一つの態様において、前記核酸はＤＮＡである。もう一つの態様において、前記核酸はＲＮＡである。
【００９９】
本明細書で使用するものとして、「特異的にハイブリズする」の用語は、その核酸自身に相補的な核酸配列を認識し、かつ相補的な塩基対との間で水素結合を介して二重らせん部分を形成する核酸分子の能力を意味する。
【０１００】
本発明にしたがった核酸は、他の種から相同性のある核酸を得るための、および試料中に相補的な配列を有する核酸の存在することを検出するためのプローブとして使用してよい。
【０１０１】
また前記核酸は、その核酸がコードする受容体をトランスフェクトした細胞内に発現するために使用してもよい。
【０１０２】
さらなる修飾をされずに天然に存在するか、または適切な点変異導入、欠失などの後であるか、いずれかであるＳＮＯＲＦ２５によってコードされる持続的に活性な受容体を使用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでアンタゴニストをスクリーニングすること、および内因性リガンドについて先行知識を持たずに、受容体ＳＮＯＲＦ２５に起因する役割を担うためのにこのようなアンタゴニストを使用することが可能になる。
【０１０３】
前記核酸の使用はさらに、受容体の多様性の可能性、およびＳＮＯＲＦ２５がメンバーである受容体ファミリー内に多数のサブタイプが存在することの解明を可能にする。
【０１０４】
最後に、数ある中で、慢性および急性炎症、関節炎、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患、細菌性、真菌性、原虫およびウイルス感染、敗血症、ＡＩＤＳ、痛み、不安、鬱病、分裂病、痴呆、精神遅延、記憶喪失、てんかんを含む精神病性および神経学的障害、神経学的障害、運動神経障害、呼吸障害、喘息、肥満、過食症、糖尿病、食欲不振を含む食事／体重障害、悪心、高血圧、低血圧、血管および心臓血管障害、虚血、発作、癌、腫瘍、尿失禁、性／生殖障害、日周期障害、腎臓障害、骨粗鬆症を含む骨疾患、良性前立腺肥大症、胃消化管障害、鼻うっ血、乾癬のような皮膚障害、アレルギー、パーキンソン病、アルツハイマー病、急性心不全、アンギナ障害、せん妄、ハンティングトン病またはギレズ デラ ツレット症候群のような運動障害、などのさまざまな病態生理学的な症状を治療するため、およびそのような症状を診断するアッセイする薬剤を設計するための貴重なツールとして、本発明が役に立つ可能性があると考えられる。また本受容体は、化学予防のための薬剤を設計するための貴重なツールとして、役に立つ可能性がある。
【０１０５】
前記受容体が細胞表面上に発現している細胞を得るために、細胞、たとえばほ乳類細胞に、このような核酸をトランスフェクトする方法は、本技術分野において周知である（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０６】
また、このようなトランスフェクトされた細胞は、ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合する化合物、並びにこのような細胞において機能的応答を活性化するか、または活性化を阻害する化合物を得るために、化合物をテストし、および化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用してよく、したがってｉｎ ｖｉｖｏでそのようになる可能性がある（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０７】
本発明はさらに、ほ乳類受容体をコードする核酸によってコードされたほ乳類受容体に結合可能な抗体を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類受容体はヒト受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類受容体はラット受容体である。本発明はまた、ほ乳類受容体に対する抗体の結合を競合的に阻害することができる薬剤を提供する。一つの態様において、前記抗体はモノクローナル抗体または抗血清である。
【０１０８】
ＳＮＯＲＦ２５受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、核酸プローブ、トランスジェニック動物を調製し、使用する方法は本技術分野において周知ある（たとえば、米国特許第５，０５３，３３７号、第５，１５５，２１８号、第５，３６０，７３５号、第５，４７２，８６６号、第５，４７６，７８２号、第５，５１６，６５３号、第５，５４５，５４９号、第５，５５６，７５３号、第５，５９５，８８０号、第５，６０２，０２４号、第５，６３９，６５２号、第５，６５２，１１３号、第５，６６１，０２４号、第５，７６６，８７９号、第５，７８６，１５５号および第５，７８６，１５７号を参照のこと。前記開示は、その全文が本明細書内に参考文献にて援用される。）。
【０１０９】
本発明はまた、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＲＮＡの翻訳を防ぐために、このようなＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするゲノムＤＮＡの転写を防ぐために、このようなゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一つの態様において、前記オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含む。
【０１１０】
本発明は、本発明による核酸によってコードされたほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合することが可能な抗体を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１１１】
さらに、本発明は、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に対する、本発明による抗体の結合を競合的に阻害することができる抗体を提供する。一つの態様において、前記抗体はモノクローナル抗体または抗血清である。
【０１１２】
本発明はまたさらに、
（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、請求項36に記載のオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１３】
一つの態様において、前記オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する基質と結合する。もう一つの態様において、前記ｍＲＮＡを不活性化する基質はリボザイムである。もう一つの態様において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、細胞のほ乳類SNORF25受容体と結合する構造物を含み、前記受容体は該構造物と結合した後に、前記細胞に取り込まれることが可能な医薬組成物である。もう一つの態様において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、選択した細胞タイプに特異的なほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体に結合することが可能である。
【０１１４】
本発明はまた、医薬組成物であって、リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な、本発明による抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明によるほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡを発現しているトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。本発明は、天然のほ乳類SNORF25受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。本発明はさらに、トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、請求項1に記載のほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡは、さらに、誘導可能なプロモーターを含む。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体をコードするＤＮＡは、さらに、組織特異的調節成分を含む。もう一つの態様において、トランスジェニック非ヒトほ乳類は、マウスである。
【０１１６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。本発明はさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法を提供する。
【０１１７】
一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体はヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は本質的に、プラスミドｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９５号）によってコードされたヒトＳＮＯＲＦ２５受容体と同様のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は本質的に図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）で示したのと同様のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様において、ほ乳類のＳＮＯＲＦ２５受容体は、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号：２）で示したアミノ酸配列を持つ。
【０１１８】
もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５（ＡＴＣＣ登録番号第２０３４９４号）によってコードされたラットＳＮＯＲＦ２５受容体と本質的に同様のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）で示した配列と本質的に同様のアミノ酸配列を有する。もう一つの態様において、前記ほ乳類のＳＮＯＲＦ２５受容体は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号：４）で示したアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は非ニューロン起源である。もう一つの態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である。本発明は本発明の前記工程によって同定された化合物を提供する。
【０１２０】
本発明はまたさらに、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【０１２１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法を提供する。
【０１２２】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体はヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記細胞は非ニューロン起源である。もう一つの態様において、非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。本発明は本発明の前記工程によって同定された化合物を提供する。
【０１２３】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらにほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法提供する。
【０１２５】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞は、非ニューロン起源である。さらなる態様において、非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ１細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１２６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを本発明による核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法を提供する。
【０１２７】
本発明は、細胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と本発明による抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法を提供する。
【０１２８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、さらに、ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法を提供する。
【０１３０】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法を提供する。
【０１３１】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。本発明は、本発明に方法によって同定されたアンタゴニストを提供する。本発明は、本発明によるアンタゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明による医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【０１３２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、本発明によるトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。本発明は、本発明によって同定されたアゴニストを提供する。本発明は、本発明によって同定されたアゴニストを含む組成物、例えば薬学的組成物およびキャリア、たとえば薬学的に許容可能なキャリアを提供する。
【０１３３】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、本発明による医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法を提供する。
【０１３４】
本発明は、ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 請求項1に記載のほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法を提供する。
【０１３５】
一つの態様において、前記疾患は、特定のほ乳類対立遺伝子の活性に関連する疾患である。
【０１３６】
本発明はまた、本発明に従って精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明は、本発明に従って精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法を提供する。
【０１３８】
本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【０１３９】
本発明は、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
【０１４０】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１４１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば薬学的組成物を提供する。一つ態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない。
【０１４２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、たとえば薬学的組成物を提供する。一つ態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない。
【０１４３】
本発明はさらに、化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法を提供する。
【０１４４】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は内部塩素電流のレベルの増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は細胞内カルシウムの測定の増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は、イノシトールリン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はイノシトールリン酸レベルの増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはアラキドン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はアラキドン酸濃度の増加である。またもう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ＧＴＰγＳリガンドの結合が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化はＧＴＰγＳリガンドの結合の増加である。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ＭＡＰキナーゼの活性化が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化はＭＡＰキナーゼ活性の増加である。さらなる態様において、前記二次メッセンジャー応答には、ｃＡＭＰの蓄積が含まれ、前記二次メッセンジャー応答の変化はｃＡＭＰ蓄積の増加である。
【０１４５】
本発明は、化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法。
【０１４６】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししか内部塩素電流レベルを増加しないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答は細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少し細胞内カルシウムレベルの測定を増加しないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答はイノシトールリン酸の放出を含み前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししかイノシトールリン酸レベルを増加しないことである。
【０１４７】
一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはＭＡＰキナーゼの活性化が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのＭＡＰキナーゼのレベルの増加が少ないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはｃＡＭＰレベルの変化が含まれ、前記二次メッセンジャー応答の変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのｃＡＭＰのレベルの変化が少ないことである。もう一つの態様において、前記二次メッセンジャー応答にはアラキドン酸の放出が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのアラキドン酸のレベルの増加が少ないことである。さらなる態様において、前記二次メッセンジャー応答にはＧＴＰγＳリガンド結合が含まれ、前記二次メッセンジャーの変化は、第二の化学化合物のみが存在するときよりも前記化合物と第二の化学化合物両方が存在するときのＧＴＰγＳリガンド結合のレベルの増加が少ないことである。
【０１４８】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞は昆虫細胞である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である。もう一つの態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。もう一つの態様において、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない。
【０１４９】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない。
【０１５０】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性を低下させるために効果的な量の本発明に従った方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリア、例えば薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない。
【０１５１】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１５２】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法を提供する。
【０１５３】
一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。さらなる態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記細胞はほ乳類細胞である。もう一つの態様において、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である。さらなる態様において、前記非ニューロン細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１５４】
本発明はまた、ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に有効な量の、本発明に従った方法によって同定された化合物、およびキャリアたとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【０１５５】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に有効な量の、本発明に従った方法によって同定された化合物、およびキャリアたとえば薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【０１５６】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記異常は、ステロイドホルモン障害、エピネフリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管障害、電解質バランス障害、高血圧、糖尿病、呼吸障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋骨格障害、神経内分泌障害、認識障害、記憶障害、体性感覚および神経伝達障害、運動協調障害、知覚統合障害、ドーパミン機能障害、食欲不振または肥満のような食欲障害、感覚伝達障害、嗅覚障害、自律神経系障害、痛み、精神病行動、感情障害、偏頭痛、癌、増殖疾患、傷治癒、組織再生、血液凝固関連障害、発達障害または虚血再灌流傷関連疾患の調節である。
【０１５７】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法提供する。一つの態様において、前記異常は、ステロイドホルモン障害、エピネフリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管障害、電解質バランス障害、高血圧、糖尿病、呼吸障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋骨格障害、神経内分泌障害、認識障害、記憶障害、体性感覚および神経伝達障害、運動協調障害、知覚統合障害、ドーパミン機能障害、食欲不振または肥満のような食欲障害、感覚伝達障害、嗅覚障害、自律神経系障害、痛み、精神病行動、感情障害、偏頭痛、癌、増殖疾患、傷治癒、組織再生、血液凝固関連障害、発達障害または虚血再灌流傷関連疾患の調節である。
【０１５８】
本発明は、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、本発明に従った方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１５９】
本発明は、組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の本発明に従った方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ヒトＳＮＯＲＦ２５受容体である。もう一つの態様において、前記ほ乳類ＳＮＯＲＦ２５受容体は、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体である。
【０１６０】
従って、いったん標的受容体のサブタイプの遺伝子がクローン化されたならば、それは前記標的受容体サブタイプをその表面上に発現するレシピエント細胞内に配置される。次いで、標的ヒト受容体サブタイプの単一集団を発現しているこの細胞を増殖させ、細胞株の樹立させる。薬物発見系を構成するこの細胞株を、２つの異なる型のアッセイで使用する：結合アッセイおよび機能性アッセイである。結合アッセイにおいて、特定の薬物発見プログラムの標的である受容体サブタイプと、副作用に関連する可能性のある他の受容体サブタイプの両方の化合物の親和性を測定する。これらの測定により、化合物の効力、並びに化合物が他の受容体サブタイプよりも標的受容体サブタイプ対して有する選択性の程度を予測することができる。結合アッセイから得たデータにより、適切であれば、化学者は最適な治療効果のために、一以上の関連性のあるサブタイプに近づけるかまたは遠ざけて化合物を設計することもできる。機能性アッセイにおいては、化合物に対する受容体サブタイプの応答の性質を測定する。機能性アッセイからのデータは、化合物が受容体サブタイプの活性を阻害するために働いているのか、促進するために働いているのかを示し、したがって薬理学者は、それらの最終的な標的ヒト受容体サブタイプにおいて迅速に化合物を評価することができ、化学者は、現存している薬物より有効であり、重度な副作用がより少なく本質的にはほとんどないであろう薬物を合理的に設計することができる、。
【０１６１】
受容体サブタイプ選択的な化合物を設計すること、および合成することへのアプローチは周知であり、伝統的な医薬化学、およびより新しいコンビナトリアルケミストリーの技術が含まれ、その両方がコンピュータ補助による分子モデリングによって支持される。このようなアプローチによって、化学者および薬理学者は、標的とした受容体サブタイプの構造、並びに受容体サブタイプに結合するおよび／または活性化するまたは活性化を阻害すると決定された化合物に対する知識を使用して、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有する可能性のある構造を設計し、かつ合成する。
【０１６２】
コンビナトリアルケミストリーは、化学構築ブロックの様々な組合せを用いて組み立てることによって、さまざまな新規の化合物を自動化合成することが含まれる。コンビナトリアルケミストリーを使用することにより、化合物を合成する工程は非常に加速した。得られた化合物の配列（アレイ）はライブラリーと呼ばれ、目的の受容体に対して十分なレベルの活性を示す化合物（「リード化合物」）をスクリーニングするために使用される。コンビナトリアルケミストリーを使用して、目的の標的受容体に非常に偏っていると予想される化合物の「特定化（ｆｏｃｕｓｅｄ）」ライブラリーを合成することが可能である。
【０１６３】
いったんリード化合物が同定されたならば、コンビナトリアルケミストリーまたは伝統的な医薬化学またはそれ以外のいずれかを使用することによって、化学構造と、生物学的または機能的活性との関係を容易に理解するために、さまざまな相同体および類似体が調製される。これらの研究は、構造活性の関係を明確にする。この関係は、効力、選択性および薬物動力学的特性が改善された薬剤を設計するために使用される。また、リードを最適化するために、コンビナトリアルケミストリーを使用して、さまざまな構造が迅速に作製される。一つずつ化合物の合成することを含む伝統的な医薬化学は、さらに精製するため、および自動化技術によって利用できない化合物を作製するために使用される。いったんこのような薬剤が限定されたならば、製薬および化学工業において利用されている標準的な製造技術を使用して、前記産物をスケールアップする。
【０１６４】
本発明は、以下の実験の詳細によって、より理解されるであろう。しかしながら、特定の方法および考察される結果が、上記特許請求の範囲がより完全に記載されるように、本発明を単に例示しただけであることは当業者にすぐに理解されるであろう。
【実施例】
【０１６５】
材料と方法
ｃＤＮＡの混合オリゴヌクレオチドプライムド増幅（ＭＯＰＡＣ）
ｃＤＮＡの混合オリゴヌクレオチド増幅（ＭＯＰＡＣ）を、ラットゲノムＤＮＡ、ＧＨ１細胞株およびＲｉｎ１４ｂ細胞株から単離したｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを含むいくつかのＤＮＡテンプレートに対して実施した。ＭＯＰＡＣ反応はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、および以下の縮重オリゴヌクレオチド、ガラニン、ソマトスタチン、および阿片受容体ファミリーのの第３膜貫通領域に基づいて設計されたＪＡＢ５５、およびガラニン受容体ファミリーの第７膜貫通領域に基づいて設計されたＴＬ１０２０を用いて実施した。
【０１６６】
ＭＯＰＡＣ ＰＣＲ反応の条件は以下のように行った。９４℃で３分間保持、９４℃で１分間、４４℃で１分４５秒間、７２℃で２分間を１０サイクル、９４℃で１分間、４９℃で１分４５秒間、７２℃で２分間を３０サイクル、アガロースゲル電気泳動の準備ができるまで４℃で保持。
【０１６７】
前記産物を１％アガロースＴＡＥゲル上で泳動し、予想される大きさ（〜５００〜６００ｂｐ）のバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製して、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にサブクローン化した。白色の（挿入物を含んだ）コロニーを取り上げ、以下のプロトコルを用いてｐＣＲ２．１ベクタープライマーのＪＡＢ１およびＪＡＢ２を用いたＰＣＲにかけた。９４℃で３分間保持、９４℃で１分間、６８℃で１分４５秒間、６８℃で２分間を３５サイクル、精製の準備ができるまで４℃で保持。ＰＣＲ産物をイソプロパノール沈殿（１０μｌ ＰＣＲ産物、１８μｌ 低ＴＥ、１０．５μｌ ２Ｍ ＮａＣｌＯ４、２１．５μｌ イソプロパノール）によって精製し、ＡＢＩ Ｂｉｇ ＤｙｅサイクルシークエンシングプロトコルおよびＡＢＩ ３７７シークエンサー（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を決定した。後にＳＮＯＲＦ２５と命名した、これらのＰＣＲ産物の１つは、データベース検索に基づいて新規のＧタンパク質結合受容体様配列であり、他の既知のＧタンパク質結合受容体との相同性を持つと決定された（既知の受容体ドーパミンＤ１、β−アドレナリン作動性２ｂおよび５−ＨＴ１ｆに対して−２９％同一、５−ＨＴ４ｌ受容体に対して３４％同一）。
【０１６８】
５’および３’ＲＡＣＥ
ＳＮＯＲＦ２５の全長コード配列を決定するために、５’／３’ｃＤＮＡ末端急速増幅（ＲＡＣＥ）のためのクローンテックマラソンｃＤＮＡアンプリフィケーション（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。Ｒｉｎ１４ｂ細胞由来のトータルＲＮＡをファストトラックｍＲＮＡアイソレーションキット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｏｌｙＡ＋選択した。５’ＲＡＣＥのためには、上述したＰＣＲ断片（ＳＮＯＲＦ２５）の推定第５膜貫通領域に由来するリバースプライマーであるプライマーＪＡＢ７３を用いて、１μｇのｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。アドバンテージクレンタックポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋｌｅｎｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、マラソンｃＤＮＡアンプリフィケーションプロトコルにしたがって、アダプターのライゲーションおよびネスティッドＰＣＲを実施した。供給業者のアダプタープライマー１（Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ １）と上述したＰＣＲ断片の第５膜貫通領域の５’末端に由来するリバースプライマーであるＪＡＢ７１を用いて、ライゲーションされたｃＤＮＡの５０倍希釈に対して第一ＰＣＲを実施した。アダプタープライマー２（Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ ２）と第四膜間通領域のすぐ下流のリバースプライマーであるＪＡＢ６９を用いて、この第一ＰＣＲ反応液の１μｌを再び増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間、９４℃で１５秒間、７２℃で１分３０秒間を５サイクル、９４℃で１５秒間および７０℃で１分３０秒間を５サイクル、９４℃で１５秒間、６８℃で１分３０秒間を２２サイクル、６８℃で５分間保持し、および解析の準備ができるまで４℃に保持した。ネスティッドＰＣＲ由来の６００ｂｐ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫキットを用いて１％アガロースＴＡＥゲルから単離して、上述したようにＡＢＩ３７７シークエンサーおよびＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定した。ウイスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）（ＧＣＧ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてシーケンスした。
【０１６９】
３’ＲＡＣＥのためには、二本鎖ｃＤＮＡをマラソンｃＤＮＡアンプリフィケーションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に付属するｃＤＮＡ合成プライマーＣＤＳを用いて、１μｇのｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡより合成した。３’ＲＡＣＥ反応のＰＣＲ条件は、上述したＭＯＰＡＣからの新規ＰＣＲ断片の第５と第６膜貫通領域の間に位置する配列に由来するフォワードプライマーであるＪＡＢ７４およびＪＡＢ７２を、それぞれＪＡＢ７１およびＪＡＢ７３の代わりに使用することを除いて、５’ＲＡＣＥ反応と同様である。ネスティッドＰＣＲ由来の１．４ｋｂ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて１％アガロースＴＡＥゲルより単離して、上記のようにシーケンスした。
【０１７０】
本受容体配列の全長コード配列を決定した後に、全コード領域を、エクスパンド ロング ＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ ＰＣＲ）システム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、Ｒｉｎ１４ｂ細胞株ｃＤＮＡ、およびラットゲノムＤＮＡから増幅した。この反応のためのプライマーは、それぞれ５’（ＪＡＢ８６）および３’（ＪＡＢ８４）プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込んだＳＮＯＲＦ２５の５’および３’非翻訳領域に特異的である。次いで、この反応由来の産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローン化し、ベクター−および遺伝子−特異的プライマーを用いて両方向をシーケンスした。Ｒｉｎ１４ｂ−クローン化ＳＮＯＲＦ２５産物由来の二本鎖配列は、ラットゲノムＤＮＡから増幅した同様の遺伝子の配列と一致した。ｐｃＤＮＡ３．１（−）内のラットＳＮＯＲＦ２５のこの受容体／発現ベクター構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５と名付けた。
【０１７１】
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体の相同性クローニング
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体をクローン化するために、ラットＳＮＯＲＦ２５配列の第２（ＢＢ４２６）および第５（ＢＢ４２７）膜貫通領域（ＴＭｓ）に基づいて２つのオリゴヌクレオチドを設計し、ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブするために使用した。両方のプライマーをα３２Ｐ−ｄＡＴＰおよび末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって末端標識化した。中程度にストリンジェントな条件下：３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）、１×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％ウシ胎児アルブミン）、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、および２５μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、においてハイブリダイゼーションを行った。濾液を２０分間室温にて、２×ＳＳＣ／０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む緩衝液中で３回、０．１×ＳＳＣ／０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む緩衝液中で２０分間２回洗浄し、−７０℃にて、増感スクリーンの存在下でコダック バイオマックス ＭＳ（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳ）フィルムに露光した。
【０１７２】
プローブとハイブリダイゼーションしたコスミドクローンを拾い、プレートに画線し、個々の陽性コロニーを確認して、単離するために同一の条件下で同一のプローブを用いて二回選別した。陽性コロニー由来のコスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに写し、３２Ｐ−標識化ＢＢ４２６でプローブした。前記プローブとハイブリダイズしたクローン＃４５ａ（ＣＯＳ４ライブラリー）由来のおよそ１．９ｋｂの断片を、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローン化し（ｐｃＥＸＶ（ミラー アンド ジャーマン（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｍａｎ）、１９８６）をＢｓｔＸＩおよび他のさらなる制限部位、並びにＴ３、Ｔ７プロモーターを含むように改変した岡山およびベルグ（Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ）発現ベクターである）、上述のように両方の鎖をシーケンスした。このベクター内のヒトＳＮＯＲＦ２５受容体構築物をｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５と名付けた。ヒトＳＮＯＲＦ２５は、ＧＣＧソフトウェアを用いて解析し、ヒトＳＮＯＲＦ２５の全長配列を含み、ラット受容体と８０％アミノ酸同一性および８３％ヌクレオチド同一性を持つことをむことを確認した。
【０１７３】
オリゴヌクレオチドプライマー
以下は、これらの受容体のクローニングに使用したプライマーとその関連配列のリストである。
【０１７４】
ＪＡＢ５５：５’−ＴＢＤＳＹＶＹＩＧＡＹＭＧＩＴＡＹＶＴＫＧ−３’（配列番号：５）
ＴＬ１０２０：５’−ＧＡＩＲＳＩＡＲＩＧＭＲＴＡＩＡＹＩＡＫＩＧＧＲＴＴ−３’（配列番号：６）
ＪＡＢ１：５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号：７）
ＪＡＢ２：５’−ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号：８）
ＪＡＢ６９：５’−ＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号：９）
ＪＡＢ７１：５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：１０）
ＪＡＢ７２：５’−ＡＴＧＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号：１１）
ＪＡＢ７３：５’−ＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１２）
ＪＡＢ７４：５’−ＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：１３）
ＪＡＢ８４：５’−ＡＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：１４）
ＪＡＢ８６：５’−ＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１５）
ＢＢ４２６：５’−ＴＴＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＡＧ−３’（配列番号：１６）
ＢＢ４２７：５’−ＧＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号：１７）
ＳＮＯＲＦ２５受容体ｃＤＮＡの他の種の相同体の単離
他の種に由来するＳＮＯＲＦ２５受容体ｃＤＮＡをコードする核酸配列を、標準的分子生物学技術および以下で記述したものなどのアプローチをしようして単離できるであろう。
【０１７５】
アプローチ＃１：ゲノムクローンを単離するために、対象の種から作製されたゲノムライブラリー（例えばコスミド、ファージ、Ｐ１、ＢＡＣ、ＹＡＣ）を、その配列が図１Ａ〜１Ｂおよび３Ａ〜３Ｂに示されたヒトまたはラットＳＮＯＲＦ２５受容体の断片に対応する３２Ｐ−標識されたオリゴヌクレオチドでスクリーニングすればよい。全長配列は、このゲノムクローンのシークエンスすることによって得ることができる。１以上のイントロンが遺伝子内に存在する場合、イントロンのない全長遺伝子は、標準的な分子生物学技術を用いてｃＤＮＡより得ることができる。例えば、５’ＵＴで設計されたフォワードＰＣＲプライマー、および３’ＵＴで設計されたリバースＰＣＲプライマーを使用して、全長、イントロンのない受容体をｃＤＮＡから増幅してもよい。ほ乳類発現ベクター内にこの遺伝子をサブクローンするために、標準的な分子生物学的技術が使用できる。
【０１７６】
アプローチ＃２：標準的な分子生物学技術を使用して、図１Ａ〜１Ｂおよび３Ａ〜３Ｂに示された配列の断片に対応する３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ストリンジェンシーを減少させた条件下でハイブリダイゼーションすることによって市販されている対象の種のｃＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングするために使用してよい。ラムダライブラリーに由来するプラーク精製クローンを得ることによって、全長ＳＮＯＲＦ２５受容体を単離し、次いでクローンを直接ＤＮＡシークエンスにかけてもよい。あるいは、部分的種相同的配列に対して設計したプライマーを使用してライブラリープールをＰＣＲ増幅することにより、ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをスクリーニングするために、標準の分子生物学技術が使用できるであろう。全長クローンは、３２Ｐオリゴヌクレオチドプローブに陽性なプールのコロニーを拾って、サザンハイブリダイゼーションすることによって単離すればよい。
【０１７７】
アプローチ＃３：３’および５’ＲＡＣＥを、ＳＮＯＲＦ２５の付加的な配列を含むＳＮＯＲＦ２５を発現している対象の種に由来するｃＤＮＡからＰＣＲ産物を作製するために使用してもよい。次いで、これらのＲＡＣＥ ＰＣＲ産物をシーケンスして、付加的な配列を決定してよい。次いで、この新規の配列を５’ＵＴ内のフォワードＰＣＲプライマーに、３’ＵＴ内の３’リバースＰＣＲプライマーを設計するために使用する。次いで、これらのプライマーはｃＤＮＡから全長ＳＮＯＲＦ２５クローンを増幅するのに使用される。
【０１７８】
他の種の例には、マウス、イヌ、サル、ハムスターおよびモルモットが限定はしないが含まれる。
【０１７９】
宿主細胞
異種性に発現しているタンパク質を研究するために、広範囲の様々な宿主細胞を使用できる。これらの細胞には、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＬＭ（ｔｋ−）、ＨＥＫ２９３などのようなほ乳類細胞株、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞株、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞のような両生類細胞、多彩な酵母株、多彩な細菌株細胞などが含まれるが、限定されない。これらの細胞タイプのそれぞれに対する培養条件は特異的であり、当業者に公知である。ＳＮＯＲＦ２５受容体を発現するために使用した細胞はＣｏｓ−７とチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であった。
【０１８０】
補充物を含むＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ グルタミン、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン／１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地）中、１５０ｍｍプレート内で、３７℃、５％ＣＯ２にてＣｏｓ−７細胞を増殖させる。Ｃｏｓ−７細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分割する。
【０１８１】
補給物（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００ユニット／ｍｌ ペニシリン／１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＨＡＭのＦ−１２培地にて、１５０ｍｍプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２にてＣＨＯ細胞を増殖させる。ＣＨＯ細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：８に分割する。
【０１８２】
一過性発現
研究するためのタンパク質をコードするＤＮＡは、リン酸カルシウムを介して、ＤＥＡＥ−デキストランを介して、リポソームを介して、ウイルスを介して、エレクトロポレーションを介してねおよびマイクロインジェクション伝送のような様々な方法によって、さまざまなほ乳類、昆虫、両生類、酵母、細菌および他の細胞株に一過性に発現させることができる。これらの方法は、それぞれＤＮＡ、細胞株、および本質的に使用するアッセイのタイプに依存している多彩な実験的パラメータの最適化を必要とする可能性がある。ＳＮＯＲＦ２５ ｃＤＮＡをさまざまな細胞株に一過性にトランスフェクトするために、エレクトロポレーション法を使用した。
【０１８３】
Ｃｏｓ−７細胞に適用したようなエレクトロポレーション法の典型的なプロトコルは、以下に記述する。トランスフェクションに使用する細胞をトランスフェクションの２４時間前に分割し、トランスフェクション時にサブコンフルエントなフラスコを用意する。細胞をトリプシン処理によって回収し、その増殖培地内に再び懸濁して計数する。５×１０６細胞を３００μｌのＤＭＥＭに懸濁させ、エレクトロポレーションキュベット内に入れる。８μｇの受容体ＤＮＡ＋８μｇの必要な任意の追加ＤＮＡ（例えばＧタンパク質発現ベクター、レポーター構築物、抗生物質抵抗性マーカー、モックベクターなど）を細胞懸濁液に添加し、キュベットをバイオラッド ジーン パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）に入れ、電気パルスを与える（ジーン パルサー設定：０．２５ｋＶ 電圧、９５０μＦ 電気容量）。パルスの後、８００μｌの完全ＤＭＥＭをそれぞれのキュベットに加え、懸濁液を滅菌チューブに移した。それぞれのチューブに、最終濃度が１×１０５細胞／１００μｌとなるまで完全培地を加える。次いで実施するアッセイのタイプに依存して必要なように細胞をプレートにまく。
【０１８４】
安定発現
異種性ＤＮＡを宿主細胞内に安定に組み込むことができ、これにより細胞に外来タンパク質を永久に発現させることになる。ＤＮＡを細胞内に運搬する方法は、一過性発現に関して上述したものと同様であるが、標的とした宿主細胞に薬物抵抗性を与えるための補助遺伝子を共トランスフェクションすることが必要である。その結果得られる薬物抵抗性は、ＤＮＡを取り込んだ細胞を選択し、保持するために活用することができる。利用可能な抵抗性遺伝子の種類には、ネオマイシン、カナマイシンおよびハイグロマイシンを含むが、限定しない。本発明の受容体に関する研究を目的として、異種性受容体タンパク質の安定発現は一般的に、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＬＭ（ｔｋ−）などを含むほ乳類で実施するが、限定する必要はない。
【０１８５】
さらに、前記受容体に対する核酸配列を天然に持ち、発現する野生細胞株を、受容体の補完を遺伝子工学的に作製する必要なしに使用してよい。
【０１８６】
膜プレパレーション
本発明にしたがった受容体タンパク質を発現する細胞膜は、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ−γ−Ｓ結合アッセイなどを含むアッセイ型に関して有用であるが、限定しない。そのような細胞膜を調製するための特性は、いくつかの場合、次のアッセイの特性によって決めてもよいが、しかし一般的には、全細胞の回収および氷冷緩衝液（たとえば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の調音波処理による細胞ペレットの粉砕を含む。得られた未精製細胞溶解物を、４℃において２００×ｇで５分間の低速遠心することによって細胞残骸を除去する。次いで除去された上清を４０，０００×ｇにて２０分間、４℃で遠心し、氷冷緩衝液中に再び懸濁すること、および高速遠心工程を繰り返すことによって、得られた膜ペレットを洗浄する。最終洗浄膜ペレットをアッセイ緩衝液に再び懸濁する。牛血清アルブミンを標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）法によって、タンパク質濃度を決定する。膜は、すぐに使用するか、または後で使用するために凍結してよい。
【０１８７】
バキュウロウイルスの作製
ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩの、存在する制限部位またはポリペプチドのコード領域に対して５’および３’の配列内に作製した部位内に、本明細書で開示したヒト受容体をコードするＤＮＡのコード領域をサブクローン化してよい。バキュウロウイルスを作製するために、０．５μｇのウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）および３μｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ構造物を（「バキュロウイルス発現ベクターシステム：手順および方法マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ）」にて）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎによって概略されたように、リン酸カルシウム共沈殿法によって２×１０６のスポドテラ フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫Ｓｆ９細胞内に共トランスフェクトしてよい。次いで細胞を２７℃にて５日間インキュベートする。
【０１８８】
共トランスフェクトプレートの上清を遠心によって回収し、組換えウイルスプラークを精製してもよい。ウイルスストックを調整するため、およびウイルスストックのタイターを調べるために、細胞にウイルスを感染させる手順はファーミンゲンのマニュアルに記述されたものである。
【０１８９】
標識化リガンド結合アッセイ
例えば標識化リガンド結合アッセイによって、前記受容体対するリガンドをスクリーニングするために、本発明にしたがった受容体を発現している細胞を使用してよい。いったんリガンドが同定されたならば、同一のアッセイを、さまざまな治療的目的のために使用してよい受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに使用してよい。
【０１９０】
１つの実施様態において、標識化リガンドは、多重ウェルマイクロタイタープレート内で受容体を発現している膜プレパレーションまたは昆虫細胞のどちらかと、非標識化化合物、および結合緩衝液を共に接触させて配置する。別の平衡結合アッセイで最適であると決定した時間、および温度において、結合反応混合液をインキュベートする。細胞ハーベスターを使用してＧＦ／Ｂフィルターを通す濾過によって、または直接結合リガンドを測定することによって、反応を停止させる。リガンドが３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射活性アイソトープで標識化されている場合、結合リガンドを液体シンチレーション計数、シンチレーション近似、または放射活性アイソトープを検出するための任意の他の方法を用いることにより検出してもよい。リガンドが蛍光化合物で標識されている場合、結合標識化リガンドは、蛍光強度、時間分解蛍光、蛍光極性、蛍光伝送、または蛍光相関分光測定などの方法によって測定してよいが、限定はしない。この方法において、受容体と結合するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、受容体を発現している膜タンパク質または昆虫細胞と標識化リガンドの結合を阻害することにより同定されるであろう。非特異的結合は、高濃度の非標識化リガンド（例えば１００〜１０００×ＫＤ）の存在下における膜タンパク質をインキュベーションした後に残っている標識化リガンドの量として定義する。平衡飽和結合アッセイでは、標識化化合物の濃度を増加させて膜プレパレーションまたは受容体をトランスフェクトした昆虫細胞をインキュベートし、標識化リガンドの結合親和性を測定する。非標識化化合物の結合親和性は、多様な濃度の置換リガンドの存在下において標識化化合物の濃度を固定して使用する、平衡競合結合アッセイによって決定してよい。
【０１９１】
機能性アッセイ
ＳＮＯＲＦ２５受容体ＤＮＡを発現している細胞を、機能性アッセイを使用してＳＮＯＲＦ２５受容体に対するリガンドをスクリーニングするために使用してよい。いったんリガンドが同定されたならば、さまざまな治療目的のために使用されるであろう受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、同一のアッセイを使用してもよい。ＧＰＣＲの過剰発現が結果として細胞内シグナル伝達経路の競合的活性化となりうることは、当業者に周知である。同様の方法で、上述したような任意の細胞株におけるＳＮＯＲＦ２５受容体の過剰発現が、以下に記述した機能的応答を活性化することができ、ここに記述したアッセイのどれもが、ＳＮＯＲＦ２５受容体のアゴニストおよびアンタゴニストリガンド両方をスクリーニングするために使用できる。
【０１９２】
ＳＮＯＲＦ２５受容体リガンドの存在をスクリーニングするために、広範囲のアッセイを使用できる。これらのアッセイは、たとえば総イノシトールリン酸の蓄積、ｃＡＭＰレベル、細胞内カルシウム流動、およびカリウム電流などの店頭的な測定から；これらの同じ二次メッセンジャーを測定する（より高い処理量となるように修飾または適合された）系まで；代謝変化、分化、細胞分裂／増殖などの受容体の活性化により生じるより一般的な細胞事象をレポートする細胞に基づいたアッセイまで範囲が及ぶ。このようなアッセイに関するいくつかの記述を以下に示す。
【０１９３】
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ
受容体を介した刺激または環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の阻害は、受容体を発現している細胞内でアッセイしてもよい。細胞を９６ウェルプレートまたは他の容器に入れ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（たとえば、典型的な阻害剤カクテルは、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチンおよび１０μｇ／ｍｌ ホスホラミドンを含む）の存在下、または非存在下において、５ｍＭ チオフィリンんどのホスホジエステラーゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ））などの緩衝液内で、２０分間３７℃、５％ＣＯ２内でプレインキュベートする。試験化合物を１０ｍＭ ホルスコリンと共にまたはなしで添加して、さらに１０分間、３７℃でインキュベートする。次いで培地を吸い取り、１００ｍＭ ＨＣｌの添加または他の方法によって反応を停止させる。プレートを４℃にて１５分間保存し、停止溶液内のｃＡＭＰ含量を放射免疫アッセイによって測定する。放射活性は、データ変換ソフトウェアを備えたガンマ計数器を使用して定量してよい。受容体に対するアッセイを最適化するため、またはｃＡＭＰの検出方法を変更するために、特定の改変を実施してもよい。
【０１９４】
アラキドン酸放出アッセイ
受容体を発現している細胞を９６ウェルプレートまたは他の容器内にまき、補充物を含む培地内で３日間増殖させる。３Ｈ−アラキドン酸（特異的活性＝０．７５μＣｉ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに１００μＬ量で伝送し、試料を３７℃、５％ＣＯ２にて１８時間インキュベートする。標識化された細胞を培地で３回洗浄する。次いでウェルを培地で満たし、総容量２５０μＬでの試験化合物または緩衝液を添加して、アッセイを開始する。細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートする。上清をマイクロタイタープレートに移し、乾燥するまで７５℃にて、吸引オーブン内で蒸発させる。次いで試料を２５μＬの滅菌水に溶解し、かつ再び懸濁させる。シンチラント（３００μＬ）をそれぞれのウェルに添加して、試料をトリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）プレート測定器内で３Ｈを計測する。データを非線形回帰およびＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍパッケージ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で利用可能な統計学的技術を用いて解析する。
【０１９５】
イノシトールリン酸アッセイ
ＳＮＯＲＦ２５受容体を介したイノシトールリン酸（ＩＰ）二次メッセンジャー経路の活性化は、ＩＰ産物を放射分析測定することによって査定できる。
【０１９６】
９６ウェルマイクロプレート形式のアッセイにおいて、細胞を７０，０００細胞／ウェルの密度でおき、２４時間インキュベートする。次いで０．５μＣｉの［３Ｈ］−ミオ−イノシトールで３７℃、５％ＣＯ２にて一晩、細胞を標識化する。アッセイの直前に培地を取り除き、９０μＬの１０ｍＭ ＬｉＣｌ含有ＰＢＳに置き換える。次いでプレートを３７℃で１５分間、５％ＣＯ２にてインキュベートする。インキュベーションの後、細胞をアゴニスト（１０μｌ／ウェル、１０×濃度）で３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて感作する。１００μＬの５０％ｖ／ｖ トリクロロ酢酸の添加して感作を終了させ、続いて３０分以上の間の４℃でのインキュベーションする。総ＩＰｓをイオン交換クロマトグラフィーにて溶解物から単離する。簡単には、溶解したウェルの含有物を、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８（２００〜４００メッシュ、フォーマット形態）を含むマルチスクリーン ＨＶ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＶ）フィルタープレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移す。それぞれのウェルに対して１００μＬのＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液（５０％ｖ／ｖ、水：樹脂）を加えて、フィルタープレートを調製する。フィルタープレートをバキュームマニホルド上に置いて、樹脂ベットを洗浄または溶出する。まず２００μｌの５ｍＭ ミオ−イノシトールでそれぞれのウェルを２回洗浄する。総［３Ｈ］リン酸イノシトールを７５μｌの１．２Ｍギ酸アンモニウム／０．１Ｍ ギ酸溶液で９６ウェルプレートに溶出する。２００μＬのシンチレーションカクテルをそれぞれのウェルに加え、放射活性を液体シンチレーション計数管にて測定する。
【０１９７】
細胞内カルシウム流動アッセイ
細胞内遊離カルシウム濃度は、蛍光指示色素Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｂｕｓｈら、１９９１）を使用して微量分光蛍光計によって測定しうる。カバーガラス挿入物を含む３５ｍｍ培養ディッシュ上に、受容体を発現している細胞をまき、一晩接着させる。次いで細胞をＨＢＳにて洗浄し、１００μＬのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）で２０〜４０分間ロードする。細胞をＨＢＳで洗浄してＦｕｒａ−２／ＡＭ溶液を除去した後、細胞をＨＢＳで１０〜２０分間平衡化する。次いで細胞をライツ フルオバート ＦＳ（Ｌｅｉｔｚ Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳ）顕微鏡の４０×対物レンズ下で視覚化し、励起波長を３４０ｎＭ〜３８０ｎＭの間で変化させて５１０ｎＭで蛍光放出を測定する。生の蛍光データを標準カルシウム濃度曲線およびソフトウェア解析技術を用いてカルシウム濃度に変換する。
【０１９８】
他の方法において、細胞内カルシウムの測定はまた、９６−ウェル（またはそれ以上）形式にて他のカルシウム感受性指示薬で実施でき、そのような指示薬の好ましい例は、エクオリン、フルオ−３（Ｆｌｕｏ−３）、フルオ−４、フルオ−５、カルシウム グリーン−１（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ−１）、オレゴン グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）、および４８８ＢＡＰＴＡである。受容体をアゴニストリガンドで活性化した後、細胞内カルシウム濃度の変化によって誘発される放射を照度計、または蛍光イメージャーによって測定してもよく、この好ましい例は、蛍光イメージャープレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）である。
【０１９９】
対象の受容体を発現する細胞を、８０，０００〜１５０，０００細胞／ウェルの密度で透き通った平底黒色壁９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上にプレートし、５％ＣＯ２、３７℃にて４８時間インキュベートさせる。培養液を吸引し、１００μｌのフルオ−３色素を含むローディング緩衝液をそれぞれのウェルに添加する。ローディング培地は、ハンクスＢＳＳ（フェノールレッドなし）（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．１または１％ＢＳＡ（シグマ）、色素／プルロン酸混合液（たとえば、１ｍＭ Ｆｌｕｏ−３、ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）および１０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用直前に混合する）、および２．５ｍＭプロベネシッド（シグマ）（新鮮に調製する）を含む。細胞を５％ＣＯ２、３７℃にて約１時間インキュベートする。
【０２００】
色素ローディングインキュベーションの間、化合物プレートを調製する。化合物を洗浄緩衝液（ハンクスＢＳＳ（フェノールレッドなし）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ プロベネシッド）中に４×最終濃度まで希釈し、透き通ったｖ底プレート（Ｎｕｎｃ）内に分液する。インキュベーションに続いて、過剰な色素を取り除くために細胞を洗浄する。穏やかに細胞を洗浄するためにＤｅｎｌｅｙプレート洗浄機を４回使用し、それぞれのウェルに１００μｌの最終容量の洗浄緩衝液を残す。細胞プレートをＦＬＩＰＲの中心トレーにおき、化合物プレートをＦＬＩＰＲの右トレーにおく。実験のためにＦＬＩＰＲソフトウェアを準備し、実験を行い、データを回収する。次いでエクセル表計算プログラムを用いてデータを解析する。
【０２０１】
アンタゴニストリガンドは、アゴニストリガンドによって誘発されたシグナルの阻害によって同定する。
【０２０２】
ＧＴＰγＳ機能性アッセイ
受容体を発現する細胞由来の膜を、プロテアーゼ阻害剤（たとえば０．１％バシトラシン）の存在下または非存在下において、アッセイ緩衝液（たとえば、５０ｍ ＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ ＧＤＰ、ｐＨ７．４）中に懸濁させる。膜を氷上で２０分間インキュベートし、９６−ウェル ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マイクロタイターＧＦ／Ｃフィルタープレートに移し、ＧＴＰγ３５Ｓ（たとえば、２５０，０００ｃｐｍ／試料、特異的活性−１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）プラスまたはマイナス非標識ＧＴＰγＳ（最終濃度＝１００μＭ）と混合する。最終膜タンパク質濃度＝９０μｇ／ｍｌ。試料を室温にて３０分間、試験化合物の存在または非存在下でインキュベートし、次いでミリポアバキュームマニホールドで濾過し、冷（４℃）アッセイ緩衝液にて３回洗浄する。試料をフィルタープレートに回収し、シンチラントで処理し、トリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）（Ｗａｌｌａｃ）液体シンチレーション計数管で３５Ｓを計測する。受容体膜プレパレーションが適切に作製された外来発現系、すなわち受容体を高レベルで発現する結果となる、および／または高い代謝率を持つＧ−タンパク質（ＧＤＰのＧＴＰへの変換のため）を発現する発現系に由来する場合、最適な結果がえられることが予測される。ＧＴＰγＳアッセイは当業者に周知であり、Ｔｉａｎら（１９９４）またはＬａｚａｒｅｎｏ ａｎｄ Ｂｉｒｄｓａｌｌ（１９９３）などに記述された上記方法の変法を使用してもよいと思われる。
【０２０３】
微小生理学的測定アッセイ
細胞代謝は、（多重メッセンジャー経路による受容体活性化を含む）広範囲の細胞事象に複雑に関わっているので、細胞代謝の微小生理学的測定を使用により、原則として、受容体のシグナル伝達系路の特性に関わらず、任意の受容体の活性化によって生じる細胞の活性化に対する一般的なアッセイが提供される。
【０２０４】
一過性受容体発現、細胞プレパレーション、および微小生理学的測定記録に関する一般的なガイドラインは他（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＯｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．，１９９６）に記載されている。一般的に、受容体を発現する細胞を回収し、実験の２４時間前に、３×１０５細胞あたり微小生理学的測定計カプセルとして完全培地中にまく。培地を記録の１６時間前に無血清培地に置き換えて、多種類かつ病気を定義する血清因子による非特異的代謝刺激を最小化する。実験の日に、細胞カプセルを微小生理学的測定計に移し、記録培地（０．１％脂肪酸なしＢＳＡを含む低緩衝ＲＰＭＩ １６４０、重炭素酸なし、血清なし（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中で平衡化し、その間、基準代謝活性の基準線測定を確立する。
【０２０５】
標準記録プロトコルは、酸性化の速度測定を行う際に、３０秒間の流速中断を含む２分間の総ポンプサイクルを使用し、１００μｌ／分流速により特定する。リガンド感作は、最初の感作後速度測定を行う直前に、試料に１分２０秒間曝露することを含み、続いて試料を合計５分２０秒間の曝露する２回のさらなるポンプサイクルを含む。一般的に、一次スクリーニングにおける薬物は、１０μＭ最終濃度にて細胞に提示する。次いで、活性な化合物の濃度依存性を試験するための実験の経過観察は、閾値から最大レベルまでの範囲における応答を作製するのに必要な量を超える薬物濃度範囲で、細胞を連続的に感作することにより行われる。次いでリガンド試料を洗い流し、報告された酸性化速度を、感作直前に観察した基準線速度に対するピーク応答の増加割合として表す。
【０２０６】
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）を、受容体の活性化を評価するためにモニターしてよい。ＭＡＰキナーゼは、細胞内で多数の経路によって活性化される。活性化の初期様式には、ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ経路が含まれる。成長因子（チロシンキナーゼ）受容体は、ＳＨＣ／Ｇｒｂ−２／ＳＯＳ／ｒａｓを介してこの経路内に入る。Ｇｉ共役受容体はまた、ｒａｓを活性化することが知られており、その後ＭＡＰキナーゼの活性化を産出することが知られている。ホスホリパーゼＣ（Ｇｑ／Ｇｌｌ−共役のような）を活性化する受容体は、ホスファチジルイノシトールを加水分解した結果としてジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産出する。ＤＡＧは、次にＭＡＰキナーゼをリン酸化するタンパク質キナーゼＣを活性化する。
【０２０７】
ＭＡＰキナーゼ活性化は、さまざまなアプローチによって検出できる。１つのアプローチは、リン酸化されていない（不活性）、またはリン酸化されている（活性）かいずれかをリン酸化状態を評価することに基づく。リン酸化されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、よりゆっくりした移動度を持つので、ウエスタンブロッティングを用いて未刺激タンパク質と比較できる。あるいは、リン酸化タンパク質に特異的な抗体が入手可能であり（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、リン酸化されたキナーゼの増加を検出するために使用できる。他の方法では、細胞を試験化合物で刺激し、次いでＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、電気泳動によってニトロセルロース、またはＩｍｍｂｉｌｏｎにタンパク質を転写する。標準的なウエスタンブロッティング技術によって免疫活性バンドを検出する。可視または化学蛍光シグナルをフィルム上に記録し、濃度計によって定量してよい。
【０２０８】
他のアプローチは、リン酸化アッセイを介したＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細胞を試験化合物で刺激し、可溶性抽出物を調製する。ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生成系、およびインスリンまたはＰＨＡＳ−Ｉによって調節される熱および酸に安定なリン酸化タンパク質などのＭＡＰキナーゼに特異的な基質と共に、抽出物を３０℃で１０分間インキュベートする。
【０２０９】
Ｈ３ＰＯ４の添加によって反応を停止し、試料を氷に移した。一部分をＷｈａｔｍａｎ ＰＢ１ クロマトグラフィー紙（リン酸化タンパク質を保持する）上にスポットした。クロマトグラフィー紙を洗浄し、液体シンチレーション計数管で３２Ｐを計数する。あるいは、細胞抽出物をガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生成系、ストレプトアビジンによってフィルター支持体に結合させたビオチン化ミエリン塩基性タンパク質と共にインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は活性化したＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応を３０℃で１０分間実施する。次いでミエリン塩基性タンパク質を保持するフィルターを通して抽出物を吸引した。フィルターを洗浄し、液体シンチレーション計数管にて３２Ｐを計数する。
【０２１０】
細胞増殖アッセイ
前記受容体の受容体活性化は、分裂促進または増殖応答を引き起こす可能性がある。これは、３Ｈ−チミジン取り込みを介してモニタできる。培養した細胞を３Ｈ−チミジンと共にインキュベートすると、チミジンは核内に移動し、そこでチミジン三リン酸にリン酸化される。次いでヌクレオチド三リン酸は、細胞増殖の速度に比例した速度で細胞のＤＮＡに取り込まれる。一般的に、細胞は１〜３日間、培養液中で増殖させる。２４時間血清を取り除くことによって細胞を静止させる。次いで分裂促進剤を培地に加える。２４時間後、１〜１０μＣｉ／ｍｌの範囲の特異的活性の３Ｈ−チミジンとともに、細胞を２〜６時間インキュベートする。回収手順は、トリプシン処理、およびＴＣＡと前インキュベーションして、またはせずにＧＦ／Ｃフィルターで濾過することによって細胞をトラップして、可溶性チミジンを抽出することを含んでもよい。フィルターをシンチラントで処理し、液体シンチレーション計数管によって３Ｈに関して計数する。あるいは、接着細胞をＭｅＯＨまたはＴＣＡで固定てし、水で洗浄し、０．０５％デオキシクロレート／０．１Ｎ ＮａＯＨで可溶化する。可溶性抽出物をシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーション計数管にて３Ｈに関して計数する。
【０２１１】
あるいは、受容体をトランスフェクトするのに使用した細胞株に発現された内因性または外因性遺伝子産物の発現を測定することによって、細胞増殖をアッセイすることができる。この測定は、蛍光強度、酵素的活性、免疫応答性、ＤＮＡハイブリット形成、ポリメラーゼ連鎖反応など方法によって検出できるが、限定されない。
【０２１２】
乱交雑二次メッセンジャーアッセイ
前記細胞の任意の与えられた受容体における多くの異なったシグナル伝達のいずれを通常使用するかを、推測的に、およびＧＰＣＲ配列に基づいただけで予測することは不可能である。しかしながら、乱交雑なＧαサブユニットを使用することにより、事前に選択された経路を介して、機能的分類の異なった受容体にシグナルを誘導することは可能である。たとえば、Ｇα１５またはＧα１６のような乱交雑Ｇｉサブユニット、またはＧαｑｚのようなキメラＧαサブユニット、ＧＰＣＲ（これらは特異的なシグナル伝達（たとえばＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ０など）を介して結合することが通常好まれるであろう）は、これらを内因性に供給する細胞に基づいた受容体アッセイ系を提供することによって、乱交雑なＧαサブユニットによって限定された経路を介して結合して、アゴニスト活性化において、そのサブユニットの経路に付随する二次メッセンジャーを産出するることが可能である。Ｇα１５、Ｇα１６および／またはＧαｑｚの場合、Ｇｑ経路の活性化および二次メッセンジャーＩＰ３の産出は、これを含むかもしれない。同様の戦略および材料を使用することにより、たとえばＣａ＋＋、ｃＡＭＰおよびＫ＋電流などの他の二次メッセンジャーを産出している経路を介した受容体シグナル伝達に偏らせることが可能である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９９）。
【０２１３】
外因的に供給したＧαサブユニットと受容体の乱交雑な相互作用は、可能性のあるそれぞれのシグナル伝達経路に対して異なるアッセイを実施する必要性を減らし、受容体活性化における機能的なシグナルを検出する機会を増加させる。
【０２１４】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞の電流を記録するための方法
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）より卵母細胞を回収し、すでに記述したようにｍＲＮＡ転写物を注入する（Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｌｅｓｔｅｒ，１９９４、Ｓｍｉｔｈら、１９９７）。本発明の試験受容体およびＧαサブユニットＲＮＡ転写物は、遺伝子の完全コード領域を含む直線化したプラスミド、またはＰＣＲ産物からＴ７ポリメラーゼ（「メッセージ マシーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｃｈｉｎｅ）」 Ａｍｂｉｏｎ）を用いて合成する。卵母細胞に１０ｎｇの合成受容体ＲＮＡを注入し、１７℃にて３〜８日間インキュベートする。結合してＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流を観察するために、記録する３〜８時間前に卵母細胞に５００ｐｇの乱交雑なＧαサブユニットｍＲＮＡを注入する。１〜２ＭＯｈｍの抵抗を持つ３Ｍ ＫＣｌ充填ガラスマイクロ電極を使用して、二電極電流クランプ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）が実施される。他に特定しない限り、卵母細胞は−８０ｍＶの保持電位で電圧固定する。記録の間、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５（ＮＤ９６）を含む連続的に流れる（１〜３ｍｌ／分）培地中に卵母細胞を浸す。薬物を、卵母細胞から０．５ｍｍの距離に固定された１０μｌのガラスキャピラリーチューブによる局所散布によって、または連続した重力供給散布ラインからスイッチングすることによって、いずれかによって供給される。
【０２１５】
受容体ｍＲＮＡと、Ｇ−タンパク質で活性化される内向整流チャネル（ＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ４、米国特許第５，７３４，０２１号および第５，７２８，５３５号、またはＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ２）の遺伝子をコードする合成ｍＲＮＡとの混合物、または任意の他の好ましい組合せ（たとえばＩｎａｎｏｂｅら、１９９９を参照のこと）を他の卵母細胞に注入してもよい。Ｇ−タンパク質内向整流Ｋ＋（ＧＩＲＫ）チャネル１、２および４（ＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ２およびＧＩＲＫ４）をコードする遺伝子は、適切な５’および３’プライマーを駆使するために、公表されている配列を用いたＰＣＲによって得てもよい（Ｋｕｂｏら、１９９３、Ｄａｓｃａｌら、１９９３、Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら、１９９５および１９９５ｂ）。ヒト心臓または脳ｃＤＮＡを、適切なプライマーと共にテンプレートとして使用してよい。
【０２１６】
アフリカツメガエル卵母細胞においてＧＰＣＲｓを外因性に発現することは、アゴニスト刺激によって活性化されるシグナル伝達系路を同定するために広く使用されてきた（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、１９８３、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８７）。ＳＮＯＲＦ２５受容体に対するｍＲＮＡが先に注入された卵母細胞に、ＮＤ９６溶液中の試験化合物を添加して、約−８０ｍＶの保持電位における内向電流を観察することによって、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路の活性化をアッセイする。−２５ｍＶで逆転し、Ｃａ＋＋で活性化されたＣｌ−チャネルに他の特性を示す電流が出現することにより、ＰＬＣの受容体活性化およびＩＰ３および細胞内Ｃａ＋＋の放出が示される。このような活性化は、ＧｑまたはＧ１１と結合するＧＰＣＲｓによって示される。
【０２１７】
ＧＰＣＲ刺激によるＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流に、Ｇ−タンパク質のＧｉ／０クラスが関与することを、Ｇｉ／ｏ Ｇ−タンパク質を不活性化する毒素であるＰＴＸを使用して評価する。卵母細胞に２５ｎｇのＰＴＸ／卵母細胞を注入して、ＳＮＯＲＦ２５受容体によってＣａ＋＋で活性化されたＣｌ−電流が調節されることを２〜５時間連続的に評価する。
【０２１８】
細胞内ｃＡＭＰの上昇は、卵母細胞内に嚢胞性線維症膜伝導性レギュレーター（ＣＦＴＲ）（そのＣｌ−選択的な孔が、タンパク質キナーゼＡによるリン酸化に応答して開く（Ｒｉｏｅｄａｎ，１９９３））が発現することよってモニターできる。卵母細胞に発現するＲＮＡ転写物を調製するために、ＣＦＴＲ遺伝子の公表された配列（Ｒｉｏｒｄａｎ，１９９３）に由来する５’および３’プライマーを使用したＰＣＲによりテンプレートを作製した。５’プライマーは、Ｔ７ポリメラーゼをコードする配列を含んでいたため、転写物はクローニングせずにＰＣＲ産物から直接、作製されるであろう。１０〜１５ｎｇのＳＮＯＲＦ２５のｍＲＮＡに加えて１０ｎｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡを卵母細胞に注入した。１８℃にて、２〜３日間のインキュベーションした後に、ＮＤ９６中で電気生理学的記録を行った。１〜２ＭＯｈｍの抵抗を持つ３Ｍ ＫＣｌ充填ガラスマイクロ電極を持つデュアル電極電圧クランプ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）の下で電流を記録する。他に特定しない限り、卵母細胞は−８０ｍＶの保持電位に電圧固定する。記録の間、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５（ＮＤ９６）を含む連続的に流れる（１〜３ｍｌ／分）培地中に卵母細胞を浸す。薬物を、卵母細胞から０．５ｍｍの距離に固定された１０μｌのガラスキャピラリーチューブによる局所散布によって、または連続した重力供給散布ラインからスイッチングすることによって、いずれかによって供給される。
【０２１９】
Ｇタンパク質ＧｉおよびＧｏの活性化は、内向整流Ｋ＋（カリウム）チャネル（ＧＩＲＫｓ）の活性を測定することでモニタできる。活性は、ほ乳類受容体＋ＧＩＲＫサブユニットをコードするｍＲＮＡを共注入した卵母細胞でモニターしてもよい。ＧＩＲＫ遺伝子産物は、共−集合して、ＧｉまたはＧｏと結合する多くのＧＰＣＲによって活性化される（すなわち刺激される）ことが知られている（Ｋｕｂｏら、１９９３、Ｄａｓｃａｌら、１９９３）Ｇタンパク質活性化カリウムチャネルを形成する。ほ乳類受容体＋ＧＩＲＫサブユニットを発現している卵母細胞では、４９ｍＭのＫ＋を含む上昇Ｋ＋溶液中のＫ＋電流を測定することによって、試験化合物に対する応答性をが試験される。
【０２２０】
ヒトおよびラットＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの局在
方法：蛍光遺伝子プローブのリアルタイム検出を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＳＮＯＲＦ２５ラットおよびヒトＲＮＡの局在を特徴づけるために、蛍光遺伝子プローブおよびヒト、ラット組織から抽出したｍＲＮＡのパネルを用いた定量性ＲＴ−ＰＣＲを使用した。
【０２２１】
本アッセイは、従来のＰＣＲ増幅における２種のオリゴヌクレオチド、並びにオリゴヌクレオチドの５’末端がレポーターで、および３’末端がクエンサーで標識された第３の特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する。本発明において、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）およびＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメチオキシフルオレセイン）が利用した二種のレポーターであり、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−４，７，２，７’−テトラメチルローダミン）がクエンサーである。増幅が進行することにより、標識したオリゴヌクレオチドプローブが、増幅に使用した２種のオリゴヌクレオチド間の遺伝子配列とハイブリダイゼーションする。標識化プローブを開裂させるために、Ｔａｑ、またはｒＴｔｈ温度安定ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用する。これは、レポーターからクエンサーを引き離し、生成したアンプリコンの量に直接的に比例する蛍光シグナルを生成する。この標識化プローブは、高い程度で特異性を付与する。標識化プローブがハイブリダイズしないので、非特異的増幅は検出されない。すべての実験を、ＰＥ７７００ シークエンス検出系（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実施した。
【０２２２】
定量性ＲＴ−ＰＣＲ
ＳＮＯＲＦ２５をコードするＲＮＡを検出するために、組織から抽出したｍＲＮＡで定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｒＴｔｈ温度安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、５０μｌ容量で逆転写およびＰＣＲ反応を実施した。以下の配列を持つプライマーを使用した：
ＳＮＯＲ２５ ヒト
フォワードプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−７６５Ｆ
５’−ＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧ−３’（配列番号：１８）
リバースプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−８６８Ｒ
５’−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号：１９）
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ：
ＳＮＯＲＦ２５−８１４Ｔ
５’（６−ＦＡＭ）−ＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号：２０）
ＳＮＯＲＦ２５ ラット
フォワードプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−２３１Ｆ
５’−ＧＴＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＡ−−３’（配列番号：２１）
リバースプライマー：
ＳＮＯＲＦ２５−３２９Ｒ
５’−ＧＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：２２）
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ：
ＳＮＯＲＦ２５−２７８Ｔ
５’（６−ＦＡＭ）−ＴＣＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号：２３）
これらのプライマー対を使用し、アンプリコンの長さは、ヒトＳＮＯＲＦ２５では１０４ｂｐ、ラットＳＮＯＲＦ２５では９９ｂｐである。それぞれのＲＴ−ＰＣＲ反応には５０ｎｇのｍＲＮＡが含んだ。オリゴヌクレオチド濃度は：フォワードおよびリバースプライマーが５００ｎＭ、蛍光プローブが２００ｎＭであった。各反応液中の試薬の濃度は、３００μＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、６００μＭ ＵＴＰ、３．０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２、５０ｍＭ ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、１１５ｍＭ 酢酸カリウム、８％ユニット ウラシルＮ−グリコシラーゼであった。ＲＴ−ＰＣＲ反応のための緩衝液も、受動参照として使用した蛍石を含んだ（ＲＯＸ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ特許登録受動参照Ｉ）。（ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを除く）ＲＴ−ＰＣＲに関するすべての試薬はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より得た。反応は、以下の温度循環器特性を用いて実施した。５０℃で２分間、６０℃で３０秒間、９５℃で５分間、続いて９４℃で２０秒間、６２℃で１分間を４０サイクル。
【０２２３】
ＰＣＲ反応に対するポジティブコントロールは、プラスミド構築物に由来する標的配列の増幅からなった。定量のための標準曲線は、プラスミドベクター内のヒトＳＮＯＲＦ２５遺伝子、または膵臓から抽出したＲＮＡを増幅のためのテンプレートとして使用いて構築した。ネガティブコントロールはｍＲＮＡブランク、並びにプライマーとｍＲＮＡブランクからなった。ｍＲＮＡがゲノムＤＮＡに混入していないことを確認するために、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転をせずに、ＲＣＲ反応を行った。ＲＮＡの完全性を、シクロフィリンまたはグリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡを増幅することによって査定した。逆転写およびＰＣＲ増幅に続いて、データをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ配列検出ソフトウェアを用いて解析した。それぞれのウェルからの蛍光シグナルを、内部受動参照を用いて正規化し、データを標準曲線に当てはめ、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡ発現の相対的量を得た。
【０２２４】
結果と考察
ＳＮＯＲＦ２５の全長配列のクローニング
ＧＨ１細胞およびＲｉｎ１４ｂ細胞を含む様々な組織から調整したゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを、ガラ二ン、ソマトスタチン、およびオピオイド受容体ファミリーのメンバーの第三膜貫通領域、およびガラニン受容体ファミリーのメンバーの第七膜貫通領域に基づいて設計した２つの縮重プライマーを用いたＭＯＰＡＫ ＰＣＲにかけた。この反応による３つの産物は、いずれの向きでも（前方向または逆方向）同一のクローンであった。このクローンは、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓ、ＧＳＳ、ＥＳＴ、またはＳＴＳデータベースでは見いだせない新規配列であることが分かった。それは他の既知Ｇタンパク質結合受容体と有意な相同性を含んでいた（既知受容体領域Ｄ１、ベータ−アドレナリン作用性２ｂおよび５−ＨＴ１Ｆと−２９％の同一性、５−ＨＴ受容体と３４％の同一性）。この受容体配列は後にＳＮＯＲＦ２５と命名され、上記の方法の節に記載のように５’および３’のｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）のプライマーを設計するために用いた。５’ＲＡＣＥ反応は、第一膜貫通領域、およびコザックコンセンサス配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）に囲まれた推定インフレームの開始メチオニンをコードする配列を通して配列情報を与えた。
【０２２５】
３’ＲＡＣＥ反応では、アガロースゲル電気泳動によって、６００ｂｐのバンドを得た。このバンドをＴＡクローニングキット内にサブクローニングし、単離したコロニーの配列を決定した。これらの産物の配列は、第七膜貫通領域をコードする領域の下流にインフレームの終止コドンが存在することを明らかにした。ＳＮＯＲＦ２５のコード配列全体の大きさは、１００５ｂｐであり、３３５のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると決定された。２つのプライマー、ＪＡＢ８６とＪＡＢ８４は、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ ＰＣＲ系を用いて、Ｒｉｎ１４ｂ細胞系ｃＤＮＡおよびラットゲノムＤＮＡ由来のコード配列全体を増幅するために使用した。この反応のためのプライマーは、５’および３’プライマーそれぞれの５’末端に組み込まれたＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を持つＳＮＯＲＦ２５の５’および３’非翻訳領域に特異的であった。これらの反応産物をｐｃＤＮＡ３．１（−）にサブクローン化し、配列を決定したところ、Ｒｉｎ１４ｂクローンおよびゲノムクローンの配列が同一であることが分かり、ラットＳＮＯＲＦ２５を含むベクター構築物をｐｃＤＮＡ３．１−ｒＳＮＯＲＦ２５と命名した。
【０２２６】
全長クローンのアミノ酸配列の疎水性（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）分析では、７つの疎水性領域が存在することを示し、それはＧタンパク質結合受容体の７つの膜貫通領域と一致する。予想される７つの膜貫通領域を図４に示す。ラットＳＮＯＲＦ２５ヌクレオチドおよびペプチド配列とＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓデータベースに含まれる配列との比較により、この受容体のアミノ酸配列がヒスタミン、アデノシン、セロトニン、ベータアドレナリン作用性、およびドーパミン受容体ファミリーに最も関連性があることを示し、これらの受容体は全体にわたり２５−３０％一致性の示しす。Ｎ−およびＣ−末端は比較的短く、アデノシン受容体ファミリーにより似ている。しかしながら、膜貫通領域の解析では、この受容体が、他のＧＰＣＲの膜貫通領域内と有意な程度の同一性を共有することを示す。ＳＮＯＲＦ２５の全ての膜貫通領域と、ＧＰＣＲ膜貫通領域の総合的なリストとの同時比較では、ＳＮＯＲＦ２５の膜貫通領域が、ベータアドレナリン作用性受容体１および２とそれぞれ３１％および３２％、並びに５−ＨＴおよび５−ＨＴ５８受容体とそれぞれ３２％および３６．６％の最も高い程度で同一性を持つことを示唆しうる。膜貫通領域をＦＡＳＴＡ検索により個々に分析すると、ＳＮＯＲＦ２５は、様々な既知Ｇタンパク質結合受容体とかなりの類似性を示す。
【０２２７】
ＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体をクローン化するために、ラットＳＮＯＲＦ２５の第二および第五膜貫通領域に基づいて設計した標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒトゲノムコスミドライブラリーをストリンジェントな培地でスクリーニングした。およそ２２５，０００のスクリーニングされたコロニーの中から、２つのコロニーをプローブとハイブリダイゼーションさせた。それぞれのコロニーを単離、解析後、これらの２つのコロニーがＳＮＯＲＦ２５のヒト相同体を含む同一のコスミドであると決定した。このコスミドのいくつかの制限切断物によるサザンブロット解析、およびその後の陽性バンドのシーケンスにより、このコスミドのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断物が、このヒトクローンの全長コード配列を含む１．９ｋｂの断片として得られたことが示された。ｐＥＸＪＴ３Ｔ７ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローン化したヒト受容体の構築物は、ｐＥＸＪＴ３Ｔ７−ｈＳＮＯＲＦ２５と命名した。ヒトＳＮＯＲＦ２５は、ラットＳＮＯＲＦ２５に対して８０％のＤＮＡ一致性および８３％のアミノ酸一致性を示した。ラット受容体と同様に、ヒトＳＮＯＲＦ２５のタンパク質コード領域は、１００５ヌクレオチド（図１Ａ〜１Ｂ）であり、３３５のアミノ酸からなるタンパク質をコードする（図２Ａ〜２Ｂ）。ラットＳＮＯＲＦ２５のＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれぞれ図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂに示す。
【０２２８】
ＧｅｎＥＭＢＬ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｌｕｓ、ＥＳＴ，ＳＴＳ、およびＧＳＳデータベースの検索により、ヒトＳＮＯＲＦ２５もまた固有の新規配列であることが確かめられた。ラットＳＮＯＲＦ２５との一致性の他に、アデノシン２ａ、５−ＨＴ４Ｌ、５−ＨＴ４Ｓ、５−ＨＴ６、および５−ＨＴ７、ドーパミンＤ１およびＤ３、そしてソマトスタチン５受容体と全体で２８〜３０％の一致性を共有する。また、アデノシンＡ１、ヒスタミンＨ１および２、ベータアドレナリン作用性１、およびソマトスタチン２および３受容体と２５−２６％の一致性を持つ。ヒトＳＮＯＲＦ２５の全ての膜貫通領域と、ＧＰＣＲ膜貫通領域の総合的なリストを同時に比較することにより、ヒトＳＮＯＲＦ２５の膜貫通領域がベータ１および２アドレナリン作用性受容体（それぞれ２９％および３２％）および５−ＨＴ４に対して最も高い程度の一致性を持つことが示唆されうる。ヒトＳＮＯＲＦ２５の個々の膜貫通領域は、他のいくつかのＧタンパク質結合受容体に由来する膜貫通領域と有意な一致性を持つ。
【０２２９】
ラットおよびヒト両方のＳＮＯＲＦ２５は、それらのアミノ酸配列中にいくつかの潜在的タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化モチーフを持つ。どちらの受容体においても、スレオニン７３、セリン７９、およびセリン３０９が潜在的ＰＫＣリン酸化部位である。ヒト受容体は、セリン２１４にさらなる推定ＰＫＣリン酸化部位を持つ（それはラットＳＮＯＲＦ２５ではプロリンである）。両方の受容体が、セリン３２９に潜在的カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）リン酸化部位を共有する。またヒトＳＮＯＲＦ２５は、さらに２つの潜在的ＣＫＩＩリン酸化部位、スレオニン２１７およびセリン３３１を持ち、それらはラット受容体には存在しない。逆に、ラットＳＮＯＲＦ２５はチロシン３２３に潜在的チロシンリン酸化部位を持ち、それはヒト受容体には存在しない。
【０２３０】
ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞のｃＡＭＰ応答
エレクトロポレーションを用いて、ＣＨＯ細胞内にＳＮＯＲＦ２５ ｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ）をトランスフェクトした。プレーティングした後、これらのリガンドの受容体とＳＮＯＲＦ２５の相同性（上記参照）に基づいて、その他の物質中にヒスタミン、アデノシン、セロトニン、ノルエピネフリン、およびドーパミンなどの在来の神経伝達物質のいくつかを含むリガンドライブラリーで前記トランスフェクタントを感作し、上記のモックがトランスフェクトされた細胞がｃＡＭＰまたはＩＰ放出を刺激する能力を試験した。興味深いことに、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞の基礎ｃＡＭＰレベルは、モックがトランスフェクトされた細胞よりも有意に高かった（＞１０倍）（図５）。この観察結果は、ＳＮＯＲＦ２５受容体が機能的にｃＡＭＰ刺激経路に結合しうることを示唆する。試験したリガンドの中で、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）だけが、モックがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中においてこれらの要素に影響を与えずに、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞のｃＡＭＰを有意に増加させたが、ＩＰ放出は増加させなかった。ＡＴＲＡ濃度１０μＭで起こった応答（上記基礎の２〜５倍）は、アデニルシクラーゼの強力な直接的刺激物質であるホルスコリンによって産生されるものに匹敵する（図６）（ｎ＝３）。
【０２３１】
モックおよびＳＮＯＲＦ２５がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞におけるホルスコリンに対する応答は、ほとんど同一であることから（図６）、ＳＮＯＲＦ２５を発現する細胞において観察されたＡＴＲＡに対する増強された最大応答（モックＤＮＡトランスフェクト細胞に比べて）が、細胞密度または細胞固有の性質が変化したためではないことが示唆される。ＡＴＲＡに近い類似体である全トランスレチノール（ビタミンＡ１）は、１０μＭでｃＡＭＰを増加させなかった（図６）。
【０２３２】
続く実験では、Ｃｏｓ−７細胞においても観察されたので、ＡＴＲＡで誘導されるｃＡＭＰ形成の増加が、宿主細胞に依存しないことを実証された（ｎ＝３）（図７）。全トランスレチノイン酸が、ドーパミンＤ１、Ｄ５、セロトニン５−ＨＴ４および５−ＨＴ６受容体を含むほかの既知シクラーゼ刺激性受容体がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞において、何の応答も起こさなかったことから、ＡＴＲＡで観察された応答が、ＳＮＯＲＦ２５トランスフェクト細胞に特有であることを示している(図７)。
【０２３３】
Ｃｏｓ−７細胞におけるＡＴＲＡに対するｃＡＭＰ応答は、ＥＣ５０値がおよそ０．２〜１μＭであり、およびＥｍａｘがおよそ２００〜３００％であり濃度依存的である（図８）。
【０２３４】
ＳＮＯＲＦ２５を発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵細胞におけるカルシウムで活性化されるＣＩ−流動の活性化
細胞内ｃＡＭＰの増加は、嚢胞性繊維症膜貫通伝導性レギュレーター（ＣＦＴＲ）（タンパク質キナーゼＡによるリン酸化に応答して、そのＣＩ−選択的な孔が開く）の発現により卵細胞中で観測することができる（Ｒｉｏｒｄａｎ，１９９３）。従って、ＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡ、およびＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを共に注入した卵細胞において、ＳＮＯＲＦ２５の活性を試験した。これらの卵母細胞３９個のうち１７個において、１０μＭの全トランスレチノイン酸の投与に応答して、内部ＣＩ−の流動（１０５±２０ｎＡ）が測定された（図９Ａ〜９Ｃおよび１０を参照のこと）。
【０２３５】
ＣＦＴＲチャンネルをコードするｍＲＮＡのみを注入した他の卵細胞では、そのような流動が観察されなかったので、この応答はＳＮＯＲＦ２５の発現に特異的であった。β２−アドレナリン作用性受容体（Ｂ２ＡＲ）を注入した卵細胞において、同様の流動が観察されたが（図９Ｃ参照）、ＳＮＯＲＦ２５発現卵細胞により生じる流動は大体２〜３倍遅く、少なかった。全トランスレチノイン酸は、ＣＦＴＲ欠損卵細胞におけるＣｌ−流動を刺激しないことから、Ｇｑ−を介したホスホリパーゼＣ経路が活性化されなかったことを示している。ＧＰＣＲ結合ＧｉおよびＧｏをホスホリパーゼＣ経路に結合させることができるキメラＧタンパク質を発現する卵細胞においても、応答は引き起こされなかった。総合すると、これらの観察結果は、ＳＮＯＲＦ２５が全トランスレチノイン酸に結合し、（おそらくＧｓの活性化を経由して）ｃＡＭＰの産生を刺激するＧＰＣＲをコードするという仮説が支持される。
【０２３６】
他の系において、全トランスレチノイン酸は、いくつかの核受容体の１つを刺激する（背景を参照のこと）。これにより１以上の遺伝子の転写が増強される。卵母細胞におけるＳＮＯＲＦ２５の発現は、通常の非注入卵細胞には存在しない、全トランスレチノイン酸の核受容体（刺激された時に、ｃＡＭＰの増大を生じる）を発現させる。この場合、レチノイン酸は必ずしもＳＮＯＲＦ２５受容体に結合しないが、レチノイン酸の既知または新規核受容体に作用するであろう。このようなレチノイン酸が間接的に作用する機構は、なぜリガンドが卵細胞の６群のうち３群でＣＦＴＲ応答を誘発しなかったか（３９の卵細胞中１７）、またなぜＢ２アドレナリン作用性受容体などのよく特徴づけられたＧＰＣＲの活性化によって、応答が引き起こされた条件下で観察されるものよりもＣＦＴＲの活性化速度が２〜３倍遅かったかを説明しうる（図９Ｃ）。それにもかかわらず、レチノイン酸によるＣＦＴＲの活性化の遅延は約１０秒でのオーダーであり、核受容体の活性化は、一般的に数分から数時間の範囲である。したがって、我々は、レチノイン酸活性化の間接的機構を除外できないが、ＳＮＯＲＦ２５を発現する卵細胞の応答における相対的に急速な開始が、そのような機構があり得ないことを示唆している。
【０２３７】
ヒトＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの検出
多数の組織（表１に一覧してある）からｍＲＮＡを単離し、記載したように分析した。
【０２３８】
蛍光遺伝子プローブを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、アッセイしたほとんどの組織で、ヒトＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡが発現していることが実証された（表１）。ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの最高レベルは、膵臓、胃、小腸および胎児の肝臓で見られ、他の場所ではそれよりも低いレベルであった。ほとんどの神経系の構成体では末梢の器官に比べＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの発現が少なかった。
【０２３９】
ＳＮＯＲＦ２５発現の最高レベルは膵臓で見られた。膵臓は、様々な普遍的活性物質（インスリンなど）を分泌しており、このことはＳＮＯＲＦ２５が、内分泌機構を経由しうる多様な代謝機能の調節に役割を果たしている可能性を示唆している。ＳＮＯＲＦ２５は、ラットインスリノーマ細胞株においても発現していることから、膵臓においてＳＮＯＲＦ２５が発現していることに不思議はない。この発見は、肝臓におけるＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの検出、並びにグルコースレベルの調節および糖尿病において役割をはたす可能性を示す。
【０２４０】
ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが高レベルである他の組織は、胃と小腸である。これらの組織構造に分布することは、胃腸内の運動性または吸収に関する機能と一致する。現時点では、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが平滑筋に局在するのか、または粘膜／粘膜下層に局在するのかは分からない。
【０２４１】
非常に低いレベルで検出されたが、視床および海馬構造（ＣＮＳの中で最もレベルが高い部位）を含むＣＮＳの多様な領域、およびその他の機能的で多様な領域に、ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが存在することにより、この受容体の広い調節機能、または局所的機能性が示される。
【０２４２】
ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、発生時に調節されていると思われる。胎児の肝臓におけるｍＲＮＡのレベルは、成人膵臓の測定値とほぼ等しい（８３％）。しかしながら、成人の組織では、膵臓で見られた量の１％以下に低下している。発生を通じて、ＳＮＯＲＦ２５ｍＲＮＡの甚大な変化は、肝臓の成熟における役割、または発生中のグルコース要求量／レベルを調節する役割があることを意味している。この増加に対する時間経過は調査されておらず、この受容体の機能を理解することが重要だと思われる。
【０２４３】
要約すると、ＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡの分布は、中枢神経系はもちろん、多様な器官系、内分泌機構を含む広範な調節機能に関係する。
【０２４４】
ラットＳＮＯＲＦ２５をコードするｍＲＮＡの検出
ヒトＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡの限定された分布と違って、ラットにおけるＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、広く分布している。ラットとヒトの分布における一つの著しい違いは、ラット中枢神経系で検出される高レベルのＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡである。ヒトでは、最高濃度のＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、膵臓でみられ、ＣＮＳ構造では、非常に低いレベルであった。ラットでは、最高レベルのＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡが海馬構造でみられ、次いで大脳皮質、小脳、視床下部、脈絡脈叢および骨髄において、高レベルに検出された。ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡはまた、背根および三叉神経節においても検出された。ＳＮＯＲＦ２５ ｍＲＮＡは、ラット膵臓、およびその他の末梢器官において検出されたが、ＣＮＳにおけるレベルよりもはるかに低いレベルで存在する。
【０２４５】
ラットＳＮＯＲＦ２５は、アッセイしたほとんどの組織で検出された。膵臓に加え、肺、結腸、十二指腸、卵巣、腎臓および副腎においてもかなりの量で発現した。表２に示すように、その他の組織でも少ない量で検出された。
【０２４６】
要約すると、ラットＳＮＯＲＦ２５受容体ｍＲＮＡの広い分布は、中枢神経系はもちろん、多様な器官系、内分泌機構を含む広い調節機構を意味している。ヒトとラットで見られる分布パターンの違いは、ラットではこの受容体がヒトと比較して異なった役割を持つ可能性を示唆している。
【表１】
【表２】
【参照文献】
【０２４７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳類SNORF25受容体をコードする単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸がDNAである請求項1に記載の核酸。
【請求項３】
前記DNAがcDNAである請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記DNAがゲノムDNAである請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸がRNAである請求項1に記載の核酸。
【請求項６】
前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF25受容体である請求項1に記載の核酸。
【請求項７】
請求項6に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項８】
請求項6に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、図2A-2B（配列番号2）に示されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項９】
前記ほ乳類SNORF25受容体が、ラットSNORF25受容体である請求項1に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項9に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）によってコードされる配列とアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項１１】
請求項9に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、図4A-4B（配列番号4）に示されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項１２】
精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１３】
前記ほ乳類SNORF25受容体タンパク質が、ヒトSNORF25受容体タンパク質である、請求項9に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１４】
前記ほ乳類SNORF25受容体タンパク質が、ラットSNORF25受容体タンパク質である、請求項9に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１５】
請求項1に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項6に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
細胞での発現のために適合された請求項15または16に記載のベクターであって、前記受容体をコードする核酸と動作可能に結合されてその発現を可能にする、細胞内で前記核酸を発現させるために必要な調節エレメントを含み、前記細胞が細菌、両生類、酵母、昆虫、またはほ乳類細胞であるベクター。
【請求項１８】
前記ベクターがバキュウロウイルスである請求項17に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターがプラスミドである請求項15に記載のベクター。
【請求項２０】
pEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）と命名された請求項19に記載のプラスミド。
【請求項２１】
pcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）と命名された請求項20に記載のプラスミド。
【請求項２２】
請求項18に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２３】
前記細胞が非ほ乳類細胞である請求項22に記載の細胞。
【請求項２４】
前記非ほ乳類細胞細胞がゼノパス卵母細胞またはゼノパスメラニン保有細胞である、請求項2３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞がほ乳類細胞である請求項22に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項25に記載のほ乳類細胞であって、前記細胞がCOS-7、293ヒト腎胚細胞、NIH−3T3細胞、LM（tk−）細胞、マウスY1細胞、またはCHO細胞である細胞。
【請求項２７】
前記細胞が昆虫細胞である請求項27に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項27に記載の細胞であって、前記昆虫細胞が、Sf9細胞、Sf21細胞、またはTrichoplusia ni 5B-4細胞である細胞。
【請求項２９】
請求項22、23、25、26、27、または28のいずれか一項に記載の細胞から単離された膜プレパレーション。
【請求項３０】
ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３１】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３２】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３３】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図3A-3B（配列番号3）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３４】
前記核酸がDNAである、請求項32または33に記載の核酸プローブ。
【請求項３５】
前記核酸がRNAである、請求項32または33に記載の核酸プローブ。
【請求項３６】
前記RNAの転写を阻害するために、請求項5に記載のRNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ゲノムDNAの転写を阻害するために、請求項5に記載のゲノムDNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項36または37に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、化学的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項1に記載の核酸によってコードされるほ乳類SNORF25受容体に結合することが可能な抗体。
【請求項４０】
請求項39に記載の抗体であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF25受容体またはラットSNORF25受容体である抗体。
【請求項４１】
請求項39の抗体とほ乳類SNORF25受容体との結合を、競合的に阻害することが可能な薬剤。
【請求項４２】
前記抗体がモノクローナル抗体、または抗血清である請求項39に記載の抗体。
【請求項４３】
（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、請求項36に記載のオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項43に記載の医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドがmRNAを不活性化する物質と結合された医薬組成物。
【請求項４５】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記mRNAを不活性化する物質がリボザイムである医薬組成物。
【請求項４６】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容可能なキャリアは、細胞のほ乳類SNORF25受容体と結合する構造物を含み、前記受容体は該構造物と結合した後に、前記細胞に取り込まれることが可能な医薬組成物。
【請求項４７】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容可能なキャリアは、選択された細胞タイプに特異的なほ乳類SNORF25受容体と結合することが可能である医薬組成物。
【請求項４８】
リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な請求項39に記載の抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項４９】
請求項1に記載のほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAを発現するトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５０】
天然のほ乳類SNORF25受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５１】
トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、請求項1に記載のほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５２】
請求項49または50に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類であって、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが、さらに誘導可能なプロモーターを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５３】
請求項49または50に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類であって、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが、さらに組織特異的調節エレメントを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５４】
前記トランスジェニック非ヒトほ乳類がマウスである、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５５】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法。
【請求項５６】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法。
【請求項５７】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF25受容体である方法。
【請求項５８】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）によってコードされるヒトSNORF25受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項５９】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図2A-2B（配列番号2）に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６０】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図2A-2B（配列番号2）に示される配列と同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６１】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ラットSNORF25受容体である方法。
【請求項６２】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）によってコードされるヒトSNORF25受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６３】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図4A-4B（配列番号4）に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６４】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図4A-4B（配列番号4）に示される配列と同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６５】
請求項55または56に記載の方法であって、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない方法。
【請求項６６】
請求項65に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項６７】
請求項55または56に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項６８】
請求項55または56に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項６９】
請求項68に記載の方法であって、前記細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項７０】
請求項69に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞が、COS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項７１】
請求項68に記載の方法であって、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である方法。
【請求項７２】
請求項71の方法によって同定された化合物。
【請求項７３】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法。
【請求項７４】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法。
【請求項７５】
請求項73または74に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項７６】
請求項73または74に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がラットSNORF251受容体である方法。
【請求項７７】
請求項73または74に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項７８】
請求項73または74に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項７９】
請求項77に記載の方法であって、前記細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項８０】
請求項79に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項８１】
請求項80に記載の方法であって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である方法。
【請求項８２】
請求項81の方法によって同定された化合物。
【請求項８３】
ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法。
【請求項８４】
ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法。
【請求項８５】
請求項83または84に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項８６】
請求項83または84に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がラットSNORF252受容体である方法。
【請求項８７】
請求項83または84に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項８８】
請求項87に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項８９】
請求項88に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、LM（tk−）細胞、CHO細胞、マウスY1細胞、又NIH−3T3細胞、である方法。
【請求項９０】
ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを請求項30、31、32、または33のいずれかに記載の核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法。
【請求項９１】
細胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と請求項39に記載の抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法。
【請求項９２】
ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、請求項49に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法。
【請求項９３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する請求項49に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法。
【請求項９４】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法。
【請求項９５】
請求項94に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項９６】
請求項94に記載の方法によって同定されたアンタゴニスト。
【請求項９７】
請求項96のアンタゴニストおよびキャリアとを含む組成物。
【請求項９８】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、請求項97に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法。
【請求項９９】
ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法。
【請求項１００】
請求項99に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１０１】
請求項99に記載の方法によって同定されたアゴニスト。
【請求項１０２】
請求項101に記載の方法によって同定されたアゴニストおよびキャリアを含む組成物。
【請求項１０３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、請求項102に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法。
【請求項１０４】
ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 請求項1に記載のほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法。
【請求項１０５】
請求項104に記載の方法であって、特定のほ乳類対立遺伝子の活性に関連する疾患を診断する方法。
【請求項１０６】
請求項12に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法。
【請求項１０７】
請求項12に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法。
【請求項１０８】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法。
【請求項１０９】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法。
【請求項１１０】
請求項108または109に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１１１】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の請求項108に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１１２】
請求項111に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない組成物。
【請求項１１３】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の請求項109に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１１４】
請求項113に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない組成物。
【請求項１１５】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法。
【請求項１１６】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は内部塩素電流のレベルの増加である方法。
【請求項１１７】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は細胞内カルシウムの測定の増加である方法。
【請求項１１８】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、イノシトールリン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はイノシトールリン酸レベルの増加である方法。
【請求項１１９】
化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法。
【請求項１２０】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししか内部塩素電流レベルを増加しない方法。
【請求項１２１】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少し細胞内カルシウムレベルの測定を増加しない方法。
【請求項１２２】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答はイノシトールリン酸の放出を含み前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししかイノシトールリン酸レベルを増加しない方法。
【請求項１２３】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１２４】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項１２５】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項１２６】
請求項125に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項１２７】
請求項126に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項１２８】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない方法。
【請求項１２９】
請求項128に記載の方法によって決定される化合物。
【請求項１３０】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の請求項115、116、117、または118のいずれか一項に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１３１】
請求項130に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない組成物。
【請求項１３２】
ほ乳類SNORF25受容体活性を低下させるために効果的な量の請求項119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１３３】
請求項132に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない組成物。
【請求項１３４】
ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項１３５】
請求項134に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体およびラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１３６】
ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項１３７】
請求項136に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項１３８】
請求項134、135、136、または137のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類である方法。
【請求項１３９】
請求項138に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項１４０】
請求項139に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源であるがCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項１４１】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に有効な量の、請求項134または135に記載の方法によって同定された化合物、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１４２】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に有効な量の、請求項136または137に記載の方法によって同定された化合物、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１４３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法。
【請求項１４４】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法。
【請求項１４５】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項55、56、73、74、83、または84のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法。
【請求項１４６】
請求項145に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１４７】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項108、115、または134のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体または相同体を合成することを含む方法。
【請求項１４８】
請求項147に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１４９】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項109、119、または156のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体または相同体を合成することを含む方法。
【請求項１５０】
請求項149に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５１】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項55、56、73、74、83、もしくは84のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５２】
請求項151に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５３】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項108、115、もしくは134のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５４】
請求項153に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５５】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項109、119、もしくは136のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５６】
請求項155に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１】
ほ乳類SNORF25受容体をコードする単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸がDNAである請求項1に記載の核酸。
【請求項３】
前記DNAがcDNAである請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記DNAがゲノムDNAである請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸がRNAである請求項1に記載の核酸。
【請求項６】
前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF25受容体である請求項1に記載の核酸。
【請求項７】
請求項6に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項８】
請求項6に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、図2A-2B（配列番号2）に示されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項９】
前記ほ乳類SNORF25受容体が、ラットSNORF25受容体である請求項1に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項9に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）によってコードされる配列とアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項１１】
請求項9に記載の核酸であって、前記ヒトSNORF25受容体は、図4A-4B（配列番号4）に示されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する核酸。
【請求項１２】
精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１３】
前記ほ乳類SNORF25受容体タンパク質が、ヒトSNORF25受容体タンパク質である、請求項9に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１４】
前記ほ乳類SNORF25受容体タンパク質が、ラットSNORF25受容体タンパク質である、請求項9に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体タンパク質。
【請求項１５】
請求項1に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項6に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
細胞での発現のために適合された請求項15または16に記載のベクターであって、前記受容体をコードする核酸と動作可能に結合されてその発現を可能にする、細胞内で前記核酸を発現させるために必要な調節エレメントを含み、前記細胞が細菌、両生類、酵母、昆虫、またはほ乳類細胞であるベクター。
【請求項１８】
前記ベクターがバキュウロウイルスである請求項17に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターがプラスミドである請求項15に記載のベクター。
【請求項２０】
pEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）と命名された請求項19に記載のプラスミド。
【請求項２１】
pcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）と命名された請求項20に記載のプラスミド。
【請求項２２】
請求項18に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２３】
前記細胞が非ほ乳類細胞である請求項22に記載の細胞。
【請求項２４】
前記非ほ乳類細胞細胞がゼノパス卵母細胞またはゼノパスメラニン保有細胞である、請求項2３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞がほ乳類細胞である請求項22に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項25に記載のほ乳類細胞であって、前記細胞がCOS-7、293ヒト腎胚細胞、NIH−3T3細胞、LM（tk−）細胞、マウスY1細胞、またはCHO細胞である細胞。
【請求項２７】
前記細胞が昆虫細胞である請求項27に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項27に記載の細胞であって、前記昆虫細胞が、Sf9細胞、Sf21細胞、またはTrichoplusia ni 5B-4細胞である細胞。
【請求項２９】
請求項22、23、25、26、27、または28のいずれか一項に記載の細胞から単離された膜プレパレーション。
【請求項３０】
ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、前記プローブは、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３１】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）に含まれるほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸の二本鎖の一本に存在する独特の配列と相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３２】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図1A-1B（配列番号1）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３３】
少なくとも15ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、ほ乳類SNORF25をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、前記プローブは、
（a）図3A-3B（配列番号3）、または
（b）その逆向きの相補鎖、
に存在する独特の配列に相補的な配列を有するプローブ。
【請求項３４】
前記核酸がDNAである、請求項32または33に記載の核酸プローブ。
【請求項３５】
前記核酸がRNAである、請求項32または33に記載の核酸プローブ。
【請求項３６】
前記RNAの転写を阻害するために、請求項5に記載のRNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ゲノムDNAの転写を阻害するために、請求項5に記載のゲノムDNAと特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項36または37に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、化学的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項1に記載の核酸によってコードされるほ乳類SNORF25受容体に結合することが可能な抗体。
【請求項４０】
請求項39に記載の抗体であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF25受容体またはラットSNORF25受容体である抗体。
【請求項４１】
請求項39の抗体とほ乳類SNORF25受容体との結合を、競合的に阻害することが可能な薬剤。
【請求項４２】
前記抗体がモノクローナル抗体、または抗血清である請求項39に記載の抗体。
【請求項４３】
（a）細胞膜を通過することが可能で、かつほ乳類SNORF25受容体の発現を減少するために有効な量の、請求項36に記載のオリゴヌクレオチドと、
（b）細胞膜を通過することが可能な薬学的に許容可能なキャリア、
とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項43に記載の医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドがmRNAを不活性化する物質と結合された医薬組成物。
【請求項４５】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記mRNAを不活性化する物質がリボザイムである医薬組成物。
【請求項４６】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容可能なキャリアは、細胞のほ乳類SNORF25受容体と結合する構造物を含み、前記受容体は該構造物と結合した後に、前記細胞に取り込まれることが可能な医薬組成物。
【請求項４７】
請求項44に記載の医薬組成物であって、前記薬学的に許容可能なキャリアは、選択された細胞タイプに特異的なほ乳類SNORF25受容体と結合することが可能である医薬組成物。
【請求項４８】
リガンドとヒトSNORF25受容体の結合をブロックするために有効な請求項39に記載の抗体のある量、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項４９】
請求項1に記載のほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAを発現するトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５０】
天然のほ乳類SNORF25受容体をノックアウトする相同組換えを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５１】
トランスジェニック非ヒトほ乳類であって、そのゲノムは、請求項1に記載のほ乳類のSNORF25受容体をコードするDNAに相補的なアンチセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAは、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAと相補的で、かつほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAに転写されるようにゲノム内に配置されることにより、mRNAの転写、および受容体の発現を減少させるトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５２】
請求項49または50に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類であって、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが、さらに誘導可能なプロモーターを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５３】
請求項49または50に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類であって、前記ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが、さらに組織特異的調節エレメントを含むトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５４】
前記トランスジェニック非ヒトほ乳類がマウスである、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類。
【請求項５５】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードして、かつその細胞表面に発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、結合および検出に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法。
【請求項５６】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、前記SNORF25受容体をコードし、かつ細胞表面に前記SNORF25受容体を発現するDNAを含有する細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）の膜プレパレーションを、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物とほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含む方法。
【請求項５７】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF25受容体である方法。
【請求項５８】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、プラスミドpEXJT3T7-hSNORF25（ATCC登録番号203495）によってコードされるヒトSNORF25受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項５９】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図2A-2B（配列番号2）に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６０】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図2A-2B（配列番号2）に示される配列と同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６１】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ラットSNORF25受容体である方法。
【請求項６２】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、プラスミドpcDNA3.1-SNORF25（ATCC登録番号203494）によってコードされるヒトSNORF25受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６３】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図4A-4B（配列番号4）に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６４】
請求項55または56に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、図4A-4B（配列番号4）に示される配列と同じアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６５】
請求項55または56に記載の方法であって、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない方法。
【請求項６６】
請求項65に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項６７】
請求項55または56に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項６８】
請求項55または56に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項６９】
請求項68に記載の方法であって、前記細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項７０】
請求項69に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞が、COS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項７１】
請求項68に記載の方法であって、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である方法。
【請求項７２】
請求項71の方法によって同定された化合物。
【請求項７３】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法。
【請求項７４】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定するための競合的結合を含む方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をその細胞表面に発現している細胞（このような細胞は通常はほ乳類SNORF25受容体を発現しない）から調製した膜試料を、前記化合物および受容体と結合することが既知である第二の化合物の両者と、両化合物の結合に適した条件下で接触させ、またこれとは別に前記第二の化合物のみと接触させることと、前記化合物と前記ほ乳類SNORF25受容体の特異的な結合を検出することとを含み、前記化合物の存在下で、前記第二の化合物とほ乳類SNORF25受容体との結合が減少することによって、前記化合物が前記ほ乳類SNORF25受容体に結合したことが示される方法。
【請求項７５】
請求項73または74に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項７６】
請求項73または74に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がラットSNORF251受容体である方法。
【請求項７７】
請求項73または74に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項７８】
請求項73または74に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項７９】
請求項77に記載の方法であって、前記細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項８０】
請求項79に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項８１】
請求項80に記載の方法であって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない化合物である方法。
【請求項８２】
請求項81の方法によって同定された化合物。
【請求項８３】
ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞と、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合することが既知である化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、工程(a)の試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが公知でない化合物を接触させることと；
(c) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下における化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(d) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体との結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法。
【請求項８４】
ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知である化合物の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、発現している細胞から調整した膜試料と、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない化合物を接触させることと；
(b) ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知の前記化合物の結合が、前記複数の化合物のいずれかの化合物の存在下で減少されるかどうかを、前記複数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれる各化合物と、ほ乳類SNORF25受容体の結合を別々に測定することにより、ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する化合物を同定することと、
を含む方法。
【請求項８５】
請求項83または84に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項８６】
請求項83または84に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がラットSNORF252受容体である方法。
【請求項８７】
請求項83または84に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項８８】
請求項87に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項８９】
請求項88に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、LM（tk−）細胞、CHO細胞、マウスY1細胞、又NIH−3T3細胞、である方法。
【請求項９０】
ほ乳類SNORF25受容体をコードするmRNAの存在を検出することによってほ乳類SNORF25受容体の発現を検出する方法であって、細胞から総mRNAを得ることと、そのようにして得たmRNAを請求項30、31、32、または33のいずれかに記載の核酸プローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プローブとハイブリダイズしたmRNAを検出することにより、前記細胞によるほ乳類SNORF25受容体の発現を検出することとを含む方法。
【請求項９１】
細胞表面のほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法であって、細胞と請求項39に記載の抗体とを、抗体と受容体の結合に適した条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を測定することにより、細胞表面におけるほ乳類SNORF25受容体の存在を検出する方法。
【請求項９２】
ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、ほ乳類SNORF25受容体活性が、ほ乳類SNORF25受容体の発現を調節する誘導可能なプロモーターの使用によって変更される、請求項49に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類を作製することを含む方法。
【請求項９３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性レベルの変化による生理的効果を測定するための方法であって、異なった量のほ乳類SNORF25受容体をそれぞれに発現する請求項49に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類集団を作製することを含む方法。
【請求項９４】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少によって軽減される異常を軽減することが可能なアンタゴニストを同定する方法であって、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として前記トランスジェニック非ヒトほ乳類に表れる身体的および行動的異常を軽減するかどうかを測定することを含み、前記異常の軽減によって前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する方法。
【請求項９５】
請求項94に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項９６】
請求項94に記載の方法によって同定されたアンタゴニスト。
【請求項９７】
請求項96のアンタゴニストおよびキャリアとを含む組成物。
【請求項９８】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、請求項97に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法。
【請求項９９】
ほ乳類SNORF25受容体活性を増加することによって軽減される患者の異常を軽減することが可能なアゴニストを同定する方法であって、請求項49、50、または51に記載のトランスジェニック非ヒトほ乳類に化合物を投薬することと、前記トランスジェニック非ヒトほ乳類にほ乳類SNORF25受容体の過剰活性の結果として表れる身体的および行動的異常を、前記化合物が軽減するかどうかを測定することを含み、異常の軽減により前記化合物をアゴニストとして同定する方法。
【請求項１００】
請求項99に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１０１】
請求項99に記載の方法によって同定されたアゴニスト。
【請求項１０２】
請求項101に記載の方法によって同定されたアゴニストおよびキャリアを含む組成物。
【請求項１０３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、請求項102に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することにより、前記異常を治療することを含む方法。
【請求項１０４】
ほ乳類対立遺伝子に特有な活性に関連した疾患に対する疾病素質を診断する方法であって、
(a) 前記疾患に罹患した患者のDNAを得ることと；
(b) 制限酵素で前記DNAの制限消化を行うことと；
(c) サイズゲル上で電気泳動により、生じたDNA断片を分離することと；
(d) ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる独特な配列と特異的にハイブリダイズすることが可能で、かつ検出可能なマーカーでラベルされた核酸プローブと、生じたゲルとを接触させることと；
(e) 請求項1に記載のほ乳類SNORF251受容体をコードするDNAにハイブリダイズしたラベルされたバンドを検出して、前記疾患に罹患した患者のDNAに特異的な独特のバンドパターンを作りだすことと；
(f) 工程(a)〜(e)によって得られる診断用のDNAを調整することと；
(g) 工程(e)の前記疾患に罹患した患者に特有なDNAの独特なバンドパターンと、工程（f）で得られた診断用のDNAとを比較して、パターンが同じか異なるかを測定することにより、パターンが同じであれば前記疾患の質病素質ありと診断することを含む方法。
【請求項１０５】
請求項104に記載の方法であって、特定のほ乳類対立遺伝子の活性に関連する疾患を診断する方法。
【請求項１０６】
請求項12に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体を発現する細胞を培養することと；
(b) 前記細胞から、前記ほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(c) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を精製すること、
を含む方法。
【請求項１０７】
請求項12に記載の精製されたほ乳類SNORF25受容体を調製する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体をコードする核酸を適切なベクターに挿入することと；
(b) 生じたベクターを適切な宿主細胞に導入することと；
(c) 生じた細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の産生を可能にする適切な条件下に置くことと；
(d) 前記そのように産生されたほ乳類SNORF25受容体を回収することと；
(e) そのように回収されたほ乳類SNORF25受容体を単離すること、および/または精製すること、
を含む方法。
【請求項１０８】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストかどうかを決定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体の活性のいかなる増加をも検出することにより、前記化合物がSNORF25受容体のアゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法。
【請求項１０９】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストかどうかを測定する方法であって、ほ乳類SNORF25受容体をコードするDNAが形質導入され、かつ発現している細胞を、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件で前記化合物と接触させることと、ほ乳類SNORF25受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストであるかどうかを決定することとを含む方法。
【請求項１１０】
請求項108または109に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１１１】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の請求項108に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１１２】
請求項111に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない組成物。
【請求項１１３】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に効果的な量の請求項109に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１１４】
請求項113に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない組成物。
【請求項１１５】
化合物が、ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ活性化するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現しない）を、ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化合物の存在下、および非存在下で前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物の存在下で前記二次メッセンジャー応答が変化することにより、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体を活性化していることが示される方法。
【請求項１１６】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は内部塩素電流のレベルの増加である方法。
【請求項１１７】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記二次メッセンジャーの変化は細胞内カルシウムの測定の増加である方法。
【請求項１１８】
請求項115に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は、イノシトールリン酸の放出を含み、前記二次メッセンジャーの変化はイノシトールリン酸レベルの増加である方法。
【請求項１１９】
化合物がほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合し、かつ阻害するかどうかを決定する方法であって、二次メッセンジャー応答を生じ、かつその細胞表面にほ乳類SNORF25受容体を発現している細胞（このような細胞は通常ほ乳類SNORF25受容体を発現していない）を、ほ乳類SNORF25受容体の結合に適した条件下で、ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知な前記化合物および第二の化合物の両者と接触させ、これとは別に第二の化合物のみの存在下、および第二の化合物と前記化合物の両者の存在下で、前記二次メッセンジャー応答を測定することを含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における前記二次メッセンジャー応答の変化が、前記第二の化合物のみの存在下の場合より少ないことによって、前記化合物がほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが示される方法。
【請求項１２０】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししか内部塩素電流レベルを増加しない方法。
【請求項１２１】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答は細胞内カルシウムレベルの変化を含み、前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少し細胞内カルシウムレベルの測定を増加しない方法。
【請求項１２２】
請求項119に記載の方法であって、前記二次メッセンジャー応答はイノシトールリン酸の放出を含み前記化合物および前記第二の化合物の両者の存在下における二次メッセンジャー応答の変化は、前記第二の化合物のみの存在下の場合よりも少ししかイノシトールリン酸レベルを増加しない方法。
【請求項１２３】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１２４】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。
【請求項１２５】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類細胞である方法。
【請求項１２６】
請求項125に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項１２７】
請求項126に記載の方法であって、前記非ニューロン細胞がCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、マウスY1細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項１２８】
請求項115、116、117、118、119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法であって、前記化合物は、ほ乳類SNORF25受容体と結合することが既知でない方法。
【請求項１２９】
請求項128に記載の方法によって決定される化合物。
【請求項１３０】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に効果的な量の請求項115、116、117、または118のいずれか一項に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１３１】
請求項130に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアゴニストが既知でない組成物。
【請求項１３２】
ほ乳類SNORF25受容体活性を低下させるために効果的な量の請求項119、120、121、または122のいずれか一項に記載の方法によって決定されたほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストと、キャリアとを含む組成物。
【請求項１３３】
請求項132に記載の組成物であって、前記ほ乳類SNORF25受容体のアンタゴニストが既知でない組成物。
【請求項１３４】
ほ乳類SNORF25受容体を活性化することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
(a) 前記ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞を、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で、前記ほ乳類SNORF25受容体に特異的に結合することが既知でない前記複数の化合物と接触させることと；
(b) 一以上の前記化合物の存在下で、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性が増加するかどうかを測定することと；もしそうならば、
(c) 前記複数の化合物に含まれるいずれかの化合物が、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加するかを別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体を活性化する各化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項１３５】
請求項134に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体およびラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１３６】
ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害することが既知でない複数の化合物をスクリーニングして、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a) ほ乳類SNORF25受容体が形質導入され、かつ発現している細胞と前記複数の化合物とを、既知のほ乳類SNORF25受容体アゴニストの存在下において、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化に適した条件下で接触させることと；
(b) 前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量が、一以上の前記化合物の存在下で減少されるかどうかを、このような一以上の化合物の非存在下における前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化の範囲または量と比較して、決定することと；もしそうならば、
(c) このようなそれぞれの化合物が、ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害するかどうかを、前記複数の化合物に含まれるそれぞれの化合物について、別々に測定することによって、前記ほ乳類SNORF25受容体の活性化を阻害する、このような複数の化合物に含まれる何れかの化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項１３７】
請求項136に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体がヒトSNORF251受容体である方法。
【請求項１３８】
請求項134、135、136、または137のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞がほ乳類である方法。
【請求項１３９】
請求項138に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源である方法。
【請求項１４０】
請求項139に記載の方法であって、前記ほ乳類細胞が非ニューロン起源であるがCOS-7細胞、293ヒト腎胚細胞、CHO細胞、NIH−3T3細胞、またはLM（tk−）細胞である方法。
【請求項１４１】
ほ乳類SNORF25受容体活性の増加に有効な量の、請求項134または135に記載の方法によって同定された化合物、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１４２】
ほ乳類SNORF25受容体活性の減少に有効な量の、請求項136または137に記載の方法によって同定された化合物、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１４３】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を増加することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アゴニストである化合物を投与することを含む方法。
【請求項１４４】
ほ乳類SNORF25受容体の活性を減少することによって軽減される患者の異常を治療する方法であって、前記患者に対して、前記異常の治療に有効な量のほ乳類SNORF25受容体アンタゴニストである化合物を投与することを含む方法。
【請求項１４５】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項55、56、73、74、83、または84のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規構造のおよび機能的な、その類似体もしくは相同体を合成することを含む方法。
【請求項１４６】
請求項145に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１４７】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項108、115、または134のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体または相同体を合成することを含む方法。
【請求項１４８】
請求項147に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１４９】
ほ乳類SNORF25受容体と特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項109、119、または156のいずれか一項に記載の方法を使用して化合物を同定することと、次に前記化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体または相同体を合成することを含む方法。
【請求項１５０】
請求項149に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５１】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項55、56、73、74、83、もしくは84のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５２】
請求項151に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５３】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項108、115、もしくは134のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５４】
請求項153に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【請求項１５５】
組成物を調製する方法であって、キャリア並びに薬学的に有効な量の請求項109、119、もしくは136のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物、または新規な構造のおよび機能的な、その類似体もしくは類似体を混合することを含む方法。
【請求項１５６】
請求項155に記載の方法であって、前記ほ乳類SNORF25受容体が、ヒトSNORF251受容体またはラットSNORF251受容体である方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−６３４５７（Ｐ２０１０−６３４５７Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２１２２５２（Ｐ２００９−２１２２５２）
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【分割の表示】特願２０００−６０１１２６（Ｐ２０００−６０１１２６）の分割
【原出願日】平成１２年２月２２日（２０００．２．２２）
【出願人】（５９８０６６５０３）ハー・ルンドベック・アクティーゼルスカブ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１２２５２（Ｐ２００９−２１２２５２）
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【分割の表示】特願２０００−６０１１２６（Ｐ２０００−６０１１２６）の分割
【原出願日】平成１２年２月２２日（２０００．２．２２）
【出願人】（５９８０６６５０３）ハー・ルンドベック・アクティーゼルスカブ (6)
【Ｆターム（参考）】
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