ＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＵＳＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥタンパク質および核酸
【課題】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質および核酸を、ゲノム配列と共に提供する。
【解決手段】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、これらの配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。
【解決手段】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、これらの配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の核酸およびタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、グラム陽性球菌である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、成人および５歳以上の子供の急性細菌性髄膜炎の最も一般的な原因である。
【０００４】
本発明の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の防止、検出、および処置を改善するための材料を提供することである。
【０００５】
より詳細には、本発明の目的は、ワクチンの開発に使用され得るタンパク質を提供することである。さらなる目的は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の診断に使用され得るタンパク質および核酸を提供すること、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出のために使用され得るタンパク質および核酸を提供すること、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質の発現に有用な核酸を提供すること、ならびに抗生物質研究の有用な標的であるタンパク質を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。これらのアミノ酸配列は、偶数の配列番号２〜４９７８である。
【０００７】
本発明はまた、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これらのタンパク質は、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体を含む。代表的に、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的な等価を示すとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメータ（ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１）を用いたアフィンギャップサーチを用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。
【０００８】
本発明はさらに、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、その配列由来の少なくともｎ個の連続アミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、この配列由来の１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、（ａ）実施例に開示されるタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）実施例に開示されるが、Ｎ末端シグナルペプチドを有さないタンパク質、および（ｃ）実施例に開示されるが、Ｎ末端アミノ酸残基を有さないタンパク質、である。
【０００９】
本発明のタンパク質は、当然、種々の手段（例えば、組換え発現、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの精製、化学合成など）により、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化など）で調製され得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）。本発明のタンパク質は、好ましくは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質である。
【００１０】
好ましいタンパク質は、実施例の表に列挙される４３２個のタンパク質である。
【００１１】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、そして任意の適切な手段により生成され得る。ヒト免疫系との適合性を増大させるために、これらの抗体は、キメラまたはヒト化抗体であり得る（例えば、Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５５（９２０５）：７３５−７４０；ＧｏｒｍａｎおよびＣｌａｒｋ（１９９０）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４５７−４６６）か、あるいは完全ヒト抗体が使用され得る。これらの抗体は、（例えば、診断アッセイのための）検出可能な標識を含み得る。
【００１２】
さらなる局面に従って、本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これらのヌクレオチド配列は、奇数の配列番号１〜４９７７、および配列番号４９７９のゲノム配列である。
【００１３】
さらに、本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列に対する配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。配列間の同一性は、好ましくは、上記のようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性アルゴリズムによって決定される。
【００１４】
さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中で６５℃）で、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００１５】
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた提供される。これらは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列由来の少なくともｎ個の連続ヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、またはそれ以上）である。
【００１６】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号４９７９のヌクレオチド配列を含む核酸；配列番号４９７９に対する配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；（好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下で）配列番号４９７９にハイブリダイズし得る核酸；配列番号４９７９由来の少なくともｎ個の連続ヌクレオチドのフラグメントを含む核酸（ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、１０００００、１００００００またはそれ以上））を提供する。
【００１８】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットまたはサザンブロット、あるいは核酸マイクロアレイまたは「遺伝子チップ」において）および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）などにおいて使用され得る。
【００１９】
本発明は、上記の核酸に相補的な配列を含む核酸を（例えば、アンチセンスまたは探索目的のために、あるいはプライマーとしての使用のために）提供することもまた、理解されるべきである。
【００２０】
本発明に従う核酸は、当然、多くの方法（例えば、化学合成によって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）によって調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブなど）をとり得る。この核酸は、好ましくは、実質的に単離された形態である。
【００２１】
本発明に従う核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識で標識され得る。これは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡにおいてプライマーまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。
【００２２】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むアナログ）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）もまた含む。
【００２３】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２４】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体、および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、免疫原性組成物として、または診断試薬として、またはワクチンとして適切であり得る。
【００２５】
本発明はまた、医薬として（例えば、免疫原性組成物またはワクチンとして）または診断試薬として使用するための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。本発明はまた、（ｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに起因する感染を処置または防止するための医薬；（ｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの存在またはｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／あるいは（ｉｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する抗体を惹起し得る試薬の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する。前記のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、任意の種、属、または株であり得るが、好ましくは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、特に、４型株である。疾患は、髄膜炎、肺炎、敗血症、中耳炎、または耳感染であり得る。
【００２６】
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、治療有効量の本発明の核酸、タンパク質、および／または抗体を患者に投与する工程を包含する。この患者は、この疾患自体の危険を有するか、または妊婦のいずれかであり得る（「先天性免疫」、例えば、ＧｌｅｚｅｎおよびＡｌｐｅｒｓ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：２１９−２２４）。
【００２７】
タンパク質抗原の投与は、免疫を誘導するための好ましい処置方法である。
【００２８】
本発明の抗体の投与は、別の好ましい処置方法である。この受動的免疫方法は、新生児または妊婦に特に有用である。この方法は、代表的に、ヒト化されているか完全なヒト抗体である、モノクローナル抗体を使用する。
【００２９】
本発明はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）核酸配列に含まれる標的配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を備えるキットを提供する。このキットは、第１プライマーおよび第２プライマーを備え、第１プライマーは、この標的配列に実質的に相補的であり、そして第２プライマーは、この標的配列の相補鎖に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有するこのプライマー対は、増幅される標的配列の末端を規定する。第１プライマーおよび／または第２プライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
【００３０】
本発明はまた、一本鎖または二本鎖核酸（またはそれらの混合物）に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）鋳型核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットを提供する。ここで、（ａ）第１オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｂ）第２オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列の相補鎖に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｃ）第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸に相補的でない配列を含み；そして（ｄ）これらのプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を規定する。特徴（ｃ）の非相補的配列は、好ましくは、プライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。これらの配列の一方または両方は、制限部位（例えば、ＥＰ−Ｂ−０５０９６１２）またはプロモーター配列（例えば、ＥＰ−Ｂ−０５０５０１２）を含み得る。第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
【００３１】
鋳型配列は、ゲノム配列の任意の部分（例えば、配列番号４９７９）であり得る。例えば、鋳型配列は、ｒＲＮＡ遺伝子またはタンパク質コード遺伝子であり得る。鋳型配列は、好ましくは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的である。
【００３２】
本発明はまた、配列表の配列の１つ以上を含むコンピューター読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなど）および／またはコンピューターデータベースを提供する。この媒体は、好ましくは、配列番号４９７９を含む。
【００３３】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表されるハイブリッドタンパク質を提供する。ここで、Ｘは、上記のような本発明のアミノ酸配列であり、Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎは、１より大きい整数である。ｎの値は、２とｘとの間であり、ｘの値は、代表的に、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。好ましくは、ｎは、２、３、または４であり；より好ましくは、２または３であり；最も好ましくは、ｎ＝２である。各々のｎの例について、−Ｘ−は、同一または異なり得る。［−Ｘ−Ｌ−］の各々のｎの例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、このハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的に、短い（例えば、２０またはそれより小さい（すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわちＧｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。−Ａ−および−Ｂ−は、任意の配列であり、代表的に短い（例えば、４０またはそれより小さい（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例として、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、各Ｘは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列であり；他の実施形態において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、および／またはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ配列の混合物が使用される（適切な配列については、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９の偶数の配列番号２〜１０９６６を参照のこと）。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のタンパク質および核酸は、Ｈｏｓｋｉｎｓら（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（２００１）１８３：５７０９−１７）により開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの無毒Ｒ６株由来の２０４３のＯＲＦ配列と配列同一性を共有する。他の実施形態において、本発明は、Ｈｏｓｋｉｎｓらにより詳細に開示される２０４３のＯＲＦの１つからなる配列を含まない。
【００３５】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００３６】
本発明のタンパク質を生成するためのプロセスが提供される。このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００３７】
本発明のタンパク質または核酸を生成するためのプロセスが提供される。ここで、このタンパク質または核酸は、化学的手段を用いて一部または全体が合成される。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、（ａ）二重鎖を形成するハイブリダイズ条件下で、本発明に従う核酸プローブと生物学的サンプルとを接触させる工程；および（ｂ）この二重鎖を検出する工程を包含する。
【００３９】
生物学的サンプル中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを検出するためのプロセスもまた提供される。このプロセスは、ハイブリダイズ条件下で、本発明に従う核酸と生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。このプロセスは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど）またはハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中のプローブとのハイブリダイゼーションなど）を含み得る。臨床サンプル中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＣＲ検出は、以前に報告されている（例えば、Ｃｈｅｒｉａｎら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３６０５−３６０８；Ｋｅａｒｎｓら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３４３４；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄ−２５、３８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣを参照のこと）。
【００４０】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、（ａ）抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、本発明の抗体と生物学的サンプルとを接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程を包含する。
【００４１】
アミノ酸配列を同定するためのプロセスが提供される。このプロセスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノム配列中の推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード領域を検索する工程を包含する。この方法は、代表的に、開始コドンおよび下流配列におけるインフレームの終止コドンの配列のインシリコ検索を含む。これらの開始コドンと終止コドンとの間の領域は、推定タンパク質コード配列である。代表的に、6つの可能性のあるリーディングフレーム全てが検索される。このような分析に適切なソフトウェアとしては、ＯＲＦＦＩＮＤＥＲ（ＮＣＢＩ）、ＧＥＮＥＭＡＲＫ（ＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙおよびＭｃＩｎｉｎｃｈ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ Ｃｈｅｍ．１７：１２２−１３３）、ＧＬＩＭＭＥＲ（Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５４４−５４８；Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５９：２４−３１；Ｄｅｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４６３６−４６４１）、またはＭａｒｋｏｖモデルを使用する他のソフトウェア（例えば、Ｓｈｍａｔｈｏｖら（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：８７４−８７６）が挙げられる。本発明はまた、同定されたアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。次いで、これらのタンパク質は、従来技術を用いて発現され得る。
【００４２】
本発明はまた、試験化合物が、本発明のタンパク質に結合するか否かを決定するためのプロセスを提供する。試験化合物が本発明のタンパク質に結合し、そしてこの結合が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌の生活サイクルを阻害する場合、この試験化合物は、抗生物質としてか、または抗生物質の設計のためのリード化合物として使用され得る。このプロセスは、代表的に、試験化合物と本発明のタンパク質とを接触させる工程、および試験化合物がこのタンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する。これらのプロセスにおいて使用するための本発明の好ましいタンパク質は、酵素（例えば、ｔＲＮＡシンテターゼ）膜トランスポーター、およびリボソームタンパク質である。適切な試験化合物としては、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの改変形態）、ならびに有機低分子（例えば、２００Ｄａと２０００Ｄａとの間のＭＷ）が挙げられる。試験化合物は、個々に提供され得るが、代表的には、ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の一部である。結合相互作用を検出する方法としては、ＮＭＲ、フィルター結合アッセイ、ゲル遅延アッセイ（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、置換アッセイ、表面プラズモン共鳴、逆ツーハイブリッドなどが挙げられる。本発明のタンパク質に結合する化合物は、この化合物とＧＢＳ細菌とを接触させ、次いで、増殖阻害をモニタリングすることにより、抗生物質活性について試験され得る。本発明はまた、これらの方法を用いて同定される化合物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、本発明のタンパク質および以下の抗原の１つ以上を含む組成物を提供する：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＶａｃＡ、ＣａｇＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）および／またはウレアーゼ）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８０９−１８１５；Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８１６−１８２０；およびＷＯ９６／２９４１２に記載されるタンパク質抗原）（タンパク質「２８７」および誘導体が特に好ましい）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、ＷＯ０１／５２８８５；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）；１０９３−１０９６；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−２９５８；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３などに開示されるＯＭＶ調製物）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８に開示される血清型Ｃ由来のオリゴ糖（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３もまた参照のこと））；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原（例えば、Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：３３１−３３２；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２６９−２８５、ｖ；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７）；
Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活性化ウイルス）由来の抗原（例えば、Ｂｅｌｌ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：１１８７−１１８８；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６）；
Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８補遺：Ｓ６３−６８およびＳ７９−８０）；
Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）（例えば、Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ３：９０１−９１５）；
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（必要に応じてパータクチンならびに／またはアグルチノゲン（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ）２および３と組み合わせても）（例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８））；
ジフテリア抗原（例えば、ジフテリア毒素（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編、ＩＳＢＮ０−７２１６−１９４６−０の第３章）、例えばＣＲＭ１９７変異体（例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１−７０））；
破傷風抗原（例えば、破傷風毒素（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第４章））；
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ由来の糖抗原；
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原（例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０）；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、ＷＯ０２／０２６０６；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：１３９７−４０６；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（捕遺３）：Ｓ５２４−５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４；ＷＯ００／３７４９４）；
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原（例えば、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９）；
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原（例えば、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９）；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、ＷＯ９９／２８４７５）；
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１４２）；
ポリオ抗原（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８、１２５−１２６）（例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ）；
狂犬病抗原（例えば、Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５捕遺：Ｓ２−６）（例えば、凍結乾燥不活性化ウイルス（例えば、ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９８ Ｊａｎ １６；４７（１）：１２、１９；ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ））；
麻疹、おたふくかぜ、および／または風疹抗原（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第９、１０、および１１章）； インフルエンザ抗原（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第１９章）（例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）；
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９捕遺１：Ｓ１０１−１０７）；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁もまた参照のこと）。
【００４４】
糖抗原または炭水化物抗原が含まれる場合、これらは、好ましくは、免疫原性を増強するためにキャリアタンパク質に結合される（例えば、Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７捕遺２：Ｓ２８−３６；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６、特に第１０巻：４８−１１４など）。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（例えば、ＥＰ−０３７２５０１）、合成ペプチド（例えば、ＥＰ−０３７８８８１、ＥＰ−０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（例えば、ＷＯ９３／１７７１２）、百日咳タンパク質（例えば、ＷＯ９８／５８６６８；ＥＰ−０４７１１７７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（例えば、ＷＯ００／５６３６０）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（例えば、ＷＯ００／６１７６１）などが挙げられる。任意の適切な結合体化反応が、必要な場合、任意の適切なリンカーと共に使用され得る。
【００４５】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、解毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒）。
【００４６】
ジフテリア抗原がこの組成物中に含まれる場合、これはまた、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、これはまた、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、これはまた、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。
【００４７】
抗原は、好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。
【００４８】
組成物中の抗原は、代表的に、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するのに十分な濃度である。
【００４９】
本発明はまた、本発明の２つ以上（例えば、３、４、５）のタンパク質を含む組成物を提供する。
【００５０】
本発明を実施するため（例えば、ワクチン接種または診断目的のために開示された配列を使用するため）に使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下の通りである。この要約は、本発明の限定ではなく、使用され得る（しかし、必須ではない）実施例を与えるものである。
【００５１】
（概論）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）。
【００５２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使用される。
【００５３】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえも含む。
【００５４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、またはいくらかの添加物を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００５５】
用語「異種」とは、天然では一緒に見出されない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では一緒に見出されないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結される場合、それらは一緒に機能し得る。別の例は、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然では見出されない配置で単一のタンパク質に組み込まれた同一または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００５６】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律単位として振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点によって、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００５７】
「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）より大きく、上記のようにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて算出される。本明細書中で使用される場合、本明細書でその核酸配列が提供される核酸分子または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは第２の単離体のゲノム中に本質的に同じ遺伝子座で存在する核酸分子または領域、および、例えば、変異または組換えにより生ずる自然の変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子または領域である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
【００５８】
（発現系）
ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物細胞、細菌、および酵母と共に使用される発現系、において発現され得る。
【００５９】
（ｉ．哺乳動物系） 哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（３’への）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る割合を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
【００６０】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的であるかまたは調節される（誘導性）かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答細胞においてグルココルチコイドにより誘導され得る。
【００６１】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合せて、エンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常、発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは逆の（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、あるいはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置される場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらが通常、より広い宿主範囲を有することから、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。
【００６２】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００６３】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００６４】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
【００６５】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に一緒に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物複製系としては、複製のためにトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数まで複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００６６】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００６７】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。
【００６８】
（ｉｉ バキュロウイルス系） タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクターに挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、この発現系の構成要素は、以下を含む：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入のために便利な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルス特異的フラグメントに対して配列相同性を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
【００６９】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムとを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態で市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中以降、「Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００７０】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター配列、リーダー配列（所望の場合）、コード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に組み込む。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子、を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
【００７１】
現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶへ導入するために、最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（ＡＴＧからＡＴＴにポリへドリン開始コドンを変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
【００７２】
プラスミドはまた、通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための複製起点を含む。
【００７３】
バキュロウイルス転移ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（５’から３’への）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合には、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は、調節されているかまたは構成的であるかのいずれかであり得る。
【００７４】
ウイルスの感染サイクルの後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開第１２７８３９号および同第１５５４７６号；およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００７５】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のようなバキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようであり、分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようであるので、非昆虫起源のリーダー（例えば、ヒトαインターフェロン（Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のリーダー）もまた、昆虫での分泌を提供するために使用され得る。
【００７６】
組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は細胞内で発現され得るか、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合には、分泌され得る。融合されていない外来タンパク質の優れた細胞内発現には、通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子が必要である。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００７７】
あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００７８】
タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区画を含む。バキュロウイルスウイルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子への挿入であり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位への挿入であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベクターにおいてポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合、ＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列の５’側および３’側の両方に隣接し、そしてポリへドリンプロモーターの下流に配置される。
【００７９】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％と約５％との間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されるウイルスの大半は、なお野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。この発現系の利点は、組換えウイルスを区別することが可能な視覚的なスクリーニングである。ネイティブのウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、それはまた包埋された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折性であり、明るく輝く外見を与え、光学顕微鏡下で容易に確認される。組換えウイルスが感染した細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクション上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で、閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００８０】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染のために開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般には、Ｆｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。
【００８１】
バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のための細胞および細胞培養培地が、市販されている；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、前出のＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
【００８２】
次いで、改変した昆虫細胞を、改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする適切な栄養培地で増殖され得る。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に継続的に発現され、そして目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補充する間、栄養培地を継続的に循環しなければならない。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、その産物を、必要な場合、さらに精製して、培地中にも存在する任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給し得る。
【００８３】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、その条件は、当該分野で公知の事項に基づいて、当業者に容易に確認できる。
【００８４】
（ｉｉｉ 植物系） 当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物体の遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のような特許文献に記載される発現系が挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載されている。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加えて、以下の文献においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモンであるジベレリン酸、およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編，１９８４ Ｐｉｔｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁に見出され得る。他の代謝調節遺伝子が記載される参考文献は；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）である。
【００８５】
代表的には、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列を、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット中に挿入する。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクター中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミド起源またはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から所望の植物宿主へＤＮＡが移動することを可能にするために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広範な宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介転移のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出されない場合は、その構築物は好ましくはまた、植物細胞が形質転換されたか否かの決定に適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見出される。
【００８６】
植物ゲノムへの異種配列の組込みを可能にするために適切な配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内への異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換えのためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。当該分野で公知であるように、さらなる機能をコードする他のＤＮＡ配列もまた、そのベクター中に存在し得る。
【００８７】
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現のための発現カセット中に含まれ得る。通常は一つのみの発現カセットが存在するが、２つ以上の発現カセットも可能である。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加えて、以下のエレメントを含む：プロモーター領域、植物の５’非翻訳配列、開始コドン（構造遺伝子が開始コドンを備えているか否かに依存する）、ならびに転写終結配列および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の固有の制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００８８】
異種コード配列は、本発明に関連する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を引き起こし得る任意の配列を欠く。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためであるので、トランスロケーションを提供するシグナルペプチドを使用することにより、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳へ、アリューロン層または胚盤上皮層を通過する。タンパク質は、そのタンパク質が産生される細胞から分泌される必要はないが、これによって、組換えタンパク質の単離および精製が容易になる。
【００８９】
所望の遺伝子産物の最終的な発現は、真核生物細胞中であるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンとして宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構によってプロセシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコード（ｆａｌｓｅ ｉｎｔｒｏｎ ｃｏｄｅ）のような遺伝的メッセージの一部を欠失することを防止するように実施され得る（ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１：９５−１０５（１９８５））。
【００９０】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いることによって、植物細胞内に直接的に微量注入され得る。Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小ビーズまたは粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいはその表面に核酸を有する小さな粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、トランスジェニックオオムギを作製するためのオオムギ胚乳の粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を教示する）。さらに別の導入方法は、他の実体、ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂質表面体のいずれかとのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００９１】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレーションされる。高い電界の強さの電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過化し、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂して、そして植物カルスを形成する。
【００９２】
プロトプラストを単離および培養して完全な再生植物を提供し得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、転移された遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、培養細胞あるいは組織（サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない）から再生され得ることが公知である。いくつかの適した植物としては、例えば、以下の属からの種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、およびＤａｔｕｒａ。
【００９３】
再生のための手段は、植物の種によって変化するが、一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織が形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根され得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特に、コーンおよびアルファルファのような種にとって有利である。シュートおよび根は、通常、同時に発生する。効果的な再生は、培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御される場合、再生は十分に再現可能でありそして反復可能である。
【００９４】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は分泌されるか、あるいはこのタンパク質は全植物体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これを回収し得る。あるいは、胚および胚を有さない不完全な種子または他の植物組織を機械的に破壊して、細胞と組織と間の任意の分泌タンパク質を遊離させ得る。その混合物を緩衝液に懸濁して、可溶性タンパク質を回収し得る。次いで、従来のタンパク質の単離方法および精製方法を使用して、組換えタンパク質を精製する。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターを慣用的な方法により調整して、異種タンパク質の発現および回収を最適化する。
【００９５】
（ｉｖ．細菌系） 細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流への（３’への）ｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これはＲＮＡ合成が始まる近接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強するかまたは低下し得る。
【００９６】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【００９７】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌あるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターが作製される（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現をもたらすために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと組み合わされ得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組み合わされたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。
【００９８】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成によりリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のために（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
【００９９】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰ−Ａ−０ ２１９ ２３７）。
【０１００】
融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内因性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結され得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（Ｘａ因子）のための部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部のＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。
【０１０１】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム空間（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、プロセシング部位は、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる。
【０１０２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ２４４ ０４２）。
【０１０３】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。
【０１０４】
通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物としてひとつになる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の有効性に依存して選択され得る。
【０１０５】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡと共に構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０ １２７ ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【０１０６】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌に薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）耐性を付与する遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【０１０７】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにひとつに組み込まれ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。
【０１０８】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか）は、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＰＣＴＷＯ ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【０１０９】
外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ）（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【０１１０】
（ｖ．酵母発現） 酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（３’への）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子とは遠位にある。このＵＡＳは、調節された（誘導性の）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させる。
【０１１１】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０ ２８４ ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０ ３２９ ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。
【０１１２】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターが生成され得る。このようなハイブリッドプロモーターの例として、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例として、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０ １６４ ５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に存在する非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【０１１３】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【０１１４】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０ １９６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を有するように作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【０１１５】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【０１１６】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質の遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０ ０１２ ８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号））から獲得され得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−０ ０６０ ０５７）。
【０１１７】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントとして、完全長プレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）が挙げられる（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとして、第１の酵母のプレ配列を用いるが、第２の酵母α因子のプロ領域を用いずに作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【０１１８】
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。
【０１１９】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物に組み立てられる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１２０】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクターに含ませるための適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に関し得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおいて発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして存在し得る。
【０１２１】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子）を含み得、それぞれ、酵母細胞においてツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１） あるいは、上記成分のうちのいくつかが、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーで構成される。
【０１２２】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母について開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１２３】
外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラスト、またはアルカリ陽イオンで処置されたインタクトな酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
【０１２４】
（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、抗原のエピトープの特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これによって、抗体と抗原との結合が可能になる。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１２５】
本発明のタンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質の識別／同定に有用である。
【０１２６】
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、獲得可能な血清量、ならびに標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の利用可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射することによって行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いる）中のタンパク質の１回以上の注射によってブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって、抗体が生成され得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に相当すると考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物の血液をガラスまたはプラスチック製容器に取り出し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、１回の採血につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
【０１２７】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改良版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大リンパ節）を取り出し、そして単一の細胞へ分離する。所望の場合、この脾臓細胞は、（非特異的な接着細胞の除去後）細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへアプライすることによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液と共に洗い落とされない。得られるＢ細胞、または全ての分離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するために誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されるＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
【０１２８】
所望の場合、抗体は（ポリクローナルであってもモノクローナルであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計を用いて定量可能な青色色素へ変換するその能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいう（例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合）。他の特異的結合パートナーとして、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対が挙げられる。同じ標識がいくつかの異なる様式で利用され得るので、上記の記載が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことが、理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として利用され得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として利用され得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識が組み合され得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【０１２９】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療有効量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１３０】
本明細書において使用される用語「治療有効量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療剤の量、あるいは、検出可能な治療効果または予防効果を示す治療剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状の減少を含む。被験体に対する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の状況についての有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１３１】
本発明の目的のために、有効用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１３２】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような、治療剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体で誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような遅く代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１３３】
薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩）が、本明細書中で使用され得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて入手可能である。
【０１３４】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
【０１３５】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１３６】
組成物の直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式として、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または複数回用量スケジュールであり得る。
【０１３７】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１３８】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、これらのキャリアとしては、そのキャリア自体が、その組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当該分野で周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体化され得る。
【０１３９】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントとして、以下が挙げられるが、それらに限定されない：（１）アルミニウム塩（「ミョウバン」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）５％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必ずしも必要ではない）を含み、マイクロフルイダイザー（例えば、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を用いてμ未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ；ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の第１０章）、（ｂ）１０％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する、μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、またはそれから生成され得る粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９ＴＭが、好ましい。
【０１４０】
上記のように、ムラミルペプチドとして、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
【０１４１】
免疫原性組成物（例えば、免疫剤／原（特に、抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈物（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１４２】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物とするために適切な、固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１４３】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、個体へのその量の投与が、単回用量または、一連の（用量の）一部のいずれかで、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲内にあり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１４４】
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内、または経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ／ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｎｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切なさらなる処方物として、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
【０１４５】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンを使用し得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６１７−６４８、本明細書中後期）。
【０１４６】
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含み、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、インビボまたはエキソビボの様式で、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１４７】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１４８】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、本発明者らは、任意のレトロウイルス遺伝子送達ベクターが本発明において利用可能であることを意図する。これらの遺伝子送達ベクターとして、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）、多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１４９】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロベクターのＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起点は鳥類白血病ウイルスに由来し得る。
【０１５０】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性のレトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによる、宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１５１】
上記のレトロウイルスベクターと共に使用するのに適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３およびＷＯ９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製するために使用され得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を排除する。
【０１５２】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスとして、鳥類白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＶＩｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスが挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとして、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、エーベルソン肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラッフィ肉腫ウイルス、グロス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、カーステン肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ならびにローシャーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、寄託機関または収集機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１５３】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第４，７７７，１２７号、同第５，５９１，６２４号に記載されるベクターが挙げられる。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １もまた参照のこと。
【０１５４】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、上記の参照文書ならびにＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるベクターが挙げられる。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような死滅したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要な例および好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。このベクターにおいて、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドから１８個までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０個のネイティブヌクレオチドから１８個までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０個のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失されているか、または非ネイティブヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブＤ配列は、各々のＡＡＶ逆方向末端反復中のＨＰ形成に関与しない２０個連続するヌクレオチドの配列である（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）。非ネイティブ置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａの米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅの米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎのＷＯ９４／２８８１５７に開示されるベクターである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優先的に発現を指示する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、および同第５，２５２，４７９号に記載される。
【０１５５】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要な例および好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるベクター）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターとしては、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ ７１３４、２ＲＨ １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７およびＶＲ−２６０として寄託されたベクターが挙げられる。
【０１５６】
本発明において使用され得るアルファウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ミドルバーグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）ならびに米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるベクターが挙げられる。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるアルファウイルスベクターが使用可能である。このようなアルファウイルスは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたアルファウイルスベクターが使用される（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１５７】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核生物層状発現系）もまた、本発明の核酸を発現させるのに有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はアルファウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１５８】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、以下に由来するベクターが挙げられる：ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５に記載されるウイルス）；リノウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌ４０１に記載されるウイルス）；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるウイルス）；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：１５３３に記載されるウイルス）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ Ｍｅｄ ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるウイルス）；アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）；ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）；カバソー（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）；チクングニヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）；ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）；ンヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）；ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）；トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）；ユナ（Ｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）；ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）；オニオン（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ）ウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）；西部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２１：１９０に記載のウイルス。
【０１５９】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記のウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、死滅させたアデノウイルスのみに連結しているかまたはしてないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手持ち型の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１６０】
粒子により媒介される遺伝子移入が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで、細胞標的化リガンドに（例えば、ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるようにアシアロオロソムコイドに、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：２５３−２６３に記載されるようにインスリンに、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ３：５３３−５３９に記載されるようにガラクトースに、ラクトースに、またはトランスフェリンに）連結された合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。
【０１６１】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改善され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、このビーズによるエンドサイトーシスの開始後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高めることによってさらに改良され得、それによって、エンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にする。
【０１６２】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような重合性ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。使用に適したさらなる非ウイルス送達としては、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチ）が挙げられる。さらに、コード配列およびそのようなコード配列の発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達のために使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手持ち型の遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）が挙げられる。
【０１６３】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７６：４２０に記載されるリポソームおよびビヒクルである。
【０１６４】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクル（この用語は上記に定義される通りである）を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１６５】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接に投与されるか；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されるか；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１６６】
この組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかへの注射によって、あるいは組織の間隙空間への送達によって達成される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式として、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮的適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは多数回投薬スケジュールであり得る。
【０１６７】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
【０１６８】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入により達成され得、これらはすべて当該分野で周知である。
【０１６９】
（ポリヌクレオチド薬学的組成物およびポリペプチド薬学的組成物）
上記の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１７０】
（Ａ．ポリペプチド） １つの例は、以下を包含するポリペプチドであるがこれらに限定されないポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球、マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）もまた、使用され得る。
【０１７１】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど） 含まれ得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１７２】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど） また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。好ましい実施態様において、そのポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含まれ得る。この局面の好ましい実施態様において、そのポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥ−デキストランである。また、キトサンおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）である。
【０１７３】
（Ｄ．脂質およびリポソーム） 所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体または被験体に由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１７４】
脂質カプセル化は、一般的に、核酸を安定に結合または捕捉し得かつ核酸を維持し得る、リポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、または脂質はこれより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１７５】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１）および精製された転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１７６】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから、商品名リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒ（前出）もまた参照のこと）。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に入手可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１７７】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率で、ＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１７８】
このリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を参照のこと。
【０１７９】
（Ｅ．リポタンパク質） さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例として、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１８０】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって示される。
【０１８１】
リポタンパク質は、１つより多いアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するカイロミクロンはアポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥで構成され、経時的にこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａアポタンパク質、Ｂアポタンパク質、Ｃアポタンパク質、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１８２】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；およびＵｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５：２３２に記載されている。
【０１８３】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質が変化する。例えば、カイロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見い出され得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するように選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１８４】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。このような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロ方法または所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡのような販売元から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、ＷＯ９８／０６４３７に見い出され得る。
【０１８５】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤） ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質と共に、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１８６】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ適用、エキソビボ適用、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生存被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１８７】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例として、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）が挙げられる。転写因子はまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸濃縮薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１８８】
有機ポリカチオン性薬剤として、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）が挙げられる。
【０１８９】
ポリカチオン性薬剤の寸法およびその物理的特性は、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤を構築するか、または合成ポリカチオン性薬剤を生成するために、上記の一覧から推定され得る。
【０１９０】
有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンが挙げられる。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１９１】
（免疫診断アッセイ）
本発明のｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓ抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗ｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓ抗体が抗原レベルを検出するために使用され得る）。十分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイが、侵襲性の診断方法を置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質に対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのアッセイは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であり；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。
【０１９２】
免疫診断に適切であり、かつ適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびにアッセイの説明書の適切なセットと共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰め込むことによって構築される。
【０１９３】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いに対する結合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そしてもう一方の配列は、溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は、水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子としては以下が挙げられる：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（デンハルト試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の結合速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
【０１９４】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の結合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究では、ハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０℃〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１９５】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブと検出される配列との間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物についての０．１〜１μｇから、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子についての１０−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い比活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇのプローブとハイブリダイズさせて、わずか１時間の曝露時間で検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、伝統的なアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、露光時間が約２４時間である。
【０１９６】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブは、フラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して遭遇する変数としては、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度およびホルムアミド含量が挙げられる。これらのすべての因子の影響は、以下の一つの式によって概算され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、そしてｎはハイブリッドの長さ（塩基対）である（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変）。
【０１９７】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合に頻繁にありうる）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイズするバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
【０１９８】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性については３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いてホルムアミド含量が下げられ、そしてそれに従って温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の両方を用いて開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【０１９９】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０２００】
核酸プローブは、本発明のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるはずであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
【０２０１】
プローブ配列はｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列（またはその相補鎖）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと、検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さにおけるいくつかの変動は、アッセイ感度の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識として役立ち得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成するために十分なｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列との相補性を有するという条件で、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
【０２０２】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。
【０２０３】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、生成され得る。
【０２０４】
プローブの化学的性質は、優先性に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させ、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性を増大させるためなどに使用され得（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ １４：３７６−３８７を参照のこと）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：３８４−３８６を参照のこと）。
【０２０５】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、二重鎖の安定性を補助するため、または、例えば、都合よい制限部位を組み込むために、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない配列を含み得る。代表的には、このような配列は、所望のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列に隣接する。
【０２０６】
熱安定性ポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。閾値量の標的核酸がポリメラーゼによって生成された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０２０７】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来のブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上の核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いで洗浄されて、すべてのハイブリダイズしていないプローブを除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、このプローブは、放射活性部分で標識される。
【０２０８】
（本発明を実施するための様式）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ４型株（Ａａｂｅｒｇｅら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １８：１４１−１５２）単離体のゲノム配列（２，１６２，５９８塩基対）は、以前は、以下のように参照されていた：ＪＮＲ．７／８７（Ｂｒｉｃｋｅｒら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７２：１３１）；ＫＮＲ．７／８７（ｄｅ Ｓａｉｚｉｅｕら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：４６９６；Ｈａｋｅｎｂｅｃｋら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２４７７）；そしてＮ４（Ｗｉｚｅｍａｎｎら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：１５９３）は、配列番号４９７９として配列表に記載されている（Ｔｅｔｔｌｉｎら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：４９８もまた参照のこと）。
【０２０９】
２４８９個のコード領域を、ＧＬＩＭＭＥＲ２（Ｄｅｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：４６３６−４６４１）を用いて、この配列内で同定した。その核酸配列を、奇数（配列番号１、３、５、・・・４９７５、４９７７）を用いて配列表に示す。２４８９個の領域のうちの２４６９個の領域について、アミノ酸配列を推測し、そしてこれらについては、核酸配列の後に、その推測される翻訳産物（配列番号２、４、６、・・・４９７６、４９７８）を示す。推測される機能を、細胞位置の指標、注目すべき任意の配列モチーフ、およびＨｏｓｋｉｎｓらのＲ６配列における任意の対応するＯＲＦとの類似性の指標と共に配列表のフィールド＜２２３＞に示す。
【０２１０】
種々の試験が、この実施例において同定されたタンパク質のインビボでの免疫原性を評価するために使用され得る。例えば、このタンパク質は、組換え発現され得、そして免疫ブロットにより患者の血清をスクリーニングするために使用され得る。このタンパク質と患者の血清との間のポジティブな反応は、その患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を以前にマウントされている（すなわち、このタンパク質が免疫原である）ことを示す。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するために使用され得る。
【０２１１】
組換えタンパク質もまた、例えば、マウスにおいて抗体を調製するために簡便に使用され得る。これらは、タンパク質が細胞表面上に位置することの直接的な確認のために使用され得る。標識抗体（例えば、ＦＡＣＳについては蛍光標識）が、インタクトな細菌と共にインキュベートされ得、そして細菌表面上の標識の存在が、このタンパク質の位置を確認する。
【０２１２】
２４８９個のコード領域のうちの、１９１０個のコード領域は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ６（Ｈｏｓｋｉｎｓら）においてホモログを有する。これらの１９１０個の領域は、複数系統の診断および／または免疫のために使用され得る。逆に、残りの領域は、Ｒ６株において細菌を区別するために使用され得る。
【０２１３】
２４８９個のコード領域のうちの、４３２個のコード領域は、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９の表ＩＶに列挙された「ＧＢＳｎｎｎ」抗原に対する相同性を示し、従って、免疫および／診断のために有用な抗原であることが推測される。
【０２１４】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型２）の臨床単離体Ｄ３９株の同系遺伝子欠失変異体を、Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ａｍｂｅｒｇら（１９９５）Ｙｅａｓｔ １１：１２７５−１２８０）を用いていくつかのコード領域について調製し、生存率に対する欠失の効果を評価した。正確な遺伝子破壊を、「二重融合」ＰＣＲストラテジーに従う遺伝子スプライシングにより達成した。各々のプロセスを、合計５つのＰＣＲ反応（３つの標準的なＰＣＲ増幅および２つの融合ＰＣＲ反応）を用いて達成した。第１工程を、破壊する各々の遺伝子の上流領域（フラグメントＵ、プライマー：Ｆ１＋Ｒ２）および下流領域（フラグメントＤ、プライマー：Ｆ５＋Ｒ６）および選択マーカー配列（フラグメントＫ、プライマーＦ３＋Ｆ４）を増幅して、その間の遺伝子のリーディングフレームを置換することによって達成した。ａｐｈＡ−３遺伝子（カナマイシン耐性）を、全ての変異体構築物について共通のＫフラグメントとして選択した。それぞれＵ−３’末端およびＤ−５’末端に対して相補的な配列を示す２４ｂｐの５’テイルおよび３’テイルを含むように、これを増幅した。第１の融合ＰＣＲを実施し、ＫにＤを連結した。次いで、各々のＫＤ増幅フラグメントをゲル精製し、そして第２の融合ＰＣＲ反応を、これと対応するＵフラグメントを融合するよう実施した。最終的なキメラ生成物は、遺伝子破壊カセット（ＵＫＤ）を構成する。プライマーＦ１およびＲ６の存在下での最後の融合ＰＣＲの間に、両方のＤＮＡ鎖の３’末端に単一のデオキシアデノシンを添加し得るＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｅｒａ）により、これらを増幅した。各々の構築物を、挿入部位に単一の３’−Ｔ突出部を与えるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、次いでエレクトロポレーションによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。プラスミドミニプレップを、真の組換えコロニーから回収し、そしてキメラ挿入物の正確さを、ＰＣＲによって確認した。プラスミドＤＮＡを使用して、天然のコンピテンスを誘導する合成ＣＳＰ−１を用いてＳｐを形質転換した（Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎら（１９９５）９２：１１１４０−４４）。簡単に言うと、早期の対数増殖期のＤ３９培養物（ＯＤ６００＝０．０５〜０．１）を、１００ｎｇ／ｍｌ ＣＳＰ−１、１０ｍＭグルコース、および１０％不活性化ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充した脳心臓注入ブロス（ＢＨＩＢ）で１：１０に希釈し、そして３７℃および５％ＣＯ２にて１５分間、通気せずにインキュベートした。プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を添加し、そしてサンプルを１時間インキュベートした後、選択的血液寒天プレート（トリプシンダイズ寒天、ＴＳＡ−Ｄｉｆｃｏ、３％の線維素の除かれたヒツジ血液および５００μｇ／ｍｌのカナマイシンが補充されている）上に展開した。増殖を、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１〜２日間行った。５〜１０のＫａｎＲ ＣＦＵを、ＰＣＲ（プライマーＦ１＋Ｒ６）または染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれかにより各々のサンプルについてスクリーニングし、正確な同系遺伝子変異コロニーを選択した。
【０２１５】
以下の配列番号を有する遺伝子のノックアウトは、増殖できなかった。このことは、必須の遺伝子である（すなわち、特に好ましい抗生物質標的であること）を示す：５０４（ＡＢＣｔｒ８３）、６９０（ａｃｃＢ）、６９４（ａｃｃＣ）、９２４（ｂｌｐＢ）、１２８８（ｍｕｒＧ）、１３２８、１４３２（ｆｔｓＥ）、１４３４（ｆｔｓＸ）、２１１６（ｆｔｓＷ）、２２５０（ｅｎｏ）、２４６０（ｖｉｃＸ）、２５５４（ｌｉｃＣ）、２５６４、３０４２、３４８０、３９０４（ｍｕｒｌ）、４８２０（ｐｕｒＸ）、４９０２、および４９２２。さらに、配列番号３３９２（ｐｓａＡ）のノックアウトは、小さいコロニーとして増殖した。これらの配列番号の中で、以下の配列番号が、ヒトまたは他の真核生物に対する配列相同性を有さないことから、特に好ましい：５０４、６９０、１２８８、１４３２、３９０４、４８２０、４９２２（すなわち、抗生物質活性に加えて、抗患者活性に対する能力が低減されている）。
【０２１６】
これらの生存不可能な変異体を作製するために使用したプライマーを以下に示す。
【０２１７】
【表２−１】
【表２−２】
本発明は、例示目的のみによって記載され、本発明の範囲および意図を維持しつつ変更がなされ得ることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の核酸およびタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、グラム陽性球菌である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、成人および５歳以上の子供の急性細菌性髄膜炎の最も一般的な原因である。
【０００４】
本発明の目的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の防止、検出、および処置を改善するための材料を提供することである。
【０００５】
より詳細には、本発明の目的は、ワクチンの開発に使用され得るタンパク質を提供することである。さらなる目的は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の診断に使用され得るタンパク質および核酸を提供すること、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出のために使用され得るタンパク質および核酸を提供すること、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質の発現に有用な核酸を提供すること、ならびに抗生物質研究の有用な標的であるタンパク質を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。これらのアミノ酸配列は、偶数の配列番号２〜４９７８である。
【０００７】
本発明はまた、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列に対する配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これらのタンパク質は、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体を含む。代表的に、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的な等価を示すとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメータ（ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１）を用いたアフィンギャップサーチを用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。
【０００８】
本発明はさらに、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、その配列由来の少なくともｎ個の連続アミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、この配列由来の１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、（ａ）実施例に開示されるタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）実施例に開示されるが、Ｎ末端シグナルペプチドを有さないタンパク質、および（ｃ）実施例に開示されるが、Ｎ末端アミノ酸残基を有さないタンパク質、である。
【０００９】
本発明のタンパク質は、当然、種々の手段（例えば、組換え発現、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの精製、化学合成など）により、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化など）で調製され得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）。本発明のタンパク質は、好ましくは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質である。
【００１０】
好ましいタンパク質は、実施例の表に列挙される４３２個のタンパク質である。
【００１１】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、そして任意の適切な手段により生成され得る。ヒト免疫系との適合性を増大させるために、これらの抗体は、キメラまたはヒト化抗体であり得る（例えば、Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５５（９２０５）：７３５−７４０；ＧｏｒｍａｎおよびＣｌａｒｋ（１９９０）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４５７−４６６）か、あるいは完全ヒト抗体が使用され得る。これらの抗体は、（例えば、診断アッセイのための）検出可能な標識を含み得る。
【００１２】
さらなる局面に従って、本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これらのヌクレオチド配列は、奇数の配列番号１〜４９７７、および配列番号４９７９のゲノム配列である。
【００１３】
さらに、本発明は、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列に対する配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。配列間の同一性は、好ましくは、上記のようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性アルゴリズムによって決定される。
【００１４】
さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中で６５℃）で、実施例に開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００１５】
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた提供される。これらは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列由来の少なくともｎ個の連続ヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、またはそれ以上）である。
【００１６】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号４９７９のヌクレオチド配列を含む核酸；配列番号４９７９に対する配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；（好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下で）配列番号４９７９にハイブリダイズし得る核酸；配列番号４９７９由来の少なくともｎ個の連続ヌクレオチドのフラグメントを含む核酸（ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、１０００００、１００００００またはそれ以上））を提供する。
【００１８】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットまたはサザンブロット、あるいは核酸マイクロアレイまたは「遺伝子チップ」において）および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）などにおいて使用され得る。
【００１９】
本発明は、上記の核酸に相補的な配列を含む核酸を（例えば、アンチセンスまたは探索目的のために、あるいはプライマーとしての使用のために）提供することもまた、理解されるべきである。
【００２０】
本発明に従う核酸は、当然、多くの方法（例えば、化学合成によって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）によって調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブなど）をとり得る。この核酸は、好ましくは、実質的に単離された形態である。
【００２１】
本発明に従う核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識で標識され得る。これは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡにおいてプライマーまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。
【００２２】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むアナログ）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）もまた含む。
【００２３】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２４】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体、および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、免疫原性組成物として、または診断試薬として、またはワクチンとして適切であり得る。
【００２５】
本発明はまた、医薬として（例えば、免疫原性組成物またはワクチンとして）または診断試薬として使用するための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。本発明はまた、（ｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに起因する感染を処置または防止するための医薬；（ｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの存在またはｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／あるいは（ｉｉｉ）ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する抗体を惹起し得る試薬の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を提供する。前記のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、任意の種、属、または株であり得るが、好ましくは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、特に、４型株である。疾患は、髄膜炎、肺炎、敗血症、中耳炎、または耳感染であり得る。
【００２６】
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、治療有効量の本発明の核酸、タンパク質、および／または抗体を患者に投与する工程を包含する。この患者は、この疾患自体の危険を有するか、または妊婦のいずれかであり得る（「先天性免疫」、例えば、ＧｌｅｚｅｎおよびＡｌｐｅｒｓ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：２１９−２２４）。
【００２７】
タンパク質抗原の投与は、免疫を誘導するための好ましい処置方法である。
【００２８】
本発明の抗体の投与は、別の好ましい処置方法である。この受動的免疫方法は、新生児または妊婦に特に有用である。この方法は、代表的に、ヒト化されているか完全なヒト抗体である、モノクローナル抗体を使用する。
【００２９】
本発明はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）核酸配列に含まれる標的配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を備えるキットを提供する。このキットは、第１プライマーおよび第２プライマーを備え、第１プライマーは、この標的配列に実質的に相補的であり、そして第２プライマーは、この標的配列の相補鎖に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有するこのプライマー対は、増幅される標的配列の末端を規定する。第１プライマーおよび／または第２プライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
【００３０】
本発明はまた、一本鎖または二本鎖核酸（またはそれらの混合物）に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）鋳型核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットを提供する。ここで、（ａ）第１オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｂ）第２オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸配列の相補鎖に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｃ）第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、この鋳型核酸に相補的でない配列を含み；そして（ｄ）これらのプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を規定する。特徴（ｃ）の非相補的配列は、好ましくは、プライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。これらの配列の一方または両方は、制限部位（例えば、ＥＰ−Ｂ−０５０９６１２）またはプロモーター配列（例えば、ＥＰ−Ｂ−０５０５０１２）を含み得る。第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み得る。
【００３１】
鋳型配列は、ゲノム配列の任意の部分（例えば、配列番号４９７９）であり得る。例えば、鋳型配列は、ｒＲＮＡ遺伝子またはタンパク質コード遺伝子であり得る。鋳型配列は、好ましくは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的である。
【００３２】
本発明はまた、配列表の配列の１つ以上を含むコンピューター読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなど）および／またはコンピューターデータベースを提供する。この媒体は、好ましくは、配列番号４９７９を含む。
【００３３】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表されるハイブリッドタンパク質を提供する。ここで、Ｘは、上記のような本発明のアミノ酸配列であり、Ｌは、任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎは、１より大きい整数である。ｎの値は、２とｘとの間であり、ｘの値は、代表的に、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。好ましくは、ｎは、２、３、または４であり；より好ましくは、２または３であり；最も好ましくは、ｎ＝２である。各々のｎの例について、−Ｘ−は、同一または異なり得る。［−Ｘ−Ｌ−］の各々のｎの例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、このハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的に、短い（例えば、２０またはそれより小さい（すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわちＧｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。−Ａ−および−Ｂ−は、任意の配列であり、代表的に短い（例えば、４０またはそれより小さい（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）アミノ酸）。例として、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、各Ｘは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列であり；他の実施形態において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、および／またはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ配列の混合物が使用される（適切な配列については、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９の偶数の配列番号２〜１０９６６を参照のこと）。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のタンパク質および核酸は、Ｈｏｓｋｉｎｓら（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（２００１）１８３：５７０９−１７）により開示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの無毒Ｒ６株由来の２０４３のＯＲＦ配列と配列同一性を共有する。他の実施形態において、本発明は、Ｈｏｓｋｉｎｓらにより詳細に開示される２０４３のＯＲＦの１つからなる配列を含まない。
【００３５】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００３６】
本発明のタンパク質を生成するためのプロセスが提供される。このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００３７】
本発明のタンパク質または核酸を生成するためのプロセスが提供される。ここで、このタンパク質または核酸は、化学的手段を用いて一部または全体が合成される。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、（ａ）二重鎖を形成するハイブリダイズ条件下で、本発明に従う核酸プローブと生物学的サンプルとを接触させる工程；および（ｂ）この二重鎖を検出する工程を包含する。
【００３９】
生物学的サンプル中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを検出するためのプロセスもまた提供される。このプロセスは、ハイブリダイズ条件下で、本発明に従う核酸と生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。このプロセスは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど）またはハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中のプローブとのハイブリダイゼーションなど）を含み得る。臨床サンプル中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＣＲ検出は、以前に報告されている（例えば、Ｃｈｅｒｉａｎら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３６０５−３６０８；Ｋｅａｒｎｓら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３４３４；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄ−２５、３８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣを参照のこと）。
【００４０】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスが提供される。このプロセスは、（ａ）抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で、本発明の抗体と生物学的サンプルとを接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程を包含する。
【００４１】
アミノ酸配列を同定するためのプロセスが提供される。このプロセスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノム配列中の推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード領域を検索する工程を包含する。この方法は、代表的に、開始コドンおよび下流配列におけるインフレームの終止コドンの配列のインシリコ検索を含む。これらの開始コドンと終止コドンとの間の領域は、推定タンパク質コード配列である。代表的に、6つの可能性のあるリーディングフレーム全てが検索される。このような分析に適切なソフトウェアとしては、ＯＲＦＦＩＮＤＥＲ（ＮＣＢＩ）、ＧＥＮＥＭＡＲＫ（ＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙおよびＭｃＩｎｉｎｃｈ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ Ｃｈｅｍ．１７：１２２−１３３）、ＧＬＩＭＭＥＲ（Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５４４−５４８；Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５９：２４−３１；Ｄｅｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４６３６−４６４１）、またはＭａｒｋｏｖモデルを使用する他のソフトウェア（例えば、Ｓｈｍａｔｈｏｖら（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：８７４−８７６）が挙げられる。本発明はまた、同定されたアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。次いで、これらのタンパク質は、従来技術を用いて発現され得る。
【００４２】
本発明はまた、試験化合物が、本発明のタンパク質に結合するか否かを決定するためのプロセスを提供する。試験化合物が本発明のタンパク質に結合し、そしてこの結合が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌の生活サイクルを阻害する場合、この試験化合物は、抗生物質としてか、または抗生物質の設計のためのリード化合物として使用され得る。このプロセスは、代表的に、試験化合物と本発明のタンパク質とを接触させる工程、および試験化合物がこのタンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する。これらのプロセスにおいて使用するための本発明の好ましいタンパク質は、酵素（例えば、ｔＲＮＡシンテターゼ）膜トランスポーター、およびリボソームタンパク質である。適切な試験化合物としては、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの改変形態）、ならびに有機低分子（例えば、２００Ｄａと２０００Ｄａとの間のＭＷ）が挙げられる。試験化合物は、個々に提供され得るが、代表的には、ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の一部である。結合相互作用を検出する方法としては、ＮＭＲ、フィルター結合アッセイ、ゲル遅延アッセイ（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、置換アッセイ、表面プラズモン共鳴、逆ツーハイブリッドなどが挙げられる。本発明のタンパク質に結合する化合物は、この化合物とＧＢＳ細菌とを接触させ、次いで、増殖阻害をモニタリングすることにより、抗生物質活性について試験され得る。本発明はまた、これらの方法を用いて同定される化合物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、本発明のタンパク質および以下の抗原の１つ以上を含む組成物を提供する：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＶａｃＡ、ＣａｇＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）および／またはウレアーゼ）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８０９−１８１５；Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１８１６−１８２０；およびＷＯ９６／２９４１２に記載されるタンパク質抗原）（タンパク質「２８７」および誘導体が特に好ましい）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、ＷＯ０１／５２８８５；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）；１０９３−１０９６；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２９５１−２９５８；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３などに開示されるＯＭＶ調製物）；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８に開示される血清型Ｃ由来のオリゴ糖（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３もまた参照のこと））；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原（例えば、Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：３３１−３３２；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２６９−２８５、ｖ；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７）；
Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活性化ウイルス）由来の抗原（例えば、Ｂｅｌｌ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ １９：１１８７−１１８８；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６）；
Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８補遺：Ｓ６３−６８およびＳ７９−８０）；
Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）（例えば、Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ３：９０１−９１５）；
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（必要に応じてパータクチンならびに／またはアグルチノゲン（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ）２および３と組み合わせても）（例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８））；
ジフテリア抗原（例えば、ジフテリア毒素（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編、ＩＳＢＮ０−７２１６−１９４６−０の第３章）、例えばＣＲＭ１９７変異体（例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１−７０））；
破傷風抗原（例えば、破傷風毒素（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第４章））；
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ由来の糖抗原；
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原（例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０）；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、ＷＯ０２／０２６０６；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：１３９７−４０６；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（捕遺３）：Ｓ５２４−５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４；ＷＯ００／３７４９４）；
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原（例えば、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９）；
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原（例えば、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９）；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、ＷＯ９９／２８４７５）；
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１４２）；
ポリオ抗原（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８、１２５−１２６）（例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ）；
狂犬病抗原（例えば、Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５捕遺：Ｓ２−６）（例えば、凍結乾燥不活性化ウイルス（例えば、ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９８ Ｊａｎ １６；４７（１）：１２、１９；ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ））；
麻疹、おたふくかぜ、および／または風疹抗原（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第９、１０、および１１章）； インフルエンザ抗原（例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第１９章）（例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）；
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９捕遺１：Ｓ１０１−１０７）；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁もまた参照のこと）。
【００４４】
糖抗原または炭水化物抗原が含まれる場合、これらは、好ましくは、免疫原性を増強するためにキャリアタンパク質に結合される（例えば、Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７捕遺２：Ｓ２８−３６；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ ３８０５５４９３２６、特に第１０巻：４８−１１４など）。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（例えば、ＥＰ−０３７２５０１）、合成ペプチド（例えば、ＥＰ−０３７８８８１、ＥＰ−０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（例えば、ＷＯ９３／１７７１２）、百日咳タンパク質（例えば、ＷＯ９８／５８６６８；ＥＰ−０４７１１７７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（例えば、ＷＯ００／５６３６０）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（例えば、ＷＯ００／６１７６１）などが挙げられる。任意の適切な結合体化反応が、必要な場合、任意の適切なリンカーと共に使用され得る。
【００４５】
毒素タンパク質抗原は、必要な場合、解毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒）。
【００４６】
ジフテリア抗原がこの組成物中に含まれる場合、これはまた、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、これはまた、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、これはまた、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。
【００４７】
抗原は、好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。
【００４８】
組成物中の抗原は、代表的に、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するのに十分な濃度である。
【００４９】
本発明はまた、本発明の２つ以上（例えば、３、４、５）のタンパク質を含む組成物を提供する。
【００５０】
本発明を実施するため（例えば、ワクチン接種または診断目的のために開示された配列を使用するため）に使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下の通りである。この要約は、本発明の限定ではなく、使用され得る（しかし、必須ではない）実施例を与えるものである。
【００５１】
（概論）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）。
【００５２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使用される。
【００５３】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえも含む。
【００５４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、またはいくらかの添加物を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００５５】
用語「異種」とは、天然では一緒に見出されない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では一緒に見出されないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結される場合、それらは一緒に機能し得る。別の例は、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然では見出されない配置で単一のタンパク質に組み込まれた同一または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００５６】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律単位として振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点によって、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００５７】
「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）より大きく、上記のようにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて算出される。本明細書中で使用される場合、本明細書でその核酸配列が提供される核酸分子または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは第２の単離体のゲノム中に本質的に同じ遺伝子座で存在する核酸分子または領域、および、例えば、変異または組換えにより生ずる自然の変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子または領域である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
【００５８】
（発現系）
ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物細胞、細菌、および酵母と共に使用される発現系、において発現され得る。
【００５９】
（ｉ．哺乳動物系） 哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（３’への）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る割合を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
【００６０】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的であるかまたは調節される（誘導性）かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答細胞においてグルココルチコイドにより誘導され得る。
【００６１】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合せて、エンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常、発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは逆の（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、あるいはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置される場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらが通常、より広い宿主範囲を有することから、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。
【００６２】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００６３】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００６４】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
【００６５】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に一緒に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物複製系としては、複製のためにトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数まで複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００６６】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００６７】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。
【００６８】
（ｉｉ バキュロウイルス系） タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクターに挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、この発現系の構成要素は、以下を含む：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入のために便利な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルス特異的フラグメントに対して配列相同性を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
【００６９】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムとを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態で市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中以降、「Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００７０】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター配列、リーダー配列（所望の場合）、コード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に組み込む。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子、を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
【００７１】
現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶへ導入するために、最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（ＡＴＧからＡＴＴにポリへドリン開始コドンを変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
【００７２】
プラスミドはまた、通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための複製起点を含む。
【００７３】
バキュロウイルス転移ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（５’から３’への）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合には、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は、調節されているかまたは構成的であるかのいずれかであり得る。
【００７４】
ウイルスの感染サイクルの後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開第１２７８３９号および同第１５５４７６号；およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００７５】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のようなバキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようであり、分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようであるので、非昆虫起源のリーダー（例えば、ヒトαインターフェロン（Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のリーダー）もまた、昆虫での分泌を提供するために使用され得る。
【００７６】
組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は細胞内で発現され得るか、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合には、分泌され得る。融合されていない外来タンパク質の優れた細胞内発現には、通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子が必要である。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００７７】
あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００７８】
タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区画を含む。バキュロウイルスウイルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子への挿入であり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位への挿入であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベクターにおいてポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合、ＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列の５’側および３’側の両方に隣接し、そしてポリへドリンプロモーターの下流に配置される。
【００７９】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％と約５％との間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されるウイルスの大半は、なお野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。この発現系の利点は、組換えウイルスを区別することが可能な視覚的なスクリーニングである。ネイティブのウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、それはまた包埋された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折性であり、明るく輝く外見を与え、光学顕微鏡下で容易に確認される。組換えウイルスが感染した細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクション上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で、閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００８０】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染のために開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般には、Ｆｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。
【００８１】
バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のための細胞および細胞培養培地が、市販されている；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、前出のＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
【００８２】
次いで、改変した昆虫細胞を、改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする適切な栄養培地で増殖され得る。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に継続的に発現され、そして目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補充する間、栄養培地を継続的に循環しなければならない。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、その産物を、必要な場合、さらに精製して、培地中にも存在する任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給し得る。
【００８３】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、その条件は、当該分野で公知の事項に基づいて、当業者に容易に確認できる。
【００８４】
（ｉｉｉ 植物系） 当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物体の遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のような特許文献に記載される発現系が挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載されている。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加えて、以下の文献においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモンであるジベレリン酸、およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編，１９８４ Ｐｉｔｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁に見出され得る。他の代謝調節遺伝子が記載される参考文献は；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）である。
【００８５】
代表的には、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列を、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット中に挿入する。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクター中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミド起源またはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から所望の植物宿主へＤＮＡが移動することを可能にするために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広範な宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介転移のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出されない場合は、その構築物は好ましくはまた、植物細胞が形質転換されたか否かの決定に適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見出される。
【００８６】
植物ゲノムへの異種配列の組込みを可能にするために適切な配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内への異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換えのためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。当該分野で公知であるように、さらなる機能をコードする他のＤＮＡ配列もまた、そのベクター中に存在し得る。
【００８７】
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現のための発現カセット中に含まれ得る。通常は一つのみの発現カセットが存在するが、２つ以上の発現カセットも可能である。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加えて、以下のエレメントを含む：プロモーター領域、植物の５’非翻訳配列、開始コドン（構造遺伝子が開始コドンを備えているか否かに依存する）、ならびに転写終結配列および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の固有の制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００８８】
異種コード配列は、本発明に関連する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を引き起こし得る任意の配列を欠く。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためであるので、トランスロケーションを提供するシグナルペプチドを使用することにより、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳へ、アリューロン層または胚盤上皮層を通過する。タンパク質は、そのタンパク質が産生される細胞から分泌される必要はないが、これによって、組換えタンパク質の単離および精製が容易になる。
【００８９】
所望の遺伝子産物の最終的な発現は、真核生物細胞中であるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンとして宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構によってプロセシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコード（ｆａｌｓｅ ｉｎｔｒｏｎ ｃｏｄｅ）のような遺伝的メッセージの一部を欠失することを防止するように実施され得る（ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１：９５−１０５（１９８５））。
【００９０】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いることによって、植物細胞内に直接的に微量注入され得る。Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小ビーズまたは粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいはその表面に核酸を有する小さな粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、トランスジェニックオオムギを作製するためのオオムギ胚乳の粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を教示する）。さらに別の導入方法は、他の実体、ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の融合可能な脂質表面体のいずれかとのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００９１】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレーションされる。高い電界の強さの電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過化し、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂して、そして植物カルスを形成する。
【００９２】
プロトプラストを単離および培養して完全な再生植物を提供し得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、転移された遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、培養細胞あるいは組織（サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない）から再生され得ることが公知である。いくつかの適した植物としては、例えば、以下の属からの種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、およびＤａｔｕｒａ。
【００９３】
再生のための手段は、植物の種によって変化するが、一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織が形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根され得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特に、コーンおよびアルファルファのような種にとって有利である。シュートおよび根は、通常、同時に発生する。効果的な再生は、培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御される場合、再生は十分に再現可能でありそして反復可能である。
【００９４】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は分泌されるか、あるいはこのタンパク質は全植物体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これを回収し得る。あるいは、胚および胚を有さない不完全な種子または他の植物組織を機械的に破壊して、細胞と組織と間の任意の分泌タンパク質を遊離させ得る。その混合物を緩衝液に懸濁して、可溶性タンパク質を回収し得る。次いで、従来のタンパク質の単離方法および精製方法を使用して、組換えタンパク質を精製する。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターを慣用的な方法により調整して、異種タンパク質の発現および回収を最適化する。
【００９５】
（ｉｖ．細菌系） 細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流への（３’への）ｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これはＲＮＡ合成が始まる近接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強するかまたは低下し得る。
【００９６】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【００９７】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌あるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターが作製される（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現をもたらすために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと組み合わされ得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組み合わされたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。
【００９８】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成によりリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のために（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
【００９９】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰ−Ａ−０ ２１９ ２３７）。
【０１００】
融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内因性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結され得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（Ｘａ因子）のための部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部のＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。
【０１０１】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム空間（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、プロセシング部位は、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる。
【０１０２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ２４４ ０４２）。
【０１０３】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。
【０１０４】
通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物としてひとつになる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の有効性に依存して選択され得る。
【０１０５】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡと共に構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０ １２７ ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【０１０６】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌に薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）耐性を付与する遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【０１０７】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにひとつに組み込まれ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。
【０１０８】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか）は、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＰＣＴＷＯ ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【０１０９】
外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ）（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【０１１０】
（ｖ．酵母発現） 酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流への（３’への）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子とは遠位にある。このＵＡＳは、調節された（誘導性の）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させる。
【０１１１】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０ ２８４ ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０ ３２９ ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。
【０１１２】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターが生成され得る。このようなハイブリッドプロモーターの例として、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例として、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０ １６４ ５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に存在する非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【０１１３】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【０１１４】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０ １９６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を有するように作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【０１１５】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【０１１６】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質の遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０ ０１２ ８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号））から獲得され得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−０ ０６０ ０５７）。
【０１１７】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントとして、完全長プレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）が挙げられる（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとして、第１の酵母のプレ配列を用いるが、第２の酵母α因子のプロ領域を用いずに作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【０１１８】
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。
【０１１９】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物に組み立てられる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１２０】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクターに含ませるための適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に関し得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおいて発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして存在し得る。
【０１２１】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子）を含み得、それぞれ、酵母細胞においてツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１） あるいは、上記成分のうちのいくつかが、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーで構成される。
【０１２２】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母について開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１２３】
外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラスト、またはアルカリ陽イオンで処置されたインタクトな酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
【０１２４】
（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、抗原のエピトープの特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これによって、抗体と抗原との結合が可能になる。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１２５】
本発明のタンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質の識別／同定に有用である。
【０１２６】
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、獲得可能な血清量、ならびに標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の利用可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射することによって行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いる）中のタンパク質の１回以上の注射によってブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって、抗体が生成され得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に相当すると考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物の血液をガラスまたはプラスチック製容器に取り出し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、１回の採血につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
【０１２７】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改良版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大リンパ節）を取り出し、そして単一の細胞へ分離する。所望の場合、この脾臓細胞は、（非特異的な接着細胞の除去後）細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへアプライすることによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液と共に洗い落とされない。得られるＢ細胞、または全ての分離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するために誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されるＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
【０１２８】
所望の場合、抗体は（ポリクローナルであってもモノクローナルであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計を用いて定量可能な青色色素へ変換するその能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいう（例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合）。他の特異的結合パートナーとして、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対が挙げられる。同じ標識がいくつかの異なる様式で利用され得るので、上記の記載が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことが、理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として利用され得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として利用され得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識が組み合され得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【０１２９】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療有効量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１３０】
本明細書において使用される用語「治療有効量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療剤の量、あるいは、検出可能な治療効果または予防効果を示す治療剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状の減少を含む。被験体に対する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の状況についての有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１３１】
本発明の目的のために、有効用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１３２】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような、治療剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体で誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような遅く代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１３３】
薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩）が、本明細書中で使用され得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて入手可能である。
【０１３４】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
【０１３５】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１３６】
組成物の直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式として、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または複数回用量スケジュールであり得る。
【０１３７】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１３８】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、これらのキャリアとしては、そのキャリア自体が、その組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当該分野で周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体化され得る。
【０１３９】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントとして、以下が挙げられるが、それらに限定されない：（１）アルミニウム塩（「ミョウバン」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）５％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必ずしも必要ではない）を含み、マイクロフルイダイザー（例えば、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を用いてμ未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ；ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の第１０章）、（ｂ）１０％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する、μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％ Ｓｑａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、またはそれから生成され得る粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９ＴＭが、好ましい。
【０１４０】
上記のように、ムラミルペプチドとして、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
【０１４１】
免疫原性組成物（例えば、免疫剤／原（特に、抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈物（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１４２】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物とするために適切な、固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１４３】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、個体へのその量の投与が、単回用量または、一連の（用量の）一部のいずれかで、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲内にあり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１４４】
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内、または経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ／ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｎｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切なさらなる処方物として、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
【０１４５】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンを使用し得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６１７−６４８、本明細書中後期）。
【０１４６】
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含み、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、インビボまたはエキソビボの様式で、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１４７】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１４８】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、本発明者らは、任意のレトロウイルス遺伝子送達ベクターが本発明において利用可能であることを意図する。これらの遺伝子送達ベクターとして、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）、多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１４９】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロベクターのＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起点は鳥類白血病ウイルスに由来し得る。
【０１５０】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性のレトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによる、宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１５１】
上記のレトロウイルスベクターと共に使用するのに適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３およびＷＯ９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製するために使用され得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を排除する。
【０１５２】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスとして、鳥類白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＶＩｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスが挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとして、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、エーベルソン肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラッフィ肉腫ウイルス、グロス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、カーステン肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ならびにローシャーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、寄託機関または収集機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１５３】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第４，７７７，１２７号、同第５，５９１，６２４号に記載されるベクターが挙げられる。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １もまた参照のこと。
【０１５４】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、上記の参照文書ならびにＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるベクターが挙げられる。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような死滅したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要な例および好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。このベクターにおいて、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドから１８個までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０個のネイティブヌクレオチドから１８個までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０個のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失されているか、または非ネイティブヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブＤ配列は、各々のＡＡＶ逆方向末端反復中のＨＰ形成に関与しない２０個連続するヌクレオチドの配列である（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）。非ネイティブ置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａの米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅの米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎのＷＯ９４／２８８１５７に開示されるベクターである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優先的に発現を指示する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、および同第５，２５２，４７９号に記載される。
【０１５５】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要な例および好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるベクター）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターとしては、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ ７１３４、２ＲＨ １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７およびＶＲ−２６０として寄託されたベクターが挙げられる。
【０１５６】
本発明において使用され得るアルファウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ミドルバーグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）ならびに米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるベクターが挙げられる。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるアルファウイルスベクターが使用可能である。このようなアルファウイルスは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたアルファウイルスベクターが使用される（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１５７】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核生物層状発現系）もまた、本発明の核酸を発現させるのに有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はアルファウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１５８】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、以下に由来するベクターが挙げられる：ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５に記載されるウイルス）；リノウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌ４０１に記載されるウイルス）；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるウイルス）；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：１５３３に記載されるウイルス）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ Ｍｅｄ ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるウイルス）；アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）；ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）；カバソー（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）；チクングニヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）；ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）；ンヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）；ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）；トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）；ユナ（Ｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）；ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）；オニオン（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ）ウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）；西部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２１：１９０に記載のウイルス。
【０１５９】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記のウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、死滅させたアデノウイルスのみに連結しているかまたはしてないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手持ち型の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１６０】
粒子により媒介される遺伝子移入が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで、細胞標的化リガンドに（例えば、ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるようにアシアロオロソムコイドに、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：２５３−２６３に記載されるようにインスリンに、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ３：５３３−５３９に記載されるようにガラクトースに、ラクトースに、またはトランスフェリンに）連結された合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。
【０１６１】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改善され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、このビーズによるエンドサイトーシスの開始後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高めることによってさらに改良され得、それによって、エンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にする。
【０１６２】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような重合性ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。使用に適したさらなる非ウイルス送達としては、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチ）が挙げられる。さらに、コード配列およびそのようなコード配列の発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達のために使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手持ち型の遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）が挙げられる。
【０１６３】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７６：４２０に記載されるリポソームおよびビヒクルである。
【０１６４】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクル（この用語は上記に定義される通りである）を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１６５】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接に投与されるか；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されるか；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１６６】
この組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかへの注射によって、あるいは組織の間隙空間への送達によって達成される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式として、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮的適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは多数回投薬スケジュールであり得る。
【０１６７】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
【０１６８】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入により達成され得、これらはすべて当該分野で周知である。
【０１６９】
（ポリヌクレオチド薬学的組成物およびポリペプチド薬学的組成物）
上記の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１７０】
（Ａ．ポリペプチド） １つの例は、以下を包含するポリペプチドであるがこれらに限定されないポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球、マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）もまた、使用され得る。
【０１７１】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど） 含まれ得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１７２】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど） また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。好ましい実施態様において、そのポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含まれ得る。この局面の好ましい実施態様において、そのポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥ−デキストランである。また、キトサンおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）である。
【０１７３】
（Ｄ．脂質およびリポソーム） 所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体または被験体に由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１７４】
脂質カプセル化は、一般的に、核酸を安定に結合または捕捉し得かつ核酸を維持し得る、リポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、または脂質はこれより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１７５】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性の調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１）および精製された転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１７６】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから、商品名リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒ（前出）もまた参照のこと）。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に入手可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１７７】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率で、ＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１７８】
このリポソームは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を参照のこと。
【０１７９】
（Ｅ．リポタンパク質） さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例として、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１８０】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって示される。
【０１８１】
リポタンパク質は、１つより多いアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するカイロミクロンはアポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥで構成され、経時的にこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａアポタンパク質、Ｂアポタンパク質、Ｃアポタンパク質、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１８２】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；およびＵｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５：２３２に記載されている。
【０１８３】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質が変化する。例えば、カイロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見い出され得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するように選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１８４】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。このような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロ方法または所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡのような販売元から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、ＷＯ９８／０６４３７に見い出され得る。
【０１８５】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤） ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質と共に、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１８６】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ適用、エキソビボ適用、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生存被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１８７】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例として、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）が挙げられる。転写因子はまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸濃縮薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１８８】
有機ポリカチオン性薬剤として、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）が挙げられる。
【０１８９】
ポリカチオン性薬剤の寸法およびその物理的特性は、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤を構築するか、または合成ポリカチオン性薬剤を生成するために、上記の一覧から推定され得る。
【０１９０】
有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンが挙げられる。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１９１】
（免疫診断アッセイ）
本発明のｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓ抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗ｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓ抗体が抗原レベルを検出するために使用され得る）。十分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイが、侵襲性の診断方法を置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のｓｔｒｅｏｔｏｃｏｃｃｕｓタンパク質に対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのアッセイは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であり；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。
【０１９２】
免疫診断に適切であり、かつ適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびにアッセイの説明書の適切なセットと共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰め込むことによって構築される。
【０１９３】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いに対する結合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そしてもう一方の配列は、溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は、水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子としては以下が挙げられる：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（デンハルト試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の結合速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
【０１９４】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の結合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究では、ハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０℃〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１９５】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブと検出される配列との間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物についての０．１〜１μｇから、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子についての１０−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い比活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇのプローブとハイブリダイズさせて、わずか１時間の曝露時間で検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、伝統的なアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、露光時間が約２４時間である。
【０１９６】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブは、フラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して遭遇する変数としては、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度およびホルムアミド含量が挙げられる。これらのすべての因子の影響は、以下の一つの式によって概算され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、そしてｎはハイブリッドの長さ（塩基対）である（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変）。
【０１９７】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合に頻繁にありうる）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイズするバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
【０１９８】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性については３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いてホルムアミド含量が下げられ、そしてそれに従って温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の両方を用いて開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【０１９９】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０２００】
核酸プローブは、本発明のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるはずであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
【０２０１】
プローブ配列はｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列（またはその相補鎖）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと、検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さにおけるいくつかの変動は、アッセイ感度の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識として役立ち得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成するために十分なｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列との相補性を有するという条件で、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
【０２０２】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。
【０２０３】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、生成され得る。
【０２０４】
プローブの化学的性質は、優先性に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させ、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性を増大させるためなどに使用され得（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ １４：３７６−３８７を参照のこと）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：３８４−３８６を参照のこと）。
【０２０５】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、二重鎖の安定性を補助するため、または、例えば、都合よい制限部位を組み込むために、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない配列を含み得る。代表的には、このような配列は、所望のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列に隣接する。
【０２０６】
熱安定性ポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。閾値量の標的核酸がポリメラーゼによって生成された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０２０７】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来のブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上の核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いで洗浄されて、すべてのハイブリダイズしていないプローブを除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、このプローブは、放射活性部分で標識される。
【０２０８】
（本発明を実施するための様式）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ４型株（Ａａｂｅｒｇｅら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １８：１４１−１５２）単離体のゲノム配列（２，１６２，５９８塩基対）は、以前は、以下のように参照されていた：ＪＮＲ．７／８７（Ｂｒｉｃｋｅｒら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７２：１３１）；ＫＮＲ．７／８７（ｄｅ Ｓａｉｚｉｅｕら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：４６９６；Ｈａｋｅｎｂｅｃｋら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２４７７）；そしてＮ４（Ｗｉｚｅｍａｎｎら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：１５９３）は、配列番号４９７９として配列表に記載されている（Ｔｅｔｔｌｉｎら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：４９８もまた参照のこと）。
【０２０９】
２４８９個のコード領域を、ＧＬＩＭＭＥＲ２（Ｄｅｌｃｈｅｒら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：４６３６−４６４１）を用いて、この配列内で同定した。その核酸配列を、奇数（配列番号１、３、５、・・・４９７５、４９７７）を用いて配列表に示す。２４８９個の領域のうちの２４６９個の領域について、アミノ酸配列を推測し、そしてこれらについては、核酸配列の後に、その推測される翻訳産物（配列番号２、４、６、・・・４９７６、４９７８）を示す。推測される機能を、細胞位置の指標、注目すべき任意の配列モチーフ、およびＨｏｓｋｉｎｓらのＲ６配列における任意の対応するＯＲＦとの類似性の指標と共に配列表のフィールド＜２２３＞に示す。
【０２１０】
種々の試験が、この実施例において同定されたタンパク質のインビボでの免疫原性を評価するために使用され得る。例えば、このタンパク質は、組換え発現され得、そして免疫ブロットにより患者の血清をスクリーニングするために使用され得る。このタンパク質と患者の血清との間のポジティブな反応は、その患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を以前にマウントされている（すなわち、このタンパク質が免疫原である）ことを示す。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するために使用され得る。
【０２１１】
組換えタンパク質もまた、例えば、マウスにおいて抗体を調製するために簡便に使用され得る。これらは、タンパク質が細胞表面上に位置することの直接的な確認のために使用され得る。標識抗体（例えば、ＦＡＣＳについては蛍光標識）が、インタクトな細菌と共にインキュベートされ得、そして細菌表面上の標識の存在が、このタンパク質の位置を確認する。
【０２１２】
２４８９個のコード領域のうちの、１９１０個のコード領域は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ６（Ｈｏｓｋｉｎｓら）においてホモログを有する。これらの１９１０個の領域は、複数系統の診断および／または免疫のために使用され得る。逆に、残りの領域は、Ｒ６株において細菌を区別するために使用され得る。
【０２１３】
２４８９個のコード領域のうちの、４３２個のコード領域は、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０４７８９の表ＩＶに列挙された「ＧＢＳｎｎｎ」抗原に対する相同性を示し、従って、免疫および／診断のために有用な抗原であることが推測される。
【０２１４】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型２）の臨床単離体Ｄ３９株の同系遺伝子欠失変異体を、Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ａｍｂｅｒｇら（１９９５）Ｙｅａｓｔ １１：１２７５−１２８０）を用いていくつかのコード領域について調製し、生存率に対する欠失の効果を評価した。正確な遺伝子破壊を、「二重融合」ＰＣＲストラテジーに従う遺伝子スプライシングにより達成した。各々のプロセスを、合計５つのＰＣＲ反応（３つの標準的なＰＣＲ増幅および２つの融合ＰＣＲ反応）を用いて達成した。第１工程を、破壊する各々の遺伝子の上流領域（フラグメントＵ、プライマー：Ｆ１＋Ｒ２）および下流領域（フラグメントＤ、プライマー：Ｆ５＋Ｒ６）および選択マーカー配列（フラグメントＫ、プライマーＦ３＋Ｆ４）を増幅して、その間の遺伝子のリーディングフレームを置換することによって達成した。ａｐｈＡ−３遺伝子（カナマイシン耐性）を、全ての変異体構築物について共通のＫフラグメントとして選択した。それぞれＵ−３’末端およびＤ−５’末端に対して相補的な配列を示す２４ｂｐの５’テイルおよび３’テイルを含むように、これを増幅した。第１の融合ＰＣＲを実施し、ＫにＤを連結した。次いで、各々のＫＤ増幅フラグメントをゲル精製し、そして第２の融合ＰＣＲ反応を、これと対応するＵフラグメントを融合するよう実施した。最終的なキメラ生成物は、遺伝子破壊カセット（ＵＫＤ）を構成する。プライマーＦ１およびＲ６の存在下での最後の融合ＰＣＲの間に、両方のＤＮＡ鎖の３’末端に単一のデオキシアデノシンを添加し得るＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｅｒａ）により、これらを増幅した。各々の構築物を、挿入部位に単一の３’−Ｔ突出部を与えるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、次いでエレクトロポレーションによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。プラスミドミニプレップを、真の組換えコロニーから回収し、そしてキメラ挿入物の正確さを、ＰＣＲによって確認した。プラスミドＤＮＡを使用して、天然のコンピテンスを誘導する合成ＣＳＰ−１を用いてＳｐを形質転換した（Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎら（１９９５）９２：１１１４０−４４）。簡単に言うと、早期の対数増殖期のＤ３９培養物（ＯＤ６００＝０．０５〜０．１）を、１００ｎｇ／ｍｌ ＣＳＰ−１、１０ｍＭグルコース、および１０％不活性化ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を補充した脳心臓注入ブロス（ＢＨＩＢ）で１：１０に希釈し、そして３７℃および５％ＣＯ２にて１５分間、通気せずにインキュベートした。プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を添加し、そしてサンプルを１時間インキュベートした後、選択的血液寒天プレート（トリプシンダイズ寒天、ＴＳＡ−Ｄｉｆｃｏ、３％の線維素の除かれたヒツジ血液および５００μｇ／ｍｌのカナマイシンが補充されている）上に展開した。増殖を、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１〜２日間行った。５〜１０のＫａｎＲ ＣＦＵを、ＰＣＲ（プライマーＦ１＋Ｒ６）または染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれかにより各々のサンプルについてスクリーニングし、正確な同系遺伝子変異コロニーを選択した。
【０２１５】
以下の配列番号を有する遺伝子のノックアウトは、増殖できなかった。このことは、必須の遺伝子である（すなわち、特に好ましい抗生物質標的であること）を示す：５０４（ＡＢＣｔｒ８３）、６９０（ａｃｃＢ）、６９４（ａｃｃＣ）、９２４（ｂｌｐＢ）、１２８８（ｍｕｒＧ）、１３２８、１４３２（ｆｔｓＥ）、１４３４（ｆｔｓＸ）、２１１６（ｆｔｓＷ）、２２５０（ｅｎｏ）、２４６０（ｖｉｃＸ）、２５５４（ｌｉｃＣ）、２５６４、３０４２、３４８０、３９０４（ｍｕｒｌ）、４８２０（ｐｕｒＸ）、４９０２、および４９２２。さらに、配列番号３３９２（ｐｓａＡ）のノックアウトは、小さいコロニーとして増殖した。これらの配列番号の中で、以下の配列番号が、ヒトまたは他の真核生物に対する配列相同性を有さないことから、特に好ましい：５０４、６９０、１２８８、１４３２、３９０４、４８２０、４９２２（すなわち、抗生物質活性に加えて、抗患者活性に対する能力が低減されている）。
【０２１６】
これらの生存不可能な変異体を作製するために使用したプライマーを以下に示す。
【０２１７】
【表２−１】
【表２−２】
本発明は、例示目的のみによって記載され、本発明の範囲および意図を維持しつつ変更がなされ得ることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化１−１】
【化１−２】
【化１−３】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に対して５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
【請求項３】
以下：
【化２−１】
【化２−２】
【化２−３】
【化２−４】
からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する、抗体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項６】
以下：
【化３−１】
【化３−２】
【化３−３】
【化３−４】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
以下：
【化４−１】
【化４−２】
【化４−３】
【化４−４】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下で請求項５〜９のいずれか１項に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質、核酸分子、または抗体を含む、組成物。
【請求項１２】
ワクチン組成物または診断組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌、特にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する疾患または感染を処置または防止するための医薬の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記疾患が、髄膜炎、肺炎、敗血症、中耳炎、または耳感染である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
患者を処置する方法であって、請求項１３に記載の組成物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列に含まれる標的配列を増幅するためのプライマーを備えるキットであって、該キットは第１プライマーおよび第２プライマーを備え、該第１プライマーは、該標的配列に実質的に相補的であり、そして該第２プライマーは、該標的配列の相補鎖に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有する該プライマーの部分は、増幅される該標的配列の末端を規定し、そして該第１プライマーおよび／または該第２プライマーは、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の核酸であるかまたは配列番号４９７９の８〜１００ヌクレオチドのフラグメントである、キット。
【請求項１８】
一本鎖核酸または二本鎖核酸（あるいはそれらの混合物）に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ鋳型核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットであって：（ａ）該第１オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｂ）該第２オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸配列の相補鎖に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｃ）該第１オリゴヌクレオチドおよび／または該第２オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸に相補的でない配列を含み；（ｄ）該プライマー配列は、増幅される該鋳型配列の末端を規定し；そして（ｅ）該第１および／または該第２のオリゴヌクレオチドは、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の核酸であるかまたは配列番号４９７９の８〜１００ヌクレオチドのフラグメントである、キット。
【請求項１９】
式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表されるハイブリッドタンパク質であって、Ｘは、請求項１、２、または３に記載のタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎは、１より大きい整数である、ハイブリッドタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質と試験化合物を接触させる工程、および該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する、アッセイ。
【請求項２１】
以下の抗原：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原；
Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原；
ジフテリア抗原；
破傷風抗原；
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ由来の糖抗原；
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原；
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原；
ポリオ抗原；
狂犬病抗原；
麻疹、おたふくかぜ、および／もしくは風疹抗原；
インフルエンザ抗原；
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原；ならびに／または
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原、
の１つ以上をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２つ以上のタンパク質を含む、組成物。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されている、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【請求項２４】
前記遺伝子が欠失されている、請求項２３に記載のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【請求項２５】
前記欠失遺伝子が同系である、請求項２４に記載のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【請求項１】
以下：
【化１−１】
【化１−２】
【化１−３】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に対して５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
【請求項３】
以下：
【化２−１】
【化２−２】
【化２−３】
【化２−４】
からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する、抗体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項６】
以下：
【化３−１】
【化３−２】
【化３−３】
【化３−４】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
以下：
【化４−１】
【化４−２】
【化４−３】
【化４−４】
からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
高ストリンジェンシー条件下で請求項５〜９のいずれか１項に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質、核酸分子、または抗体を含む、組成物。
【請求項１２】
ワクチン組成物または診断組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌、特にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する疾患または感染を処置または防止するための医薬の製造における、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記疾患が、髄膜炎、肺炎、敗血症、中耳炎、または耳感染である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
患者を処置する方法であって、請求項１３に記載の組成物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ核酸配列に含まれる標的配列を増幅するためのプライマーを備えるキットであって、該キットは第１プライマーおよび第２プライマーを備え、該第１プライマーは、該標的配列に実質的に相補的であり、そして該第２プライマーは、該標的配列の相補鎖に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有する該プライマーの部分は、増幅される該標的配列の末端を規定し、そして該第１プライマーおよび／または該第２プライマーは、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の核酸であるかまたは配列番号４９７９の８〜１００ヌクレオチドのフラグメントである、キット。
【請求項１８】
一本鎖核酸または二本鎖核酸（あるいはそれらの混合物）に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ鋳型核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットであって：（ａ）該第１オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｂ）該第２オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸配列の相補鎖に実質的に相補的なプライマー配列を含み；（ｃ）該第１オリゴヌクレオチドおよび／または該第２オリゴヌクレオチドは、該鋳型核酸に相補的でない配列を含み；（ｄ）該プライマー配列は、増幅される該鋳型配列の末端を規定し；そして（ｅ）該第１および／または該第２のオリゴヌクレオチドは、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の核酸であるかまたは配列番号４９７９の８〜１００ヌクレオチドのフラグメントである、キット。
【請求項１９】
式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表されるハイブリッドタンパク質であって、Ｘは、請求項１、２、または３に記載のタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてｎは、１より大きい整数である、ハイブリッドタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質と試験化合物を接触させる工程、および該試験化合物が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程を包含する、アッセイ。
【請求項２１】
以下の抗原：
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原；
Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原；
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原；
ジフテリア抗原；
破傷風抗原；
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ由来の糖抗原；
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原；
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原；
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原；
ポリオ抗原；
狂犬病抗原；
麻疹、おたふくかぜ、および／もしくは風疹抗原；
インフルエンザ抗原；
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原；ならびに／または
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原、
の１つ以上をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２つ以上のタンパク質を含む、組成物。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されている、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【請求項２４】
前記遺伝子が欠失されている、請求項２３に記載のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【請求項２５】
前記欠失遺伝子が同系である、請求項２４に記載のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌。
【公開番号】特開２００９−２１３４６６（Ｐ２００９−２１３４６６Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０３９２８（Ｐ２００８−３０３９２８）
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５７６２７９（Ｐ２００２−５７６２７９）の分割
【原出願日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【出願人】（５０９１１６６０２）ジェイ．クレイグ・ヴェンター・インスティチュート・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５７６２７９（Ｐ２００２−５７６２７９）の分割
【原出願日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【出願人】（５０９１１６６０２）ジェイ．クレイグ・ヴェンター・インスティチュート・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]