ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく免疫抑制剤
本発明は、医薬品として使用するための、構造式（１）およびその誘導体の化合物に関する。それらは、好ましくは、免疫抑制剤であり、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく作用機序を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用の薬剤として使用するための、以下の構造式（１）の化合物およびその誘導体に関する。
【０００２】
【化１】
【０００３】
上記化合物およびその誘導体は、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく作用機序を備えた、免疫抑制的な薬剤であることが好ましい。
【背景技術】
【０００４】
Ｔリンパ球は、他人からの臓器移植の拒絶反応において、中心的な役割をはたしており、かつ、多かれ少なかれ、自己免疫病の発生に関与している。それゆえ、現状の免疫抑制的な医薬品の作用機序は、Ｔリンパ球の活性化の阻害に基づいている。上記免疫抑制剤は、特異的な法にてリンパ球の活性化経路を阻害していないので、高い毒性を有している。
【０００５】
Ｔリンパ球は、外来物としての移植された器官の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を認識する、抗原レセプタ（ＴＣＲ）を通して活性化される。ＴＣＲは、６コのサブユニットにより形成されている。それらのうちの２つ（ＴＣＲα、ＴＣＲβ）は、抗原ペプチドにリンクされたＭＨＣを認識するための役割を有している。一方、残りの４つ（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ）は、リンパ球の細胞質ヘのシグナル伝達のための役割をはたしている（larcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, W.W. (2003) Immunol Rev, 191, 38-46 において論評）。
【０００６】
ＭＨＣによるＴＣＲの結合後に生じる最初の各プロセスの１つは、Ｓｒｃファミリ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎのチロシンキナーゼを活性化し、上記チロシンキナーゼにより、ＣＤ３の各サブユニットのＩＴＡＭの各チロシンが、リン酸化されて、Ｓｙｋファミリ（ＺＡＰ７０およびＳｙｋ）のチロシンキナーゼのための結合サイトに変換される。
【０００７】
近年まで、上記プロセスは、Ｓｙｋファミリ（特にＺＡＰ７０）のキナーゼからの、分岐する活性化カスケードが生じ、免疫抑制的な薬剤であるシクロスポリンおよびＦＫ５０６のターゲットであるＮＦＡＴを含む種々の転写ファクタの活性化を結果として招来する、シグナル伝達のための直線的なスキームであったと考えられてきた（Lin, J. and Weiss, A. (2001) J Cell Sci, 114, 243-244）。
【０００８】
数年前、本発明の著者らは、ＴＣＲが、活性化された状態において構造的に変化し、Ｎｃｋ適合体が、ＣＤ３εのサブユニットのプロリンリッチな配列（ＰＲＳ）に直接的に置換される結果を生じることを発見した（Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912）。
【０００９】
上記のＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用は、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインのアミノ末端の過剰発現を含む実験によって、および、Ｔリンパ球内へのＡＰＡ１／１の導入によって、ＴＣＲの活性化にとって重要であることが示された。ＡＰＡ１／１は、ＰＲＳと結合し、ＰＲＳをブロック（遮断）する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の免疫抑制剤による重要な問題は、上記免疫抑制剤がリンパ球の経路を特異的に阻害しないことに起因する、上記免疫抑制剤の毒性である。
【００１１】
本発明は、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく、Ｔリンパ球に対するより特異的な、かつ、従来の化合物より二次的な影響がより少ない免疫抑制的な化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＴＣＲ内の構造的な変化およびシグナル伝達の開始の機構の双方において、エフェクタタンパクの置換のための基本的なステップは、本発明の化合物の一部として考慮される。
【００１３】
刺激された抗体とＭＨＣとの結合の後に生じるＴＣＲにおける構造上の変化は、「プルダウン」アッセイによって最初に示された。「プルダウン」アッセイは、ＴＣＲを、ＧＳＴ−Ｎｃｋの融合タンパクのマトリクスに対し誘導的に結合させるものである。
【００１４】
上記生化学的なアッセイは、ＴＣＲが構造的な変化を受ける細胞を、個々に同定し得るものではない。
【００１５】
しかしながら、本発明の著者らは、また、ＡＰＡ１／１抗体が、上記構造的な変化を認識することを示した（Risueno, R.M., Gil, D., Fernandez, E., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2005) Blood, 106, 601-608）。上記抗体は、培養中のＴリンパ球の調製において、また、免疫組織化学的な分野において、使用され得る。
【００１６】
上記試薬は、「プルダウン」以外の操作によって構造上の変化の存在を示すことができることに加えて、上記構造上の変化が生体内において生じていることを示している。その上、上記抗体は、Ｔリンパ球とペプチドアゴニストが負荷された細胞に発現する抗原との間の免疫シナプスを認識するが、部分的なアゴニスト／アンタゴニストによって形成されるシナプスを認識しない。
【００１７】
上記のデータは、ＴＣＲ内の構造上の変化が、Ｔリンパ球による強いアゴニストおよび弱いアゴニストの間の区別と無関係なものであり得、かつ、強いリガンドの認識の間において特定の活性化カスケードを活性化し得るものであることを示唆している。
【００１８】
上記仮説は、胸腺内での展開の間、上記構造上の変化（ＡＰＡ１／１を染色により視覚化された）が、ポジティブ選択を誘導するリガンドの認識の間ではなく、ネガティブ選択を誘導するリガンドの認識の間に生じるという、胸腺内での展開の中での事実によって裏付けられているように思われる（Risueno, R.M., van Santen, H.M. and Alarcon, B. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A., 103, 9625-9630）。
【００１９】
上記構造上の変化が、また、他のＣＤ３のサブユニットの細胞質領域に伝達され、全体的に、ＩＴＡＭのチロシンのリン酸化を含む、ＴＣＲによるシグナル伝達の開始の全体のプロセスに影響する可能性について考慮され得ないけれども、ＴＣＲにおける構造上の変化の、唯一の公知の結果は、ＣＤ３ε上のＰＲＳの露出である（Minguet, S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, I.F. and Schamel, W.W. (2007) Immunity., 26, 43-54）。
【００２０】
しかしながら、ＣＤ３εのＰＲＳのＮｃｋへの置き換えは、上記構造上の変化が、細胞内の活性化経路への伝達の可能な機構である（Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912）。
【００２１】
Ｔリンパ球の活性化における、Ｎｃｋ−ＣＤ３εの相互作用の重要性を示し、かつ、免疫調整剤のためのターゲットとしての上記相互作用を評価するために、合成ペプチドが、ＣＤ３εの結合サイトへのＮｃｋの結合をブロックし得る、ＰＲＳの配列を模倣するようにデザインされた。１１Ｒ０８５と命名されたペプチドは、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインとＣＤ３εとの相互作用の阻害に関するネイティブな野生の配列を備えたペプチドより３００倍以上の能力を有するものとして得られた。
【００２２】
上記ペプチドを用いると、人のＴリンパ球の増殖は、約２０μＭのＩＣ５０によるアンチＣＤ３抗体への刺激への応答において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方にて、特異的に阻害された。一方、異なるレセプタであるＩＬ２Ｒに依存する人のＴリンパ球の増殖は、３倍の濃度であっても、上記ペプチドによって実際上影響されなかった。
【００２３】
それゆえ、ペプチド１１Ｒ０８５は、ＴＣＲにより開始される活性化を阻害するが、他のレセプタにより媒介される活性化を阻害しないので、ターゲット分子をデザインするための特異的なものである。
【００２４】
ペプチド１１Ｒ０８５は、また、ＩＬ２の生成を阻害し、かつ、約５μＭのＩＣ５０にて処理された、ＯＴ−１トランスジェニックマウスの１次リンパ球内の抗原によって誘導される増殖を阻害する。それゆえ、免疫抑制剤の開発のためのターゲット分子としてＮｃｋ−ＣＤ３εの相互作用は、有効なものとして評価された。
【００２５】
上記情報およびバイオインフォマティックスの選択戦略を用いて、ＳＨ３．１ドメインに結合する化合物のバーチャルスクリーニングが、本発明の各実施例内にて実行された。上記スクリーニング後、１０個の候補化合物が選択された。候補化合物は、ＳＨ３．１の疎水性ポケットに最も良く適合し、ＣＤ３εのＰＲＳ配列を認識可能なものである（図１を参照）。
【００２６】
これらの、構造上、極めて互いに異なる各化合物の全ては、ある程度の活性を有するが、そのうちの、最も高い活性、かつ、高い投与量でもより低い毒性を示した（図７）１つは、ＣＢＭ−１と命名された化合物であった。上記化合物は、構造式（１）を有するものである。
【００２７】
良い活性と免疫抑制能を示した化合物ＣＢＭ−１は、アンチＣＤ３抗体によって誘導される人のＴリンパ球の増殖を阻害するが、ＩＬ２依存性の増殖を阻害しない。また、化合物ＣＢＭ−１は、抗原依存性のマウスのＴリンパ球の増殖、およびＩＬ２の放出を阻害した。
【００２８】
化合物ＣＢＭ−１は、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦβの生成を阻害すると共に、アンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８の各抗体により刺激される人のリンパ球内のアンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８に対応してＩＦＮγを生成する人の細胞の発生も阻害した。
【００２９】
上記の各データは、上記化合物が、０．１μＭといった低濃度にて、好ましくは、０．１μＭと１μＭとの間の濃度にて、人とマウスとの双方において、Ｔリンパ球の活性化について、阻害作用を有することを立証している。
【００３０】
それゆえ、ＣＢＭ−１は、免疫抑制的な薬剤としての活性を備えるものである。上述したように、本発明の第１の観点は、医薬品、好ましくは免疫抑制剤として使用するための、式（１）の化合物またはその誘導体に関する。上記誘導体は、その塩類、アイソマー類またはアイソマー類の混合物、プロドラッグ類、結晶型などを含む。
【００３１】
【化２】
【００３２】
本発明のアイソマー類またはアイソマー類の混合物は以下に示す意味にて理解される。
１）上記化合物の複数の各結合部位に関する各置換基の位置によって規定されるＺまたはＥのアイソマー類。
２）上記化合物の光学活性（エナンチオマーの溶液中に通して偏光光の回転）についての各エナンチオマー間の違いを生じるキラル中心（４つの互いに異なる置換基に結合された原子）の存在によって生じる、光学的アイソマー、つまりエナンチオマー。
３）少なくとも２つのキラル中心を有し、各中心の置換基が同じアイソマー、かつ、各中心の各置換基が異なるアイソマー、つまりジアステレオアイソマー。
【００３３】
式（１）の化合物の「プロドラッグ」の語句は、個体に投与されたときに、上記式（１）の１つまたは幾つかの化合物を直接的にまたは間接的に提供可能な何れの誘導体（例えば、エステル類、カルバメート類、アミド類など）に関するものと理解される。
【００３４】
上記誘導体の規定は、また、上記式（１）の化合物の「結晶形態］が、フリー状態や、溶媒化合物の形態であることを含む。本明細書にて使用される「溶媒化合物」の語句は、ドラッグの組成に使用されること、および、ドラッグの調製に有用な溶媒化合物の双方を含む。溶媒化合物は、当業者であれば公知の溶媒和の従来方法によって得られる。
【００３５】
本発明における「塩」の語句は、ドラッグの調製において有用であり得る、医薬品において許容され得るもの、および、医薬品において許容され得ないものの双方であると理解される。
【００３６】
最後に、「誘導体」の規定は、同位元素の原子量を増やした原子を１以上有する、本発明の化合物を含む。例えば、本発明の各化合物の１つの化合物において、１または幾つかの水素原子が、重水素や三重水素に置換されたり、１または幾つかの炭素原子が、13Ｃや14Ｃの原子に置換されたり、または、１または幾つかの窒素原子が、15Ｎの原子に置換されたりする。
【００３７】
式（１）の上記化合物は、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインに結合して、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用を遮断することによって、他の免疫抑制剤と比較して、明らかな利点を有する、Ｔリンパ球の、特異的な免疫抑制剤であり、より少ない２次効果を引き起こす１つのものである。
【００３８】
それゆえ、本発明の１観点は、Ｔリンパ球の過剰増殖に関連する病気の治療および／または防止のためのドラッグの調製において、上記構造式（１）の化合物またはその誘導体の使用である。
【００３９】
上記病気は、好ましくは、自己免疫病、臓器移植や器官や組織の外部からの移植の拒絶反応に関連する病気、リンパ腫、および／または、Ｔ型白血病である。
【００４０】
自己免疫病は、Ｔリンパ球の活性化が、誘導および／またはエフェクタのフェーズにおいて重要な役割をはたす病気がより好ましい。より好ましい、全身の器官特異的な自己免疫病のリストは、多発性硬化症およびその変種、全身性のルーパスエリテマトーセス、乾癬、白班、リューマチ様関節炎、喘息、自己免疫性肝炎、Ｉ型の糖尿病、重症筋無力症、癒着性脊椎炎、クローン病（Crohn's disease）などを含む。
【００４１】
本発明の他の観点は、構造式（１）の化合物、または、上記化合物の前述した誘導体のと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬剤組成物を志向する。
【００４２】
上記各観点の場合では、上記組成物は、使用される投与型に適合するであろう。それゆえ、上述の上記組成物は、経口的な投与のための、固体（例えば、錠剤、ピル、カプセルなど）または液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョンなど）の何れかの薬剤形態にて、非経口的な投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内など）のための薬剤形態にて、直腸投与などの薬剤形態にて、または、臨床上許容される他の投与形態の何れにて、かつ、治療上にて有効な投与量にて提供される。
【００４３】
上記組成物に使用可能な、薬学的に許容可能な補薬および賦形剤は、当業者において通常使用される賦形剤である。本発明により提供される、薬学的な上記組成物は、何れの投与ルートにより投与され得るので、上記組成物は、上記選択された投与ルートのための好適な薬学的形態にて製剤化されるであろう。
【００４４】
本明細書の記載および請求項の記載を通して、「含む」およびそれに関連する語句は、他の技術的特徴、添加物、組成、または、各ステップを排除することを意図していない。本発明の技術分野の専門家にとって、本発明の他の、目的、利点および特徴は、本明細書の記載の一部から、かつ、本発明の実行の一部から明らかであろう。以下に示す、図面および実施例は、説明のためにのみ提供され、本発明を限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＳＨ３．１ドメインのモデル、および、結合が可能な各化合物のバーチャルスクリーニングを示す概略図である。ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインに結合する各化合物のバーチャルスクリーニング。ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインの構造の理論的モデル（パネルＡ）。パネルＢは、上記各化合物の１つが、上記バーチャルモデルの上部部分に対し、どのように適合するかを示す。
【図２】アンチＣＤ３により誘導される増殖に関する上記バーチャルスクリーニングの結果から得られた各化合物の選択的効果を示すグラフである。増殖は、ＣＤ８＋の集合体内での緑蛍光体（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。相異する各化合物は、順に番号が付与されたＮＳＩコードによって表されている。ＣＢＭ-１は、化合物ＮＳＩ−６５である。
【図３】アンチＣＤ３により誘導される増殖に関する化合物ＣＢＭ-１の選択的効果を示すグラフである。アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球の増殖における、ＣＢＭ-１による阻害。上記結果は、人のＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖の結果と比較された。
【図４】ＣＢＭ-１による、サイトカインの放出の阻害を示すグラフである。アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球によるサイトカインの分泌における、ＣＢＭ-１による阻害。健康なドナーから精製された抹消血単核球（ＰＢＭＮＣ）が、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、種々な濃度のＣＢＭ-１の存在下において、７２時間、刺激された。上清（ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＦＮ−β）中の示されたサイトカインの濃度は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー（ＢＤサイトメトリックビーズアレイ）により評価された。化合物ＣＢＭ-１は、ＩＬ５、ＩＬ１-β、ＩＬ６の放出に影響しなかった。一方、ＩＬ２、ＩＬ４は、検出されなかった。
【図５】ＩＮＦγの細胞内生成の阻害を示すグラフである。アンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８の混合物による刺激に対応した、ＩＮＦγの細胞内での発現。上記グラフは、ＩＮＦγの細胞内での発現（ポジティブ細胞と平均蛍光との積として）を、ＣＢＭ-１の濃度の関数として示す。
【図６Ａ】ＳＨ３．１ドメインおよび高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。５つの各βシートは、順番に番号が付与されている。ＮとＣとは、それぞれ、アミノ末端、カルボキシ末端を示す。
【図６Ｂ】ＳＨ３．１ドメインおよび高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインへの、高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合により置換された残部と、Ｎｃｋαの残部との比較。
【図７】ＳＨ３．１ドメインおよびＣＢＭ-１の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＳＨ３．１ドメイン内のアミノ酸残部の置換は、化合物ＣＢＭ-１との相互作用により生じた。上記アミノ酸の位置が上記化合物と結合後に変化した上記アミノ酸の水平鎖を示している。上記変化は、化合物ＣＢＭ-１が、バーチャルスクリーニングにて視覚化された上記ポケットに結合した結果生じたものである。
【図８】ＣＢＭ-１の毒性を示すグラフである。人のジャーカットのＴリンパ球株および人のラジのリンパ芽球様Ｂ細胞株が、示された濃度のＣＢＭ-１と共に４８時間培養された。上記化合物の毒性は、プロピジウムイオダイド（propidium iodide）排除およびフローサイトメトリーにより評価された。上記２つの株は、上記化合物の最大濃度においても、４８時間後において、１００％の生存率にて生存していた。
【図９】ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの１次配列と、ＮｃｋβのＳＨ３．１ドメインの１次配列、ＮｃｋαのＳＨ３．２ドメインの１次配列、およびＮｃｋαのＳＨ３．３ドメインの１次配列との比較を示す図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメイン内の各βシートおよび各結合ループの各位置が示されている。各黒矢印は、ＣＢＭ-１の結合後に強く置換された残部を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、本発明の化合物を同定し、上記化合物の効果を示すために、実行された作業を説明する、本発明者らにより実行された幾つかの試験結果により、以下に例示される。
【００４７】
（実施例１）Ｔリンパ球の活性化に関する、Ｎｃｋ-ＣＤ３εの相互作用を阻害する各ペプチドの効果
Ｔリンパ球の活性化に関する、Ｎｃｋ-ＣＤ３εの相互作用の重要性を示し、免疫調整剤のためのターゲットとして上記相互作用を評価するために、各合成ペプチドが、ＰＲＳの配列を模倣し、ＮｃｋのＣＤ３εの結合サイトへの結合をブロックし得るようにデザインされた。
【００４８】
１１Ｒ０８５と命名されたペプチドは、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインとＣＤ３εとの相互作用の阻害に関するネイティブな野生の配列を備えたペプチドより３００倍以上の能力を有するものとして得られた。
【００４９】
上記ペプチドを用いると、人のＴリンパ球の増殖は、約２０μＭのＩＣ５０によるアンチＣＤ３抗体への刺激への応答において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方にて、特異的に阻害された。一方、異なるレセプタであるＩＬ２Ｒに依存する人のＴリンパ球の増殖は、３倍の濃度であっても、上記ペプチドによって実際上影響されなかった。
【００５０】
上記の結果は、ペプチド１１Ｒ０８５が、ＴＣＲにより開始される活性化を阻害するが、他のレセプタにより媒介される活性化を阻害しないので、ターゲット分子をデザインするための特異的なものであることを示唆している。
【００５１】
ペプチド１１Ｒ０８５は、また、ＩＬ２の生成を阻害し、かつ、約５μＭのＩＣ５０にて処理された、ＯＴ−１トランスジェニックマウスの１次リンパ球における、抗原により誘導される増殖を阻害する。それゆえ、免疫抑制剤の開発のためのターゲット分子としてＮｃｋ−ＣＤ３εの相互作用は、有効なものとして評価された。
【００５２】
（実施例２）Ｎｃｋ−ＣＤ３εの相互作用をブロックする可能性を有する各化合物のバーチャルスクリーニングによる選択および上記各化合物の免疫抑制剤としての能力の評価
他のタンパクの５０種類の公知のＳＨ３ドメインの幾つかの構造およびその配列に基づく同一性による、ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの構造を得るように、分子モデリング技術（Fiser, A., Feig, M., Brooks, C.L., 3rd and Sali, A. (2002) Acc. Chem. Res., 35, 413-421）が用いられた。
【００５３】
上記技術の方法では、上記構造の理論的なモデルが、上記ドメインの実構造に非常に類似すると考えられるものとして得られた。上記構造から開始して、本発明者らのソフトウエアによるバーチャルスクリーニングが、北アメリカカンパニーケンブリッジにより提供された３０００００個以上の各化合物のコレクションについて実行された。１０個の各化合物が、ＳＨ３．１の疎水性のポケットに対して、理論的に最も良く適合するものとして選択された。上記ポケットは、ＣＤ３εのＰＲＳ配列の認識についての原因となるものと考えられている（図１を参照）。
【００５４】
上記各化合物は、アンチＣＤ３抗体により刺激される人のＴリンパ球の増殖を阻害するアッセイを実行するために、後に使用された。
【００５５】
（実施例３）アンチＣＤ３により誘導される増殖に関するバーチャルスクリーニングの結果から得られた上記各化合物の選択的な効果
Ｎｃｋ−ＣＤ３の相互作用のブロックする可能性によるバーチャルスクリーニングの結果から得られる上記各化合物の選択の次のラウンドのために、健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣが、蛍光によりラベル化され、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、種々な濃度の上記各化合物の存在下において、５日間培養された。
【００５６】
増殖は、ＣＤ８＋の集合体内での緑蛍光（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。試験された各化合物の全ては、リンパ球の増殖に対して、ある程度の活性を有するが、図２に示されるように、そのうちの、最も高い活性、かつ、より低い毒性を示したものは、ＣＢＭ−１（構造式（１）の化合物）と命名された化合物であった。ＣＢＭ-１は、化合物ＮＳＩ−６５である。
【００５７】
（実施例４）アンチＣＤ３により誘導される増殖に関するＣＢＭ−１の選択的な効果
健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣが、ＣＦＳＥによりラベル化され、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、上記各化合物の内の、ＣＢＭ−１にて示された化合物の種々な濃度での存在下において、５日間培養された。
【００５８】
増殖は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方の集合体内での緑蛍光（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。同様な実験が、人の、ＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖についても実行された。健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣは、ＰＨＡにより４８時間刺激され、ＣＦＳＥにてラベル化された。
【００５９】
続いて、上記２つの実験は、人の組み換えＩＬ２の１００ＩＵ／ｍｌの存在下、特にＣＢＭ−１として使用される化合物の各濃度での存在下にて３日間培養された。
【００６０】
化合物ＣＢＭ−１は、２μＭのＩＣ５０と共のアンチＣＤ３により誘導される、ＣＤ４＋のリンパ球の増殖、および、３μＭのＩＣ５０により誘導される、ＣＤ８＋のリンパ球の増殖を阻害した。他の各化合物の阻害効果は、少し小さかった。
【００６１】
しかしながら、ＣＢＭ−１は、２０μＭの濃度で、人の、ＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖を顕著には阻害しなかった。このことは、ＣＢＭ−１は、ＴＣＲ活性化に依存する増殖に対して特異的であり、ＩＬ２Ｒに依存する増殖には特異的ではないことを示している。このデータは、ＴＣＲに関する選択的な作用機序をサポートしている。
【００６２】
（実施例５）アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球によるサイトカインの分泌の阻害
サイトカインの生成に関するＣＢＭ-１の効果が、人のＰＢＭＮＣが、アンチＣＤ３抗体刺激されるアッセイにて測定された。上記細胞の上清が、７２時間後に採取された。数種類のサイトカインが、同時に、フローサイトメトリーアッセイによって測定された。
【００６３】
上記各実験は、上記化合物が、サイトカインＴｈ１およびＩＢＦγ（０．３μＭのＩＣ５０）、サイトカインＴＦＮ−β（０．２μＭのＩＣ５０）、並びにサイトカインＩＬ−１０（０．２μＭのＩＣ５０）について、可能な阻害効果を有することを示し（図４）、３０μＭの濃度まででもＩＬ５、ＩＬ６の生成に影響しないことを示した。
【００６４】
それゆえ、上記データは、ＣＢＭ-１が、Ｔリンパ球による幾つかの各サイトカインの生成を選択的に阻害し、他のサイトカインの生成を阻害しないことを示した。つまり、ＣＢＭ-１は、細胞内のシグナル伝達経路の阻害において、ある程度の選択性を示す。
【００６５】
（実施例６）アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞による、細胞内でのＩＦＮγの発現の阻害
阻害剤が、Ｔｈ０リンパ球のＴｈ１リンパ球への分化を防止するか否かを示すために、分化アッセイが、試験管内にて実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞が、アンチＣＤ３＋抗体、アンチＣＤ２８抗体と共に、４８時間、示された各濃度でのＣＢＭ-１の存在下にて刺激され、さらに６時間、ブレフェルジンＡと共に培養された。
【００６６】
ＣＢＭ-１は、０．８μＭのＩＣ５０と共でのＴｈ１リンパ球のＩＦＮγの分泌の生成を阻害したことが見出された。上記細胞は、最初、ＣＤ４−ＰＥにて染色され、固定および洗浄後、アンチＩＮＦγ抗体にて染色された。図５は、ＩＮＦγの細胞内での発現（ポジティブ細胞のパーセントと平均蛍光との積として）を、ＣＢＭ-１の濃度の関数として示す。
【００６７】
（実施例７）ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの三次元構造のＮＭＲでの決定
ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの三次元構造が、ペプチド１１Ｒ０８５の存在下および非存在下にて同様な方法にて決定された（キミカ−フィスカ ロカソラノ（ＣＳＩＣ、マドリッド）のマリアアンジェレジメネス教授およびマニュエルリコ教授の研究室と共同研究）（図６）。
【００６８】
上記結果は、バーチャルスクリーニングのために使用される、コンピュータモデルによる構造の予測の有効性を示すことが可能となった。さらに、バーチャルスクリーニングは、化合物ＣＢＭ-１により生じる上記構造の化学的な置換の測定を可能にした（図７）。
【００６９】
上記結果は、ＣＢＭ-１が、バイオインフォマティックスの研究によって予測されるように、上記タンパクと構造上にて相互作用することを示した。上記化合物は、各残基Ｔｒｐ４１およびＴｒｐ／Ｐｈｅ５３の関与した、疎水性のポケットに結合する。上記結合は、β２−シートの、かつ、末端ループの残基の歪みおよび置換を生じる（図７および図９）。ＳＨ３．１ドメイン内の各残基の置換は、ＳＨ３．１ドメインとＣＢＭ-１との相互作用の予測を有効なものにし、また、上記モデルと一致する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用の薬剤として使用するための、以下の構造式（１）の化合物およびその誘導体に関する。
【０００２】
【化１】
【０００３】
上記化合物およびその誘導体は、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく作用機序を備えた、免疫抑制的な薬剤であることが好ましい。
【背景技術】
【０００４】
Ｔリンパ球は、他人からの臓器移植の拒絶反応において、中心的な役割をはたしており、かつ、多かれ少なかれ、自己免疫病の発生に関与している。それゆえ、現状の免疫抑制的な医薬品の作用機序は、Ｔリンパ球の活性化の阻害に基づいている。上記免疫抑制剤は、特異的な法にてリンパ球の活性化経路を阻害していないので、高い毒性を有している。
【０００５】
Ｔリンパ球は、外来物としての移植された器官の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を認識する、抗原レセプタ（ＴＣＲ）を通して活性化される。ＴＣＲは、６コのサブユニットにより形成されている。それらのうちの２つ（ＴＣＲα、ＴＣＲβ）は、抗原ペプチドにリンクされたＭＨＣを認識するための役割を有している。一方、残りの４つ（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ）は、リンパ球の細胞質ヘのシグナル伝達のための役割をはたしている（larcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, W.W. (2003) Immunol Rev, 191, 38-46 において論評）。
【０００６】
ＭＨＣによるＴＣＲの結合後に生じる最初の各プロセスの１つは、Ｓｒｃファミリ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎのチロシンキナーゼを活性化し、上記チロシンキナーゼにより、ＣＤ３の各サブユニットのＩＴＡＭの各チロシンが、リン酸化されて、Ｓｙｋファミリ（ＺＡＰ７０およびＳｙｋ）のチロシンキナーゼのための結合サイトに変換される。
【０００７】
近年まで、上記プロセスは、Ｓｙｋファミリ（特にＺＡＰ７０）のキナーゼからの、分岐する活性化カスケードが生じ、免疫抑制的な薬剤であるシクロスポリンおよびＦＫ５０６のターゲットであるＮＦＡＴを含む種々の転写ファクタの活性化を結果として招来する、シグナル伝達のための直線的なスキームであったと考えられてきた（Lin, J. and Weiss, A. (2001) J Cell Sci, 114, 243-244）。
【０００８】
数年前、本発明の著者らは、ＴＣＲが、活性化された状態において構造的に変化し、Ｎｃｋ適合体が、ＣＤ３εのサブユニットのプロリンリッチな配列（ＰＲＳ）に直接的に置換される結果を生じることを発見した（Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912）。
【０００９】
上記のＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用は、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインのアミノ末端の過剰発現を含む実験によって、および、Ｔリンパ球内へのＡＰＡ１／１の導入によって、ＴＣＲの活性化にとって重要であることが示された。ＡＰＡ１／１は、ＰＲＳと結合し、ＰＲＳをブロック（遮断）する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の免疫抑制剤による重要な問題は、上記免疫抑制剤がリンパ球の経路を特異的に阻害しないことに起因する、上記免疫抑制剤の毒性である。
【００１１】
本発明は、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用のブロックに基づく、Ｔリンパ球に対するより特異的な、かつ、従来の化合物より二次的な影響がより少ない免疫抑制的な化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＴＣＲ内の構造的な変化およびシグナル伝達の開始の機構の双方において、エフェクタタンパクの置換のための基本的なステップは、本発明の化合物の一部として考慮される。
【００１３】
刺激された抗体とＭＨＣとの結合の後に生じるＴＣＲにおける構造上の変化は、「プルダウン」アッセイによって最初に示された。「プルダウン」アッセイは、ＴＣＲを、ＧＳＴ−Ｎｃｋの融合タンパクのマトリクスに対し誘導的に結合させるものである。
【００１４】
上記生化学的なアッセイは、ＴＣＲが構造的な変化を受ける細胞を、個々に同定し得るものではない。
【００１５】
しかしながら、本発明の著者らは、また、ＡＰＡ１／１抗体が、上記構造的な変化を認識することを示した（Risueno, R.M., Gil, D., Fernandez, E., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2005) Blood, 106, 601-608）。上記抗体は、培養中のＴリンパ球の調製において、また、免疫組織化学的な分野において、使用され得る。
【００１６】
上記試薬は、「プルダウン」以外の操作によって構造上の変化の存在を示すことができることに加えて、上記構造上の変化が生体内において生じていることを示している。その上、上記抗体は、Ｔリンパ球とペプチドアゴニストが負荷された細胞に発現する抗原との間の免疫シナプスを認識するが、部分的なアゴニスト／アンタゴニストによって形成されるシナプスを認識しない。
【００１７】
上記のデータは、ＴＣＲ内の構造上の変化が、Ｔリンパ球による強いアゴニストおよび弱いアゴニストの間の区別と無関係なものであり得、かつ、強いリガンドの認識の間において特定の活性化カスケードを活性化し得るものであることを示唆している。
【００１８】
上記仮説は、胸腺内での展開の間、上記構造上の変化（ＡＰＡ１／１を染色により視覚化された）が、ポジティブ選択を誘導するリガンドの認識の間ではなく、ネガティブ選択を誘導するリガンドの認識の間に生じるという、胸腺内での展開の中での事実によって裏付けられているように思われる（Risueno, R.M., van Santen, H.M. and Alarcon, B. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A., 103, 9625-9630）。
【００１９】
上記構造上の変化が、また、他のＣＤ３のサブユニットの細胞質領域に伝達され、全体的に、ＩＴＡＭのチロシンのリン酸化を含む、ＴＣＲによるシグナル伝達の開始の全体のプロセスに影響する可能性について考慮され得ないけれども、ＴＣＲにおける構造上の変化の、唯一の公知の結果は、ＣＤ３ε上のＰＲＳの露出である（Minguet, S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, I.F. and Schamel, W.W. (2007) Immunity., 26, 43-54）。
【００２０】
しかしながら、ＣＤ３εのＰＲＳのＮｃｋへの置き換えは、上記構造上の変化が、細胞内の活性化経路への伝達の可能な機構である（Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Cell, 109, 901-912）。
【００２１】
Ｔリンパ球の活性化における、Ｎｃｋ−ＣＤ３εの相互作用の重要性を示し、かつ、免疫調整剤のためのターゲットとしての上記相互作用を評価するために、合成ペプチドが、ＣＤ３εの結合サイトへのＮｃｋの結合をブロックし得る、ＰＲＳの配列を模倣するようにデザインされた。１１Ｒ０８５と命名されたペプチドは、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインとＣＤ３εとの相互作用の阻害に関するネイティブな野生の配列を備えたペプチドより３００倍以上の能力を有するものとして得られた。
【００２２】
上記ペプチドを用いると、人のＴリンパ球の増殖は、約２０μＭのＩＣ５０によるアンチＣＤ３抗体への刺激への応答において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方にて、特異的に阻害された。一方、異なるレセプタであるＩＬ２Ｒに依存する人のＴリンパ球の増殖は、３倍の濃度であっても、上記ペプチドによって実際上影響されなかった。
【００２３】
それゆえ、ペプチド１１Ｒ０８５は、ＴＣＲにより開始される活性化を阻害するが、他のレセプタにより媒介される活性化を阻害しないので、ターゲット分子をデザインするための特異的なものである。
【００２４】
ペプチド１１Ｒ０８５は、また、ＩＬ２の生成を阻害し、かつ、約５μＭのＩＣ５０にて処理された、ＯＴ−１トランスジェニックマウスの１次リンパ球内の抗原によって誘導される増殖を阻害する。それゆえ、免疫抑制剤の開発のためのターゲット分子としてＮｃｋ−ＣＤ３εの相互作用は、有効なものとして評価された。
【００２５】
上記情報およびバイオインフォマティックスの選択戦略を用いて、ＳＨ３．１ドメインに結合する化合物のバーチャルスクリーニングが、本発明の各実施例内にて実行された。上記スクリーニング後、１０個の候補化合物が選択された。候補化合物は、ＳＨ３．１の疎水性ポケットに最も良く適合し、ＣＤ３εのＰＲＳ配列を認識可能なものである（図１を参照）。
【００２６】
これらの、構造上、極めて互いに異なる各化合物の全ては、ある程度の活性を有するが、そのうちの、最も高い活性、かつ、高い投与量でもより低い毒性を示した（図７）１つは、ＣＢＭ−１と命名された化合物であった。上記化合物は、構造式（１）を有するものである。
【００２７】
良い活性と免疫抑制能を示した化合物ＣＢＭ−１は、アンチＣＤ３抗体によって誘導される人のＴリンパ球の増殖を阻害するが、ＩＬ２依存性の増殖を阻害しない。また、化合物ＣＢＭ−１は、抗原依存性のマウスのＴリンパ球の増殖、およびＩＬ２の放出を阻害した。
【００２８】
化合物ＣＢＭ−１は、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦβの生成を阻害すると共に、アンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８の各抗体により刺激される人のリンパ球内のアンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８に対応してＩＦＮγを生成する人の細胞の発生も阻害した。
【００２９】
上記の各データは、上記化合物が、０．１μＭといった低濃度にて、好ましくは、０．１μＭと１μＭとの間の濃度にて、人とマウスとの双方において、Ｔリンパ球の活性化について、阻害作用を有することを立証している。
【００３０】
それゆえ、ＣＢＭ−１は、免疫抑制的な薬剤としての活性を備えるものである。上述したように、本発明の第１の観点は、医薬品、好ましくは免疫抑制剤として使用するための、式（１）の化合物またはその誘導体に関する。上記誘導体は、その塩類、アイソマー類またはアイソマー類の混合物、プロドラッグ類、結晶型などを含む。
【００３１】
【化２】
【００３２】
本発明のアイソマー類またはアイソマー類の混合物は以下に示す意味にて理解される。
１）上記化合物の複数の各結合部位に関する各置換基の位置によって規定されるＺまたはＥのアイソマー類。
２）上記化合物の光学活性（エナンチオマーの溶液中に通して偏光光の回転）についての各エナンチオマー間の違いを生じるキラル中心（４つの互いに異なる置換基に結合された原子）の存在によって生じる、光学的アイソマー、つまりエナンチオマー。
３）少なくとも２つのキラル中心を有し、各中心の置換基が同じアイソマー、かつ、各中心の各置換基が異なるアイソマー、つまりジアステレオアイソマー。
【００３３】
式（１）の化合物の「プロドラッグ」の語句は、個体に投与されたときに、上記式（１）の１つまたは幾つかの化合物を直接的にまたは間接的に提供可能な何れの誘導体（例えば、エステル類、カルバメート類、アミド類など）に関するものと理解される。
【００３４】
上記誘導体の規定は、また、上記式（１）の化合物の「結晶形態］が、フリー状態や、溶媒化合物の形態であることを含む。本明細書にて使用される「溶媒化合物」の語句は、ドラッグの組成に使用されること、および、ドラッグの調製に有用な溶媒化合物の双方を含む。溶媒化合物は、当業者であれば公知の溶媒和の従来方法によって得られる。
【００３５】
本発明における「塩」の語句は、ドラッグの調製において有用であり得る、医薬品において許容され得るもの、および、医薬品において許容され得ないものの双方であると理解される。
【００３６】
最後に、「誘導体」の規定は、同位元素の原子量を増やした原子を１以上有する、本発明の化合物を含む。例えば、本発明の各化合物の１つの化合物において、１または幾つかの水素原子が、重水素や三重水素に置換されたり、１または幾つかの炭素原子が、13Ｃや14Ｃの原子に置換されたり、または、１または幾つかの窒素原子が、15Ｎの原子に置換されたりする。
【００３７】
式（１）の上記化合物は、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインに結合して、ＴＣＲ−Ｎｃｋの相互作用を遮断することによって、他の免疫抑制剤と比較して、明らかな利点を有する、Ｔリンパ球の、特異的な免疫抑制剤であり、より少ない２次効果を引き起こす１つのものである。
【００３８】
それゆえ、本発明の１観点は、Ｔリンパ球の過剰増殖に関連する病気の治療および／または防止のためのドラッグの調製において、上記構造式（１）の化合物またはその誘導体の使用である。
【００３９】
上記病気は、好ましくは、自己免疫病、臓器移植や器官や組織の外部からの移植の拒絶反応に関連する病気、リンパ腫、および／または、Ｔ型白血病である。
【００４０】
自己免疫病は、Ｔリンパ球の活性化が、誘導および／またはエフェクタのフェーズにおいて重要な役割をはたす病気がより好ましい。より好ましい、全身の器官特異的な自己免疫病のリストは、多発性硬化症およびその変種、全身性のルーパスエリテマトーセス、乾癬、白班、リューマチ様関節炎、喘息、自己免疫性肝炎、Ｉ型の糖尿病、重症筋無力症、癒着性脊椎炎、クローン病（Crohn's disease）などを含む。
【００４１】
本発明の他の観点は、構造式（１）の化合物、または、上記化合物の前述した誘導体のと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬剤組成物を志向する。
【００４２】
上記各観点の場合では、上記組成物は、使用される投与型に適合するであろう。それゆえ、上述の上記組成物は、経口的な投与のための、固体（例えば、錠剤、ピル、カプセルなど）または液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョンなど）の何れかの薬剤形態にて、非経口的な投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内など）のための薬剤形態にて、直腸投与などの薬剤形態にて、または、臨床上許容される他の投与形態の何れにて、かつ、治療上にて有効な投与量にて提供される。
【００４３】
上記組成物に使用可能な、薬学的に許容可能な補薬および賦形剤は、当業者において通常使用される賦形剤である。本発明により提供される、薬学的な上記組成物は、何れの投与ルートにより投与され得るので、上記組成物は、上記選択された投与ルートのための好適な薬学的形態にて製剤化されるであろう。
【００４４】
本明細書の記載および請求項の記載を通して、「含む」およびそれに関連する語句は、他の技術的特徴、添加物、組成、または、各ステップを排除することを意図していない。本発明の技術分野の専門家にとって、本発明の他の、目的、利点および特徴は、本明細書の記載の一部から、かつ、本発明の実行の一部から明らかであろう。以下に示す、図面および実施例は、説明のためにのみ提供され、本発明を限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＳＨ３．１ドメインのモデル、および、結合が可能な各化合物のバーチャルスクリーニングを示す概略図である。ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインに結合する各化合物のバーチャルスクリーニング。ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインの構造の理論的モデル（パネルＡ）。パネルＢは、上記各化合物の１つが、上記バーチャルモデルの上部部分に対し、どのように適合するかを示す。
【図２】アンチＣＤ３により誘導される増殖に関する上記バーチャルスクリーニングの結果から得られた各化合物の選択的効果を示すグラフである。増殖は、ＣＤ８＋の集合体内での緑蛍光体（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。相異する各化合物は、順に番号が付与されたＮＳＩコードによって表されている。ＣＢＭ-１は、化合物ＮＳＩ−６５である。
【図３】アンチＣＤ３により誘導される増殖に関する化合物ＣＢＭ-１の選択的効果を示すグラフである。アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球の増殖における、ＣＢＭ-１による阻害。上記結果は、人のＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖の結果と比較された。
【図４】ＣＢＭ-１による、サイトカインの放出の阻害を示すグラフである。アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球によるサイトカインの分泌における、ＣＢＭ-１による阻害。健康なドナーから精製された抹消血単核球（ＰＢＭＮＣ）が、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、種々な濃度のＣＢＭ-１の存在下において、７２時間、刺激された。上清（ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、ＴＦＮ−β）中の示されたサイトカインの濃度は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー（ＢＤサイトメトリックビーズアレイ）により評価された。化合物ＣＢＭ-１は、ＩＬ５、ＩＬ１-β、ＩＬ６の放出に影響しなかった。一方、ＩＬ２、ＩＬ４は、検出されなかった。
【図５】ＩＮＦγの細胞内生成の阻害を示すグラフである。アンチＣＤ３およびアンチＣＤ２８の混合物による刺激に対応した、ＩＮＦγの細胞内での発現。上記グラフは、ＩＮＦγの細胞内での発現（ポジティブ細胞と平均蛍光との積として）を、ＣＢＭ-１の濃度の関数として示す。
【図６Ａ】ＳＨ３．１ドメインおよび高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。５つの各βシートは、順番に番号が付与されている。ＮとＣとは、それぞれ、アミノ末端、カルボキシ末端を示す。
【図６Ｂ】ＳＨ３．１ドメインおよび高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインへの、高アフィニティペプチドである１１Ｒ０８５の結合により置換された残部と、Ｎｃｋαの残部との比較。
【図７】ＳＨ３．１ドメインおよびＣＢＭ-１の結合後に生じる置換の、ＮＭＲによる構造を示す概略図である。ＳＨ３．１ドメイン内のアミノ酸残部の置換は、化合物ＣＢＭ-１との相互作用により生じた。上記アミノ酸の位置が上記化合物と結合後に変化した上記アミノ酸の水平鎖を示している。上記変化は、化合物ＣＢＭ-１が、バーチャルスクリーニングにて視覚化された上記ポケットに結合した結果生じたものである。
【図８】ＣＢＭ-１の毒性を示すグラフである。人のジャーカットのＴリンパ球株および人のラジのリンパ芽球様Ｂ細胞株が、示された濃度のＣＢＭ-１と共に４８時間培養された。上記化合物の毒性は、プロピジウムイオダイド（propidium iodide）排除およびフローサイトメトリーにより評価された。上記２つの株は、上記化合物の最大濃度においても、４８時間後において、１００％の生存率にて生存していた。
【図９】ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの１次配列と、ＮｃｋβのＳＨ３．１ドメインの１次配列、ＮｃｋαのＳＨ３．２ドメインの１次配列、およびＮｃｋαのＳＨ３．３ドメインの１次配列との比較を示す図である。ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメイン内の各βシートおよび各結合ループの各位置が示されている。各黒矢印は、ＣＢＭ-１の結合後に強く置換された残部を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、本発明の化合物を同定し、上記化合物の効果を示すために、実行された作業を説明する、本発明者らにより実行された幾つかの試験結果により、以下に例示される。
【００４７】
（実施例１）Ｔリンパ球の活性化に関する、Ｎｃｋ-ＣＤ３εの相互作用を阻害する各ペプチドの効果
Ｔリンパ球の活性化に関する、Ｎｃｋ-ＣＤ３εの相互作用の重要性を示し、免疫調整剤のためのターゲットとして上記相互作用を評価するために、各合成ペプチドが、ＰＲＳの配列を模倣し、ＮｃｋのＣＤ３εの結合サイトへの結合をブロックし得るようにデザインされた。
【００４８】
１１Ｒ０８５と命名されたペプチドは、ＮｃｋのＳＨ３．１ドメインとＣＤ３εとの相互作用の阻害に関するネイティブな野生の配列を備えたペプチドより３００倍以上の能力を有するものとして得られた。
【００４９】
上記ペプチドを用いると、人のＴリンパ球の増殖は、約２０μＭのＩＣ５０によるアンチＣＤ３抗体への刺激への応答において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方にて、特異的に阻害された。一方、異なるレセプタであるＩＬ２Ｒに依存する人のＴリンパ球の増殖は、３倍の濃度であっても、上記ペプチドによって実際上影響されなかった。
【００５０】
上記の結果は、ペプチド１１Ｒ０８５が、ＴＣＲにより開始される活性化を阻害するが、他のレセプタにより媒介される活性化を阻害しないので、ターゲット分子をデザインするための特異的なものであることを示唆している。
【００５１】
ペプチド１１Ｒ０８５は、また、ＩＬ２の生成を阻害し、かつ、約５μＭのＩＣ５０にて処理された、ＯＴ−１トランスジェニックマウスの１次リンパ球における、抗原により誘導される増殖を阻害する。それゆえ、免疫抑制剤の開発のためのターゲット分子としてＮｃｋ−ＣＤ３εの相互作用は、有効なものとして評価された。
【００５２】
（実施例２）Ｎｃｋ−ＣＤ３εの相互作用をブロックする可能性を有する各化合物のバーチャルスクリーニングによる選択および上記各化合物の免疫抑制剤としての能力の評価
他のタンパクの５０種類の公知のＳＨ３ドメインの幾つかの構造およびその配列に基づく同一性による、ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの構造を得るように、分子モデリング技術（Fiser, A., Feig, M., Brooks, C.L., 3rd and Sali, A. (2002) Acc. Chem. Res., 35, 413-421）が用いられた。
【００５３】
上記技術の方法では、上記構造の理論的なモデルが、上記ドメインの実構造に非常に類似すると考えられるものとして得られた。上記構造から開始して、本発明者らのソフトウエアによるバーチャルスクリーニングが、北アメリカカンパニーケンブリッジにより提供された３０００００個以上の各化合物のコレクションについて実行された。１０個の各化合物が、ＳＨ３．１の疎水性のポケットに対して、理論的に最も良く適合するものとして選択された。上記ポケットは、ＣＤ３εのＰＲＳ配列の認識についての原因となるものと考えられている（図１を参照）。
【００５４】
上記各化合物は、アンチＣＤ３抗体により刺激される人のＴリンパ球の増殖を阻害するアッセイを実行するために、後に使用された。
【００５５】
（実施例３）アンチＣＤ３により誘導される増殖に関するバーチャルスクリーニングの結果から得られた上記各化合物の選択的な効果
Ｎｃｋ−ＣＤ３の相互作用のブロックする可能性によるバーチャルスクリーニングの結果から得られる上記各化合物の選択の次のラウンドのために、健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣが、蛍光によりラベル化され、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、種々な濃度の上記各化合物の存在下において、５日間培養された。
【００５６】
増殖は、ＣＤ８＋の集合体内での緑蛍光（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。試験された各化合物の全ては、リンパ球の増殖に対して、ある程度の活性を有するが、図２に示されるように、そのうちの、最も高い活性、かつ、より低い毒性を示したものは、ＣＢＭ−１（構造式（１）の化合物）と命名された化合物であった。ＣＢＭ-１は、化合物ＮＳＩ−６５である。
【００５７】
（実施例４）アンチＣＤ３により誘導される増殖に関するＣＢＭ−１の選択的な効果
健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣが、ＣＦＳＥによりラベル化され、アンチＣＤ３ ＯＫＴ３抗体にてコートされた各プレート上にて、上記各化合物の内の、ＣＢＭ−１にて示された化合物の種々な濃度での存在下において、５日間培養された。
【００５８】
増殖は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の双方の集合体内での緑蛍光（ＣＦＳＥ）の損失に基づくフローサイトメトリーにより評価された。同様な実験が、人の、ＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖についても実行された。健康なドナーから精製されたＰＢＭＮＣは、ＰＨＡにより４８時間刺激され、ＣＦＳＥにてラベル化された。
【００５９】
続いて、上記２つの実験は、人の組み換えＩＬ２の１００ＩＵ／ｍｌの存在下、特にＣＢＭ−１として使用される化合物の各濃度での存在下にて３日間培養された。
【００６０】
化合物ＣＢＭ−１は、２μＭのＩＣ５０と共のアンチＣＤ３により誘導される、ＣＤ４＋のリンパ球の増殖、および、３μＭのＩＣ５０により誘導される、ＣＤ８＋のリンパ球の増殖を阻害した。他の各化合物の阻害効果は、少し小さかった。
【００６１】
しかしながら、ＣＢＭ−１は、２０μＭの濃度で、人の、ＩＬ２依存性のリンパ芽球の増殖を顕著には阻害しなかった。このことは、ＣＢＭ−１は、ＴＣＲ活性化に依存する増殖に対して特異的であり、ＩＬ２Ｒに依存する増殖には特異的ではないことを示している。このデータは、ＴＣＲに関する選択的な作用機序をサポートしている。
【００６２】
（実施例５）アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、人のＴリンパ球によるサイトカインの分泌の阻害
サイトカインの生成に関するＣＢＭ-１の効果が、人のＰＢＭＮＣが、アンチＣＤ３抗体刺激されるアッセイにて測定された。上記細胞の上清が、７２時間後に採取された。数種類のサイトカインが、同時に、フローサイトメトリーアッセイによって測定された。
【００６３】
上記各実験は、上記化合物が、サイトカインＴｈ１およびＩＢＦγ（０．３μＭのＩＣ５０）、サイトカインＴＦＮ−β（０．２μＭのＩＣ５０）、並びにサイトカインＩＬ−１０（０．２μＭのＩＣ５０）について、可能な阻害効果を有することを示し（図４）、３０μＭの濃度まででもＩＬ５、ＩＬ６の生成に影響しないことを示した。
【００６４】
それゆえ、上記データは、ＣＢＭ-１が、Ｔリンパ球による幾つかの各サイトカインの生成を選択的に阻害し、他のサイトカインの生成を阻害しないことを示した。つまり、ＣＢＭ-１は、細胞内のシグナル伝達経路の阻害において、ある程度の選択性を示す。
【００６５】
（実施例６）アンチＣＤ３抗体による刺激に対応した、マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞による、細胞内でのＩＦＮγの発現の阻害
阻害剤が、Ｔｈ０リンパ球のＴｈ１リンパ球への分化を防止するか否かを示すために、分化アッセイが、試験管内にて実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞が、アンチＣＤ３＋抗体、アンチＣＤ２８抗体と共に、４８時間、示された各濃度でのＣＢＭ-１の存在下にて刺激され、さらに６時間、ブレフェルジンＡと共に培養された。
【００６６】
ＣＢＭ-１は、０．８μＭのＩＣ５０と共でのＴｈ１リンパ球のＩＦＮγの分泌の生成を阻害したことが見出された。上記細胞は、最初、ＣＤ４−ＰＥにて染色され、固定および洗浄後、アンチＩＮＦγ抗体にて染色された。図５は、ＩＮＦγの細胞内での発現（ポジティブ細胞のパーセントと平均蛍光との積として）を、ＣＢＭ-１の濃度の関数として示す。
【００６７】
（実施例７）ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの三次元構造のＮＭＲでの決定
ＮｃｋαのＳＨ３．１ドメインの三次元構造が、ペプチド１１Ｒ０８５の存在下および非存在下にて同様な方法にて決定された（キミカ−フィスカ ロカソラノ（ＣＳＩＣ、マドリッド）のマリアアンジェレジメネス教授およびマニュエルリコ教授の研究室と共同研究）（図６）。
【００６８】
上記結果は、バーチャルスクリーニングのために使用される、コンピュータモデルによる構造の予測の有効性を示すことが可能となった。さらに、バーチャルスクリーニングは、化合物ＣＢＭ-１により生じる上記構造の化学的な置換の測定を可能にした（図７）。
【００６９】
上記結果は、ＣＢＭ-１が、バイオインフォマティックスの研究によって予測されるように、上記タンパクと構造上にて相互作用することを示した。上記化合物は、各残基Ｔｒｐ４１およびＴｒｐ／Ｐｈｅ５３の関与した、疎水性のポケットに結合する。上記結合は、β２−シートの、かつ、末端ループの残基の歪みおよび置換を生じる（図７および図９）。ＳＨ３．１ドメイン内の各残基の置換は、ＳＨ３．１ドメインとＣＢＭ-１との相互作用の予測を有効なものにし、また、上記モデルと一致する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するための、
【化１】
上記式（１）およびその誘導体の化合物。
【請求項２】
医薬品を調製するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
Ｔリンパ球の活性化、その過剰増殖または異常増殖に関係する病気を治療および／または防止するための医薬品を調製するための、請求項２に記載の、化合物の使用。
【請求項４】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、自己免疫病である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項５】
上記自己免疫病は、多発性硬化症およびその変種、全身性のルーパスエリテマトーセス、乾癬、白班、リューマチ様関節炎、喘息、自己免疫性肝炎、Ｉ型の糖尿病、重症筋無力症、癒着性脊椎炎、クローン病を含むリストから選択されるものである、請求項４に記載の、化合物の使用。
【請求項６】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、臓器移植や器官や組織の外部からの移植の拒絶反応に関連する病気である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項７】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、リンパ腫またはＴ細胞の白血病である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、製薬学の組成物。
【請求項９】
免疫抑制剤としての、請求項６に記載の製薬学の組成物の使用。
【請求項１】
医薬品として使用するための、
【化１】
上記式（１）およびその誘導体の化合物。
【請求項２】
医薬品を調製するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
Ｔリンパ球の活性化、その過剰増殖または異常増殖に関係する病気を治療および／または防止するための医薬品を調製するための、請求項２に記載の、化合物の使用。
【請求項４】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、自己免疫病である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項５】
上記自己免疫病は、多発性硬化症およびその変種、全身性のルーパスエリテマトーセス、乾癬、白班、リューマチ様関節炎、喘息、自己免疫性肝炎、Ｉ型の糖尿病、重症筋無力症、癒着性脊椎炎、クローン病を含むリストから選択されるものである、請求項４に記載の、化合物の使用。
【請求項６】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、臓器移植や器官や組織の外部からの移植の拒絶反応に関連する病気である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項７】
上記Ｔリンパ球の活性化に関係する上記病気は、リンパ腫またはＴ細胞の白血病である、請求項３に記載の、化合物の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、製薬学の組成物。
【請求項９】
免疫抑制剤としての、請求項６に記載の製薬学の組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５２６６０７（Ｐ２０１１−５２６６０７Ａ）
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５４９０（Ｐ２０１１−５１５４９０）
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／０７０２３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００９００
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５１１００００８３）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）
【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｓｅｒｒａｎｏ，１１７，Ｅ−２８００６ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／０７０２３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００９００
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５１１００００８３）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）
【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｓｅｒｒａｎｏ，１１７，Ｅ−２８００６ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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