ＴＤプローブ及びその用途
本発明は、ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びその用途又は応用に関する。前記ＴＤプローブは、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び３’−第１ハイブリダイゼーション部位の両方ともを通じてターゲット核酸配列にハイブリダイズする。ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び分割部位の両方ともが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズせず、このような二つの部位は一本鎖を形成し、これは、低いＴｍ値に起因する。上述のように、前記ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列のそれぞれに対して互いに異なるハイブリダイゼーションパターンを明確に示し、これは、より高い特異性でターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することが可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有することを特徴とするターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、これにより、前記ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
【請求項２】
前記プローブが、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項３】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項２に記載のＴＤプローブ。
【請求項４】
前記相互作用的標識システムが、ＴＤプローブに位置したレポーター分子及びクエンチャー分子の一対である請求項２に記載のＴＤプローブ。
【請求項５】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項４に記載のＴＤプローブ。
【請求項６】
前記ＴＤプローブが、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを有し、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位に他の一つを有する請求項４に記載のＴＤプローブ。
【請求項７】
前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、４０℃乃至８０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項８】
前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、６℃乃至４０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項９】
前記分割部位の前記Ｔｍが、２℃乃至１５℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項１０】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の少なくとも一つは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記蛍光レポーター分子が前記クエンチャー分子から分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生しない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断により発生された前記蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、熱安定性酵素である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブがハイブリダイズする位置（ｓｉｔｅ）の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記上流プライマーが、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより延長される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）が、逆方向プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる逆方向プライマーの延長反応によりＴＤプローブとハイブリダイゼーションできる前記ターゲット核酸配列が生成される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含む請求項１０、１３及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット核酸配列が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーにより前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含み、かつ前記上流プライマーが少なくとも２種のプライマーを含むか、又は前記逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む請求項１３から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、３’−末端を通じて固相基質の表面に固定化されており、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブから前記標識が放出されて、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れず、これにより前記固相基質上のシグナル変化を検出し、前記ターゲット核酸配列の存在を決定する工程と、
（ｃ）前記固相基質上の前記シグナル変化を検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断による前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、熱安定性酵素である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が、蛍光レポーター分子であり、前記シグナル変化が、前記固相基質上において蛍光シグナルの減少又は消滅である請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムであり、前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に他の一つを有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記クエンチャー分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置し、前記蛍光分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、前記プローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ＴＤプローブのクエンチャー分子が蛍光レポーター分子から分割されるように、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、これにより前記ターゲット核酸配列の存在が決定されるように前記固相基質上の前記蛍光シグナルが検出される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーにより前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する前記ＴＤプローブ、（ｉｉｉ）それぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー、及び（ｉｖ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を用意する工程であって、前記ＴＤプローブは、前記二つのプライマー間の位置にハイブリダイズし、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識されており、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して少なくとも２サイクルのプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性で前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により延長されて、前記ターゲット核酸配列を増幅して、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、その結果、前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から分離されず、蛍光シグナルが現れない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記発生した蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記ターゲット核酸配列が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含み、前記正方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含み、かつ前記逆方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を第１プローブ及び第２プローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記第１プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、第２プローブは、前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブは、ライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせる工程であって、これにより、ライゲーションされたプローブが生成される工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記ライゲーションされたプローブ上の前記標識からのシグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記リガーゼが、熱安定性酵素である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションする場合、前記第１プローブ及び第２プローブは、互いに直接隣接した位置に位置する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記標識が、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対からなる相互作用的標識システムである請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１プローブが、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する請求項４４に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項５０】
前記方法が、工程（ａ）−（ｃ）又は（ａ）−（ｄ）を反復することをさらに含む請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ａ）で利用された前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーを利用して前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、液相で行われる請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が固相で行われ、前記第１プローブが固相基質の表面上にその５’−末端を通じて固定化され、かつ前記第２プローブが固定化されない請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が固相で行われ、前記第２プローブが固相基質の表面上にその３’−末端を通じて固定化され、かつ前記第１プローブが固定化されない請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、工程（ｄ）以前に、前記固定化されたプローブにライゲーションされなかった前記非固定化プローブ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）の除去のために、工程（ｃ）の結果物を洗浄する工程をさらに含む請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記第１プローブ及び前記第２プローブのそれぞれが少なくとも２種のプローブを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項４４、５３及び５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列とＴＤプローブとをハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に蛍光レポーター分子で標識され、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導できず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記蛍光変化を検出する工程であって、前記蛍光変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブ、逆方向プライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われ、これにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列が追加的に生成され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブに、正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われ、これにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列がＰＣＲにより増幅され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＴＤプローブが、前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で追加的に標識された請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記鋳型−依存的核酸配列ポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない熱安定性ポリメラーゼである請求項６０及び６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、液相又は固相で行われる請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
プローブ分子がターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を選択する工程と、
（ｂ）プローブ分子の配列を設計する工程であって、これにより、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列及び（ｉｉ）少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有し、前記分割部位は、ハイブリダイゼーション配列内に存在し、前記プローブ分子の三つの部位を形成する工程と、
（ｃ）前記分割部位の前記５’−方向にある部位は、前記分割部位の３’−方向にある部位より低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように前記プローブ分子の前記分割部位位置を決定する工程であって、これにより、それぞれ異なるＴｍ値を有する三つの部位を有するプローブ分子が提供されて、前記三つの部位において、（ｉ）前記プローブ分子の５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記プローブ分子の３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位と前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位との間にある前記プローブ分子の分割部位は、少なくとも三つのユニバーサル塩基を有して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、これにより、前記プローブ分子は、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６６】
ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を含むことを特徴とするキット。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ，ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’，Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、これにより、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列から前記ターゲット核酸配列を区別する。）
【請求項６７】
前記ＴＤプローブが、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記ＴＤプローブが、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを含み、他の一つを、３’−第１ハイブリダイゼーション部位に含む請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７１】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸配列ポリメラーゼ、及び前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション位置の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと逆方向プライマーのうち、少なくとも一つのプライマーをさらに含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７２】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７３】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含み、かつ前記上流プライマーが少なくとも２種のプライマーを含むか、又は前記逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む請求項７１に記載のキット。
【請求項７４】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７５】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項６９に記載のキット。
【請求項７７】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する前記ＴＤプローブであって、前記ＴＤプローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されて、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するプローブと、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方とも前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズし、
前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記非ターゲット核酸配列から前記ターゲット核酸配列を区別する。）、
（ｂ）前記固相基質と、を含むことを特徴とするキット。
【請求項７８】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムであり、前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない一位置に他の一つを有する請求項７７に記載のキット。
【請求項８０】
前記クエンチャー分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置し、前記蛍光レポーター分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位が前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、前記ＴＤプローブ上の前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が解離されて蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位が前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、これにより前記ターゲット核酸配列の存在が決定されるように固相基質上の蛍光シグナルが検出される請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む請求項７７及び８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８２】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含む請求項７７に記載のキット。
【請求項８３】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含み、前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項７７に記載のキット。
【請求項８４】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項７７及び８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８５】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第１プローブと、
（ｂ）前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第２プローブと、
を含み、
前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有することを特徴とするキット。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブがライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
【請求項８６】
前記キットが、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び前記第２プローブをライゲーションするリガーゼをさらに含む請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記標識が、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムである請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
前記第１プローブが、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する請求項８５に記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーション配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項８９】
前記利用されたターゲット核酸配列が、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列であり、前記キットが、増幅プライマーをさらに含む請求項８５に記載のキット。
【請求項９０】
前記キットが固相で利用され、前記第１プローブが、その５’−末端を通じて前記固相基質の表面上に固定化されており、前記第２プローブが、固定化されない請求項８５に記載のキット。
【請求項９１】
前記キットが固相で利用され、前記第２プローブが、その３’−末端を通じて前記固相基質の表面上に固定化されており、前記第１プローブが、固定化されない請求項８５に記載のキット。
【請求項９２】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記第１プローブ及び前記第２プローブのそれぞれが、少なくとも２種のプローブを含む請求項８５に記載のキット。
【請求項９３】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項８５、９０及び９１のいずれかに記載のキット。
【請求項９４】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項９３に記載のキット。
【請求項１】
ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有することを特徴とするターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、これにより、前記ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
【請求項２】
前記プローブが、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項３】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項２に記載のＴＤプローブ。
【請求項４】
前記相互作用的標識システムが、ＴＤプローブに位置したレポーター分子及びクエンチャー分子の一対である請求項２に記載のＴＤプローブ。
【請求項５】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項４に記載のＴＤプローブ。
【請求項６】
前記ＴＤプローブが、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを有し、その３’−第１ハイブリダイゼーション部位に他の一つを有する請求項４に記載のＴＤプローブ。
【請求項７】
前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、４０℃乃至８０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項８】
前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の前記Ｔｍが、６℃乃至４０℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項９】
前記分割部位の前記Ｔｍが、２℃乃至１５℃である請求項１に記載のＴＤプローブ。
【請求項１０】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の少なくとも一つは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記蛍光レポーター分子が前記クエンチャー分子から分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生しない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断により発生された前記蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、熱安定性酵素である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブがハイブリダイズする位置（ｓｉｔｅ）の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記上流プライマーが、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより延長される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）が、逆方向プライマーと共に前記ＴＤプローブを利用して行われ、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであり、前記工程（ｂ）で前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる逆方向プライマーの延長反応によりＴＤプローブとハイブリダイゼーションできる前記ターゲット核酸配列が生成される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含む請求項１０、１３及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット核酸配列が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーにより前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含み、かつ前記上流プライマーが少なくとも２種のプライマーを含むか、又は前記逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む請求項１３から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＤプローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、３’−末端を通じて固相基質の表面に固定化されており、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブから前記標識が放出されて、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、前記固相基質上に固定化されたＴＤプローブでシグナル変化が現れず、これにより前記固相基質上のシグナル変化を検出し、前記ターゲット核酸配列の存在を決定する工程と、
（ｃ）前記固相基質上の前記シグナル変化を検出する工程であって、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の切断による前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、熱安定性酵素である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が、蛍光レポーター分子であり、前記シグナル変化が、前記固相基質上において蛍光シグナルの減少又は消滅である請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムであり、前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に他の一つを有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記クエンチャー分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置し、前記蛍光分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、前記プローブがターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ＴＤプローブのクエンチャー分子が蛍光レポーター分子から分割されるように、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、これにより前記ターゲット核酸配列の存在が決定されるように前記固相基質上の前記蛍光シグナルが検出される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、反復サイクルの間の変性過程とをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーにより前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する前記ＴＤプローブ、（ｉｉｉ）それぞれ前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー、及び（ｉｖ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を用意する工程であって、前記ＴＤプローブは、前記二つのプライマー間の位置にハイブリダイズし、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングするクエンチャー分子で二重標識されており、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して少なくとも２サイクルのプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性で前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により延長されて、前記ターゲット核酸配列を増幅して、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が分離されて、蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず、その結果、前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＤプローブ上にある前記クエンチャー分子から分離されず、蛍光シグナルが現れない工程と、
（ｃ）前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記発生した蛍光シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記ターゲット核酸配列が、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式又は指定時間間隔方式で検出される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが、少なくとも２種のプローブを含み、前記正方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含み、かつ前記逆方向プライマーが、少なくとも２種のプライマーを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を第１プローブ及び第２プローブにハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記第１プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、第２プローブは、前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブは、ライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせる工程であって、これにより、ライゲーションされたプローブが生成される工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記ライゲーションされたプローブ上の前記標識からのシグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記リガーゼが、熱安定性酵素である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションする場合、前記第１プローブ及び第２プローブは、互いに直接隣接した位置に位置する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記標識が、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対からなる相互作用的標識システムである請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１プローブが、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する請求項４４に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項５０】
前記方法が、工程（ａ）−（ｃ）又は（ａ）−（ｄ）を反復することをさらに含む請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ａ）で利用された前記ターゲット核酸配列が、増幅プライマーを利用して前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、液相で行われる請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法が固相で行われ、前記第１プローブが固相基質の表面上にその５’−末端を通じて固定化され、かつ前記第２プローブが固定化されない請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が固相で行われ、前記第２プローブが固相基質の表面上にその３’−末端を通じて固定化され、かつ前記第１プローブが固定化されない請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、工程（ｄ）以前に、前記固定化されたプローブにライゲーションされなかった前記非固定化プローブ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）の除去のために、工程（ｃ）の結果物を洗浄する工程をさらに含む請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記第１プローブ及び前記第２プローブのそれぞれが少なくとも２種のプローブを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項４４、５３及び５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列とＴＤプローブとをハイブリダイゼーションさせる工程であって、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する工程と、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上に蛍光レポーター分子で標識され、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記蛍光レポーター分子から出る蛍光の変化を誘導できず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する。）
（ｂ）前記蛍光変化を検出する工程であって、前記蛍光変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブ、逆方向プライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われ、これにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列が追加的に生成され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記工程（ａ）が、前記ＴＤプローブに、正方向プライマー及び逆方向プライマーとして二つのプライマーからなる一対のプライマー及び鋳型−依存的核酸ポリメラーゼを共に利用して行われ、これにより、前記ＴＤプローブとハイブリダイゼーション可能な前記ターゲット核酸配列がＰＣＲにより増幅され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光変化を増加させる請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＴＤプローブが、前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で追加的に標識された請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記鋳型−依存的核酸配列ポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない熱安定性ポリメラーゼである請求項６０及び６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、液相又は固相で行われる請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
プローブ分子がターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を選択する工程と、
（ｂ）プローブ分子の配列を設計する工程であって、これにより、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション配列及び（ｉｉ）少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有し、前記分割部位は、ハイブリダイゼーション配列内に存在し、前記プローブ分子の三つの部位を形成する工程と、
（ｃ）前記分割部位の前記５’−方向にある部位は、前記分割部位の３’−方向にある部位より低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように前記プローブ分子の前記分割部位位置を決定する工程であって、これにより、それぞれ異なるＴｍ値を有する三つの部位を有するプローブ分子が提供されて、前記三つの部位において、（ｉ）前記プローブ分子の５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記プローブ分子の３’−第１ハイブリダイゼーション部位は、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位と前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位との間にある前記プローブ分子の分割部位は、少なくとも三つのユニバーサル塩基を有して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、これにより、前記プローブ分子は、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６６】
ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別することを可能とする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を含むことを特徴とするキット。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ，ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’，Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、これにより、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列から前記ターゲット核酸配列を区別する。）
【請求項６７】
前記ＴＤプローブが、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識又は多数の標識を含む相互作用的標識システムを有する請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子が、両方とも前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置するか、又は前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のそれぞれが、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位のそれぞれ異なる部位に位置する請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記ＴＤプローブが、５’−第２ハイブリダイゼーション部位に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを含み、他の一つを、３’−第１ハイブリダイゼーション部位に含む請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７１】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸配列ポリメラーゼ、及び前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション位置の下流位置にハイブリダイズする上流プライマーと逆方向プライマーのうち、少なくとも一つのプライマーをさらに含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７２】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７３】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含み、かつ前記上流プライマーが少なくとも２種のプライマーを含むか、又は前記逆方向プライマーが少なくとも２種のプライマーを含む請求項７１に記載のキット。
【請求項７４】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項６６に記載のキット。
【請求項７５】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記ＴＤプローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項６９に記載のキット。
【請求項７７】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する前記ＴＤプローブであって、前記ＴＤプローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化されて、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するプローブと、
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、前記ＴＤプローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方とも前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズし、
前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、これにより、前記ＴＤプローブは、前記非ターゲット核酸配列から前記ターゲット核酸配列を区別する。）、
（ｂ）前記固相基質と、を含むことを特徴とするキット。
【請求項７８】
前記標識が、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、相互作用的標識、発光標識、化学発光標識又は金属標識である請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記標識が、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムであり、前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち一つを有し、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない一位置に他の一つを有する請求項７７に記載のキット。
【請求項８０】
前記クエンチャー分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される前記ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位上の一位置に位置し、前記蛍光レポーター分子が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されない位置に位置し、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、その５’−第２ハイブリダイゼーション部位が前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、前記ＴＤプローブ上の前記クエンチャー分子から前記蛍光レポーター分子が解離されて蛍光シグナルが発生し、前記ＴＤプローブが前記非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位が前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されず、蛍光シグナルが発生せず、これにより前記ターゲット核酸配列の存在が決定されるように固相基質上の蛍光シグナルが検出される請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
前記キットが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む請求項７７及び８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８２】
前記ターゲット核酸配列が少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記ＴＤプローブが少なくとも２種のプローブを含む請求項７７に記載のキット。
【請求項８３】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含み、前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項７７に記載のキット。
【請求項８４】
前記ＴＤプローブが、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも一つのヌクレオチドをブロッカーとして含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位が、ＴＤプローブの３’−第１ハイブリダイゼーション部位に位置する請求項７７及び８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８５】
ターゲット区別性プローブ（ＴＤプローブ）を利用して、ライゲーション反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第１プローブと、
（ｂ）前記第１位置の上流に位置する前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリダイゼーション核酸配列を有する第２プローブと、
を含み、
前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一つは、検出可能なシグナルを発生する標識を有し、前記第２プローブは、ＴＤプローブであり、前記ＴＤプローブは、下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有することを特徴とするキット。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させて、
前記第２プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第１ハイブリダイゼーション部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリダイズし、前記第１プローブ及び前記第２プローブのライゲーションが起こり、前記第２プローブが非ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合は、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記第１プローブ及び前記第２プローブがライゲーションされず、これにより、前記第２プローブは、前記ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別する）
【請求項８６】
前記キットが、前記ターゲット核酸配列とハイブリダイズした前記第１プローブ及び前記第２プローブをライゲーションするリガーゼをさらに含む請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記標識が、レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含む相互作用的標識システムである請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
前記第１プローブが、下記一般式ＩＩの二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）構造を有する請求項８５に記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーション配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼーションに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは、前記オリゴヌクレオチドの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項８９】
前記利用されたターゲット核酸配列が、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列であり、前記キットが、増幅プライマーをさらに含む請求項８５に記載のキット。
【請求項９０】
前記キットが固相で利用され、前記第１プローブが、その５’−末端を通じて前記固相基質の表面上に固定化されており、前記第２プローブが、固定化されない請求項８５に記載のキット。
【請求項９１】
前記キットが固相で利用され、前記第２プローブが、その３’−末端を通じて前記固相基質の表面上に固定化されており、前記第１プローブが、固定化されない請求項８５に記載のキット。
【請求項９２】
前記ターゲット核酸配列が、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記第１プローブ及び前記第２プローブのそれぞれが、少なくとも２種のプローブを含む請求項８５に記載のキット。
【請求項９３】
前記ターゲット核酸配列が、ヌクレオチド変異を含む請求項８５、９０及び９１のいずれかに記載のキット。
【請求項９４】
前記ターゲット核酸配列上の前記ヌクレオチド変異が、前記第２プローブの前記５’−第２ハイブリダイゼーション部位の向かい側に位置する請求項９３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５０３６２７（Ｐ２０１３−５０３６２７Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７８２６（Ｐ２０１２−５２７８２６）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００５９７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８０４１
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０７２９２９５５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００５９７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８０４１
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０７２９２９５５）
【Ｆターム（参考）】
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