ＴＮＦアンタゴニスト
ＴＮＦ結合ポリペプチドは、改善した結合特性および改善した有効性を有するヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＤ）に基づく。ポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）を有するＴＮＦ結合ドメインを含む。さらに、本発明のポリペプチドの調製法を提供する。ポリペプチドは、医薬組成物の調製および関節リウマチの治療などのＴＮＦが介在する病変を有する対象の治療に用いてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ＴＮＦに結合し、そのアンタゴニストとして作用しうるポリペプチドおよび関連化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、単球およびマクロファージを含む多数の細胞型により産生されるホモ三量体サイトカインであり、当初は特定のマウスの腫瘍の壊死を誘導する機能に基づき同定された。ＴＮＦは、免疫および炎症反応の主要な介在物質の一つであり、例えば、人口の約０．５−１％に影響を与える一般的な自己免疫炎症性疾患である関節リウマチの発症に重要な役割を果たすことが知られている。さらに、ＴＮＦは、内毒素性ショック、脳マラリアおよび移植片対宿主反応を含む、広範囲の病状の発症に関することも知られている。溶解性および生物活性型のＴＮＦは、３つの同一の１７ｋＤのタンパク質サブユニット（ホモ三量体）からなり、それに対し膜結合型は、３つの同一の２６ｋＤのサブユニットからなる。
【０００３】
組換えまたは修飾タンパク質は、新規クラスの治療薬である。現在までに、ＴＮＦアンタゴニストの機能を果たす数種の組換えまたは修飾タンパク質が開示されている。特に、ＴＮＦに結合し、中和する抗体は、ＴＮＦ活性を阻害するための手段として求められている。インフリキシマブ（レミケード）およびエタナーセプト（エンブレル）は、関節リウマチの治療について米国およびヨーロッパ両方で製造承認を受けた２つのＴＮＦアンタゴニストの例である。２つの製品は、乾癬およびクローン病の治療についても効果を示している。インフリキシマブはマウス可変領域ならびにヒトＩｇＧ１およびκ定常領域でのキメラ抗体であり、溶解性および膜貫通型のＴＮＦに結合することによりＴＮＦの生物活性を中和し、かかる受容体とＴＮＦの結合を阻害する。インフリキシマブの構造は、自然に分泌される抗体の構造と同様である。エタナーセプトは、ｐ７５のＴＮＦ受容体の細胞外ドメインおよびヒンジならびにヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを構成する融合タンパク質である。
【０００４】
ＷＯ２００４／０３９８は、ＴＮＦとの結合能を有するヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）に基づく４種の特異的結合ポリペプチドを開示している。タンパク質は、ループ１領域（配列番号７９のテトラネクチンアミノ酸番号１１６−１２２）中のアミノ酸配列ＫＶＲＳＲＹＦ、およびＰＲＨＴ、ＰＴＮＮ、ＰＴＮＲ、またはループ３／４領域（配列番号７９のテトラネクチンアミノ酸番号１４６−１４９）中のＰＮＮＲで野生型ＣＴＬＤと異なっている（例えば、ＷＯ２００４／０３９８、表４、４６頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、改善した結合特性および改善した有効性を有するヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメインに基づく特異的ＴＮＦ結合タンパク質を同定し、かつ、単離した。同定されたＴＮＦ結合タンパク質は、インビボでのＴＮＦの阻害能および中和能に関して上記の先行技術の動脈内のＴＮＦ結合タンパク質に基づくＣＴＬＤより優れている。これは、例えば、下記の実施例から分かるように、マウス繊維芽細胞株アッセイにおいて、ＴＮＦアルファ媒介性細胞傷害の阻害能により明らかにされた。さらに、単離された特異的ＴＮＦ結合タンパク質はまた、商業的に入手可能なＴＮＦアンタゴニスト、インフリキシマブ（レミケード）およびエタナーセプト（エンブレル）と比べて優れたＴＮＦ拮抗特性を有することが明らかにされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、最初の態様において、本発明は、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）を含むＴＮＦ結合ドメインを含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有するポリペプチドに関する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、上記のポリペプチドをコードする配列を含む核酸、ならびに特異的ポリペプチドが発現されるかかる条件下で前記核酸を発現すること、および特異的ポリペプチドを回収することを含む本発明の特異的ポリペプチドの調製法を提供する。
【０００８】
本発明に記載のポリペプチドを、医薬組成物の調製、およびＴＮＦが介在する病変を有する対象の治療法、例えば、有効量の本発明の特異的結合剤を対象に投与することを含む関節リウマチの治療法において用いてもよい。
【０００９】
本発明のこれらおよび別の態様をさらに詳細に以下において記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＴＮＦと高いアフィニティーおよび低い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で結合し、高い腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）中和能を有するポリペプチドに関する。
【００１１】
上記のとおり、本発明のポリペプチドは、テトラネクチンＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造に由来する。Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）は、タンパク質ドメインファミリーであり、多数の動物種から単離された多数のタンパク質で同定されている。最初に、ＣＴＬＤドメインを、いわゆるＣ型レクチン（カルシウム依存性炭水化物結合タンパク質）と「糖認識ドメイン」（「ＣＲＤ」）に共通するドメインとして同定した。さらに近年、かかるドメインは、テトラネクチンなどの多数の真核生物のタンパクの間で共有され、そのうちのいくつかは糖部分と結合せず、したがって、標準ドメインがＣＴＬＤと称されることが明らかになっている。ＣＴＬＤは、約１２０個のアミノ酸残基からなり、特徴として、２または３個の鎖内ジスルフィド架橋を含む。
【００１２】
ＣＴＬＤドメインは、リガンド結合タンパク質ユニットのランダム化ライブラリーの作成に適するものとして、すでにＷＯ／０２４８１８９に開示されている。ライブラリーを、ＣＴＬＤのループ領域を一部または全部、１つまたはそれ以上のランダム化ポリペプチド断片で置換したテトラネクチンＣＴＬＤ骨格構造を組み合わせることにより構築した。
【００１３】
本発明のポリペプチドを、かかるランダム化ライブラリーシステムを用いて構築し、その際にテトラネクチンのＣＴＬＤドメインを新規ＴＮＦ結合ポリペプチドの構築に用いた。本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドは、一連の注意して取り扱われたインビトロでのエボリューション工程を介して、その高い結合アフィニティーおよびインビボでのＴＮＦの阻害能および中和能を有するに至った。一般に、該方法は、連続するアフィニティーおよび結合速度の成熟工程を介して、特異性に富むが、アフィニティーに乏しい第一の候補ポリペプチドを採用することを暗示する。本発明のポリペプチドは、選択および成熟工程を数回行った「結果」である。
【００１４】
本発明は、ＴＮＦとの結合能を有し、好ましくは中和能を有する配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。そのアミノ酸配列は、テトラネクチンＣＴＬＤ骨格（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のいわゆるループ１領域にて作り出される。かかる配列は、特に、高いＴＮＦ中和活性を含む、有利な特性を提供する。アミノ酸配列は、以下の表１に記載している：
【表１】
【００１５】
本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、ＴＮＦの一部との結合能を有する。本発明にしたがって、「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有する」なる語は、ＴＮＦに結合する特異的ポリペプチドをいう。有用な実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴により決定される、好ましくは、１×１０−８Ｍ以下であるＴＮＦに対する結合アフィニティー（Ｋｄ）を有する。別の有用な実施態様において、Ｋｄ値は、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、さらには１×１０−１５Ｍ未満でさえある。さらに有用な実施態様において、本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドについてのＫ−ｏｆｆ速度は、表面プラズモン共鳴により決定される１×１０−３Ｓ−１未満例えば、１×１０−５Ｓ−１未満を含め１×１０−４Ｓ−１未満、さらには１×１０−６Ｓ−１未満である。本明細書に用いられる「Ｋ−ｏｆｆ」なる語は、ＴＮＦ結合ポリペプチド／ＴＮＦ複合体からの本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドの解離のための解離速度定数を意図とする。本明細書に用いられる「表面プラズモン共鳴」なる語は、例えばＢＩＡコアシステム（ファーマシア バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用いてバイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより実時間生物特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象をいう。
【００１６】
好ましくは、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、ＴＮＦの生物活性および／または別のＴＮＦ関連活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害または中和するような手段で、ＴＮＦとの結合能を有する。本明細書に用いられる、「中和する」なる表現は、インビボまたはインビトロで測定されるＴＮＦの阻害または生物活性の減少を意味する。本発明に記載のポリペプチドのＴＮＦ中和または拮抗作用は、以下の実施例に記載のネズミ繊維芽細胞Ｌ９２９細胞株アッセイまたはＨＵＶＥＣアッセイなどのインビトロアッセイにより示唆されうる。別法として、インビボでの動物実験、例えば、以下の実施例に記載のＴｇ１９７トランスジェニックマウス系を適用することによりＴＮＦ拮抗作用を測定することが適当であってもよい。
【００１７】
本明細書において用いられる「腫瘍壊死因子」（本明細書にてＴＮＦと省略）なる語は、溶解性および生物活性型が、３個の同一の１７ｋＤの非共有結合タンパク質サブユニットからなり、それに対し膜結合型が、３個の同一の２６ｋＤタンパク質サブユニットからなるヒトサイトカインを意図とする。特に、該語は、エントリー名「ＴＮＦＡ＿ＨＵＭＡＮ」およびＥｘＰＡＳｙの一次アクセッション番号Ｐ０１３７５：ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｉｎ−ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３７８４−３７８８（２００３）（インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでアクセス可能）の下に記載されるタンパク質を意図とする。ＴＮＦの構造は、例えば、Ｐｅｎｎｉｃａ Ｄ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９にさらに記載される。頻繁に用いられるＴＮＦの同義語は、ＴＮＦ−アルファ、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー２、ＴＮＦ−αおよびカケクチンを含む。
【００１８】
上記のとおり、本発明のポリペプチドは、実質的にＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）として示されるようなアミノ酸配列を含む。「実質的に示されるような」により、本発明のポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦと同一又は高度の相同性を示すアミノ酸配列を含むであろうことを意味する。「高度の相同性」により、配列ＫＲＷＳＲＹＦの７個のアミノ酸の中から１、２、３またはさらに４個を別のアミノ酸で置換してもよいことが考えられる。したがって、本発明にしたがって本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）と少なくとも約４３％、５７％、７１％、８６％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸の置換は、元のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドをもたらす保存的置換である。自然に分泌されるアミノ酸残基は、共通の側鎖の特徴に基づく（重複する）クラスに分類してもよい：
（１）疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；
（２）親水性：セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；
（３）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；
（４）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；
（５）塩基性：リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；
（６）荷電性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；および
（７）鎖配向に影響を与える残基：グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）。
【００１９】
保存的アミノ酸置換は、上記のアミノ酸クラスの一つのメンバーを同じクラスの他のメンバーと交換することを含む。保存的変化は、典型的には、生体系での合成によるよりもむしろ化学ペプチド合成により組み込まれる、特殊なアミノ酸残基を包含しうる。
【００２０】
下記の実施例から明らかであるように、上記の配列ＫＲＷＳＲＹＦに加えて、さらに共通のアミノ酸配列モチーフＰＸ１ＰＸ２Ｎ（配列番号２）（ここで、Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、アミノ酸残基である）を含む本発明のポリペプチドが、特に、高いＴＮＦ中和活性を含む有意な特性を有していることを本発明者らにより見出された。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、さらに共通のアミノ酸配列モチーフＸ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）（ここで、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４は、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＣからなる群より選択される疎水性アミノ酸である）を含む。さらに有用な実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）（Ｘ１は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される疎水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４は、Ｗ、ＦおよびＹからなる群より選択される芳香族アミノ酸である）をさらに含む。
【００２２】
現在好ましい実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、以下の表２に示すような配列番号２−２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
【表２】
【００２３】
配列モチーフＰＸＰＸＮが、全ての同定された配列（配列番号４−２８）において見出されうることが表２から明確に分かる。そのため、保存的置換などのアミノ酸置換は、前述の表２に示される上記のアミノ酸配列に適用してもよいことを意図とする。したがって、配列番号４−２８の１３個のアミノ酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９またはさらに１０個は別のアミノ酸により置換されてもよいことを意図とする。したがって、本発明にしたがって本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列番号４−２８のいずれかと少なくとも約２３％、３１％、３８％、４６％、５４％、６２％、６９％、７７％、８５％または９２％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸の置換は、元のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドをもたらす保存的置換である。
【００２４】
当業者は、本発明に記載の様々な同定されたアミノ酸配列を特異的結合剤構造中に挿入してもよいことを分かるであろう。したがって、本発明に記載の得られたアミノ酸配列は、一部を形成するか、または適当なタンパク様骨格に保有されていてもよく、ただし、得られたポリペプチドは上記のＴＮＦとの結合能、および好ましくは、ＴＮＦ生物活性の中和能を保持する。しかしながら、好ましい実施態様において、本発明の生じたアミノ酸配列を保有する構造は、一般に、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）またはその実質的部分であろうし、生じたアミノ酸配列（配列番号１）は、ヒトテトラネクチンのループ１領域（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のようなＣＴＬＤのループ１領域に対応する位置に位置される。同様に、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）またはその実質的部分は、配列番号２−２８から選択される生じたアミノ酸配列をさらに含んでいてもよく、好ましくは、ヒトテトラネクチンのループ１領域（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のようなＣＴＬＤのループ３／４領域に対応する位置に位置される。
【００２５】
現在好ましい実施態様において、本発明のアミノ酸配列は、ヒトテトラネクチンなどのテトラネクチン由来ＣＴＬＤ骨格と結合し、そのため、そこに保有されている。好ましくは、ヒトテトラネクチン由来ＣＴＬＤドメインは、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列である。
【００２６】
下記の実施例から明らかであるように、本発明に記載のポリペプチド（ここで、テトラネクチン由来Ｃ型レクチン様ドメインは、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列であり、残基番号１６５のアスパラギン酸はグリシンに変異されている）が、特に、優れたＴＮＦ中和特性を有していることが本発明者らによりさらに見出された。
【００２７】
一の実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号２９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号３０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号３１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号３２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号３３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号３４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号３５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号３６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号３７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号３８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号３９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号４０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号４１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号４２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号４３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号４４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号４５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号４６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号４７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号４８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号４９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号５０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号５１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号５２）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号５３）などのポリペプチドを含む、テトラネクチンから誘導されるＣＴＬＤ骨格に基づく単量体ＴＮＦ結合ポリペプチドである。
【００２８】
改善した有効性または中和能を提供し、毒性を減少させ、免疫源性を減少させ、血中濃度半減期を延ばしおよび／またはタンパク質分解から保護するために、有用な実施態様において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端を介してビヒクルまたはアミノ酸残基の一つの側鎖と結合していてもよい。ビヒクルの例として、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような線状ポリマー、ポリリシン、デキストラン；分岐鎖ポリマー；液体；コレステロール基（例えば、ステロイド）；炭水化物もしくはオリゴ糖；または天然もしくは合成タンパク質、ヒト血清アルブミンを含むポリペプチドもしくはペプチドが挙げられる。ビヒクルと結合している本発明に記載のポリペプチドの一例は、実施例５に見られるＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７と命名されたペグ化ＴＮＦ結合ポリペプチドである。
【００２９】
特に好ましい実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、多量体化ドメインに保有されるかまたは多量体化ドメインと結合している。本明細書において、「多量体化ドメイン」なる語は、別の、類似のまたは同一の多量体化ドメインと相互作用しうるペプチド、タンパク質またはタンパク質の一部である。相互作用は、多量体タンパク質またはポリペプチドを生成する形態である。かかる相互作用は、多量体化ドメインの成分間の共有結合ならびに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力および塩橋により引き起こされてもよい。有用な実施態様において、多量体化ドメインペプチドは、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、五量体化ドメインまたは六量体化ドメインである。三量体化ドメインの一例は、ＷＯ９５／３１５４０に開示され、コレクチンネック領域を含むポリペプチドを記載している。コレクチンネック領域を構成するアミノ酸配列は、選択されるポリペプチドに結合してもよい。次いで、三量体は、適当な条件下で、コレクチンネック領域のアミノ酸配列を含む３つのポリペプチドで形成されうる。
【００３０】
現在好ましい実施態様において、Ｃ型レクチン様ドメインは、テトラネクチン由来三量体化ドメインに保有され、テトラネクチン由来三量体ドメインと結合している。より明確には、すでにＷＯ９８／５６９０６に詳細に記載されていたテトラネクチン三量体構造要素（以下、ＴＴＳＥという）を含む。ＴＴＳＥのアミノ酸配列は、配列番号８０に示される。ＴＴＳＥの三量体化効果は、比較的高温でさえ非常に安定である三重αへリックスコイルドコイル三量体を形成する２つの別のＴＴＳＥのコイルドコイル構造と相互作用するコイルドコイル構造により引き起こされる。ＴＴＳＥなる語はまた、タンパク質のテトラネクチンファミリーの自然に分泌される一員のＴＴＳＥの変種、αへリックスコイルドコイル三量体を形成するＴＴＳＥの機能に相当な程度悪影響を与えることのないアミノ酸配列に修飾される変種を含むことも意図とする。したがって、本発明に記載のポリペプチドは、三量体化ドメインとしてＴＴＳＥを含んでいてもよく、少なくとも８７％、例えば、少なくとも９２％を含む、配列番号８０の配列と少なくとも６８％、例えば、少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を含む。本明細書にしたがって、ＴＴＳＥ（配列番号５０）の残基番号５０システインは、望ましくない多量体化をもたらしうる、望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避するためにセリン、トレオニン、メチオニンまたは別の適当なアミノ酸残基に有利に変異させてもよい。
【００３１】
さらなる実施態様において、ＴＴＳＥ三量体化ドメイン（配列番号５０）は、（ｉ）ポリヒスチジン配列および／または血液凝固因子Ｘａの切断部位の取り込み、（ｉｉ）Ｃｙｓ５０をＳｅｒで置換すること、および（ｉｉｉ）Ｃ−末端ＫＧＳ配列を含むことにより修飾してもよい。かかる修飾ＴＴＳＥは、配列番号８１として得、ＴｒｉｐＡと命名される。
【００３２】
本発明に基づく異なる三量体ポリペプチドのいくつかの例は、以下の実施例で提供され、上記のＴＴＳＥ三量体化ドメインが適用される。これらは、ＴＮＦ結合ポリペプチドに基づく三量体ＣＴＬＤ：ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号５４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号５５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号５６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号５７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号５８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号５９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号６０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号６１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号６２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号６３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号６４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号６５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号６６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号６７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号６８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号６９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号７０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号７１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号７２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号７３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号７４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号７５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号７６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号７７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号７８）およびＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）を含む。
【００３３】
本発明にしたがって、本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドは、三量体化ドメインのＮ−末端またはＣ−末端アミノ酸残基のいずれかと結合していてもよい。しかしながら、特定の実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドを単量体の三量体化ドメインのＮ−末端およびＣ−末端の両方に結合することが有利であってもよいことも想定され、それにより、ＴＮＦとの結合能および中和能を有する６つの特定のポリペプチドを含む三量体ポリペプチドを提供する。
【００３４】
可動性分子リンカーは、所望により、共有結合間、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドおよび三量体化ドメインの間に介在してもよいことが分かるであろう。特定の実施態様において、リンカーは約１−２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは１０個未満のアミノ酸、最も好ましくは、５、４、３、２または１個であってもよい。特定の場合において、９、８、７または６個のアミノ酸が適当であることがあってもよい。有用な実施態様において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、タンパク分解的切断をする傾向にはなく、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基を含まない（例、システイン残基）。
【００３５】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２−２８、配列番号２９−５３として示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む本発明のポリペプチド、より好ましくは完全な三量体ポリペプチドの配列番号５４−７８をコードする核酸を提供する。
【００３６】
本発明はまた、プラスミド、ベクター、上記の少なくとも１つの核酸を含む転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。必要に応じて、プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、標識遺伝子および他の配列を含む適当な調節配列を含む、適当なベクターを選択または構築しうる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照する。
【００３７】
本発明はまた、上記の１つまたはそれ以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞は、バクテリア、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現の技術に利用可能な哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞およびその他多数を含む。一般に、好ましいバクテリアの宿主はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００３８】
本発明のポリペプチドの発現は、適当な条件下で、例えば、以下の実施例２に詳細に記載の核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより都合よく達成されてもよい。好ましくは、発現は、望ましいタンパク質をインビトロで容易に単離され、再折りたたみしてもよい発現系で行われる。一般的事項として、高収率のタンパク質を得ることができ、効率的精製および再折りたたみ方法が利用可能であるので、系に基づくイー・コリを含む原核生物の発現系が好まれる。したがって、適当または好ましい発現系を選択することは、必要以上の実験をすることなく、当業者の能力および裁量の範囲で十分である。同様に、本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列が選択されると、選択される宿主のコドンバイアスのような因子、宿主の分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ切断部位の導入などを考慮して、当業者は容易に望ましいタンパク質をコードするだろう組換えＤＮＡ構築物などの適当なポリヌクレオチドを設計しうる。これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択される宿主に適当な発現ベクターのメンバーのインフレームに挿入されてもよい。適当または好ましい発現ベクターの選択は、再度、技術者の能力および判断の十分な範囲内の事柄である。好ましくは、発現ベクターは、組換え構築物の発現を促進する強力なプロモーターを含むであろう。最後に、本発明のポリペプチドを、当業者に周知な適当な標準的な製法を用いて単離し、所望により、例えば、凍結乾燥などさらに処理してもよい。本発明のポリペプチドはまた、当業者に周知である適当な物質および反応条件を選択することにより化学合成で製造してもよい。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、通常、ポリペプチドに加えて少なくとも１つの成分、および所望により、別の治療成分を含んでいてもよい、医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明に記載、および本発明にしたがって用いられる医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者に周知な医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または他の物質を含んでいてもよい。物質は、他の成分と混合可能であり、その受容者に無害という意味では許容してもよい。一般に、医薬組成物の調製法は、活性成分およびさらなる成分に付随する工程を含む。
経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液剤の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバンドなどの固体担体を含んでいてもよい。液剤の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油などの液体担体を含む。生理学的なセイライン溶液、デキストロースもしくは他のサッカリド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含んでいてもよい。
【００４０】
静脈注射、または苦痛の部位への注射について、活性成分は、発熱物質遊離であり、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であるだろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを用いて適当な溶液を十分に調製しうる。保存料、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要に応じ含んでいてもよい。
医薬組成物は、治療状況により同時または連続的に単独または他の治療と併用して投与してもよい。他の治療は、適量の非ステロイド性抗炎症薬（例、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）などの鎮痛剤またはモルヒネなどの鎮静剤、あるいは制吐剤の投与を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明の治療用途は、本発明の治療上有効量のポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することにより、ＴＮＦが介在する病変を有する対象を治療することを含む。
【００４２】
上記のように、ＴＮＦは、免疫および炎症反応の主要な介在物質の一つであり、例えば、ＴＮＦが介在する広範囲の疾患の発症に重要な役割を果たすことが知られている。本明細書に用いられる、「ＴＮＦが介在する疾患」または「ＴＮＦが介在する病変」は、ＴＮＦ関連病変または疾患をいう。ＴＮＦ関連病変または疾患は以下を含むが、これに限定されるものではない：
（Ａ）急性および慢性免疫ならびに自己免疫病変、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、甲状腺炎、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）、強皮症、糖尿病、グレーブス病、アレルギーであるが、これに限定されず、同種移植に付随する急性もしくは慢性免疫疾患、例えば、腎移植、心臓移植、骨髄移植、肝移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植および皮膚移植であるが、これに限定されるものではない；
（Ｂ）急性もしくは慢性細菌感染、急性および慢性寄生および／または感染症、悪液質、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ認知症および感染症を含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの細菌性、ウイルス性または真菌性の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）による敗血症候群、悪液質、循環虚脱およびショックを含む感染症であるが、これに限定されるものではない；
（Ｃ）サルコイドーシス、慢性炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病などの慢性炎症性疾患であるが、これに限定されない；播種性血管内凝固症候群、アテローム性動脈硬化、川崎病などの血管炎症性疾患であるが、これに限定されるものではなく、および結節性多発動脈炎、ウェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・ショーンライン紫斑病、巨細胞動脈炎および腎臓の顕微鏡的血管炎などの血管炎症候群であるが、これに限定されるものではない；慢性活動性肝炎；シェーングレン症候群；強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および脊椎炎、病原性関節炎および脊椎炎、反応性関節炎および炎症性大腸炎に付随する関節炎などの脊椎関節症；ならびに、ブドウ膜炎などの炎症性疾患；
（Ｄ）多発性硬化症および急性横断性脊髄炎などの脱髄疾患；重症筋無力症；皮質脊髄系の障害などの錐体外路系および小脳疾患；大脳基底核疾患または小脳疾患；ハンチントン舞踏病、老年性舞踏病などの運動過剰障害；中枢神経系（ＣＮＳ）ドーパミン受容体を阻害する薬剤により誘導される障害などの薬物性運動障害；パーキンソン病などの運動不全障害；進行性核上麻痺；小脳の構造的病変などの小脳および脊髄小脳疾患；脊髄小脳変性症（精髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性症、多系統萎縮症（メンチェル（Ｍｅｎｃｈｅｌ）、デジェリンートーマス（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ）、シャイ・ドレーガーおよびマシャドジョセフ（ＭａｃｈａｄｏＪｏｓｅｐｈ）））；および全身性疾患（レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症、およびミトコンドリア多系統疾患）；神経原性筋萎縮症などの運動単位の障害（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性症）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体疾患；レヴィー小体型老年性認知症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール依存症；原発性胆汁性肝硬変；特発性間質性肺炎および他の繊維性肺疾患；溶血性貧血；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病；ならびにボクサー認知症、またはその一部を含む神経変性疾患であるが、これに限定されるものではない；
（Ｅ）ＴＮＦ分泌腫瘍を含む悪性疾患またはＴＮＦを含む他の悪性腫瘍、例えば、白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ性および／または骨髄胃形成症候群）；リンパ腫（悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫または菌状息肉腫）などのホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）であるが、これに限定されるものではない；
（Ｆ）過剰のＴＮＦを含む、悪液質症候群ならびに他の病変および疾患、例えば、癌の悪液質、寄生虫症および心不全であるが、これに限定されるものではない；ならびに
（Ｇ）アルコール性肝炎および他の形態の慢性肝炎
【００４３】
本発明のポリペプチドは、一般に、血流中への注入またはＴＮＦが介在する疾患の部位に直接注入することで、適当な経路を介して、それを必要とする対象または患者に直接投与してもよい。
【００４４】
例えば、診断目的、アッセイ方法および診断キットについて、本発明のポリペプチドはまた、検出可能なまたは機能的標識で標識してもよい。検出可能な標識は、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび９９Ｔｃなどの放射性標識、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アミノメチルクマリンおよびフィコエリトリンなどの蛍光プローブを含み、タンパク質の標識化の分野において知られている一般的な化学物質を用いて本発明のポリペプチドに結合させてもよい。標識はまた、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。さらに標識は、特定の同族検出部、例えば、標識化アビジンとの結合を介して検出されてもよいビオチンなどの化学部分を含む。機能的標識は、ＴＮＦ発症領域の部位を標的とするために設計される物質を含む。かかる機能的標識は、リシンなどの毒および細菌カルボキシペプチダーゼまたはニトロ還元酵素などの酵素を含み、ＴＮＦ発症領域の部位でプロドラッグを活性剤に変換しうる。
【００４５】
したがって、本発明はまた、（ｉ）試料を本発明に記載のポリペプチドと接触させること、および（ｉｉ）ＴＮＦとポリペプチドの結合を検出することを含む、試料中のＴＮＦを検出するためのアッセイ法を提供する。
【００４６】
この度、本発明は、以下の限定されない実施例および図面において説明するために記載されるであろう。
【００４７】
（図面の記載）
図１は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２）および単量体（ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図２は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を単量体（ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図３は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図４は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２４）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図５は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図６は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図７は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を用いるＨＵＶＥＣアッセイにおけるＴＮＦ誘導性ＩＬ６およびＩＬ８産生の阻害を示す。
図８は、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）、および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。エンブレルおよびレミケードを、対照として用いた。
図９は、３種類の異なる濃度：マウス当たり１２．３、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注射されたマウスのＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
図１０は、三種類の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入されたマウスのＴＮＦ誘導性ＭＣＰ−１産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
図１１は、三種類の異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン（Ｂｏｒｅａｎ）構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処理したマウスの異なる群の関節炎患者のスコアを示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１：ＴＮＦ結合ポリペプチドの単離および構築
テトラネクチン（配列番号６）Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造は、すでにＷＯ／０２４８１８９に開示され、ＴＮＦ結合ポリペプチドの単離および構築に用いられた。発達したＴＮＦ結合ポリペプチドは、一連の注意して取り扱われたインビトロでの成熟工程を介してその有効性に至った。特異性は高いが、弱いアフィニティーの第一候補分子は、アフィニティーおよび結合動的成熟の連続的な工程を介して得、得られた候補は、成熟の第三および第四工程からの「結果」である。成熟は、本質的にＷＯ／０２４８１８９に記載のファージディスプレイ技術を用いて行われた。
ＴＮＦ結合クローンに基づく同定された単量体ＣＴＬＤを、対応する配列番号ならびにループ１およびループ３／４のアミノ酸配列と一緒に、以下の表３に記載する。
【表３】
同定されたクローンはまた、テトラネクチン三量化構造要素（ＴＴＳＥ；配列番号８０）を用いて三量体形態で生産された。上記の同定されたクローンの対応する三量体バージョンは、以下の表４に記載される。
【表４】
【００４９】
実施例２：ＴＮＦ結合ポリペプチドの生産および精製
本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、典型的には、以下の方法を用いて生産および精製された。ＴＮＦ結合ポリペプチドのコード化配列を含有するプラスミドベクターを含むＢＬ２１−ＡＩの単一コロニーから、０．２％Ｌ−アラビノースで誘導し、発現を４時間継続する前に、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを有する２ｘＴＹ中の６Ｌの培養物をＡ６００＝０．８に成長させる。
細胞を収集し、封入体を回収する。６Ｌの培養液からパックした細胞ペレットを、超音波処理により１００ｍＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｗ／ｖ％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、（リーシス−バッファー）で均質化する。次いで、試料を室温で１５分間静置する前に１００ｍＬのリーシス−バッファー当たり１００ｍｇのリゾチームを添加し、合わせる。次いで、試料を合間に合わせながら２−５分間超音波分解する。１００ｍＬの０．２ＭのＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％デオキシコール酸塩、１ｗ／ｖ％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０のＮａ塩、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ（デタージェント−バッファー）を添加し、試料を合わせ、再度、超音波分解する。封入体を４℃、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離により回収する。上清を捨て、ペレットは１００ｍＬの０．５ｗ／ｖ％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ｐＨ８の１ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁した。封入体を４℃、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離により回収する。トリトンＸ−１００バッファー洗浄を再度繰り返す。封入体を、４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離により回収する。
封入体を５０ｍＬの６Ｍのグアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭのＤＴＴ中で再懸濁する。溶液は、セファデックスＧ−２５ファインマトリックス（Ｆｉｎｅ ｍａｔｒｉｘ）カラム上で８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃに変換されるバッファーである。
次いで、タンパク質をＮｉＮＴＡ ＩＭＡＣカラム（キアゲン製ＮｉＮＴＡアガロース）上で捕捉し、カラムは、８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃで洗浄する。次いで、タンパク質を８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃ、２０ｍＭのＥＤＴＡ中で溶出する。
ＮｉＮＴＡ ＩＭＡＣ捕捉カラムからの捕捉溶出液を、１Ｌスケールで希釈による再折りたたみに用いる。３Ｍの尿素、５０ｍＭのグリシン ｐＨ９．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．３ｍＭのシスタミンを含む１Ｌの再折りたたみバッファーを濾過し、７℃の令書にある２Ｌの瓶に入れる。マグネット攪拌棒を加え、攪拌は２５０ｒｐｍで行う。次いで、変性捕捉溶出タンパク質溶液を、蠕動ポンプを用いて１００μＬ／分の一定流量で再折りたたみバッファーに滴下する。再折りたたみが終了する時点の最終タンパク質濃度は２５０μｇ／ｍＬである。
多量体は、８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２、４００ｍＭのＮａＣｌの勾配（室温）でＳＰ−セファロース（アマシャム）上にて除去される。次いで、カラムは、全マトリックス容量の約４００ｍｌのセファデックスＧ−２５ファインマトリックスで充填され、１Ｌの１Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０は１０ｍｌ／分で平衡に用いられる。
ＳＰ−セファロースから溶出液を、約８ｍｌ／分の流速でセファデックスＧ−２５ファインマトリックスに適用する。タンパク質は、約８ｍｌ／分の流速で１Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０を用いて溶出される。溶出液を貯蔵し、タンパク質濃度を測定する。
１：２５０％ｗ／ｗ（ｍｇのＧｒＢ／ｍｇの三量体ＴＮＦ結合ポリペプチド）の割合に相当するグランザイムＢを添加する。添加後、溶液を徐々に合わせ、２５℃で２４時間インキュベートする。温浸後、固体尿素を８Ｍの尿素溶液を産生する溶液に添加し、ｐＨを１Ｍの酢酸ナトリウムでｐＨ４．５に合わせる。
ＴＮＦ結合ポリペプチドを、８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０００ｍＭのＮａＣｌの勾配（室温）でスクロース１５Ｓカラム（アマシャム）上にて研磨し、かつ、濃縮する。最後に、溶出した単量体フラクションは、セファデックスＧ−２５ファインマトリックス上でゲル濾過により２５ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ５．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのスクロース中で製剤化される。かかる工程収率は９５％以上であり、タンパク質は、可視可能なまたはＡ４１０で追跡した場合に測定可能な沈殿をすることなく複数の解凍−凍結サイクルに耐える。
【００５０】
実施例３：ＴＮＦ結合ポリペプチドの生物活性
表４に示されるＴＮＦ結合ポリペプチド、すなわち、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９ならびに単量体ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（それぞれＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７に対応する）の選択は、Ｌ９２９腫瘍細胞株、ネズミ線維芽細胞様細胞を用いて、ＴＮＦの生物活性を阻害する機能を測定することによりアッセイされた。選択したクローンのＴＮＦ中和活性は、商業的に入手可能なＴＮＦアンタゴニストのレミケード（エタナーセプト）、エンブレル（インフリキシマブ）および溶解性ＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号１０８９−Ｒ２−０２５／ＣＦ）と比較した。
ＴＮＦ阻害アッセイを、以下のアッセイプロトコルにしたがって実施した：Ｌ９２９細胞（ＥＣＡＣＣ番号：８５０１１４２５）を、アッセイの準備前日に３ｘ１０５／ｍｌで蒔く。試験体を添加する前に、細胞を接着させ、集密となるようにさせなければならない。平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）；Ｃａｔ番号１６７００８）のウェルに７５μｌの容量の細胞懸濁液を分注する。ＥＩＬＳＡリーダーのブランクとして、１列の８個のウェルを細胞のない状態にしておく。細胞を添加する時点で、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの最終培養濃度を得るために、試験試料を２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含有する培養液で希釈する。２０μｇ／ｍｌで（必要ならば３７℃に加温しながら）ＰＢＳ中のアクチノマイシンＤ（シグマ）を溶解し、５ｍｌの（または適当な）量にて−２０℃で保存する。必要に応じてヒトＴＮＦを解凍し、培養液で４μｇ／ｍｌに希釈する−解凍した濃縮溶液は、４℃で最大２週間安定である。培養液中で試験試料の一連の希釈物を作製する（ＴＮＦ ＱＣの場合、３倍希釈が適している）。次いで、試験試料をヒトＴＮＦを含む種々の溶液１：１で希釈する。各希釈について、７５μｌの容量を３回、Ｌ９２９細胞に添加する。各プレート上で、陰性対照（すなわち、組織培養液のみ）および陽性対照（阻害薬を有しないヒトＴＮＦ）を含む。試験試料の添加後、３７℃、５％のＣＯ２で１６時間マイクロタイタープレートをインキュベートする。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射性細胞増殖アッセイキット（プロメガ）の部分としてＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジ−フェニル−テトラゾリウム）を用いて測定する：ＭＴＳ−およびＰＭＳ溶液を解凍する。１５０μｌの容量で培養した細胞を含有する１個の９６ウェルプレートに十分な量の試薬を調製するために、３．０ｍｌのＭＴＳ溶液を無菌法を用いて琥珀色の試薬瓶から取り出し、試験管に移し替える。細胞を含有する培養プレートに添加する直前に１５０μｌのＰＭＳ溶液を３．０ｍｌのＭＴＳ溶液に添加する。合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液の完全混合を確実にするために試験管を穏やかに回転させる。培養液中１５０μｌの細胞を含有する９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに３０μｌの合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液をピペットで添加する。加湿された５％ＣＯ２雰囲気下において、３７℃で１−４時間プレートをインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を記録する。
上記ＴＮＦ阻害アッセイからの結果を、図１、２、３、４、５および６に示す。三量体クローンＴＮ２Ｂ１Ｃ２２、ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１およびＴＮ２Ｂ１Ｃ２４（対応する単量体ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４）全て、レミケード（インフリキシマブ）および溶解性ＴＮＦ受容体ＩＩ（ＲＩＩ）と比べて同等またはより良いＴＮＦ中和能力を有することが図１、３および４から明確である。特に、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１はエンブレルよりさらに優れていることが図１および３から見ることができる。図１は、ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２（すなわち、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２）の単量体型のＴＮＦ阻害能は、レミケードと同等であることを示す。ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２−７（すなわち、ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）の単量体型は、レミケードより優れていることが図２から分かる。
【００５１】
実施例４：ＨＵＶＥＣアッセイ
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、臍帯から単離された初代非形質転換ヒト細胞である。細胞は数継代の培養液中で保持しうる。臍帯内皮細胞はＴＮＦに感受性がある。ＴＮＦによる細胞の活性化の後に、細胞はＩＬ８およびＩＬ６のような炎症性サイトカインを産生し始める。これらの反応は、細菌感染後の一次防御を表す。ＴＮＲ結合ポリペプチドの有効性を調べるために、本発明者らは、ＩＬ６およびＩＬ８の産生を誘導するＴＮＦの阻害を試験した。
ＨＵＶＥＣ細胞（カンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）Ｌｏｔ．Ｎｒ．２ｆ１８２８）を、アッセイの準備前日にＥＧＭ−２培地に蒔く。試験前に細胞を接着させ、集密になるようにさせなければならない。ウェル当たり２００μｌの５ｘ１０４／ｍＬのＨＵＶＥＣ細胞懸濁液は、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンクロン；Ｃａｔ．番号１６７００８）のウェルにピペットで添加する。試験試料を培養液で希釈する。試験試料を以下のとおり調製する：望ましい濃度でＴＮＦ結合ポリペプチド、エンブレルまたはレミケードを１５分間インキュベートする。次いで、３ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦを有しており、１００μｌの溶液をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、最終濃度１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを得る。希釈の正確な範囲は、試験試料の性質および標的の感受性による。各プレートは、陰性対照（すなわち、組織培養液のみ）および陽性対照を含む。試験試料の添加後、マイクロタイタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６−２４時間インキュベートする。
翌日、上清をウェルから収集し、ＩＬ６およびＩＬ８（１０倍希釈）Ｅｌｉｓａを、ヒトＩＬ−６＆ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡ（９６ウェル）のプロトコルにしたがってＴＮＦ誘導性サイトカインを測定するために実施する。以下の物質：ヒト組換えＩＬ−６：Ｃａｔ．番号２０６−ＩＬ−０１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、モノクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体 コード番号ＭＡＢ ２０６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチン化抗ヒトＩＬ−６抗体 Ｃａｔ．番号ＢＡＦ２０６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト組換えＩＬ−８：Ｃａｔ．番号２０８−ＩＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、モノクローナル抗ヒトＩＬ−８抗体 コード番号ＭＡＢ２０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチン化抗ヒトＩＬ−８抗体Ｃａｔ．番号ＢＡＦ２０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡに用いる。
ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を、上記ＨＵＶＥＣアッセイで試験した。かかる実験結果を図６および７に示す。かかる図から分かるように、ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８は、好ましくは、ＩＬ８（図６）およびＩＬ６（図７）の誘導を阻害しうる。ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８（Ｃ２２−８）は、かかる試験においてエンブレルと同程度であり、有意にレミケードより優れている。
【００５２】
実施例５：ペグ化ＴＮＦ結合ポリペプチドＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７
三量体ＴＮＦ結合ポリペプチドＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）を、溶液がセファデックスＧ−２５ファインマトリックスカラム上の下記のペグ化バッファーに交換したバッファーであることを除き、基本的に実施例２の記載のとおりに調製した。
かかる構築物は、配列の最初の９残基のアミノ酸の欠失、およびＮ末端に２個のグリシン残基を付加することによりペグ化を行った。２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を含む８Ｍ尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ中のＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液は、１０モル過剰の２０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシ ポリ（エチレングリコール）−ブチル−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）を添加された。反応物を約２０℃で一晩攪拌した。その後、タンパク質とｍＰＥＧ−ＡＬＤの間の反応進行度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。
ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を非反応性単量体から分離するために、陽イオン交換カラムに付した。８Ｍ尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２で平衡化した１ｍＬのスクロース１５Ｓカラム（アマシャム）に反応混合物を充填し、８Ｍ尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿路、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０００ｍＭのＮａＣｌの線状勾配を、非ペグ化タンパク質からペグ化タンパク質を分画するために用いた。
Ｌ９２９アッセイを、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いて実施例３に記載のとおり実施した。エンブレルおよびレミケードを対照として用いた。
図８から分かるように、インビトロアッセイのペグ化物質の有効性は、非ペグ化物質と有意に異なってはいなかった。
【００５３】
実施例６：マウスにおける炎症性サイトカイン誘導のインビボ阻害
マウスは、３種の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入された。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。対照において正常に見られるように、ヒトＴＮＦは、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１などの炎症性サイトカイン産生を誘導する。しかしながら、図９および１０から分かるように、ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１は、かかる炎症性サイトカインの誘導を阻害しうる。
【００５４】
実施例６：関節リウマチ誘発のインビボ防止
Ｔｇ１９７トランスジェニックマウス系は、ヒトＴＮＦを発現する。マウスは５個のヒトＴＮＦコピーを持っており、３ないし４週の年齢で多発性関節炎を発症する。疾患は、足関節の腫れおよび変形を伴って４週で臨床的に検出可能である。これは、重度の関節破壊および８ないし１０週の年齢の後脚の脚運動の機能障害をもたらす。進行性体重減少は共通するものである。ＴＮＦ中和剤の適当な投与は、疾患の発症を予防する。Ｔｇ１９７ネズミ関節炎モデル中の多発性関節炎の予防における本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドの有効性を試験するために、ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ３１を年齢および体重が一致するＴｇ１９７マウスの群に投与した。処置は３−４週で予防を開始した。ＴＮＦ結合ポリペプチドを、５週間腹腔内（ｉ．ｐ．）に３種の用量：３．３、１．０および０．５ｍｇ／ｋｇで週に３回投与した。２回目の腹腔内注射前および実験の終了までに血液試料を得た。
関節炎の重症度を、ＡＳ−０からＡＳ−３の範囲の関節炎スコアで評価し、表した（ここで、０は関節炎がなく、３は関節中の軟骨破壊および骨破壊により完全に足が不自由となっている）。
図１１は、異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処置した異なる群のマウスの関節炎スコアを示す。図１１から分かるように、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１の量が高いほど関節炎スコアはさらに低くなる。これは、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１が関節リウマチの治療に有効であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２）および単量体（ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図２】図２は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を単量体（ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図３】図３は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図４】図４は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２４）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図５】図５は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図６】図６は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図７】図７は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を用いるＨＵＶＥＣアッセイにおけるＴＮＦ誘導性ＩＬ６およびＩＬ８産生の阻害を示す。
【図８】図８は、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）、および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。エンブレルおよびレミケードを、対照として用いた。
【図９】図９は、３種類の異なる濃度：マウス当たり１２．３、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注射されたマウスのＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
【図１０】図１０は、三種類の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入されたマウスのＴＮＦ誘導性ＭＣＰ−１産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
【図１１】図１１は、三種類の異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処理したマウスの異なる群の関節炎患者のスコアを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ＴＮＦに結合し、そのアンタゴニストとして作用しうるポリペプチドおよび関連化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、単球およびマクロファージを含む多数の細胞型により産生されるホモ三量体サイトカインであり、当初は特定のマウスの腫瘍の壊死を誘導する機能に基づき同定された。ＴＮＦは、免疫および炎症反応の主要な介在物質の一つであり、例えば、人口の約０．５−１％に影響を与える一般的な自己免疫炎症性疾患である関節リウマチの発症に重要な役割を果たすことが知られている。さらに、ＴＮＦは、内毒素性ショック、脳マラリアおよび移植片対宿主反応を含む、広範囲の病状の発症に関することも知られている。溶解性および生物活性型のＴＮＦは、３つの同一の１７ｋＤのタンパク質サブユニット（ホモ三量体）からなり、それに対し膜結合型は、３つの同一の２６ｋＤのサブユニットからなる。
【０００３】
組換えまたは修飾タンパク質は、新規クラスの治療薬である。現在までに、ＴＮＦアンタゴニストの機能を果たす数種の組換えまたは修飾タンパク質が開示されている。特に、ＴＮＦに結合し、中和する抗体は、ＴＮＦ活性を阻害するための手段として求められている。インフリキシマブ（レミケード）およびエタナーセプト（エンブレル）は、関節リウマチの治療について米国およびヨーロッパ両方で製造承認を受けた２つのＴＮＦアンタゴニストの例である。２つの製品は、乾癬およびクローン病の治療についても効果を示している。インフリキシマブはマウス可変領域ならびにヒトＩｇＧ１およびκ定常領域でのキメラ抗体であり、溶解性および膜貫通型のＴＮＦに結合することによりＴＮＦの生物活性を中和し、かかる受容体とＴＮＦの結合を阻害する。インフリキシマブの構造は、自然に分泌される抗体の構造と同様である。エタナーセプトは、ｐ７５のＴＮＦ受容体の細胞外ドメインおよびヒンジならびにヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを構成する融合タンパク質である。
【０００４】
ＷＯ２００４／０３９８は、ＴＮＦとの結合能を有するヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）に基づく４種の特異的結合ポリペプチドを開示している。タンパク質は、ループ１領域（配列番号７９のテトラネクチンアミノ酸番号１１６−１２２）中のアミノ酸配列ＫＶＲＳＲＹＦ、およびＰＲＨＴ、ＰＴＮＮ、ＰＴＮＲ、またはループ３／４領域（配列番号７９のテトラネクチンアミノ酸番号１４６−１４９）中のＰＮＮＲで野生型ＣＴＬＤと異なっている（例えば、ＷＯ２００４／０３９８、表４、４６頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、改善した結合特性および改善した有効性を有するヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメインに基づく特異的ＴＮＦ結合タンパク質を同定し、かつ、単離した。同定されたＴＮＦ結合タンパク質は、インビボでのＴＮＦの阻害能および中和能に関して上記の先行技術の動脈内のＴＮＦ結合タンパク質に基づくＣＴＬＤより優れている。これは、例えば、下記の実施例から分かるように、マウス繊維芽細胞株アッセイにおいて、ＴＮＦアルファ媒介性細胞傷害の阻害能により明らかにされた。さらに、単離された特異的ＴＮＦ結合タンパク質はまた、商業的に入手可能なＴＮＦアンタゴニスト、インフリキシマブ（レミケード）およびエタナーセプト（エンブレル）と比べて優れたＴＮＦ拮抗特性を有することが明らかにされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、最初の態様において、本発明は、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）を含むＴＮＦ結合ドメインを含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有するポリペプチドに関する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、上記のポリペプチドをコードする配列を含む核酸、ならびに特異的ポリペプチドが発現されるかかる条件下で前記核酸を発現すること、および特異的ポリペプチドを回収することを含む本発明の特異的ポリペプチドの調製法を提供する。
【０００８】
本発明に記載のポリペプチドを、医薬組成物の調製、およびＴＮＦが介在する病変を有する対象の治療法、例えば、有効量の本発明の特異的結合剤を対象に投与することを含む関節リウマチの治療法において用いてもよい。
【０００９】
本発明のこれらおよび別の態様をさらに詳細に以下において記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＴＮＦと高いアフィニティーおよび低い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で結合し、高い腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）中和能を有するポリペプチドに関する。
【００１１】
上記のとおり、本発明のポリペプチドは、テトラネクチンＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造に由来する。Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）は、タンパク質ドメインファミリーであり、多数の動物種から単離された多数のタンパク質で同定されている。最初に、ＣＴＬＤドメインを、いわゆるＣ型レクチン（カルシウム依存性炭水化物結合タンパク質）と「糖認識ドメイン」（「ＣＲＤ」）に共通するドメインとして同定した。さらに近年、かかるドメインは、テトラネクチンなどの多数の真核生物のタンパクの間で共有され、そのうちのいくつかは糖部分と結合せず、したがって、標準ドメインがＣＴＬＤと称されることが明らかになっている。ＣＴＬＤは、約１２０個のアミノ酸残基からなり、特徴として、２または３個の鎖内ジスルフィド架橋を含む。
【００１２】
ＣＴＬＤドメインは、リガンド結合タンパク質ユニットのランダム化ライブラリーの作成に適するものとして、すでにＷＯ／０２４８１８９に開示されている。ライブラリーを、ＣＴＬＤのループ領域を一部または全部、１つまたはそれ以上のランダム化ポリペプチド断片で置換したテトラネクチンＣＴＬＤ骨格構造を組み合わせることにより構築した。
【００１３】
本発明のポリペプチドを、かかるランダム化ライブラリーシステムを用いて構築し、その際にテトラネクチンのＣＴＬＤドメインを新規ＴＮＦ結合ポリペプチドの構築に用いた。本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドは、一連の注意して取り扱われたインビトロでのエボリューション工程を介して、その高い結合アフィニティーおよびインビボでのＴＮＦの阻害能および中和能を有するに至った。一般に、該方法は、連続するアフィニティーおよび結合速度の成熟工程を介して、特異性に富むが、アフィニティーに乏しい第一の候補ポリペプチドを採用することを暗示する。本発明のポリペプチドは、選択および成熟工程を数回行った「結果」である。
【００１４】
本発明は、ＴＮＦとの結合能を有し、好ましくは中和能を有する配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。そのアミノ酸配列は、テトラネクチンＣＴＬＤ骨格（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のいわゆるループ１領域にて作り出される。かかる配列は、特に、高いＴＮＦ中和活性を含む、有利な特性を提供する。アミノ酸配列は、以下の表１に記載している：
【表１】
【００１５】
本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、ＴＮＦの一部との結合能を有する。本発明にしたがって、「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有する」なる語は、ＴＮＦに結合する特異的ポリペプチドをいう。有用な実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴により決定される、好ましくは、１×１０−８Ｍ以下であるＴＮＦに対する結合アフィニティー（Ｋｄ）を有する。別の有用な実施態様において、Ｋｄ値は、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、さらには１×１０−１５Ｍ未満でさえある。さらに有用な実施態様において、本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドについてのＫ−ｏｆｆ速度は、表面プラズモン共鳴により決定される１×１０−３Ｓ−１未満例えば、１×１０−５Ｓ−１未満を含め１×１０−４Ｓ−１未満、さらには１×１０−６Ｓ−１未満である。本明細書に用いられる「Ｋ−ｏｆｆ」なる語は、ＴＮＦ結合ポリペプチド／ＴＮＦ複合体からの本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドの解離のための解離速度定数を意図とする。本明細書に用いられる「表面プラズモン共鳴」なる語は、例えばＢＩＡコアシステム（ファーマシア バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用いてバイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより実時間生物特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象をいう。
【００１６】
好ましくは、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、ＴＮＦの生物活性および／または別のＴＮＦ関連活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害または中和するような手段で、ＴＮＦとの結合能を有する。本明細書に用いられる、「中和する」なる表現は、インビボまたはインビトロで測定されるＴＮＦの阻害または生物活性の減少を意味する。本発明に記載のポリペプチドのＴＮＦ中和または拮抗作用は、以下の実施例に記載のネズミ繊維芽細胞Ｌ９２９細胞株アッセイまたはＨＵＶＥＣアッセイなどのインビトロアッセイにより示唆されうる。別法として、インビボでの動物実験、例えば、以下の実施例に記載のＴｇ１９７トランスジェニックマウス系を適用することによりＴＮＦ拮抗作用を測定することが適当であってもよい。
【００１７】
本明細書において用いられる「腫瘍壊死因子」（本明細書にてＴＮＦと省略）なる語は、溶解性および生物活性型が、３個の同一の１７ｋＤの非共有結合タンパク質サブユニットからなり、それに対し膜結合型が、３個の同一の２６ｋＤタンパク質サブユニットからなるヒトサイトカインを意図とする。特に、該語は、エントリー名「ＴＮＦＡ＿ＨＵＭＡＮ」およびＥｘＰＡＳｙの一次アクセッション番号Ｐ０１３７５：ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｉｎ−ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３７８４−３７８８（２００３）（インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでアクセス可能）の下に記載されるタンパク質を意図とする。ＴＮＦの構造は、例えば、Ｐｅｎｎｉｃａ Ｄ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９にさらに記載される。頻繁に用いられるＴＮＦの同義語は、ＴＮＦ−アルファ、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー２、ＴＮＦ−αおよびカケクチンを含む。
【００１８】
上記のとおり、本発明のポリペプチドは、実質的にＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）として示されるようなアミノ酸配列を含む。「実質的に示されるような」により、本発明のポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦと同一又は高度の相同性を示すアミノ酸配列を含むであろうことを意味する。「高度の相同性」により、配列ＫＲＷＳＲＹＦの７個のアミノ酸の中から１、２、３またはさらに４個を別のアミノ酸で置換してもよいことが考えられる。したがって、本発明にしたがって本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）と少なくとも約４３％、５７％、７１％、８６％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸の置換は、元のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドをもたらす保存的置換である。自然に分泌されるアミノ酸残基は、共通の側鎖の特徴に基づく（重複する）クラスに分類してもよい：
（１）疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；
（２）親水性：セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；
（３）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；
（４）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；
（５）塩基性：リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；
（６）荷電性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；および
（７）鎖配向に影響を与える残基：グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）。
【００１９】
保存的アミノ酸置換は、上記のアミノ酸クラスの一つのメンバーを同じクラスの他のメンバーと交換することを含む。保存的変化は、典型的には、生体系での合成によるよりもむしろ化学ペプチド合成により組み込まれる、特殊なアミノ酸残基を包含しうる。
【００２０】
下記の実施例から明らかであるように、上記の配列ＫＲＷＳＲＹＦに加えて、さらに共通のアミノ酸配列モチーフＰＸ１ＰＸ２Ｎ（配列番号２）（ここで、Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、アミノ酸残基である）を含む本発明のポリペプチドが、特に、高いＴＮＦ中和活性を含む有意な特性を有していることを本発明者らにより見出された。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、さらに共通のアミノ酸配列モチーフＸ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）（ここで、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４は、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＣからなる群より選択される疎水性アミノ酸である）を含む。さらに有用な実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）（Ｘ１は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される疎水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４は、Ｗ、ＦおよびＹからなる群より選択される芳香族アミノ酸である）をさらに含む。
【００２２】
現在好ましい実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、以下の表２に示すような配列番号２−２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
【表２】
【００２３】
配列モチーフＰＸＰＸＮが、全ての同定された配列（配列番号４−２８）において見出されうることが表２から明確に分かる。そのため、保存的置換などのアミノ酸置換は、前述の表２に示される上記のアミノ酸配列に適用してもよいことを意図とする。したがって、配列番号４−２８の１３個のアミノ酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９またはさらに１０個は別のアミノ酸により置換されてもよいことを意図とする。したがって、本発明にしたがって本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列番号４−２８のいずれかと少なくとも約２３％、３１％、３８％、４６％、５４％、６２％、６９％、７７％、８５％または９２％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。好ましくは、アミノ酸の置換は、元のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドをもたらす保存的置換である。
【００２４】
当業者は、本発明に記載の様々な同定されたアミノ酸配列を特異的結合剤構造中に挿入してもよいことを分かるであろう。したがって、本発明に記載の得られたアミノ酸配列は、一部を形成するか、または適当なタンパク様骨格に保有されていてもよく、ただし、得られたポリペプチドは上記のＴＮＦとの結合能、および好ましくは、ＴＮＦ生物活性の中和能を保持する。しかしながら、好ましい実施態様において、本発明の生じたアミノ酸配列を保有する構造は、一般に、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）またはその実質的部分であろうし、生じたアミノ酸配列（配列番号１）は、ヒトテトラネクチンのループ１領域（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のようなＣＴＬＤのループ１領域に対応する位置に位置される。同様に、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）またはその実質的部分は、配列番号２−２８から選択される生じたアミノ酸配列をさらに含んでいてもよく、好ましくは、ヒトテトラネクチンのループ１領域（配列番号７９のアミノ酸番号１１６−１２２）のようなＣＴＬＤのループ３／４領域に対応する位置に位置される。
【００２５】
現在好ましい実施態様において、本発明のアミノ酸配列は、ヒトテトラネクチンなどのテトラネクチン由来ＣＴＬＤ骨格と結合し、そのため、そこに保有されている。好ましくは、ヒトテトラネクチン由来ＣＴＬＤドメインは、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列である。
【００２６】
下記の実施例から明らかであるように、本発明に記載のポリペプチド（ここで、テトラネクチン由来Ｃ型レクチン様ドメインは、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列であり、残基番号１６５のアスパラギン酸はグリシンに変異されている）が、特に、優れたＴＮＦ中和特性を有していることが本発明者らによりさらに見出された。
【００２７】
一の実施態様において、本発明に記載のポリペプチドは、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号２９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号３０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号３１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号３２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号３３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号３４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号３５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号３６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号３７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号３８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号３９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号４０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号４１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号４２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号４３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号４４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号４５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号４６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号４７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号４８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号４９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号５０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号５１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号５２）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号５３）などのポリペプチドを含む、テトラネクチンから誘導されるＣＴＬＤ骨格に基づく単量体ＴＮＦ結合ポリペプチドである。
【００２８】
改善した有効性または中和能を提供し、毒性を減少させ、免疫源性を減少させ、血中濃度半減期を延ばしおよび／またはタンパク質分解から保護するために、有用な実施態様において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端を介してビヒクルまたはアミノ酸残基の一つの側鎖と結合していてもよい。ビヒクルの例として、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような線状ポリマー、ポリリシン、デキストラン；分岐鎖ポリマー；液体；コレステロール基（例えば、ステロイド）；炭水化物もしくはオリゴ糖；または天然もしくは合成タンパク質、ヒト血清アルブミンを含むポリペプチドもしくはペプチドが挙げられる。ビヒクルと結合している本発明に記載のポリペプチドの一例は、実施例５に見られるＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７と命名されたペグ化ＴＮＦ結合ポリペプチドである。
【００２９】
特に好ましい実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、多量体化ドメインに保有されるかまたは多量体化ドメインと結合している。本明細書において、「多量体化ドメイン」なる語は、別の、類似のまたは同一の多量体化ドメインと相互作用しうるペプチド、タンパク質またはタンパク質の一部である。相互作用は、多量体タンパク質またはポリペプチドを生成する形態である。かかる相互作用は、多量体化ドメインの成分間の共有結合ならびに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力および塩橋により引き起こされてもよい。有用な実施態様において、多量体化ドメインペプチドは、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、五量体化ドメインまたは六量体化ドメインである。三量体化ドメインの一例は、ＷＯ９５／３１５４０に開示され、コレクチンネック領域を含むポリペプチドを記載している。コレクチンネック領域を構成するアミノ酸配列は、選択されるポリペプチドに結合してもよい。次いで、三量体は、適当な条件下で、コレクチンネック領域のアミノ酸配列を含む３つのポリペプチドで形成されうる。
【００３０】
現在好ましい実施態様において、Ｃ型レクチン様ドメインは、テトラネクチン由来三量体化ドメインに保有され、テトラネクチン由来三量体ドメインと結合している。より明確には、すでにＷＯ９８／５６９０６に詳細に記載されていたテトラネクチン三量体構造要素（以下、ＴＴＳＥという）を含む。ＴＴＳＥのアミノ酸配列は、配列番号８０に示される。ＴＴＳＥの三量体化効果は、比較的高温でさえ非常に安定である三重αへリックスコイルドコイル三量体を形成する２つの別のＴＴＳＥのコイルドコイル構造と相互作用するコイルドコイル構造により引き起こされる。ＴＴＳＥなる語はまた、タンパク質のテトラネクチンファミリーの自然に分泌される一員のＴＴＳＥの変種、αへリックスコイルドコイル三量体を形成するＴＴＳＥの機能に相当な程度悪影響を与えることのないアミノ酸配列に修飾される変種を含むことも意図とする。したがって、本発明に記載のポリペプチドは、三量体化ドメインとしてＴＴＳＥを含んでいてもよく、少なくとも８７％、例えば、少なくとも９２％を含む、配列番号８０の配列と少なくとも６８％、例えば、少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を含む。本明細書にしたがって、ＴＴＳＥ（配列番号５０）の残基番号５０システインは、望ましくない多量体化をもたらしうる、望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避するためにセリン、トレオニン、メチオニンまたは別の適当なアミノ酸残基に有利に変異させてもよい。
【００３１】
さらなる実施態様において、ＴＴＳＥ三量体化ドメイン（配列番号５０）は、（ｉ）ポリヒスチジン配列および／または血液凝固因子Ｘａの切断部位の取り込み、（ｉｉ）Ｃｙｓ５０をＳｅｒで置換すること、および（ｉｉｉ）Ｃ−末端ＫＧＳ配列を含むことにより修飾してもよい。かかる修飾ＴＴＳＥは、配列番号８１として得、ＴｒｉｐＡと命名される。
【００３２】
本発明に基づく異なる三量体ポリペプチドのいくつかの例は、以下の実施例で提供され、上記のＴＴＳＥ三量体化ドメインが適用される。これらは、ＴＮＦ結合ポリペプチドに基づく三量体ＣＴＬＤ：ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号５４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号５５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号５６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号５７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号５８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号５９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号６０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号６１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号６２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号６３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号６４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号６５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号６６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号６７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号６８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号６９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号７０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号７１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号７２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号７３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号７４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号７５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号７６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号７７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号７８）およびＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）を含む。
【００３３】
本発明にしたがって、本発明に記載のＴＮＦ結合ポリペプチドは、三量体化ドメインのＮ−末端またはＣ−末端アミノ酸残基のいずれかと結合していてもよい。しかしながら、特定の実施態様において、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドを単量体の三量体化ドメインのＮ−末端およびＣ−末端の両方に結合することが有利であってもよいことも想定され、それにより、ＴＮＦとの結合能および中和能を有する６つの特定のポリペプチドを含む三量体ポリペプチドを提供する。
【００３４】
可動性分子リンカーは、所望により、共有結合間、本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドおよび三量体化ドメインの間に介在してもよいことが分かるであろう。特定の実施態様において、リンカーは約１−２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは１０個未満のアミノ酸、最も好ましくは、５、４、３、２または１個であってもよい。特定の場合において、９、８、７または６個のアミノ酸が適当であることがあってもよい。有用な実施態様において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、タンパク分解的切断をする傾向にはなく、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基を含まない（例、システイン残基）。
【００３５】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２−２８、配列番号２９−５３として示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む本発明のポリペプチド、より好ましくは完全な三量体ポリペプチドの配列番号５４−７８をコードする核酸を提供する。
【００３６】
本発明はまた、プラスミド、ベクター、上記の少なくとも１つの核酸を含む転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。必要に応じて、プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、標識遺伝子および他の配列を含む適当な調節配列を含む、適当なベクターを選択または構築しうる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照する。
【００３７】
本発明はまた、上記の１つまたはそれ以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞は、バクテリア、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現の技術に利用可能な哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞およびその他多数を含む。一般に、好ましいバクテリアの宿主はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００３８】
本発明のポリペプチドの発現は、適当な条件下で、例えば、以下の実施例２に詳細に記載の核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより都合よく達成されてもよい。好ましくは、発現は、望ましいタンパク質をインビトロで容易に単離され、再折りたたみしてもよい発現系で行われる。一般的事項として、高収率のタンパク質を得ることができ、効率的精製および再折りたたみ方法が利用可能であるので、系に基づくイー・コリを含む原核生物の発現系が好まれる。したがって、適当または好ましい発現系を選択することは、必要以上の実験をすることなく、当業者の能力および裁量の範囲で十分である。同様に、本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列が選択されると、選択される宿主のコドンバイアスのような因子、宿主の分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ切断部位の導入などを考慮して、当業者は容易に望ましいタンパク質をコードするだろう組換えＤＮＡ構築物などの適当なポリヌクレオチドを設計しうる。これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択される宿主に適当な発現ベクターのメンバーのインフレームに挿入されてもよい。適当または好ましい発現ベクターの選択は、再度、技術者の能力および判断の十分な範囲内の事柄である。好ましくは、発現ベクターは、組換え構築物の発現を促進する強力なプロモーターを含むであろう。最後に、本発明のポリペプチドを、当業者に周知な適当な標準的な製法を用いて単離し、所望により、例えば、凍結乾燥などさらに処理してもよい。本発明のポリペプチドはまた、当業者に周知である適当な物質および反応条件を選択することにより化学合成で製造してもよい。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、通常、ポリペプチドに加えて少なくとも１つの成分、および所望により、別の治療成分を含んでいてもよい、医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明に記載、および本発明にしたがって用いられる医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者に周知な医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または他の物質を含んでいてもよい。物質は、他の成分と混合可能であり、その受容者に無害という意味では許容してもよい。一般に、医薬組成物の調製法は、活性成分およびさらなる成分に付随する工程を含む。
経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液剤の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバンドなどの固体担体を含んでいてもよい。液剤の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油などの液体担体を含む。生理学的なセイライン溶液、デキストロースもしくは他のサッカリド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含んでいてもよい。
【００４０】
静脈注射、または苦痛の部位への注射について、活性成分は、発熱物質遊離であり、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であるだろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを用いて適当な溶液を十分に調製しうる。保存料、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要に応じ含んでいてもよい。
医薬組成物は、治療状況により同時または連続的に単独または他の治療と併用して投与してもよい。他の治療は、適量の非ステロイド性抗炎症薬（例、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）などの鎮痛剤またはモルヒネなどの鎮静剤、あるいは制吐剤の投与を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明の治療用途は、本発明の治療上有効量のポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することにより、ＴＮＦが介在する病変を有する対象を治療することを含む。
【００４２】
上記のように、ＴＮＦは、免疫および炎症反応の主要な介在物質の一つであり、例えば、ＴＮＦが介在する広範囲の疾患の発症に重要な役割を果たすことが知られている。本明細書に用いられる、「ＴＮＦが介在する疾患」または「ＴＮＦが介在する病変」は、ＴＮＦ関連病変または疾患をいう。ＴＮＦ関連病変または疾患は以下を含むが、これに限定されるものではない：
（Ａ）急性および慢性免疫ならびに自己免疫病変、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、甲状腺炎、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）、強皮症、糖尿病、グレーブス病、アレルギーであるが、これに限定されず、同種移植に付随する急性もしくは慢性免疫疾患、例えば、腎移植、心臓移植、骨髄移植、肝移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植および皮膚移植であるが、これに限定されるものではない；
（Ｂ）急性もしくは慢性細菌感染、急性および慢性寄生および／または感染症、悪液質、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ認知症および感染症を含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの細菌性、ウイルス性または真菌性の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）による敗血症候群、悪液質、循環虚脱およびショックを含む感染症であるが、これに限定されるものではない；
（Ｃ）サルコイドーシス、慢性炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病などの慢性炎症性疾患であるが、これに限定されない；播種性血管内凝固症候群、アテローム性動脈硬化、川崎病などの血管炎症性疾患であるが、これに限定されるものではなく、および結節性多発動脈炎、ウェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・ショーンライン紫斑病、巨細胞動脈炎および腎臓の顕微鏡的血管炎などの血管炎症候群であるが、これに限定されるものではない；慢性活動性肝炎；シェーングレン症候群；強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および脊椎炎、病原性関節炎および脊椎炎、反応性関節炎および炎症性大腸炎に付随する関節炎などの脊椎関節症；ならびに、ブドウ膜炎などの炎症性疾患；
（Ｄ）多発性硬化症および急性横断性脊髄炎などの脱髄疾患；重症筋無力症；皮質脊髄系の障害などの錐体外路系および小脳疾患；大脳基底核疾患または小脳疾患；ハンチントン舞踏病、老年性舞踏病などの運動過剰障害；中枢神経系（ＣＮＳ）ドーパミン受容体を阻害する薬剤により誘導される障害などの薬物性運動障害；パーキンソン病などの運動不全障害；進行性核上麻痺；小脳の構造的病変などの小脳および脊髄小脳疾患；脊髄小脳変性症（精髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性症、多系統萎縮症（メンチェル（Ｍｅｎｃｈｅｌ）、デジェリンートーマス（Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ）、シャイ・ドレーガーおよびマシャドジョセフ（ＭａｃｈａｄｏＪｏｓｅｐｈ）））；および全身性疾患（レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症、およびミトコンドリア多系統疾患）；神経原性筋萎縮症などの運動単位の障害（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性症）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体疾患；レヴィー小体型老年性認知症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール依存症；原発性胆汁性肝硬変；特発性間質性肺炎および他の繊維性肺疾患；溶血性貧血；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病；ならびにボクサー認知症、またはその一部を含む神経変性疾患であるが、これに限定されるものではない；
（Ｅ）ＴＮＦ分泌腫瘍を含む悪性疾患またはＴＮＦを含む他の悪性腫瘍、例えば、白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ性および／または骨髄胃形成症候群）；リンパ腫（悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫または菌状息肉腫）などのホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）であるが、これに限定されるものではない；
（Ｆ）過剰のＴＮＦを含む、悪液質症候群ならびに他の病変および疾患、例えば、癌の悪液質、寄生虫症および心不全であるが、これに限定されるものではない；ならびに
（Ｇ）アルコール性肝炎および他の形態の慢性肝炎
【００４３】
本発明のポリペプチドは、一般に、血流中への注入またはＴＮＦが介在する疾患の部位に直接注入することで、適当な経路を介して、それを必要とする対象または患者に直接投与してもよい。
【００４４】
例えば、診断目的、アッセイ方法および診断キットについて、本発明のポリペプチドはまた、検出可能なまたは機能的標識で標識してもよい。検出可能な標識は、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび９９Ｔｃなどの放射性標識、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アミノメチルクマリンおよびフィコエリトリンなどの蛍光プローブを含み、タンパク質の標識化の分野において知られている一般的な化学物質を用いて本発明のポリペプチドに結合させてもよい。標識はまた、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。さらに標識は、特定の同族検出部、例えば、標識化アビジンとの結合を介して検出されてもよいビオチンなどの化学部分を含む。機能的標識は、ＴＮＦ発症領域の部位を標的とするために設計される物質を含む。かかる機能的標識は、リシンなどの毒および細菌カルボキシペプチダーゼまたはニトロ還元酵素などの酵素を含み、ＴＮＦ発症領域の部位でプロドラッグを活性剤に変換しうる。
【００４５】
したがって、本発明はまた、（ｉ）試料を本発明に記載のポリペプチドと接触させること、および（ｉｉ）ＴＮＦとポリペプチドの結合を検出することを含む、試料中のＴＮＦを検出するためのアッセイ法を提供する。
【００４６】
この度、本発明は、以下の限定されない実施例および図面において説明するために記載されるであろう。
【００４７】
（図面の記載）
図１は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２）および単量体（ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図２は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を単量体（ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図３は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図４は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２４）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図５は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図６は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
図７は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を用いるＨＵＶＥＣアッセイにおけるＴＮＦ誘導性ＩＬ６およびＩＬ８産生の阻害を示す。
図８は、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）、および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。エンブレルおよびレミケードを、対照として用いた。
図９は、３種類の異なる濃度：マウス当たり１２．３、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注射されたマウスのＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
図１０は、三種類の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入されたマウスのＴＮＦ誘導性ＭＣＰ−１産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
図１１は、三種類の異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン（Ｂｏｒｅａｎ）構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処理したマウスの異なる群の関節炎患者のスコアを示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１：ＴＮＦ結合ポリペプチドの単離および構築
テトラネクチン（配列番号６）Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造は、すでにＷＯ／０２４８１８９に開示され、ＴＮＦ結合ポリペプチドの単離および構築に用いられた。発達したＴＮＦ結合ポリペプチドは、一連の注意して取り扱われたインビトロでの成熟工程を介してその有効性に至った。特異性は高いが、弱いアフィニティーの第一候補分子は、アフィニティーおよび結合動的成熟の連続的な工程を介して得、得られた候補は、成熟の第三および第四工程からの「結果」である。成熟は、本質的にＷＯ／０２４８１８９に記載のファージディスプレイ技術を用いて行われた。
ＴＮＦ結合クローンに基づく同定された単量体ＣＴＬＤを、対応する配列番号ならびにループ１およびループ３／４のアミノ酸配列と一緒に、以下の表３に記載する。
【表３】
同定されたクローンはまた、テトラネクチン三量化構造要素（ＴＴＳＥ；配列番号８０）を用いて三量体形態で生産された。上記の同定されたクローンの対応する三量体バージョンは、以下の表４に記載される。
【表４】
【００４９】
実施例２：ＴＮＦ結合ポリペプチドの生産および精製
本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドは、典型的には、以下の方法を用いて生産および精製された。ＴＮＦ結合ポリペプチドのコード化配列を含有するプラスミドベクターを含むＢＬ２１−ＡＩの単一コロニーから、０．２％Ｌ−アラビノースで誘導し、発現を４時間継続する前に、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを有する２ｘＴＹ中の６Ｌの培養物をＡ６００＝０．８に成長させる。
細胞を収集し、封入体を回収する。６Ｌの培養液からパックした細胞ペレットを、超音波処理により１００ｍＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｗ／ｖ％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、（リーシス−バッファー）で均質化する。次いで、試料を室温で１５分間静置する前に１００ｍＬのリーシス−バッファー当たり１００ｍｇのリゾチームを添加し、合わせる。次いで、試料を合間に合わせながら２−５分間超音波分解する。１００ｍＬの０．２ＭのＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％デオキシコール酸塩、１ｗ／ｖ％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０のＮａ塩、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ（デタージェント−バッファー）を添加し、試料を合わせ、再度、超音波分解する。封入体を４℃、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離により回収する。上清を捨て、ペレットは１００ｍＬの０．５ｗ／ｖ％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ｐＨ８の１ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁した。封入体を４℃、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離により回収する。トリトンＸ−１００バッファー洗浄を再度繰り返す。封入体を、４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離により回収する。
封入体を５０ｍＬの６Ｍのグアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭのＤＴＴ中で再懸濁する。溶液は、セファデックスＧ−２５ファインマトリックス（Ｆｉｎｅ ｍａｔｒｉｘ）カラム上で８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃに変換されるバッファーである。
次いで、タンパク質をＮｉＮＴＡ ＩＭＡＣカラム（キアゲン製ＮｉＮＴＡアガロース）上で捕捉し、カラムは、８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃで洗浄する。次いで、タンパク質を８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−ｍｅｒｃ、２０ｍＭのＥＤＴＡ中で溶出する。
ＮｉＮＴＡ ＩＭＡＣ捕捉カラムからの捕捉溶出液を、１Ｌスケールで希釈による再折りたたみに用いる。３Ｍの尿素、５０ｍＭのグリシン ｐＨ９．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．３ｍＭのシスタミンを含む１Ｌの再折りたたみバッファーを濾過し、７℃の令書にある２Ｌの瓶に入れる。マグネット攪拌棒を加え、攪拌は２５０ｒｐｍで行う。次いで、変性捕捉溶出タンパク質溶液を、蠕動ポンプを用いて１００μＬ／分の一定流量で再折りたたみバッファーに滴下する。再折りたたみが終了する時点の最終タンパク質濃度は２５０μｇ／ｍＬである。
多量体は、８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２、４００ｍＭのＮａＣｌの勾配（室温）でＳＰ−セファロース（アマシャム）上にて除去される。次いで、カラムは、全マトリックス容量の約４００ｍｌのセファデックスＧ−２５ファインマトリックスで充填され、１Ｌの１Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０は１０ｍｌ／分で平衡に用いられる。
ＳＰ−セファロースから溶出液を、約８ｍｌ／分の流速でセファデックスＧ−２５ファインマトリックスに適用する。タンパク質は、約８ｍｌ／分の流速で１Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０を用いて溶出される。溶出液を貯蔵し、タンパク質濃度を測定する。
１：２５０％ｗ／ｗ（ｍｇのＧｒＢ／ｍｇの三量体ＴＮＦ結合ポリペプチド）の割合に相当するグランザイムＢを添加する。添加後、溶液を徐々に合わせ、２５℃で２４時間インキュベートする。温浸後、固体尿素を８Ｍの尿素溶液を産生する溶液に添加し、ｐＨを１Ｍの酢酸ナトリウムでｐＨ４．５に合わせる。
ＴＮＦ結合ポリペプチドを、８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０００ｍＭのＮａＣｌの勾配（室温）でスクロース１５Ｓカラム（アマシャム）上にて研磨し、かつ、濃縮する。最後に、溶出した単量体フラクションは、セファデックスＧ−２５ファインマトリックス上でゲル濾過により２５ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ５．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのスクロース中で製剤化される。かかる工程収率は９５％以上であり、タンパク質は、可視可能なまたはＡ４１０で追跡した場合に測定可能な沈殿をすることなく複数の解凍−凍結サイクルに耐える。
【００５０】
実施例３：ＴＮＦ結合ポリペプチドの生物活性
表４に示されるＴＮＦ結合ポリペプチド、すなわち、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９ならびに単量体ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（それぞれＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７に対応する）の選択は、Ｌ９２９腫瘍細胞株、ネズミ線維芽細胞様細胞を用いて、ＴＮＦの生物活性を阻害する機能を測定することによりアッセイされた。選択したクローンのＴＮＦ中和活性は、商業的に入手可能なＴＮＦアンタゴニストのレミケード（エタナーセプト）、エンブレル（インフリキシマブ）および溶解性ＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号１０８９−Ｒ２−０２５／ＣＦ）と比較した。
ＴＮＦ阻害アッセイを、以下のアッセイプロトコルにしたがって実施した：Ｌ９２９細胞（ＥＣＡＣＣ番号：８５０１１４２５）を、アッセイの準備前日に３ｘ１０５／ｍｌで蒔く。試験体を添加する前に、細胞を接着させ、集密となるようにさせなければならない。平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）；Ｃａｔ番号１６７００８）のウェルに７５μｌの容量の細胞懸濁液を分注する。ＥＩＬＳＡリーダーのブランクとして、１列の８個のウェルを細胞のない状態にしておく。細胞を添加する時点で、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの最終培養濃度を得るために、試験試料を２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含有する培養液で希釈する。２０μｇ／ｍｌで（必要ならば３７℃に加温しながら）ＰＢＳ中のアクチノマイシンＤ（シグマ）を溶解し、５ｍｌの（または適当な）量にて−２０℃で保存する。必要に応じてヒトＴＮＦを解凍し、培養液で４μｇ／ｍｌに希釈する−解凍した濃縮溶液は、４℃で最大２週間安定である。培養液中で試験試料の一連の希釈物を作製する（ＴＮＦ ＱＣの場合、３倍希釈が適している）。次いで、試験試料をヒトＴＮＦを含む種々の溶液１：１で希釈する。各希釈について、７５μｌの容量を３回、Ｌ９２９細胞に添加する。各プレート上で、陰性対照（すなわち、組織培養液のみ）および陽性対照（阻害薬を有しないヒトＴＮＦ）を含む。試験試料の添加後、３７℃、５％のＣＯ２で１６時間マイクロタイタープレートをインキュベートする。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射性細胞増殖アッセイキット（プロメガ）の部分としてＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジ−フェニル−テトラゾリウム）を用いて測定する：ＭＴＳ−およびＰＭＳ溶液を解凍する。１５０μｌの容量で培養した細胞を含有する１個の９６ウェルプレートに十分な量の試薬を調製するために、３．０ｍｌのＭＴＳ溶液を無菌法を用いて琥珀色の試薬瓶から取り出し、試験管に移し替える。細胞を含有する培養プレートに添加する直前に１５０μｌのＰＭＳ溶液を３．０ｍｌのＭＴＳ溶液に添加する。合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液の完全混合を確実にするために試験管を穏やかに回転させる。培養液中１５０μｌの細胞を含有する９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに３０μｌの合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液をピペットで添加する。加湿された５％ＣＯ２雰囲気下において、３７℃で１−４時間プレートをインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を記録する。
上記ＴＮＦ阻害アッセイからの結果を、図１、２、３、４、５および６に示す。三量体クローンＴＮ２Ｂ１Ｃ２２、ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１およびＴＮ２Ｂ１Ｃ２４（対応する単量体ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４）全て、レミケード（インフリキシマブ）および溶解性ＴＮＦ受容体ＩＩ（ＲＩＩ）と比べて同等またはより良いＴＮＦ中和能力を有することが図１、３および４から明確である。特に、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１はエンブレルよりさらに優れていることが図１および３から見ることができる。図１は、ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２（すなわち、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２）の単量体型のＴＮＦ阻害能は、レミケードと同等であることを示す。ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２−７（すなわち、ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）の単量体型は、レミケードより優れていることが図２から分かる。
【００５１】
実施例４：ＨＵＶＥＣアッセイ
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、臍帯から単離された初代非形質転換ヒト細胞である。細胞は数継代の培養液中で保持しうる。臍帯内皮細胞はＴＮＦに感受性がある。ＴＮＦによる細胞の活性化の後に、細胞はＩＬ８およびＩＬ６のような炎症性サイトカインを産生し始める。これらの反応は、細菌感染後の一次防御を表す。ＴＮＲ結合ポリペプチドの有効性を調べるために、本発明者らは、ＩＬ６およびＩＬ８の産生を誘導するＴＮＦの阻害を試験した。
ＨＵＶＥＣ細胞（カンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）Ｌｏｔ．Ｎｒ．２ｆ１８２８）を、アッセイの準備前日にＥＧＭ−２培地に蒔く。試験前に細胞を接着させ、集密になるようにさせなければならない。ウェル当たり２００μｌの５ｘ１０４／ｍＬのＨＵＶＥＣ細胞懸濁液は、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンクロン；Ｃａｔ．番号１６７００８）のウェルにピペットで添加する。試験試料を培養液で希釈する。試験試料を以下のとおり調製する：望ましい濃度でＴＮＦ結合ポリペプチド、エンブレルまたはレミケードを１５分間インキュベートする。次いで、３ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦを有しており、１００μｌの溶液をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、最終濃度１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを得る。希釈の正確な範囲は、試験試料の性質および標的の感受性による。各プレートは、陰性対照（すなわち、組織培養液のみ）および陽性対照を含む。試験試料の添加後、マイクロタイタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６−２４時間インキュベートする。
翌日、上清をウェルから収集し、ＩＬ６およびＩＬ８（１０倍希釈）Ｅｌｉｓａを、ヒトＩＬ−６＆ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡ（９６ウェル）のプロトコルにしたがってＴＮＦ誘導性サイトカインを測定するために実施する。以下の物質：ヒト組換えＩＬ−６：Ｃａｔ．番号２０６−ＩＬ−０１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、モノクローナル抗ヒトＩＬ−６抗体 コード番号ＭＡＢ ２０６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチン化抗ヒトＩＬ−６抗体 Ｃａｔ．番号ＢＡＦ２０６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト組換えＩＬ−８：Ｃａｔ．番号２０８−ＩＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、モノクローナル抗ヒトＩＬ−８抗体 コード番号ＭＡＢ２０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチン化抗ヒトＩＬ−８抗体Ｃａｔ．番号ＢＡＦ２０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡに用いる。
ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を、上記ＨＵＶＥＣアッセイで試験した。かかる実験結果を図６および７に示す。かかる図から分かるように、ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８は、好ましくは、ＩＬ８（図６）およびＩＬ６（図７）の誘導を阻害しうる。ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８（Ｃ２２−８）は、かかる試験においてエンブレルと同程度であり、有意にレミケードより優れている。
【００５２】
実施例５：ペグ化ＴＮＦ結合ポリペプチドＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７
三量体ＴＮＦ結合ポリペプチドＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）を、溶液がセファデックスＧ−２５ファインマトリックスカラム上の下記のペグ化バッファーに交換したバッファーであることを除き、基本的に実施例２の記載のとおりに調製した。
かかる構築物は、配列の最初の９残基のアミノ酸の欠失、およびＮ末端に２個のグリシン残基を付加することによりペグ化を行った。２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を含む８Ｍ尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ中のＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液は、１０モル過剰の２０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシ ポリ（エチレングリコール）−ブチル−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）を添加された。反応物を約２０℃で一晩攪拌した。その後、タンパク質とｍＰＥＧ−ＡＬＤの間の反応進行度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。
ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を非反応性単量体から分離するために、陽イオン交換カラムに付した。８Ｍ尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２で平衡化した１ｍＬのスクロース１５Ｓカラム（アマシャム）に反応混合物を充填し、８Ｍ尿素、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２から８Ｍの尿路、５０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．５、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０００ｍＭのＮａＣｌの線状勾配を、非ペグ化タンパク質からペグ化タンパク質を分画するために用いた。
Ｌ９２９アッセイを、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いて実施例３に記載のとおり実施した。エンブレルおよびレミケードを対照として用いた。
図８から分かるように、インビトロアッセイのペグ化物質の有効性は、非ペグ化物質と有意に異なってはいなかった。
【００５３】
実施例６：マウスにおける炎症性サイトカイン誘導のインビボ阻害
マウスは、３種の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入された。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。対照において正常に見られるように、ヒトＴＮＦは、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１などの炎症性サイトカイン産生を誘導する。しかしながら、図９および１０から分かるように、ＴＮＦ結合ポリペプチドＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１は、かかる炎症性サイトカインの誘導を阻害しうる。
【００５４】
実施例６：関節リウマチ誘発のインビボ防止
Ｔｇ１９７トランスジェニックマウス系は、ヒトＴＮＦを発現する。マウスは５個のヒトＴＮＦコピーを持っており、３ないし４週の年齢で多発性関節炎を発症する。疾患は、足関節の腫れおよび変形を伴って４週で臨床的に検出可能である。これは、重度の関節破壊および８ないし１０週の年齢の後脚の脚運動の機能障害をもたらす。進行性体重減少は共通するものである。ＴＮＦ中和剤の適当な投与は、疾患の発症を予防する。Ｔｇ１９７ネズミ関節炎モデル中の多発性関節炎の予防における本発明のＴＮＦ結合ポリペプチドの有効性を試験するために、ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ３１を年齢および体重が一致するＴｇ１９７マウスの群に投与した。処置は３−４週で予防を開始した。ＴＮＦ結合ポリペプチドを、５週間腹腔内（ｉ．ｐ．）に３種の用量：３．３、１．０および０．５ｍｇ／ｋｇで週に３回投与した。２回目の腹腔内注射前および実験の終了までに血液試料を得た。
関節炎の重症度を、ＡＳ−０からＡＳ−３の範囲の関節炎スコアで評価し、表した（ここで、０は関節炎がなく、３は関節中の軟骨破壊および骨破壊により完全に足が不自由となっている）。
図１１は、異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処置した異なる群のマウスの関節炎スコアを示す。図１１から分かるように、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１の量が高いほど関節炎スコアはさらに低くなる。これは、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１が関節リウマチの治療に有効であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２２）および単量体（ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図２】図２は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７を単量体（ＴＮ３−Ｂ１−Ｃ２２−７）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図３】図３は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ３１）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図４】図４は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４を完全な三量体形態（ＴＮ２Ｂ１Ｃ２４）として用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図５】図５は、エンブレル、レミケードおよびＴＮＦ受容体ＩＩフラグメント（ＲＩＩ）と比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１４、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１２、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−１９を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図６】図６は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮＦアンタゴニストＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−８、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７およびＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。
【図７】図７は、エンブレルおよびレミケードと比較して、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−８を用いるＨＵＶＥＣアッセイにおけるＴＮＦ誘導性ＩＬ６およびＩＬ８産生の阻害を示す。
【図８】図８は、ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（２０ＫＰＥＧ−ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７）、非ペグ化ＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（ＧＧ Ｃ２２−７）、および未変異ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（Ｃ２２−７）（配列番号３２）を用いるＬ９２９細胞アッセイにおけるＴＮＦの阻害を示す。エンブレルおよびレミケードを、対照として用いた。
【図９】図９は、３種類の異なる濃度：マウス当たり１２．３、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注射されたマウスのＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
【図１０】図１０は、三種類の異なる濃度：マウス当たり１２．５、２５および５０μｇでＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１を注入されたマウスのＴＮＦ誘導性ＭＣＰ−１産生の阻害を示す。３０分後マウスは、３μｇのヒトＴＮＦを静脈注射された。
【図１１】図１１は、三種類の異なる量のＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（図中の「ボレアン構築物」をいう）、セイライン溶液（陰性対照）、野生型テトラネクチン（陰性対照）およびレミケード（陽性対照）で処理したマウスの異なる群の関節炎患者のスコアを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、Ｃ型レクチン様ドメインの一部を形成する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｃ型レクチン様ドメインがテトラネクチンに由来する請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
テトラネクチン由来Ｃ型レクチン様ドメインが、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列である請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７９の残基番号１６５のアスパラギン酸がグリシンに変異される請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１およびＸ２が、各々独立して、アミノ酸残基であるアミノ酸配列ＰＸ１ＰＸ２Ｎ（配列番号２）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３が、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４がＭ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＣからなる群より選択される疎水性アミノ酸である、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ１が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３が、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４がＷ、ＦおよびＹからなる群より選択される芳香族アミノ酸である、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号２９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号３０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号３１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号３２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号３３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号３４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号３５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号３６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−５（配列番号３７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号３８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号３９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号４０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号４１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号４２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号４３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号４４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号４５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号４６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号４７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号４８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号４９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号５０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号５１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号５２）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号５３）からなる群より選択される請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｃ型レクチン様ドメインが、テトラネクチン由来三量体化ドメインと結合している請求項３記載のポリペプチド。
【請求項１２】
テトラネクチン由来三量体化ドメインが、配列番号８０の配列と少なくとも６８％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を含む請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列の同一性が、少なくとも７５％、例えば、少なくとも９２％を含む少なくとも８７％である請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
テトラネクチン由来三量体化ドメインがアミノ酸配列番号８１を含む請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号５４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号５５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号５６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号５７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号５８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号５９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号６０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号６１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号６２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号６３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号６４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号６５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号６６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号６７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号６８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号６９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号７０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号７１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号７２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号７３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号７４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号７５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号７６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号７７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号７８）およびＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）からなる群より選択される請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１−１５のいずれか一に記載のポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１−１５のいずれか記載のＴＮＦとの結合能を有するポリペプチドの調製法であって、（ｉ）前記ポリペプチドを発現するかかる条件下で請求項１６記載の単離された核酸を発現し、および（ｉｉ）ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
【請求項２０】
請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２１】
ＴＮＦが介在する病変を有する対象を治療する方法であって、有効量の請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドまたは請求項２０記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
ＴＮＦが介在する病変が、関節リウマチ、乾癬およびクローン病からなる群より選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試料中のＴＮＦを検出するアッセイ方法であって、（ｉ）請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドと前記試料を接触させること、および（ｉｉ）前記ポリペプチドに対するＴＮＦの結合を検出することを含む方法。
【請求項２４】
医薬として使用するための請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ＴＮＦが介在する疾患を治療するための請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２６】
医薬品の調製における請求項１−１５記載のポリペプチドの使用。
【請求項１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）との結合能を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列ＫＲＷＳＲＹＦ（配列番号１）を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、Ｃ型レクチン様ドメインの一部を形成する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｃ型レクチン様ドメインがテトラネクチンに由来する請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
テトラネクチン由来Ｃ型レクチン様ドメインが、実質的に配列番号７９の残基５０−１８１として示されるようなアミノ酸配列である請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７９の残基番号１６５のアスパラギン酸がグリシンに変異される請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１およびＸ２が、各々独立して、アミノ酸残基であるアミノ酸配列ＰＸ１ＰＸ２Ｎ（配列番号２）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３が、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４がＭ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＣからなる群より選択される疎水性アミノ酸である、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ１が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨから選択される親水性アミノ酸であり；Ｘ２およびＸ３が、各々独立して、アミノ酸残基であり、Ｘ４がＷ、ＦおよびＹからなる群より選択される芳香族アミノ酸である、アミノ酸配列Ｘ１ＰＸ２ＰＸ３ＮＸ４（配列番号３）をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号２９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号３０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号３１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号３２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号３３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号３４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号３５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号３６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−５（配列番号３７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号３８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号３９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号４０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号４１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号４２）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号４３）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号４４）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号４５）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号４６）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号４７）、ＴＮ３−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号４８）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号４９）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号５０）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号５１）、ＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号５２）およびＴＮ３−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号５３）からなる群より選択される請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｃ型レクチン様ドメインが、テトラネクチン由来三量体化ドメインと結合している請求項３記載のポリペプチド。
【請求項１２】
テトラネクチン由来三量体化ドメインが、配列番号８０の配列と少なくとも６８％のアミノ酸配列の同一性を有する配列を含む請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列の同一性が、少なくとも７５％、例えば、少なくとも９２％を含む少なくとも８７％である請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
テトラネクチン由来三量体化ドメインがアミノ酸配列番号８１を含む請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２（配列番号５４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ３１（配列番号５５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２４（配列番号５６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号５７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１（配列番号５８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−２（配列番号５９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−３（配列番号６０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−４（配列番号６１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−６（配列番号６２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−７（配列番号６３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−８（配列番号６４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−９（配列番号６５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１０（配列番号６６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１１（配列番号６７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１２（配列番号６８）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１３（配列番号６９）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１４（配列番号７０）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１５（配列番号７１）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ２２−１６（配列番号７２）、ＴＮ２−２−Ｂ１−ｃ７（配列番号７３）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１９（配列番号７４）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ１（配列番号７５）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２０（配列番号７６）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ５３（配列番号７７）、ＴＮ２−２−Ｂ１−Ｃ２９（配列番号７８）およびＧＧ−Ｉ１０−ＴＮ−２−Ｂ１−Ｃ２２−７（配列番号７９）からなる群より選択される請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１−１５のいずれか一に記載のポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１−１５のいずれか記載のＴＮＦとの結合能を有するポリペプチドの調製法であって、（ｉ）前記ポリペプチドを発現するかかる条件下で請求項１６記載の単離された核酸を発現し、および（ｉｉ）ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
【請求項２０】
請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２１】
ＴＮＦが介在する病変を有する対象を治療する方法であって、有効量の請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドまたは請求項２０記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
ＴＮＦが介在する病変が、関節リウマチ、乾癬およびクローン病からなる群より選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試料中のＴＮＦを検出するアッセイ方法であって、（ｉ）請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチドと前記試料を接触させること、および（ｉｉ）前記ポリペプチドに対するＴＮＦの結合を検出することを含む方法。
【請求項２４】
医薬として使用するための請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ＴＮＦが介在する疾患を治療するための請求項１−１５のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項２６】
医薬品の調製における請求項１−１５記載のポリペプチドの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５２０２１４（Ｐ２００８−５２０２１４Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４１６９１（Ｐ２００７−５４１６９１）
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００７４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３５６８
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（３０７０１８３３５）
【氏名又は名称原語表記】Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ ＡｐＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００７４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３５６８
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（３０７０１８３３５）
【氏名又は名称原語表記】Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ ＡｐＳ
【Ｆターム（参考）】
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