ＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型検出法
【課題】本発明は、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することを課題とする。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することを課題とする。
【解決手段】上記課題を解決するために、本件発明はTaqMan PCR法に用いるプライマーの設計方法、並びに、TaqManPCR法に用いるプライマー及びプローブの配列を提供する。
【解決手段】上記課題を解決するために、本件発明はTaqMan PCR法に用いるプライマーの設計方法、並びに、TaqManPCR法に用いるプライマー及びプローブの配列を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明はUGT1A1遺伝子の多型とイリノテカンの副作用との相関に関する薬理遺伝学又は薬理ゲノミクスの技術分野に属する。また、一塩基多型又は遺伝的多型の検出法の技術分野に属し、より詳しくは、TaqManPCR法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬の有効性や副作用の個人差の要因として、薬物代謝・動態に関する遺伝子多型の関与が注目され、遺伝子診断に基づき適切な薬剤の選択及び投与量を行うテーラーメイド医療（患者個別化治療）の実現を目指すゲノム薬理学研究は、この数年で急速に進展した。ハプロタイプ（染色体上の個別の遺伝子多型の組み合わせ）を含めて、遺伝子多型診断の有用性が明らかにされた例も多く、テーラーメイド医療は現実のものとなりつつある（非特許文献20）。
【０００３】
カンプトテシン誘導体のイリノテカンは、肺がん、消化器系がんなどに広く適用されてきたが、ときとして重篤な下痢や白血球減少などを引き起こすことが問題とされてきた（非特許文献20）。またIyerらは、イリノテカンの活性代謝物であるSN-38のグルクロン酸抱合がUGT1A1酵素によって触媒されること、SN-38のグルクロン酸抱合を薬学的に操作することによってイリノテカンの治療係数を改善できるかもしれないこと、及び、これらの発見がギルバート症候群（Gilbert’s syndrome）のようなUGT1A1の活性が低下した集団にとって特に重要であることを示した（非特許文献9）。通常個体ではA(TA)6TAAであるUGT1A1プロモーターの領域が、ギルバート症候群ではA(TA)7TAAとなっている（非特許文献9）。
【０００４】
Ando（非特許文献2）らによって、UGT1A1遺伝子多型の1つである *28(-40_-39insTA)とイリノテカン投与患者における重篤な副作用との関連が初めて報告されて以来、欧米においても多くの研究により*28の重要性が示唆されてきた（非特許文献2、非特許文献10、非特許文献8、非特許文献14、非特許文献17）。UGT1A1の発現低下をもたらす重要な多型として、プロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回から7回（最後のTAAのTAは数に入れないことに注意されたい。）に増えているUGT1A1*28(-40_-39insTA) （非特許文献20、非特許文献3）、及びエンハンサー領域に存在するUGT1A1*60 (-3279 T>G)がある（非特許文献21）。また、アミノ酸置換を伴うUGT1A1*6[211 G>A (Gly71Arg)]、UGT1A1*7 [1456 T>G (Tyr486Asp)] 及びUGT1A1*27 [686C>A (Pro229Gln)] は、SN-38グルクロン酸抱合活性が低下する（非特許文献5、非特許文献11）。
【０００５】
図1にUGT1A1遺伝子の構造の模式図を示す（UGT1A1遺伝子の詳細な構造については非特許文献20 のFig. 2を参照）。*28はUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在し、*6はエクソン1に存在する。
【０００６】
Saiらは、*6 [211 G>A (Gly71Arg)]と*28 (-40_-39insTA)は互いに独立である（別の染色体上にある）ことを明らかにし（非特許文献18）、日本人においては*28だけでなく*6も考慮すべきであることを示唆した（非特許文献20）。また、Saiらは、*28及び*6を有する患者において、ハプロタイプ数に依存したAUC比（非特許文献10参照）の低下が認められ、さらに*6及び*28を同時に有する場合にも有意な低下が見られること（非特許文献18）、*6と*28は同程度のUGT活性低下をもたらし、しかも独立（別のハプロタイプ）であることから、日本人においては“*6 or *28” が有用な遺伝子多型マーカーであること（非特許文献20）を示した。*6単独の効果についても、グレード3以上の好中球減少発現頻度の増大との有意な関連が示され（非特許文献19）、UGT1A1*6は東アジア人に特徴的な多型であるため、日本人のみならず、韓国人や中国人においても、*28とともに*6を考慮する必要があることが教示されている（非特許文献20、非特許文献15）。
【０００７】
一塩基置換（SNP）又は遺伝子多型の検出方法としては、Invader法、DNAシークエンス法、SSCP法など多数の方法が開発されており（非特許文献12参照）、より簡便、低コスト、正確、ハイスループットな方法が日夜研究されている。
【０００８】
TaqMan PCR法（5’nuclease assayとも呼ばれる）は、1991年にHollandらが初めてその原理を示した方法である（非特許文献7）。彼らはPCRで増幅する領域に、5’末端を32Pで標識し且つ3’末端を保護した相補的なDNAプローブをデザインした。このDNAプローブ存在下でPCRを行うと、Taqポリメラーゼの持つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの進行と共にプローブは分解される。この分解されたプローブから得られる標識シグナルはアンプリコンの量に比例することが確認された（非特許文献7、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社のウェブサイト）。更にこの方法はFRETを応用した蛍光標識プローブを使用し、蛍光強度の変化を蛍光検出器により測定することで、プローブの分解をモニターできることが示された（非特許文献13）。
【０００９】
その後、TaqMan PCR法は、リアルタイム定量PCRに応用され（非特許文献6）、複数箇所の（multiplex）遺伝子多型を同時に（simultaneous）検出する、ハイスループットな検出法が開発されているが（非特許文献1、非特許文献4、非特許文献16、非特許文献22、非特許文献23、非特許文献24）、それらは簡便性及び正確性の点で満足できるものではなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、より簡便、低コスト、正確、ハイスループットな方法を開発するため鋭意研究を重ねた結果、本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Acommon 1317TC polymorphism in MTHFR can lead to erroneous 1298AC genotyping byPCR-RE and TaqMan probe assays. Allen RA, Gatalica Z, Knezetic J, HatcherL, Vogel JS, Dunn ST. Genet Test. 2007 Summer;11(2):167-73.
【非特許文献２】Polymorphismsof UDP-glucuronosyltransferase gene and irinotecan toxicity: a pharmacogeneticanalysis. Ando Y, Saka H, Ando M, Sawa T, Muro K, Ueoka H, Yokoyama A,Saitoh S, Shimokata K, Hasegawa Y. Cancer Res. 2000 Dec 15;60(24):6921-6.
【非特許文献３】Racialvariability in the UDP-glucuronosyltransferase 1 (UGT1A1) promoter: a balancedpolymorphism for regulation of bilirubin metabolism? Beutler E, GelbartT, Demina A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 7;95(14):8170-4.
【非特許文献４】Real-timePCR genotyping of human platelet alloantigens HPA-1, HPA-2, HPA-3 and HPA-5 issuperior to the standard PCR-SSP method. Ficko T, Galvani V, Rupreht R,Dovc T, Rozman P. Transfus Med. 2004 Dec;14(6):425-32.
【非特許文献５】Commonhuman UGT1A polymorphisms and the altered metabolism of irinotecan activemetabolite 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38). Gagne JF, Montminy V, Belanger P,Journault K, Gaucher G, Guillemette C. Mol Pharmacol. 2002 Sep;62(3):608-17.
【非特許文献６】Realtime quantitative PCR. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94.
【非特許文献７】Detectionof specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Holland PM, Abramson RD, Watson R, GelfandDH. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Aug 15;88(16):7276-80.
【非特許文献８】Geneticvariants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severeneutropenia of irinotecan. Innocenti F, Undevia SD, Iyer L, Chen PX, DasS, Kocherginsky M, Karrison T, Janisch L, Ramirez J, Rudin CM, Vokes EE, RatainMJ. J Clin Oncol. 2004 Apr 15;22(8):1382-8. Epub 2004 Mar 8.
【非特許文献９】Geneticpredisposition to the metabolism of irinotecan (CPT-11). Role of uridinediphosphate glucuronosyltransferase isoform 1A1 in the glucuronidation of itsactive metabolite (SN-38) in human liver microsomes. Iyer L, King CD,Whitington PF, Green MD, Roy SK, Tephly TR, Coffman BL, Ratain MJ. J ClinInvest. 1998 Feb 15;101(4):847-54.
【非特許文献１０】UGT1A1*28polymorphism as a determinant of irinotecan disposition and toxicity. Iyer L, Das S, Janisch L, Wen M, Ramirez J, Karrison T, Fleming GF, Vokes EE,Schilsky RL, Ratain MJ. Pharmacogenomics J. 2002;2(1):43-7.
【非特許文献１１】Glucuronidationof 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38), an active metabolite of irinotecan(CPT-11), by human UGT1A1 variants, G71R, P229Q, and Y486D. Jinno H,Tanaka-Kagawa T, Hanioka N, Saeki M, Ishida S, Nishimura T, Ando M, Saito Y,Ozawa S, Sawada J. Drug Metab Dispos. 2003 Jan;31(1):108-13.
【非特許文献１２】Detectionof single nucleotide polymorphisms. Kwok PY, Chen X. Curr IssuesMol Biol. 2003 Apr;5(2):43-60. Review.
【非特許文献１３】Allelicdiscrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Lee LG,Connell CR, Bloch W. Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11;21(16):3761-6.
【非特許文献１４】UGT1A1gene variations and irinotecan treatment in patients with metastatic colorectalcancer. Marcuello E, Altes A, Menoyo A, Del Rio E, Gomez-Pardo M, BaigetM. Br J Cancer. 2004 Aug 16;91(4):678-82.
【非特許文献１５】Irinotecanpharmacokinetics/pharmacodynamics and UGT1A genetic polymorphisms in Japanese:roles of UGT1A1*6 and *28. Minami H, Sai K, Saeki M, Saito Y, Ozawa S,Suzuki K, Kaniwa N, Sawada J, Hamaguchi T, Yamamoto N, Shirao K, Yamada Y,Ohmatsu H, Kubota K, Yoshida T, Ohtsu A, Saijo N. Pharmacogenet Genomics.2007 Jul;17(7):497-504.
【非特許文献１６】Four-colormultiplex reverse transcription polymerase chain reaction--overcoming itslimitations. Persson K, Hamby K, Ugozzoli LA. Anal Biochem.2005 Sep 1;344(1):33-42.
【非特許文献１７】Relevanceof different UGT1A1 polymorphisms in irinotecan-induced toxicity: a molecularand clinical study of 75 patients. Rouits E, Boisdron-Celle M, Dumont A, Guerin O, Morel A,Gamelin E. Clin Cancer Res. 2004 Aug 1;10(15):5151-9.
【非特許文献１８】UGT1A1haplotypes associated with reduced glucuronidation and increased serumbilirubin in irinotecan-administered Japanese patients with cancer. SaiK, Saeki M, Saito Y, Ozawa S, Katori N, Jinno H, Hasegawa R, Kaniwa N, SawadaJ, Komamura K, Ueno K, Kamakura S, Kitakaze M, Kitamura Y, Kamatani N, MinamiH, Ohtsu A, Shirao K, Yoshida T, Saijo N. Clin Pharmacol Ther. 2004Jun;75(6):501-15.
【非特許文献１９】Importanceof UDP-glucuronosyltransferase 1A1*6 for irinotecan toxicities in Japanesecancer patients. Sai K, Saito Y, Sakamoto H, Shirao K, Kurose K, Saeki M,Ozawa S, Kaniwa N, Hirohashi S, Saijo N, Sawada J, Yoshida T. CancerLett. 2008 Mar 18;261(2):165-71. Epub 2007 Dec 20.
【非特許文献２０】Irinotecanpharmacogenetics in Japanese cancer patients: roles of UGT1A1*6 and *28. Sai K, Sawada J, Minami H. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84.Review. Japanese.
【非特許文献２１】Identificationof a defect in the UGT1A1 gene promoter and its association withhyperbilirubinemia. Sugatani J, Yamakawa K, Yoshinari K, Machida T,Takagi H, Mori M, Kakizaki S, Sueyoshi T, Negishi M, Miwa M. BiochemBiophys Res Commun. 2002 Mar 29;292(2):492-7.
【非特許文献２２】Four-colormultiplex 5' nuclease assay for the simultaneous detection of the factor VLeiden and the prothrombin G20210A mutations. Ugozzoli LA, Hamby K. Mol Cell Probes. 2004 Jun;18(3):161-6.
【非特許文献２３】Animproved real time PCR method for simultaneous detection of C282Y and H63Dmutations in the HFE gene associated with hereditary hemochromatosis. Walburger DK, Afonina IA, Wydro R. MutatRes. 2001 Jan;432(3-4):69-78.
【非特許文献２４】Simultaneousgenotyping of coagulation factor XI type II and type III mutations by multiplexreal-time polymerase chain reaction to determine their prevalence in healthyand factor XI-deficient Italians. Zadra G, Asselta R, Tenchini ML,Castaman G, Seligsohn U, Mannucci PM, Duga S. Haematologica. 2008May;93(5):715-21. Epub 2008 Apr 2.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することを課題とする。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本件発明はTaqMan PCR法に用いるプライマーの設計方法、並びに、TaqMan PCR法に用いるプライマー及びプローブの配列を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を使用すれば、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することができる。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1はUGT1A1遺伝子の構造の模式図である。
【図２−１】図2-1AはテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F2及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果であり、図2-1Bは理想的なTaqManPCR法による多型の検出結果を示す模式図である。
【図２−２】図2-2はテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F7及び6R7）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【図３】図3はテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、2種のプライマー（28F4及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【図４】図4はテンプレートDNAとしてヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用い、かつ、2種のプライマー（28F4及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[定義]
同時に：本明細書において「同時に」検出する、「同時に」使用する、などという場合は、時間的に「同じ時刻」という意味ではなく、例えば、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液からの複数波長の蛍光を検出する、あるいは、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液に複数のプライマーを使用する、などの意味で用いる。
ホモ：遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の両方に特定の多型が存在することを意味する。
ヘテロ：遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の一方のみに特定の多型が存在することを意味する。
野生型：多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型を野生型と呼ぶ。
変異型：多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型以外の多型を変異型と呼ぶ。
多型：名詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列における集団内の個体差（バリエーション）又はその配列を意味する。形容詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列の特定箇所に集団内の個体差（バリエーション）が存在することを意味する。
多型を検出する：本明細書で「多型を検出する」という場合には、「特定の個体由来のサンプル中に注目する多型の変異型が存在することを検出すること」を意味する場合の他に、「当該注目する多型の遺伝型を決定すること」を意味する場合もある。
遺伝型：ある個体が特定の「遺伝型」を有するとは、注目される多型部位（単数又は複数）についてその個体が特定の多型の組み合わせ（複数の多型部位又は2つの相同染色体）を有することを意味する。
【００１７】
UGT1A1*28多型：UGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回から7回に増えている多型を意味する。多型の位置に関しては、Saiet al. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84. Reviewを参照。
UGT1A1*6多型：UGT1A1遺伝子のアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）を意味する。多型の位置に関しては、Saiet al. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84. Reviewを参照。
UGT1A1*28多型部位：UGT1A1*28多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*28部位と言うこともある。
UGT1A1*6多型部位：UGT1A1*6多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*6部位と言うこともある。
UGT1A1*28多型領域：UGT1A1*28部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*6多型領域：UGT1A1*6部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*28 野生型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回であることを意味する。
UGT1A1*6 野生型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）が存在しない（当該塩基がGである。）ことを意味する。
UGT1A1*28 変異型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回ではなく7回であることを意味する。
UGT1A1*6 変異型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）が存在する（当該塩基がAである。）ことを意味する。
UGT1A1*28：UGT1A1*28多型又はUGT1A1*28多型部位を意味する。
UGT1A1*6：UGT1A1*6多型又はUGT1A1*6多型部位を意味する。
【００１８】
アンプリコン：PCR法において連続したDNAとして増幅される単位を意味する。
TaqMan PCR法の原理：本件発明において「TaqMan PCR法の原理」という場合には、PCRで増幅する領域に、5’末端側を標識した相補的なDNAプローブをデザインし、このDNAプローブ存在下でPCRを行い、Taqポリメラーゼの持つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの進行と共にプローブが分解され、この分解されたプローブから得られる標識シグナルがアンプリコンの量に比例することを基礎としてテンプレートDNAの定量をする原理をいう。
【００１９】
[実験材料及び方法]
<ヒトゲノムDNA>
ヒトゲノムDNAの抽出はQIAamp DNA Mini kit（Cat. No.51304, QIAGEN）により行った。ヒトゲノムDNA抽出用の血液は積水メディカル株式会社社内ボランティアから取得した。血液採取に当たっては社内倫理規定を遵守した。提供されたプロトコルに従い、200μlの血液から約3μgのゲノムDNAを得た。
【００２０】
<プライマー>
PCR反応に使用したプライマーの作製には、SIGMA社のカスタムオリゴDNA合成サービスを利用した。精製グレードはカートリッジ精製（逆相カートリッジ（RP1））を選択した。
【００２１】
<プライマーデザイン>
プライマー設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターにはprimerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値：58〜60℃、塩基数：20mer、GC含量：30〜80%を目安に設計した。条件を満たす11個のプライマーを合成して実際の増幅効率及び特異性を試験し、それらの中から優れたものを選んだ。
【００２２】
表1にUGT1A1*28多型領域を増幅する1対のプライマーペア（UGT-28 TprimerF4及びUGT-28 TprimerR4）の配列を示す。また、表1にUGT1A1*6多型領域を増幅する2対のプライマーペア（UGT-6TprimerF2とUGT-6 TprimerR2のペア、並びに、UGT-6 TprimerF7とUGT-6 TprimerR7のペア）の配列を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
<TaqManプローブ>
TaqManプローブの作成には、オペロン バイオテクノロジー 株式会社の受託合成サービスを利用し、全て蛍光色素と消光剤で二重標識されたものを購入した。精製グレードはHPLC精製を選択した。
【００２５】
<TaqManプローブのデザイン>
プローブ設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターには、primerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値：65〜68℃、塩基数：30〜40mer、GC含量：30〜80%を目安に設計した。
【００２６】
表2にUGT1A1*28多型部位が野生型であるか（UGT1A1*28 野生型検出プローブ）、又は、*28変異型であるかを判定するためのプローブ（UGT1A1*28変異型検出プローブ）を示す。また、表2にUGT1A1*6多型部位が野生型であるか（UGT1A1*6 野生型検出プローブ）、又は、*6変異型であるかを判定するためのプローブ（UGT1A1*6変異型検出プローブ）を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
<Real-TimePCR反応>
リアルタイムPCR反応（TaqMan PCR）は表3に示した条件で行った。テンプレートDNAには、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)、あるいはゲノムDNAを使用した。プラスミドコントロールは、105〜107コピー数になるよう調整し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ゲノムDNAは10〜20ngになるように量を調製し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ExTaqとしてはPremix Ex Taq（TaKaRa）を使用し、PCR反応チューブにはMultiplate PCR Plates Low96-wellclear（BIO RAD）を用いた。サーマルサイクラーにはPTC-200（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いた。PCR反応は表4に示すとおり、98℃で15秒、65℃で1分の2ステップ反応で行った。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
<蛍光検出>
リアルタイムPCRの蛍光検出にはChromo4 Real-Time PCR Detector（BIO RAD）を用いた。実際には、上記リアルタイムPCR反応と同時に蛍光検出を行った。提供されたマニュアルに従い、OpticonMonitorVersion3.1プログラムを用いてデータを解析した。蛍光励起及び蛍光検出の条件は以下の通りである；波長(蛍光励起範囲：1チャンネル450〜490nm 2チャンネル500〜535nm 3チャンネル555〜585nm 4チャンネル620〜650nm、 蛍光検出範囲：1チャンネル515〜530nm 2チャンネル560〜580nm 3チャンネル610〜650nm 4チャンネル675〜730nm)。
【００３２】
実験の最後に蛍光量を測定した値、即ち、最大蛍光値をEndpointとして表した。ウェルで測定された最も低い蛍光値をベースラインとして定義し、それぞれの色素の相対蛍光値を縦軸及び横軸にプロットして表した。
【００３３】
[結果及び考察]
[参考例1]
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-1]
テンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F2及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を用いて、TaqMan PCR法によりUGT1A1*28多型及びUGT1A1*6多型を同時に検出した結果を図2-1Aに示す。28F4-28R4プライマーペアはUGT1A1*28多型領域の149bpのアンプリコンを増幅し、6F2-6R2プライマーペアはUGT1A1*6多型領域の133bpのアンプリコンを増幅する。
【００３４】
テンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F7及び6R7）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を用いて、TaqMan PCR法によりUGT1A1*28多型及びUGT1A1*6多型を同時に検出した結果を図2-2に示す。
【００３５】
図2-1Bに理想的なTaqMan PCR法による多型の検出結果を模式図として示す。例えば、UGT1A1*28変異型又はUGT1A1*28野生型を検出する各プローブは、それぞれ、HEX又はFAMで蛍光標識されているので、両方の相同遺伝子が変異型（Homo）の場合にはHEXのみの蛍光が強く観察され、両方の相同遺伝子が野生型（WT）の場合にはFAMのみの蛍光が強く観察され、また、一方の相同遺伝子が変異型で且つ他方の相同遺伝子が野生型の場合（Hetero）の場合にはHEX及びFAMの両方の蛍光が観察されるはずである。もちろん、サンプル中にDNAが無い場合には、蛍光（バックグラウンド）は検出されないのが理想である。UGT1A1*6多型部位についても同様のことが言える。
【００３６】
図2-1Aの結果については、UGT1A1*28多型検出におけるHEX蛍光シグナルのバックグラウンドの高さ（DNAなし）、若しくは、ヘテロの場合の理想パターンからの乖離は満足の行く結果ではなかった。また、図2-2の結果については、UGT1A1*6多型検出におけるCy5（0.125弱）及びTXR（0.06強）の蛍光強度の弱さは満足の行く結果ではなかった。
【実施例１】
【００３７】
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-2]
上記参考例1の結果が満足の行くものではなかったため、本発明者らはUGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することが出来る方法の開発を目指して、鋭意検討を重ねた。
【００３８】
多数のプライマーペアを試験したうち（データを示さず）の最良の結果が参考例1であった。従って、本発明者らは、プライマーデザインを最適化するだけでは上記課題を解決できないと考え、UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一対のプライマーペアで増幅する方法を試した。28F4-6R2プライマーペアの場合は424bpのアンプリコンを増幅する。
【００３９】
通常、PCR反応の効率はアンプリコンが約100bpから200bp程度で最大であり、アンプリコンが大きくなると増幅効率、特異性などが低下することが予想される。しかし、驚くべきことに、28F4-6R2プライマーペアの場合は、蛍光強度のレベル、バックグラウンドの低さ、のいずれにおいても参考例の結果を凌駕し、より正確な多型の検出結果が得られた（図3）。この現象の基礎となる分子的なメカニズムは現時点では明らかではないが、例えば、28F4、28R4、6F2及び6R2の4プライマーを使用した場合には、意図された2種のアンプリコン（28F4-28R4及び6F2-6R2）の他に、28F4-6R2プライマーペアによるアンプリコンが生成しうるため、これらが互いに阻害的な効果を発揮している可能性は考えられる。
【実施例２】
【００４０】
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-3]
テンプレートDNAとしてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が既知のヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用い、かつ、28F4-6R2プライマーペア、並びに、既出の4種の検出プローブを同時に用いて多型検出を行った結果を図4に示す。また、各検体についてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が野生型又は変異型の何れであったかを纏めたのが表5である。
【００４１】
【表５】
【００４２】
これらの結果は、独立な手段により既に知られた多型と完全に一致した。このことから、ヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用いれば、再現性良く、UGT1A1*28及び*6の多型を簡便に、低コストで、正確に、同時に検出できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のUGT1A1*28多型及び*6多型の検出法を利用すれば、簡便、低コスト、正確かつハイスループットにUGT1A1*28多型及び*6多型を検出するための試薬又はキットを提供することができる。また、本発明のUGT1A1*28多型及び*6多型の検出法を利用すれば、簡便、低コスト、正確かつハイスループットで、イリノテカンの副作用を予測し当該薬剤の投与量を調節するために必要な情報を医師に提供することができる。
【符号の説明】
【００４４】
UGT1A1 UGT1A1遺伝子
Promoter プロモーター領域
Exon エクソン領域
【００４５】
28F4 UGT-28TprimerF4
28R4 UGT-28TprimerR4
6F2 UGT-6TprimerF2
6R2 UGT-6TprimerR2
6F7 UGT-6TprimerF7
6R7 UGT-6TprimerR7
Endpoint,HEX HEXの最大蛍光値
Endpoint,FAM FAMの最大蛍光値
Endpoint,Cy5 Cy5の最大蛍光値
Endpoint,TXR TXRの最大蛍光値
Homo ホモ
Hetero ヘテロ
WT 野生型
【００４６】
+/+ 注目される多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
+/- 注目される多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
-/- 注目される多型部位において、2つの相同染色体ともに野生型であること
*28/*28 UGT1A1*28多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/*6 UGT1A1*28多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であり、更に、UGT1A1*6多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であること；なお、UGT1A1*28多型とUGT1A1*6多型は別の染色体にある（別のハプロタイプである）ことに注意されたい。
*6/*6 UGT1A1*6多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/- UGT1A1*28多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
*6/- UGT1A1*6多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
【技術分野】
【０００１】
本件発明はUGT1A1遺伝子の多型とイリノテカンの副作用との相関に関する薬理遺伝学又は薬理ゲノミクスの技術分野に属する。また、一塩基多型又は遺伝的多型の検出法の技術分野に属し、より詳しくは、TaqManPCR法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬の有効性や副作用の個人差の要因として、薬物代謝・動態に関する遺伝子多型の関与が注目され、遺伝子診断に基づき適切な薬剤の選択及び投与量を行うテーラーメイド医療（患者個別化治療）の実現を目指すゲノム薬理学研究は、この数年で急速に進展した。ハプロタイプ（染色体上の個別の遺伝子多型の組み合わせ）を含めて、遺伝子多型診断の有用性が明らかにされた例も多く、テーラーメイド医療は現実のものとなりつつある（非特許文献20）。
【０００３】
カンプトテシン誘導体のイリノテカンは、肺がん、消化器系がんなどに広く適用されてきたが、ときとして重篤な下痢や白血球減少などを引き起こすことが問題とされてきた（非特許文献20）。またIyerらは、イリノテカンの活性代謝物であるSN-38のグルクロン酸抱合がUGT1A1酵素によって触媒されること、SN-38のグルクロン酸抱合を薬学的に操作することによってイリノテカンの治療係数を改善できるかもしれないこと、及び、これらの発見がギルバート症候群（Gilbert’s syndrome）のようなUGT1A1の活性が低下した集団にとって特に重要であることを示した（非特許文献9）。通常個体ではA(TA)6TAAであるUGT1A1プロモーターの領域が、ギルバート症候群ではA(TA)7TAAとなっている（非特許文献9）。
【０００４】
Ando（非特許文献2）らによって、UGT1A1遺伝子多型の1つである *28(-40_-39insTA)とイリノテカン投与患者における重篤な副作用との関連が初めて報告されて以来、欧米においても多くの研究により*28の重要性が示唆されてきた（非特許文献2、非特許文献10、非特許文献8、非特許文献14、非特許文献17）。UGT1A1の発現低下をもたらす重要な多型として、プロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回から7回（最後のTAAのTAは数に入れないことに注意されたい。）に増えているUGT1A1*28(-40_-39insTA) （非特許文献20、非特許文献3）、及びエンハンサー領域に存在するUGT1A1*60 (-3279 T>G)がある（非特許文献21）。また、アミノ酸置換を伴うUGT1A1*6[211 G>A (Gly71Arg)]、UGT1A1*7 [1456 T>G (Tyr486Asp)] 及びUGT1A1*27 [686C>A (Pro229Gln)] は、SN-38グルクロン酸抱合活性が低下する（非特許文献5、非特許文献11）。
【０００５】
図1にUGT1A1遺伝子の構造の模式図を示す（UGT1A1遺伝子の詳細な構造については非特許文献20 のFig. 2を参照）。*28はUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在し、*6はエクソン1に存在する。
【０００６】
Saiらは、*6 [211 G>A (Gly71Arg)]と*28 (-40_-39insTA)は互いに独立である（別の染色体上にある）ことを明らかにし（非特許文献18）、日本人においては*28だけでなく*6も考慮すべきであることを示唆した（非特許文献20）。また、Saiらは、*28及び*6を有する患者において、ハプロタイプ数に依存したAUC比（非特許文献10参照）の低下が認められ、さらに*6及び*28を同時に有する場合にも有意な低下が見られること（非特許文献18）、*6と*28は同程度のUGT活性低下をもたらし、しかも独立（別のハプロタイプ）であることから、日本人においては“*6 or *28” が有用な遺伝子多型マーカーであること（非特許文献20）を示した。*6単独の効果についても、グレード3以上の好中球減少発現頻度の増大との有意な関連が示され（非特許文献19）、UGT1A1*6は東アジア人に特徴的な多型であるため、日本人のみならず、韓国人や中国人においても、*28とともに*6を考慮する必要があることが教示されている（非特許文献20、非特許文献15）。
【０００７】
一塩基置換（SNP）又は遺伝子多型の検出方法としては、Invader法、DNAシークエンス法、SSCP法など多数の方法が開発されており（非特許文献12参照）、より簡便、低コスト、正確、ハイスループットな方法が日夜研究されている。
【０００８】
TaqMan PCR法（5’nuclease assayとも呼ばれる）は、1991年にHollandらが初めてその原理を示した方法である（非特許文献7）。彼らはPCRで増幅する領域に、5’末端を32Pで標識し且つ3’末端を保護した相補的なDNAプローブをデザインした。このDNAプローブ存在下でPCRを行うと、Taqポリメラーゼの持つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの進行と共にプローブは分解される。この分解されたプローブから得られる標識シグナルはアンプリコンの量に比例することが確認された（非特許文献7、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社のウェブサイト）。更にこの方法はFRETを応用した蛍光標識プローブを使用し、蛍光強度の変化を蛍光検出器により測定することで、プローブの分解をモニターできることが示された（非特許文献13）。
【０００９】
その後、TaqMan PCR法は、リアルタイム定量PCRに応用され（非特許文献6）、複数箇所の（multiplex）遺伝子多型を同時に（simultaneous）検出する、ハイスループットな検出法が開発されているが（非特許文献1、非特許文献4、非特許文献16、非特許文献22、非特許文献23、非特許文献24）、それらは簡便性及び正確性の点で満足できるものではなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、より簡便、低コスト、正確、ハイスループットな方法を開発するため鋭意研究を重ねた結果、本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Acommon 1317TC polymorphism in MTHFR can lead to erroneous 1298AC genotyping byPCR-RE and TaqMan probe assays. Allen RA, Gatalica Z, Knezetic J, HatcherL, Vogel JS, Dunn ST. Genet Test. 2007 Summer;11(2):167-73.
【非特許文献２】Polymorphismsof UDP-glucuronosyltransferase gene and irinotecan toxicity: a pharmacogeneticanalysis. Ando Y, Saka H, Ando M, Sawa T, Muro K, Ueoka H, Yokoyama A,Saitoh S, Shimokata K, Hasegawa Y. Cancer Res. 2000 Dec 15;60(24):6921-6.
【非特許文献３】Racialvariability in the UDP-glucuronosyltransferase 1 (UGT1A1) promoter: a balancedpolymorphism for regulation of bilirubin metabolism? Beutler E, GelbartT, Demina A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 7;95(14):8170-4.
【非特許文献４】Real-timePCR genotyping of human platelet alloantigens HPA-1, HPA-2, HPA-3 and HPA-5 issuperior to the standard PCR-SSP method. Ficko T, Galvani V, Rupreht R,Dovc T, Rozman P. Transfus Med. 2004 Dec;14(6):425-32.
【非特許文献５】Commonhuman UGT1A polymorphisms and the altered metabolism of irinotecan activemetabolite 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38). Gagne JF, Montminy V, Belanger P,Journault K, Gaucher G, Guillemette C. Mol Pharmacol. 2002 Sep;62(3):608-17.
【非特許文献６】Realtime quantitative PCR. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94.
【非特許文献７】Detectionof specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Holland PM, Abramson RD, Watson R, GelfandDH. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Aug 15;88(16):7276-80.
【非特許文献８】Geneticvariants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severeneutropenia of irinotecan. Innocenti F, Undevia SD, Iyer L, Chen PX, DasS, Kocherginsky M, Karrison T, Janisch L, Ramirez J, Rudin CM, Vokes EE, RatainMJ. J Clin Oncol. 2004 Apr 15;22(8):1382-8. Epub 2004 Mar 8.
【非特許文献９】Geneticpredisposition to the metabolism of irinotecan (CPT-11). Role of uridinediphosphate glucuronosyltransferase isoform 1A1 in the glucuronidation of itsactive metabolite (SN-38) in human liver microsomes. Iyer L, King CD,Whitington PF, Green MD, Roy SK, Tephly TR, Coffman BL, Ratain MJ. J ClinInvest. 1998 Feb 15;101(4):847-54.
【非特許文献１０】UGT1A1*28polymorphism as a determinant of irinotecan disposition and toxicity. Iyer L, Das S, Janisch L, Wen M, Ramirez J, Karrison T, Fleming GF, Vokes EE,Schilsky RL, Ratain MJ. Pharmacogenomics J. 2002;2(1):43-7.
【非特許文献１１】Glucuronidationof 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38), an active metabolite of irinotecan(CPT-11), by human UGT1A1 variants, G71R, P229Q, and Y486D. Jinno H,Tanaka-Kagawa T, Hanioka N, Saeki M, Ishida S, Nishimura T, Ando M, Saito Y,Ozawa S, Sawada J. Drug Metab Dispos. 2003 Jan;31(1):108-13.
【非特許文献１２】Detectionof single nucleotide polymorphisms. Kwok PY, Chen X. Curr IssuesMol Biol. 2003 Apr;5(2):43-60. Review.
【非特許文献１３】Allelicdiscrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Lee LG,Connell CR, Bloch W. Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11;21(16):3761-6.
【非特許文献１４】UGT1A1gene variations and irinotecan treatment in patients with metastatic colorectalcancer. Marcuello E, Altes A, Menoyo A, Del Rio E, Gomez-Pardo M, BaigetM. Br J Cancer. 2004 Aug 16;91(4):678-82.
【非特許文献１５】Irinotecanpharmacokinetics/pharmacodynamics and UGT1A genetic polymorphisms in Japanese:roles of UGT1A1*6 and *28. Minami H, Sai K, Saeki M, Saito Y, Ozawa S,Suzuki K, Kaniwa N, Sawada J, Hamaguchi T, Yamamoto N, Shirao K, Yamada Y,Ohmatsu H, Kubota K, Yoshida T, Ohtsu A, Saijo N. Pharmacogenet Genomics.2007 Jul;17(7):497-504.
【非特許文献１６】Four-colormultiplex reverse transcription polymerase chain reaction--overcoming itslimitations. Persson K, Hamby K, Ugozzoli LA. Anal Biochem.2005 Sep 1;344(1):33-42.
【非特許文献１７】Relevanceof different UGT1A1 polymorphisms in irinotecan-induced toxicity: a molecularand clinical study of 75 patients. Rouits E, Boisdron-Celle M, Dumont A, Guerin O, Morel A,Gamelin E. Clin Cancer Res. 2004 Aug 1;10(15):5151-9.
【非特許文献１８】UGT1A1haplotypes associated with reduced glucuronidation and increased serumbilirubin in irinotecan-administered Japanese patients with cancer. SaiK, Saeki M, Saito Y, Ozawa S, Katori N, Jinno H, Hasegawa R, Kaniwa N, SawadaJ, Komamura K, Ueno K, Kamakura S, Kitakaze M, Kitamura Y, Kamatani N, MinamiH, Ohtsu A, Shirao K, Yoshida T, Saijo N. Clin Pharmacol Ther. 2004Jun;75(6):501-15.
【非特許文献１９】Importanceof UDP-glucuronosyltransferase 1A1*6 for irinotecan toxicities in Japanesecancer patients. Sai K, Saito Y, Sakamoto H, Shirao K, Kurose K, Saeki M,Ozawa S, Kaniwa N, Hirohashi S, Saijo N, Sawada J, Yoshida T. CancerLett. 2008 Mar 18;261(2):165-71. Epub 2007 Dec 20.
【非特許文献２０】Irinotecanpharmacogenetics in Japanese cancer patients: roles of UGT1A1*6 and *28. Sai K, Sawada J, Minami H. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84.Review. Japanese.
【非特許文献２１】Identificationof a defect in the UGT1A1 gene promoter and its association withhyperbilirubinemia. Sugatani J, Yamakawa K, Yoshinari K, Machida T,Takagi H, Mori M, Kakizaki S, Sueyoshi T, Negishi M, Miwa M. BiochemBiophys Res Commun. 2002 Mar 29;292(2):492-7.
【非特許文献２２】Four-colormultiplex 5' nuclease assay for the simultaneous detection of the factor VLeiden and the prothrombin G20210A mutations. Ugozzoli LA, Hamby K. Mol Cell Probes. 2004 Jun;18(3):161-6.
【非特許文献２３】Animproved real time PCR method for simultaneous detection of C282Y and H63Dmutations in the HFE gene associated with hereditary hemochromatosis. Walburger DK, Afonina IA, Wydro R. MutatRes. 2001 Jan;432(3-4):69-78.
【非特許文献２４】Simultaneousgenotyping of coagulation factor XI type II and type III mutations by multiplexreal-time polymerase chain reaction to determine their prevalence in healthyand factor XI-deficient Italians. Zadra G, Asselta R, Tenchini ML,Castaman G, Seligsohn U, Mannucci PM, Duga S. Haematologica. 2008May;93(5):715-21. Epub 2008 Apr 2.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することを課題とする。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本件発明はTaqMan PCR法に用いるプライマーの設計方法、並びに、TaqMan PCR法に用いるプライマー及びプローブの配列を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を使用すれば、イリノテカンの副作用の重篤性に関わるUGT1A1遺伝子の複数の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、よりハイスループットで検出することができる。具体的には、UGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1はUGT1A1遺伝子の構造の模式図である。
【図２−１】図2-1AはテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F2及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果であり、図2-1Bは理想的なTaqManPCR法による多型の検出結果を示す模式図である。
【図２−２】図2-2はテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F7及び6R7）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【図３】図3はテンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、2種のプライマー（28F4及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【図４】図4はテンプレートDNAとしてヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用い、かつ、2種のプライマー（28F4及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を同時に用いて多型検出を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[定義]
同時に：本明細書において「同時に」検出する、「同時に」使用する、などという場合は、時間的に「同じ時刻」という意味ではなく、例えば、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液からの複数波長の蛍光を検出する、あるいは、同一PCRチューブ内の同一PCR反応液に複数のプライマーを使用する、などの意味で用いる。
ホモ：遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の両方に特定の多型が存在することを意味する。
ヘテロ：遺伝学の通常の用語の意味で用いるが、特に、2つの相同染色体の一方のみに特定の多型が存在することを意味する。
野生型：多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型を野生型と呼ぶ。
変異型：多型は全て野生型と呼ぶことも出来るが、本明細書においては、特定の集団の中で最も頻繁に観察される多型以外の多型を変異型と呼ぶ。
多型：名詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列における集団内の個体差（バリエーション）又はその配列を意味する。形容詞的に使用する場合は、ゲノム塩基配列の特定箇所に集団内の個体差（バリエーション）が存在することを意味する。
多型を検出する：本明細書で「多型を検出する」という場合には、「特定の個体由来のサンプル中に注目する多型の変異型が存在することを検出すること」を意味する場合の他に、「当該注目する多型の遺伝型を決定すること」を意味する場合もある。
遺伝型：ある個体が特定の「遺伝型」を有するとは、注目される多型部位（単数又は複数）についてその個体が特定の多型の組み合わせ（複数の多型部位又は2つの相同染色体）を有することを意味する。
【００１７】
UGT1A1*28多型：UGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回から7回に増えている多型を意味する。多型の位置に関しては、Saiet al. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84. Reviewを参照。
UGT1A1*6多型：UGT1A1遺伝子のアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）を意味する。多型の位置に関しては、Saiet al. Yakugaku Zasshi. 2008 Apr;128(4):575-84. Reviewを参照。
UGT1A1*28多型部位：UGT1A1*28多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*28部位と言うこともある。
UGT1A1*6多型部位：UGT1A1*6多型が存在する塩基又は塩基対の場所を意味する。省略してUGT1A1*6部位と言うこともある。
UGT1A1*28多型領域：UGT1A1*28部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*6多型領域：UGT1A1*6部位を含むゲノム配列上の領域を意味する。
UGT1A1*28 野生型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回であることを意味する。
UGT1A1*6 野生型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 野生型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）が存在しない（当該塩基がGである。）ことを意味する。
UGT1A1*28 変異型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*28 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子のプロモーター領域に存在するTA反復配列数が通常の6回ではなく7回であることを意味する。
UGT1A1*6 変異型：ある個体のゲノムの塩基配列が「UGT1A1*6 変異型である」とは、その個体の2つの相同染色体の両方、又は、注目する一方のUGT1A1遺伝子にアミノ酸置換を伴う多型（一般的に、211G>Aと表される。）が存在する（当該塩基がAである。）ことを意味する。
UGT1A1*28：UGT1A1*28多型又はUGT1A1*28多型部位を意味する。
UGT1A1*6：UGT1A1*6多型又はUGT1A1*6多型部位を意味する。
【００１８】
アンプリコン：PCR法において連続したDNAとして増幅される単位を意味する。
TaqMan PCR法の原理：本件発明において「TaqMan PCR法の原理」という場合には、PCRで増幅する領域に、5’末端側を標識した相補的なDNAプローブをデザインし、このDNAプローブ存在下でPCRを行い、Taqポリメラーゼの持つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの進行と共にプローブが分解され、この分解されたプローブから得られる標識シグナルがアンプリコンの量に比例することを基礎としてテンプレートDNAの定量をする原理をいう。
【００１９】
[実験材料及び方法]
<ヒトゲノムDNA>
ヒトゲノムDNAの抽出はQIAamp DNA Mini kit（Cat. No.51304, QIAGEN）により行った。ヒトゲノムDNA抽出用の血液は積水メディカル株式会社社内ボランティアから取得した。血液採取に当たっては社内倫理規定を遵守した。提供されたプロトコルに従い、200μlの血液から約3μgのゲノムDNAを得た。
【００２０】
<プライマー>
PCR反応に使用したプライマーの作製には、SIGMA社のカスタムオリゴDNA合成サービスを利用した。精製グレードはカートリッジ精製（逆相カートリッジ（RP1））を選択した。
【００２１】
<プライマーデザイン>
プライマー設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターにはprimerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値：58〜60℃、塩基数：20mer、GC含量：30〜80%を目安に設計した。条件を満たす11個のプライマーを合成して実際の増幅効率及び特異性を試験し、それらの中から優れたものを選んだ。
【００２２】
表1にUGT1A1*28多型領域を増幅する1対のプライマーペア（UGT-28 TprimerF4及びUGT-28 TprimerR4）の配列を示す。また、表1にUGT1A1*6多型領域を増幅する2対のプライマーペア（UGT-6TprimerF2とUGT-6 TprimerR2のペア、並びに、UGT-6 TprimerF7とUGT-6 TprimerR7のペア）の配列を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
<TaqManプローブ>
TaqManプローブの作成には、オペロン バイオテクノロジー 株式会社の受託合成サービスを利用し、全て蛍光色素と消光剤で二重標識されたものを購入した。精製グレードはHPLC精製を選択した。
【００２５】
<TaqManプローブのデザイン>
プローブ設計ソフトウェアには、Primer Express 3.0 (Applied Biosystems)を用いた。提供されたマニュアルに従い、設計パラメーターには、primerprobe toolのDocument Type TaqMan Allelic Discriminationを用いた。選定基準として、Tm値：65〜68℃、塩基数：30〜40mer、GC含量：30〜80%を目安に設計した。
【００２６】
表2にUGT1A1*28多型部位が野生型であるか（UGT1A1*28 野生型検出プローブ）、又は、*28変異型であるかを判定するためのプローブ（UGT1A1*28変異型検出プローブ）を示す。また、表2にUGT1A1*6多型部位が野生型であるか（UGT1A1*6 野生型検出プローブ）、又は、*6変異型であるかを判定するためのプローブ（UGT1A1*6変異型検出プローブ）を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
<Real-TimePCR反応>
リアルタイムPCR反応（TaqMan PCR）は表3に示した条件で行った。テンプレートDNAには、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)、あるいはゲノムDNAを使用した。プラスミドコントロールは、105〜107コピー数になるよう調整し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ゲノムDNAは10〜20ngになるように量を調製し、全量が50μLになるように水の量を調節した。ExTaqとしてはPremix Ex Taq（TaKaRa）を使用し、PCR反応チューブにはMultiplate PCR Plates Low96-wellclear（BIO RAD）を用いた。サーマルサイクラーにはPTC-200（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いた。PCR反応は表4に示すとおり、98℃で15秒、65℃で1分の2ステップ反応で行った。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
<蛍光検出>
リアルタイムPCRの蛍光検出にはChromo4 Real-Time PCR Detector（BIO RAD）を用いた。実際には、上記リアルタイムPCR反応と同時に蛍光検出を行った。提供されたマニュアルに従い、OpticonMonitorVersion3.1プログラムを用いてデータを解析した。蛍光励起及び蛍光検出の条件は以下の通りである；波長(蛍光励起範囲：1チャンネル450〜490nm 2チャンネル500〜535nm 3チャンネル555〜585nm 4チャンネル620〜650nm、 蛍光検出範囲：1チャンネル515〜530nm 2チャンネル560〜580nm 3チャンネル610〜650nm 4チャンネル675〜730nm)。
【００３２】
実験の最後に蛍光量を測定した値、即ち、最大蛍光値をEndpointとして表した。ウェルで測定された最も低い蛍光値をベースラインとして定義し、それぞれの色素の相対蛍光値を縦軸及び横軸にプロットして表した。
【００３３】
[結果及び考察]
[参考例1]
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-1]
テンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F2及び6R2）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を用いて、TaqMan PCR法によりUGT1A1*28多型及びUGT1A1*6多型を同時に検出した結果を図2-1Aに示す。28F4-28R4プライマーペアはUGT1A1*28多型領域の149bpのアンプリコンを増幅し、6F2-6R2プライマーペアはUGT1A1*6多型領域の133bpのアンプリコンを増幅する。
【００３４】
テンプレートDNAとして、UGT1A1*28、UGT1A1*6の野生型もしくは変異型の配列を組み込んだプラスミドコントロール(Heteroサンプルは野生型と変異型を等濃度混合した)を用い、かつ、4種のプライマー（28F4、28R4、6F7及び6R7）、並びに、4種の検出プローブ（UGT1A1*28野生型、UGT1A1*28 変異型、UGT1A1*6 野生型及びUGT1A1*6 変異型）を用いて、TaqMan PCR法によりUGT1A1*28多型及びUGT1A1*6多型を同時に検出した結果を図2-2に示す。
【００３５】
図2-1Bに理想的なTaqMan PCR法による多型の検出結果を模式図として示す。例えば、UGT1A1*28変異型又はUGT1A1*28野生型を検出する各プローブは、それぞれ、HEX又はFAMで蛍光標識されているので、両方の相同遺伝子が変異型（Homo）の場合にはHEXのみの蛍光が強く観察され、両方の相同遺伝子が野生型（WT）の場合にはFAMのみの蛍光が強く観察され、また、一方の相同遺伝子が変異型で且つ他方の相同遺伝子が野生型の場合（Hetero）の場合にはHEX及びFAMの両方の蛍光が観察されるはずである。もちろん、サンプル中にDNAが無い場合には、蛍光（バックグラウンド）は検出されないのが理想である。UGT1A1*6多型部位についても同様のことが言える。
【００３６】
図2-1Aの結果については、UGT1A1*28多型検出におけるHEX蛍光シグナルのバックグラウンドの高さ（DNAなし）、若しくは、ヘテロの場合の理想パターンからの乖離は満足の行く結果ではなかった。また、図2-2の結果については、UGT1A1*6多型検出におけるCy5（0.125弱）及びTXR（0.06強）の蛍光強度の弱さは満足の行く結果ではなかった。
【実施例１】
【００３７】
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-2]
上記参考例1の結果が満足の行くものではなかったため、本発明者らはUGT1A1*28及び*6の多型をより簡便に、より低コストで、より正確に、同時に（simultaneous）検出することが出来る方法の開発を目指して、鋭意検討を重ねた。
【００３８】
多数のプライマーペアを試験したうち（データを示さず）の最良の結果が参考例1であった。従って、本発明者らは、プライマーデザインを最適化するだけでは上記課題を解決できないと考え、UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一対のプライマーペアで増幅する方法を試した。28F4-6R2プライマーペアの場合は424bpのアンプリコンを増幅する。
【００３９】
通常、PCR反応の効率はアンプリコンが約100bpから200bp程度で最大であり、アンプリコンが大きくなると増幅効率、特異性などが低下することが予想される。しかし、驚くべきことに、28F4-6R2プライマーペアの場合は、蛍光強度のレベル、バックグラウンドの低さ、のいずれにおいても参考例の結果を凌駕し、より正確な多型の検出結果が得られた（図3）。この現象の基礎となる分子的なメカニズムは現時点では明らかではないが、例えば、28F4、28R4、6F2及び6R2の4プライマーを使用した場合には、意図された2種のアンプリコン（28F4-28R4及び6F2-6R2）の他に、28F4-6R2プライマーペアによるアンプリコンが生成しうるため、これらが互いに阻害的な効果を発揮している可能性は考えられる。
【実施例２】
【００４０】
[TaqManPCR法を用いたUGT1A1*28及びUGT1A1*6多型の同時検出-3]
テンプレートDNAとしてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が既知のヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用い、かつ、28F4-6R2プライマーペア、並びに、既出の4種の検出プローブを同時に用いて多型検出を行った結果を図4に示す。また、各検体についてUGT1A1*28及びUGT1A1*6部位の配列が野生型又は変異型の何れであったかを纏めたのが表5である。
【００４１】
【表５】
【００４２】
これらの結果は、独立な手段により既に知られた多型と完全に一致した。このことから、ヒトゲノムDNAを20ng又は10ngを用いれば、再現性良く、UGT1A1*28及び*6の多型を簡便に、低コストで、正確に、同時に検出できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のUGT1A1*28多型及び*6多型の検出法を利用すれば、簡便、低コスト、正確かつハイスループットにUGT1A1*28多型及び*6多型を検出するための試薬又はキットを提供することができる。また、本発明のUGT1A1*28多型及び*6多型の検出法を利用すれば、簡便、低コスト、正確かつハイスループットで、イリノテカンの副作用を予測し当該薬剤の投与量を調節するために必要な情報を医師に提供することができる。
【符号の説明】
【００４４】
UGT1A1 UGT1A1遺伝子
Promoter プロモーター領域
Exon エクソン領域
【００４５】
28F4 UGT-28TprimerF4
28R4 UGT-28TprimerR4
6F2 UGT-6TprimerF2
6R2 UGT-6TprimerR2
6F7 UGT-6TprimerF7
6R7 UGT-6TprimerR7
Endpoint,HEX HEXの最大蛍光値
Endpoint,FAM FAMの最大蛍光値
Endpoint,Cy5 Cy5の最大蛍光値
Endpoint,TXR TXRの最大蛍光値
Homo ホモ
Hetero ヘテロ
WT 野生型
【００４６】
+/+ 注目される多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
+/- 注目される多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
-/- 注目される多型部位において、2つの相同染色体ともに野生型であること
*28/*28 UGT1A1*28多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/*6 UGT1A1*28多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であり、更に、UGT1A1*6多型部位において一方の相同染色体が変異型でありかつ他方の相同染色体が野生型であること；なお、UGT1A1*28多型とUGT1A1*6多型は別の染色体にある（別のハプロタイプである）ことに注意されたい。
*6/*6 UGT1A1*6多型部位において、2つの相同染色体ともに変異型であること
*28/- UGT1A1*28多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
*6/- UGT1A1*6多型部位において、一方の相同染色体が変異型であり、かつ、他方の相同染色体が野生型であること
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の全ての条件を満たす、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するための方法。
(a) TaqMan PCR法の原理を用いる
(b) TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアを含む
(c) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域又はUGT1A1*6多型領域の一方のみをアンプリコンとして増幅するプライマーペアを含まない
(d) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28 野生型を検出するためのプローブ、UGT1A1*28 変異型を検出するためのプローブ、UGT1A1*6野生型を検出するためのプローブ、及び、UGT1A1*6変異型を検出するためのプローブの4種のプローブを含む
【請求項２】
UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有し、かつ、UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、又は、配列番号11の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
以下の全てを含む、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するためのキット。
(a) 配列番号2及び配列番号5の配列を有する2種の多型領域増幅用オリゴヌクレオチド
(b) 配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有する4種の多型検出用オリゴヌクレオチド
ここで、当該4種の多型検出用オリゴヌクレオチドは、いずれも、5’末端又は3’末端が蛍光色素で修飾され、他端が消光剤で修飾されている
【請求項１】
以下の全ての条件を満たす、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するための方法。
(a) TaqMan PCR法の原理を用いる
(b) TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアを含む
(c) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28多型領域又はUGT1A1*6多型領域の一方のみをアンプリコンとして増幅するプライマーペアを含まない
(d) 上記TaqMan PCRの反応液がUGT1A1*28 野生型を検出するためのプローブ、UGT1A1*28 変異型を検出するためのプローブ、UGT1A1*6野生型を検出するためのプローブ、及び、UGT1A1*6変異型を検出するためのプローブの4種のプローブを含む
【請求項２】
UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有し、かつ、UGT1A1*28多型領域及びUGT1A1*6多型領域の両方を一つのアンプリコンとして増幅する一対のプライマーペアが、配列番号2及び配列番号5の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
上記4種のプローブが、それぞれ、配列番号8、配列番号9、配列番号10、又は、配列番号11の配列を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
以下の全てを含む、UGT1A1*28及びUGT1A1*6の2種類の多型を同時に検出するためのキット。
(a) 配列番号2及び配列番号5の配列を有する2種の多型領域増幅用オリゴヌクレオチド
(b) 配列番号8、配列番号9、配列番号10、及び、配列番号11の配列を有する4種の多型検出用オリゴヌクレオチド
ここで、当該4種の多型検出用オリゴヌクレオチドは、いずれも、5’末端又は3’末端が蛍光色素で修飾され、他端が消光剤で修飾されている
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２３３４９６（Ｐ２０１０−２３３４９６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８４９４０（Ｐ２００９−８４９４０）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]