ＶＬＤＬＲ遺伝子の検出による胃癌の検出方法
【課題】胃癌の早期発見や悪性度の診断、抗癌物質の選別に役立つ、安定で再現性の高い、胃癌の新規な検出方法を提供すること。
【解決手段】胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ（ＶＬＤＬリセプター）遺伝子の、（ホモ接合体）欠失、ＣｐＧアイランドのメチル化等による不活性化を検出することにより、当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法。検出手段としては、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法等が挙げられる。
【解決手段】胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ（ＶＬＤＬリセプター）遺伝子の、（ホモ接合体）欠失、ＣｐＧアイランドのメチル化等による不活性化を検出することにより、当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法。検出手段としては、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法等が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ヒトＶＬＤＬＲ）遺伝子の不活性化を検出することによって胃癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ：ＧＣ）は日本では毎年１００，０００人以上が罹患し、男女比は約２：１と男性に多く、男性では１番多い癌である。年間の死亡者数は日本で約５０，０００人と全癌の１６％を占める。これまでの研究により、胃組織細胞は、細胞の分化と増殖の過程で、遺伝子の変化が連鎖的に起こり、その結果、癌化に至ると考えられている。しかし、どのような遺伝子の変化が、胃組織細胞の癌化を誘導するのかは、未だ明らかではない。従って、胃癌の検出方法並びに胃癌の悪性度の検査方法は存在しない状況である。
【０００３】
胃癌の検診には胃Ｘ線検査、胃内視鏡、血中ペプシノーゲン値、腫瘍マーカーが挙げられ、胃内視鏡（確実な診断が得られる唯一の検査）も広く行われている。しかしながら、これら多くは、画像診断や早期診断のためのツールであり、癌の確定診断やタイピング、進行度の判定、転移の有無を判定する方法ではない。
【０００４】
また、遺伝子に着目した胃癌の検出方法としては、例えば、特許文献１に記載の方法が知られている。しかし、この方法は遺伝子の発現プロファイルの変化に着目したものである。遺伝子の発現プロファイルの測定とは、複数のｍＲＮＡ量の測定である。ｍＲＮＡは非常に不安定で分解しやすく、また発現のダイナミックレンジも大きいため、マイクロアレイ等による測定の再現性が悪い。このため、より安定で再現性の高い手法が求められてきた。
【０００５】
ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）は、ゲノム上での遺伝子の増幅を検出するためには、感度が高く効率の良い方法である。本発明者らは、このＣＧＨアレイ法を用いて胃癌細胞で増幅する遺伝子群、すなわち、クロモソーム２ｐ２４．１で増幅しているＳＤＣ１遺伝子、クロモソーム２ｐ２３．３で増幅するＤＮＭＴ３Ａ遺伝子、クロモソーム３ｐ２２．３で増幅するＭＬＨ１遺伝子、クロモソーム３ｐ２２．１で増幅するＣＴＮＮＢ１遺伝子等を同定した（非特許文献１）。
【０００６】
一般的に癌化の遺伝子レベルでの機構として、上記のような複数遺伝子の増幅と共に癌抑制遺伝子の欠失が報告されているが、特定の遺伝子の欠失の同定は、ポジショナルクローニング等の通常の方法を用いた場合、大変な時間と労力がかかり、目的とする遺伝子を見出すことは困難である。また、ＣＧＨ法においても、５−１０Ｍｂより小さいサイズのゲノムＤＮＡの欠失は、通常のメタフェーズクロモソームを用いた方法では検出が困難であった（非特許文献２及び３）。例えば、ＤＰＣ４／ＳＭＡＤ４、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ｐ１６−ＩＮＫ４Ａ、ＲＡＳＳＦ１等の癌抑制遺伝子は、染色体のマッピング法によりホモ接合体欠失領域を狭めて行き、最終的に目的とする癌抑制遺伝子が同定された。
【０００７】
【非特許文献１】Takada H, Imoto I, Tsuda H, Sonoda I, Ichikura T, Mochizuki H, Okanoue T, Inazawa J. : Screening of DNA copy-number aberrations in gastric cancer cell lines by array-based comparative genomic hybridization. Cancer Sci. 2005 Feb;96(2):100-10
【非特許文献２】Bentz,M.,Plesch,A.,Stilgenbauer,S.,Dohner,H.&Lichter,P.:Minimal sizes of deletions detected by comparative genomichybridization, Genes Chromosomes Cancer,, 172-175, 1998
【非特許文献３】Kirchhoff,M., Gerdes,T., Maahr,J., Rose,H., Bentz,M., Dohner,H. & Lundsteen,C.: Deletions below 10megabase pairs are detected in comparative genomic hybridization by standard reference intervas, Genes Chromosomes Cancer,, 410-413, 1999
【特許文献１】特表２００５−５１４０５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新たな胃癌関連遺伝子を見出して、該癌関連遺伝子の不活性化を検出することによって、より安定で再現性の高い胃癌の検出方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はまた、遺伝子レベルにおける胃組織細胞の癌化の早期発見や胃癌の悪性度の診断を行う方法、さらに、当該メカニズムに基づく抗癌物質の選別を行う方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはＣＧＨ法の感度と精度を上げ、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔな方法を開発し、ＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ／ＰＡＣＤＮＡを選別することにより、胃組織細胞の癌化を抑制する癌抑制遺伝子、すなわち、ヒトＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＬＤＬＲ）遺伝子（以下、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ともいう）の同定に成功した。そして、胃組織細胞の癌化を惹き起こす、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化の原因まで突っ込んだ解明を行い、当該遺伝子の不活性化が、（１）当該遺伝子の欠失、及び（２）当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化により惹き起こされることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを用いて当該遺伝子の不活性化を検出する。
【００１２】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化は、当該遺伝子の欠失による不活性化である。さらに好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失は、当該遺伝子のホモ接合体欠失である。
【００１３】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化は、当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である。
【００１４】
好ましくは、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、または、ＣＧＨ法を用いて胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、胃組織細胞検体における癌化の兆候、癌の進行度や悪性度を的確に把握することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による胃癌の検出方法は、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを特徴とする。
【００１７】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する対象となる胃組織細胞は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。この検体組織細胞は、健常人の胃組織細胞か、胃癌患者の当該癌組織であるかを問わないが、現実的には、（１）内視鏡検査等の結果、胃組織に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織、または、（２）胃癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある胃癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１８】
本発明の検出方法により、「内視鏡検査等の結果、胃組織に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織」におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が認められた場合には、当該病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。また、「胃癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある胃癌の組織」におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が認められた場合にも、当該癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。検体として採取された胃組織細胞組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製を行い、本発明の検出方法を行う対象とすることができる。
【００１９】
本発明の検出方法は、上述したように、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより、当該細胞の癌化（特に、癌化のイニシエーション）を特定することが可能である。このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化の態様としては、（１）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失、または、（２）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が欠失していない場合における遺伝子の発現量の低下が挙げられる。
【００２０】
（１）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失
このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失の検出を直接的に行うことができる代表的方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡまたはＰＡＣ（Ｐｈａｇｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨを行うと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失部分を検出することができる。具体的に、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ−１１−６７１Ｆ１６， ＲＰ１１−３２０Ｅ１６， ＲＰ１１−５７８Ｍ２， ＲＰ１１−７１９Ｍ６， ＲＰ１１−９４１Ｄ２３を挙げることができる。
【００２１】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いて行うことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００２２】
通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。
【００２３】
アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列部分を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを、検出用プローブとして用いることもできる。
【００２４】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス、プラスチック、メンブレン、３次元アレイ等があげられ、スライドガラス等のガラス基板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２５】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ／μｌ〜５μｇ／μｌ、より好ましくは１ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或いはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２６】
乾燥スポットの調製は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェト式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが好ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２７】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２８】
また、このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。なお、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列はそれぞれ公知であり、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
【００２９】
（２）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が欠失していない場合における遺伝子の発現量の低下
この態様の方法は、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を基とする、ポリヌクレオチド量またはヒトＶＬＤＬＲ蛋白質量を定量し、この定量値を指標にして、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の低下を検出することができる。上記ポリヌクレオチドとしては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、これを鋳型として得られるｃＤＮＡを挙げることができる。
【００３０】
なお、常法によりヒトＶＬＤＬＲ蛋白質に対する抗体を調製する等して、これを用いて検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質量を定量して、上記の定量値を求めることができるが、本発明の検出方法における検出対象は、遺伝子の発現量の「低下」であり、このようなネガティブな検出における指標を蛋白質量とすることは、バックグラウンドの存在等の問題を解決しなければならず、効率的とはいえない面がある。よって、この態様の方法における検出手段としては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を基とする、ポリヌクレオチド量の検出方法を用いることが好適である。このポリヌクレオチド量の検出方法としては、例えば、下記の手段を例示することができる。
【００３１】
最も典型的な態様は、検体における、ヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡを検出することにより、間接的に検体において存在するｍＲＮＡを検出して、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が発現している程度を把握する検出方法である（以下、この態様の検出手段を、ＶＬＤＬＲｍＲＮＡ検出方法ともいう。この態様の検出方法には、下記のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が含まれる）。
【００３２】
ＶＬＤＬＲｍＲＮＡ検出方法では、典型的には、公知の方法（例えば、オリゴｄＴを用いる方法）に従い、検体の全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを選別する。そして、得られたｍＲＮＡから、既知のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の塩基配列に対応するヌクレオチド鎖を、増幅用プライマーとして用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、ｍＲＮＡを鋳型として遺伝子を増幅することが可能な遺伝子増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒトＶＬＤＬＲ蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅し、かかる遺伝子増幅操作による増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、好適にはリアルタイムに検出することができる。
【００３３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００３４】
なお、上記のようにして増幅されたヒトＶＬＤＬＲ蛋白質をコードするｃＤＮＡを鋳型として、さらにＰＣＲ法等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる遺伝子増幅操作を施し、これによる遺伝子増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、一層正確に検出することができる（この２回目の遺伝子増幅操作において用いる遺伝子増幅用プライマーは、１回目の遺伝子増幅操作において用いられた遺伝子増幅用プライマーよりも、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の内側に対応するヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅用プライマーとして用いる必要がある）。
【００３５】
ＤＮＡチップ法は、検体細胞で発現しているｍＲＮＡを定量する方法の一つである。例えば、基盤（上述したＣＧＨ法で用いられ得る基盤と実質的に同一）上に、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の特徴的な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを固定し（ｃＤＮＡを固定することもできる）、検体から調製したＲＮＡをリバーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成する時に標識を行う。本標識ｃＤＮＡと基盤上の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、結合した標識の量をスキャンすることによりｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
【００３６】
ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを、分離して固定し、これと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の特徴的な配列を有する合成オリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡを用いることもできる）とのハイブリダイズを検出することにより、検体中のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現を検出する方法である。
【００３７】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失以外の原因で、当該遺伝子の発現量が減少する主な原因としては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化が挙げられる。以下に、この要因について簡単に説明する。
【００３８】
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活化がおこることが報告されている（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．＆Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂｅｌｔｓ， ｂｒａｃｅｓ， ａｎｄｃｈｒｏｍａｔｉｎ， Ｃｅｌｌ， ４５１−４５４， １９９９）。癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは、ヒト癌での癌抑制遺伝子の不活化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ．， Ｊｉａｎｇ，Ｇ．， Ｆｉａｌａ，Ｅ．， Ｄｏｍｅ，Ｊ．Ｓ．， Ｙｕ，Ｍ．Ｃ．， Ｌｏｎｇ，Ｔ．Ｉ．， Ｙｏｕｎ，Ｂ．， Ｓｏｈｎ，Ｏ．Ｓ．， Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒ，Ｍ．， Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．， Ｃｈｉｎｔａｇｕｍｐａｌａ，Ｍ．， Ｃｈａｍｐａｇｎｅ，Ｍ．， Ｐａｒｈａｍ，Ｄ．， Ｌｉａｎｇ，Ｇ．， Ｍａｌｉｋ，Ｋ． ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ． ： Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒｓ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，， ６６９４−６７０２， ２００２）。
【００３９】
後述するように、実際、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１の一部とその上流領域に存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有することが判明した。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の胃癌細胞でのヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現の抑制と強く相関していた。そして、胃癌細胞を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果より、ＣｐＧアイランドの高密度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が胃癌細胞における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度でおこす原因の一つであることが判明した。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
［実施例１］
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのゲノムデータベースウエブサイト並びに選択されたＤＮＡのＢＬＡＳＴ検索の結果から癌化並びに癌細胞の増殖に極めて重要な遺伝子或いはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅマーカーを有する８００種類のＢＡＣ／ＰＡＣクローンを選択した。
【００４２】
ＢＡＣ及びＰＡＣ ＤＮＡをＤｐｎＩ、ＲｓａＩ、ＨａｅＩＩＩで消化し、その後アダプターＤＮＡとのライゲーションを行った。次に、アダプターの配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを２回行った。２本のプライマーの一方には５’末端がアミノ化されている。このプロセスを無尽蔵化と言い、得られたＤＮＡを無尽蔵化ＤＮＡと定義する。無尽蔵化ＤＮＡをインクジェットタイプのスポッター（ＧＥＮＥＳＨＯＴ、ＮＧＫＩｎｓｕｌａｔｏｒｓ、名古屋）を使用してＤｕｐｌｉｃａｔｅにオリゴＤＮＡマイクロアレイ（マツナミガラス、大阪）に共有結合でプリントした。
【００４３】
［実施例２］
胃癌での新規なホモ接合体欠失を検出するために、３２種類の胃癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、実施例１のＣＧＨアレイを使用したＣＧＨアレイ解析を行った。
【００４４】
なお、対照として男性の健常人ゲノムＤＮＡを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして上記胃癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ及び０．４ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（胃癌細胞）或いは０．４ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ニックトランスレーションにより標識した。Ｃｙ３並びにＣｙ５標識ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（東京）より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ、２ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーにセットしたＣＧＨアレイ上に加え、３７℃で３ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）のスピードで振とうしながら４８−７２時間インキュベーションを行った。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄し、さらに、０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて室温で１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ４．１イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３／Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上の時にゲノムの増幅があり、４以上の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。
【００４５】
その結果、胃癌（ＨＳＣ５８）細胞でクロモソーム９ｐ２４．２に存在するヒトＶＬＤＬＲの遺伝子が欠失していることが判った。このときのＬｏｇ２Ｒａｔｉｏは−２．６３であった［図１Ａ：被検細胞としてＨＳＣ５８のゲノムＤＮＡを用いて、実施例１に示したＣＧＨアレイ上でＣＧＨ解析を行った時の代表的なアレイイメージである。クロモソーム９ｐ２４．２−２４．３におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子コピー数の減少は明確なシグナル（Ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝−２．６３）で示される（右拡大図中の矢印で示す）。］。
【００４６】
他の細胞種について検討を進めた所、３１種類の胃癌細胞中で［図２Ａは、胃癌細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失の検出を表している。ＰＬＣは健常者由来のＤＮＡを用いた結果を示す。ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌ ｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子のＰＣＲは対照として用いた。］、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失は見出せなかった。さらに、Ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）を行ったプライマリー胃癌では３９サンプル中の１サンプル［図２Ｃの楔印で示す。図２Ｃは、Ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）−処理プライマリー胃癌におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失を示している。楔印はホモ接合体欠失を検出した細胞種を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲは対照として用いた。］について、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失が検出された。
【００４７】
［実施例３］
胃癌細胞において、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の配列から各々２種類のプライマーを設計し、両領域に由来するｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で検出した。
【００４８】
その結果、ホモ接合体欠失の起こっている細胞株でｍＲＮＡを検出できなかった。さらに、ホモ接合体欠失の起こっていない３２細胞株の中の９細胞株ではＲＴ-ＰＣＲ産物を検出できず、７細胞株では明らかに通常の胃組織と比較して発現の低下を示していた［図２Ｂ ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出された胃癌細胞のヒトＶＬＤＬＲの発現を示している。図２Ａに矢印で表示したホモ接合体欠失を示す細胞種に同様に矢印をつけた。ホモ接合体欠失を示さない３１細胞種の中で９細胞種について、ヒトＶＬＤＬＲ ｍＲＮＡ発現が頻度２９．０％で消失し、頻度２２．６％で発現低下していた。］。従って、ヒトＶＬＤＬＲ ｍＲＮＡを検出できない理由はゲノム上での遺伝子欠失に加えて他のメカニズムが考えられるので、さらにその検討を行った。
【００４９】
［実施例４］
ＣｐＧアイランドのメチル化は遺伝子発現を抑制するメカニズムの１つである。ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドをＣｐＧＰＬＯＴを用いて解析した結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエキソン１の周辺に４断片を同定した。本領域中のＣｐＧ部位並びにＣｐＧ部位が密集して存在するＣｐＧアイランドを表示した［図２Ｄ：ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１周辺のＣｐＧアイランドの図解マップである。エクソン１を白抜きボックスで表示し、転写開始点を＋１で示した。ＣｐＧアイランドはＣｐＧＰＬＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）により同定し、水平矢印で示した。ＣｐＧアイランドはヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の−５１４から＋１９１４までから構成される。プロモーターアッセイにより解析した領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ１から３まで）、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析を行った領域、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスを行った領域を水平の線で示した。］。
【００５０】
ここで同定したヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドのプロモーター活性を調べるために、このＣｐＧアイランドの周辺を含めて３つの断片（図２Ｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ １−３）に分けそれらの断片をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に挿入し、ＳＮＵ６０１細胞並びにＭＫ７０４細胞を、一過性にｐＲＬ−ｈＴＫ内部標準ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にコトランスフェクションした。用いたレポーターアッセイ系は、ホタルルシフェラーゼ酵素のメッセンジャーＲＮＡが発現し、タンパクに変換されて活性のある酵素として働くことによる発光物を測定する方法によった。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を下流域に配置しＶＬＤＬＲ遺伝子ｆｒａｇｍｅｎｔ１から３をプロモーター解析領域として含むコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）についてＶＬＤＬＲ遺伝子の発現がみられないＳＮＵ６０１、ＭＫ７０４細胞に導入しその酵素活性を測定した（図３Ｂ）。ｆｒａｇｍｅｎｔ２が両細胞共に高いルシフェラーゼ酵素活性を示したことから、ＶＬＤＬＲ遺伝子の転写活性化領域の基本単位は、ｆｒａｇｍｅｎｔ２にあることが判明した。
【００５１】
遺伝子変異の検出法として亜硫酸水素ナトリウムの処理の有無で、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換するがメチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。これを鋳型としたＰＣＲ検出を行いメチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて、変化したシトシンと非メチル化シトシン由来増幅ＤＮＡ産物における配列の違いを制限酵素切断の有無により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ法と制限酵素切断法を組み合わせた実験法）。そこで、ＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１近傍のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した（図３Ｃ）。ＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の低いＭＫＮ２８，ＭＫＮ７４，ＫＡＴＯ−ＩＩＩ，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ６３８およびＳＮＵ７１９細胞株では制限酵素ＨｈａＩの切断部位が存在することにより３本の切断ＤＮＡが電気泳動上観察された（矢印）。一方、ＶＬＤＬＲ遺伝子の発現がみられるＭＫＮ４５，ＨＳＣ４１，ＮＵＧＣ−３、ＡＺ−５２１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ４８４およびＳＨ１０１Ｐ４ではメチル化に依存した制限酵素切断点が発生しないため、電気泳動上単一バンドを示した（Ｍ）。
【００５２】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランド内の各ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化度をＢｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法により解析した。その結果、ホモ接合体欠失の認められない細胞（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）では、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドはメチル化度が特に高く、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現している細胞（ＡＺ−５２１）ではメチル化されていなかった［図３Ｄは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのＢｉｓｕｌｆｉｔｅゲノムシーケンスを示している。転写開始点を＋１で表示するとＣｐＧアイランドは＋４７１から＋１９１４までを占める。この領域には７１ヶ所のＣｐＧ部位がありそれを升目で表した。白抜き升目はメチル化されていないＣｐＧ部位で、黒塗り升目はメチル化されたＣｐＧ部位である。使用した細胞はヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（＋）と表示）のＡＺ−５２１、並びにヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現していない細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（−）と表示）のＳＮＵ６０１及びＭＫＮ７４である。］。従って、胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失のある場合と、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドが高度にメチル化されている場合にはヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現は検出されないか或いは非常に低いことが判った。この２つのケースより、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現と胃組織細胞の癌化との関係が強く示唆される。
【００５３】
［実施例５］
これまで、胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化を解析してきたが、実際に胃癌組織でも同様な現象が起こっているかどうかを検討した。その結果、プライマリー胃癌７例で、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化が起こっていることが判明した［図４Ｃは、プライマリー胃癌のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのＣＯＢＲＡ解析を示している。Ｎは非癌胃組織、Ｔはプライマリー胃癌組織を示す］。以上の結果より、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化による、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活化は胃組織細胞の癌化に重要な役割を示すと推定される。
【００５４】
［実施例６］
胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドを脱メチル化したときのヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現を検討した。具体的には、胃癌細胞をメチル転移酵素阻害剤である各種濃度の５−ａｚａ−ｄＣ存在下で５日間処理したときのヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡ誘導能を測定した。その結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子欠失はないがヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡが検出されない細胞では５−ａｚａ−ｄＣ処理を行なうことにより、ヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡ誘導能が見出された［図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣ存在下並びに不在下での胃癌細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現解析を示している。ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を増幅するための２種類の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動の結果得られたバンドを示した。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。鋳型に使用したゲノムはホモ接合体欠失の認められないヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現しない細胞種（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）を５−ａｚａ−ｄＣ存在下並びに不在下で５日間培養した後に調製した。］。
【００５５】
［実施例７］
ＣｐＧアイランドのメチル化に伴う遺伝子発現抑制はゲノムの染色体構造を変化させることに起因することが明らかになってきた。同様にゲノムと相互作用するヒストン蛋白質の低アセチル化もゲノム構造を変化させ、遺伝子発現に影響を与える。今回、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）とメチル基転移酵素阻害剤である５−ａｚａ−ｄＣを用いてＣｐＧメチル化とヒストンアセチル化の関連を検討した。
【００５６】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドが密にメチル化されているＳＮＵ６０１およびＭＫＮ７４細胞を、ＴＳＡ存在下でインキュベーションしたところ、ＴＳＡ不在下と発現量に変化はなかった［図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣ及びＴＳＡ存在下で培養した後の、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子非発現胃癌細胞（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）におけるＶＬＤＬＲｍＲＮＡの発現を示している。両細胞を５−ａｚａ−ｄＣ存在下で５日間、ＴＳＡ存在下或いは５−ａｚａ−ｄＣとＴＳＡ共存下で１２時間培養した。それぞれの細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を増幅するための２種類の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動の結果得られたバンドを示した。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。］。両細胞とも、ＴＳＡと５−ａｚａ−ｄＣ共在下でインキュベーションしても、特にヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の変化は認められなかった。この結果は、ＣｐＧアイランドのメチル化のみがヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現に影響を与え、染色体高次構造の変化には関連がないことを示唆している
【００５７】
［実施例８］
プロモーター領域のメチル化検出法について、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換することが可能であるが、この被検ＤＮＡに対し亜硫酸水素ナトリウムの処理後変化した部位のウラシルに対応するプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、特定部位のメチル化の検出を行うことが可能である（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ法： ＭＳＰ）。この方法を利用して胃癌細胞株、さらに臨床サンプル由来の隣接正常組織、癌組織から得られたサンプルについて図２Ｄに表示したＭＳＰプライマーを用いて解析した（図４Ａおよび図４Ｂ； Ｕ：非メチル化、Ｍ：メチル化、Ｎ：正常部位、Ｔ：腫瘍部位）。胃癌細胞株ではＶＬＤＬＲ遺伝子の発現のないＭＫＮ７４（Ｎｏ．５），ＳＮＵ６０１（Ｎｏ．２７）両株のプロモーター部位がメチル化したＭＳＰ法での結果となり、ＶＬＤＬＲ遺伝子が発現するＡＺ−５２１（Ｎｏ．２４）細胞ではメチル化されていないという予想どおりの結果が得られた。臨床からの癌組織からのＭＳＰ法によるメチル化解析では、２０サンプル中７サンプルに関してメチル化が検出された。また癌組織ならびに隣接正常部位が解析可能であった７サンプル中５サンプルで癌組織で癌部位特異的にメチル化が検出され、隣接正常部位ではメチル化が検出されない結果となった。このメチル化の差異が検出されたもの（１７，２１）を用いて、さらにＶＬＤＬＲ遺伝子ＢＳ−２領域（図２Ｄ参照）についてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてメチル化を解析した（図４Ｄ）。メチル化の差異が検出された癌１７，２１では予想どおりメチル化が観察された（メチル化している部位は黒で表示した）。
【００５８】
上記の各実施例で使用したプライマー配列とPCR条件を以下の表１に記載する。
【００５９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１Ａは、ＨＳＣ５８細胞株の典型的な二連のアレイＣＧＨイメージを示す。ＲＰ１１−４８Ｍ１７の９ｐ２４．２−２４．３のコピー数の比（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）の著しい減少が明確な赤いシグナルとして検出された。図１Ｂは、ＨＳＣ５８細胞の９番染色体の典型的なコピー数プロファイルを示す。赤および青のバーは各々９ｐ２４．２−２４．３および９ｐ２１．２−２１．３のホモ接合体欠失のパターンを示す候補スポットを示している。図１Ｃは、ＨＳＣ５８を含むいくつかの胃癌細胞株を使用した、ＧＡＰＤＨ、機能的コントロール、および９ｐ２４．２−２４．３におけるホモ接合体欠失の周辺に存在する典型的な遺伝子を示すゲノミックＰＣＲ実験からのイメージを示す。ＰＬＣ：通常の末梢リンパ球。図１Ｄは、ＨＳＣ５８細胞株中でのホモ接合体欠失領域をカバーしている９ｐ２４．２−２４．３のマップを示す。アレイにスポッティングされているＢＡＣは水平な白いバーによって示されている。ＨＳＣ５８細胞中のホモ接合体欠失領域は、ゲノミックＰＣＲで決定されたものとして、水平な白い矢印として示される。この領域の周辺に存在する１３の遺伝子は、ＨＳＣ５８細胞株中でホモ接合体欠失しているか残っているかは、各々、黒あるいはグレーのバーで示され、位置と転写の方向を示している。
【図２】図２Ａは、ゲノミックＰＣＲ解析で検出された胃癌細胞株中のＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失（楔印）を示す。１：ＭＫＮ２，２：ＭＫＮ７，３：ＭＫＮ２８，４：ＭＫＮ４５，５：ＭＫＮ７４，６：ＫＡＴＯ−ＩＩＩ，７：ＯＫＡＪＩＭＡ，８：ＯＣＵＭ−１，９：ＨＳＣ３９，１０：ＨＳＣ４０Ａ，１１：ＨＳＣ４１，１２：ＨＳＣ４２，１３：ＨＳＣ４３，１４：ＨＳＣ４４ＰＥ，１５：ＨＳＣ４５，１６：ＨＳＣ５７，１７：ＨＳＣ５８，１８：ＨＳＣ６０，１９：ＨＳＣ６４，２０：ＮＵＧＣ−２，２１：ＮＵＧＣ−３，２２：ＮＵＧＣ−４，２３：ＲＥＲＦ−ＧＣ−１Ｂ，２４：ＡＺ−５２１，２５：ＳＮＵ２１６，２６：ＳＮＵ４８４，２７：ＳＮＵ６０１，２８：ＳＮＵ６３８，２９：ＳＮＵ６６８，３０：ＳＮＵ７１９，３１：ＳＨ１０１Ｐ４，および３２：Ｔａｋｉｇａｗａ。図２Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ解析で検出された、胃癌細胞株および正常な胃組織中のＶＬＤＬＲの発現を示す。楔印は図２Ａで示されたホモ接合体欠失を持つ細胞株を示す。ＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失を持たない３１細胞株のうち９株（２９．０％）がほとんど完全なこの遺伝子の抑制を示し、７株（２２．６％）が明らかに通常の胃組織と比較して減少した発現を示したことに注意すること。図２Ｃは、ＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失で、検討した３９のＬＣＭ処理したプライマリー胃癌のうち１つがゲノミックＰＣＲ解析で検出された（楔印）ことを示す。図２Ｄは、ＣＰＧＰＬＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）を使用して同定された合計４つのＣｐＧアイランドの概略図を示す。４つのｖｅｒｔｉｃａｌな閉じた矢印は各々５５１−ｂｐ、９９４−ｂｐ、２９７−ｂｐ、２７４−ｂｐのＣｐＧアイランドを示す（−４７１から＋８０；ＣｐＧ−１，＋２６９からＩＶＳ＋７９３；ＣｐＧ−２，ＩＶＳ＋８２６からＩＶＳ＋１１２２；ＣｐＧ−３，ＩＶＳ＋１１７２からＩＶＳ＋１４４５；ＣｐＧ−４）。エクソン１は開いたボックスで示され、転写開始点は＋１とマークされる。プロモーターアッセイで検討されたフラグメント（フラグメント１−３）は太い黒線で示される。ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析およびｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシングで検討された領域（ＢＳ−１およびＢＳ−２）は水平なグレーのバーで示される。最下部の矢印はＭＳＰのプライマーの位置を示す。ＣｐＧサイトは拡張された軸の垂直な目盛りで示される。
【図３】図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣｙｄ（１０μＭ）で５日間処理もしくは無処理、および／もしくはＴＳＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、ＳＮＵ６０１およびＭＫＮ７４細胞内でのＶＬＤＬＲ発現を示す、典型的なＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。図３Ｂは、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１あり、および／もしくは、なしでの領域のプロモーター活性を示す。ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃの空ベクター（モック）とＶＬＤＬＲのエキソン１の上流あるいは周辺の３つの異なる配列（フラグメント １−３）のうち１つを含むコンストラクトがＳＮＵ６０１細胞とＭＫＮ７４細胞内に導入された。ルシフェラーゼ活性は内部コントロールに対して標準化された。提示されたデータは、各々３連で行われた３つの別々の実験の平均値±ＳＥＭである。図３Ｃは、胃癌細胞株内のＨｈａＩによる消化後のＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲの典型的な結果を示す。矢印はメチル化ＣｐＧとして認識されたサイト内で特異的に制限酵素で消化されたフラグメントを示す。図３Ｄは、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇの結果を示す。ＶＬＤＬＲ発現細胞株（＋）およびＶＬＤＬＲ非発現細胞株（−）で検討した結果を示す。２つのフラグメント（ＢＳ−１およびＢＳ−２）を用いて、７１のＣｐＧサイトが全て配列決定された。各々の正方形はＣｐＧサイトを示す：白い正方形、非メチル化；黒い正方形、メチル化。
【図４】図４Ａは、胃癌細胞株のＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のＭＳＰ解析の典型的な結果を示す。数字は図２Ａに記述されている通り、各々のＧＣ細胞株を示す。非メチル化（Ｕ）およびメチル化（Ｍ）されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いて、同時に増幅反応を行った。図４Ｂは、プライマリー胃癌組織（Ｔ）および対応する非癌胃組織（Ｎ）の、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のＭＳＰ解析の典型的な結果を示す。図４Ｃは、７人のプライマリー胃癌患者の、ＨｈａＩ消化後のＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析の典型的な結果を示す。ＭＳＰ解析による腫瘍組織内でのメチル化を示している。矢印は、メチル化されたＣｐＧとして認識されたサイトで特異的に制限酵素で消化されたフラグメントを示す。図４Ｄは、ＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のメチル化状態は２つの典型的な胃癌サンプルペアのｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで決定されることを示す。Ｎ，通常組織。Ｔ，腫瘍組織。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> A method for detecting stomach cancer by detection of deletion of VLDLR gene
<130> A61300A
<160> 14
<210> 1
<211> 3646
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctctccggcc gccgccggtg cgggtgctcc gctaccggct cctctccgtt ctgtgctctc 60
ttctgctctc ggctccccac cccctctccc ttccctcctc tccccttgcc tcccctcctc 120
tgcagcgcct gcattatttt ctgcccgcag gctcggcttg cactgctgct gcagcccggg 180
gaggtggctg ggtgggtggg gaggagactg tgcaagttgt aggggagggg gtgccctctt 240
cttccccgct cccttccccc gccaactcct tcccctcctt ctcccccttt cccctccccg 300
cccccacctt cttcctcctt tcggaaggac tggtaacttg tcgtgcggag cgaacggcgg 360
cggcggcggc ggcggcggca ccatccaggc gggcaccatg ggcacgtccg cgctctgggc 420
gctctggctg ctgctcgcgc tgtgctgggc gccccgggag agcggcgcca ccggaaccgg 480
gagaaaagcc aaatgtgaac cctcccaatt ccagtgcaca aatggtcgct gtattacgct 540
gttgtggaaa tgtgatgggg atgaagactg tgttgacggc agtgatgaaa agaactgtgt 600
aaagaagacg tgtgctgaat ctgacttcgt gtgcaacaat ggccagtgtg ttcccagccg 660
atggaagtgt gatggagatc ctgactgcga agatggttca gatgaaagcc cagaacagtg 720
ccatatgaga acatgccgca tacatgaaat cagctgtggc gcccattcta ctcagtgtat 780
cccagtgtcc tggagatgtg atggtgaaaa tgattgtgac agtggagaag atgaagaaaa 840
ctgtggcaat ataacatgta gtcccgacga gttcacctgc tccagtggcc gctgcatctc 900
caggaacttt gtatgcaatg gccaggatga ctgcagcgat ggcagtgatg agctggactg 960
tgccccgcca acctgtggcg cccatgagtt ccagtgcagc acctcctcct gcatccccat 1020
cagctgggta tgcgacgatg atgcagactg ctccgaccaa tctgatgagt ccctggagca 1080
gtgtggccgt cagccagtca tacacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc 1140
tggcgagtgc atccataaga agtggcgatg tgatggggac cctgactgca aggatggcag 1200
tgatgaggtc aactgtccct ctcgaacttg ccgacctgac caatttgaat gtgaggatgg 1260
cagctgcatc catggcagca ggcagtgtaa tggtatccga gactgtgtcg atggttccga 1320
tgaagtcaac tgcaaaaatg tcaatcagtg cttgggccct ggaaaattca agtgcagaag 1380
tggagaatgc atagatatca gcaaagtatg taaccaggag caggactgca gggactggag 1440
tgatgagccc ctgaaagagt gtcatataaa cgaatgcttg gtaaataatg gtggatgttc 1500
tcatatctgc aaagacctag ttataggcta cgagtgtgac tgtgcagctg ggtttgaact 1560
gatagatagg aaaacctgtg gagatattga tgaatgccaa aatccaggaa tctgcagtca 1620
aatttgtatc aacttaaaag gcggttacaa gtgtgaatgt agtcgtggct atcaaatgga 1680
tcttgctact ggcgtgtgca aggcagtagg caaagagcca agtctgatct tcactaatcg 1740
aagagacatc aggaagattg gcttagagag gaaagaatat atccaactag ttgaacagct 1800
aagaaacact gtggctctcg atgctgacat tgctgcccag aaactattct gggccgatct 1860
aagccaaaag gctatcttca gtgcctcaat tgatgacaag gttggtagac atgttaaaat 1920
gatcgacaat gtctataatc ctgcagccat tgctgttgat tgggtgtaca agaccatcta 1980
ctggactgat gcggcttcta agactatttc agtagctacc ctagatggaa ccaagaggaa 2040
gttcctgttt aactctgact tgcgagagcc tgcctccata gctgtggacc cactgtctgg 2100
ctttgtttac tggtcagact ggggtgaacc agctaaaata gaaaaagcag gaatgaatgg 2160
attcgataga cgtccactgg tgacagcgga tatccagtgg cctaacggaa ttacacttga 2220
ccttataaaa agtcgcctct attggcttga ttctaagttg cacatgttat ccagcgtgga 2280
cttgaatggc caagatcgta ggatagtact aaagtctctg gagttcctag ctcatcctct 2340
tgcactaaca atatttgagg atcgtgtcta ctggatagat ggggaaaatg aagcagtcta 2400
tggtgccaat aaattcactg gatcagagct agccactcta gtcaacaacc tgaatgatgc 2460
ccaagacatc attgtctatc atgaacttgt acagccatca ggtaaaaatt ggtgtgaaga 2520
agacatggag aatggaggat gtgaatacct atgcctgcca gcaccacaga ttaatgatca 2580
ctctccaaaa tatacctgtt cctgtcccag tgggtacaat gtagaggaaa atggccgaga 2640
ctgtcaaagt actgcaacta ctgtgactta cagtgagaca aaagatacga acacaacaga 2700
aatttcagca actagtggac tagttcctgg agggatcaat gtgaccacag cagtatcaga 2760
ggtcagtgtt cccccaaaag ggacttctgc cgcatgggcc attcttcctc tcttgctctt 2820
agtgatggca gcagtaggtg gctacttgat gtggcggaat tggcaacaca agaacatgaa 2880
aagcatgaac tttgacaatc ctgtgtactt gaaaaccact gaagaggacc tctccataga 2940
cattggtaga cacagtgctt ctgttggaca cacgtaccca gcaatatcag ttgtaagcac 3000
agatgatgat ctagcttgac ttctgtgaca aatgttgacc tttgaggtct aaacaaataa 3060
tacccccgtc ggaatggtaa ccgagccagc agctgaagtc tctttttctt cctctcggct 3120
ggaagaacat caagatacct ttgcgtggat caagcttgtg tacttgaccg tttttatatt 3180
acttttgtaa atattcttgt ccacattcta cttcagcttt ggatgtggtt accgagtatc 3240
tgtaaccctt gaatttctag acagtattgc cacctctggc caaatatgca ctttccctag 3300
aaagccatat tccagcagtg aaacttgtgc tatagtgtat accacctgta catacattgt 3360
ataggccatc tgtaaatatc ccagagaaca atcactattc ttaagcactt tgaaaatatt 3420
tctatgtaaa ttattgtaaa ctttttcaat ggttgggaca atggcaatag gacaaaacgg 3480
gttactaaga tgaaattgcc aaaaaaattt ataaactaat tttgtacgta tgaatgatat 3540
ctttgacctc aatggaggtt tgcaaagact gagtgttcaa actactgtac attttttttc 3600
aagtgctaaa aaattaaacc aagcagctta accatgaaaa aaaaaa 3646
<210> 2
<211> 873
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Thr Ser Ala Leu Trp Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Cys
1 5 10 15
Trp Ala Pro Arg Glu Ser Gly Ala Thr Gly Thr Gly Arg Lys Ala Lys
20 25 30
Cys Glu Pro Ser Gln Phe Gln Cys Thr Asn Gly Arg Cys Ile Thr Leu
35 40 45
Leu Trp Lys Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu
50 55 60
Lys Asn Cys Val Lys Lys Thr Cys Ala Glu Ser Asp Phe Val Cys Asn
65 70 75 80
Asn Gly Gln Cys Val Pro Ser Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Pro Asp
85 90 95
Cys Glu Asp Gly Ser Asp Glu Ser Pro Glu Gln Cys His Met Arg Thr
100 105 110
Cys Arg Ile His Glu Ile Ser Cys Gly Ala His Ser Thr Gln Cys Ile
115 120 125
Pro Val Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asn Asp Cys Asp Ser Gly Glu
130 135 140
Asp Glu Glu Asn Cys Gly Asn Ile Thr Cys Ser Pro Asp Glu Phe Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ser Gly Arg Cys Ile Ser Arg Asn Phe Val Cys Asn Gly Gln
165 170 175
Asp Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Leu Asp Cys Ala Pro Pro Thr
180 185 190
Cys Gly Ala His Glu Phe Gln Cys Ser Thr Ser Ser Cys Ile Pro Ile
195 200 205
Ser Trp Val Cys Asp Asp Asp Ala Asp Cys Ser Asp Gln Ser Asp Glu
210 215 220
Ser Leu Glu Gln Cys Gly Arg Gln Pro Val Ile His Thr Lys Cys Pro
225 230 235 240
Ala Ser Glu Ile Gln Cys Gly Ser Gly Glu Cys Ile His Lys Lys Trp
245 250 255
Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn
260 265 270
Cys Pro Ser Arg Thr Cys Arg Pro Asp Gln Phe Glu Cys Glu Asp Gly
275 280 285
Ser Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Val
290 295 300
Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn Cys Lys Asn Val Asn Gln Cys Leu Gly
305 310 315 320
Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys
325 330 335
Val Cys Asn Gln Glu Gln Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu
340 345 350
Lys Glu Cys His Ile Asn Glu Cys Leu Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser
355 360 365
His Ile Cys Lys Asp Leu Val Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala
370 375 380
Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys
385 390 395 400
Gln Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gln Ile Cys Ile Asn Leu Lys Gly Gly
405 410 415
Tyr Lys Cys Glu Cys Ser Arg Gly Tyr Gln Met Asp Leu Ala Thr Gly
420 425 430
Val Cys Lys Ala Val Gly Lys Glu Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg
435 440 445
Arg Asp Ile Arg Lys Ile Gly Leu Glu Arg Lys Glu Tyr Ile Gln Leu
450 455 460
Val Glu Gln Leu Arg Asn Thr Val Ala Leu Asp Ala Asp Ile Ala Ala
465 470 475 480
Gln Lys Leu Phe Trp Ala Asp Leu Ser Gln Lys Ala Ile Phe Ser Ala
485 490 495
Ser Ile Asp Asp Lys Val Gly Arg His Val Lys Met Ile Asp Asn Val
500 505 510
Tyr Asn Pro Ala Ala Ile Ala Val Asp Trp Val Tyr Lys Thr Ile Tyr
515 520 525
Trp Thr Asp Ala Ala Ser Lys Thr Ile Ser Val Ala Thr Leu Asp Gly
530 535 540
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Phe Asn Ser Asp Leu Arg Glu Pro Ala Ser
545 550 555 560
Ile Ala Val Asp Pro Leu Ser Gly Phe Val Tyr Trp Ser Asp Trp Gly
565 570 575
Glu Pro Ala Lys Ile Glu Lys Ala Gly Met Asn Gly Phe Asp Arg Arg
580 585 590
Pro Leu Val Thr Ala Asp Ile Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp
595 600 605
Leu Ile Lys Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Asp Ser Lys Leu His Met Leu
610 615 620
Ser Ser Val Asp Leu Asn Gly Gln Asp Arg Arg Ile Val Leu Lys Ser
625 630 635 640
Leu Glu Phe Leu Ala His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg
645 650 655
Val Tyr Trp Ile Asp Gly Glu Asn Glu Ala Val Tyr Gly Ala Asn Lys
660 665 670
Phe Thr Gly Ser Glu Leu Ala Thr Leu Val Asn Asn Leu Asn Asp Ala
675 680 685
Gln Asp Ile Ile Val Tyr His Glu Leu Val Gln Pro Ser Gly Lys Asn
690 695 700
Trp Cys Glu Glu Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu
705 710 715 720
Pro Ala Pro Gln Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys
725 730 735
Pro Ser Gly Tyr Asn Val Glu Glu Asn Gly Arg Asp Cys Gln Ser Thr
740 745 750
Ala Thr Thr Val Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Thr Asn Thr Thr Glu
755 760 765
Ile Ser Ala Thr Ser Gly Leu Val Pro Gly Gly Ile Asn Val Thr Thr
770 775 780
Ala Val Ser Glu Val Ser Val Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp
785 790 795 800
Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Met Ala Ala Val Gly Gly Tyr
805 810 815
Leu Met Trp Arg Asn Trp Gln His Lys Asn Met Lys Ser Met Asn Phe
820 825 830
Asp Asn Pro Val Tyr Leu Lys Thr Thr Glu Glu Asp Leu Ser Ile Asp
835 840 845
Ile Gly Arg His Ser Ala Ser Val Gly His Thr Tyr Pro Ala Ile Ser
850 855 860
Val Val Ser Thr Asp Asp Asp Leu Ala
865 870
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
ccacagatat cagttgtaag ca 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
aaaagagact tcagctgctg g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 5
ctagtcaaca acctgaatga tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 6
aagaatggcc catgcggcag aa 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 7
gaaattgtaa gtatttttta ggtgt 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 8
tacctatcct aatttcctaa tcc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 9
ggattaggaa attaggatag gta 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 10
cccacccaac cacctccc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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gagttttagg cgaacgcgc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 12
ctcctttccc tcgacgcg 18
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 13
ttgtgagttt taggtgaatg tgt 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 14
ccctcctttc cctcaacaca 20
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ヒトＶＬＤＬＲ）遺伝子の不活性化を検出することによって胃癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ：ＧＣ）は日本では毎年１００，０００人以上が罹患し、男女比は約２：１と男性に多く、男性では１番多い癌である。年間の死亡者数は日本で約５０，０００人と全癌の１６％を占める。これまでの研究により、胃組織細胞は、細胞の分化と増殖の過程で、遺伝子の変化が連鎖的に起こり、その結果、癌化に至ると考えられている。しかし、どのような遺伝子の変化が、胃組織細胞の癌化を誘導するのかは、未だ明らかではない。従って、胃癌の検出方法並びに胃癌の悪性度の検査方法は存在しない状況である。
【０００３】
胃癌の検診には胃Ｘ線検査、胃内視鏡、血中ペプシノーゲン値、腫瘍マーカーが挙げられ、胃内視鏡（確実な診断が得られる唯一の検査）も広く行われている。しかしながら、これら多くは、画像診断や早期診断のためのツールであり、癌の確定診断やタイピング、進行度の判定、転移の有無を判定する方法ではない。
【０００４】
また、遺伝子に着目した胃癌の検出方法としては、例えば、特許文献１に記載の方法が知られている。しかし、この方法は遺伝子の発現プロファイルの変化に着目したものである。遺伝子の発現プロファイルの測定とは、複数のｍＲＮＡ量の測定である。ｍＲＮＡは非常に不安定で分解しやすく、また発現のダイナミックレンジも大きいため、マイクロアレイ等による測定の再現性が悪い。このため、より安定で再現性の高い手法が求められてきた。
【０００５】
ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）は、ゲノム上での遺伝子の増幅を検出するためには、感度が高く効率の良い方法である。本発明者らは、このＣＧＨアレイ法を用いて胃癌細胞で増幅する遺伝子群、すなわち、クロモソーム２ｐ２４．１で増幅しているＳＤＣ１遺伝子、クロモソーム２ｐ２３．３で増幅するＤＮＭＴ３Ａ遺伝子、クロモソーム３ｐ２２．３で増幅するＭＬＨ１遺伝子、クロモソーム３ｐ２２．１で増幅するＣＴＮＮＢ１遺伝子等を同定した（非特許文献１）。
【０００６】
一般的に癌化の遺伝子レベルでの機構として、上記のような複数遺伝子の増幅と共に癌抑制遺伝子の欠失が報告されているが、特定の遺伝子の欠失の同定は、ポジショナルクローニング等の通常の方法を用いた場合、大変な時間と労力がかかり、目的とする遺伝子を見出すことは困難である。また、ＣＧＨ法においても、５−１０Ｍｂより小さいサイズのゲノムＤＮＡの欠失は、通常のメタフェーズクロモソームを用いた方法では検出が困難であった（非特許文献２及び３）。例えば、ＤＰＣ４／ＳＭＡＤ４、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ｐ１６−ＩＮＫ４Ａ、ＲＡＳＳＦ１等の癌抑制遺伝子は、染色体のマッピング法によりホモ接合体欠失領域を狭めて行き、最終的に目的とする癌抑制遺伝子が同定された。
【０００７】
【非特許文献１】Takada H, Imoto I, Tsuda H, Sonoda I, Ichikura T, Mochizuki H, Okanoue T, Inazawa J. : Screening of DNA copy-number aberrations in gastric cancer cell lines by array-based comparative genomic hybridization. Cancer Sci. 2005 Feb;96(2):100-10
【非特許文献２】Bentz,M.,Plesch,A.,Stilgenbauer,S.,Dohner,H.&Lichter,P.:Minimal sizes of deletions detected by comparative genomichybridization, Genes Chromosomes Cancer,, 172-175, 1998
【非特許文献３】Kirchhoff,M., Gerdes,T., Maahr,J., Rose,H., Bentz,M., Dohner,H. & Lundsteen,C.: Deletions below 10megabase pairs are detected in comparative genomic hybridization by standard reference intervas, Genes Chromosomes Cancer,, 410-413, 1999
【特許文献１】特表２００５−５１４０５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新たな胃癌関連遺伝子を見出して、該癌関連遺伝子の不活性化を検出することによって、より安定で再現性の高い胃癌の検出方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はまた、遺伝子レベルにおける胃組織細胞の癌化の早期発見や胃癌の悪性度の診断を行う方法、さらに、当該メカニズムに基づく抗癌物質の選別を行う方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはＣＧＨ法の感度と精度を上げ、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔな方法を開発し、ＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ／ＰＡＣＤＮＡを選別することにより、胃組織細胞の癌化を抑制する癌抑制遺伝子、すなわち、ヒトＶｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＬＤＬＲ）遺伝子（以下、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ともいう）の同定に成功した。そして、胃組織細胞の癌化を惹き起こす、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化の原因まで突っ込んだ解明を行い、当該遺伝子の不活性化が、（１）当該遺伝子の欠失、及び（２）当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化により惹き起こされることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを用いて当該遺伝子の不活性化を検出する。
【００１２】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化は、当該遺伝子の欠失による不活性化である。さらに好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失は、当該遺伝子のホモ接合体欠失である。
【００１３】
好ましくは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化は、当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である。
【００１４】
好ましくは、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、または、ＣＧＨ法を用いて胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、胃組織細胞検体における癌化の兆候、癌の進行度や悪性度を的確に把握することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による胃癌の検出方法は、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを特徴とする。
【００１７】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する対象となる胃組織細胞は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。この検体組織細胞は、健常人の胃組織細胞か、胃癌患者の当該癌組織であるかを問わないが、現実的には、（１）内視鏡検査等の結果、胃組織に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織、または、（２）胃癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある胃癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１８】
本発明の検出方法により、「内視鏡検査等の結果、胃組織に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織」におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が認められた場合には、当該病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。また、「胃癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある胃癌の組織」におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が認められた場合にも、当該癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。検体として採取された胃組織細胞組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製を行い、本発明の検出方法を行う対象とすることができる。
【００１９】
本発明の検出方法は、上述したように、胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより、当該細胞の癌化（特に、癌化のイニシエーション）を特定することが可能である。このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化の態様としては、（１）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失、または、（２）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が欠失していない場合における遺伝子の発現量の低下が挙げられる。
【００２０】
（１）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失
このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失の検出を直接的に行うことができる代表的方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡまたはＰＡＣ（Ｐｈａｇｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨを行うと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失部分を検出することができる。具体的に、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ−１１−６７１Ｆ１６， ＲＰ１１−３２０Ｅ１６， ＲＰ１１−５７８Ｍ２， ＲＰ１１−７１９Ｍ６， ＲＰ１１−９４１Ｄ２３を挙げることができる。
【００２１】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いて行うことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００２２】
通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。
【００２３】
アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列部分を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを、検出用プローブとして用いることもできる。
【００２４】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス、プラスチック、メンブレン、３次元アレイ等があげられ、スライドガラス等のガラス基板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２５】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ／μｌ〜５μｇ／μｌ、より好ましくは１ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或いはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２６】
乾燥スポットの調製は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェト式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが好ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２７】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２８】
また、このヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。なお、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列はそれぞれ公知であり、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
【００２９】
（２）ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が欠失していない場合における遺伝子の発現量の低下
この態様の方法は、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を基とする、ポリヌクレオチド量またはヒトＶＬＤＬＲ蛋白質量を定量し、この定量値を指標にして、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の低下を検出することができる。上記ポリヌクレオチドとしては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、これを鋳型として得られるｃＤＮＡを挙げることができる。
【００３０】
なお、常法によりヒトＶＬＤＬＲ蛋白質に対する抗体を調製する等して、これを用いて検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質量を定量して、上記の定量値を求めることができるが、本発明の検出方法における検出対象は、遺伝子の発現量の「低下」であり、このようなネガティブな検出における指標を蛋白質量とすることは、バックグラウンドの存在等の問題を解決しなければならず、効率的とはいえない面がある。よって、この態様の方法における検出手段としては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を基とする、ポリヌクレオチド量の検出方法を用いることが好適である。このポリヌクレオチド量の検出方法としては、例えば、下記の手段を例示することができる。
【００３１】
最も典型的な態様は、検体における、ヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡを検出することにより、間接的に検体において存在するｍＲＮＡを検出して、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子が発現している程度を把握する検出方法である（以下、この態様の検出手段を、ＶＬＤＬＲｍＲＮＡ検出方法ともいう。この態様の検出方法には、下記のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が含まれる）。
【００３２】
ＶＬＤＬＲｍＲＮＡ検出方法では、典型的には、公知の方法（例えば、オリゴｄＴを用いる方法）に従い、検体の全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを選別する。そして、得られたｍＲＮＡから、既知のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の塩基配列に対応するヌクレオチド鎖を、増幅用プライマーとして用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、ｍＲＮＡを鋳型として遺伝子を増幅することが可能な遺伝子増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒトＶＬＤＬＲ蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅し、かかる遺伝子増幅操作による増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、好適にはリアルタイムに検出することができる。
【００３３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００３４】
なお、上記のようにして増幅されたヒトＶＬＤＬＲ蛋白質をコードするｃＤＮＡを鋳型として、さらにＰＣＲ法等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる遺伝子増幅操作を施し、これによる遺伝子増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体におけるヒトＶＬＤＬＲ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、一層正確に検出することができる（この２回目の遺伝子増幅操作において用いる遺伝子増幅用プライマーは、１回目の遺伝子増幅操作において用いられた遺伝子増幅用プライマーよりも、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の内側に対応するヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅用プライマーとして用いる必要がある）。
【００３５】
ＤＮＡチップ法は、検体細胞で発現しているｍＲＮＡを定量する方法の一つである。例えば、基盤（上述したＣＧＨ法で用いられ得る基盤と実質的に同一）上に、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の特徴的な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを固定し（ｃＤＮＡを固定することもできる）、検体から調製したＲＮＡをリバーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成する時に標識を行う。本標識ｃＤＮＡと基盤上の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、結合した標識の量をスキャンすることによりｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
【００３６】
ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを、分離して固定し、これと、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の特徴的な配列を有する合成オリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡを用いることもできる）とのハイブリダイズを検出することにより、検体中のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現を検出する方法である。
【００３７】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失以外の原因で、当該遺伝子の発現量が減少する主な原因としては、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化が挙げられる。以下に、この要因について簡単に説明する。
【００３８】
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活化がおこることが報告されている（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．＆Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂｅｌｔｓ， ｂｒａｃｅｓ， ａｎｄｃｈｒｏｍａｔｉｎ， Ｃｅｌｌ， ４５１−４５４， １９９９）。癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは、ヒト癌での癌抑制遺伝子の不活化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ．， Ｊｉａｎｇ，Ｇ．， Ｆｉａｌａ，Ｅ．， Ｄｏｍｅ，Ｊ．Ｓ．， Ｙｕ，Ｍ．Ｃ．， Ｌｏｎｇ，Ｔ．Ｉ．， Ｙｏｕｎ，Ｂ．， Ｓｏｈｎ，Ｏ．Ｓ．， Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒ，Ｍ．， Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．， Ｃｈｉｎｔａｇｕｍｐａｌａ，Ｍ．， Ｃｈａｍｐａｇｎｅ，Ｍ．， Ｐａｒｈａｍ，Ｄ．， Ｌｉａｎｇ，Ｇ．， Ｍａｌｉｋ，Ｋ． ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ． ： Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒｓ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，， ６６９４−６７０２， ２００２）。
【００３９】
後述するように、実際、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１の一部とその上流領域に存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有することが判明した。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の胃癌細胞でのヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現の抑制と強く相関していた。そして、胃癌細胞を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果より、ＣｐＧアイランドの高密度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が胃癌細胞における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度でおこす原因の一つであることが判明した。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
［実施例１］
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのゲノムデータベースウエブサイト並びに選択されたＤＮＡのＢＬＡＳＴ検索の結果から癌化並びに癌細胞の増殖に極めて重要な遺伝子或いはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅマーカーを有する８００種類のＢＡＣ／ＰＡＣクローンを選択した。
【００４２】
ＢＡＣ及びＰＡＣ ＤＮＡをＤｐｎＩ、ＲｓａＩ、ＨａｅＩＩＩで消化し、その後アダプターＤＮＡとのライゲーションを行った。次に、アダプターの配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを２回行った。２本のプライマーの一方には５’末端がアミノ化されている。このプロセスを無尽蔵化と言い、得られたＤＮＡを無尽蔵化ＤＮＡと定義する。無尽蔵化ＤＮＡをインクジェットタイプのスポッター（ＧＥＮＥＳＨＯＴ、ＮＧＫＩｎｓｕｌａｔｏｒｓ、名古屋）を使用してＤｕｐｌｉｃａｔｅにオリゴＤＮＡマイクロアレイ（マツナミガラス、大阪）に共有結合でプリントした。
【００４３】
［実施例２］
胃癌での新規なホモ接合体欠失を検出するために、３２種類の胃癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、実施例１のＣＧＨアレイを使用したＣＧＨアレイ解析を行った。
【００４４】
なお、対照として男性の健常人ゲノムＤＮＡを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして上記胃癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ及び０．４ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（胃癌細胞）或いは０．４ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ニックトランスレーションにより標識した。Ｃｙ３並びにＣｙ５標識ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（東京）より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ、２ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーにセットしたＣＧＨアレイ上に加え、３７℃で３ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）のスピードで振とうしながら４８−７２時間インキュベーションを行った。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄し、さらに、０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて室温で１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ４．１イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３／Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上の時にゲノムの増幅があり、４以上の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。
【００４５】
その結果、胃癌（ＨＳＣ５８）細胞でクロモソーム９ｐ２４．２に存在するヒトＶＬＤＬＲの遺伝子が欠失していることが判った。このときのＬｏｇ２Ｒａｔｉｏは−２．６３であった［図１Ａ：被検細胞としてＨＳＣ５８のゲノムＤＮＡを用いて、実施例１に示したＣＧＨアレイ上でＣＧＨ解析を行った時の代表的なアレイイメージである。クロモソーム９ｐ２４．２−２４．３におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子コピー数の減少は明確なシグナル（Ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝−２．６３）で示される（右拡大図中の矢印で示す）。］。
【００４６】
他の細胞種について検討を進めた所、３１種類の胃癌細胞中で［図２Ａは、胃癌細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失の検出を表している。ＰＬＣは健常者由来のＤＮＡを用いた結果を示す。ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌ ｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子のＰＣＲは対照として用いた。］、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失は見出せなかった。さらに、Ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）を行ったプライマリー胃癌では３９サンプル中の１サンプル［図２Ｃの楔印で示す。図２Ｃは、Ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）−処理プライマリー胃癌におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失を示している。楔印はホモ接合体欠失を検出した細胞種を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲは対照として用いた。］について、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失が検出された。
【００４７】
［実施例３］
胃癌細胞において、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の配列から各々２種類のプライマーを設計し、両領域に由来するｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で検出した。
【００４８】
その結果、ホモ接合体欠失の起こっている細胞株でｍＲＮＡを検出できなかった。さらに、ホモ接合体欠失の起こっていない３２細胞株の中の９細胞株ではＲＴ-ＰＣＲ産物を検出できず、７細胞株では明らかに通常の胃組織と比較して発現の低下を示していた［図２Ｂ ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出された胃癌細胞のヒトＶＬＤＬＲの発現を示している。図２Ａに矢印で表示したホモ接合体欠失を示す細胞種に同様に矢印をつけた。ホモ接合体欠失を示さない３１細胞種の中で９細胞種について、ヒトＶＬＤＬＲ ｍＲＮＡ発現が頻度２９．０％で消失し、頻度２２．６％で発現低下していた。］。従って、ヒトＶＬＤＬＲ ｍＲＮＡを検出できない理由はゲノム上での遺伝子欠失に加えて他のメカニズムが考えられるので、さらにその検討を行った。
【００４９】
［実施例４］
ＣｐＧアイランドのメチル化は遺伝子発現を抑制するメカニズムの１つである。ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドをＣｐＧＰＬＯＴを用いて解析した結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエキソン１の周辺に４断片を同定した。本領域中のＣｐＧ部位並びにＣｐＧ部位が密集して存在するＣｐＧアイランドを表示した［図２Ｄ：ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１周辺のＣｐＧアイランドの図解マップである。エクソン１を白抜きボックスで表示し、転写開始点を＋１で示した。ＣｐＧアイランドはＣｐＧＰＬＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）により同定し、水平矢印で示した。ＣｐＧアイランドはヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の−５１４から＋１９１４までから構成される。プロモーターアッセイにより解析した領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ１から３まで）、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析を行った領域、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスを行った領域を水平の線で示した。］。
【００５０】
ここで同定したヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドのプロモーター活性を調べるために、このＣｐＧアイランドの周辺を含めて３つの断片（図２Ｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ １−３）に分けそれらの断片をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に挿入し、ＳＮＵ６０１細胞並びにＭＫ７０４細胞を、一過性にｐＲＬ−ｈＴＫ内部標準ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にコトランスフェクションした。用いたレポーターアッセイ系は、ホタルルシフェラーゼ酵素のメッセンジャーＲＮＡが発現し、タンパクに変換されて活性のある酵素として働くことによる発光物を測定する方法によった。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を下流域に配置しＶＬＤＬＲ遺伝子ｆｒａｇｍｅｎｔ１から３をプロモーター解析領域として含むコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）についてＶＬＤＬＲ遺伝子の発現がみられないＳＮＵ６０１、ＭＫ７０４細胞に導入しその酵素活性を測定した（図３Ｂ）。ｆｒａｇｍｅｎｔ２が両細胞共に高いルシフェラーゼ酵素活性を示したことから、ＶＬＤＬＲ遺伝子の転写活性化領域の基本単位は、ｆｒａｇｍｅｎｔ２にあることが判明した。
【００５１】
遺伝子変異の検出法として亜硫酸水素ナトリウムの処理の有無で、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換するがメチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。これを鋳型としたＰＣＲ検出を行いメチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて、変化したシトシンと非メチル化シトシン由来増幅ＤＮＡ産物における配列の違いを制限酵素切断の有無により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ法と制限酵素切断法を組み合わせた実験法）。そこで、ＶＬＤＬＲ遺伝子のエクソン１近傍のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した（図３Ｃ）。ＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の低いＭＫＮ２８，ＭＫＮ７４，ＫＡＴＯ−ＩＩＩ，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ６３８およびＳＮＵ７１９細胞株では制限酵素ＨｈａＩの切断部位が存在することにより３本の切断ＤＮＡが電気泳動上観察された（矢印）。一方、ＶＬＤＬＲ遺伝子の発現がみられるＭＫＮ４５，ＨＳＣ４１，ＮＵＧＣ−３、ＡＺ−５２１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ４８４およびＳＨ１０１Ｐ４ではメチル化に依存した制限酵素切断点が発生しないため、電気泳動上単一バンドを示した（Ｍ）。
【００５２】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランド内の各ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化度をＢｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法により解析した。その結果、ホモ接合体欠失の認められない細胞（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）では、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドはメチル化度が特に高く、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現している細胞（ＡＺ−５２１）ではメチル化されていなかった［図３Ｄは、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのＢｉｓｕｌｆｉｔｅゲノムシーケンスを示している。転写開始点を＋１で表示するとＣｐＧアイランドは＋４７１から＋１９１４までを占める。この領域には７１ヶ所のＣｐＧ部位がありそれを升目で表した。白抜き升目はメチル化されていないＣｐＧ部位で、黒塗り升目はメチル化されたＣｐＧ部位である。使用した細胞はヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（＋）と表示）のＡＺ−５２１、並びにヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現していない細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（−）と表示）のＳＮＵ６０１及びＭＫＮ７４である。］。従って、胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のホモ接合体欠失のある場合と、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のＣｐＧアイランドが高度にメチル化されている場合にはヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現は検出されないか或いは非常に低いことが判った。この２つのケースより、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現と胃組織細胞の癌化との関係が強く示唆される。
【００５３】
［実施例５］
これまで、胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化を解析してきたが、実際に胃癌組織でも同様な現象が起こっているかどうかを検討した。その結果、プライマリー胃癌７例で、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化が起こっていることが判明した［図４Ｃは、プライマリー胃癌のヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのＣＯＢＲＡ解析を示している。Ｎは非癌胃組織、Ｔはプライマリー胃癌組織を示す］。以上の結果より、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化による、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活化は胃組織細胞の癌化に重要な役割を示すと推定される。
【００５４】
［実施例６］
胃癌細胞でヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドを脱メチル化したときのヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現を検討した。具体的には、胃癌細胞をメチル転移酵素阻害剤である各種濃度の５−ａｚａ−ｄＣ存在下で５日間処理したときのヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡ誘導能を測定した。その結果、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子欠失はないがヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡが検出されない細胞では５−ａｚａ−ｄＣ処理を行なうことにより、ヒトＶＬＤＬＲｍＲＮＡ誘導能が見出された［図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣ存在下並びに不在下での胃癌細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子発現解析を示している。ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を増幅するための２種類の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動の結果得られたバンドを示した。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。鋳型に使用したゲノムはホモ接合体欠失の認められないヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を発現しない細胞種（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）を５−ａｚａ−ｄＣ存在下並びに不在下で５日間培養した後に調製した。］。
【００５５】
［実施例７］
ＣｐＧアイランドのメチル化に伴う遺伝子発現抑制はゲノムの染色体構造を変化させることに起因することが明らかになってきた。同様にゲノムと相互作用するヒストン蛋白質の低アセチル化もゲノム構造を変化させ、遺伝子発現に影響を与える。今回、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）とメチル基転移酵素阻害剤である５−ａｚａ−ｄＣを用いてＣｐＧメチル化とヒストンアセチル化の関連を検討した。
【００５６】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子ＣｐＧアイランドが密にメチル化されているＳＮＵ６０１およびＭＫＮ７４細胞を、ＴＳＡ存在下でインキュベーションしたところ、ＴＳＡ不在下と発現量に変化はなかった［図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣ及びＴＳＡ存在下で培養した後の、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子非発現胃癌細胞（ＳＮＵ６０１，ＭＫＮ７４）におけるＶＬＤＬＲｍＲＮＡの発現を示している。両細胞を５−ａｚａ−ｄＣ存在下で５日間、ＴＳＡ存在下或いは５−ａｚａ−ｄＣとＴＳＡ共存下で１２時間培養した。それぞれの細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を増幅するための２種類の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動の結果得られたバンドを示した。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。］。両細胞とも、ＴＳＡと５−ａｚａ−ｄＣ共在下でインキュベーションしても、特にヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現の変化は認められなかった。この結果は、ＣｐＧアイランドのメチル化のみがヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の発現に影響を与え、染色体高次構造の変化には関連がないことを示唆している
【００５７】
［実施例８］
プロモーター領域のメチル化検出法について、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換することが可能であるが、この被検ＤＮＡに対し亜硫酸水素ナトリウムの処理後変化した部位のウラシルに対応するプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、特定部位のメチル化の検出を行うことが可能である（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ法： ＭＳＰ）。この方法を利用して胃癌細胞株、さらに臨床サンプル由来の隣接正常組織、癌組織から得られたサンプルについて図２Ｄに表示したＭＳＰプライマーを用いて解析した（図４Ａおよび図４Ｂ； Ｕ：非メチル化、Ｍ：メチル化、Ｎ：正常部位、Ｔ：腫瘍部位）。胃癌細胞株ではＶＬＤＬＲ遺伝子の発現のないＭＫＮ７４（Ｎｏ．５），ＳＮＵ６０１（Ｎｏ．２７）両株のプロモーター部位がメチル化したＭＳＰ法での結果となり、ＶＬＤＬＲ遺伝子が発現するＡＺ−５２１（Ｎｏ．２４）細胞ではメチル化されていないという予想どおりの結果が得られた。臨床からの癌組織からのＭＳＰ法によるメチル化解析では、２０サンプル中７サンプルに関してメチル化が検出された。また癌組織ならびに隣接正常部位が解析可能であった７サンプル中５サンプルで癌組織で癌部位特異的にメチル化が検出され、隣接正常部位ではメチル化が検出されない結果となった。このメチル化の差異が検出されたもの（１７，２１）を用いて、さらにＶＬＤＬＲ遺伝子ＢＳ−２領域（図２Ｄ参照）についてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてメチル化を解析した（図４Ｄ）。メチル化の差異が検出された癌１７，２１では予想どおりメチル化が観察された（メチル化している部位は黒で表示した）。
【００５８】
上記の各実施例で使用したプライマー配列とPCR条件を以下の表１に記載する。
【００５９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１Ａは、ＨＳＣ５８細胞株の典型的な二連のアレイＣＧＨイメージを示す。ＲＰ１１−４８Ｍ１７の９ｐ２４．２−２４．３のコピー数の比（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）の著しい減少が明確な赤いシグナルとして検出された。図１Ｂは、ＨＳＣ５８細胞の９番染色体の典型的なコピー数プロファイルを示す。赤および青のバーは各々９ｐ２４．２−２４．３および９ｐ２１．２−２１．３のホモ接合体欠失のパターンを示す候補スポットを示している。図１Ｃは、ＨＳＣ５８を含むいくつかの胃癌細胞株を使用した、ＧＡＰＤＨ、機能的コントロール、および９ｐ２４．２−２４．３におけるホモ接合体欠失の周辺に存在する典型的な遺伝子を示すゲノミックＰＣＲ実験からのイメージを示す。ＰＬＣ：通常の末梢リンパ球。図１Ｄは、ＨＳＣ５８細胞株中でのホモ接合体欠失領域をカバーしている９ｐ２４．２−２４．３のマップを示す。アレイにスポッティングされているＢＡＣは水平な白いバーによって示されている。ＨＳＣ５８細胞中のホモ接合体欠失領域は、ゲノミックＰＣＲで決定されたものとして、水平な白い矢印として示される。この領域の周辺に存在する１３の遺伝子は、ＨＳＣ５８細胞株中でホモ接合体欠失しているか残っているかは、各々、黒あるいはグレーのバーで示され、位置と転写の方向を示している。
【図２】図２Ａは、ゲノミックＰＣＲ解析で検出された胃癌細胞株中のＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失（楔印）を示す。１：ＭＫＮ２，２：ＭＫＮ７，３：ＭＫＮ２８，４：ＭＫＮ４５，５：ＭＫＮ７４，６：ＫＡＴＯ−ＩＩＩ，７：ＯＫＡＪＩＭＡ，８：ＯＣＵＭ−１，９：ＨＳＣ３９，１０：ＨＳＣ４０Ａ，１１：ＨＳＣ４１，１２：ＨＳＣ４２，１３：ＨＳＣ４３，１４：ＨＳＣ４４ＰＥ，１５：ＨＳＣ４５，１６：ＨＳＣ５７，１７：ＨＳＣ５８，１８：ＨＳＣ６０，１９：ＨＳＣ６４，２０：ＮＵＧＣ−２，２１：ＮＵＧＣ−３，２２：ＮＵＧＣ−４，２３：ＲＥＲＦ−ＧＣ−１Ｂ，２４：ＡＺ−５２１，２５：ＳＮＵ２１６，２６：ＳＮＵ４８４，２７：ＳＮＵ６０１，２８：ＳＮＵ６３８，２９：ＳＮＵ６６８，３０：ＳＮＵ７１９，３１：ＳＨ１０１Ｐ４，および３２：Ｔａｋｉｇａｗａ。図２Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ解析で検出された、胃癌細胞株および正常な胃組織中のＶＬＤＬＲの発現を示す。楔印は図２Ａで示されたホモ接合体欠失を持つ細胞株を示す。ＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失を持たない３１細胞株のうち９株（２９．０％）がほとんど完全なこの遺伝子の抑制を示し、７株（２２．６％）が明らかに通常の胃組織と比較して減少した発現を示したことに注意すること。図２Ｃは、ＶＬＤＬＲのホモ接合体欠失で、検討した３９のＬＣＭ処理したプライマリー胃癌のうち１つがゲノミックＰＣＲ解析で検出された（楔印）ことを示す。図２Ｄは、ＣＰＧＰＬＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）を使用して同定された合計４つのＣｐＧアイランドの概略図を示す。４つのｖｅｒｔｉｃａｌな閉じた矢印は各々５５１−ｂｐ、９９４−ｂｐ、２９７−ｂｐ、２７４−ｂｐのＣｐＧアイランドを示す（−４７１から＋８０；ＣｐＧ−１，＋２６９からＩＶＳ＋７９３；ＣｐＧ−２，ＩＶＳ＋８２６からＩＶＳ＋１１２２；ＣｐＧ−３，ＩＶＳ＋１１７２からＩＶＳ＋１４４５；ＣｐＧ−４）。エクソン１は開いたボックスで示され、転写開始点は＋１とマークされる。プロモーターアッセイで検討されたフラグメント（フラグメント１−３）は太い黒線で示される。ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析およびｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシングで検討された領域（ＢＳ−１およびＢＳ−２）は水平なグレーのバーで示される。最下部の矢印はＭＳＰのプライマーの位置を示す。ＣｐＧサイトは拡張された軸の垂直な目盛りで示される。
【図３】図３Ａは、５−ａｚａ−ｄＣｙｄ（１０μＭ）で５日間処理もしくは無処理、および／もしくはＴＳＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、ＳＮＵ６０１およびＭＫＮ７４細胞内でのＶＬＤＬＲ発現を示す、典型的なＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。図３Ｂは、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１あり、および／もしくは、なしでの領域のプロモーター活性を示す。ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃの空ベクター（モック）とＶＬＤＬＲのエキソン１の上流あるいは周辺の３つの異なる配列（フラグメント １−３）のうち１つを含むコンストラクトがＳＮＵ６０１細胞とＭＫＮ７４細胞内に導入された。ルシフェラーゼ活性は内部コントロールに対して標準化された。提示されたデータは、各々３連で行われた３つの別々の実験の平均値±ＳＥＭである。図３Ｃは、胃癌細胞株内のＨｈａＩによる消化後のＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲの典型的な結果を示す。矢印はメチル化ＣｐＧとして認識されたサイト内で特異的に制限酵素で消化されたフラグメントを示す。図３Ｄは、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇの結果を示す。ＶＬＤＬＲ発現細胞株（＋）およびＶＬＤＬＲ非発現細胞株（−）で検討した結果を示す。２つのフラグメント（ＢＳ−１およびＢＳ−２）を用いて、７１のＣｐＧサイトが全て配列決定された。各々の正方形はＣｐＧサイトを示す：白い正方形、非メチル化；黒い正方形、メチル化。
【図４】図４Ａは、胃癌細胞株のＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のＭＳＰ解析の典型的な結果を示す。数字は図２Ａに記述されている通り、各々のＧＣ細胞株を示す。非メチル化（Ｕ）およびメチル化（Ｍ）されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いて、同時に増幅反応を行った。図４Ｂは、プライマリー胃癌組織（Ｔ）および対応する非癌胃組織（Ｎ）の、ＶＬＤＬＲ ＣｐＧ−１のＭＳＰ解析の典型的な結果を示す。図４Ｃは、７人のプライマリー胃癌患者の、ＨｈａＩ消化後のＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ解析の典型的な結果を示す。ＭＳＰ解析による腫瘍組織内でのメチル化を示している。矢印は、メチル化されたＣｐＧとして認識されたサイトで特異的に制限酵素で消化されたフラグメントを示す。図４Ｄは、ＶＬＤＬＲ ＢＳ−２のメチル化状態は２つの典型的な胃癌サンプルペアのｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで決定されることを示す。Ｎ，通常組織。Ｔ，腫瘍組織。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> A method for detecting stomach cancer by detection of deletion of VLDLR gene
<130> A61300A
<160> 14
<210> 1
<211> 3646
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctctccggcc gccgccggtg cgggtgctcc gctaccggct cctctccgtt ctgtgctctc 60
ttctgctctc ggctccccac cccctctccc ttccctcctc tccccttgcc tcccctcctc 120
tgcagcgcct gcattatttt ctgcccgcag gctcggcttg cactgctgct gcagcccggg 180
gaggtggctg ggtgggtggg gaggagactg tgcaagttgt aggggagggg gtgccctctt 240
cttccccgct cccttccccc gccaactcct tcccctcctt ctcccccttt cccctccccg 300
cccccacctt cttcctcctt tcggaaggac tggtaacttg tcgtgcggag cgaacggcgg 360
cggcggcggc ggcggcggca ccatccaggc gggcaccatg ggcacgtccg cgctctgggc 420
gctctggctg ctgctcgcgc tgtgctgggc gccccgggag agcggcgcca ccggaaccgg 480
gagaaaagcc aaatgtgaac cctcccaatt ccagtgcaca aatggtcgct gtattacgct 540
gttgtggaaa tgtgatgggg atgaagactg tgttgacggc agtgatgaaa agaactgtgt 600
aaagaagacg tgtgctgaat ctgacttcgt gtgcaacaat ggccagtgtg ttcccagccg 660
atggaagtgt gatggagatc ctgactgcga agatggttca gatgaaagcc cagaacagtg 720
ccatatgaga acatgccgca tacatgaaat cagctgtggc gcccattcta ctcagtgtat 780
cccagtgtcc tggagatgtg atggtgaaaa tgattgtgac agtggagaag atgaagaaaa 840
ctgtggcaat ataacatgta gtcccgacga gttcacctgc tccagtggcc gctgcatctc 900
caggaacttt gtatgcaatg gccaggatga ctgcagcgat ggcagtgatg agctggactg 960
tgccccgcca acctgtggcg cccatgagtt ccagtgcagc acctcctcct gcatccccat 1020
cagctgggta tgcgacgatg atgcagactg ctccgaccaa tctgatgagt ccctggagca 1080
gtgtggccgt cagccagtca tacacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc 1140
tggcgagtgc atccataaga agtggcgatg tgatggggac cctgactgca aggatggcag 1200
tgatgaggtc aactgtccct ctcgaacttg ccgacctgac caatttgaat gtgaggatgg 1260
cagctgcatc catggcagca ggcagtgtaa tggtatccga gactgtgtcg atggttccga 1320
tgaagtcaac tgcaaaaatg tcaatcagtg cttgggccct ggaaaattca agtgcagaag 1380
tggagaatgc atagatatca gcaaagtatg taaccaggag caggactgca gggactggag 1440
tgatgagccc ctgaaagagt gtcatataaa cgaatgcttg gtaaataatg gtggatgttc 1500
tcatatctgc aaagacctag ttataggcta cgagtgtgac tgtgcagctg ggtttgaact 1560
gatagatagg aaaacctgtg gagatattga tgaatgccaa aatccaggaa tctgcagtca 1620
aatttgtatc aacttaaaag gcggttacaa gtgtgaatgt agtcgtggct atcaaatgga 1680
tcttgctact ggcgtgtgca aggcagtagg caaagagcca agtctgatct tcactaatcg 1740
aagagacatc aggaagattg gcttagagag gaaagaatat atccaactag ttgaacagct 1800
aagaaacact gtggctctcg atgctgacat tgctgcccag aaactattct gggccgatct 1860
aagccaaaag gctatcttca gtgcctcaat tgatgacaag gttggtagac atgttaaaat 1920
gatcgacaat gtctataatc ctgcagccat tgctgttgat tgggtgtaca agaccatcta 1980
ctggactgat gcggcttcta agactatttc agtagctacc ctagatggaa ccaagaggaa 2040
gttcctgttt aactctgact tgcgagagcc tgcctccata gctgtggacc cactgtctgg 2100
ctttgtttac tggtcagact ggggtgaacc agctaaaata gaaaaagcag gaatgaatgg 2160
attcgataga cgtccactgg tgacagcgga tatccagtgg cctaacggaa ttacacttga 2220
ccttataaaa agtcgcctct attggcttga ttctaagttg cacatgttat ccagcgtgga 2280
cttgaatggc caagatcgta ggatagtact aaagtctctg gagttcctag ctcatcctct 2340
tgcactaaca atatttgagg atcgtgtcta ctggatagat ggggaaaatg aagcagtcta 2400
tggtgccaat aaattcactg gatcagagct agccactcta gtcaacaacc tgaatgatgc 2460
ccaagacatc attgtctatc atgaacttgt acagccatca ggtaaaaatt ggtgtgaaga 2520
agacatggag aatggaggat gtgaatacct atgcctgcca gcaccacaga ttaatgatca 2580
ctctccaaaa tatacctgtt cctgtcccag tgggtacaat gtagaggaaa atggccgaga 2640
ctgtcaaagt actgcaacta ctgtgactta cagtgagaca aaagatacga acacaacaga 2700
aatttcagca actagtggac tagttcctgg agggatcaat gtgaccacag cagtatcaga 2760
ggtcagtgtt cccccaaaag ggacttctgc cgcatgggcc attcttcctc tcttgctctt 2820
agtgatggca gcagtaggtg gctacttgat gtggcggaat tggcaacaca agaacatgaa 2880
aagcatgaac tttgacaatc ctgtgtactt gaaaaccact gaagaggacc tctccataga 2940
cattggtaga cacagtgctt ctgttggaca cacgtaccca gcaatatcag ttgtaagcac 3000
agatgatgat ctagcttgac ttctgtgaca aatgttgacc tttgaggtct aaacaaataa 3060
tacccccgtc ggaatggtaa ccgagccagc agctgaagtc tctttttctt cctctcggct 3120
ggaagaacat caagatacct ttgcgtggat caagcttgtg tacttgaccg tttttatatt 3180
acttttgtaa atattcttgt ccacattcta cttcagcttt ggatgtggtt accgagtatc 3240
tgtaaccctt gaatttctag acagtattgc cacctctggc caaatatgca ctttccctag 3300
aaagccatat tccagcagtg aaacttgtgc tatagtgtat accacctgta catacattgt 3360
ataggccatc tgtaaatatc ccagagaaca atcactattc ttaagcactt tgaaaatatt 3420
tctatgtaaa ttattgtaaa ctttttcaat ggttgggaca atggcaatag gacaaaacgg 3480
gttactaaga tgaaattgcc aaaaaaattt ataaactaat tttgtacgta tgaatgatat 3540
ctttgacctc aatggaggtt tgcaaagact gagtgttcaa actactgtac attttttttc 3600
aagtgctaaa aaattaaacc aagcagctta accatgaaaa aaaaaa 3646
<210> 2
<211> 873
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Thr Ser Ala Leu Trp Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Cys
1 5 10 15
Trp Ala Pro Arg Glu Ser Gly Ala Thr Gly Thr Gly Arg Lys Ala Lys
20 25 30
Cys Glu Pro Ser Gln Phe Gln Cys Thr Asn Gly Arg Cys Ile Thr Leu
35 40 45
Leu Trp Lys Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu
50 55 60
Lys Asn Cys Val Lys Lys Thr Cys Ala Glu Ser Asp Phe Val Cys Asn
65 70 75 80
Asn Gly Gln Cys Val Pro Ser Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Pro Asp
85 90 95
Cys Glu Asp Gly Ser Asp Glu Ser Pro Glu Gln Cys His Met Arg Thr
100 105 110
Cys Arg Ile His Glu Ile Ser Cys Gly Ala His Ser Thr Gln Cys Ile
115 120 125
Pro Val Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asn Asp Cys Asp Ser Gly Glu
130 135 140
Asp Glu Glu Asn Cys Gly Asn Ile Thr Cys Ser Pro Asp Glu Phe Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ser Gly Arg Cys Ile Ser Arg Asn Phe Val Cys Asn Gly Gln
165 170 175
Asp Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Leu Asp Cys Ala Pro Pro Thr
180 185 190
Cys Gly Ala His Glu Phe Gln Cys Ser Thr Ser Ser Cys Ile Pro Ile
195 200 205
Ser Trp Val Cys Asp Asp Asp Ala Asp Cys Ser Asp Gln Ser Asp Glu
210 215 220
Ser Leu Glu Gln Cys Gly Arg Gln Pro Val Ile His Thr Lys Cys Pro
225 230 235 240
Ala Ser Glu Ile Gln Cys Gly Ser Gly Glu Cys Ile His Lys Lys Trp
245 250 255
Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn
260 265 270
Cys Pro Ser Arg Thr Cys Arg Pro Asp Gln Phe Glu Cys Glu Asp Gly
275 280 285
Ser Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Val
290 295 300
Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn Cys Lys Asn Val Asn Gln Cys Leu Gly
305 310 315 320
Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys
325 330 335
Val Cys Asn Gln Glu Gln Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu
340 345 350
Lys Glu Cys His Ile Asn Glu Cys Leu Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser
355 360 365
His Ile Cys Lys Asp Leu Val Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala
370 375 380
Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys
385 390 395 400
Gln Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gln Ile Cys Ile Asn Leu Lys Gly Gly
405 410 415
Tyr Lys Cys Glu Cys Ser Arg Gly Tyr Gln Met Asp Leu Ala Thr Gly
420 425 430
Val Cys Lys Ala Val Gly Lys Glu Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg
435 440 445
Arg Asp Ile Arg Lys Ile Gly Leu Glu Arg Lys Glu Tyr Ile Gln Leu
450 455 460
Val Glu Gln Leu Arg Asn Thr Val Ala Leu Asp Ala Asp Ile Ala Ala
465 470 475 480
Gln Lys Leu Phe Trp Ala Asp Leu Ser Gln Lys Ala Ile Phe Ser Ala
485 490 495
Ser Ile Asp Asp Lys Val Gly Arg His Val Lys Met Ile Asp Asn Val
500 505 510
Tyr Asn Pro Ala Ala Ile Ala Val Asp Trp Val Tyr Lys Thr Ile Tyr
515 520 525
Trp Thr Asp Ala Ala Ser Lys Thr Ile Ser Val Ala Thr Leu Asp Gly
530 535 540
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Phe Asn Ser Asp Leu Arg Glu Pro Ala Ser
545 550 555 560
Ile Ala Val Asp Pro Leu Ser Gly Phe Val Tyr Trp Ser Asp Trp Gly
565 570 575
Glu Pro Ala Lys Ile Glu Lys Ala Gly Met Asn Gly Phe Asp Arg Arg
580 585 590
Pro Leu Val Thr Ala Asp Ile Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp
595 600 605
Leu Ile Lys Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Asp Ser Lys Leu His Met Leu
610 615 620
Ser Ser Val Asp Leu Asn Gly Gln Asp Arg Arg Ile Val Leu Lys Ser
625 630 635 640
Leu Glu Phe Leu Ala His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg
645 650 655
Val Tyr Trp Ile Asp Gly Glu Asn Glu Ala Val Tyr Gly Ala Asn Lys
660 665 670
Phe Thr Gly Ser Glu Leu Ala Thr Leu Val Asn Asn Leu Asn Asp Ala
675 680 685
Gln Asp Ile Ile Val Tyr His Glu Leu Val Gln Pro Ser Gly Lys Asn
690 695 700
Trp Cys Glu Glu Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu
705 710 715 720
Pro Ala Pro Gln Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys
725 730 735
Pro Ser Gly Tyr Asn Val Glu Glu Asn Gly Arg Asp Cys Gln Ser Thr
740 745 750
Ala Thr Thr Val Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Thr Asn Thr Thr Glu
755 760 765
Ile Ser Ala Thr Ser Gly Leu Val Pro Gly Gly Ile Asn Val Thr Thr
770 775 780
Ala Val Ser Glu Val Ser Val Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp
785 790 795 800
Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Met Ala Ala Val Gly Gly Tyr
805 810 815
Leu Met Trp Arg Asn Trp Gln His Lys Asn Met Lys Ser Met Asn Phe
820 825 830
Asp Asn Pro Val Tyr Leu Lys Thr Thr Glu Glu Asp Leu Ser Ile Asp
835 840 845
Ile Gly Arg His Ser Ala Ser Val Gly His Thr Tyr Pro Ala Ile Ser
850 855 860
Val Val Ser Thr Asp Asp Asp Leu Ala
865 870
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
ccacagatat cagttgtaag ca 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
aaaagagact tcagctgctg g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 5
ctagtcaaca acctgaatga tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 6
aagaatggcc catgcggcag aa 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 7
gaaattgtaa gtatttttta ggtgt 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 8
tacctatcct aatttcctaa tcc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 9
ggattaggaa attaggatag gta 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 10
cccacccaac cacctccc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 11
gagttttagg cgaacgcgc 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 12
ctcctttccc tcgacgcg 18
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 13
ttgtgagttt taggtgaatg tgt 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 14
ccctcctttc cctcaacaca 20
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法。
【請求項２】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを用いて当該遺伝子の不活性化を検出する、請求項１に記載の胃癌の検出方法。
【請求項３】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が、当該遺伝子の欠失による不活性化である、請求項１又は２に記載の胃癌の検出方法。
【請求項４】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失が、当該遺伝子のホモ接合体欠失である、請求項３に記載の胃癌の検出方法。
【請求項５】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が、当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である、請求項１又は２に記載の胃癌の検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、または、ＣＧＨ法を用いて胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する、請求項１から５の何れかに記載の胃癌の検出方法。
【請求項１】
胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出することにより当該胃組織細胞の癌化を検出することを含む、胃癌の検出方法。
【請求項２】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを用いて当該遺伝子の不活性化を検出する、請求項１に記載の胃癌の検出方法。
【請求項３】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が、当該遺伝子の欠失による不活性化である、請求項１又は２に記載の胃癌の検出方法。
【請求項４】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の欠失が、当該遺伝子のホモ接合体欠失である、請求項３に記載の胃癌の検出方法。
【請求項５】
ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化が、当該遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である、請求項１又は２に記載の胃癌の検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、または、ＣＧＨ法を用いて胃組織細胞におけるヒトＶＬＤＬＲ遺伝子の不活性化を検出する、請求項１から５の何れかに記載の胃癌の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２８９０２１（Ｐ２００７−２８９０２１Ａ）
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１８０３０（Ｐ２００６−１１８０３０）
【出願日】平成１８年４月２１日（２００６．４．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２１日（２００６．４．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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