ｐＨ応答性高分子の使用
【課題】 本発明は目標化合物を液体から単離する方法に関する。
【解決手段】 本発明の方法は、第１のｐＨで、液体を、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、疎水性相互作用によって目標化合物を吸着させる段階と、第２のｐＨ値を有し、ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす溶出液を加えて、前記化合物を放出させる段階とを含む。溶出は、ｐＨ勾配及び／又は塩勾配によって有利に行われる。
【解決手段】 本発明の方法は、第１のｐＨで、液体を、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、疎水性相互作用によって目標化合物を吸着させる段階と、第２のｐＨ値を有し、ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす溶出液を加えて、前記化合物を放出させる段階とを含む。溶出は、ｐＨ勾配及び／又は塩勾配によって有利に行われる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明方法は、１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、目標化合物を分離媒体に吸着させた後、媒体から目標化合物を溶出させることによって単離を実施する方法に関する。本発明の方法で用いる媒体は、その表面に局在化したｐＨ応答性高分子を含む。本発明は、分離媒体の製造にｐＨ応答性高分子を使用することも包含する。
【背景技術】
【０００２】
夾雑化学種からの液体の精製、溶液からのタンパク質その他の生体分子のような所望化合物の単離など、様々な用途で溶液中の他の成分から目標化合物が単離される。近年のバイオテクノロジーの発展及び組換え産物の用途の増大に伴い、効率的な精製法に対するニーズが一段と高まっている。大抵の場合、生産される化合物が生体分子であろうと、その他の有機化合物、さらには無機化合物であろうと、使用に際しての安全性を確保するため、生産される化合物に求められる純度の要請が高い。
【０００３】
その汎用性と感度のため、クロマトグラフィーが生体分子及び医薬品の好ましい精製法であることが多い。クロマトグラフィーという用語は密接に関連した一群の分離法を包含し、これらはすべて非混和性の２つの相を接触させるという原理に基づくものである。具体的には、目標化合物を移動相に導入して、これを固定相と接触させるが、固定相は通例固体マトリックスである。目標化合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で一連の相互作用を受ける。相互作用は試料中の成分の物理的又は化学的性質の差異を利用する。相互作用は、電荷、疎水性、親和性などの１以上の異なる原理に基づくものとし得る。
【０００４】
疎水性及び関連相互作用は、濾過及びクロマトグラフィーなどの液体から目標化合物を分離するための様々な用途に利用されている。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）では、移動相は通例水性であり、マトリックスは疎水性基が親水性マトリックスに結合したものからなるのに対して、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）では一般に有機移動相と極性の低い（つまり親水性の高い）マトリックスが用いられる。媒体と溶質表面の相互作用は、塩その他のリオトロピック剤の添加によって促進されることが多い。したがって、ＨＩＣでは通例ＲＰＣよりも疎水性が低く、水性の環境が用いられ、多くの用途ではＨＩＣはＭＷの大きいタンパク質その他の脆弱な物質に適している。しかし、用途によっては、ＲＰＣマトリックスとＨＩＣマトリックスの間に明確な境界線はなく、移動相の選択如何によって決まる。こうした場合、ＨＩＣ用の媒体はＰＲＣにも使えるし、その逆も成り立つ。
【０００５】
目標分子と固定相とのＨＩＣ相互作用は、主に目標分子を水和する移動相の能力によって制御され、疎水性相互作用と共に目標と媒体の相互作用を安定化させる塩その他の添加剤によって影響される。他の相互作用、例えばファンデルワールス相互作用、電荷−電荷相互作用なども、タンパク質の保持、構造の安定化及び各種目標分子での分離能に関して副次的ではあるが重要な役割を果たすことがある。通例、ＨＩＣ媒体への目標分子の吸着は塩濃度の高い移動相で実施され、溶出は低塩濃度で起こる。数種の溶質間の選択性を高めるため塩勾配が用いられることが多い。かかる勾配で流すと、理想的には最も疎水性の高い化合物が最後に溶出する。タンパク質の場合、タンパク質の疎水性とＨＩＣ溶出との関係は完全には解明されていない。疎水性表面領域を有する高度に電荷した可溶性タンパク質は、ＨＩＣで最後に溶出することがある。
【０００６】
タンパク質の精製において、ＨＩＣは、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー法と補完性があるので、関心が高まりつつある。具体的には、ＨＩＣは、ダウンストリームプロセッシングの初期段階（例えば塩析後でイオン交換の前）にも、後期段階で例えば前の処理工程で変性した目標タンパク質の除去などにも成功裏に用いられている。しかし、特定の状況下では依然として短所を抱えている。
【０００７】
ＨＩＣの最も重大な短所の一つは、ＲＰＣにもいえることであるが、処理の際に目標タンパク質が変性しかねないことである。例えば、ＨＩＣで必要とされる高塩濃度の緩衝液は、タンパク質のような変性し易い目標化合物には有害となりかねず、そうした場合、変性が助長されかねない。この問題を軽減するため、カオトロピック剤又はタンパク質安定剤を使用することができるが、これらを除去するための追加の下流工程が必要となり、そのためプロセス全体のコストが増大してしまう。タンパク質の変性は、媒体との疎水性相互作用、及びその後の溶出条件下での媒体からの除去によっても引き起こされることもある。関与する機序は判然としないが、単純化すれば、移動相と媒体の界面自由エネルギー差に適応するように、しかも表面基との疎水性その他の相互作用を介してタンパク質自体の界面自由エネルギーの低下を促すようにタンパク質がコンフォメーションを変えることと関係していると思われる。こうした変性の問題は、タンパク質を媒体から溶出した後もタンパク質がその新しいコンフォメーションを保持していることである。
【０００８】
以上のことから、タンパク質の変性しにくい条件下で、その疎水性に基づいてタンパク質その他の分子を分離するクロマトグラフィーその他の分離表面の開発に多大な関心がもたれている。
【０００９】
荷電していない疎水性リガンドを用いる伝統的なＨＩＣ媒体に代わるものとして、Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ他（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１３，Ｊｕｌｙ，２０００）は、変性し易い生体高分子、特に抗体を単離するための疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）と名付けられた方法を提案している。市販品のＢｉｏＳｅｐｒａ ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）はこの種の相互作用に基づくものであり、リガンドとして４−メルカプトエチルピリジンを含んでいる。理論的には、このリガンドは中性ｐＨでは非荷電で、穏和な疎水性相互作用で分子と結合する。ｐＨを下げるとリガンドは正に帯電し、疎水結合はおそらくリガンドの荷電基とタンパク質との静電反発力で打ち消される。しかし、この方法には幾つかの問題が予見できる。第１に、溶出ｐＨで正味正電荷となる適当なｐＩの目標タンパク質が必要とされる。第２に、タンパク質は、溶出ｐＨで実質的に正味の正電荷を有する必要がある。第３に、用いられるピリジン基はそのｐＫａが中性の７に近いため、π結合の重なり、キレート化、イオン交換、カチオン−πのような他の安定化相互作用を促進して、その機能を損なうおそれがある。
【００１０】
常用される小さなリガンドに代わるものとして、大きな分子、特に高分子を分離用途における固定相として使用することが提案されている。
【００１１】
例えば、国際公開第０２／３０５６４号（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社）には、刺激応答性高分子をアフィニティクロマトグラフィーに使用することが開示されている。具体的には、「インテリジェント又は応答性高分子」としても知られるかかる刺激応答性高分子は、適当な刺激に暴露されるとその物理化学的性質が構造的で可逆的に変化する。この変化によって、かかる高分子の溶液中での自己会合にみられるような顕著な疎水性が、顕著な親水性、つまり水和作用へ変換される可能性があり、その逆もまた同様である。最も一般的で検討されている刺激は温度変化であるが、国際公開第０２／３０５６４号で提案されている代替刺激は、光、磁場、電場及び振動である。これら４つの刺激は、若干の技術的な困難は伴うものの分析用マイクロカラムのようなコート表面の総面積が小さい用途では使用できるかもしれないが、大きなカラム及び表面を伴う用途でうまく使用できるか疑問である。分離媒体からの目標物質の溶出を促すために注意深い温度制御が必要な場合は、媒体周囲の条件を一定にすることも必要になると思われる。その結果、使用する装置に対する要求が高くなる。提案された代替刺激の使用にも同様の短所が含まれると思われる。興味深いことに、国際公開第０２／３０５６４号は、塩、有機溶媒、酸及び塩基などの添加された化学物質のために、不活性化、回収率の低下などの問題を引き起こす恐れがあるので、塩、無機溶媒、ｐＨなど、溶出液の組成を変化させることによって溶出することは望ましくないことがあると記載している。
【００１２】
アフィニティクロマトグラフィーの他の一例が、米国特許第５９９８５８８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に記載されている。この特許は、相互作用性分子コンジュゲート、具体的には、これを利用してレセプター−リガンド相互作用や酵素−基質相互作用など分子間のアフィニティ若しくは認識相互作用を変調若しくは「切換える」ことができる材料に関する。したがって、開示されたコンジュゲートは刺激応答性高分子成分と相互作用性分子の組合せである。これらの高分子は、ｐＨ、光その他の刺激を変化させることによって操作することができる。刺激応答性成分を相互作用性分子の特定部位に結合させると、隣接するリガンド結合部位、例えば抗体の抗原結合部位又は酵素の活性部位に結合するリガンドを変えるようにこれを操作することが可能になる。
【００１３】
欧州特許第１０８１４９２号（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社）には、高分子コーティングを固定相とする他の例が記載されている。この特許では、帯電した共重合体からなるクロマトグラフィー充填材が開示されている。具体的には、開示されたイオン交換機能を持つ充填材は、例えばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）を正に帯電したジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡｍ）と共重合させることによって調製できる。得られる充填材は、逆相クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの両方で使用することができる。かかる充填材に吸着した物質の溶出は、温度を変化させることによって固定相表面の疎水性／親水性バランスを変化させることによって行われる。しかし、上記のように温度制御には短所がある。例えば、温度制御には、小さいカラムでも、一般にヒーター、浴、温度計、カラムジャケット及びポンプなどの特別な装置が必要である。かかる方法を大きなカラムに適用すると、カラムジャケット間の流体シール漏れ並びに長軸及びカラム径方向の不均一な温度分布を含めた当然随伴する問題が発生すると思われるので、装置の関与が大きくなる。大きなカラムでは温度勾配が流れの混合及び物性（例えば粘度）の差をもたらす可能性があり、これはゲルベッド全体の物質移動及び性能につながる。
【００１４】
欧州特許第０８５１７６８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｅａｔｔｌｅ）は、刺激応答性高分子及び相互作用性分子を使用して、分析、アフィニティ分離、処理などに有用な部位特異性コンジュゲートを形成することを提案している。この高分子は、ｐＨ、温度、光その他の刺激を変化させることによってこれを操作することができる。相互作用性分子は、ペプチド、タンパク質、抗体、レセプター又は酵素のような生体分子とすることができる。刺激応答性コンジュゲートを相互作用性分子の特異部位に結合させると、刺激応答性成分を操作して隣接する結合部位へのリガンドの結合を変えることができる。上記のように、この結合はアフィニティ基によるものであり、その結果提示された材料のアフィニティ認識相互作用を「切換える」ことができる。具体的には、目標化合物のアフィニティ部位に対する高分子の物理的関係が上記の変化によって制御される。さらにリガンドその他のアフィニティ物質が開示されているが、応答性高分子をかかる物質にグラフトすることによってその基本的な相互作用は望み通り改変される。
【００１５】
Ｔｕｎｃｅｌ ｅｔ ａｌ（Ａｌｉ Ｔｕｎｃｅｌ，Ｅｎｄｅｒ Ｕｎｓａｌ，Ｈｕｓｅｙｉｎ Ｃｉｃｅｋ：ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７７，３１５４−３１６１，２０００）は、アミン官能化モノマーＮ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭ）の懸濁重合によって均一なゲルビーズを製造することが記載されている。開示された架橋ゲルビーズは、ｐＨ感受性、可逆的、膨潤及び解膨潤挙動を示し、ＤＮＡ吸着用に提案されている。しかし、開示されたビーズの使用分野はその剛性によって制約されると思われる。この剛性は薬物の送達などの用途には十分であるが、高い流速が望ましい用途では不十分であると思われる。例えば、充填クロマトグラフィーベッド内の液の流れは不可避的にかかるビーズを崩壊させると思われるので、その吸着特性は低下することになろう。
【００１６】
最後に、国際公開第９６／００７３５号（Ｍａｓｓｅｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）には、目標タンパク質又はペプチドの精製に有用なクロマトグラフィー用樹脂が開示されている。具体的には樹脂−目標コンジュゲートが開示されており、樹脂は選択されるイオン性リガンドを共有結合した担体マトリックスを含む。リガンドは、ペプチドが樹脂に吸着するｐＨでは静電帯電しておらず、ペプチドが脱着するｐＨでは静電帯電している。非荷電の樹脂への吸着は疎水性相互作用によって行われるのに対し、脱着は電荷の反発作用によって行われる。リガンドとしては、アミノ基、カルボキシル基、ヒスチジル基、ピリジル基、アニリン基、モルフォリノ基又はイミダゾール基が挙げられる。さらに、スペーサーアームを介してリガンドを支持体に結合させることができる。スペーサーアームはこの発明に必須ではないが、例えばβ−アラニン、アミノ酪酸、アミノカプロン酸などから誘導することができる。スペーサーが存在してもイオン性基を含まないので、開示された樹脂の脱着特性には貢献できない。したがって、国際公開第９６／００７３５号に開示されたリガンドはすべて比較的小さい有機分子であり、各リガンドは通常１つの官能基を有する。したがって、この樹脂のリガンドは上述の刺激応答性高分子とは全く異なる。
【特許文献１】国際公開第０２／３０５６４号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５９９８５８８明細書
【特許文献３】欧州特許第１０８１４９２号明細書
【特許文献４】欧州特許第０８５１７６８号明細書
【特許文献５】国際公開第９６／００７３５号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１３，Ｊｕｌｙ，２０００
【非特許文献２】Ａｌｉ Ｔｕｎｃｅｌ，Ｅｎｄｅｒ Ｕｎｓａｌ，Ｈｕｓｅｙｉｎ Ｃｉｃｅｋ，“ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７７，３１５４−３１６１，２０００
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，“Ａ ｎｅｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ− ａｎｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９６，１２５１−１２５９（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の１つの目的は、通常のＨＩＣ媒体に比べて選択性及び／又は分離能向上した疎水性相互作用（ＨＩＣ）分離媒体を提供することである。具体的な目的は、選択性及び／又は分離能が向上し、回収率が通常のＨＩＣ媒体と少なくとも同等である、かかる媒体を提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、１種以上の目標化合物を液体から同定又は単離する方法を提供することである。この方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に常用される相互作用を利用して、移動相のｐＨ及び／又は塩濃度によってその相対的疎水性を変化させることができる媒体に目標化合物を吸着させる。この場合、疎水性は、ＨＩＣ媒体として常用されるアルカン又はフェニルリガンド系表面コーティングに対するタンパク質の吸着によって判定する。
【００１９】
本発明の特定の目的は、ｐＨ制御を用いて、リガンドを荷電又は非荷電にして吸着を促進又は低下させるだけでなく、相対的な相互作用を変化させる方法を提供することである。したがって、本発明を分離目的に使用すると作業者は他の変数即ちｐＨを持つことになり、これを用いて本方法の分離能を操作することができる。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、目標化合物の天然構造及び活性の観点から、吸着及び溶出条件下で従来技術の方法よりも完全性を維持しやすいクロマトグラフィー法を提供することである。特定の目的は、タンパク質などの巨大分子を分離するための方法を提供することである。本発明によれば、これは、液体から１種以上の目標化合物を同定又は単離する方法によって実現することができる。この方法では疎水性相互作用を利用して目標化合物を媒体に吸着させる。具体的には、前記媒体は、吸着及び溶出プロセス時に目標化合物に対するコンフォメーションを変化させる可撓性高分子表面コーティングを備えたマトリックスからなる。かかる変化は、ｐＨ及びＨＩＣで以前使用された他の刺激例えば塩濃度によって影響を受ける。したがって、本方法によって、作業者は、未変性又は変質した目標材料の回収率に影響を及ぼす操作変数の制御を改良することができる。
【００２１】
本発明の特定の目的は、疎水性相互作用が、目標化合物に対するその表面疎水性を例えばｐＨの変化によって変えることができる媒体への目標化合物の吸着に利用される主要な相互作用である、クロマトグラフィー法を提供することである。この場合、ｐＨの変化は、移動相塩濃度の有意な変化、又は有機溶媒若しくは極性を変化させる高分子添加剤などの移動相変性剤の使用には左右されない。本方法は、例えば塩濃度、有機溶媒及び高分子移動相変性剤などに関わる広範囲の移動相で利用することができる。
【００２２】
本発明の特定の目的は、従来技術と比べて可能な運転条件が広くなると共に運転経費が低減する上記のＨＩＣ方法を提供することであり、且つ従来技術のＨＩＣ方法よって運転装置への悪影響が少ない方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、疎水性相互作用を利用して媒体に目標化合物を吸着させるクロマトグラフィー法を提供することである。この方法によって、ＨＩＣが用いられることが多い中性ｐＨ領域で溶解性が低いタンパク質及びポリペプチドにＨＩＣを使用することが可能になる。これは、疎水性相互作用を、マトリックス表面に局在化した高分子のコンフォメーション、並びにｐＨと関連したタンパク質−高分子相互作用に関連づける方法によって実現される。
【００２４】
本発明の別の目的は、標準的なＨＩＣ媒体と同じ順序でタンパク質を溶出させるが、選択されるタンパク質の媒体との相対的相互作用、即ち他のタンパク質に対するこのタンパク質のピーク溶出位置をｐＨの変化によって変化させる、クロマトグラフィー法を提供することである。したがって、本方法は、ＨＩＣ方法で得られる分離能を向上させることができる。
【００２５】
本発明の他の目的は、製造に適したクロマトグラフィー材料を使用するクロマトグラフィー法を提供することである。これは、常用されるアルカン又はフェニル基などの特定の疎水性リガンドではなく、表面局在化高分子を呈するマトリックスの使用によって実現することができる。後者は、元の表面の疎水性の改質、リガンドを結合させる基の連結などの疎水性コーティングの使用に関連する生産コストを必要とすることが多い。本方法を用いることによってこれを回避することができる。
【００２６】
本発明の最後の目的は、タンパク質などの様々な目標化合物の望ましい分離を行うために必要な媒体の範囲を狭くすることである。これは、その固有の表面疎水性をｐＨ制御によって変えることができる分離媒体を使用することによって、本発明に従って実現することができる。標準的なＨＩＣ媒体が持つ疎水性の固有の範囲は、異なるアルカン基を有する媒体によって、しばしば２つ以上の表面密度で与えられるので、各用途に対して製造し試験しなければならない媒体の範囲が狭ければ供給元にもユーザーにも有利である。
【００２７】
本発明の他の目的及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。
【００２８】
定義
「表面局在化」という用語は、表面近傍における分子その他の物質の局在化を意味する。これは、吸着、共有結合などの任意の通常の相互作用によって実現することができる。
【００２９】
「表面」という用語は、マトリックスの外面を意味し、多孔質材料の場合は、内面又は気孔表面を意味する。
【００３０】
「マトリックス」という用語は、本明細書ではクロマトグラフィー及び濾過などの同定及び単離分野に使用される通常の固体坦体の任意の１種について用いる。
【００３１】
「分離媒体」は、上に定義したマトリックスからなり、これにリガンド又は高分子などの結合基が結合されている。
【００３２】
「疎水性」という用語は、本明細書でも、クロマトグラフィーの分野で一般に使用されている意味で用いる。この分野で「疎水性」という用語を定義するには、例えば溶解性の観点から周知の多くの共通の方法がある。
【００３３】
「脱着」及び「放出」という用語は、本明細書で区別なく用いられている。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
第１の態様では、本発明は、１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、
（ａ）液体を、第１のｐＨ値で、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、目標化合物を吸着させる段階と、
（ｂ）ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす第２のｐＨ値の溶出液を加えて、分離媒体から１種以上の前記目標化合物を放出させる段階と
を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本方法の一実施形態では第２のｐＨ値は第１のｐＨ値よりも低い。最も有利な実施形態では溶出液はｐＨ低下勾配を備える。吸着力は、高分子と目標化合物の相互作用に左右されるので、異なる目標化合物は、段階的又は線形ｐＨ勾配などのｐＨ勾配によって媒体から示差的に溶出することができる。したがって、有利な実施形態では段階（ｂ）は２種以上の目標化合物の示差的な溶出である。本方法では各々の目標化合物を純粋又は実質的に純粋な画分として溶出させることができる。アルコール、界面活性剤、カオトロピック塩などの常用される添加剤を溶出緩衝液中に使用して、段階（ｂ）における脱着時の選択性に影響を及ぼすことができる。しかし、高濃度のかかる添加剤にさらすことによって目標化合物を変性又は不活性化しないように注意することが望ましい。
【００３６】
勾配溶出法はクロマトグラフィー分野で周知の方法であり、当業者は通常の酸／塩基系を用いた適当な勾配を容易に決めることができる。
【００３７】
したがって、本実施形態では、ｐＨの変化によって高分子の物理的状態を変えることができる。高分子の性質に応じて、高分子が自己会合する傾向、及びその疎水性との関係で材料に対する表面の吸着性が高まる傾向を、ｐＨの変化によって増大又は減少させることができる。図５〜８に示す例ではこの傾向はｐＨを下げると共に増大する。その結果、一般にタンパク質が表面から溶出する塩濃度は低下する。これは、図１及び２に示すように、標準的なＨＩＣ媒体表面の疎水性を高めたときに見られるのと同じ機構である。
【００３８】
明らかにこの逆も真であり、吸着性が低下するようにｐＨを変化させるに連れて、媒体とタンパク質その他の吸着剤との相互作用は弱くなる。この文脈において、ｐＨに関連した高分子のコンフォメーションの傾向は、吸着及び脱着のｐＨ制御に影響を及ぼすことが分かる。しかし、当業者には自明であろうが、本方法において目標化合物は、図３に示すようにマトリックス表面からの放出を促進するのに十分ではない方法で、わずかではあるがコンフォメーションの変化も受ける。したがって、かかるケースも本発明の範囲内に包含される。したがって、本方法における化合物の吸着及び放出は、主に、しかも好ましくは、大部分がｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化によって促進される。
【００３９】
本方法を利用して、上記のように目標化合物を吸着させることによって目標化合物を単離することができる。したがって、本方法の一実施形態では吸着した化合物が目標化合物である。別の実施形態では本発明を利用して望ましくない化合物を吸着させることによってこれを液体から除去し、目標化合物を通過させる。特定の実施形態では上記の吸着は、目標化合物の満足すべき単離及び／又は同定を可能にする事実上の障害物である。
【００４０】
本方法の別の実施形態では溶出液の導電率が段階（ａ）の液体の導電率と異なるが、第２のｐＨ値は第１のｐＨ値と等しく又は少なくとも実質的に等しく保つ。タンパク質の単離に最も有利な実施形態では溶出は中性又はアルカリ性ｐＨで行われる。導電度の変化は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに常用される任意の１種など、一般に適当な塩の添加によって与えられる。有利な実施形態では溶出液は塩勾配を含む。吸着力は高分子と目標化合物の相互作用に左右されるので、異なる目標化合物は、段階的又は線形塩勾配などの塩勾配によって示差的に溶出することができる。有利な実施形態では段階（ｂ）は２種以上の目標化合物の示差的な溶出である。本方法では各々の目標化合物を純粋又は実質的に純粋な画分として溶出させることができる。アルコール、界面活性剤、カオトロピック塩などの常用される添加剤を溶出緩衝液中に使用して、段階（ｂ）における脱着時の選択性に影響を及ぼすことができる。しかし、高濃度のかかる添加剤にさらすことによって目標化合物を変性又は不活性化しないように注意することが望ましい。勾配溶出法はクロマトグラフィー分野で周知の方法であり、当業者は適当な勾配を容易に決めることができる。
【００４１】
特定の実施形態では上記のｐＨ及び塩勾配溶出法を組み合わせて、両者の原理を吸着した１種以上の化合物の溶出に利用する。
【００４２】
要約すると、本方法の段階（ａ）ではｐＨ応答性高分子の性質に応じて、当業者は容易に吸着条件を適合させることができる。例えば、周知のように、高い表面張力は、疎水性表面上へのタンパク質の吸着に好ましい疎溶媒性の環境を与える。したがって、モル表面張力の高い塩の使用は、タンパク質などの目標化合物の媒体への保持を増大させることになる。ＨＩＣで最も一般的に使用される塩は硫酸アンモニウムである。しかし、非常にアルカリ性の環境ではこれを使用することができない。その他の有用な塩としては、例えば、グルタミン酸モノナトリウム、グアニジン、硫酸ナトリウム及びアスパルギン酸ナトリウムが挙げられる。これらはｐＨ約９．５で使用するのが有利である。本方法は室温で行うのが最も有利である。
【００４３】
一実施形態では目標化合物の吸着はｐＨ応答性高分子と目標化合物の疎水性相互作用によって与えられる。したがって、本実施形態の基本を形成する原理を、本明細書では、「ｐＨ応答性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）」と表すことがある。特定の実施形態では目標化合物の吸着は、関連相互作用を追加した疎水性相互作用によって与えられる。かかる関連相互作用は、電荷−電荷相互作用、ファンデルワールス相互作用及び共溶媒和／共水和からなる群から適切に選択される。一定のｐＨ及び塩濃度における特定のタンパク質の場合などに関する別の実施形態ではかかる１以上の関連相互作用が支配的である。しかし、一般に、かかる他の相互作用は疎水性相互作用と比べて二次的である。
【００４４】
具体的には、塩勾配疎水性相互作用を用いた実施形態ではタンパク質などの目標化合物は、段階（ａ）において、表面の疎水性、１種以上の目標化合物の疎水性、及び溶出液の性質との関係で吸着される。したがって、これらの相互作用は、一般に例えばアルカン又は芳香族疎水性リガンドをコーティングした坦体又はマトリックスを含む標準的なＨＩＣ媒体に共通の相互作用の型を模倣しているという点で、主として疎水性である。
【００４５】
したがって、ｐＨ応答性高分子を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に基づく本発明は、Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ等が提案した上記の電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）とは異なる。この電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）では（１）用いるリガンドは低ＭＷ分子であって本発明のように高分子ではない、（２）結合時はリガンドを中性、非結合時はこれを陽性にするように移動相のｐＨを変化させる、（３）ｐＨの変化に応じてリガンドのコンフォメーションを変化させることをＢｏｓｃｈｅｔｔｉ等は提案していない、（４）誘導しうる荷電基を疎水性リガンドに結合させ、実質的にはこれが標準的なＨＩＣリガンドの変性を意味する。ＣＩＣ法で予見できる幾つかの問題、例えば（ｉ）荷電形態のＣＩＣリガンドに対するタンパク質荷電基の親和性、（ｉｉ）電荷−電荷相互作用がＨＩＣ緩衝液の高い塩濃度によって遮蔽されてしまうこと、並びに（ｉｉｉ）リガンド密度と媒体の性能の関係、などの要因によって引き起こされる問題は、本発明によって回避される。
【００４６】
本方法の一実施形態ではｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化は、ｐＨの低下によって引き起こされる疎水性の低いコンフォメーションへの変化である。別の実施形態では高分子のコンフォメーション変化は、高分子の自己会合及び／又はマトリックスとの会合に基づいている。
【００４７】
当業者は、ｐＨが上昇又は低下するに連れて、水溶液その他の溶液で疎水性の高いコンフォメーションを経由して疎水性の低いコンフォメーションへ変わる、適当なｐＨ応答性高分子を製造することができる。これには自己会合が付随して起こることが多いが、自己会合は高分子が溶液中で自由なときに溶液から出てくることによって検出される。水溶液系における温度応答性高分子については、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）がある。ｐＨ応答性高分子のＬＣＳＴはｐＨで変化すると共に、その他の因子、例えばイオン強度及び溶液中のイオンその他の添加剤の種類の影響を受ける可能性もある。かかる高分子が表面に結合すると、高分子のコンフォメーション変化はそのまま保持され、表面の相対的疎水性を高分子の疎水性と同様に変化させる。このように、表面に会合した高分子は自己会合し、ｐＨに応じてコンフォメーションを変化することができる。
【００４８】
ｐＨ応答性高分子を結合させるマトリックスは、分離プロセスの妨げになりかねない電荷を持たない限り、ｐＨ応答性高分子の結合が可能な任意の有機又は無機多孔質材料とすることができる。したがって、一実施形態ではマトリックスは、架橋アガロースなどの疎水性炭水化物からなる。この場合は、下記の実験の部で詳細に記載するように、マトリックス材料は、最初に好ましくはＮａＯＨなどの塩基の存在下で周知の方法に従って適当な程度までアリル化した後、アミノ化してその後の高分子の結合を可能にする。別の実施形態ではマトリックスを初めアリル化した後、表面にモノマーをグラフトすることによってｐＨ応答性高分子コーティングを得る。この実施形態ではモノマーを表面に直接共重合させる。モノマーの選択によって、所望の応答性を有する高分子の調製が可能になる。例えば、当業者は、常法を用いて所望のＬＣＳＴを有する高分子コーティングを容易に調製することができる。特定の実施形態ではｐＨ応答性高分子を温度応答性高分子と結合させて独特の特徴を得ることができる。別の実施形態ではグラフト技術によってかかるマトリックスを調製することができる。
【００４９】
別の実施形態ではマトリックスはシリカ又は合成共重合体材料である。必要に応じ、マトリックスを上述の如くアリル化した後アミノ化する。クロマトグラフィーの場合は、使用する前にマトリックスの残りのアミノ基をアルキル化することが特に好ましい。かかる基は化合物の分離低下を引き起こす恐れがあるからである。
【００５０】
本方法で有用なｐＨ応答性高分子は、ｐＨに対する感受性が高い任意のものとすることができる。この場合、周囲のｐＨの変化が高分子のコイルで有意のコンフォメーション変化を引き起こす。この種の高分子の総説については、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，“Ａ ｎｅｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ− ａｎｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９６，１２５１−１２５９（１９９５）を参照されたい。特定の実施形態ではこのｐＨ応答性高分子は、ｐＨ２〜１３、例えば２〜１２、３〜１２、４〜７、又は７〜１０の範囲でｐＨ応答性である。
【００５１】
簡単に言えば、本明細書で有用な合成ｐＨ感受性高分子は、一般に、アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡＡｃ）、無水マレイン酸（ＭＡｎｈ）、マレイン酸（ＭＡｃ）、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、Ｎ−ビニルホルムアミド（ＮＶＡ）、Ｎ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）（最後の２つは重合後加水分解してポリビニルアミンにすることができる）、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）、ホスホリルエチルアクリレート（ＰＥＡ）又はメタクリレート（ＰＥＭＡ）などのｐＨ感受性ビニルモノマーに基づくものである。かかるｐＨ感受性高分子は、アミノ酸（例えば、ポリリシン若しくはポリグルタミン酸）からポリペプチドとして合成することもできる。或いは、タンパク質（例えば、リゾチーム、アルブミン、カゼインなど）、又は多糖類（例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラギーナン、キトサン、カルボキシメチルセルロースなど）又はＤＮＡなどの核酸などの天然高分子から誘導することもできる。
【００５２】
一実施形態ではｐＨ応答性高分子はコモノマーである。別の実施形態では各ｐＨ応答性高分子は疎水性部分と親水性部分とｐＨ応答性部分からなる。好ましくは、ｐＨ応答性部分は、第１級、第２級又は第３級アミンなどのアミン及び／又はアクリル酸からなる。これらは一定のｐＫａ値でプロトン化する。
【００５３】
特定の実施形態ではｐＨ応答性高分子は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、―ＳＯ２ＮＨ２基、―ＲＮＨ２基、Ｒ２ＮＨ基及びＲ３Ｎ基（式中、ＲはＣである）からなる基から選択されるｐＨ応答性基を含む。
【００５４】
特定の実施形態では高分子の疎水性を与える又は疎水性を高める１以上の官能基を含有するように、本ｐＨ応答性高分子を設計することができる。本方法における最も好ましい官能基は、不飽和系例えばアルケン又は芳香族系に見られるような炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）である。
【００５５】
本方法で使用されるｐＨ応答性表面は、当業者が有機合成高分子化学を用いて官能基の単層又は多層として設計することができる。一般に、本明細書で有用なｐＨ応答性高分子は、常法に従って、分子量が約１０００〜約２５００００ダルトン、例えば約２０００〜約３００００ダルトンになるように合成することができる。当業者には自明であろうが、下限は表面被覆や疎水性の程度などの要因で決まり、上限は高分子／拡散効果などの要因で決まる。
【００５６】
上記の如く、ｐＨ応答性高分子を例証する１つの型は、１つのアミノ基と１つのカルボキシル基を有するアミノ酸から調製することができ、これを多糖マトリックスに結合することができる。このモノマーはラジカル重合で容易に重合し、ｐＨ４〜８の領域で一定の膨潤を示し、酸性及び塩基領域で膨潤が増大するマトリックスが得られる。高分子をマトリックス表面に結合させる別の方法は、表面グラフト法である。この方法では、一定の大きさのｐＨ応答性高分子をまず合成し、次いでこれを坦体にグラフトする。可逆的なｐＨ応答性表面を作製するさらに別の公知の方法は、「閉込め官能化」である。この方法では、精巧な標識ポリエチレンオリゴマーが作製される。その場合、これらのオリゴマーを、添加剤を含まないＨＤＰＥと混合することができる。高分子と官能化オリゴマーの両方を溶解することによって、官能化ＰＥフィルムの製造に使用できる均質な溶液が得られる。
【００５７】
別の実施形態では本方法は、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−プロピルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＰＰ）、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−メチルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＭＰ）及びポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−エチルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＥＰ）などの高分子を使用する。これらは、ｐＨと温度の両方に感受性を有するヒドロゲルである。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート［ＤＭＥＥＭＡ］系高分子は、温度とｐＨに応答性を有するヒドロゲルのもう１つのグループである。
【００５８】
本法の一実施形態では１種以上の目標化合物はタンパク質又はペプチドのような生体分子である。この点で特に適当なタンパク質の具体例としては、抗原、セルラーゼ、糖タンパク質、ホルモン、免疫グロブリン、リパーゼ、膜タンパク質、核タンパク質、胎盤タンパク質、リボゾームタンパク質及び血清タンパク質が挙げられる。目標化合物は、どんな液体中に存在してもよいが、一般には水溶液中に存在する。但し、吸着プロセスに適合し、ｐＨ応答性高分子又は目標化合物に決して有害ではないことが条件である。一実施形態ではこの液体は発酵液であり、目標化合物はその中で製造されたタンパク質又はペプチドである。かかる発酵液は、ｐＨ応答性高分子の性質に応じて希釈してもよく、粗抽出物のように希釈しなくてもよい。
【００５９】
現在の最良の実施形態では本発明の方法はクロマトグラフィー法である。かかるクロマトグラフィー法は、大量生産に至るあらゆる規模での調製用とすることもでき、或いは分析用とすることもできる。したがって、特定の実施形態では本方法は分析法である。具体的な実施形態では分離用マトリックスは、マイクロタイタープレート、バイオセンサー、バイオチップなどである。別の実施形態では本発明は細胞培養に使用される。本方法は、小規模の装置でも大規模の装置でも同じように有用である。
【００６０】
別の実施形態では本方法は濾過法である。この場合、マトリックスは、上記のｐＨ応答性高分子を標準法に従って結合させた任意の周知の材料とすることができる。濾過の一般原理は当業者には周知である。
【００６１】
別の態様では本発明は、クロマトグラフィー媒体の製造に、上記定義のｐＨ応答性高分子を使用することに関する。したがって、本発明は、適当な共重合体を、アガロースなどのマトリックスにグラフトする方法も包含する。この方法では、共重合体の性質は、所望の環境下でｐＨ応答性になるように設計される。
【００６２】
最後に、本発明は、ｐＨを変化させることによって表面吸着を増大又は減少させるｐＨ応答性高分子の使用も包含する。溶液中又は表面上の高分子が、溶液中又は前記表面に局在化した巨大分子又はコロイドなどの、タンパク質その他の分子と相互作用できることは一般の現象である。かかる相互作用は、被覆表面−タンパク質相互作用などの高分子−タンパク質相互作用をもたらす可能性があるが、これは高分子と他方の材料の化学基に大きく左右される。したがって、かかる相互作用は、様々な化学的相互作用、例えば、共水和、疎水性、ファンデルワールス及び水素結合と関連し、且つ他方の材料の独特な構造を反映すると考えられる。これらの相互作用を使用して、表面と材料との相互作用を様々に制御することができる。かかる相互作用は高分子の自己会合傾向を促進し安定化させる可能性があることに留意されたい。
【００６３】
具体的には、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離マトリックスの使用によって、１種以上の目標化合物が液体の他の成分から分離される。最も有利な実施形態ではｐＨ応答性高分子は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、―ＳＯ２ＮＨ２基、―ＲＮＨ２基、Ｒ２ＮＨ基及びＲ３Ｎ基（式中、ＲはＣである）からなる基から選択されるｐＨ感受性ペンダント基を含む。特定の実施形態では前記高分子は原位置でマトリックス表面上に重合させる。
【００６４】
したがって、本発明は、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体を使用して液体中の他の成分から生体分子を分離する方法を包含する。上記のように、かかる分離法はクロマトグラフィー法又は濾過法とすることができる。これを使用することは、従来の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の有利な代替法である。ｐＨ応答性高分子に関する詳細は、本発明の方法に関連して上述した通りである。
【００６５】
最後に、本発明は、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体にも関する。特定の実施形態では高分子のｐＨ応答性基は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる基から選択される。本媒体及びその使用に関する詳細は、本発明の方法に関連して上述した通りである。
【００６６】
さらに、本発明は、目標化合物を単離するためのキットであって、別々のコンパートメントに、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体を充填したクロマトグラフィーカラムと、第１のｐＨを有する吸着緩衝液と、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨを有する溶出液と、その使用説明書を含むキットも包含する。前記使用説明書は、本発明の方法を実施する方法の使用説明書を含んでもよい。
【００６７】
図１は、様々な従来のＨＩＣ媒体、即ち上から下へ：Ｅｔｈｅｒ ６５ＯＳ（商標）、Ｅｔｈｅｒ ５ＰＷ（商標）、Ｐｈｅｎｙｌ ６５ＯＳ（商標）及びＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷ（商標）（Ｔｏｓｏｈ）、並びにＰｈｅｎｙｌ ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））に関するクロマトグラムを示す。これらの媒体はそのリガンド（フェニル又はエーテル基）によって表される。この例では、４種のタンパク質（ミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、α−ラクトアルブミン及びα−キモトリプシノーゲンＡ）（その性質の幾つかは実験の部で表にした）を、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に加えた。この緩衝液は後で０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４まで勾配として使用される。単一のタンパク質を用いた試験によれば、これらのタンパク質は上記の典型的な「標準的」ＨＩＣの順序で溶出することが分かる。以下のことが認められる：（ａ）タンパク質はすべて、カラムから同じ順序で溶出する傾向がある−ピークの分離能は異なるが相対的なピーク位置は変わらない；（ｂ）幾つかの媒体はこれら４種のタンパク質のピーク分離能が他のものよりも優れている；（ｃ）これらの媒体は異なるタンパク質を異なる塩濃度で溶出させるように見える。例えば、上から下へエーテルからフェニルリガンド被覆媒体に変わると、ミオグロビンのピークは２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４で、次いで約１Ｍで溶出するように見える。これは、フェニル基とエチル基の疎水性の違いに呼応しており、タンパク質の相互作用はフェニル被覆媒体の方が強いことを示唆するものである。
【００６８】
図２は、同じタンパク質と同じ条件、並びに以下の様々なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）媒体（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて図１と同様に実施した「標準的」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。これらの媒体は下から上へ、１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（低密度）；２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（高密度）；３．Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ；及びＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦである。但し、「密度」とは相対的なリガンド密度を表すものであり、媒体の疎水性が高くなると共に高くなる。市販の媒体はそのリガンドとリガンド密度によって表す。個々のタンパク質の試験（図示せず）によれば、これら４種のタンパク質は図１に見られる順序で溶出するが、さらに以下のことを示唆している：（ａ）これらのタンパク質は２つのピーク（ミオグロビンとリボヌクレアーゼ、その後α−ラクトアルブミンとα−キモトリプシノーゲンＡ）にしか解像されない；（ｂ）低密度のフェニル基を有する媒体から高密度の媒体に変えると、ピークは低塩濃度で溶出する（疎水性の高い媒体表面の相互作用の方が強いことを示す）；並びに（ｃ）媒体の疎水性はリガンドの疎水性だけでなく密度によって決まる。したがって、疎水性は最も高いリガンドだが最も低いリガンド密度（８ｕｍｏｌｅ／ｍｌゲル、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ参照）を有するオクチル媒体におけるタンパク質ピークは、ブチル（５０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）又はフェニル低密度（２０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）若しくは高密度（４０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）媒体よりも前に溶出する。なお、図１のフェニル−ＨＰ媒体のリガンド密度は２５ｕｍｏｌｅ／ｍｌゲルである。
【００６９】
図３ａは、図１及び２の４種のタンパク質混合物と同じものを用いた、同様のｐＨ７勾配ＨＩＣ試験を示す図である。様々な曲線は上から下へリボヌクレアーゼ、ミオグロビン、α−ラクトアルブミン、α−キモトリプシノーゲンＡ及びこれらの混合物を示す。また、示しているのは別々に実験した個々のタンパク質試料の結果である。図３ｂは、ｐＨ４における同じタンパク質を示す。なお、（ａ）タンパク質混合物の結果は何れのｐＨでも同じように見える；（ｂ）此処でも２つのピークしか解像されていない；（ｃ）ｐＨを７から４に変えると、ミオグロビンとα−ラクトアルブミンはカラム上に保持される傾向がある（塩濃度が低くなっても強い相互作用を示す）。
【００７０】
図４ａは、酸性ｐＨ領域（例えば４〜７）でｐＨ ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）応答性を持つように開発された応答性高分子コーティング：ＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡの一般式を示す図である。これは、荷電及び疎水性で自己会合している基「ｍ」、ｐＨ応答性を調節するために加えられた基「ｎ」−この場合酸性ｐＨ応答性のための酸基及びＨＩＣ（自己会合）官能性を改良するためのもう１つの基「ｏ」からなる。図で認められるように、多くの変数を変化させて任意の特定の用途に対してこの高分子を最適化することができ、本明細書で直接実証したもの以外の他の多くの用途が可能である。明らかな変更としては、ベースマトリックスを変えること、３種の官能基ｍ、ｎ及びｏのモル比を変えること、基の種類を変えること（例えばｎをピリジン基、ｏをフェニル基にする、互いに緩衝できる２種の基で基ｎを置換して４種の官能基を使うなど）、基の相対的配置を変化させることなどが挙げられる。図４ｂは、塩基性ｐＨ範囲で機能するように設計された、異なる種類のｐＨ応答性高分子を示す図である。
【００７１】
図５は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）媒体に図４ａの高分子をグラフトして調製した媒体（ＵＢ８７８０２９、Ｕ８７８０３２：１〜３）を用いて、４種のタンパク質混合物について上図の如く（但しｐＨ４で）実施した「標準的」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。３種の高分子成分のモル比を変えて４通りの媒体を作り、これらを使用した結果が示されている。なお、（ａ）モル比は調節することができる；（ｂ）クロマトグラフィー挙動はモル比によって変化する傾向があり、したがって調節することができる；（ｃ）同じようなモル比を有する高分子では同じようなＨＩＣクロマトグラムが得られる。
【００７２】
図６は、図４ａの高分子で被覆したｐＨ感受性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）プロトタイプ媒体の１種（Ｕ８７８０３２：３）を用いて、４種のタンパク質混合物について上図の如く、但し本発明の一態様に従って吸着及び溶出段階の両方でｐＨ４から７に変化させて実施した「標準」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。なお、（ａ）ｐＨ７では、「ｐＨＩＣ」媒体は、タンパク質が個々の実験（図示せず）によって確認された普通の順序で溶出する、代表的なＨＩＣクロマトグラムを示す；（ｂ）４つのピークの分離能は、図１及び２に示す市販媒体の結果と同等又は優れている；（ｃ）ｐＨを４から７へ変化させるに連れて、ミオグロビン（ｐＩ６．３）ピークの溶出順序は最初の溶出から最後の溶出へ移動し、α−ラクトアルブミン（ｐＩ５）も移動する（下記参照）；（ｄ）他のピーク、例えばリボヌクレアーゼ（ｐＩ９．４）及びａ−キモトリプシノーゲンＡ（ｐＩ９．６）は相対的な位置を保持するが、低塩濃度で溶出する傾向がある。観察「ｃ」は、ｐＨを変化させることによって、独特の分離（例えば、標準ＨＩＣでは一緒に溶出する傾向があるリボヌクレアーゼとミオグロビンの精製）を行うことができることを示唆している。観察「ｄ」は、図１及び２と同様、右へのピーク移動は媒体の疎水性の上昇に付随することを示唆している。この結果、ｐＨを減少させることによって、媒体の効果的な塩勾配範囲を減少させることができる。また、１つの媒体を異なるｐＨ値で使用することによって、図１及び２における多くの異なる媒体の範囲と同様なクロマトグラフィー分離を再現することもできる。
【００７３】
図７は、図６（Ｕ８７８０３２：３）におけるｐＨ４の勾配試験に伴う個々のタンパク質のクロマトグラムを示す図である。４種の個々のタンパク質に対するピーク分離能を、図３における市販のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のものと比較されたい。ピーク形状が著しく改善されていること、並びにミオグロビン及びα−ラクトアルブミンが回復していることに留意されたい。
【００７４】
図８は、図６に示すｐＨＩＣ媒体を用いた３つの別々の試験を示す図であり、クロマトグラムの再現性を示している。同じようなモル比の媒体を用いた実験（図示せず）も、同じくかかる媒体を製造することの再現性（確実性）を示唆するものであった。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、単に例証を目的として提供されるものであり、頭記の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書で引用した文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７６】
材料
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
方法
機器
ＵＶ検出器を備えたＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＩＤ １１９）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムはガラス製であり、ＨＲ５／５（１８−０３８３−１）型のものである。
【００８０】
ゲルの滴定には、ＡＢＵ ９３ ＴＲＩＢＵＲＥＴＴＥ（ＩＤ６７２）（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を使用した。アミノ基の滴定には５ｍｌのテフロン（商標）キューブ（ＩＤ８５）を使用し、アリル基の滴定には１ｍｌのテフロン（商標）キューブ（ＩＤ６００）を使用した。ゲルのＦＴＩＲ分析にはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １６ ＰＣ（一連番号１４５６８９）を使用した。ＮＭＲで分析したゲルは、５０μｌのテフロン（商標）キューブを用いて計量し、ａｖ５００を用いて分析した。純高分子は、溶解して、ａｖ３００を用いてＮＭＲで分析した。
【００８１】
重量の計量はすべて、重量≦１ｇにはＭｅｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ（ＩＤ５２６）、重量≧１ｇにはＭｅｔｌｅｒ ＰＭ４８０（ＩＤ６３５）を用いて行った（他の情報が無い場合）。
【００８２】
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００（ＩＤ１３４）を用いて、温度の関数として高分子の吸光度を測定した。ＴＨＦ中のＧＰＣには、Ｗａｔｅｒｓ ７１２ ＷＩＳＰ（ＩＤ６４８）、Ｗａｔｅｒ ４１０（示差屈折計）及びＰＬ−ＥＬＳ １０００（検出器）を使用した。
【００８３】
実施例１：アミン化アリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰの調製
アリル−ＨＰの調製：１００ｍｌの水切りしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰを２５０ｍｌの容器に入れ、水２５ｍｌを加えて撹拌を開始した。５０℃で６０分放置した後、様々な量のＮａＯＨ、０．２ｇのＮａＢＨ４及び６ｇのＮａ２ＳＯ４を加え、これらの物質を５０℃で連続的に撹拌しながら１６〜２０時間反応させた。
【００８４】
アリル−ＨＰのアミン化：水切りしたアリル−ＨＰゲルを５０〜１００ｍｌの水と共に容器に入れ、撹拌を開始した。ＮａＡｃ５ｇを加え、黄色が残って見えるまでＢｒ２（水溶液）を加えた後、この色が消えるまでＮａＣＯＯＨを加え、ゲルを水洗した。
【００８５】
１，６ジアミンヘキサン１７ｇ、ＮａＣｌ８．８ｇ、水５０ｍｌの溶液を調製し、これを冷却中のゲルに加えた。５０℃で１６〜２０時間、反応を行った。
【００８６】
実施例２：変性Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ−ゲルの分析
滴定結果
滴定結果は予想した通りであった。ゲルのアリル濃度は水酸化ナトリウムの重量百分率が上昇するに連れて上昇した。ゲルの塩化物イオン結合量も上昇した（表１）。
【００８７】
【表３】
【００８８】
実施例３：アミン化ゲルへのＰＶＣＬ−ＮＰＡ共重合体の結合
ゲル１０ｍｌの調製：
１０ｍｌのアミン変性アガロース粒子をＤＭＦで洗った。９６ｍｇのＰＶＣＬ−ＮＰＡをＤＭＦ１０ｍｌに溶解した後、この溶液をアガロース粒子に加えた。この混合物を一晩振盪した。無水酢酸５０μｌを混合物に加えて（坦体の残存アミノアルキルをアセチル化し）、その後ガラスフィルター（孔径４）で濾過し、ＤＭＦ２００ｍｌで洗って過剰の高分子を除去した。
【００８９】
ゲルを評価したところ、アミノアルキルのアセチル化が不十分であることが分かったので、無水酢酸の添加量を１０ｍｌに増加した。
【００９０】
実施例４：アリル化ゲルへのＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ高分子のグラフト
モノマー及びＡＩＢＮを表２に従って計量し、１５ｍｌのバイアルに入れたジオキサンに溶解した。水抜きしたアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰをバイアルに加え、ゴムセプタムで容器を密封した。バイアルにＡｒ（ｇ）を５分間吹き込んだ。次いでバイアルを７０℃に設定した振盪式ヒートブロックに入れ、一晩反応させた。
【００９１】
【表４】
【００９２】
ゲルをガラスフィルターで濾過し、溶出した溶液を丸底フラスコに回収した。ジオキサンでゲルの洗浄を行い、その後エタノール及び水で洗浄した。
【００９３】
高分子溶液をジエチルエーテル中に沈殿させ、真空乾燥機で乾燥した。次いで乾燥高分子をＴＨＦに溶解し、再度沈殿させた。乾燥したふわふわした粉末が得られる迄この操作を続けた。
【００９４】
実施例５：分析
アミノ基の滴定
変性アガロースの正確なアミン濃度は未知であり、滴定で求める必要があった。用いた方法（ＮＲ０８）は以下の通りである：
・ １５〜２０ｍｌのゲルを水、１００ｍｌの０．５ＭＨＣｌ、最後に２００ｍｌの１ｍＭＨＣｌで洗浄する。
【００９５】
・ テフロン（商標）キューブ（５ｍｌ）の底部に濾紙を置き、これにゲルと１ｍＭＨＣｌのスラリーを満たす。
【００９６】
・ 乾燥ゲルの表面が見えてから引き続き約３０秒間、キューブを水流吸引に接続する。
【００９７】
・ キューブを取外し、水を加えてゲルを滴定カップに移す。
【００９８】
・ ２〜３滴の濃硝酸を加えて滴定を開始する。
【００９９】
アリル基の滴定
以下の方法（ＮＲ０８）を用いた：
・ ゲルを水−エタノール−水−ＨＡｃ−水で洗った。
【０１００】
・ １ｍｌのゲルを上記テフロン（商標）キューブ（ＩＤ６００）で計量し、蒸留水を加えてビンに移し、希釈して総量１０ｍｌにした。
【０１０１】
・ 色が変わらなくなるまで、かき混ぜながらＢｒ２（水溶液）を加えた。
【０１０２】
・ 溶液が無色になるまで、フラスコを吸引した。
【０１０３】
・ 水を用いてフラスコの内容物を滴定カップに移し、３０ｍｌに希釈し、１〜２滴の濃硝酸を加えて、ＡｇＮＯ３による滴定を開始した。
【０１０４】
カルボキシル基の滴定
１ｍｌのゲルをテフロン（商標）キューブで計量した。１５ｍｌの１ＭＫＣｌを用いてゲルを滴定ビーカーに移した。滴定を開始する前に、ｐＨを３未満に下げた。０．１ＭＮａＯＨを用いてｐＨ１１．５まで滴定を行った。
【０１０５】
ＮＭＲ（ＨＲ−ＭＡＳ）によるゲルの分析
高分子被覆ゲルは、ＨＲ−ＭＡＳ（マジック角度回転）を用いて分析した。この方法を用いると、ゲルマトリックスからの妨害が最小の状態で、結合した高分子の分析を行うことが可能である。
【０１０６】
５０μｌのゲルをテフロン（商標）キューブで計量し、１ｍｌの水と、その後５００μｌのＤＭＳＯで２回洗浄した。１０μｌのＴＭＢをプローブの底部に置いた後、ゲルを加えた。ＴＭＢは内部標準としての役割を果たし、定量計算のためのピーク積分値の比較が可能になる。
【０１０７】
ＮＭＲによる純高分子及びモノマーの分析
モノマー又は純高分子（ゲルに結合していない高分子）の１Ｈ−ＮＭＲを試験する場合は、１０ｍｇの試料を０．７０ｍｌの重水素化溶媒に溶解した。
【０１０８】
ＵＶ−ＶＩＳ
ＵＶ分光光度計を用いて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を分析した。緩衝液に溶解した高分子の１％溶液を調製した。使用した緩衝液は、ｐＨが４〜７の０．１Ｍリン酸カリウムであった（同じ緩衝液をＨＩＣで使用する）。この溶液を１ｃｍの試料セルに入れた。水を対照として用いた。５００ｎｍの光透過率を用いて曇点を観察した。測定した温度幅は２０〜７５℃であり、加熱速度は０．５℃／分とした。ＬＣＳＴは、吸光度−温度曲線における変曲点の温度と定義した。
【０１０９】
ＧＰＣ
高分子をＴＨＦに溶解（高分子０．５ｍｇ／ＴＨＦｍｌ）し、この溶液を濾過した後バイアルに入れた。また、３種の異なる分子量を有するＰＳを各々含有する２つの異なる標準を調製し、濾過してバイアルに入れた。次いでこれらのバイアルを自動回転式バイアルホルダーに置いた。試料はこの装置によってホルダーから取出され分析装置に注入された。
【０１１０】
実施例６：クロマトグラフィー評価
カラムの充填
高分子が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））とエタノールのスラリー（２０％ｂ．ｖ．）を、パスツールピペットを用いてカラムに注意深く充填し、カラムの頂部にわずかに２〜３ｃｍの空間を残した。２〜３滴のエタノールを加え、カラムを密封し、ＨＩＣ装置に取り付けた。
【０１１１】
分離材料
タンパク質混合物は、４種のタンパク質：ミオグロビン１．０ｍｇ／ｍｌ、リボヌクレアーゼＡ２．０ｍｇ／ｍｌ、α−ラクトアルブミン０．８ｍｇ／ｍｌ及びα−キモトリプシノーゲンＡ０．８ｍｇ／ｍｌからなるものとした。このタンパク質を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。タンパク質溶液試料はフリーザーに保存した。また、タンパク質は、ミオグロビン１．０ｍｇ／ｍｌ、リボヌクレアーゼＡ２．０ｍｇ／ｍｌ、α−ラクトアルブミン０．８ｍｇ／ｍｌ及びα−キモトリプシノーゲンＡ０．８ｍｇ／ｍｌで別々にクロマトグラフィーにかけた。このタンパク質を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。タンパク質溶液試料はフリーザーに保存した。
【０１１２】
ｐＨ範囲に応じて２つの異なる緩衝液系を用いた（表３参照）。緩衝液Ａは、「塩析」効果を有し、タンパク質−ＨＩＣ媒体相互作用を促進し、緩衝液Ｂの低イオン強度は溶出を促進する。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ｂ１００％まで、塩勾配を用いてＨＩＣ試験を行った。流速は１ｍｌ／分であった。ＵＶ検出器は、２１５、２５４及び２８０ｎｍで動作させた。注入量は５０μｌとした。試験中ｐＨと温度は一定に保持した。
【０１１５】
試験タンパク質の性状
試験混合物に用いたタンパク質の幾つかの性質を示す（表４）。なお、ｐＨ７から４に変化させると、２種のタンパク質（ミオグロビンとリボヌクレアーゼ）はその等電ｐＨを通過し、正味電荷が負から正に変化するが、他の２種のタンパク質はその正の正味電荷を保持する。出典：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
実施例７：高分子分析の結果
ＮＭＲ結果
ＮＭＲ分析による推定値（表５）は、正確な値と見なすべきではない。ピークがはっきり分離していなかったので、この結果はやや信頼性に欠如している。結果は、単一のピークではなくピーク群を比較して推定した。これは好ましいやり方である。ピークの分離が悪かったのは、おそらく高分子が自由に回転できる良溶媒を見出すことが困難であったことによると思われる。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
ＵＶ−ＶＩＳ結果
理論によれば、ＬＣＳＴ値は、疎水性成分を加えると上昇し、コモノマーが親水性の場合は低下すると考えられる。この場合、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと比べて、アクリル酸は親水性が高く、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）は親水性が低い。
【０１２０】
この試験では、ＬＣＳＴは、吸光度−温度曲線における変曲点の温度で表されると定義した。
【０１２１】
低いｐＨでは、ＬＣＳＴ値は３２℃未満であるが、これはＢＭＡを加えていない高分子でも同じである。実際はこの高分子がこれらすべての中で最も低いＬＣＳＴ値を有する。これらの高分子の水溶性はそれほど良くない。１％溶液を作るのも難しい。
【０１２２】
一方、高分子の曇点はｐＨの影響を非常に受けやすい。ｐＨ４〜５では、ＬＣＳＴ値は２５〜３０℃であるが、ｐＨが５を超えると、ＬＣＳＴは約７０℃で観察される。ｐＨ７では、観察した温度範囲（２０〜７５℃）でＬＣＳＴは見られない。ＡＡのカルボキシル基はｐＨ６〜７で帯電しており、親水性したがってＬＣＳＴは上昇する。
【０１２３】
室温でｐＨ７から４へ変化させることは、検討したすべてのＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡ組成について、高分子構造にコンフォメーションの変化をもたらすと判断することができる。ｐＨが５を超えると高分子の親水性は著しく上昇し、ｐＨ７では高分子溶液の曇りは観察されない。
【０１２４】
ＧＰＣ結果
ＮＩＰＡＡＭ、ＡＡ及びＢＭＡの三元共重合体のＧＰＣからのクロマトグラムは、幅広いピーク、時には複数のピークを示す。これは、試料中にホモポリマーとコポリマーがあることを意味する可能性がある。
【０１２５】
【表８】
【０１２６】
反応条件はモノマーの供給比以外同じであるが、連鎖移動剤なしに合成された高分子の多分散性は高く、分子量は系間で著しく異なる（表６）。
【０１２７】
実施例８：ＨＩＣ評価
フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ媒体を用いた対照ＨＩＣ
フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（Ｐｈｅ−ＨＰ）媒体を用いて対照試験を行った。カラムの調製及び用いたクロマトグラフィー方法はすべてのカラムについて同一とした。
【０１２８】
図３ａ及びｂは、我々の標準タンパク質混合物及び個々のタンパク質の両方について、Ｐｈｅ−ＨＰ媒体をｐＨ７及び４で用いて得られた結果を示す。明らかに分かるように、ｐＨ７とｐＨ４で試験したタンパク質混合物のクロマトグラムにはほとんど差がない。かかるｐＨ応答性の欠如は、実際には標準ＨＩＣ媒体では好ましい性状であると見なされる。しかし、どちらの場合も、２つの大きなピーク以上の分解が見られない。個々のタンパク質の試験からも分かるように、ｐＨ７では、第１のピークはミオグロビンとリボヌクレアーゼＡからなり、第２のピークは−キモトリプシノーゲンＡ（二頂ピーク）と−ラクトアルブミン（非常にブロードな低い「ピーク」）からなる。
【０１２９】
ｐＨを４に変化させても、２つの大きなタンパク質混合物のピークが依然として残っている。個々の試験から、これらはやはり各々リボヌクレアーゼＡ、−キモトリプシノーゲンＡの影響を受けていることが分かった。ミオグロビン及び−ラクトアルブミンは溶出されていないように見える。或いは非常にブロードな低い「ピーク」として溶出されている可能性もある。
【０１３０】
ＰＮＩＰＰＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡを用いた対照ＨＩＣ
ＮＩＰＡＡｍ、ＡＡ及びＢＭＡの供給比が異なる４種のゲルをカラムに充填し、ｐＨ４〜７でタンパク質混合物のＨＩＣ試験を行った（表７）。
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
市販のフェニル−ＨＰ媒体（図５）と比べて、４種のゲルすべてが有望なＨＩＣ媒体挙動を示している（図３ａ及びｂ）。ｐＨ４では、Ｕ８７８０３２：３は、溶出時間２２分に大きなピークを有する。このピークはカラムＵ８７８０２９及びＵ８７８０３２：１にも見られる（小さいが）。一方、Ｕ８７８０３２：２のクロマトグラムにはこのピークが完全に欠如している。組成（表７）が似ている２種の媒体（０３２：３及び０２９）で最良の結果が得られた。
【０１３３】
わずかに異なる組成で同じく良好な結果が得られることは、この結果の再現性を示唆するものである。これはまた、かかる媒体の連続生産でわずかな変化があってもよい媒体が得られることを示唆するものである。しかし、結果はＡＡとＢＭＡの比が適切であるかどうかで決まることに留意すべきであり、これについてはさらに検討することが望ましい。
【０１３４】
タンパク質混合物をさらに評価するためにカラムＵ８７８０３２：３を選択し（図６）、個別のタンパク質を用いて位置を確かめた。個別タンパク質のクロマトグラムを以下（図７及び８）に示す。相対溶出塩濃度（硫酸アンモニウム）で表した平均ピーク位置を表８に示す。
【０１３５】
Ｕ８７８０３２：３をｐＨ４〜７で用いたＨＩＣ試験からのすべてのクロマトグラムで、α−キモトリプシノーゲンＡは、小さいピークとこれに続く大きなピークの二重ピーク挙動を示す。上述したようにこれは極めて典型的である。すべてのタンパク質は、ｐＨを低下させると低塩濃度で溶出する（表８及び図６）。これは、ｐＨ応答性高分子媒体によって、低塩条件下におけるＨＩＣの可能性があることを示唆する。
【０１３６】
【表１０】
【０１３７】
ｐＨ７では、タンパク質は、予想される順序、即ちミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、α−ラクトアルブミン及び最後にα−キモトリプシノーゲンＡの順序で溶出する。ミオグロビンとリボヌクレアーゼＡの分解は十分ではないが、タンパク質の分離能は多くの市販媒体と同等である。
【０１３８】
ｐＨを６に変化させると、溶出時間はやや長くなるが、溶出の相対的順序はｐＨ７のときと同じである。ミオグロビンとリボヌクレアーゼＡのピーク間の分離は大きいと思われるが、α−ラクトアルブミン（ｐＩ５）のピークはｐＨ７ほどシャープではない。
【０１３９】
溶出の順序はｐＨ５で変化した。ｐＨ７及び６で最初に溶出するミオグロビン（ｐＩ６．３）は正味電荷が約＋８に変化し、最後に溶出するタンパク質となった。α−キモトリプシノーゲンＡとα−ラクトアルブミンは、ミオグロビンの直前にほとんど同じ塩濃度で溶出する。したがって、リボヌクレアーゼ、α−ラクトアルブミン及びα−キモトリプシノーゲンＡの相対位置は、標準的なＨＩＣ挙動（即ち相対的疎水性）を保持したままである。
【０１４０】
ｐＨ４では、ミオグロビンとα−ラクトアルブミン（酸性ｐＩを有する２つのタンパク質）は、同じ濃度（緩衝液Ｂ１００％）で溶出し、タンパク質混合物では単一のピークが得られる。こうして、溶出の順序は、リボヌクレアーゼＡ、α−キモトリプシノーゲンＡ（塩基性ｐＩを有する２つのタンパク質）、次にα−ラクトアルブミン及びミオグロビンである（図７）。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】４種のタンパク質と数種の市販の媒体の混合物を含む、代表的なｐＨ７塩勾配疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を示す図である。
【図２】図１と同様のクロマトグラムを示すが、他の数種の市販媒体を実証した図である。
【図３】各々ｐＨ７及び４における図１と同様のクロマトグラムを示すが、ｐＨ７から４にしても市販媒体ＨＩＣにはｐＨの有用な効果が無いことを実証した図である。
【図４】本発明の方法に使用されたｐＨ応答性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）高分子コーティングの代表的な構造を示す図である。
【図５】図１及び２と同様の方法を用いて、しかし成分のモル比が異なる様々なｐＨＩＣ高分子コーティングを用いて、ｐＨ４で得られた代表的な塩勾配ＨＩＣ結果を示す図である。
【図６】ｐＨをｐＨ７から４に変化させたときの代表的なｐＨＩＣ高分子コート媒体の結果を示す図であり、ｐＨ７における標準ＨＩＣ媒体と比べて分離能が改良されていること及びかかる分離能の向上、並びにｐＨの変化に伴う異例の選択性制御が示されている。
【図７】図６と同様のクロマトグラムを示すが、図３と比べて分離能の向上が分かるように個々のタンパク質に対するクロマトグラムを示す図である。
【図８】図６及び７の結果の再現性を裏付ける図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明方法は、１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、目標化合物を分離媒体に吸着させた後、媒体から目標化合物を溶出させることによって単離を実施する方法に関する。本発明の方法で用いる媒体は、その表面に局在化したｐＨ応答性高分子を含む。本発明は、分離媒体の製造にｐＨ応答性高分子を使用することも包含する。
【背景技術】
【０００２】
夾雑化学種からの液体の精製、溶液からのタンパク質その他の生体分子のような所望化合物の単離など、様々な用途で溶液中の他の成分から目標化合物が単離される。近年のバイオテクノロジーの発展及び組換え産物の用途の増大に伴い、効率的な精製法に対するニーズが一段と高まっている。大抵の場合、生産される化合物が生体分子であろうと、その他の有機化合物、さらには無機化合物であろうと、使用に際しての安全性を確保するため、生産される化合物に求められる純度の要請が高い。
【０００３】
その汎用性と感度のため、クロマトグラフィーが生体分子及び医薬品の好ましい精製法であることが多い。クロマトグラフィーという用語は密接に関連した一群の分離法を包含し、これらはすべて非混和性の２つの相を接触させるという原理に基づくものである。具体的には、目標化合物を移動相に導入して、これを固定相と接触させるが、固定相は通例固体マトリックスである。目標化合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で一連の相互作用を受ける。相互作用は試料中の成分の物理的又は化学的性質の差異を利用する。相互作用は、電荷、疎水性、親和性などの１以上の異なる原理に基づくものとし得る。
【０００４】
疎水性及び関連相互作用は、濾過及びクロマトグラフィーなどの液体から目標化合物を分離するための様々な用途に利用されている。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）では、移動相は通例水性であり、マトリックスは疎水性基が親水性マトリックスに結合したものからなるのに対して、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）では一般に有機移動相と極性の低い（つまり親水性の高い）マトリックスが用いられる。媒体と溶質表面の相互作用は、塩その他のリオトロピック剤の添加によって促進されることが多い。したがって、ＨＩＣでは通例ＲＰＣよりも疎水性が低く、水性の環境が用いられ、多くの用途ではＨＩＣはＭＷの大きいタンパク質その他の脆弱な物質に適している。しかし、用途によっては、ＲＰＣマトリックスとＨＩＣマトリックスの間に明確な境界線はなく、移動相の選択如何によって決まる。こうした場合、ＨＩＣ用の媒体はＰＲＣにも使えるし、その逆も成り立つ。
【０００５】
目標分子と固定相とのＨＩＣ相互作用は、主に目標分子を水和する移動相の能力によって制御され、疎水性相互作用と共に目標と媒体の相互作用を安定化させる塩その他の添加剤によって影響される。他の相互作用、例えばファンデルワールス相互作用、電荷−電荷相互作用なども、タンパク質の保持、構造の安定化及び各種目標分子での分離能に関して副次的ではあるが重要な役割を果たすことがある。通例、ＨＩＣ媒体への目標分子の吸着は塩濃度の高い移動相で実施され、溶出は低塩濃度で起こる。数種の溶質間の選択性を高めるため塩勾配が用いられることが多い。かかる勾配で流すと、理想的には最も疎水性の高い化合物が最後に溶出する。タンパク質の場合、タンパク質の疎水性とＨＩＣ溶出との関係は完全には解明されていない。疎水性表面領域を有する高度に電荷した可溶性タンパク質は、ＨＩＣで最後に溶出することがある。
【０００６】
タンパク質の精製において、ＨＩＣは、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー法と補完性があるので、関心が高まりつつある。具体的には、ＨＩＣは、ダウンストリームプロセッシングの初期段階（例えば塩析後でイオン交換の前）にも、後期段階で例えば前の処理工程で変性した目標タンパク質の除去などにも成功裏に用いられている。しかし、特定の状況下では依然として短所を抱えている。
【０００７】
ＨＩＣの最も重大な短所の一つは、ＲＰＣにもいえることであるが、処理の際に目標タンパク質が変性しかねないことである。例えば、ＨＩＣで必要とされる高塩濃度の緩衝液は、タンパク質のような変性し易い目標化合物には有害となりかねず、そうした場合、変性が助長されかねない。この問題を軽減するため、カオトロピック剤又はタンパク質安定剤を使用することができるが、これらを除去するための追加の下流工程が必要となり、そのためプロセス全体のコストが増大してしまう。タンパク質の変性は、媒体との疎水性相互作用、及びその後の溶出条件下での媒体からの除去によっても引き起こされることもある。関与する機序は判然としないが、単純化すれば、移動相と媒体の界面自由エネルギー差に適応するように、しかも表面基との疎水性その他の相互作用を介してタンパク質自体の界面自由エネルギーの低下を促すようにタンパク質がコンフォメーションを変えることと関係していると思われる。こうした変性の問題は、タンパク質を媒体から溶出した後もタンパク質がその新しいコンフォメーションを保持していることである。
【０００８】
以上のことから、タンパク質の変性しにくい条件下で、その疎水性に基づいてタンパク質その他の分子を分離するクロマトグラフィーその他の分離表面の開発に多大な関心がもたれている。
【０００９】
荷電していない疎水性リガンドを用いる伝統的なＨＩＣ媒体に代わるものとして、Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ他（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１３，Ｊｕｌｙ，２０００）は、変性し易い生体高分子、特に抗体を単離するための疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）と名付けられた方法を提案している。市販品のＢｉｏＳｅｐｒａ ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）はこの種の相互作用に基づくものであり、リガンドとして４−メルカプトエチルピリジンを含んでいる。理論的には、このリガンドは中性ｐＨでは非荷電で、穏和な疎水性相互作用で分子と結合する。ｐＨを下げるとリガンドは正に帯電し、疎水結合はおそらくリガンドの荷電基とタンパク質との静電反発力で打ち消される。しかし、この方法には幾つかの問題が予見できる。第１に、溶出ｐＨで正味正電荷となる適当なｐＩの目標タンパク質が必要とされる。第２に、タンパク質は、溶出ｐＨで実質的に正味の正電荷を有する必要がある。第３に、用いられるピリジン基はそのｐＫａが中性の７に近いため、π結合の重なり、キレート化、イオン交換、カチオン−πのような他の安定化相互作用を促進して、その機能を損なうおそれがある。
【００１０】
常用される小さなリガンドに代わるものとして、大きな分子、特に高分子を分離用途における固定相として使用することが提案されている。
【００１１】
例えば、国際公開第０２／３０５６４号（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社）には、刺激応答性高分子をアフィニティクロマトグラフィーに使用することが開示されている。具体的には、「インテリジェント又は応答性高分子」としても知られるかかる刺激応答性高分子は、適当な刺激に暴露されるとその物理化学的性質が構造的で可逆的に変化する。この変化によって、かかる高分子の溶液中での自己会合にみられるような顕著な疎水性が、顕著な親水性、つまり水和作用へ変換される可能性があり、その逆もまた同様である。最も一般的で検討されている刺激は温度変化であるが、国際公開第０２／３０５６４号で提案されている代替刺激は、光、磁場、電場及び振動である。これら４つの刺激は、若干の技術的な困難は伴うものの分析用マイクロカラムのようなコート表面の総面積が小さい用途では使用できるかもしれないが、大きなカラム及び表面を伴う用途でうまく使用できるか疑問である。分離媒体からの目標物質の溶出を促すために注意深い温度制御が必要な場合は、媒体周囲の条件を一定にすることも必要になると思われる。その結果、使用する装置に対する要求が高くなる。提案された代替刺激の使用にも同様の短所が含まれると思われる。興味深いことに、国際公開第０２／３０５６４号は、塩、有機溶媒、酸及び塩基などの添加された化学物質のために、不活性化、回収率の低下などの問題を引き起こす恐れがあるので、塩、無機溶媒、ｐＨなど、溶出液の組成を変化させることによって溶出することは望ましくないことがあると記載している。
【００１２】
アフィニティクロマトグラフィーの他の一例が、米国特許第５９９８５８８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に記載されている。この特許は、相互作用性分子コンジュゲート、具体的には、これを利用してレセプター−リガンド相互作用や酵素−基質相互作用など分子間のアフィニティ若しくは認識相互作用を変調若しくは「切換える」ことができる材料に関する。したがって、開示されたコンジュゲートは刺激応答性高分子成分と相互作用性分子の組合せである。これらの高分子は、ｐＨ、光その他の刺激を変化させることによって操作することができる。刺激応答性成分を相互作用性分子の特定部位に結合させると、隣接するリガンド結合部位、例えば抗体の抗原結合部位又は酵素の活性部位に結合するリガンドを変えるようにこれを操作することが可能になる。
【００１３】
欧州特許第１０８１４９２号（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社）には、高分子コーティングを固定相とする他の例が記載されている。この特許では、帯電した共重合体からなるクロマトグラフィー充填材が開示されている。具体的には、開示されたイオン交換機能を持つ充填材は、例えばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）を正に帯電したジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡｍ）と共重合させることによって調製できる。得られる充填材は、逆相クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの両方で使用することができる。かかる充填材に吸着した物質の溶出は、温度を変化させることによって固定相表面の疎水性／親水性バランスを変化させることによって行われる。しかし、上記のように温度制御には短所がある。例えば、温度制御には、小さいカラムでも、一般にヒーター、浴、温度計、カラムジャケット及びポンプなどの特別な装置が必要である。かかる方法を大きなカラムに適用すると、カラムジャケット間の流体シール漏れ並びに長軸及びカラム径方向の不均一な温度分布を含めた当然随伴する問題が発生すると思われるので、装置の関与が大きくなる。大きなカラムでは温度勾配が流れの混合及び物性（例えば粘度）の差をもたらす可能性があり、これはゲルベッド全体の物質移動及び性能につながる。
【００１４】
欧州特許第０８５１７６８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｅａｔｔｌｅ）は、刺激応答性高分子及び相互作用性分子を使用して、分析、アフィニティ分離、処理などに有用な部位特異性コンジュゲートを形成することを提案している。この高分子は、ｐＨ、温度、光その他の刺激を変化させることによってこれを操作することができる。相互作用性分子は、ペプチド、タンパク質、抗体、レセプター又は酵素のような生体分子とすることができる。刺激応答性コンジュゲートを相互作用性分子の特異部位に結合させると、刺激応答性成分を操作して隣接する結合部位へのリガンドの結合を変えることができる。上記のように、この結合はアフィニティ基によるものであり、その結果提示された材料のアフィニティ認識相互作用を「切換える」ことができる。具体的には、目標化合物のアフィニティ部位に対する高分子の物理的関係が上記の変化によって制御される。さらにリガンドその他のアフィニティ物質が開示されているが、応答性高分子をかかる物質にグラフトすることによってその基本的な相互作用は望み通り改変される。
【００１５】
Ｔｕｎｃｅｌ ｅｔ ａｌ（Ａｌｉ Ｔｕｎｃｅｌ，Ｅｎｄｅｒ Ｕｎｓａｌ，Ｈｕｓｅｙｉｎ Ｃｉｃｅｋ：ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７７，３１５４−３１６１，２０００）は、アミン官能化モノマーＮ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭ）の懸濁重合によって均一なゲルビーズを製造することが記載されている。開示された架橋ゲルビーズは、ｐＨ感受性、可逆的、膨潤及び解膨潤挙動を示し、ＤＮＡ吸着用に提案されている。しかし、開示されたビーズの使用分野はその剛性によって制約されると思われる。この剛性は薬物の送達などの用途には十分であるが、高い流速が望ましい用途では不十分であると思われる。例えば、充填クロマトグラフィーベッド内の液の流れは不可避的にかかるビーズを崩壊させると思われるので、その吸着特性は低下することになろう。
【００１６】
最後に、国際公開第９６／００７３５号（Ｍａｓｓｅｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）には、目標タンパク質又はペプチドの精製に有用なクロマトグラフィー用樹脂が開示されている。具体的には樹脂−目標コンジュゲートが開示されており、樹脂は選択されるイオン性リガンドを共有結合した担体マトリックスを含む。リガンドは、ペプチドが樹脂に吸着するｐＨでは静電帯電しておらず、ペプチドが脱着するｐＨでは静電帯電している。非荷電の樹脂への吸着は疎水性相互作用によって行われるのに対し、脱着は電荷の反発作用によって行われる。リガンドとしては、アミノ基、カルボキシル基、ヒスチジル基、ピリジル基、アニリン基、モルフォリノ基又はイミダゾール基が挙げられる。さらに、スペーサーアームを介してリガンドを支持体に結合させることができる。スペーサーアームはこの発明に必須ではないが、例えばβ−アラニン、アミノ酪酸、アミノカプロン酸などから誘導することができる。スペーサーが存在してもイオン性基を含まないので、開示された樹脂の脱着特性には貢献できない。したがって、国際公開第９６／００７３５号に開示されたリガンドはすべて比較的小さい有機分子であり、各リガンドは通常１つの官能基を有する。したがって、この樹脂のリガンドは上述の刺激応答性高分子とは全く異なる。
【特許文献１】国際公開第０２／３０５６４号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５９９８５８８明細書
【特許文献３】欧州特許第１０８１４９２号明細書
【特許文献４】欧州特許第０８５１７６８号明細書
【特許文献５】国際公開第９６／００７３５号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１３，Ｊｕｌｙ，２０００
【非特許文献２】Ａｌｉ Ｔｕｎｃｅｌ，Ｅｎｄｅｒ Ｕｎｓａｌ，Ｈｕｓｅｙｉｎ Ｃｉｃｅｋ，“ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７７，３１５４−３１６１，２０００
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，“Ａ ｎｅｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ− ａｎｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９６，１２５１−１２５９（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の１つの目的は、通常のＨＩＣ媒体に比べて選択性及び／又は分離能向上した疎水性相互作用（ＨＩＣ）分離媒体を提供することである。具体的な目的は、選択性及び／又は分離能が向上し、回収率が通常のＨＩＣ媒体と少なくとも同等である、かかる媒体を提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、１種以上の目標化合物を液体から同定又は単離する方法を提供することである。この方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に常用される相互作用を利用して、移動相のｐＨ及び／又は塩濃度によってその相対的疎水性を変化させることができる媒体に目標化合物を吸着させる。この場合、疎水性は、ＨＩＣ媒体として常用されるアルカン又はフェニルリガンド系表面コーティングに対するタンパク質の吸着によって判定する。
【００１９】
本発明の特定の目的は、ｐＨ制御を用いて、リガンドを荷電又は非荷電にして吸着を促進又は低下させるだけでなく、相対的な相互作用を変化させる方法を提供することである。したがって、本発明を分離目的に使用すると作業者は他の変数即ちｐＨを持つことになり、これを用いて本方法の分離能を操作することができる。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、目標化合物の天然構造及び活性の観点から、吸着及び溶出条件下で従来技術の方法よりも完全性を維持しやすいクロマトグラフィー法を提供することである。特定の目的は、タンパク質などの巨大分子を分離するための方法を提供することである。本発明によれば、これは、液体から１種以上の目標化合物を同定又は単離する方法によって実現することができる。この方法では疎水性相互作用を利用して目標化合物を媒体に吸着させる。具体的には、前記媒体は、吸着及び溶出プロセス時に目標化合物に対するコンフォメーションを変化させる可撓性高分子表面コーティングを備えたマトリックスからなる。かかる変化は、ｐＨ及びＨＩＣで以前使用された他の刺激例えば塩濃度によって影響を受ける。したがって、本方法によって、作業者は、未変性又は変質した目標材料の回収率に影響を及ぼす操作変数の制御を改良することができる。
【００２１】
本発明の特定の目的は、疎水性相互作用が、目標化合物に対するその表面疎水性を例えばｐＨの変化によって変えることができる媒体への目標化合物の吸着に利用される主要な相互作用である、クロマトグラフィー法を提供することである。この場合、ｐＨの変化は、移動相塩濃度の有意な変化、又は有機溶媒若しくは極性を変化させる高分子添加剤などの移動相変性剤の使用には左右されない。本方法は、例えば塩濃度、有機溶媒及び高分子移動相変性剤などに関わる広範囲の移動相で利用することができる。
【００２２】
本発明の特定の目的は、従来技術と比べて可能な運転条件が広くなると共に運転経費が低減する上記のＨＩＣ方法を提供することであり、且つ従来技術のＨＩＣ方法よって運転装置への悪影響が少ない方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、疎水性相互作用を利用して媒体に目標化合物を吸着させるクロマトグラフィー法を提供することである。この方法によって、ＨＩＣが用いられることが多い中性ｐＨ領域で溶解性が低いタンパク質及びポリペプチドにＨＩＣを使用することが可能になる。これは、疎水性相互作用を、マトリックス表面に局在化した高分子のコンフォメーション、並びにｐＨと関連したタンパク質−高分子相互作用に関連づける方法によって実現される。
【００２４】
本発明の別の目的は、標準的なＨＩＣ媒体と同じ順序でタンパク質を溶出させるが、選択されるタンパク質の媒体との相対的相互作用、即ち他のタンパク質に対するこのタンパク質のピーク溶出位置をｐＨの変化によって変化させる、クロマトグラフィー法を提供することである。したがって、本方法は、ＨＩＣ方法で得られる分離能を向上させることができる。
【００２５】
本発明の他の目的は、製造に適したクロマトグラフィー材料を使用するクロマトグラフィー法を提供することである。これは、常用されるアルカン又はフェニル基などの特定の疎水性リガンドではなく、表面局在化高分子を呈するマトリックスの使用によって実現することができる。後者は、元の表面の疎水性の改質、リガンドを結合させる基の連結などの疎水性コーティングの使用に関連する生産コストを必要とすることが多い。本方法を用いることによってこれを回避することができる。
【００２６】
本発明の最後の目的は、タンパク質などの様々な目標化合物の望ましい分離を行うために必要な媒体の範囲を狭くすることである。これは、その固有の表面疎水性をｐＨ制御によって変えることができる分離媒体を使用することによって、本発明に従って実現することができる。標準的なＨＩＣ媒体が持つ疎水性の固有の範囲は、異なるアルカン基を有する媒体によって、しばしば２つ以上の表面密度で与えられるので、各用途に対して製造し試験しなければならない媒体の範囲が狭ければ供給元にもユーザーにも有利である。
【００２７】
本発明の他の目的及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。
【００２８】
定義
「表面局在化」という用語は、表面近傍における分子その他の物質の局在化を意味する。これは、吸着、共有結合などの任意の通常の相互作用によって実現することができる。
【００２９】
「表面」という用語は、マトリックスの外面を意味し、多孔質材料の場合は、内面又は気孔表面を意味する。
【００３０】
「マトリックス」という用語は、本明細書ではクロマトグラフィー及び濾過などの同定及び単離分野に使用される通常の固体坦体の任意の１種について用いる。
【００３１】
「分離媒体」は、上に定義したマトリックスからなり、これにリガンド又は高分子などの結合基が結合されている。
【００３２】
「疎水性」という用語は、本明細書でも、クロマトグラフィーの分野で一般に使用されている意味で用いる。この分野で「疎水性」という用語を定義するには、例えば溶解性の観点から周知の多くの共通の方法がある。
【００３３】
「脱着」及び「放出」という用語は、本明細書で区別なく用いられている。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
第１の態様では、本発明は、１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、
（ａ）液体を、第１のｐＨ値で、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、目標化合物を吸着させる段階と、
（ｂ）ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす第２のｐＨ値の溶出液を加えて、分離媒体から１種以上の前記目標化合物を放出させる段階と
を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本方法の一実施形態では第２のｐＨ値は第１のｐＨ値よりも低い。最も有利な実施形態では溶出液はｐＨ低下勾配を備える。吸着力は、高分子と目標化合物の相互作用に左右されるので、異なる目標化合物は、段階的又は線形ｐＨ勾配などのｐＨ勾配によって媒体から示差的に溶出することができる。したがって、有利な実施形態では段階（ｂ）は２種以上の目標化合物の示差的な溶出である。本方法では各々の目標化合物を純粋又は実質的に純粋な画分として溶出させることができる。アルコール、界面活性剤、カオトロピック塩などの常用される添加剤を溶出緩衝液中に使用して、段階（ｂ）における脱着時の選択性に影響を及ぼすことができる。しかし、高濃度のかかる添加剤にさらすことによって目標化合物を変性又は不活性化しないように注意することが望ましい。
【００３６】
勾配溶出法はクロマトグラフィー分野で周知の方法であり、当業者は通常の酸／塩基系を用いた適当な勾配を容易に決めることができる。
【００３７】
したがって、本実施形態では、ｐＨの変化によって高分子の物理的状態を変えることができる。高分子の性質に応じて、高分子が自己会合する傾向、及びその疎水性との関係で材料に対する表面の吸着性が高まる傾向を、ｐＨの変化によって増大又は減少させることができる。図５〜８に示す例ではこの傾向はｐＨを下げると共に増大する。その結果、一般にタンパク質が表面から溶出する塩濃度は低下する。これは、図１及び２に示すように、標準的なＨＩＣ媒体表面の疎水性を高めたときに見られるのと同じ機構である。
【００３８】
明らかにこの逆も真であり、吸着性が低下するようにｐＨを変化させるに連れて、媒体とタンパク質その他の吸着剤との相互作用は弱くなる。この文脈において、ｐＨに関連した高分子のコンフォメーションの傾向は、吸着及び脱着のｐＨ制御に影響を及ぼすことが分かる。しかし、当業者には自明であろうが、本方法において目標化合物は、図３に示すようにマトリックス表面からの放出を促進するのに十分ではない方法で、わずかではあるがコンフォメーションの変化も受ける。したがって、かかるケースも本発明の範囲内に包含される。したがって、本方法における化合物の吸着及び放出は、主に、しかも好ましくは、大部分がｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化によって促進される。
【００３９】
本方法を利用して、上記のように目標化合物を吸着させることによって目標化合物を単離することができる。したがって、本方法の一実施形態では吸着した化合物が目標化合物である。別の実施形態では本発明を利用して望ましくない化合物を吸着させることによってこれを液体から除去し、目標化合物を通過させる。特定の実施形態では上記の吸着は、目標化合物の満足すべき単離及び／又は同定を可能にする事実上の障害物である。
【００４０】
本方法の別の実施形態では溶出液の導電率が段階（ａ）の液体の導電率と異なるが、第２のｐＨ値は第１のｐＨ値と等しく又は少なくとも実質的に等しく保つ。タンパク質の単離に最も有利な実施形態では溶出は中性又はアルカリ性ｐＨで行われる。導電度の変化は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに常用される任意の１種など、一般に適当な塩の添加によって与えられる。有利な実施形態では溶出液は塩勾配を含む。吸着力は高分子と目標化合物の相互作用に左右されるので、異なる目標化合物は、段階的又は線形塩勾配などの塩勾配によって示差的に溶出することができる。有利な実施形態では段階（ｂ）は２種以上の目標化合物の示差的な溶出である。本方法では各々の目標化合物を純粋又は実質的に純粋な画分として溶出させることができる。アルコール、界面活性剤、カオトロピック塩などの常用される添加剤を溶出緩衝液中に使用して、段階（ｂ）における脱着時の選択性に影響を及ぼすことができる。しかし、高濃度のかかる添加剤にさらすことによって目標化合物を変性又は不活性化しないように注意することが望ましい。勾配溶出法はクロマトグラフィー分野で周知の方法であり、当業者は適当な勾配を容易に決めることができる。
【００４１】
特定の実施形態では上記のｐＨ及び塩勾配溶出法を組み合わせて、両者の原理を吸着した１種以上の化合物の溶出に利用する。
【００４２】
要約すると、本方法の段階（ａ）ではｐＨ応答性高分子の性質に応じて、当業者は容易に吸着条件を適合させることができる。例えば、周知のように、高い表面張力は、疎水性表面上へのタンパク質の吸着に好ましい疎溶媒性の環境を与える。したがって、モル表面張力の高い塩の使用は、タンパク質などの目標化合物の媒体への保持を増大させることになる。ＨＩＣで最も一般的に使用される塩は硫酸アンモニウムである。しかし、非常にアルカリ性の環境ではこれを使用することができない。その他の有用な塩としては、例えば、グルタミン酸モノナトリウム、グアニジン、硫酸ナトリウム及びアスパルギン酸ナトリウムが挙げられる。これらはｐＨ約９．５で使用するのが有利である。本方法は室温で行うのが最も有利である。
【００４３】
一実施形態では目標化合物の吸着はｐＨ応答性高分子と目標化合物の疎水性相互作用によって与えられる。したがって、本実施形態の基本を形成する原理を、本明細書では、「ｐＨ応答性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）」と表すことがある。特定の実施形態では目標化合物の吸着は、関連相互作用を追加した疎水性相互作用によって与えられる。かかる関連相互作用は、電荷−電荷相互作用、ファンデルワールス相互作用及び共溶媒和／共水和からなる群から適切に選択される。一定のｐＨ及び塩濃度における特定のタンパク質の場合などに関する別の実施形態ではかかる１以上の関連相互作用が支配的である。しかし、一般に、かかる他の相互作用は疎水性相互作用と比べて二次的である。
【００４４】
具体的には、塩勾配疎水性相互作用を用いた実施形態ではタンパク質などの目標化合物は、段階（ａ）において、表面の疎水性、１種以上の目標化合物の疎水性、及び溶出液の性質との関係で吸着される。したがって、これらの相互作用は、一般に例えばアルカン又は芳香族疎水性リガンドをコーティングした坦体又はマトリックスを含む標準的なＨＩＣ媒体に共通の相互作用の型を模倣しているという点で、主として疎水性である。
【００４５】
したがって、ｐＨ応答性高分子を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に基づく本発明は、Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ等が提案した上記の電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）とは異なる。この電荷誘導クロマトグラフィー（ＣＩＣ）では（１）用いるリガンドは低ＭＷ分子であって本発明のように高分子ではない、（２）結合時はリガンドを中性、非結合時はこれを陽性にするように移動相のｐＨを変化させる、（３）ｐＨの変化に応じてリガンドのコンフォメーションを変化させることをＢｏｓｃｈｅｔｔｉ等は提案していない、（４）誘導しうる荷電基を疎水性リガンドに結合させ、実質的にはこれが標準的なＨＩＣリガンドの変性を意味する。ＣＩＣ法で予見できる幾つかの問題、例えば（ｉ）荷電形態のＣＩＣリガンドに対するタンパク質荷電基の親和性、（ｉｉ）電荷−電荷相互作用がＨＩＣ緩衝液の高い塩濃度によって遮蔽されてしまうこと、並びに（ｉｉｉ）リガンド密度と媒体の性能の関係、などの要因によって引き起こされる問題は、本発明によって回避される。
【００４６】
本方法の一実施形態ではｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化は、ｐＨの低下によって引き起こされる疎水性の低いコンフォメーションへの変化である。別の実施形態では高分子のコンフォメーション変化は、高分子の自己会合及び／又はマトリックスとの会合に基づいている。
【００４７】
当業者は、ｐＨが上昇又は低下するに連れて、水溶液その他の溶液で疎水性の高いコンフォメーションを経由して疎水性の低いコンフォメーションへ変わる、適当なｐＨ応答性高分子を製造することができる。これには自己会合が付随して起こることが多いが、自己会合は高分子が溶液中で自由なときに溶液から出てくることによって検出される。水溶液系における温度応答性高分子については、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）がある。ｐＨ応答性高分子のＬＣＳＴはｐＨで変化すると共に、その他の因子、例えばイオン強度及び溶液中のイオンその他の添加剤の種類の影響を受ける可能性もある。かかる高分子が表面に結合すると、高分子のコンフォメーション変化はそのまま保持され、表面の相対的疎水性を高分子の疎水性と同様に変化させる。このように、表面に会合した高分子は自己会合し、ｐＨに応じてコンフォメーションを変化することができる。
【００４８】
ｐＨ応答性高分子を結合させるマトリックスは、分離プロセスの妨げになりかねない電荷を持たない限り、ｐＨ応答性高分子の結合が可能な任意の有機又は無機多孔質材料とすることができる。したがって、一実施形態ではマトリックスは、架橋アガロースなどの疎水性炭水化物からなる。この場合は、下記の実験の部で詳細に記載するように、マトリックス材料は、最初に好ましくはＮａＯＨなどの塩基の存在下で周知の方法に従って適当な程度までアリル化した後、アミノ化してその後の高分子の結合を可能にする。別の実施形態ではマトリックスを初めアリル化した後、表面にモノマーをグラフトすることによってｐＨ応答性高分子コーティングを得る。この実施形態ではモノマーを表面に直接共重合させる。モノマーの選択によって、所望の応答性を有する高分子の調製が可能になる。例えば、当業者は、常法を用いて所望のＬＣＳＴを有する高分子コーティングを容易に調製することができる。特定の実施形態ではｐＨ応答性高分子を温度応答性高分子と結合させて独特の特徴を得ることができる。別の実施形態ではグラフト技術によってかかるマトリックスを調製することができる。
【００４９】
別の実施形態ではマトリックスはシリカ又は合成共重合体材料である。必要に応じ、マトリックスを上述の如くアリル化した後アミノ化する。クロマトグラフィーの場合は、使用する前にマトリックスの残りのアミノ基をアルキル化することが特に好ましい。かかる基は化合物の分離低下を引き起こす恐れがあるからである。
【００５０】
本方法で有用なｐＨ応答性高分子は、ｐＨに対する感受性が高い任意のものとすることができる。この場合、周囲のｐＨの変化が高分子のコイルで有意のコンフォメーション変化を引き起こす。この種の高分子の総説については、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，“Ａ ｎｅｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ− ａｎｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９６，１２５１−１２５９（１９９５）を参照されたい。特定の実施形態ではこのｐＨ応答性高分子は、ｐＨ２〜１３、例えば２〜１２、３〜１２、４〜７、又は７〜１０の範囲でｐＨ応答性である。
【００５１】
簡単に言えば、本明細書で有用な合成ｐＨ感受性高分子は、一般に、アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡＡｃ）、無水マレイン酸（ＭＡｎｈ）、マレイン酸（ＭＡｃ）、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、Ｎ−ビニルホルムアミド（ＮＶＡ）、Ｎ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）（最後の２つは重合後加水分解してポリビニルアミンにすることができる）、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）、ホスホリルエチルアクリレート（ＰＥＡ）又はメタクリレート（ＰＥＭＡ）などのｐＨ感受性ビニルモノマーに基づくものである。かかるｐＨ感受性高分子は、アミノ酸（例えば、ポリリシン若しくはポリグルタミン酸）からポリペプチドとして合成することもできる。或いは、タンパク質（例えば、リゾチーム、アルブミン、カゼインなど）、又は多糖類（例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラギーナン、キトサン、カルボキシメチルセルロースなど）又はＤＮＡなどの核酸などの天然高分子から誘導することもできる。
【００５２】
一実施形態ではｐＨ応答性高分子はコモノマーである。別の実施形態では各ｐＨ応答性高分子は疎水性部分と親水性部分とｐＨ応答性部分からなる。好ましくは、ｐＨ応答性部分は、第１級、第２級又は第３級アミンなどのアミン及び／又はアクリル酸からなる。これらは一定のｐＫａ値でプロトン化する。
【００５３】
特定の実施形態ではｐＨ応答性高分子は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、―ＳＯ２ＮＨ２基、―ＲＮＨ２基、Ｒ２ＮＨ基及びＲ３Ｎ基（式中、ＲはＣである）からなる基から選択されるｐＨ応答性基を含む。
【００５４】
特定の実施形態では高分子の疎水性を与える又は疎水性を高める１以上の官能基を含有するように、本ｐＨ応答性高分子を設計することができる。本方法における最も好ましい官能基は、不飽和系例えばアルケン又は芳香族系に見られるような炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）である。
【００５５】
本方法で使用されるｐＨ応答性表面は、当業者が有機合成高分子化学を用いて官能基の単層又は多層として設計することができる。一般に、本明細書で有用なｐＨ応答性高分子は、常法に従って、分子量が約１０００〜約２５００００ダルトン、例えば約２０００〜約３００００ダルトンになるように合成することができる。当業者には自明であろうが、下限は表面被覆や疎水性の程度などの要因で決まり、上限は高分子／拡散効果などの要因で決まる。
【００５６】
上記の如く、ｐＨ応答性高分子を例証する１つの型は、１つのアミノ基と１つのカルボキシル基を有するアミノ酸から調製することができ、これを多糖マトリックスに結合することができる。このモノマーはラジカル重合で容易に重合し、ｐＨ４〜８の領域で一定の膨潤を示し、酸性及び塩基領域で膨潤が増大するマトリックスが得られる。高分子をマトリックス表面に結合させる別の方法は、表面グラフト法である。この方法では、一定の大きさのｐＨ応答性高分子をまず合成し、次いでこれを坦体にグラフトする。可逆的なｐＨ応答性表面を作製するさらに別の公知の方法は、「閉込め官能化」である。この方法では、精巧な標識ポリエチレンオリゴマーが作製される。その場合、これらのオリゴマーを、添加剤を含まないＨＤＰＥと混合することができる。高分子と官能化オリゴマーの両方を溶解することによって、官能化ＰＥフィルムの製造に使用できる均質な溶液が得られる。
【００５７】
別の実施形態では本方法は、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−プロピルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＰＰ）、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−メチルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＭＰ）及びポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｎ’−エチルピペラジン）（ＰＡｃｒＮＥＰ）などの高分子を使用する。これらは、ｐＨと温度の両方に感受性を有するヒドロゲルである。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート［ＤＭＥＥＭＡ］系高分子は、温度とｐＨに応答性を有するヒドロゲルのもう１つのグループである。
【００５８】
本法の一実施形態では１種以上の目標化合物はタンパク質又はペプチドのような生体分子である。この点で特に適当なタンパク質の具体例としては、抗原、セルラーゼ、糖タンパク質、ホルモン、免疫グロブリン、リパーゼ、膜タンパク質、核タンパク質、胎盤タンパク質、リボゾームタンパク質及び血清タンパク質が挙げられる。目標化合物は、どんな液体中に存在してもよいが、一般には水溶液中に存在する。但し、吸着プロセスに適合し、ｐＨ応答性高分子又は目標化合物に決して有害ではないことが条件である。一実施形態ではこの液体は発酵液であり、目標化合物はその中で製造されたタンパク質又はペプチドである。かかる発酵液は、ｐＨ応答性高分子の性質に応じて希釈してもよく、粗抽出物のように希釈しなくてもよい。
【００５９】
現在の最良の実施形態では本発明の方法はクロマトグラフィー法である。かかるクロマトグラフィー法は、大量生産に至るあらゆる規模での調製用とすることもでき、或いは分析用とすることもできる。したがって、特定の実施形態では本方法は分析法である。具体的な実施形態では分離用マトリックスは、マイクロタイタープレート、バイオセンサー、バイオチップなどである。別の実施形態では本発明は細胞培養に使用される。本方法は、小規模の装置でも大規模の装置でも同じように有用である。
【００６０】
別の実施形態では本方法は濾過法である。この場合、マトリックスは、上記のｐＨ応答性高分子を標準法に従って結合させた任意の周知の材料とすることができる。濾過の一般原理は当業者には周知である。
【００６１】
別の態様では本発明は、クロマトグラフィー媒体の製造に、上記定義のｐＨ応答性高分子を使用することに関する。したがって、本発明は、適当な共重合体を、アガロースなどのマトリックスにグラフトする方法も包含する。この方法では、共重合体の性質は、所望の環境下でｐＨ応答性になるように設計される。
【００６２】
最後に、本発明は、ｐＨを変化させることによって表面吸着を増大又は減少させるｐＨ応答性高分子の使用も包含する。溶液中又は表面上の高分子が、溶液中又は前記表面に局在化した巨大分子又はコロイドなどの、タンパク質その他の分子と相互作用できることは一般の現象である。かかる相互作用は、被覆表面−タンパク質相互作用などの高分子−タンパク質相互作用をもたらす可能性があるが、これは高分子と他方の材料の化学基に大きく左右される。したがって、かかる相互作用は、様々な化学的相互作用、例えば、共水和、疎水性、ファンデルワールス及び水素結合と関連し、且つ他方の材料の独特な構造を反映すると考えられる。これらの相互作用を使用して、表面と材料との相互作用を様々に制御することができる。かかる相互作用は高分子の自己会合傾向を促進し安定化させる可能性があることに留意されたい。
【００６３】
具体的には、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離マトリックスの使用によって、１種以上の目標化合物が液体の他の成分から分離される。最も有利な実施形態ではｐＨ応答性高分子は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、―ＳＯ２ＮＨ２基、―ＲＮＨ２基、Ｒ２ＮＨ基及びＲ３Ｎ基（式中、ＲはＣである）からなる基から選択されるｐＨ感受性ペンダント基を含む。特定の実施形態では前記高分子は原位置でマトリックス表面上に重合させる。
【００６４】
したがって、本発明は、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体を使用して液体中の他の成分から生体分子を分離する方法を包含する。上記のように、かかる分離法はクロマトグラフィー法又は濾過法とすることができる。これを使用することは、従来の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の有利な代替法である。ｐＨ応答性高分子に関する詳細は、本発明の方法に関連して上述した通りである。
【００６５】
最後に、本発明は、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体にも関する。特定の実施形態では高分子のｐＨ応答性基は、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる基から選択される。本媒体及びその使用に関する詳細は、本発明の方法に関連して上述した通りである。
【００６６】
さらに、本発明は、目標化合物を単離するためのキットであって、別々のコンパートメントに、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体を充填したクロマトグラフィーカラムと、第１のｐＨを有する吸着緩衝液と、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨを有する溶出液と、その使用説明書を含むキットも包含する。前記使用説明書は、本発明の方法を実施する方法の使用説明書を含んでもよい。
【００６７】
図１は、様々な従来のＨＩＣ媒体、即ち上から下へ：Ｅｔｈｅｒ ６５ＯＳ（商標）、Ｅｔｈｅｒ ５ＰＷ（商標）、Ｐｈｅｎｙｌ ６５ＯＳ（商標）及びＰｈｅｎｙｌ ５ＰＷ（商標）（Ｔｏｓｏｈ）、並びにＰｈｅｎｙｌ ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））に関するクロマトグラムを示す。これらの媒体はそのリガンド（フェニル又はエーテル基）によって表される。この例では、４種のタンパク質（ミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、α−ラクトアルブミン及びα−キモトリプシノーゲンＡ）（その性質の幾つかは実験の部で表にした）を、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に加えた。この緩衝液は後で０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４まで勾配として使用される。単一のタンパク質を用いた試験によれば、これらのタンパク質は上記の典型的な「標準的」ＨＩＣの順序で溶出することが分かる。以下のことが認められる：（ａ）タンパク質はすべて、カラムから同じ順序で溶出する傾向がある−ピークの分離能は異なるが相対的なピーク位置は変わらない；（ｂ）幾つかの媒体はこれら４種のタンパク質のピーク分離能が他のものよりも優れている；（ｃ）これらの媒体は異なるタンパク質を異なる塩濃度で溶出させるように見える。例えば、上から下へエーテルからフェニルリガンド被覆媒体に変わると、ミオグロビンのピークは２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４で、次いで約１Ｍで溶出するように見える。これは、フェニル基とエチル基の疎水性の違いに呼応しており、タンパク質の相互作用はフェニル被覆媒体の方が強いことを示唆するものである。
【００６８】
図２は、同じタンパク質と同じ条件、並びに以下の様々なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）媒体（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて図１と同様に実施した「標準的」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。これらの媒体は下から上へ、１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（低密度）；２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（高密度）；３．Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ；及びＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦである。但し、「密度」とは相対的なリガンド密度を表すものであり、媒体の疎水性が高くなると共に高くなる。市販の媒体はそのリガンドとリガンド密度によって表す。個々のタンパク質の試験（図示せず）によれば、これら４種のタンパク質は図１に見られる順序で溶出するが、さらに以下のことを示唆している：（ａ）これらのタンパク質は２つのピーク（ミオグロビンとリボヌクレアーゼ、その後α−ラクトアルブミンとα−キモトリプシノーゲンＡ）にしか解像されない；（ｂ）低密度のフェニル基を有する媒体から高密度の媒体に変えると、ピークは低塩濃度で溶出する（疎水性の高い媒体表面の相互作用の方が強いことを示す）；並びに（ｃ）媒体の疎水性はリガンドの疎水性だけでなく密度によって決まる。したがって、疎水性は最も高いリガンドだが最も低いリガンド密度（８ｕｍｏｌｅ／ｍｌゲル、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ参照）を有するオクチル媒体におけるタンパク質ピークは、ブチル（５０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）又はフェニル低密度（２０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）若しくは高密度（４０ｕｍｏｌｅ／ｍｌ）媒体よりも前に溶出する。なお、図１のフェニル−ＨＰ媒体のリガンド密度は２５ｕｍｏｌｅ／ｍｌゲルである。
【００６９】
図３ａは、図１及び２の４種のタンパク質混合物と同じものを用いた、同様のｐＨ７勾配ＨＩＣ試験を示す図である。様々な曲線は上から下へリボヌクレアーゼ、ミオグロビン、α−ラクトアルブミン、α−キモトリプシノーゲンＡ及びこれらの混合物を示す。また、示しているのは別々に実験した個々のタンパク質試料の結果である。図３ｂは、ｐＨ４における同じタンパク質を示す。なお、（ａ）タンパク質混合物の結果は何れのｐＨでも同じように見える；（ｂ）此処でも２つのピークしか解像されていない；（ｃ）ｐＨを７から４に変えると、ミオグロビンとα−ラクトアルブミンはカラム上に保持される傾向がある（塩濃度が低くなっても強い相互作用を示す）。
【００７０】
図４ａは、酸性ｐＨ領域（例えば４〜７）でｐＨ ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）応答性を持つように開発された応答性高分子コーティング：ＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡの一般式を示す図である。これは、荷電及び疎水性で自己会合している基「ｍ」、ｐＨ応答性を調節するために加えられた基「ｎ」−この場合酸性ｐＨ応答性のための酸基及びＨＩＣ（自己会合）官能性を改良するためのもう１つの基「ｏ」からなる。図で認められるように、多くの変数を変化させて任意の特定の用途に対してこの高分子を最適化することができ、本明細書で直接実証したもの以外の他の多くの用途が可能である。明らかな変更としては、ベースマトリックスを変えること、３種の官能基ｍ、ｎ及びｏのモル比を変えること、基の種類を変えること（例えばｎをピリジン基、ｏをフェニル基にする、互いに緩衝できる２種の基で基ｎを置換して４種の官能基を使うなど）、基の相対的配置を変化させることなどが挙げられる。図４ｂは、塩基性ｐＨ範囲で機能するように設計された、異なる種類のｐＨ応答性高分子を示す図である。
【００７１】
図５は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）媒体に図４ａの高分子をグラフトして調製した媒体（ＵＢ８７８０２９、Ｕ８７８０３２：１〜３）を用いて、４種のタンパク質混合物について上図の如く（但しｐＨ４で）実施した「標準的」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。３種の高分子成分のモル比を変えて４通りの媒体を作り、これらを使用した結果が示されている。なお、（ａ）モル比は調節することができる；（ｂ）クロマトグラフィー挙動はモル比によって変化する傾向があり、したがって調節することができる；（ｃ）同じようなモル比を有する高分子では同じようなＨＩＣクロマトグラムが得られる。
【００７２】
図６は、図４ａの高分子で被覆したｐＨ感受性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）プロトタイプ媒体の１種（Ｕ８７８０３２：３）を用いて、４種のタンパク質混合物について上図の如く、但し本発明の一態様に従って吸着及び溶出段階の両方でｐＨ４から７に変化させて実施した「標準」勾配ＨＩＣに関するクロマトグラムを示す図である。なお、（ａ）ｐＨ７では、「ｐＨＩＣ」媒体は、タンパク質が個々の実験（図示せず）によって確認された普通の順序で溶出する、代表的なＨＩＣクロマトグラムを示す；（ｂ）４つのピークの分離能は、図１及び２に示す市販媒体の結果と同等又は優れている；（ｃ）ｐＨを４から７へ変化させるに連れて、ミオグロビン（ｐＩ６．３）ピークの溶出順序は最初の溶出から最後の溶出へ移動し、α−ラクトアルブミン（ｐＩ５）も移動する（下記参照）；（ｄ）他のピーク、例えばリボヌクレアーゼ（ｐＩ９．４）及びａ−キモトリプシノーゲンＡ（ｐＩ９．６）は相対的な位置を保持するが、低塩濃度で溶出する傾向がある。観察「ｃ」は、ｐＨを変化させることによって、独特の分離（例えば、標準ＨＩＣでは一緒に溶出する傾向があるリボヌクレアーゼとミオグロビンの精製）を行うことができることを示唆している。観察「ｄ」は、図１及び２と同様、右へのピーク移動は媒体の疎水性の上昇に付随することを示唆している。この結果、ｐＨを減少させることによって、媒体の効果的な塩勾配範囲を減少させることができる。また、１つの媒体を異なるｐＨ値で使用することによって、図１及び２における多くの異なる媒体の範囲と同様なクロマトグラフィー分離を再現することもできる。
【００７３】
図７は、図６（Ｕ８７８０３２：３）におけるｐＨ４の勾配試験に伴う個々のタンパク質のクロマトグラムを示す図である。４種の個々のタンパク質に対するピーク分離能を、図３における市販のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のものと比較されたい。ピーク形状が著しく改善されていること、並びにミオグロビン及びα−ラクトアルブミンが回復していることに留意されたい。
【００７４】
図８は、図６に示すｐＨＩＣ媒体を用いた３つの別々の試験を示す図であり、クロマトグラムの再現性を示している。同じようなモル比の媒体を用いた実験（図示せず）も、同じくかかる媒体を製造することの再現性（確実性）を示唆するものであった。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、単に例証を目的として提供されるものであり、頭記の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書で引用した文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７６】
材料
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
方法
機器
ＵＶ検出器を備えたＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＩＤ １１９）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムはガラス製であり、ＨＲ５／５（１８−０３８３−１）型のものである。
【００８０】
ゲルの滴定には、ＡＢＵ ９３ ＴＲＩＢＵＲＥＴＴＥ（ＩＤ６７２）（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を使用した。アミノ基の滴定には５ｍｌのテフロン（商標）キューブ（ＩＤ８５）を使用し、アリル基の滴定には１ｍｌのテフロン（商標）キューブ（ＩＤ６００）を使用した。ゲルのＦＴＩＲ分析にはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １６ ＰＣ（一連番号１４５６８９）を使用した。ＮＭＲで分析したゲルは、５０μｌのテフロン（商標）キューブを用いて計量し、ａｖ５００を用いて分析した。純高分子は、溶解して、ａｖ３００を用いてＮＭＲで分析した。
【００８１】
重量の計量はすべて、重量≦１ｇにはＭｅｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ（ＩＤ５２６）、重量≧１ｇにはＭｅｔｌｅｒ ＰＭ４８０（ＩＤ６３５）を用いて行った（他の情報が無い場合）。
【００８２】
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００（ＩＤ１３４）を用いて、温度の関数として高分子の吸光度を測定した。ＴＨＦ中のＧＰＣには、Ｗａｔｅｒｓ ７１２ ＷＩＳＰ（ＩＤ６４８）、Ｗａｔｅｒ ４１０（示差屈折計）及びＰＬ−ＥＬＳ １０００（検出器）を使用した。
【００８３】
実施例１：アミン化アリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰの調製
アリル−ＨＰの調製：１００ｍｌの水切りしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰを２５０ｍｌの容器に入れ、水２５ｍｌを加えて撹拌を開始した。５０℃で６０分放置した後、様々な量のＮａＯＨ、０．２ｇのＮａＢＨ４及び６ｇのＮａ２ＳＯ４を加え、これらの物質を５０℃で連続的に撹拌しながら１６〜２０時間反応させた。
【００８４】
アリル−ＨＰのアミン化：水切りしたアリル−ＨＰゲルを５０〜１００ｍｌの水と共に容器に入れ、撹拌を開始した。ＮａＡｃ５ｇを加え、黄色が残って見えるまでＢｒ２（水溶液）を加えた後、この色が消えるまでＮａＣＯＯＨを加え、ゲルを水洗した。
【００８５】
１，６ジアミンヘキサン１７ｇ、ＮａＣｌ８．８ｇ、水５０ｍｌの溶液を調製し、これを冷却中のゲルに加えた。５０℃で１６〜２０時間、反応を行った。
【００８６】
実施例２：変性Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ−ゲルの分析
滴定結果
滴定結果は予想した通りであった。ゲルのアリル濃度は水酸化ナトリウムの重量百分率が上昇するに連れて上昇した。ゲルの塩化物イオン結合量も上昇した（表１）。
【００８７】
【表３】
【００８８】
実施例３：アミン化ゲルへのＰＶＣＬ−ＮＰＡ共重合体の結合
ゲル１０ｍｌの調製：
１０ｍｌのアミン変性アガロース粒子をＤＭＦで洗った。９６ｍｇのＰＶＣＬ−ＮＰＡをＤＭＦ１０ｍｌに溶解した後、この溶液をアガロース粒子に加えた。この混合物を一晩振盪した。無水酢酸５０μｌを混合物に加えて（坦体の残存アミノアルキルをアセチル化し）、その後ガラスフィルター（孔径４）で濾過し、ＤＭＦ２００ｍｌで洗って過剰の高分子を除去した。
【００８９】
ゲルを評価したところ、アミノアルキルのアセチル化が不十分であることが分かったので、無水酢酸の添加量を１０ｍｌに増加した。
【００９０】
実施例４：アリル化ゲルへのＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＢＭＡ高分子のグラフト
モノマー及びＡＩＢＮを表２に従って計量し、１５ｍｌのバイアルに入れたジオキサンに溶解した。水抜きしたアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰをバイアルに加え、ゴムセプタムで容器を密封した。バイアルにＡｒ（ｇ）を５分間吹き込んだ。次いでバイアルを７０℃に設定した振盪式ヒートブロックに入れ、一晩反応させた。
【００９１】
【表４】
【００９２】
ゲルをガラスフィルターで濾過し、溶出した溶液を丸底フラスコに回収した。ジオキサンでゲルの洗浄を行い、その後エタノール及び水で洗浄した。
【００９３】
高分子溶液をジエチルエーテル中に沈殿させ、真空乾燥機で乾燥した。次いで乾燥高分子をＴＨＦに溶解し、再度沈殿させた。乾燥したふわふわした粉末が得られる迄この操作を続けた。
【００９４】
実施例５：分析
アミノ基の滴定
変性アガロースの正確なアミン濃度は未知であり、滴定で求める必要があった。用いた方法（ＮＲ０８）は以下の通りである：
・ １５〜２０ｍｌのゲルを水、１００ｍｌの０．５ＭＨＣｌ、最後に２００ｍｌの１ｍＭＨＣｌで洗浄する。
【００９５】
・ テフロン（商標）キューブ（５ｍｌ）の底部に濾紙を置き、これにゲルと１ｍＭＨＣｌのスラリーを満たす。
【００９６】
・ 乾燥ゲルの表面が見えてから引き続き約３０秒間、キューブを水流吸引に接続する。
【００９７】
・ キューブを取外し、水を加えてゲルを滴定カップに移す。
【００９８】
・ ２〜３滴の濃硝酸を加えて滴定を開始する。
【００９９】
アリル基の滴定
以下の方法（ＮＲ０８）を用いた：
・ ゲルを水−エタノール−水−ＨＡｃ−水で洗った。
【０１００】
・ １ｍｌのゲルを上記テフロン（商標）キューブ（ＩＤ６００）で計量し、蒸留水を加えてビンに移し、希釈して総量１０ｍｌにした。
【０１０１】
・ 色が変わらなくなるまで、かき混ぜながらＢｒ２（水溶液）を加えた。
【０１０２】
・ 溶液が無色になるまで、フラスコを吸引した。
【０１０３】
・ 水を用いてフラスコの内容物を滴定カップに移し、３０ｍｌに希釈し、１〜２滴の濃硝酸を加えて、ＡｇＮＯ３による滴定を開始した。
【０１０４】
カルボキシル基の滴定
１ｍｌのゲルをテフロン（商標）キューブで計量した。１５ｍｌの１ＭＫＣｌを用いてゲルを滴定ビーカーに移した。滴定を開始する前に、ｐＨを３未満に下げた。０．１ＭＮａＯＨを用いてｐＨ１１．５まで滴定を行った。
【０１０５】
ＮＭＲ（ＨＲ−ＭＡＳ）によるゲルの分析
高分子被覆ゲルは、ＨＲ−ＭＡＳ（マジック角度回転）を用いて分析した。この方法を用いると、ゲルマトリックスからの妨害が最小の状態で、結合した高分子の分析を行うことが可能である。
【０１０６】
５０μｌのゲルをテフロン（商標）キューブで計量し、１ｍｌの水と、その後５００μｌのＤＭＳＯで２回洗浄した。１０μｌのＴＭＢをプローブの底部に置いた後、ゲルを加えた。ＴＭＢは内部標準としての役割を果たし、定量計算のためのピーク積分値の比較が可能になる。
【０１０７】
ＮＭＲによる純高分子及びモノマーの分析
モノマー又は純高分子（ゲルに結合していない高分子）の１Ｈ−ＮＭＲを試験する場合は、１０ｍｇの試料を０．７０ｍｌの重水素化溶媒に溶解した。
【０１０８】
ＵＶ−ＶＩＳ
ＵＶ分光光度計を用いて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を分析した。緩衝液に溶解した高分子の１％溶液を調製した。使用した緩衝液は、ｐＨが４〜７の０．１Ｍリン酸カリウムであった（同じ緩衝液をＨＩＣで使用する）。この溶液を１ｃｍの試料セルに入れた。水を対照として用いた。５００ｎｍの光透過率を用いて曇点を観察した。測定した温度幅は２０〜７５℃であり、加熱速度は０．５℃／分とした。ＬＣＳＴは、吸光度−温度曲線における変曲点の温度と定義した。
【０１０９】
ＧＰＣ
高分子をＴＨＦに溶解（高分子０．５ｍｇ／ＴＨＦｍｌ）し、この溶液を濾過した後バイアルに入れた。また、３種の異なる分子量を有するＰＳを各々含有する２つの異なる標準を調製し、濾過してバイアルに入れた。次いでこれらのバイアルを自動回転式バイアルホルダーに置いた。試料はこの装置によってホルダーから取出され分析装置に注入された。
【０１１０】
実施例６：クロマトグラフィー評価
カラムの充填
高分子が結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））とエタノールのスラリー（２０％ｂ．ｖ．）を、パスツールピペットを用いてカラムに注意深く充填し、カラムの頂部にわずかに２〜３ｃｍの空間を残した。２〜３滴のエタノールを加え、カラムを密封し、ＨＩＣ装置に取り付けた。
【０１１１】
分離材料
タンパク質混合物は、４種のタンパク質：ミオグロビン１．０ｍｇ／ｍｌ、リボヌクレアーゼＡ２．０ｍｇ／ｍｌ、α−ラクトアルブミン０．８ｍｇ／ｍｌ及びα−キモトリプシノーゲンＡ０．８ｍｇ／ｍｌからなるものとした。このタンパク質を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。タンパク質溶液試料はフリーザーに保存した。また、タンパク質は、ミオグロビン１．０ｍｇ／ｍｌ、リボヌクレアーゼＡ２．０ｍｇ／ｍｌ、α−ラクトアルブミン０．８ｍｇ／ｍｌ及びα−キモトリプシノーゲンＡ０．８ｍｇ／ｍｌで別々にクロマトグラフィーにかけた。このタンパク質を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。タンパク質溶液試料はフリーザーに保存した。
【０１１２】
ｐＨ範囲に応じて２つの異なる緩衝液系を用いた（表３参照）。緩衝液Ａは、「塩析」効果を有し、タンパク質−ＨＩＣ媒体相互作用を促進し、緩衝液Ｂの低イオン強度は溶出を促進する。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ｂ１００％まで、塩勾配を用いてＨＩＣ試験を行った。流速は１ｍｌ／分であった。ＵＶ検出器は、２１５、２５４及び２８０ｎｍで動作させた。注入量は５０μｌとした。試験中ｐＨと温度は一定に保持した。
【０１１５】
試験タンパク質の性状
試験混合物に用いたタンパク質の幾つかの性質を示す（表４）。なお、ｐＨ７から４に変化させると、２種のタンパク質（ミオグロビンとリボヌクレアーゼ）はその等電ｐＨを通過し、正味電荷が負から正に変化するが、他の２種のタンパク質はその正の正味電荷を保持する。出典：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
実施例７：高分子分析の結果
ＮＭＲ結果
ＮＭＲ分析による推定値（表５）は、正確な値と見なすべきではない。ピークがはっきり分離していなかったので、この結果はやや信頼性に欠如している。結果は、単一のピークではなくピーク群を比較して推定した。これは好ましいやり方である。ピークの分離が悪かったのは、おそらく高分子が自由に回転できる良溶媒を見出すことが困難であったことによると思われる。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
ＵＶ−ＶＩＳ結果
理論によれば、ＬＣＳＴ値は、疎水性成分を加えると上昇し、コモノマーが親水性の場合は低下すると考えられる。この場合、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと比べて、アクリル酸は親水性が高く、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）は親水性が低い。
【０１２０】
この試験では、ＬＣＳＴは、吸光度−温度曲線における変曲点の温度で表されると定義した。
【０１２１】
低いｐＨでは、ＬＣＳＴ値は３２℃未満であるが、これはＢＭＡを加えていない高分子でも同じである。実際はこの高分子がこれらすべての中で最も低いＬＣＳＴ値を有する。これらの高分子の水溶性はそれほど良くない。１％溶液を作るのも難しい。
【０１２２】
一方、高分子の曇点はｐＨの影響を非常に受けやすい。ｐＨ４〜５では、ＬＣＳＴ値は２５〜３０℃であるが、ｐＨが５を超えると、ＬＣＳＴは約７０℃で観察される。ｐＨ７では、観察した温度範囲（２０〜７５℃）でＬＣＳＴは見られない。ＡＡのカルボキシル基はｐＨ６〜７で帯電しており、親水性したがってＬＣＳＴは上昇する。
【０１２３】
室温でｐＨ７から４へ変化させることは、検討したすべてのＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡ組成について、高分子構造にコンフォメーションの変化をもたらすと判断することができる。ｐＨが５を超えると高分子の親水性は著しく上昇し、ｐＨ７では高分子溶液の曇りは観察されない。
【０１２４】
ＧＰＣ結果
ＮＩＰＡＡＭ、ＡＡ及びＢＭＡの三元共重合体のＧＰＣからのクロマトグラムは、幅広いピーク、時には複数のピークを示す。これは、試料中にホモポリマーとコポリマーがあることを意味する可能性がある。
【０１２５】
【表８】
【０１２６】
反応条件はモノマーの供給比以外同じであるが、連鎖移動剤なしに合成された高分子の多分散性は高く、分子量は系間で著しく異なる（表６）。
【０１２７】
実施例８：ＨＩＣ評価
フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ媒体を用いた対照ＨＩＣ
フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（Ｐｈｅ−ＨＰ）媒体を用いて対照試験を行った。カラムの調製及び用いたクロマトグラフィー方法はすべてのカラムについて同一とした。
【０１２８】
図３ａ及びｂは、我々の標準タンパク質混合物及び個々のタンパク質の両方について、Ｐｈｅ−ＨＰ媒体をｐＨ７及び４で用いて得られた結果を示す。明らかに分かるように、ｐＨ７とｐＨ４で試験したタンパク質混合物のクロマトグラムにはほとんど差がない。かかるｐＨ応答性の欠如は、実際には標準ＨＩＣ媒体では好ましい性状であると見なされる。しかし、どちらの場合も、２つの大きなピーク以上の分解が見られない。個々のタンパク質の試験からも分かるように、ｐＨ７では、第１のピークはミオグロビンとリボヌクレアーゼＡからなり、第２のピークは−キモトリプシノーゲンＡ（二頂ピーク）と−ラクトアルブミン（非常にブロードな低い「ピーク」）からなる。
【０１２９】
ｐＨを４に変化させても、２つの大きなタンパク質混合物のピークが依然として残っている。個々の試験から、これらはやはり各々リボヌクレアーゼＡ、−キモトリプシノーゲンＡの影響を受けていることが分かった。ミオグロビン及び−ラクトアルブミンは溶出されていないように見える。或いは非常にブロードな低い「ピーク」として溶出されている可能性もある。
【０１３０】
ＰＮＩＰＰＡｍ−ｃｏ−ＰＡＡ−ｃｏ−ＰＢＭＡを用いた対照ＨＩＣ
ＮＩＰＡＡｍ、ＡＡ及びＢＭＡの供給比が異なる４種のゲルをカラムに充填し、ｐＨ４〜７でタンパク質混合物のＨＩＣ試験を行った（表７）。
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
市販のフェニル−ＨＰ媒体（図５）と比べて、４種のゲルすべてが有望なＨＩＣ媒体挙動を示している（図３ａ及びｂ）。ｐＨ４では、Ｕ８７８０３２：３は、溶出時間２２分に大きなピークを有する。このピークはカラムＵ８７８０２９及びＵ８７８０３２：１にも見られる（小さいが）。一方、Ｕ８７８０３２：２のクロマトグラムにはこのピークが完全に欠如している。組成（表７）が似ている２種の媒体（０３２：３及び０２９）で最良の結果が得られた。
【０１３３】
わずかに異なる組成で同じく良好な結果が得られることは、この結果の再現性を示唆するものである。これはまた、かかる媒体の連続生産でわずかな変化があってもよい媒体が得られることを示唆するものである。しかし、結果はＡＡとＢＭＡの比が適切であるかどうかで決まることに留意すべきであり、これについてはさらに検討することが望ましい。
【０１３４】
タンパク質混合物をさらに評価するためにカラムＵ８７８０３２：３を選択し（図６）、個別のタンパク質を用いて位置を確かめた。個別タンパク質のクロマトグラムを以下（図７及び８）に示す。相対溶出塩濃度（硫酸アンモニウム）で表した平均ピーク位置を表８に示す。
【０１３５】
Ｕ８７８０３２：３をｐＨ４〜７で用いたＨＩＣ試験からのすべてのクロマトグラムで、α−キモトリプシノーゲンＡは、小さいピークとこれに続く大きなピークの二重ピーク挙動を示す。上述したようにこれは極めて典型的である。すべてのタンパク質は、ｐＨを低下させると低塩濃度で溶出する（表８及び図６）。これは、ｐＨ応答性高分子媒体によって、低塩条件下におけるＨＩＣの可能性があることを示唆する。
【０１３６】
【表１０】
【０１３７】
ｐＨ７では、タンパク質は、予想される順序、即ちミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、α−ラクトアルブミン及び最後にα−キモトリプシノーゲンＡの順序で溶出する。ミオグロビンとリボヌクレアーゼＡの分解は十分ではないが、タンパク質の分離能は多くの市販媒体と同等である。
【０１３８】
ｐＨを６に変化させると、溶出時間はやや長くなるが、溶出の相対的順序はｐＨ７のときと同じである。ミオグロビンとリボヌクレアーゼＡのピーク間の分離は大きいと思われるが、α−ラクトアルブミン（ｐＩ５）のピークはｐＨ７ほどシャープではない。
【０１３９】
溶出の順序はｐＨ５で変化した。ｐＨ７及び６で最初に溶出するミオグロビン（ｐＩ６．３）は正味電荷が約＋８に変化し、最後に溶出するタンパク質となった。α−キモトリプシノーゲンＡとα−ラクトアルブミンは、ミオグロビンの直前にほとんど同じ塩濃度で溶出する。したがって、リボヌクレアーゼ、α−ラクトアルブミン及びα−キモトリプシノーゲンＡの相対位置は、標準的なＨＩＣ挙動（即ち相対的疎水性）を保持したままである。
【０１４０】
ｐＨ４では、ミオグロビンとα−ラクトアルブミン（酸性ｐＩを有する２つのタンパク質）は、同じ濃度（緩衝液Ｂ１００％）で溶出し、タンパク質混合物では単一のピークが得られる。こうして、溶出の順序は、リボヌクレアーゼＡ、α−キモトリプシノーゲンＡ（塩基性ｐＩを有する２つのタンパク質）、次にα−ラクトアルブミン及びミオグロビンである（図７）。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】４種のタンパク質と数種の市販の媒体の混合物を含む、代表的なｐＨ７塩勾配疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を示す図である。
【図２】図１と同様のクロマトグラムを示すが、他の数種の市販媒体を実証した図である。
【図３】各々ｐＨ７及び４における図１と同様のクロマトグラムを示すが、ｐＨ７から４にしても市販媒体ＨＩＣにはｐＨの有用な効果が無いことを実証した図である。
【図４】本発明の方法に使用されたｐＨ応答性ＨＩＣ（ｐＨＩＣ）高分子コーティングの代表的な構造を示す図である。
【図５】図１及び２と同様の方法を用いて、しかし成分のモル比が異なる様々なｐＨＩＣ高分子コーティングを用いて、ｐＨ４で得られた代表的な塩勾配ＨＩＣ結果を示す図である。
【図６】ｐＨをｐＨ７から４に変化させたときの代表的なｐＨＩＣ高分子コート媒体の結果を示す図であり、ｐＨ７における標準ＨＩＣ媒体と比べて分離能が改良されていること及びかかる分離能の向上、並びにｐＨの変化に伴う異例の選択性制御が示されている。
【図７】図６と同様のクロマトグラムを示すが、図３と比べて分離能の向上が分かるように個々のタンパク質に対するクロマトグラムを示す図である。
【図８】図６及び７の結果の再現性を裏付ける図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、
（ａ）液体を、第１のｐＨで、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、疎水性相互作用によって１種以上の目標化合物を吸着させる段階と、
（ｂ）ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす第２のｐＨ値の溶出液を加えて、分離媒体から１種以上の目標化合物を放出させる段階と
を含む方法。
【請求項２】
第２のｐＨ値が第１のｐＨ値よりも低い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶出液がｐＨ低下勾配を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
溶出液の導電率が段階（ａ）の液体の導電率と異なるが、第２のｐＨ値を第１のｐＨ値と実質的に等しく保つ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
溶出液が塩勾配を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）において分離媒体が非荷電である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
段階（ａ）において、１種以上の目標化合物を、電荷−電荷相互作用、ファンデルワールス相互作用及び共溶媒和／共水和に基づく相互作用からなる群から選択されるｐＨ応答性高分子と目標化合物の追加の相互作用によっても吸着させる、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）において分離媒体が非荷電である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）におけるｐＨ応答性高分子の疎水性が段階（ａ）よりも低い、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
高分子の自己会合及び／又は高分子と媒体との会合によって高分子のコンフォメーション変化をもたらす、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ応答性高分子が共重合体である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
各ｐＨ応答性高分子が疎水性部分と親水性部分とｐＨ応答性部分を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨ応答性高分子が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択されるｐＨ感受性ペンダント基を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
目標化合物がタンパク質又はペプチドのような生体分子である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
当該方法がクロマトグラフィー法である、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
当該方法が分析法である、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
マトリックスがバイオセンサー又はバイオチップである、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
当該方法が濾過法である、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体であって、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体。
【請求項２０】
前記高分子のｐＨ応答性基が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択される、請求項１９記載の媒体。
【請求項２１】
目標化合物を単離するためのキットであって、別々のコンパートメントに、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体を充填したクロマトグラフィーカラムと、第１のｐＨを有する吸着緩衝液と、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨを有する溶出液と、その使用説明書とを含むキット。
【請求項２２】
前記高分子のｐＨ応答性基が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択される、請求項２１記載のキット。
【請求項１】
１種以上の目標化合物を液体から単離する方法であって、
（ａ）液体を、第１のｐＨで、表面局在化ｐＨ応答性高分子を呈する分離媒体と接触させて、疎水性相互作用によって１種以上の目標化合物を吸着させる段階と、
（ｂ）ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化をもたらす第２のｐＨ値の溶出液を加えて、分離媒体から１種以上の目標化合物を放出させる段階と
を含む方法。
【請求項２】
第２のｐＨ値が第１のｐＨ値よりも低い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶出液がｐＨ低下勾配を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
溶出液の導電率が段階（ａ）の液体の導電率と異なるが、第２のｐＨ値を第１のｐＨ値と実質的に等しく保つ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
溶出液が塩勾配を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）において分離媒体が非荷電である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
段階（ａ）において、１種以上の目標化合物を、電荷−電荷相互作用、ファンデルワールス相互作用及び共溶媒和／共水和に基づく相互作用からなる群から選択されるｐＨ応答性高分子と目標化合物の追加の相互作用によっても吸着させる、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）において分離媒体が非荷電である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）におけるｐＨ応答性高分子の疎水性が段階（ａ）よりも低い、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
高分子の自己会合及び／又は高分子と媒体との会合によって高分子のコンフォメーション変化をもたらす、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ応答性高分子が共重合体である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
各ｐＨ応答性高分子が疎水性部分と親水性部分とｐＨ応答性部分を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨ応答性高分子が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択されるｐＨ感受性ペンダント基を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
目標化合物がタンパク質又はペプチドのような生体分子である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
当該方法がクロマトグラフィー法である、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
当該方法が分析法である、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
マトリックスがバイオセンサー又はバイオチップである、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
当該方法が濾過法である、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体であって、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体。
【請求項２０】
前記高分子のｐＨ応答性基が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択される、請求項１９記載の媒体。
【請求項２１】
目標化合物を単離するためのキットであって、別々のコンパートメントに、ＨＩＣリガンドを呈する表面局在化ｐＨ応答性高分子が結合したマトリックスからなる媒体を充填したクロマトグラフィーカラムと、第１のｐＨを有する吸着緩衝液と、第１のｐＨよりも低い第２のｐＨを有する溶出液と、その使用説明書とを含むキット。
【請求項２２】
前記高分子のｐＨ応答性基が、−ＣＯＯＨ基、−ＯＰＯ（ＯＨ）２基、−ＳＯ３−基、−ＳＯ２ＮＨ２基、−ＣＮＨ２基、−Ｃ２ＮＨ基及び−Ｃ３Ｎ基からなる群から選択される、請求項２１記載のキット。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５２０９１０（Ｐ２００６−５２０９１０Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７９７０（Ｐ２００６−５０７９７０）
【出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００４１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８２８０１
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００４１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８２８０１
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
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