α−グルコシダーゼとその製造方法並びに用途
【課題】 イソマルトースの製造に有用なα−グルコシダーゼと、当該酵素を用いたイソマルトースの製造方法を提供することを課題とする。
【解決手段】 下記の基質特異性を有するα−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに該酵素を利用してイソマルトースを製造する方法を提供することにより上記課題を解決する：
（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；
（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び
（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない。
【解決手段】 下記の基質特異性を有するα−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに該酵素を利用してイソマルトースを製造する方法を提供することにより上記課題を解決する：
（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；
（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び
（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、さらには当該酵素を用いたイソマルトースの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イソマルトース（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グルコース）は、グルコース２分子がα−１，６グルコシド結合により結合した構造を有する還元性二糖であり、難結晶性で優れた保湿性を有する糖質である。イソマルトースは発酵食品などに微量含まれており、従来、グルコース、マルトース、パノースなどとの混合物の状態で各種食品、化粧品などに利用されている。
【０００３】
イソマルトースの製造方法としては、デキストランを酸で部分分解したものにイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させる方法（特許文献１）が知られている。デキストランを原料とするこの方法は、イソマルトースの収率は高いものの、デキストランという特殊な多糖の入手が容易ではないためイソマルトースの工業的な製造方法として採用されるに至っていない。また、イソマルトースの別の製造方法として、マルトースに麹菌由来のα−グルコシダーゼ（別名「トランスグルコシダーゼ」）を作用させ、イソマルトースを含むイソマルトオリゴ糖を生成させる方法も知られている（特許文献２）。しかしながら、当該方法により得られるイソマルトオリゴ糖は、イソマルトースとともに未反応原料であるマルトース、加水分解産物であるグルコース、さらにはパノースやイソマルトトリオースなど副生する多くの糖質を含有する混合物であるため、イソマルトオリゴ糖におけるイソマルトースの含量は、通常、糖組成当たり５乃至２０質量％に過ぎず、また、イソマルトオリゴ糖からのイソマルトースの単離も容易ではない。さらに、イソマルトオリゴ糖に前記のイソマルトデキストラナーゼを作用させたとしても、糖組成中のイソマルトースの含量は、通常、４０質量％未満と低い。
【０００４】
近年、本願と同じ出願人は、澱粉部分分解物を原料に、新規酵素であるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と上記イソマルトデキストラナーゼとを同時に作用させることを特徴とするイソマルトースの効率的製造方法を確立し開示した（特許文献３）。この方法によれば、酵素反応のみによって澱粉部分分解物から糖組成当たりイソマルトースを５０乃至７０質量％含有する糖組成物が得られるため、イソマルトースの工業的な製造方法として有用である。しかしながら、さらに異なるイソマルトースの製造方法が確立できれば、イソマルトースの製造における選択肢が広がると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２１６４９３号公報
【特許文献２】欧州特許公開 ＥＰ０８７５５８５ Ａ１公報
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ ２００２／０８８３７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イソマルトースの製造に有用なα−グルコシダーゼと、当該酵素を用いたイソマルトースの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、イソマルトース生成酵素産生能を有する微生物に着目し、鋭意スクリーニングを続けてきた。その結果、通性嫌気性菌であるラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＪＣＭ２７７２が、マルトースからイソマルトースを多量生成するα−グルコシダーゼを産生することを見出し、さらに当該α−グルコシダーゼが、意外にも、マルトースに作用してパノースやイソマルトトリオースを生成しないことを見出した。そして、このα−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立するとともに、該酵素を利用したイソマルトースの製造方法を確立して本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、α−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに該酵素を利用したイソマルトースの製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のα−グルコシダーゼは、とりわけ、マルトースによく作用し、多量のイソマルトースを生成するとともに、パノース、イソマルトトリオースなどの副生成物をほとんど生成しないことから、マルトースを原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。また、本発明のα−グルコシダーゼをβ−アミラーゼや澱粉枝切り酵素などと併用することにより、澱粉を原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の至適温度を示す図である。
【図３】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の温度安定性を示す図である。
【図５】組換え型α−グルコシダーゼ発現用の組換えＤＮＡを示す図である。図中、白抜き矢印で示した部分は、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のα−グルコシダーゼは、（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない；という特徴を有している。本発明のα−グルコシダーゼは、上記特徴の内、特に（３）の点において、公知の麹菌由来のα−グルコシダーゼ（別名「トランスグルコシダーゼ」）と明瞭に区別することができる。
【００１２】
本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、マルトースを基質とした反応液中に生成したイソマルトースを定量することにより測定することができる。具体的には、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にマルトース（商品名「マルトースＨＨＨ」、マルトース純度９９．９％以上、林原生物化学研究所販売）を終濃度２％（ｗ／ｖ）になるよう溶解したものを基質溶液とし、この基質溶液２ｍｌと酵素液２ｍｌを混合して３５℃で２時間反応を行ない、その後沸騰水浴中で１０分間保持することにより酵素を失活させ反応を停止する。次いで、反応液を脱塩した後、以下に示す条件にて高速液体クロマトグラフィー（以下、本明細書では「ＨＰＬＣ」と略記する）及びガス−リキッドクロマトグラフィー（以下、本明細書では「ＧＬＣ」と略記する）をそれぞれ行い、反応液中のイソマルトースを定量する。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０１（昭和電工）
カラム温度：６０℃
溶離液：水
流 速：０．５ｍｌ／分
検 出：示差屈折計
＜ＧＬＣ分析条件＞
試 料：反応物を常法によりトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）したもの
カラム：２％Ｓｉｌｉｃｏｎ ＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＣＳ ８０〜１００メッシュ （内径３ｍｍ×長さ２ｍ）
昇温プログラム：１６０℃（２分維持） → ３２０℃（７．５℃／分で昇温）
検 出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
上記ＨＰＬＣ分析において二糖の分離が不十分な場合、ＧＬＣ分析により求めたイソマルトースと他の二糖と割合に基づきＨＰＬＣで求めた二糖の含量を比例配分して反応液中のイソマルトースを定量する。なお、イソマルトース生成活性１単位は、上記反応条件下において、マルトースから１分間に１μｍｏｌのイソマルトースを生成する酵素量と定義する。
【００１３】
本発明のα−グルコシダーゼは、ラクトバチルス・ラムノサスを培養し、菌体内に産生されたα−グルコシダーゼを採取することにより調製することができる。ラクトバチルス・ラムノサスとしては、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２や、当該菌株を常法により突然変異処理して得られる酵素高生産性変異株などが有利に利用できる。
【００１４】
本発明のα−グルコシダーゼは、下記の理化学的性質を有している。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６２，０００±５，０００ダルトン；
（２）至適ｐＨ
３５℃、２時間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至７．０；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃；
（４）ｐＨ安定性
６℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、２時間保持の条件下、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃以下で安定；
１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃以下で安定；
【００１５】
また、上記理化学的性質を有する本発明のα−グルコシダーゼは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している場合がある。
【００１６】
本発明のα−グルコシダーゼは、通常、特定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、マルトースから多量のイソマルトースを生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号１０で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するものが好適である。
【００１７】
本発明のＤＮＡとは、上記α−グルコシダーゼをコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、上記α−グルコシダーゼをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を含むラクトバチルス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００１８】
本発明のＤＮＡは、通常、特定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号９で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号９で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号９で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号９で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００１９】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主細胞に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２０】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、目的とするα−グルコシダーゼを生成するものを選択すればよい。
【００２１】
本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生物若しくは形質転換体の培養方法は、常法に従い、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１乃至５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌などにより好気的条件下で培養し、得られる菌体又は培養液上清などの培養物からα−グルコシダーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗α−グルコシダーゼとして利用することができる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採取し、利用することができる。さらに高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、更には、モノクローナル抗体への吸着、溶出などを組合せて純度を高めて利用することも随意である。また、本発明のα−グルコシダーゼ又はα−グルコシダーゼを発現したラクトバチルス属微生物菌体を公知の方法により固定化し、固定化酵素又は固定化菌体として、反応に繰り返し利用することも、連続反応に利用することも有利に実施できる。
【００２２】
α−グルコシダーゼが組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００２３】
イソマルトースの生成反応は、通常、次の条件で行なわれる。マルトース又はマルトース含有糖質を基質とし、基質濃度は１乃至６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、１０乃至４０％（ｗ／ｖ）、反応温度は１０乃至５０℃、望ましくは、３０乃至４０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望ましくは、６．０乃至７．０、用いる酵素の量はイソマルトース生成活性として基質１グラム当り１単位以上、望ましくは、２乃至５単位の範囲から選ばれる。反応時間は適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５乃至７０時間の範囲が選ばれる。
【００２４】
上記の酵素反応により得られる反応液は、未反応原料のマルトースと加水分解により生成したグルコース及びグルコシル転移により新たに生成したイソマルトースやマルトトリオースを含有しており、これをイソマルトース含有糖質として、そのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、反応液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ＋型及びＯＨ−型イオン変換樹脂を用いて脱塩、濃縮してシラップ状製品とする。
【００２５】
必要ならば、更に、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型又はアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したイソマルトースを分離精製し、得られるイソマルトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることも有利に実施できる。
【００２６】
このようにして得られたイソマルトースは、比較的低甘味の甘味料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、嗜好性向上などに有利に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００２７】
また、本発明のα−グルコシダーゼをマルトース又はマルトース含有糖質に作用させて得られるイソマルトース含有糖質を、常法により水素添加することによってイソマルチトールを製造することもできる。
【００２８】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。なお、以下の実験におけるα−グルコシダーゼ活性は、前述した活性測定法により測定したマルトースからイソマルトースを生成するイソマルトース生成活性として表記した。
【００２９】
＜実験１：ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の培養＞
マルトース（商品名「サンマルト シロ」、株式会社林原商事販売）１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（商品名「酵母エキスＳ」、日本製薬株式会社販売）０．１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（商品名「ポリペプトン」、日本製薬株式会社販売）０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素ナトリウム０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン０．００１％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び脱イオン水からなる液体培地（ｐＨ６．５）を５００ｍｌ−容三角フラスコに３００ｍｌ入れたものを１６本調製し、１２１℃、２０分間滅菌した後、予め同培地で培養したラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の種培養液１．５％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、２４０ｒｐｍで撹拌しながら２７℃で６５時間培養した。
【００３０】
＜実験２：α−グルコシダーゼの精製＞
実験１で得た培養液約４．８Ｌを遠心分離して菌体約４０ｇを集め、一旦、−３０℃で凍結した。この凍結菌体に１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５６０ｍｌを添加して解凍した後、氷冷しつつ、超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。次いで、菌体破砕抽出液に８０％飽和になるよう硫安を添加溶解し、一晩放置して塩析し、生じた沈澱を遠心分離にて回収し、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析液中の不溶物を遠心分離にて除去した後、予め同緩衝液で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（株式会社東ソー製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量５５ｍｌ）に供したところ、α−グルコシダーゼは陰イオン交換体に吸着しなかったものの、大半の非吸着蛋白質とは遅れて溶出した。非吸着画分からα−グルコシダーゼ活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に透析し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック株式会社製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量６ｍｌ）に供した。α−グルコシダーゼは陽イオン交換体に吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．０５Ｍで溶出した。得られたα−グルコシダーゼ活性画分を濃縮し、α−グルコシダーゼ精製標品とした。精製工程を表１にまとめた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１の結果から明らかなように、この精製工程によって、α−グルコシダーゼの比活性は約４８０倍に上昇した。精製により得たα−グルコシダーゼ標品の純度を５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動法により検定したところ、蛋白バンドはほぼ単一であり、純度の高い標品であった。
【００３３】
＜実験３：α−グルコシダーゼの性質＞
【００３４】
＜実験３−１：分子量＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）の移動度と比較することにより分子量を測定したところ、当該α−グルコシダーゼの分子量は６２，０００±５，０００ダルトンであることが判明した。
【００３５】
＜実験３−２：至適ｐＨ及び至適温度＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性に及ぼすｐＨ及び温度の影響を活性測定法に準じてそれぞれ調べた。これらの結果を図１（至適ｐＨ）及び図２（至適温度）に示す。本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性の至適ｐＨは、３５℃、２時間反応の条件下でｐＨ６．５乃至７．０であった。また、至適温度はｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃であることが判明した。
【００３６】
＜実験３−３：ｐＨ安定性及び温度安定性＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性のｐＨ安定性及び温度安定性を調べた。ｐＨ安定性は、酵素を各ｐＨの緩衝液中で６℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存するイソマルトース生成活性を測定することにより求めた。温度安定性は、１ｍＭ塩化カルシウム添加又は無添加の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、酵素溶液を各温度に２時間保持し、水冷した後、残存するイソマルトース生成活性を測定することにより求めた。これらの結果を図３（ｐＨ安定性）及び図４（温度安定性）に示す。図３から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性はｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定であることが判明した。また、図４から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、Ｃａ２＋イオン非存在下（図４における符号●）では４０℃以下で安定であり、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下（図４における符号○）では４５℃以下で安定であることが判明した。
【００３７】
＜実験３−４：酵素活性に及ぼす金属イオンの影響＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性に及ぼす金属イオンの影響を、濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定することにより調べた。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、調査した１５種の金属イオンの内、Ｆｅ３＋及びＨｇ２＋イオンによって著しく阻害され、Ｓｎ２＋、Ａｌ３＋及びＣｕ２＋イオンでは３０乃至４０％阻害された。また、ＥＤＴＡによっては阻害されなかった。
【００４０】
＜実験３−５：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、常法により本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（モデル「Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２ＨＴ」、アプライドバイオシステムズ社製）にて１５残基分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、スレオニン−アスパラギン−スレオニン−アルギニン−トリプトファン−トリプトファン−リジン−グリシン−グルタミン酸−イソロイシン−バリン−チロシン−グルタミン−バリン−チロシン を有していることが判明した。
【００４１】
＜実験３−６：内部部分アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を適量とり、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約０．１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１００μｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）２μｇを加えて、３０℃、１８時間保持することにより酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０』、直径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に注入し、流速０．１ｍｌ／分、室温の条件下、０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸から０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液までの１６０分間のアセトニトリル濃度のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を溶出させ分画した。ペプチド断片の溶出は波長２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。保持時間約３２分、約４５分及び約６０分に溶出した３種のペプチド断片Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を分取し、それぞれのアミノ酸配列を実験３−５と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号２、３及び４で示されるアミノ酸配列を有していた。
【００４２】
＜実験４：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
本発明のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡをラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び、形質転換体の調製を行った。
【００４３】
＜実験４−１：ゲノムＤＮＡの調製＞
実験１と同じ方法でラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を培養し、培養液約４ｍｌを遠心分離して、培養菌体約２ｍｇを得た。回収した菌体から『ディーエヌイージー・ティシュー・キット』（キアゲン社製）を用い、キットに添付された説明書記載の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、２０μｇを得た。調製したゲノムＤＮＡの濃度は５０μｇ／ｍｌとした。
【００４４】
＜実験４−２：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定＞
α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）の第５乃至第１１番目のアミノ酸配列に基づき、センスプライマーとして配列表における配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、同酵素の内部部分アミノ酸配列である配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列の第１１乃至第１６番目のアミノ酸配列に基づき、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−プラス−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素とし、ＰＣＲ装置（商品名「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９７００」、ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行ったところ、約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ Ｉサイトにクローニングし、得られた組換えＤＮＡを用い大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べたところ、目的とする約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片を有していた。その組換えＤＮＡを「ｐＣＲＲＭ１」と命名した。
【００４５】
組換えＤＮＡ、ｐＣＲＲＭ１が有する約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、通常のジデオキシ法により解読したところ、解読した１，１８７ｂｐの塩基配列がコードするアミノ酸配列中に、α−グルコシダーゼの内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列）が含まれていた。この結果から、得られたＤＮＡ断片は目的とするα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推察された。
【００４６】
上記のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｅｃｏ ＲＩにて切断されないことを予め確認した後、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推定されるＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号７及び８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約６，０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。
【００４７】
得られた約６，０００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、メチオニンで始まり、α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）と３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）を全て含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームが認められ、本ＤＮＡ断片中に目的遺伝子全長が存在していることが判明した。この知見に基づきα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡは、配列表における配列番号９で示される鎖長１，６７７ｂｐの塩基配列を有しており、当該塩基配列に併記した５５９残基からなるアミノ酸配列をコードしていることが判明した。実験３−５で判明したα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）及び実験３−６で判明した３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）は、そのいずれもが配列表における配列番号９で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列中に認められ、それぞれ当該アミノ酸配列における第２乃至第１６番目、第２３０乃至第２３８番目、第１１２６乃至第１３０番目、及び、第３８６乃至第４０３番目のアミノ酸配列と完全に一致していた。この結果から、本発明のα−グルコシダーゼは、配列表における配列番号９で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列においてＮ末端のメチオニンが１つ欠けたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号１０で示される５５８アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有していることが分かった。なお、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列から算出される分子量は６３，５２８であり、この値は実験３−１で求めたラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼの分子量、６２，０００±５，０００ダルトンとよく一致するものであった。
【００４８】
＜実験４−３：組換え型α−グルコシダーゼ発現用ベクターの構築と形質転換体の調製＞
ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）における第１乃至第６番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の５´末端側に制限酵素Ｎｄｅ Ｉ認識部位を作製すべく、センスプライマーとして配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。また、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列における第５５１乃至第５５８番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の３´末端側にヒスチジン残基（Ｈｉｓ）６残基からなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）と制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ認識部位を作製すべく、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−プラス−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素とし、ＰＣＲ装置（商品名「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９７００」、ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡをポリエチレングリコール沈澱により精製し、クローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ Ｉ認識部位に挿入し、得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。得られた形質転換体より市販のキット（商品名「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」キアゲン社製）を用いて組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化した。前記市販のキットを用いてＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を調製し、同じ制限酵素の組み合わせで予め消化しておいた発現ベクター（商品名「ｐＲＳＥＴ Ａ」、インビトロジェン社製）に市販のキット（商品名「Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ」、東洋紡製）を用いて挿入した。得られた反応物を用いて大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べ、目的とする約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を有するものを選択した。選択した形質転換体が有する組換えＤＮＡを「ｐＲＳ−ＲＭＨＴ」と命名した。組換えＤＮＡ、ｐＲＳ−ＲＭＨＴを用いて発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、形質転換体『ＲＳ−ＲＭＨＴ』を調製した。
【００４９】
＜実験４−４：形質転換体における組換え型α−グルコシダーゼの発現と部分精製＞
実験４−３で得た形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴを、ＴＢ培地（トリプトン １．２％、酵母エキス ２．４％、グリセリン ０．４％、リン酸２水素１カリウム １７ｍＭ、リン酸水素２カリウム ７２ｍＭ、ｐＨ６．８、アンピシリン １００μｇ／ｍｌ含有）を１００ｍｌずつ入れた５００ｍｌ容三角フラスコ２本に植菌し、２７℃で１８時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して菌体を回収した。次いで、菌体を、０．３Ｍ食塩を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）に懸濁し、リゾチームを０．７５ｍｇ加えて−８０℃で凍結させ、２５℃で融解した後、２５℃で１時間振トウした。超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物の遠心分離上清を全細胞抽出物とした。全細胞抽出液の総α−グルコシダーゼ活性（イソマルトース生成活性）は約３，６１０単位であった。
【００５０】
形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴにおいて発現させた組換え型α−グルコシダーゼにはＨｉｓ−ｔａｇが付加されていることから、全細胞抽出液を商品名「ＴＡＬＯＮ ｒｅｓｉｎ（Ｃｏ２＋）」（クロンテック社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供し、常法に従い溶出し、組換え型α−グルコシダーゼの部分精製を行った。組換え型酵素の精製結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表３に示すように、アフィニティークロマトグラフィーにより組換え型α−グルコシダーゼの部分精製標品が１１６ｍｇ得られた。当該部分精製標品の比活性は１４単位／ｍｇ−蛋白、全細胞抽出液からの活性収率は４５％であった。
【００５３】
さらに組換え型α−グルコシダーゼの部分精製酵素標品の酵素的性質を実験３に示した方法に準じて調べた。その結果、組換え型α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性の至適ｐＨは３５℃、２時間反応の条件下でｐＨ６．５乃至７．０、至適温度はｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃、ｐＨ安定性は、各ｐＨに６℃で２４時間保持する条件下で約４．５乃至１０．０の範囲で安定、温度安定性は、各温度にｐＨ６．０で２時間保持する条件下で、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃まで安定、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃まで安定であった。これらの理化学的性質は、実験２で調製したα−グルコシダーゼのそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のα−グルコシダーゼが、組換えＤＮＡ技術によっても良好に製造できることを示している。
【００５４】
＜実験５：α−グルコシダーゼの基質特異性＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼの精製標品を各種糖質に作用させ、基質特異性を調べた。
【００５５】
＜実験５−１：α−グルコシダーゼの各種糖質への作用＞
下記の表５に示す３０種の糖質を用いてα−グルコシダーゼの基質特異性を調べた。各糖質を基質として終濃度２％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを２．５単位ずつ加え、３５℃で１６時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止させた後、それぞれの基質から生成した反応物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略称する）に供し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無及び生成する糖質を確認した。ＴＬＣにおいて、用いた基質以外の反応生成物のスポットが認められるものを「作用する」（＋）、反応生成物が認められないものを「作用しない」（−）と判定した。結果を表４に示す。
＜ＴＬＣ分析条件＞
ＴＬＣプレート：シリカゲルアルミニウムプレート（商品名『シリカゲル
６０Ｆ２５４』、１０×２０ｃｍ、メルク社製）
展開溶媒：ｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）
展開方法：上昇法、２回展開
検出方法：硫酸−メタノール法
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４の結果から明らかなように、本酵素は、試験した糖質のうち、ＰＮＰ−α−グルコシド、スクロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、コージビオース、ニゲロース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖、さらにマルチトール、マルトトリイトール、短鎖アミロースに作用し、グルコースを生成した。また、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖からはイソマルトースの生成が認められた。一方、ＰＮＰ−β−グルコシド、トレハロース、ラクトース、セロビオースなどのα−グルコシド結合を有さない基質への作用は認められなかった。α−グルコシド結合を有する基質であっても、イソマルトトリオース、パノース、サイクロデキストリンへの作用は認められなかった。また、可溶性澱粉、グリコーゲン、プルラン、デキストランなどの多糖への作用は認められなかった。
【００５８】
＜実験５−２：α−グルコシダーゼのマルトオリゴ糖への作用＞
実験５−１の結果を踏まえ、当該酵素のマルトオリゴ糖及びイソマルトオリゴ糖への作用をより詳細に検討した。純度９５％以上の試薬級のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース又はイソパノース（いずれも株式会社林原生物化学研究所販売）をそれぞれ終濃度１％（ｗ／ｖ）になるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを基質溶液とし、実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品をイソマルトース生成活性として基質固形物１グラム当たり４．５単位ずつ加え、３５℃で４時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止させた後、それぞれの基質から生成した反応物の糖組成をＨＰＬＣとＧＬＣを併用して測定した。ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。また、結果を表５に示す。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ（Ａｇ型）（三菱化学株式会社製）
内径１０ｍｍ×長さ２００ｍｍのカラムを２本連結して使用した。
カラム温度：８０℃
溶離液：水
流 速：０．４ｍｌ／分
検 出：示差屈折計
【００５９】
【表５】
【００６０】
表５の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼはマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース及びマルトペンタオースのいずれをも加水分解し、主としてグルコースとグルコース重合度が１減少したオリゴ糖及びイソマルトースを生成することが判明した。また、イソマルトース及びイソパノースも僅かに加水分解した。一方、イソマルトトリオース及びパノースには全く作用しなかった（反応前後で糖組成に変化なし）。また、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースと、基質のグルコース重合度が大きくなるにつれて、反応後に残存する基質の量が多くなり、本酵素の作用性が低下してゆくことが判明した。本酵素は、とりわけマルトースによく作用しグルコース以外に主としてイソマルトースを、また、僅かにマルトトリオースを生成した。
【００６１】
＜実験６：α−グルコシダーゼによるマルトースからのイソマルトースの生成＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼの精製標品を用い、本発明のα−グルコシダーゼによるマルトースからのイソマルトースの生成に及ぼす基質濃度の影響を調べた。マルトースを、終濃度１、５、１０、２０、３０又は４０質量％となるように２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものをそれぞれ基質溶液とし、実験２の方法で得た精製酵素標品をイソマルトース生成活性として基質固形物１グラム当たり２．３単位加え、３５℃で４８時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間保持して酵素を失活させた後、各反応液の糖組成当たりのイソマルトース含量を前述したイソマルトース生成活性測定法と同じ方法で測定した。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
表６から明らかなように、基質マルトースの濃度が高くなるにつれて反応液の糖組成におけるイソマルトース含量は増加し、基質濃度２０乃至４０質量％ではほぼ一定の約６４％に達した。この結果は、比較的基質濃度が高い条件において、本発明のα−グルコシダーゼをマルトースに作用させることにより、効率よくイソマルトースを製造できることを示している。
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
＜α−グルコシダーゼの調製＞
実験１で用いた液体培地を３０Ｌ−容ジャーファーメンターに約２０Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の種培養液２％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で６０時間培養した。培養液約１８Ｌから遠心分離して菌体を集め、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５Ｌに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル（ベッコーフェン製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液のイソマルトース生成活性を測定し培養液１ｍｌ当たりの活性に換算したところ、約０．０１単位／ｍｌ−培養液であった。菌体破砕抽出液は、陰イオン交換体としてセパビーズ ＦＰ ＤＡ−１３を用いた以外は実験２の方法に準じて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの段階まで精製し、α−グルコシダーゼ部分精製酵素標品として総イソマルトース生成活性で約１１０単位を得た。
【実施例２】
【００６６】
＜α−グルコシダーゼの調製＞
実験４−４で用いた液体培地を３０Ｌ−容ジャーファーメンターに約２０Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、実験４−３で得た形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴの種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で６０時間培養した。培養液約１８Ｌから遠心分離して菌体を集め、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５Ｌに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル（ベッコーフェン製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液は、実験２の方法に準じて硫安塩析・透析し、α−グルコシダーゼ粗酵素標品としてイソマルトース生成活性を総活性で約３１０，０００単位得た。
【実施例３】
【００６７】
＜マルトースからのイソマルトース含有糖質の製造＞
試薬級マルトース（商品名「マルトースＨＨＨ」、マルトース純度９９．９％以上、株式会社林原生物化学研究所販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、ｐＨを６．０に調整した後、実施例１の方法で調製した本発明のα−グルコシダーゼを固形物１グラム当たり３単位加え、４８時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりイソマルトースを６３％含有する反応液が得られた。この反応液を常法にしたがい濾過、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を行い、さらに濃縮して固形物濃度７０質量％のイソマルトース含有シラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１３．９％、マルトース４．６％、イソマルトース６２．２％、その他のオリゴ糖１９．３％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例４】
【００６８】
＜高純度イソマルトースの調製＞
実施例３の方法で得たイソマルトース含有シラップを原糖液とし、イソマルトース含量を高めるため強酸性カチオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＣＲ−１３１０」Ｎａ＋型、オルガノ株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。すなわち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレスカラム１０本に充填し、これらカラムを直列に接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して１．５％（ｖ／ｖ）加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣでモニターしながらイソマルトース高含有画分を採取した。得られたイソマルトース高含有画分を常法により精製し、濃縮して固形物濃度７５％のシラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１．７％、マルトース６．９％、イソマルトース８８．３％、その他のオリゴ糖３．１％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例５】
【００６９】
＜澱粉からのイソマルトース含有糖質の製造＞
トウモロコシ澱粉を濃度約３３％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加え、ｐＨ６．０に調整し、耐熱性α−アミラーゼ（商品名「スピターゼＨＳ」、ナガセケムテックス株式会社製）を澱粉質量当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、さらに、約５５℃に急冷して液化澱粉溶液を得た。この液化澱粉溶液に大豆β−アミラーゼを澱粉１グラム当たり４単位、及び、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉１グラム当たり２００単位になるよう加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で３６時間反応させた。この反応液に、α−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼ ＰＫ２」、ナガセケムテックス株式会社製）を澱粉１グラム当たり５単位加えて温度５０℃で１２時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりマルトースを８０．３％含有する反応液が得られた。次いで、反応液の温度を３５℃に、ｐＨを６．０に調整した後、実施例１の方法で調製した本発明のα−グルコシダーゼを固形物１グラム当たり２．５単位加え、４８時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりイソマルトースを５７．１％含有する反応液が得られた。この反応液を常法にしたがい濾過、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を行い、さらに濃縮して固形物濃度７０質量％のイソマルトース含有シラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１５．３％、マルトース４．０％、イソマルトース５５．１％、その他のオリゴ糖２５．６％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例６】
【００７０】
＜固定化α−グルコシダーゼ＞
ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を実施例１と同様の方法で培養し、培養液を遠心分離することによりα−グルコシダーゼ活性を発現した湿菌体１５０ｇを得た。次いで、この湿菌体を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社販売）溶液１５０ｍｌに混練した。得られた菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌した０．１Ｍ塩化カルシウム溶液に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径約２ｍｍの球状のゲル化物を調製した。これを０．１Ｍ塩化カルシウム溶液中に約２時間保持した後、吸引濾過してアルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体はα−グルコシダーゼ活性を発現していることから、カラムに充填するなどして固定化α−グルコシダーゼとしてイソマルトースの製造に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のα−グルコシダーゼは、マルトースに作用し、パノースやイソマルトトリオースを実質的に生成することなく多量のイソマルトースを生成することから、本発明のα−グルコシダーゼを用いればマルトースを原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。また、β−アミラーゼや他の酵素と組み合わせて用いれば、澱粉を原料として工業的規模でイソマルトースを製造することができる。従って、本発明のα−グルコシダーゼとこれを用いたイソマルトース製造法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
【符号の説明】
【００７２】
図２及び４において、
●：Ｃａ２＋イオン非存在下
○：１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下
図５において、
白抜き矢印：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡ
Ｔ７：Ｔ７プロモーター
ｐＵＣ ｏｒｉ：ｐＵＣ由来複製開始点
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｈｉｓ−ｔａｇ：ヒスチジンタグ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、さらには当該酵素を用いたイソマルトースの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イソマルトース（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グルコース）は、グルコース２分子がα−１，６グルコシド結合により結合した構造を有する還元性二糖であり、難結晶性で優れた保湿性を有する糖質である。イソマルトースは発酵食品などに微量含まれており、従来、グルコース、マルトース、パノースなどとの混合物の状態で各種食品、化粧品などに利用されている。
【０００３】
イソマルトースの製造方法としては、デキストランを酸で部分分解したものにイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させる方法（特許文献１）が知られている。デキストランを原料とするこの方法は、イソマルトースの収率は高いものの、デキストランという特殊な多糖の入手が容易ではないためイソマルトースの工業的な製造方法として採用されるに至っていない。また、イソマルトースの別の製造方法として、マルトースに麹菌由来のα−グルコシダーゼ（別名「トランスグルコシダーゼ」）を作用させ、イソマルトースを含むイソマルトオリゴ糖を生成させる方法も知られている（特許文献２）。しかしながら、当該方法により得られるイソマルトオリゴ糖は、イソマルトースとともに未反応原料であるマルトース、加水分解産物であるグルコース、さらにはパノースやイソマルトトリオースなど副生する多くの糖質を含有する混合物であるため、イソマルトオリゴ糖におけるイソマルトースの含量は、通常、糖組成当たり５乃至２０質量％に過ぎず、また、イソマルトオリゴ糖からのイソマルトースの単離も容易ではない。さらに、イソマルトオリゴ糖に前記のイソマルトデキストラナーゼを作用させたとしても、糖組成中のイソマルトースの含量は、通常、４０質量％未満と低い。
【０００４】
近年、本願と同じ出願人は、澱粉部分分解物を原料に、新規酵素であるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と上記イソマルトデキストラナーゼとを同時に作用させることを特徴とするイソマルトースの効率的製造方法を確立し開示した（特許文献３）。この方法によれば、酵素反応のみによって澱粉部分分解物から糖組成当たりイソマルトースを５０乃至７０質量％含有する糖組成物が得られるため、イソマルトースの工業的な製造方法として有用である。しかしながら、さらに異なるイソマルトースの製造方法が確立できれば、イソマルトースの製造における選択肢が広がると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２１６４９３号公報
【特許文献２】欧州特許公開 ＥＰ０８７５５８５ Ａ１公報
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ ２００２／０８８３７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イソマルトースの製造に有用なα−グルコシダーゼと、当該酵素を用いたイソマルトースの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、イソマルトース生成酵素産生能を有する微生物に着目し、鋭意スクリーニングを続けてきた。その結果、通性嫌気性菌であるラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＪＣＭ２７７２が、マルトースからイソマルトースを多量生成するα−グルコシダーゼを産生することを見出し、さらに当該α−グルコシダーゼが、意外にも、マルトースに作用してパノースやイソマルトトリオースを生成しないことを見出した。そして、このα−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立するとともに、該酵素を利用したイソマルトースの製造方法を確立して本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、α−グルコシダーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに該酵素を利用したイソマルトースの製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のα−グルコシダーゼは、とりわけ、マルトースによく作用し、多量のイソマルトースを生成するとともに、パノース、イソマルトトリオースなどの副生成物をほとんど生成しないことから、マルトースを原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。また、本発明のα−グルコシダーゼをβ−アミラーゼや澱粉枝切り酵素などと併用することにより、澱粉を原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の至適温度を示す図である。
【図３】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明のα−グルコシダーゼにおけるイソマルトース生成活性の温度安定性を示す図である。
【図５】組換え型α−グルコシダーゼ発現用の組換えＤＮＡを示す図である。図中、白抜き矢印で示した部分は、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のα−グルコシダーゼは、（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない；という特徴を有している。本発明のα−グルコシダーゼは、上記特徴の内、特に（３）の点において、公知の麹菌由来のα−グルコシダーゼ（別名「トランスグルコシダーゼ」）と明瞭に区別することができる。
【００１２】
本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、マルトースを基質とした反応液中に生成したイソマルトースを定量することにより測定することができる。具体的には、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にマルトース（商品名「マルトースＨＨＨ」、マルトース純度９９．９％以上、林原生物化学研究所販売）を終濃度２％（ｗ／ｖ）になるよう溶解したものを基質溶液とし、この基質溶液２ｍｌと酵素液２ｍｌを混合して３５℃で２時間反応を行ない、その後沸騰水浴中で１０分間保持することにより酵素を失活させ反応を停止する。次いで、反応液を脱塩した後、以下に示す条件にて高速液体クロマトグラフィー（以下、本明細書では「ＨＰＬＣ」と略記する）及びガス−リキッドクロマトグラフィー（以下、本明細書では「ＧＬＣ」と略記する）をそれぞれ行い、反応液中のイソマルトースを定量する。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０１（昭和電工）
カラム温度：６０℃
溶離液：水
流 速：０．５ｍｌ／分
検 出：示差屈折計
＜ＧＬＣ分析条件＞
試 料：反応物を常法によりトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）したもの
カラム：２％Ｓｉｌｉｃｏｎ ＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＣＳ ８０〜１００メッシュ （内径３ｍｍ×長さ２ｍ）
昇温プログラム：１６０℃（２分維持） → ３２０℃（７．５℃／分で昇温）
検 出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
上記ＨＰＬＣ分析において二糖の分離が不十分な場合、ＧＬＣ分析により求めたイソマルトースと他の二糖と割合に基づきＨＰＬＣで求めた二糖の含量を比例配分して反応液中のイソマルトースを定量する。なお、イソマルトース生成活性１単位は、上記反応条件下において、マルトースから１分間に１μｍｏｌのイソマルトースを生成する酵素量と定義する。
【００１３】
本発明のα−グルコシダーゼは、ラクトバチルス・ラムノサスを培養し、菌体内に産生されたα−グルコシダーゼを採取することにより調製することができる。ラクトバチルス・ラムノサスとしては、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２や、当該菌株を常法により突然変異処理して得られる酵素高生産性変異株などが有利に利用できる。
【００１４】
本発明のα−グルコシダーゼは、下記の理化学的性質を有している。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６２，０００±５，０００ダルトン；
（２）至適ｐＨ
３５℃、２時間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至７．０；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃；
（４）ｐＨ安定性
６℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、２時間保持の条件下、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃以下で安定；
１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃以下で安定；
【００１５】
また、上記理化学的性質を有する本発明のα−グルコシダーゼは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している場合がある。
【００１６】
本発明のα−グルコシダーゼは、通常、特定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、マルトースから多量のイソマルトースを生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号１０で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するものが好適である。
【００１７】
本発明のＤＮＡとは、上記α−グルコシダーゼをコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、上記α−グルコシダーゼをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を含むラクトバチルス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００１８】
本発明のＤＮＡは、通常、特定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号９で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号９で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号９で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号９で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００１９】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主細胞に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２０】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、目的とするα−グルコシダーゼを生成するものを選択すればよい。
【００２１】
本発明のα−グルコシダーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生物若しくは形質転換体の培養方法は、常法に従い、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１乃至５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌などにより好気的条件下で培養し、得られる菌体又は培養液上清などの培養物からα−グルコシダーゼを採取すればよい。通常、培養物を粗α−グルコシダーゼとして利用することができる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して採取し、利用することができる。さらに高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、更には、モノクローナル抗体への吸着、溶出などを組合せて純度を高めて利用することも随意である。また、本発明のα−グルコシダーゼ又はα−グルコシダーゼを発現したラクトバチルス属微生物菌体を公知の方法により固定化し、固定化酵素又は固定化菌体として、反応に繰り返し利用することも、連続反応に利用することも有利に実施できる。
【００２２】
α−グルコシダーゼが組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００２３】
イソマルトースの生成反応は、通常、次の条件で行なわれる。マルトース又はマルトース含有糖質を基質とし、基質濃度は１乃至６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、１０乃至４０％（ｗ／ｖ）、反応温度は１０乃至５０℃、望ましくは、３０乃至４０℃、反応ｐＨは５乃至１０、望ましくは、６．０乃至７．０、用いる酵素の量はイソマルトース生成活性として基質１グラム当り１単位以上、望ましくは、２乃至５単位の範囲から選ばれる。反応時間は適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５乃至７０時間の範囲が選ばれる。
【００２４】
上記の酵素反応により得られる反応液は、未反応原料のマルトースと加水分解により生成したグルコース及びグルコシル転移により新たに生成したイソマルトースやマルトトリオースを含有しており、これをイソマルトース含有糖質として、そのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、反応液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ＋型及びＯＨ−型イオン変換樹脂を用いて脱塩、濃縮してシラップ状製品とする。
【００２５】
必要ならば、更に、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型又はアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したイソマルトースを分離精製し、得られるイソマルトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることも有利に実施できる。
【００２６】
このようにして得られたイソマルトースは、比較的低甘味の甘味料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、嗜好性向上などに有利に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００２７】
また、本発明のα−グルコシダーゼをマルトース又はマルトース含有糖質に作用させて得られるイソマルトース含有糖質を、常法により水素添加することによってイソマルチトールを製造することもできる。
【００２８】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。なお、以下の実験におけるα−グルコシダーゼ活性は、前述した活性測定法により測定したマルトースからイソマルトースを生成するイソマルトース生成活性として表記した。
【００２９】
＜実験１：ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の培養＞
マルトース（商品名「サンマルト シロ」、株式会社林原商事販売）１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（商品名「酵母エキスＳ」、日本製薬株式会社販売）０．１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（商品名「ポリペプトン」、日本製薬株式会社販売）０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素ナトリウム０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン０．００１％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び脱イオン水からなる液体培地（ｐＨ６．５）を５００ｍｌ−容三角フラスコに３００ｍｌ入れたものを１６本調製し、１２１℃、２０分間滅菌した後、予め同培地で培養したラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の種培養液１．５％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、２４０ｒｐｍで撹拌しながら２７℃で６５時間培養した。
【００３０】
＜実験２：α−グルコシダーゼの精製＞
実験１で得た培養液約４．８Ｌを遠心分離して菌体約４０ｇを集め、一旦、−３０℃で凍結した。この凍結菌体に１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５６０ｍｌを添加して解凍した後、氷冷しつつ、超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。次いで、菌体破砕抽出液に８０％飽和になるよう硫安を添加溶解し、一晩放置して塩析し、生じた沈澱を遠心分離にて回収し、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析液中の不溶物を遠心分離にて除去した後、予め同緩衝液で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（株式会社東ソー製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量５５ｍｌ）に供したところ、α−グルコシダーゼは陰イオン交換体に吸着しなかったものの、大半の非吸着蛋白質とは遅れて溶出した。非吸着画分からα−グルコシダーゼ活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に透析し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック株式会社製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量６ｍｌ）に供した。α−グルコシダーゼは陽イオン交換体に吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．０５Ｍで溶出した。得られたα−グルコシダーゼ活性画分を濃縮し、α−グルコシダーゼ精製標品とした。精製工程を表１にまとめた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１の結果から明らかなように、この精製工程によって、α−グルコシダーゼの比活性は約４８０倍に上昇した。精製により得たα−グルコシダーゼ標品の純度を５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動法により検定したところ、蛋白バンドはほぼ単一であり、純度の高い標品であった。
【００３３】
＜実験３：α−グルコシダーゼの性質＞
【００３４】
＜実験３−１：分子量＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）の移動度と比較することにより分子量を測定したところ、当該α−グルコシダーゼの分子量は６２，０００±５，０００ダルトンであることが判明した。
【００３５】
＜実験３−２：至適ｐＨ及び至適温度＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性に及ぼすｐＨ及び温度の影響を活性測定法に準じてそれぞれ調べた。これらの結果を図１（至適ｐＨ）及び図２（至適温度）に示す。本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性の至適ｐＨは、３５℃、２時間反応の条件下でｐＨ６．５乃至７．０であった。また、至適温度はｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃であることが判明した。
【００３６】
＜実験３−３：ｐＨ安定性及び温度安定性＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性のｐＨ安定性及び温度安定性を調べた。ｐＨ安定性は、酵素を各ｐＨの緩衝液中で６℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存するイソマルトース生成活性を測定することにより求めた。温度安定性は、１ｍＭ塩化カルシウム添加又は無添加の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、酵素溶液を各温度に２時間保持し、水冷した後、残存するイソマルトース生成活性を測定することにより求めた。これらの結果を図３（ｐＨ安定性）及び図４（温度安定性）に示す。図３から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性はｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定であることが判明した。また、図４から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、Ｃａ２＋イオン非存在下（図４における符号●）では４０℃以下で安定であり、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下（図４における符号○）では４５℃以下で安定であることが判明した。
【００３７】
＜実験３−４：酵素活性に及ぼす金属イオンの影響＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性に及ぼす金属イオンの影響を、濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定することにより調べた。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
本発明のα−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性は、調査した１５種の金属イオンの内、Ｆｅ３＋及びＨｇ２＋イオンによって著しく阻害され、Ｓｎ２＋、Ａｌ３＋及びＣｕ２＋イオンでは３０乃至４０％阻害された。また、ＥＤＴＡによっては阻害されなかった。
【００４０】
＜実験３−５：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を用い、常法により本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー（モデル「Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２ＨＴ」、アプライドバイオシステムズ社製）にて１５残基分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、スレオニン−アスパラギン−スレオニン−アルギニン−トリプトファン−トリプトファン−リジン−グリシン−グルタミン酸−イソロイシン−バリン−チロシン−グルタミン−バリン−チロシン を有していることが判明した。
【００４１】
＜実験３−６：内部部分アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品を適量とり、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約０．１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１００μｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）２μｇを加えて、３０℃、１８時間保持することにより酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０』、直径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に注入し、流速０．１ｍｌ／分、室温の条件下、０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸から０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液までの１６０分間のアセトニトリル濃度のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を溶出させ分画した。ペプチド断片の溶出は波長２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。保持時間約３２分、約４５分及び約６０分に溶出した３種のペプチド断片Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を分取し、それぞれのアミノ酸配列を実験３−５と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号２、３及び４で示されるアミノ酸配列を有していた。
【００４２】
＜実験４：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
本発明のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡをラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び、形質転換体の調製を行った。
【００４３】
＜実験４−１：ゲノムＤＮＡの調製＞
実験１と同じ方法でラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を培養し、培養液約４ｍｌを遠心分離して、培養菌体約２ｍｇを得た。回収した菌体から『ディーエヌイージー・ティシュー・キット』（キアゲン社製）を用い、キットに添付された説明書記載の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、２０μｇを得た。調製したゲノムＤＮＡの濃度は５０μｇ／ｍｌとした。
【００４４】
＜実験４−２：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定＞
α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）の第５乃至第１１番目のアミノ酸配列に基づき、センスプライマーとして配列表における配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、同酵素の内部部分アミノ酸配列である配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列の第１１乃至第１６番目のアミノ酸配列に基づき、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−プラス−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素とし、ＰＣＲ装置（商品名「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９７００」、ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行ったところ、約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ Ｉサイトにクローニングし、得られた組換えＤＮＡを用い大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べたところ、目的とする約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片を有していた。その組換えＤＮＡを「ｐＣＲＲＭ１」と命名した。
【００４５】
組換えＤＮＡ、ｐＣＲＲＭ１が有する約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、通常のジデオキシ法により解読したところ、解読した１，１８７ｂｐの塩基配列がコードするアミノ酸配列中に、α−グルコシダーゼの内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列）が含まれていた。この結果から、得られたＤＮＡ断片は目的とするα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推察された。
【００４６】
上記のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｅｃｏ ＲＩにて切断されないことを予め確認した後、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの一部と推定されるＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号７及び８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約６，０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。
【００４７】
得られた約６，０００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、メチオニンで始まり、α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）と３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）を全て含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームが認められ、本ＤＮＡ断片中に目的遺伝子全長が存在していることが判明した。この知見に基づきα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡは、配列表における配列番号９で示される鎖長１，６７７ｂｐの塩基配列を有しており、当該塩基配列に併記した５５９残基からなるアミノ酸配列をコードしていることが判明した。実験３−５で判明したα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）及び実験３−６で判明した３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）は、そのいずれもが配列表における配列番号９で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列中に認められ、それぞれ当該アミノ酸配列における第２乃至第１６番目、第２３０乃至第２３８番目、第１１２６乃至第１３０番目、及び、第３８６乃至第４０３番目のアミノ酸配列と完全に一致していた。この結果から、本発明のα−グルコシダーゼは、配列表における配列番号９で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列においてＮ末端のメチオニンが１つ欠けたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号１０で示される５５８アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有していることが分かった。なお、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列から算出される分子量は６３，５２８であり、この値は実験３−１で求めたラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼの分子量、６２，０００±５，０００ダルトンとよく一致するものであった。
【００４８】
＜実験４−３：組換え型α−グルコシダーゼ発現用ベクターの構築と形質転換体の調製＞
ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２由来α−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）における第１乃至第６番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の５´末端側に制限酵素Ｎｄｅ Ｉ認識部位を作製すべく、センスプライマーとして配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。また、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列における第５５１乃至第５５８番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の３´末端側にヒスチジン残基（Ｈｉｓ）６残基からなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）と制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ認識部位を作製すべく、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−プラス−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素とし、ＰＣＲ装置（商品名「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ９７００」、ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡをポリエチレングリコール沈澱により精製し、クローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ Ｉ認識部位に挿入し、得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。得られた形質転換体より市販のキット（商品名「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」キアゲン社製）を用いて組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化した。前記市販のキットを用いてＮｄｅ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を調製し、同じ制限酵素の組み合わせで予め消化しておいた発現ベクター（商品名「ｐＲＳＥＴ Ａ」、インビトロジェン社製）に市販のキット（商品名「Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ」、東洋紡製）を用いて挿入した。得られた反応物を用いて大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べ、目的とする約１，７００ｂｐのＤＮＡ断片を有するものを選択した。選択した形質転換体が有する組換えＤＮＡを「ｐＲＳ−ＲＭＨＴ」と命名した。組換えＤＮＡ、ｐＲＳ−ＲＭＨＴを用いて発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、形質転換体『ＲＳ−ＲＭＨＴ』を調製した。
【００４９】
＜実験４−４：形質転換体における組換え型α−グルコシダーゼの発現と部分精製＞
実験４−３で得た形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴを、ＴＢ培地（トリプトン １．２％、酵母エキス ２．４％、グリセリン ０．４％、リン酸２水素１カリウム １７ｍＭ、リン酸水素２カリウム ７２ｍＭ、ｐＨ６．８、アンピシリン １００μｇ／ｍｌ含有）を１００ｍｌずつ入れた５００ｍｌ容三角フラスコ２本に植菌し、２７℃で１８時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して菌体を回収した。次いで、菌体を、０．３Ｍ食塩を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）に懸濁し、リゾチームを０．７５ｍｇ加えて−８０℃で凍結させ、２５℃で融解した後、２５℃で１時間振トウした。超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物の遠心分離上清を全細胞抽出物とした。全細胞抽出液の総α−グルコシダーゼ活性（イソマルトース生成活性）は約３，６１０単位であった。
【００５０】
形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴにおいて発現させた組換え型α−グルコシダーゼにはＨｉｓ−ｔａｇが付加されていることから、全細胞抽出液を商品名「ＴＡＬＯＮ ｒｅｓｉｎ（Ｃｏ２＋）」（クロンテック社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供し、常法に従い溶出し、組換え型α−グルコシダーゼの部分精製を行った。組換え型酵素の精製結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表３に示すように、アフィニティークロマトグラフィーにより組換え型α−グルコシダーゼの部分精製標品が１１６ｍｇ得られた。当該部分精製標品の比活性は１４単位／ｍｇ−蛋白、全細胞抽出液からの活性収率は４５％であった。
【００５３】
さらに組換え型α−グルコシダーゼの部分精製酵素標品の酵素的性質を実験３に示した方法に準じて調べた。その結果、組換え型α−グルコシダーゼのイソマルトース生成活性の至適ｐＨは３５℃、２時間反応の条件下でｐＨ６．５乃至７．０、至適温度はｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃、ｐＨ安定性は、各ｐＨに６℃で２４時間保持する条件下で約４．５乃至１０．０の範囲で安定、温度安定性は、各温度にｐＨ６．０で２時間保持する条件下で、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃まで安定、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃まで安定であった。これらの理化学的性質は、実験２で調製したα−グルコシダーゼのそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のα−グルコシダーゼが、組換えＤＮＡ技術によっても良好に製造できることを示している。
【００５４】
＜実験５：α−グルコシダーゼの基質特異性＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼの精製標品を各種糖質に作用させ、基質特異性を調べた。
【００５５】
＜実験５−１：α−グルコシダーゼの各種糖質への作用＞
下記の表５に示す３０種の糖質を用いてα−グルコシダーゼの基質特異性を調べた。各糖質を基質として終濃度２％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを２．５単位ずつ加え、３５℃で１６時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止させた後、それぞれの基質から生成した反応物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略称する）に供し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無及び生成する糖質を確認した。ＴＬＣにおいて、用いた基質以外の反応生成物のスポットが認められるものを「作用する」（＋）、反応生成物が認められないものを「作用しない」（−）と判定した。結果を表４に示す。
＜ＴＬＣ分析条件＞
ＴＬＣプレート：シリカゲルアルミニウムプレート（商品名『シリカゲル
６０Ｆ２５４』、１０×２０ｃｍ、メルク社製）
展開溶媒：ｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）
展開方法：上昇法、２回展開
検出方法：硫酸−メタノール法
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４の結果から明らかなように、本酵素は、試験した糖質のうち、ＰＮＰ−α−グルコシド、スクロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、コージビオース、ニゲロース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖、さらにマルチトール、マルトトリイトール、短鎖アミロースに作用し、グルコースを生成した。また、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖からはイソマルトースの生成が認められた。一方、ＰＮＰ−β−グルコシド、トレハロース、ラクトース、セロビオースなどのα−グルコシド結合を有さない基質への作用は認められなかった。α−グルコシド結合を有する基質であっても、イソマルトトリオース、パノース、サイクロデキストリンへの作用は認められなかった。また、可溶性澱粉、グリコーゲン、プルラン、デキストランなどの多糖への作用は認められなかった。
【００５８】
＜実験５−２：α−グルコシダーゼのマルトオリゴ糖への作用＞
実験５−１の結果を踏まえ、当該酵素のマルトオリゴ糖及びイソマルトオリゴ糖への作用をより詳細に検討した。純度９５％以上の試薬級のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース又はイソパノース（いずれも株式会社林原生物化学研究所販売）をそれぞれ終濃度１％（ｗ／ｖ）になるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを基質溶液とし、実験２の方法で得たα−グルコシダーゼ精製標品をイソマルトース生成活性として基質固形物１グラム当たり４．５単位ずつ加え、３５℃で４時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止させた後、それぞれの基質から生成した反応物の糖組成をＨＰＬＣとＧＬＣを併用して測定した。ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。また、結果を表５に示す。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ（Ａｇ型）（三菱化学株式会社製）
内径１０ｍｍ×長さ２００ｍｍのカラムを２本連結して使用した。
カラム温度：８０℃
溶離液：水
流 速：０．４ｍｌ／分
検 出：示差屈折計
【００５９】
【表５】
【００６０】
表５の結果から明らかなように、本発明のα−グルコシダーゼはマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース及びマルトペンタオースのいずれをも加水分解し、主としてグルコースとグルコース重合度が１減少したオリゴ糖及びイソマルトースを生成することが判明した。また、イソマルトース及びイソパノースも僅かに加水分解した。一方、イソマルトトリオース及びパノースには全く作用しなかった（反応前後で糖組成に変化なし）。また、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースと、基質のグルコース重合度が大きくなるにつれて、反応後に残存する基質の量が多くなり、本酵素の作用性が低下してゆくことが判明した。本酵素は、とりわけマルトースによく作用しグルコース以外に主としてイソマルトースを、また、僅かにマルトトリオースを生成した。
【００６１】
＜実験６：α−グルコシダーゼによるマルトースからのイソマルトースの生成＞
実験２の方法で得たα−グルコシダーゼの精製標品を用い、本発明のα−グルコシダーゼによるマルトースからのイソマルトースの生成に及ぼす基質濃度の影響を調べた。マルトースを、終濃度１、５、１０、２０、３０又は４０質量％となるように２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものをそれぞれ基質溶液とし、実験２の方法で得た精製酵素標品をイソマルトース生成活性として基質固形物１グラム当たり２．３単位加え、３５℃で４８時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間保持して酵素を失活させた後、各反応液の糖組成当たりのイソマルトース含量を前述したイソマルトース生成活性測定法と同じ方法で測定した。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
表６から明らかなように、基質マルトースの濃度が高くなるにつれて反応液の糖組成におけるイソマルトース含量は増加し、基質濃度２０乃至４０質量％ではほぼ一定の約６４％に達した。この結果は、比較的基質濃度が高い条件において、本発明のα−グルコシダーゼをマルトースに作用させることにより、効率よくイソマルトースを製造できることを示している。
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
＜α−グルコシダーゼの調製＞
実験１で用いた液体培地を３０Ｌ−容ジャーファーメンターに約２０Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２の種培養液２％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で６０時間培養した。培養液約１８Ｌから遠心分離して菌体を集め、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５Ｌに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル（ベッコーフェン製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液のイソマルトース生成活性を測定し培養液１ｍｌ当たりの活性に換算したところ、約０．０１単位／ｍｌ−培養液であった。菌体破砕抽出液は、陰イオン交換体としてセパビーズ ＦＰ ＤＡ−１３を用いた以外は実験２の方法に準じて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの段階まで精製し、α−グルコシダーゼ部分精製酵素標品として総イソマルトース生成活性で約１１０単位を得た。
【実施例２】
【００６６】
＜α−グルコシダーゼの調製＞
実験４−４で用いた液体培地を３０Ｌ−容ジャーファーメンターに約２０Ｌ入れ、１２０℃、２０分間滅菌した後、実験４−３で得た形質転換体ＲＳ−ＲＭＨＴの種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら２７℃で６０時間培養した。培養液約１８Ｌから遠心分離して菌体を集め、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５Ｌに懸濁し、細胞破砕機ダイノミル（ベッコーフェン製）を用いて破砕した。得られた菌体破砕懸濁液を遠心分離し、上清を回収して菌体破砕抽出液とした。菌体破砕抽出液は、実験２の方法に準じて硫安塩析・透析し、α−グルコシダーゼ粗酵素標品としてイソマルトース生成活性を総活性で約３１０，０００単位得た。
【実施例３】
【００６７】
＜マルトースからのイソマルトース含有糖質の製造＞
試薬級マルトース（商品名「マルトースＨＨＨ」、マルトース純度９９．９％以上、株式会社林原生物化学研究所販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、ｐＨを６．０に調整した後、実施例１の方法で調製した本発明のα−グルコシダーゼを固形物１グラム当たり３単位加え、４８時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりイソマルトースを６３％含有する反応液が得られた。この反応液を常法にしたがい濾過、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を行い、さらに濃縮して固形物濃度７０質量％のイソマルトース含有シラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１３．９％、マルトース４．６％、イソマルトース６２．２％、その他のオリゴ糖１９．３％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例４】
【００６８】
＜高純度イソマルトースの調製＞
実施例３の方法で得たイソマルトース含有シラップを原糖液とし、イソマルトース含量を高めるため強酸性カチオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＣＲ−１３１０」Ｎａ＋型、オルガノ株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。すなわち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレスカラム１０本に充填し、これらカラムを直列に接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して１．５％（ｖ／ｖ）加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣでモニターしながらイソマルトース高含有画分を採取した。得られたイソマルトース高含有画分を常法により精製し、濃縮して固形物濃度７５％のシラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１．７％、マルトース６．９％、イソマルトース８８．３％、その他のオリゴ糖３．１％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例５】
【００６９】
＜澱粉からのイソマルトース含有糖質の製造＞
トウモロコシ澱粉を濃度約３３％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加え、ｐＨ６．０に調整し、耐熱性α−アミラーゼ（商品名「スピターゼＨＳ」、ナガセケムテックス株式会社製）を澱粉質量当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、さらに、約５５℃に急冷して液化澱粉溶液を得た。この液化澱粉溶液に大豆β−アミラーゼを澱粉１グラム当たり４単位、及び、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉１グラム当たり２００単位になるよう加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で３６時間反応させた。この反応液に、α−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼ ＰＫ２」、ナガセケムテックス株式会社製）を澱粉１グラム当たり５単位加えて温度５０℃で１２時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりマルトースを８０．３％含有する反応液が得られた。次いで、反応液の温度を３５℃に、ｐＨを６．０に調整した後、実施例１の方法で調製した本発明のα−グルコシダーゼを固形物１グラム当たり２．５単位加え、４８時間反応させ、９５℃で３０分間保持して反応を停止させた。この操作により糖組成当たりイソマルトースを５７．１％含有する反応液が得られた。この反応液を常法にしたがい濾過、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩を行い、さらに濃縮して固形物濃度７０質量％のイソマルトース含有シラップを得た。本品の糖組成は、グルコース１５．３％、マルトース４．０％、イソマルトース５５．１％、その他のオリゴ糖２５．６％であった。本品は、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。
【実施例６】
【００７０】
＜固定化α−グルコシダーゼ＞
ラクトバチルス・ラムノサス ＪＣＭ２７７２を実施例１と同様の方法で培養し、培養液を遠心分離することによりα−グルコシダーゼ活性を発現した湿菌体１５０ｇを得た。次いで、この湿菌体を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社販売）溶液１５０ｍｌに混練した。得られた菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌した０．１Ｍ塩化カルシウム溶液に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径約２ｍｍの球状のゲル化物を調製した。これを０．１Ｍ塩化カルシウム溶液中に約２時間保持した後、吸引濾過してアルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体はα−グルコシダーゼ活性を発現していることから、カラムに充填するなどして固定化α−グルコシダーゼとしてイソマルトースの製造に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のα−グルコシダーゼは、マルトースに作用し、パノースやイソマルトトリオースを実質的に生成することなく多量のイソマルトースを生成することから、本発明のα−グルコシダーゼを用いればマルトースを原料として効率よくイソマルトースを製造することができる。また、β−アミラーゼや他の酵素と組み合わせて用いれば、澱粉を原料として工業的規模でイソマルトースを製造することができる。従って、本発明のα−グルコシダーゼとこれを用いたイソマルトース製造法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
【符号の説明】
【００７２】
図２及び４において、
●：Ｃａ２＋イオン非存在下
○：１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下
図５において、
白抜き矢印：α−グルコシダーゼをコードするＤＮＡ
Ｔ７：Ｔ７プロモーター
ｐＵＣ ｏｒｉ：ｐＵＣ由来複製開始点
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｈｉｓ−ｔａｇ：ヒスチジンタグ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の基質特異性を有するα−グルコシダーゼ：
（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；
（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び
（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求項１記載のα−グルコシダーゼ。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６２，０００±５，０００ダルトンを示す；
（２）至適ｐＨ
３５℃、２時間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至７．０；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃；
（４）ｐＨ安定性
６℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、２時間保持の条件下、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃以下で安定；
１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃以下で安定。
【請求項３】
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する請求項１又は２記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項４】
配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列か、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、α−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項１乃至３のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項５】
請求項４記載のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表における配列番号９で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号９で示される塩基配列において、コードするα−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号９で示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項５又は６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
ラクトバチルス属に属し、請求項１乃至５のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ産生能を有する微生物を、栄養培地で培養してα−グルコシダーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項９記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型α−グルコシダーゼを採取することを特徴とする組換え型α−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１２】
マルトースを含有する溶液に、請求項１乃至５のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを作用させることによりイソマルトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法。
【請求項１】
下記の基質特異性を有するα−グルコシダーゼ：
（１）マルトオリゴ糖に作用し、加水分解反応によりグルコースを生成する；
（２）マルトースに作用し、グルコシル転移反応によりイソマルトースとともにマルトトリオースを生成する；及び
（３）マルトースからパノース及びイソマルトトリオースを生成しない。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求項１記載のα−グルコシダーゼ。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、６２，０００±５，０００ダルトンを示す；
（２）至適ｐＨ
３５℃、２時間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至７．０；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、２時間反応の条件下で４０℃；
（４）ｐＨ安定性
６℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０の範囲で安定；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、２時間保持の条件下、Ｃａ２＋イオン非存在下において４０℃以下で安定；
１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下において４５℃以下で安定。
【請求項３】
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する請求項１又は２記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項４】
配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列か、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、α−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項１乃至３のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項５】
請求項４記載のα−グルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表における配列番号９で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号９で示される塩基配列において、コードするα−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号９で示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項５又は６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
ラクトバチルス属に属し、請求項１乃至５のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ産生能を有する微生物を、栄養培地で培養してα−グルコシダーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項９記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型α−グルコシダーゼを採取することを特徴とする組換え型α−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１２】
マルトースを含有する溶液に、請求項１乃至５のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを作用させることによりイソマルトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２３９１０（Ｐ２０１１−２２３９１０Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９５９８８（Ｐ２０１０−９５９８８）
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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