本発明は、ベータ-アミノ酸の立体特異的合成方法及び鏡像異性体濃縮方法に関する。Ｄ-ベータ-フェニルアラニン・Ｄ-３-アミノ-３-フェニルプロパン酸への立体選択性を示す新規のＤ-ベータ-アミノトランスフェラーゼは、バリオボラックス・パラドキサスの新たに単離された株から精製された。新規のＬ-ベータ-アミノトランスフェラーゼは、アルカリゲネス・ユートロフスの新たに単離された株から精製された。Ｄ-及びＬ-ベータ-アミノトランスフェラーゼは、コファクターであるリン酸ピリドキサールの存在下で、Ｌ-グルタミン酸又はＬ-アラニン、及び３-ケト-３-フェニルプロパン酸からベータ-Ｄ-フェニルアラニン又はベータ-Ｌ-フェニルアラニンの立体選択的生合成を促進するために使用されうる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002] 本発明は、βアミノ酸の立体特異的合成方法及び鏡像異性体濃縮方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0001] 本出願は、２００３年７月１０日に出願された米国仮特許出願第60/486,032号、及び２００３年９月２日に出願された米国仮特許出願第60/499,622号の優先権を主張する。
【０００３】
背景
[0003] β-アミノ酸は、抗菌性、抗真菌性、又は細胞傷害性の性質を有する多様な天然物において鍵となる構造要素であることが多い。β-アミノ酸を最終的な構造の要素として必要とする化合物、又は鏡像異性的に純粋なβ-アミノ酸をキラル中間体として使用することを必要とする化合物の合成は、困難であることが多い(Enantioselective Synthesis of β-Amino Acids, Eusebio Juaristi編, Wiley-VCH, 491頁, 1997を参照のこと)。
【０００４】
[0004] 多くのβ-アミノ酸は市販されておらず、合成することが難しいか、又は鏡像異性的に純粋な調製品を得ることは法外に値段が高い。鏡像異性的に純粋なβ-アミノ酸を生産するために、多くの合成化学経路が開発されてきた一方、アミノ・トランスフェラーゼ又は他の酵素を使用するβ-アミノ酸を産生するための生合成経路は、クロマトグラフィー方法によりキラル化合物の分離を必要とする化学方法より好ましいかもしれない( (Soloshonok, V. A. Biocatalytic entry to enantiomerically pure p-amino acids. In Enantioseleetive Synthesis of-Amino Acids, Eusebio Juaristi編, Wiley-VCH, 1997, 443-464)。
【０００５】
[0005] アミノ・トランスフェラーゼ(E.C. 2. 6. 1)は、一級アミンからアミノ基、電子対、及びプロトンを、アクセプター分子のカルボニル基に移すことを触媒する((Stirling, D. I. "Enzymic synthesis and resolution of enantiomerically pure compounds" In Chiralty Ind. (1992) 209-22, Wileyら編. Colins, Andrew N.; Sheldrake, G. N., 及びCrosby, J.)。多くのアミノ・トランスフェラーゼは、コファクター、つまりコエンザイムであるピリドキサール５-リン酸を必要とする。種々のアミノ・トランスフェラーゼは、特徴づけられてきており、特にα-アミノ酸からのアミノ基を、２-ケト酸に移すことに関与する。ピルビン酸、オキサロアセテート、及び２-ケトグルタル酸は、アルファ・アミノ・トランスフェラーゼと分類されるこれらの酵素の重要な基質である。
【０００６】
[0006] アミノ・トランスフェラーゼの幾つかの別の型(例えば、γ-、ε-、及びω-アミノ・トランスフェラーゼ)が記載された。ω-アミノ・トランスフェラーゼは、アミノ基がカルボン酸基に近接(隣接)していない基質を利用できる。当該クラスの酵素において、アミノ・ドナーは、一般的にω-アミノ酸及びα,ω-ジアミノ酸に限定されている。これらは、アルファ・オメガ-ジアミノ酸(Ｅ.Ｃ.２.６.８)、Ｌ-オルニチン(Ｅ.Ｃ.２.６.１３)、β-アラニン(Ｅ.Ｃ.２.６.１８)、４アミノブチレート(Ｅ.Ｃ.２.６.１９)、アルファオメガ・ジアミン(Ｅ.Ｃ.２.６.２９)、Ｌ-リジン(Ｅ.Ｃ.２.６.３６)、２.４ジアミノブチレート(Ｅ.Ｃ.２.６.４６)、又はタウリン(Ｅ.Ｃ.２.６.５５)をアミノ酸ドナーとして使用し、そして２-ケトグルタレート又はピルベートをアミノ・アクセプターとして使用する酵素を含む。
【０００７】
[0007] β-アラニン-ピルベート・トランスアミナーゼ(ＥＣ２.６.１.１８；β-アラニン-ピルベート・アミノ・トランスフェラーゼ；β-アラニン-α-アラニン・トランスアミナーゼ；Ｌ-アラニン：３-オキソプロパノエート・アミノ・トランスフェラーゼ)として通常知られるω-アミノ・トランスフェラーゼは、リン酸ピリドキサールをコファクターとして使用して、以下の反応：
Ｌ-アラニン＋３-オキソプロパノエート＝ピルベート＋β-アラニン
を行う (Hayaishi, O., Nishizuka, Y., Tatibana, M., Takeshita, M. 及び Kuno, S. Enzymatic studies on the metabolism of β-alanine. J. Biol. Chem. 236 (1961) 781-790; Stinson, R. A. 及び Spencer, M.S. β-alanine aminotransferase(s) from a plant source. Biochem. Biophys. Res. Commun. 34 (1969) 120- 127)。 Watersとその同僚は、シュードモナス・アレルギノーサ(Pseudomonas aeraginosa)によるβ-アラニンの完全な異化代謝が、β-アラニン：ピルベート・アミノ・トランスフェラーゼでのアミノ基転移に関するということを記載した(FEMS Micro Lett 34 (1986) 279-282)。
【０００８】
[0008] Yonahaとその同僚は、シュードモナス種において見つかったオメガ・アミノ酸ピルベート・トランスアミナーゼを記載した。ここでピルベートは、排他的（exclusive）アミノ・アクセプターであった(Agric. Biol. Chem. 42(12) : 2363-2367, 1978; Agric. Biol. Chem. 41 (9) : 1701-1706, 1977)。 一級アミノアルカンは、好ましいアミノ・ドナーであり、そしてオメガ・アミノ酸、例えばβ-アラニンは、好ましい基質ではない。
【０００９】
[0009] ナカノとその同僚は、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)において、β-アラニン・アミノ・トランスフェラーゼ及びガンマ・アミノブチレート・トランスアミナーゼを含む２種のオメガ・アミノ酸・トランスアミナーゼを同定した。当該２種の酵素は、β-アラニンにおける活性(１００対３)及びガンマ-アミノブチレートにおける活性(４３対１００)において異なった(J. Biochem 81, 1375-1381, 1977)。
【００１０】
[0010] β-アラニン・アミノ・トランスフェラーゼは、βアラニン(３-アミノプロピオン酸)、或いはアミノ基が末端でありかつカルボン酸に近接していない類似構造の直鎖アミノ酸を使用する。しかしながら、これらの酵素のどれも、より複雑なβ-アミノ酸(例えば、β-置換β-アミノ酸、又はα,β-二置換β-アミノ酸)の可逆性アミノ基転移、例えば３-ケト-３-フェニルプロピオン酸とβ-フェニルアラニンとの間のアミノ基転移を触媒しないことが示された。
【００１１】
[0011] イー・コリ(E. coli)のペニシリン・アシラーゼ(ＰＡ；ＥＣ ３. ５.１.１１)は、β-置換及びα,β-二置換β-アミノ酸を製造するために使用された。α-アミノ酸のみを基質として許容する多くのアミノ酸アシラーゼ及びアミノ・トランスフェラーゼとは異なって、PAは、広い基質許容性を有するように思われる(Pohl, T., Waldmann H, Tetrahedron Lett (1995) 36: 2963 - 2966; Waldman H. Tetrahedron Lett (1988) 29 : 1131-1134)。Soloshonokとその同僚は、β-アルキル及びβ-フルオロアルキル・ベータ・アラニンのＮ-フェニルアセチル誘導体のＰＡ触媒性加水分解を報告し、そして光学的に純粋なβ-アリール-β-アミノ酸の合成を報告した(Soloshonok, V. A.ら、An enzymatic entry to enantiopure β-amino acids. Synlett (1933) 5: 339-341; Soloshonok, V. A.ら、Biocatalytic approach to enantiomerically pure β-amino acids. Tetrahedron : Asymmetry (1995) 6 : 1601-1610)。Cardilloとその同僚は、一連のラセミ化合物のα-アルキル-β-アミノ酸を製造した(Cardillo G. ら、Enzymic resolution of α-alkyl-β-amino acids using immobilized Penicillin G acylase, J. Org. Chem. (1996) 61: 8651-8654)。Ngとその同僚は、β-一置換β・アミノ酸のＰＡ-触媒性の分離を報告した(Ng, J. S. and Topgi, R. S. Biocatalytic process for optically active β-amino acids. Curr. Opin. Drug Disc Dev (1998) 1(3) : 314-328 ;米国特許第6,214,909号に総説される)。
【００１２】
[0012] キラル・アミノ酸及びアミンの製造において使用するアミノ・トランスフェラーゼ酵素の単離のための選択的濃縮の使用が報告された(Stirling, D. I.,1992 The Use of Aminotransferases for the Production of Chiral Amino Acids and Amines, pp. 209-222. In: Collins, Sheldrake, 及びCrosbyら(編), Chirality in Industry, John Wiley and Sons Ltd., New York)。Stirlingは、唯一の窒素源としてカルチャー内に第二アミンを含むことにより、微生物の濃縮を記載した。単離された生物体、並びにω-アミノ・トランスフェラーゼ活性を含むと知られている生物体は、１-フェニル-３-アミノブタンを脱アミノ化する能力についてスクリーニングされた。バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 15692、及びシュードモナス・プチーダ(Pseudomonas putida)ATCC 39213は全て、当該能力について選別された。これらの酵素の全ては、脱アミノ化反応において、ピルビン酸、又は代わりのα-ケト酸を、アミノ基アクセプターとして必要とすることが発見された。当該研究が、β-フェニルアラニンを脱アミノ化(鏡像異性体濃縮、又は分離)できる可能性を記載する一方で、当該研究は、トランスアミナーゼ酵素を使用して、対応するβ-ケト酸から当該化合物を鏡像異性体合成する証拠を示さない。ラセミ性β-フェニルアラニンの分離はまた、(R)又はL-鏡像異性体での活性に特異的である。
【００１３】
[0013] Stirlingらに対する米国特許第4,950,606号、第5,300,437号、及び第5,169,780号は、アミノ基がキラル置換される二番目の炭素原子上にある、アミンの鏡像異性濃縮を開示する。プロキラル・ケトン由来の１のキラルアミンの立体選択的合成が開示される。当該試験において使用されるω-トランスアミナーゼの由来元は、バチルス・メガテリウム、シュードモナス・アエルギノーサATCC１５６９２、及びシュードモナス・プチーダATCC３９２１３を含む。これらの酵素を使用して、β-ケト酸からβ-アミノ酸、例えばβ-フェニルアラニンを製造することは開示されなかった。
【００１４】
[0014] Kidmanに対する米国特許第5,316,943号は、アミノ酸のＤ,Ｌラセミ混合体から、光学的に純粋なＬ-アミノ酸を製造する方法であって、以下のステップ：
(i) 当該アミノ酸のラセミ混合体を、トランスアミナーゼ産生微生物で処理し；
(ii) 当該アミノ酸のラセミ混合体及び微生物を適切な温度及びｐＨで適切な時間発酵し；そして
(iii) 当該光学的に純粋なL-アミノ酸を回収する
を含む方法を記載する。
【００１５】
[0015] Rozellに対する米国特許第4,518,692号は、アルファ・アミノ酸又はその誘導体を産生する方法であって、トランスアミナーゼ酵素の存在下でアルファ-ケト酸をL-アスパラギン酸と反応して、(１)当該アルファ・ケト酸に対応するアルファ・アミノ酸及び(２)オキサロアセテートを産生し；そして当該オキサロアセテートを脱炭酸することを含む方法を開示する。
【００１６】
[0016] Rozellに対する米国特許第4,826,766号は、２個のアミノ・トランスフェラーゼに関与する結合反応を使用して、所望のアルファ-アミノ酸を産生する方法を開示する。第一トランスアミナーゼは、所望のアルファ-アミノ酸及び不所望のアルファ・ケト酸をもたらす反応を効率的に触媒し、そして第二トランスアミナーゼは、不所望のアルファ・ケト酸を基質として使用して、反応を効率的に触媒する。
【００１７】
[0017] Fotheringhamに対する米国特許第6,197,558号は、第一アミノ酸及びケト酸を、トランスアミナーゼと反応させて、第二アミノ酸及びピルベートを産生し、そしてピルベートをアセト乳酸シンターゼと反応して、トランスアミナーゼと反応しない化合物を製造することによりアミノ酸を作成する方法を記載する。
【００１８】
[0018] Woodに対する米国特許第4,600,692号は、フェニルアラニンの製造方法であって、フェニルピルビン酸又はフェニルピルベートを、アミン・ドナーの存在下でトランスアミナーゼ活性を有する固定化全細胞と接触することを含む方法を記載する。遊離又は固定状態において、酵素で破壊又は投下処理された細胞が使用されうる。
【発明の開示】
【００１９】
要約
[0019] 本発明は、β-アミノ酸の立体特異的合成及び鏡像異性体濃縮に関する。その最も広い意味では、本発明は、アミノ・アクセプターの存在下において、β-アミノ酸トランスアミナーゼ(β-トランスアミナーゼ又はβ-アミノ・トランスフェラーゼ)を使用して、当該アミノ基が非末端、キラル置換される炭素原子に結合するキラルアミンの混合体を立体選択的に合成し又は鏡像異性体濃縮することに関する。
【００２０】
[0020] 本発明の１の態様は、β-アミノ酸、又はその塩の立体選択的な合成方法であり、当該合成は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下においてアミノ・ドナー及びアミノ・アクセプターを接触して、アミノ・アクセプターからβ-アミノ酸鏡像異性体、又はその塩を形成することを含む。
好ましい態様において、当該β-アミノ酸は、以下の式I：
【化１】

の化合物であり、そして当該アミノ・アクセプターは、以下の式II：
【化２】

の化合物である。
式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキルのラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで、当該ラジカルの全ては、ヒドロキシル、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらの基は場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され、
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は全てがＨであることはなく、
Ｒ⁴が、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む。
【００２１】
[0021] 本発明の別の態様は、β-アミノ酸、又はその塩を立体選択的に合成するための方法であり、当該方法は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下においてアミノ・ドナー及びアミノ・アクセプターを接触して、当該アミノ・アクセプターから立体選択的にβ-アミノ酸鏡像異性体、又はその塩を形成することを含む。
ここで、当該β-アミノ酸、又はその塩は、以下の式ＩＩＩ：
【化３】

で表される化合物であり、そして当該アミノ酸アクセプターは、以下の式ＩＶ：
【化４】

の化合物である。
式中、Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む。
【００２２】
[0022] 本発明の別の態様は、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＬ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性的に濃縮する方法であり、当該方法は、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下で、当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体をアミノ・アクセプターと接触させて、当該Ｌ-β-アミノ酸エナンチオマーの少なくとも一部を、対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体において当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体対当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増加させることを含む。
【００２３】
[0023] 本発明の別の態様は、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体、及びその対応するＤ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性体濃縮する方法であり、当該方法は、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下において、当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体を、アミノ・アクセプターと接触して、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体の少なくとも一部を、対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体における当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体対当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大することを含む。
【００２４】
[0024] 本発明の別の態様は、鏡像異性体濃縮されたβ-アミノ酸、又はその塩を製造する方法であり、当該方法は、ラセミ体のβ-アミノ酸の１の鏡像異性体をその対応するβ-ケト酸誘導体に変換するために適切な条件下で、
(ｉ) 以下の式Ｉ：
【化５】

[式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで置換される)で場合により置換され；
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、全てがＨではなく；そして
Ｒ⁴が水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
で表される構造を有するラセミ体β-アミノ酸、又はその塩；
(ii) アミノ・アクセプター、及び
(iii) 立体特異的β-アミノ酸トランスアミナーゼ
を接触し、それにより当該β-アミノ酸の反対の鏡像異性体が、実質的に鏡像異性体濃縮された形態で保持され、そして当該保持されたβ-アミノ酸からβ-ケト酸誘導体を分離することを含む。
【００２５】
[0025] 本発明の別の態様は、バリオボラックス属(Variovorax)、ノカルディア属(Nocardia)、コマモナス属(Comamonas)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、及びシュードモナス属(Pseudomonas)からなる群から選ばれる微生物由来の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼである。
【００２６】
[0026] 本發明の別の態様は、アルカリゲネス属(Alcaligenes)の微生物由来の精製された立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼである。
【００２７】
[0027] 本発明の別の態様は、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む細胞ホモジェネート由来の立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法が、当該細胞ホモジェネートを沈殿剤と接触して、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む沈殿物を産生することを含む。
【００２８】
[0028] 本発明の別の態様は、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法は以下のステップ：
(ａ) 疎水性相互作用物質上に当該立体特異的β-トランスアミナーゼを吸着し；そして
(ｂ) 溶出緩衝液を使用して当該疎水性相互作用物質から立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む。
【００２９】
[0029] 本発明の別の態様は、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法は、以下のステップ：
(ａ) サイズ排除物質上に当該立体特異的β-トランスアミナーゼを吸着し、そして
(ｂ) 溶出溶媒を使用して当該サイズ排除物質から当該立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む。
【００３０】
[0030] 本発明の別の態様は、β-トランスアミナーゼを発現する１以上の微生物について、微生物の個体数を増大させる方法であり、当該方法は、β-アミノ酸又はその塩を選択的窒素源として含むカルチャー培地中で当該微生物の個体数を増大させることを含む。
【００３１】
[0031] 本発明の別の態様は、バリオボラックス・パラドキサス(Variovorax paradoxus)を含む精製されたカルチャーであって、ここで当該バリオボラックス・パラドキサスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が配列番号１を含む、前記カルチャーである。
【００３２】
[0032] 本発明の別の態様は、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)を含む精製されたカルチャーであって、ここで当該ロドコッカス・オパクスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号２を含む、前記カルチャーである。
【００３３】
[0033] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製核酸、又はその相補体である。
【００３４】
[0034] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列精製核酸に、高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体である。
【００３５】
[0035] 本發明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
【００３６】
[0036] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片に高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
【００３７】
[0037] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製核酸、又はその相補体である。
【００３８】
[0038] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製された核酸に高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体である。
【００３９】
[0039] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
【００４０】
[0040] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片に高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
【００４１】
[0041] 本発明の別の態様は、核酸の検出方法であって以下の：
(Ａ) 第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体、或いは配列番号１の約１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体に少なくとも９７％の同一性を有する核酸を含み、
(Ｂ) 当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し；そして
(Ｃ) 当該第一核酸へのハイブリッド形成の存在を検出する
を含む方法である。
【００４２】
[0042] 本発明の別の態様は、核酸の検出方法であって以下の：
(Ａ) 第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体、或いは配列番号２の約１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体に少なくとも９７％の同一性を有する核酸を含み、
(Ｂ) 当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し；そして
(Ｃ) 当該第一核酸へのハイブリッド形成の存在を検出する
を含む方法である。
【００４３】
用語と定義
[0043] 以下は、本明細書中で互換的に使用される略語とその対応する意味のリストである：
ＣＶ ＝ カラム体積
ＧＣ／ＭＳ ＝ ガス・クロマトグラフィー・質量分析
ＧＣ-ＦＡＭＥ ＝ ガス・クロマトグラフィー・脂肪酸メチル・エステル
ＨＰＬＣ ＝ 高速液体クロマトグラフィー
Ｌ ＝ リットル
ＬＣ/ＭＳ ＝ 液体クロマトグラフィー・質量分析
ｍＢａｒ ＝ ミリバール
ｍｇ ＝ ミリグラム
ｍｌ又はｍＬ ＝ ミリリットル
ＭＷＣＯ ＝ 分画分子量
ＯＣ₆₀₀ ＝ 吸光単位における光学密度
ｒｐｍ ＝ 一分あたりの回転数
ＲＴ ＝ 室温
Ｕ ＝ ユニット
ｕｇ又はμｇ ＝ マイクログラム
ｕｌ又はμｌ ＝ マイクロリットル
【００４４】
[0044] 以下は、本明細書中で使用される種々のアミノ酸についての一文字表記のリストである：Ａ ＝ アラニン；Ｂ ＝ アスパラギン酸又はアスパラギン； Ｃ ＝ シトシン ； Ｄ ＝ アスバラギン酸； Ｅ ＝ グルタミン； Ｆ ＝ フェニルアラニン； Ｇ ＝ グリシン； Ｈ ＝ ヒスチジン； Ｉ ＝ イソロイシン ； Ｋ ＝ リジン； Ｌ ＝ ロイシン； Ｍ ＝ メチオニン； Ｎ ＝ アスパラギン ； Ｐ ＝ プロリン； Ｑ ＝ グルタミン ； Ｒ ＝ アルギニン； Ｓ ＝ セリン； Ｔ ＝ スレオニン ； Ｕ ＝ セレノシステイン； Ｖ ＝ バリン； Ｗ ＝ トリプトファン ； Ｙ ＝ チロシン ； Ｚ ＝ グルタメート又はグルタミン ； Ｘ ＝ いずれかのアミノ酸残基。
【００４５】
[0045] 「β-アミノ酸トランスアミナーゼ」「β-トランスアミナーゼ」、及び「β-アミノ・トランスフェラーゼ」という用語は、互換的に使用され、そしてβ-アミノ酸、又はその塩のアミノ基(＞Ｃ-ＮＨ₂)を、カルボニル基(＞Ｃ＝Ｏ)に可逆的に変換する性質を示す酵素を意味する。
【００４６】
[0046] 「ベータ・アミノ酸」という用語は、以下の：
(１) α-一置換β-アミノ酸、例えばβ-アミノ-α-ヒドロキシ酸；
(２) α,α-二置換β-アミノ酸；及び
(３) β-置換βアミノ酸、及びその塩
からなる群から選ばれる化合物を意味する。当該用語は、以下の式Ｉ：
【化６】

[式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ、ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、ハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され；
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³の全てがＨではなく；そして
Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む。
【００４７】
[0047] 「アミノ・アクセプター」という用語は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの影響下で記載されたアミンからのアミノ基を受容できるカルボニル化合物を意味する。
【００４８】
[0048] 「アミノ・ドナー」という用語は、同じβ-アミノ酸トランスアミナーゼの影響下で、アミノ基を記載されたケトン基に提供でき、それによりカルボニル種になる種々のアミノ化合物を指す。
【００４９】
[0049] 本明細書中で使用されるとき、置換基そのものとして又は置換基の一部としてのアルキル、アルケニル、及びアルキニニル基は、Ｃ₁-Ｃ₅₀、好ましくはＣ₁-Ｃ₂₀、そして最も好ましくはＣ₁-Ｃ₁₀である。
【００５０】
[0050] 「脂環式炭化水素」という用語は、３〜約１０個の炭素原子、そして好ましくは３〜約６個の炭素原子を有する環状の脂肪族ラジカルを意味する。適切な脂環式ラジカルの例は、シクロプロピル、シクロプロピルエニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２-シクロヘキセン-１-イル、シクロヘキセニルなどを含む。
【００５１】
[0051] 「アルキル」及び「低級アルキル」という用語は、１〜約１０個の炭素原子、及び１〜約６個の炭素原子をそれぞれ有する直鎖又は分枝鎖の炭化水素ラジカルを指す。そうしたアルキル・ラジカル及び低級アルキル・ラジカルの例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、オクチル、ノニル、デシルなどである。
【００５２】
[0052] 「アルケニル」又は「低級アルケニル」という用語は、少なくとも１の二重結合及び２〜約１０個の炭素原子、及び２〜約６個の炭素原子をそれぞれ含む不飽和非環式炭化水素ラジカルを指し、その炭素-炭素二重結合は、当該二重結合炭素上に置換された基に対して、アルケニル部分内においてシス又はトランス幾何配置を有しうる。そうした基の例は、エテニル、プロペニル、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなどである。
【００５３】
[0053] 「アルコキシ」などの用語は、直鎖又は分枝鎖の式-ＯＲ[式中、Ｒは上で定義されたアルキル基である]の酸素含有ラジカルを指す。含まれるアルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、n-ブトキシ、イソプロポキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、t-ブトキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシなどを含む。
【００５４】
[0054] 「アルキニル」又は「低級アルキニル」という用語は、１以上の三重結合及び２〜約１０個の炭素原子、及び２〜約６個の炭素原子をそれぞれ含む非環式の炭化水素ラジカルを指す。そうした基の例は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどを含む。
【００５５】
[0055] 「芳香族炭化水素ラジカル」という用語は、６〜約１４個の炭素原子、好ましくは６〜約１２個の炭素原子、より好ましくは６〜約１０個炭素原子を意味する。適切な芳香族炭化水素ラジカルの例は、フェニル、ナフチルなどを含む。
【００５６】
[0056] 本明細書中に使用される「アリール」という用語は、１以上の芳香環から構成される芳香環システムを指す。好ましいアリール基は、１、２、または３個の芳香環からなる基である。当該用語は、フェニル、ピリジル、ナフチル、チオフェン、フラン、ビフェニルなどの芳香族ラジカルを包含する。
【００５７】
[0057] 「アリールアルキル」又は「アラルキル」という用語は、式-Ｒ²-Ｒ¹[式中、Ｒ¹は本明細書中に定義されるアリールであり、そしてＲ²は、本明細書中に定義されるアルキレンである]のラジカルを指す。アラルキル基の例は、ベンジル、ピリジルメチル、ナフチルプロピル、フェネチルなどを含む。
【００５８】
[0058] 「カルボキシル誘導体」という用語は、カルボン酸、カルボキシル・エステル、及びカルボキシル・アミドを含む。
[0059] 本明細書中で使用される「シクロアルキル」という用語は、３〜約８個の炭素原子、及びより好ましくは４〜約６個の炭素原子を含む飽和又は部分的に不飽和の環状ラジカルを指す。そうしたシクロアルキルラジカルの例は、シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２-シクロヘキセン-１-イルなどを含む。
【００５９】
[0060] 「融合アリール」という用語は、１以上のフェニル環に融合される上で定義されたアリール基などの芳香環を指す。「融合アリール」置換基は、非限定的にペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、非対称インダセン(asymm-indacene)、対称インダセン(symm-indacene)、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナンスレン、アントラセン、フルオラセン(flouranthene)、アセフェナンスリレン(acephenanthrylene)、アセアンスリレン(aceanthrylene)、トリフェニレン、ピレン(pyrene)、クリセン(chrysene)、ナフタセン(Naphthacene)、プレジャデン(plejadene)、ピセン(picene)、ペリレン(perylene)、ペンタフェン(pentaphene)、ペンタセン(pentacene)、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ヘキサセン(hexacene)、ルビセン(rubicene)、コロネン(coronene)、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘップタセン(heptacene)、ピランスレン(ピランthrene)、オバレン(ovalene)、インデン(indane)、アセナフセン(acenaphthene)、コランスレン(cholanthrene)、アセアンスレン(aceanthrene)、アセフェナンスレン(acephenanthrene)、ビオラスレン(violanthrene)、イソビアランスレン(isovialanthrene)を含む。
【００６０】
[0061] 「融合単環複素環」という用語は、ベンゼンが融合される上で定義された単環複素環を指す。本明細書中で使用されるとき「融合単環複素環」置換基は、非限定的にベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンゾジオキソール、ベンゾチアゾール、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール・ピロリジン、インドリジン、イソインドール、３Ｈ-インドール、インドール、１Ｈ-インダゾール、プリン、４Ｈ-キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、１,８-ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、キノリン、プテリジニン(pteridine)、４aＨ-カルバゾール、カルバゾール、フェナンスリジン(phenanthridine)、アクリジン(acridine)、ペリミジン(perimidine)、１,７-フェナンスロリン(phenanthroline)、フェナジン(phenazine)、フェノメルカジン(phenomercazine)、フェナルサジン(phenarsazine)、イソチアゾール、フェノホスファジン(phenophosphazine)、フェノテルラジン(phenotellurazine)、フェノセレナジン(phenoselenazine)、フェノチアジン、イソキサゾール、フラザン(furazane)、フェノキサジン(phenoxazine)、イソクロマン、クロマン、ピロリジン、ピロリン(pyrroline)、イミダゾリジン、フェノメルクリン(phenomercurine)、イソアルシンドール(isoarsindole)、アルシンドール(arsindole)、イソアルシノリン(isoarsinoline)、アルシノリン(arsinoline)、アルサンスリジン(arsanthridine)、アルシンダルシン(arcidarsine)、アルサンスレン(arsanthrene)、イソホスフィンドール(isophosphindole)、ホスフィンドール(phosphindole)、イソホスフィノリン(isophosphinoline)、ホスフィノリン(phosphinoline)、ホスファンスレン(phosphanthrene)、セレナンスレン(selenanthrene)、ベンゾ [b] チオフェン、ナフトール[２,３-ｂ]チオフェン、チアンスレン(thianthrene)、フェノチアルシン(phenothiarsine)、イソベンゾフラン、２Ｈ-クロマン、キサンテン(xanthene)、フェノキサンチモニン(phenoxantimonine)、フェノキサシン(phenoxarsine)、フェノキサホスフィン(phenoxaphosphine)、フェノキサテルリン(phenoxatellurine)、フェノキサセレン(phenoxaselenin)、及びフェノキサチン( phenoxathiine)を含む。
【００６１】
[0062] 「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。
[0063] 「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味する。
[0064] 「ハロアルキル」という用語は、１以上の炭素原子上で、同じか又は異なる１以上のハロ基で置換される上で定義されたアルキル基を指す。ハロアルキル基の例は、トリフルオロメチル、ジクロロエチル、フルオロプロピルなどを含む。
[0065] 「ヘテロ原子」という用語は、炭素及び水素以外の原子を意味するべきである。
【００６２】
[0066] 「炭化水素」及び「炭化水素の(hydrocarbyl)」という用語は、本明細書中に使用されるとき、炭素元素及び水素元素からのみなる有機化合物又はラジカルを記載する。これらの部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリール部分を含む。これらの部分はまた、他の脂肪族又は環状炭化水素基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリール部分、例えばアルカリール(alkaryl)、アルケナリール(Alkenaryl)、及びアルキナリール(Alkynaryl)を含む。他に記載がない限り、これらの部分は好ましくは１〜２０個の炭素原子を含む。
【００６３】
[0067] 「ヘテロシクリル・ラジカル」という用語は、４〜約１０個の炭素原子、好ましくは約５個〜約６個の炭素原子(ここで１〜約３個の炭素原子は窒素、酸素、又は硫黄により置き換えられる)を有するヘテロシクリル炭化水素ラジカル、好ましくは芳香族ヘテロシクリル炭化水素を意味する。「ヘテロシクリル・ラジカル」という用語は、芳香族炭化水素ラジカルに融合されるか、又は別の複素環ラジカルに融合され得る。「複素環ラジカル」は、飽和、部分的に飽和、又は十分に不飽和でありうる。適切な例は、ピロリル、ピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、インドリル、チオフェニル、フラニル、テトラゾリル、２-ピロリニル、３-ピロリニル、ピロリジニル、１,３-ジオキソラニル、２-イミダゾリニル、イミダゾリジニル、２-ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリン、イソチアゾリン、１,２,３-オキサジアゾリン、１,２,３-トリアゾリン、１,３,４-チアジアゾリン、２Ｈ-ピラニル、４Ｈ-ピラニル、ピペリジニル、１,４-ジオキサニル、モルフォリニル、１,４-ジチアニル、チオモルフォリニル、ピラジニル、ピペラジニル、１,３,５-トリアジニル、１,３,５-トリチアニル、ベンゾ(b)チオフェニル、ベンズイミダゾリン、キノリニルなどを含む。
【００６４】
[0068] 「低級アルキル」という用語は、単独又は組合せにおいて、１〜約１０個、好ましくは１〜約８個の炭素原子、より好ましくは１〜約６個の炭素原子を含む非環式のアルキルラジカルを意味する。そうしたラジカルの例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソ-アミル、ヘキシル、オクチルなどを含む。
【００６５】
[0069] 「低級アルケニル」という用語は、少なくとも１の二重結合を含む不飽和非環式炭化水素ラジカルを指す。約２〜約１０個の炭素原子、好ましくは約２〜約８個の炭素原子、そしてより好ましくは２〜約６個の炭素原子を含む。適切なアルケニルラジカルの例は、プロピレニル、ブテン-１-イル、イソブテニル、ペンテン-１-イル、２-２-メチルブテン-１-イル、３-メチルブテン-１-イル、ヘキセン-１-イル、ヘプテン-１-イル、及びオクテン-１-イルなどを含む。
【００６６】
[0070] 本明細書中に使用される「低級アルキレン」又は「アルキレン」という用語は、１〜約６個の炭素原子の二価直鎖又は分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。
[0071] 「低級アルコキシ」という用語は、単独又は組合せにおいて、アルキル・エーテル・ラジカルであり、ここで当該アルキルという用語は上で定義される通りであり、そして最も好ましくは１〜約４個の炭素原子を含む。適切なアルキル・エーテル・ラジカルの例は、メトキシ、エトキシ、ｎ-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソ-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどを含む。
【００６７】
[0072] 「低級アルキニル」という用語は、１以上の３重結合を含む不飽和非環炭化水素ラジカルを指し、そうしたラジカルは約２〜約１０個の炭素原子を含み、好ましくは約２〜約８個の炭素原子を有し、そしてより好ましくは２〜約６個の炭素原子を有する。適切なアルキニル・ラジカルの例は、エチニル、プロピニル、ブチン-１-イル、ブチン-２-イル、ペンチン-１-イル、ペンチン-２-イル、３-メチルブチン-１-イル、へキシン-１-イル、へキシン-２-イル、へキシン-３-イル、３,３-ジメチルブチン-１-イル・ラジカルなどを含む。
【００６８】
[0073] 「単環複素環」又は「単環複素環の」という用語は、４〜約１２個の原子、そしてより好ましくは５〜約１０個の原子(ここで１〜３個の原子は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選ばれるヘテロ原子である。但し、２以上の異なるヘテロ原子が存在する場合、少なくとも１のヘテロ原子は、窒素でなければならない)からなる単環を指す。置換基は、非限定的にイミダゾール、フラン、ピリジン、オキサゾール、ピラン、トリアゾール、チオフェン、ピラゾール、チアゾール、チアジアゾール、ピラゾール、ピラジンピリミジン、ピリダジン、チオフェン、テルロフェン(tellurophene)、セレノフェン(selenophene)、及びピロールを含む。
【００６９】
[0074] 本明細書中に記載される「置換炭化水素」部分は、炭素以外の少なくとも１の原子で置換された炭化水素部分であり、炭素鎖原子が、窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素、硫黄、又はハロゲン原子で置換される部分を含む。これらの置換基は、ハロゲン、複素環、アルコキシ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、水酸基、保護水酸基、ケト、アシル、アシルオキシ、ニトロ、アミノ、アミド、ニトロ、シアノ、チオール、ケタール、アセタール、エステル、及びエーテルを含む。
【００７０】
[0075] 本発明中に示される化合物は、種々の異性体形態で存在し、そしてそうした異性体形態の全てが含まれることを意図する。互変異性体、並びにそうした異性体及び互変異性体の塩もまた含まれる。
【００７１】
[0076] 文書中に記載された化学反応は、本発明の化合物の製造に対する最も広い適用について一般的に開示される。時々、当該反応は、開示された範囲内に含まれる各化合物に対して記載されるように適用されないかもしれない。こうしたことが起こる化合物は、当業者により容易に認識されるであろう。そうした場合の全てにおいて、当業者に知られる慣用の改変、例えば妨害基の適切な保護、代わりの慣用試薬への変更、反応条件の通常の改変などによってうまく行われる反応、或いは本明細書中に開示されるかそうでなければ慣用である他の反応のいずれかは、本発明の対応する化合物の製造に適用できるであろう。全ての製造方法、全ての開始物質は知られているか、又は既知の開始物質から容易に作られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
[0086] その最も広い意味において、本発明は、アミノ・アクセプターの存在下において、β-アミノ酸トランスアミナーゼ(β-トランスアミナーゼ又はβ-アミノ・トランスフェラーゼ)を使用して、キラル・アミンの混合体を立体選択的に合成し、又は鏡像異性体濃縮することに関する。
【００７３】
[0087] 本発明は、新たに単離された微生物(例えば土壌由来及びコンポスト・サンプル由来)由来のβ-アミノ・トランスフェラーゼの驚くべき発見及び部分的な特徴づけに関する。これらの酵素は、鏡像異性的に純粋なβ-アミノ酸、特にＬ-β-フェニルアラニン及びＤ-β-フェニルアラニンの生合成に経済的に実行可能な経路を提供しうる。
【００７４】
[0088] β-アミノ・トランスフェラーゼ活性を有する微生物は、濃縮培養プロトコルを利用して単離された。当該プロトコルは、β-アミノ酸としてのみ供給される窒素を利用する能力に基づいて、環境集団由来の微生物を濃縮した。ＤＬ-β-フェニルアラニンは、唯一の窒素源として存在する場合、アミノ酸のベータ炭素に結合された窒素を利用できる微生物をうまく選別することをもたらした。選ばれた微生物は、純粋なカルチャーとして使用され、そしてβ-アミノ・トランスフェラーゼ活性について、全細胞触媒として、及び無細胞ホモジェネート調製品の両方として選別された。β-アミノ・トランスフェラーゼ活性を有する微生物は、３-ケト-３フェニルプロピオン酸とβ-フェニルアラニンとの間の可逆的アミノ基転移を触媒した。
【００７５】
[0089] １の酵素は、β-Ｄ-フェニルアラニンに１００％の選好性を示し、Ｌ-鏡像異性体に対して活性を有さない。当該酵素は、α-ケトグルタレートをアミノ・アクセプターとして好み、そしてリン酸ピリドキサールを触媒作用に必要とする。当該酵素は、Ｌ-アミノ酸又はα-アミノ酸に作用せず、そして驚くべきことに、３-ケト-３-フェニルプロピオン酸のβ-Ｄ-フェニルアラニンへのアミノ基転移において、Ｄ-グルタミン酸よりもＬ-グルタミン酸を、アミノ・ドナーとして好む。適切な条件下において、当該酵素は、β-アミノ酸、特にＤ-β-アミノ酸、そして好ましくはＤ-β-フェニルアラニンの鏡像異性選択的生合成のために使用されうる。
【００７６】
[0090] 第二のβ-アミノ・トランスフェラーゼはまた、上記と同じ条件下で単離され、そして反対の立体選択性を有することが示された。第二の酵素は、β-Ｌ-フェニルアラニンへの１００％の選好性を示し、Ｄ-鏡像異性体について活性を有さない。当該酵素は、ピルビン酸をアミノ・アクセプターとして好み、そして触媒作用にリン酸ピリドキサールを必要とする。適切な条件下で、当該酵素は、β-アミノ酸、特にＬ-β-アミノ酸、及び好ましくはＬ-β-フェニルアラニンの鏡像選択的生合成に使用されうる。
【００７７】
[0091] 本発明の１の態様は、β-アミノ酸、又はその塩の立体選択的合成方法であり、当該方法は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下で、アミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させて、アミノ・アクセプターからβ-アミノ酸鏡像異性体、又はその塩を形成することを含む。
【００７８】
[0092] 好ましくは、当該アミノ・アクセプターは、β-ケト酸である。
[0093] 好ましくは、当該アミノ・ドナーは、α-アミノ酸である。
[0094] 好ましくは、形成されたＤ-β-アミノ酸又はＬ-β-アミノ酸対それぞれの形成されたＬ-β-アミノ酸又はＤ-β-アミノ酸のモル比は、１：１を超える。より好ましくは、当該モル比は３：１を超える。さらに好ましくは当該モル比は好ましくは１０：１を超える。
【００７９】
[0095] 好ましくは、当該方法は、さらに当該β-アミノ酸を回収することをさらに含む。
[0096] 好ましくは、当該接触は、β-トランスアミナーゼを含む微生物の全細胞の存在下で行われる。
[0097] 好ましくは、当該接触は、β-トランスアミナーゼを含む微生物の膜透過細胞の存在下で行われる。
[0098] 好ましくは、β-トランスアミナーゼの無細胞調製品の存在下で行われる。
[0099] 好ましくは、当該β-トランスアミナーゼは、支持体上に固定される。
[0100] 好ましくは、当該接触は、水性条件下で行われる。
【００８０】
[0101] 好ましくは当該接触は、有機共溶媒の存在下で行われうる。より好ましくは、当該有機共溶媒は、アルコール、ケトン、エーテル、エステル、ニトリル、及び炭化水素からなる群から選ばれる。より好ましくは、当該有機共溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジエチル・エーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、メチル t-ブチル・エーテル、フタル酸ジオクチル、トルエン、ジアルキル・エーテル、ジフェニルエーテルからなる群から選ばれる。さらにより好ましくは、当該有機共溶媒は、０％〜１００％の間の量(ｖ/ｖ)で存在する。さらにより好ましくは、当該有機共溶媒は、０％〜約８０％の量で存在する。さらにより好ましくは、当該有機共溶媒は、約５％の量で存在する。より好ましくは、当該有機共溶媒は、水混和性である。より好ましくは、当該有機共溶媒は、水不混和性である。
【００８１】
[0102] 好ましくは、当該方法はさらに、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下において、アミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触することにより産生されたアミノ・ドナーの対応するケト形態を、β-トランスアミナーゼと反応しない化合物を産生するために適切な条件下で反応することを含む。より好ましくは、当該アミノ・ドナーのケト形態は、アルファ-ケト酸である。さらにより好ましくは、当該アミノ・ドナーは、グルタメートであり、そして当該アミノ・ドナーのケト形態は、α-ケト・グルタレートである。さらにより好ましくは当該アミノ・ドナーは、グルタメートであり、当該アミノ・ドナーのケト形態は、α-ケト・グルタレートであり、そして当該反応は、ａｓｐ-オキサロアセテート・トランスアミナーゼ及びオキサロアセテート・デカルボキシラーゼの存在下で行われる。より好ましくは、当該アミノ・ドナーのケト形態は、ピルビン酸である。さらにより好ましくは、当該アミノ・ドナーは、Ｌ-アラニンであり、当該アミノ・ドナーのケト形態は、ピルビン酸であり、そして当該反応は、ピルベート・デカルボキシラーゼの存在下で行われる。
【００８２】
[0103] 好ましくは、当該β-アミノ酸鏡像異性体は、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体である。より好ましくは、当該β-アミノ酸鏡像異性体は、Ｄ-β-アミノ酸及び当該トランスアミナーゼは、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼである。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、バリオボラックス、ノカルディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物由来である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノカルディア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、コマモナス・テリゲーナ(Comamonas terrigena)、シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)、コマモナス・アシドボランス(Coomamonas acidovorans)、及びロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)からなる群から選ばれる微生物由来である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼが、バリオボラックス、ノカルディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノカルディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、バリオボラックス、ノカルディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス 、及びロドコカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。
【００８３】
[0104] 好ましくは、当該β-アミノ酸鏡像異性体は、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体である。より好ましくは、Ｌ-β-アミノ酸は、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下で合成される。さらにより好ましくは、トランスアミナーゼは、アルカリゲネス属の微生物から由来される。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、アルカリゲネス属の微生物により産生される立体選択的のＬ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である。さらに好ましくは、当該トランスアミナーゼは、アルカリゲネス属の微生物により産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である。さらにより好ましくは、当該トランスアミナーゼは、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一である。
【００８４】
[0105] 好ましくは、当該β-アミノ酸鏡像異性体は、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下において合成されるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体であり、ここで当該トランスアミナーゼは、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と少なくとも９７％の同一性を有する微生物から由来される。
【００８５】
[0106] 好ましくは、当該β-アミノ酸鏡像異性体は、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下において合成されるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体であり、ここで当該トランスアミナーゼは、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と少なくとも９７％の同一性を有する微生物から由来される。
【００８６】
好ましくは、当該β-アミノ酸は、以下の式Ｉ：
【化７】

の化合物であり、そして当該アミノ・アクセプターは、以下の式ＩＩ：
【化８】

の化合物である。
式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルと置換される)で場合により置換され；
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は全てがＨではなく；そして
Ｒ⁴が、ヒドロキシ、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む。
【００８７】
[0107] より好ましくは、Ｍは、アルカリ金属、カチオン、及びＮＨ₄⁺からなる群から選ばれる。さらにより好ましくは、Ｍは、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、及びＮＨ₄⁺からなる群から選ばれる。
【００８８】
[0108] より好ましくは、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-5アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_6-12アリール、及びＣ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、ラジカルからなる群から選ばれ、ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、ハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで場合により置換される)で場合により置換される。
【００８９】
[0109] さらにより好ましくは、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_6-12アリール、及びＣ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、ラジカルからなる群から独立して選ばれ；ここで、当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)で場合により置換される。
【００９０】
[0110] さらにより好ましくは、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、及びＣ_2-8アルキニル、ラジカルからなる群から選ばれ；ここで、当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)により場合により置換される。
【００９１】
[0111] さらにより好ましくは、Ｒ²又はＲ³がＯＨであるが、両方がＯＨであることはない。
[0112] さらにより好ましくは、Ｒ²又はＲ³がＨであるが、両方がＨであることはない。
[0113] さらにより好ましくは、Ｒ²及びＲ³が両方ともＨである。
[0114] さらにより好ましくは、Ｒ¹は、Ｃ_6-12アリール及びＣ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル・ラジカル(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)からなる群から選ばれる。
[0115] さらにより好ましくは、Ｒ¹はフェニルである。
【００９２】
[0116] 本発明の別の態様は、β-アミノ酸、又はその塩の立体選択的合成方法であり、当該方法は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下でアミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させて、当該アミノ・アクセプターから立体選択的にβ-アミノ酸鏡像異性体、又はその塩を形成することを含む。
【００９３】
[0117] ここで、当該β-アミノ酸又はその塩は、以下の式ＩＩＩ：
【化９】

で表される化合物であり、そして当該アミノ・アクセプターは、以下の式ＩＶ：
【化１０】

で表される化合物である。
[0118] 式中、Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む。
【００９４】
[0119] 好ましくは、当該β-アミノ酸は、Ｄ-β-フェニルアラニン及びＬ-フェニルアラニンからなる群から選ばれる。
[0120] 好ましくは、当該アミノ・アクセプターは、β-ケト酸及びインサイチュにおいてβ-ケト酸に変換される化合物からなる群から選ばれる。
【００９５】
[0121] 好ましくは、当該アミノ・ドナーは：Ｄ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｄ,Ｌ-グルタミン酸、Ｄ-アスパラギン酸、Ｌ-アスパラギン酸、Ｄ,Ｌ-アスパラギン酸、Ｄ-アラニン、Ｌ-アラニン、及びＤ,Ｌ-アラニン、３-アミノアジピン酸、及び２-アミノアジピン酸からなる群から選ばれる。より好ましくは、当該アミノ・ドナーは： Ｄ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｄ,Ｌ-グルタミン酸、Ｄ-アスパラギン酸、Ｌ-アスパラギン酸、Ｄ,Ｌ-アスパラギン酸からなる群から選ばれる。
【００９６】
[0122] 本発明の別の態様は、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＬ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を、鏡像異性体濃縮する方法であり、当該方法は、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下において、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体をアミノ・アクセプターと接触して、少なくとも１部のＬ-β-アミノ酸鏡像異性体を、当該対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮された混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大することを含む。
【００９７】
[0123] 好ましくは、濃縮された混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、３：１より大きい。さらにより好ましくは、濃縮混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、１０：１を超える。
【００９８】
[0124] より好ましくは、濃縮混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、３：１を超える。さらにより好ましくは、濃縮混合体益虫におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、１０：１を超える。
【００９９】
[0125] 本発明の別の態様は、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体とその対応するＤ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性的に濃縮する方法であり、当該方法は、立体選択的Ｄ-β-アミナーゼの存在下において、当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体を、アミノ・アクセプターと接触して、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体の少なくとも１部を対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体においてＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大することを含む。
【０１００】
[0126] 好ましくは、濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、１：１より大きい。
[0127] より好ましくは、濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比は、３：１より大きい。さらにより好ましくは、当該濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸虚像異性体のモル比は、１０：１より大きい。
【０１０１】
[0128] 本発明の別の態様は、鏡像異性的に濃縮されたβ-アミノ酸又はその塩の製造方法であって、以下の：
(ｉ) 以下の式Ｉ：
【化１１】

[式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルから独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全てが、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで置換される)で場合により置換され；
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³の全てがＨであることはなく、そして
Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
の構造を有するラセミ体のβ-アミノ酸、又はその塩
(ｉｉ) アミノ・アクセプター、及び
(ｉｉｉ) 立体特異的β-アミノ酸トランスアミナーゼ
を、ラセミ体のβ-アミノ酸の１の鏡像異性体を対応するβ-ケト酸誘導体に変換するために適切な条件下で接触させて、それにより当該β-アミノ酸の反対の鏡像異性体を、実質的に鏡像異性的に濃縮された形態で保持し、そして
当該保持されたβアミノ酸からβ-ケト酸誘導体を分離する
ことを含む。
【０１０２】
[0129] 本発明の別の態様は、バリオボラックス、ノカルディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる群から選ばれる微生物由来の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼである。
[0130] 好ましくは、当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物由来である。
【０１０３】
[0131] より好ましくは、当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列に１５００ヌクレオチドにわたり少なくとも９７％の同一性を有する。さらにより好ましくは、当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサス由来であり、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は、配列番号１を含む。さらにより好ましくは、請求項８３に記載される当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサスから由来され、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号１からなる。
【０１０４】
[0132] より好ましくは、当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列に１５００ヌクレオチドに渡って少なくとも９７％の同一性を有する。さらにより好ましくは、当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、ロドコッカス・オパクス由来である。さらにより好ましくは、特許請求の範囲に記載される当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、ロドコッカス・オパクス由来であり、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号２を含む。さらにより好ましくは、当該精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、ロドコッカス・オパクス由来であり、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号２からなる。
【０１０５】
[0133] 本発明の別の態様は、アルカリゲネス属の微生物由来の精製された立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼである。
[0134] 好ましくは、当該精製された立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼは、アルカリゲネス・ユートロフス由来である。
【０１０６】
[0135] 本発明の別の態様は、立体選択的β-トランスフェラーゼを含む細胞ホモジェネートから立体選択的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法は、細胞ホモジェネートを沈殿剤と接触させて、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む沈殿を生成することを含む。
【０１０７】
[0136] 好ましくは、当該沈殿剤は、硫酸アンモニウムである。
[0137] 好ましくは、当該沈殿が、さらにクロマトグラフィーにより精製される。
[0138] より好ましくは、当該沈殿が、疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製される。さらにより好ましくは、当該疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチル・セファロースＦＦレジンで行われる。
【０１０８】
[0139] より好ましくは、当該沈殿は、さらにサイズ排除クロマトグラフィーにより生成される。さらにより好ましくは当該サイズ排除クロマトグラフィーは、ＴＳＫ Ｇ３００ＳＷレジンで行われる。
【０１０９】
[0140] より好ましくは、当該沈殿は、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。さらにより好ましくは、当該疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチルセファロースＦＦレジンで行われ、そして当該サイズ排除クロマトグラフィーは、ＴＳＫ Ｇ３００ ＳＷレジンで行われる。
【０１１０】
[0141] 好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、当該細胞ホモジェネートがバリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる群から選ばれる微生物から得られる方法によって行われる。
【０１１１】
[0142] より好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、当該細胞ホモジェネートがバリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ 亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物から得られる方法により製造される。さらにより好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、当該細胞ホモジェネートがバリオボラックス・パラドキサスから得られる方法により製造される。さらにより好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、バリオボラックス・パラドキサスにより産生され、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡは配列番号１を含む。さらにより好ましくは当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、バリオボラックスにより産生され、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１からなる。さらにより好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、当該細胞ホモジェネートがロドコッカス・オパクスから得られる方法により産生される。さらにより好ましくは、当該立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、ロドコッカス・オパクスにより産生され、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡは配列番号２を含む。さらにより好ましくは、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼは、ロドッコッカス・オパクスにより産生され、ここで当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡは配列番号２からなる。
【０１１２】
[0143] 好ましくは、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼは、上記細胞ホモジェネートをアルカリゲネス属の微生物から取得する前記方法により製造される。
[0144] より好ましくは、当該立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼは、上記微生物がアルカリゲネス・ユートロフスである前記方法により製造される。
[0145] 好ましくは、β-トランスアミナーゼは、前記方法により製造され、４５〜５５ｋＤａの分子量のサブユニットを有する。
[0146] 本発明の別の態様は、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法は、以下のステップ：
ａ) 立体特異的β-トランスアミナーゼを疎水性相互作用物質上に吸着させ、そして
ｂ) 溶出緩衝液を使用して疎水性相互作用物質から立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む。
【０１１３】
[0147] 本発明の別の態様は、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から、立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であり、当該方法は、以下のステップ：
(ａ) 立体特異的β-トランスアミナーゼをサイズ排除物質上に吸着し、そして
(ｂ) 溶出緩衝液を使用して当該サイズ排除物質から立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む。
【０１１４】
[0148] 本発明の別の態様は、β-トランスアミナーゼを発現する１以上の微生物について微生物の個体数を増大させる方法であり、当該方法は、β-アミノ酸、又はその塩を選択的窒素源として含むカルチャー培地中において、微生物の個体数を増大させることを含む。
【０１１５】
[0149] 好ましくは、当該β-トランスアミナーゼは、立体特異的β-トランスアミナーゼである。
[0150] より好ましくは、当該立体特異的β-トランスアミナーゼは、Ｄ-β-トランスアミナーゼである。
[0151] より好ましくは、当該立体特異的β-トランスアミナーゼは、Ｌ-β-トランスアミナーゼである。
[0152] 好ましくは、当該β-アミノ酸は、Ｄ-β-アミノ酸、Ｌ-β-アミノ酸、又はそれらの混合体からなる群から選ばれる。
[0153] より好ましくは、当該β-アミノ酸は、Ｄ-β-フェニルアラニン、及びＬ-β-フェニルアラニン、又はそれらの混合体からなる群から選ばれる。
【０１１６】
[0154] 好ましくは、当該カルチャー培地は、無機塩、炭素源、及び窒素源を含み、ここで当該β-アミノ酸又はその塩は、選択的濃縮に使用される窒素源である。
[0155] 好ましくは、当該カルチャー培地は、無機塩、炭素源、及び窒素源を含み、ここで当該β-アミノ酸又はその塩は、窒素源及び炭素源である。
[0156] 好ましくは、微生物の個体は、土壌から収集される。
[0157] 本発明の別の態様は、バリオボラックス・パラドキサスを含む精製されたカルチャーであり、ここで当該バリオボラックス・パラドキサスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号１を含む。
[0158] 本発明の別の態様は、ロドコッカス・オパクスを含む精製されたカルチャーであり、ここで当該ロドコッカス・オパクスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は配列番号２を含む。
【０１１７】
[0159] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を含む精製された核酸、又はその相補体である。
[0160] 好ましくは、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を含む精製された核酸のＲＮＡ相当物、又はその相補体を含む。
【０１１８】
[0161] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の精製された核酸に対して高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体である。
【０１１９】
[0162] 本発明の別の態様は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
[0163] 好ましくは、当該精製核酸は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片のＲＮＡ同等物、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
[0164] 本発明の別の態様は、高度に厳密な条件下で、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸に、高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有する核酸断片に特異的にハイブリッド形成する核酸である。
【０１２０】
[0165] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製核酸、又はその相補体である。
[0166] 好ましくは、当該精製核酸が、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製核酸のＲＮＡ相当物、又はその相補体を含む。
[0167] 本発明の別の態様は、高度に厳密な条件下、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製核酸に特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体である。
[0168] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものである。
【０１２１】
[0169] 好ましくは、当該精製核酸は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片のＲＮＡ相当物、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものを含む。
【０１２２】
[0170] 本発明の別の態様は、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片に、高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するものを含む。
【０１２３】
[0171] 本発明の別の態様は、核酸を検出する方法であって、以下の：
(Ａ) 第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで第一核酸が、配列番号１の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含むか、或いは配列番号１の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％の同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含み、
(Ｂ) 当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し；そして
(Ｃ) 当該第一核酸へのハイブリッド形成の存在を検出する
を含む、方法である。
【０１２４】
[0172] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0173] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも１５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0174] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも２００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0175] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも２５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0176] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号１の少なくとも３００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
【０１２５】
[0177] 本発明の別の態様は、核酸を検出する方法であって、以下の：
(Ａ) 第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで第一核酸が、配列番号２の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含むか、或いは配列番号２の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％の同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含み、
(Ｂ) 当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し；そして
(Ｃ) 当該第一核酸へのハイブリッド形成の存在を検出する
を含む、方法である。
【０１２６】
[0178] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0179] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも１５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0180] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも２００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0181] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも２５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
[0182] 好ましくは、当該第一核酸は、配列番号２の少なくとも３００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む。
【０１２７】
具体的実施態様
[0183] １. β-アミノ酸又はその塩の立体選択的合成方法であって、当該方法が、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下でアミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させて、当該アミノ・アクセプターからβ-アミノ酸鏡像異性体又はその塩を形成することを含む、前記合成方法。
[0184] ２. 前記アミノ・アクセプターがβ-ケト酸である、実施態様１に記載の方法。
[0185] ３. 前記アミノ・ドナーがα-アミノ酸である、実施態様１に記載の方法。
[0186] ４. 前記Ｄ-β-アミノ酸又はＬ-β-アミノ酸 対 対応するＬ-アミノ酸又はＤ-β-アミノ酸のモル比が、１：１を超える、実施態様１に記載の方法。
[0187] ５. 前記モル比が３：１を超える、実施態様４に記載の方法。
[0188] ６. 前記モル比が１０：１を超える、実施態様５に記載の方法。
[0189] ７. 前記β-アミノ酸を回収することをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
[0190] ８. 前記接触が、前記β-トランスアミナーゼを含む微生物の全細胞の存在下で行われる、実施態様１に記載の方法。
[0191] ９. 前記接触が、β-トランスアミナーゼを含む微生物の膜透過細胞の存在下において行われる、実施態様１に記載の方法。
[0192] １０. 前記接触が、β-トランスアミナーゼの無細胞調製品の存在下で行われる、実施態様１に記載の方法。
【０１２８】
[0193] １１. 前記β-トランスアミナーゼが、支持体上に固定される、実施態様１に記載の方法。
[0194] １２. 前記接触が、水性条件において行われる、実施態様１に記載の方法。
[0195] １３. 前記接触が、有機共溶媒の存在下で行われる、実施態様１に記載の方法。
[0196] １４. 前記有機共溶媒が、アルコール、ケトン、エーテル、エステル、ニトリル、及び炭化水素からなる群から選ばれる、実施態様１３に記載の方法。
[0197] １５. 前記有機共溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジエチル・エーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、メチル・ｔ-ブチル・エーテル、フタル酸ジオクチル、トルエン、ジアルキル・エーテル、及びジフェニル・エーテルからなる群から選ばれる、実施態様１３に記載の方法。
【０１２９】
[0198] １６. 前記有機共溶媒が、０％〜１００％(ｖ/ｖ)の量で存在する、実施態様１５に記載の方法。
[0199] １７. 前記有機共溶媒が、０％〜３０％(ｖ/ｖ)の量で存在する、実施太陽１６に記載の方法。
[0200] １８. 前記有機共溶媒が、約５％(ｖ/ｖ)の量で存在する、実施態様１７に記載の方法。
[0201] １９. 前記有機共溶媒が水混和性である、実施態様１に記載の方法。
[0202] ２０. 前記有機共溶媒が水不混和性である、実施態様１に記載の方法。
【０１３０】
[0203] ２１. β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下でアミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させることにより製造される当該アミノ・ドナーの対応するケト形態を、β-トランスアミナーゼと反応しない化合物を製造するために適した条件下で反応することをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
[0204] ２２. 当該アミノ・ドナーのケト形態がアルファ・ケト酸である、実施態様２１に記載の方法。
[0205] ２３. 前記アミノ・ドナーがグルタメートであり、そして当該アミノ・ドナーのケト形態がα-ケト・グルタレートである、実施態様２２に記載の方法。
[0206] ２４. 前記アミノ・ドナーがグルタメートであり、当該アミノ・ドナーのケト形態がα-ケト・グルタレートであり、そして前記反応がａｓｐ-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及びオキサロ酢酸デカルボキシラーゼの存在下で行われる、実施態様２３に記載の方法。
[0207] ２５. 前記アミノ・ドナーのケト形態が、ピルビン酸である、実施態様２１に記載の方法。
【０１３１】
[0208] ２６. 前記アミノ・ドナーがＬ-アラニンであり、当該アミノ・ドナーのケト形態がピルビン酸であり、そして前記反応が、ピルベート・デカルボキシラーゼの存在下で行われる、実施態様２５に記載の方法。
[0209] ２７. 前記β-アミノ酸鏡像異性体が、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体である、実施態様１に記載の方法。
[0210] ２８. 前記β-アミノ酸鏡像異性体が、Ｄ-β-アミノ酸であり、そして前記トランスアミナーゼが、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼである、実施態様２７に記載の方法。
[0211] ２９. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物に由来する、実施態様２８に記載の方法。
[0212] ３０. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物に由来する、実施態様２９に記載の方法。
【０１３２】
[0213] ３１. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である、実施態様２８に記載の方法。
[0214] ３２. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である、実施態様３１に記載の方法。
[0215] ３３. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる属から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に少なくとも３０％同一である、実施態様２８に記載の方法。
[0216] ３４. 前記トランスアミナーゼが、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物により産生される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、実施態様３３に記載の方法。
【０１３３】
[0217] ３５. 前記β-アミノ酸鏡像異性体が、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体である、実施態様１に記載の方法。
[0218] ３６. Ｌ-β-アミノ酸が立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下において合成される、実施態様３５に記載の方法。
[0219] ３７. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス属の微生物に由来する、実施態様３６に記載の方法。
[0220] ３８. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される、実施態様３７に記載の方法。
[0221] ３９. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス属の微生物により産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である、実施態様３６に記載の方法。
[0222] ４０. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼに実質的に同一である、実施態様３９に記載の方法。
【０１３４】
[0223] ４１. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス属の微生物により産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、実施様態３６に記載の方法。
[0224] ４２. 前記トランスアミナーゼが、アルカリゲネス・ユートロフスにより産生される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、実施態様４１に記載の方法。
[0225] ４３. 前記β-アミノ酸鏡像異性体が、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下において合成されるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体であり、ここで当該トランスアミナーゼが、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と１５００ヌクレオチドにわたり少なくとも９７％の同一性を有する微生物に由来する、実施態様１に記載の方法。
[0226] ４４. 前記β-アミノ酸鏡像異性体が、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下において合成されるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体であり、ここで当該トランスアミナーゼが、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と１５００ヌクレオチドにわたり少なくとも９７％の同一性を有する微生物に由来する、実施態様１に記載の方法。
[0227] ４５. 前記β-アミノ酸が、以下の式Ｉ：
【化１２】

で表される化合物であり、そして前記アミノ・アクセプターが以下の式ＩＩ：
【化１３】

[両式中、
Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全てが、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは場合により水素、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され；
但しＲ¹、Ｒ²、及びＲ³の全てが、Ｈであることはなく；そして
Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
で表される化合物である、実施態様１に記載の方法。
[0228] ４６. Ｍがアルカリ金属カチオン及びＮＨ₄⁺からなる群から選ばれる、実施態様４５に記載の方法。
[0229] ４７. ＭがＮａ⁺、Ｋ⁺、及びＮＨ₄⁺からなる群から選ばれる、実施態様４６に記載の方法。
[0230] ４８. Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³が、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_6-12アリール、及びＣ_6-12アリール-Ｃ_1-8 アルキル、ラジカルからなる群から選ばれ；
ここで当該ラジカルの全てが、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)で場合により置換される、
実施態様４５に記載の方法。
[0231] ４９. Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³が、水素、Ｃ_6-12アリール、及びＣ_6-12 アリール-Ｃ_1-8アルキル、ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで、当該ラジカルの全てが、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)で場合により置換される、実施態様４８に記載の方法。
[0232] ５０. Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、及びＣ_2-8アルキニル、ラジカルからなる群から選ばれ；
ここで、当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される)で場合により置換される、実施態様４８に記載の方法。
【０１３５】
[0233] ５１. Ｒ²又はＲ³がＯＨであるが、両方がＯＨであることはない、実施態様４８に記載の方法。
[0234] ５２. Ｒ²又はＲ³がＨであるが、両方がＨであることはない、実施態様４８に記載の方法。
[0235] ５３. Ｒ²及びＲ³が両方ともＨである、実施態様４８に記載の方法。
[0236] ５４. Ｒ¹がＣ_6-12アリール及びＣ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から選ばれ、これらが場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキル・ラジカルで置換される、実施態様５３に記載の方法。
[0237] ５５. Ｒ¹がフェニルである、実施態様５４に記載の方法。
【０１３６】
[0238] ５６. β-アミノ酸、その塩の立体選択的合成方法であって、当該方法がβ-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下でアミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触して、当該アミノ・アクセプターから立体選択的にβ-アミノ酸鏡像異性体又はその塩を形成することを含み、
ここで当該β-アミノ酸又はその塩が、以下の式ＩＩＩ：
【化１４】

で表される化合物であり、そして当該アミノ・アクセプターが以下の式ＩＶ：
【化１５】

[両式中、Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
の化合物である、前記方法。
[0239] ５７. 前記β-アミノ酸が、Ｄ-β-フェニルアラニン及びＬ-β-フェニルアラニンからなる群から選ばれる、実施態様５６に記載の方法。
[0240] ５８. 前記アミノ・アクセプターが、β-ケト酸及びインサイチュでβ-ケト酸に変換される化合物からなる群から選ばれる、実施態様５６に記載の方法。
[0241] ５９. 前記アミノ・ドナーが、以下の：
Ｄ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｄ,Ｌ-グルタミン酸、
Ｄ-アスパラギン酸、Ｌ-アスパラギン酸、Ｄ,Ｌ-アスパラギン酸、
Ｄ-アラニン、Ｌ-アラニン、及びＤ,Ｌ-アラニン、
３-アミノアジピン酸、及び
２-アミノアジピン酸
からなる群から選ばれる、実施態様５６に記載の方法。
[0242] ６０. 前記アミノ・ドナーが、以下の：
Ｄ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｄ,Ｌ-グルタミン酸、
Ｄ-アスパラギン酸、Ｌ-アスパラギン酸、及びＤ,Ｌ-アスパラギン酸
からなる群から選ばれる、実施態様５９に記載の方法。
【０１３７】
[0243] ６１. Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＬ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性的に濃縮する方法であって、当該方法が、当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体を、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下でアミノ・アクセプターと接触して、Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体の少なくとも一部を対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮された混合体において、当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大することを含む、前記方法。
[0244] ６２. 前記濃縮混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、１：１を超える、実施態様６１に記載の方法。
[0245] ６３. 前記濃縮混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、３：１を超える、実施態様６２に記載の方法。
[0246] ６４. 前記濃縮混合体におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、１０：１を超える、実施態様６３に記載の方法。
[0247] ６５. Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＤ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を立体異性的に濃縮する方法であって、当該方法が、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下で当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体をアミノ・アクセプターと接触させて、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体の少なくとも一部を対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体において、当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 当該Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大することを含む、前記方法。
【０１３８】
[0248] ６６. 前記濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、１：１を超える、実施態様６５に記載の方法。
[0249] ６７. 前記濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、３：１を超える、実施態様６６に記載の方法。
[0250] ６８. 前記濃縮混合体におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比が、１０：１を超える、実施態様６７に記載の方法。
【０１３９】
[0251] ６９. 鏡像異性的に濃縮されたβ-アミノ酸又はその塩を鏡像異性的に濃縮する方法であって、当該方法が、
ラセミ体のβ-アミノ酸の１の鏡像異性体をその対応するβ-ケト酸誘導体に変換し、それにより当該β-アミノ酸の反対の鏡像異性体が、鏡像異性的に濃縮された形態で実質的に保持される条件下で、
以下の式Ｉ：
【化１６】

[式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_2-8アルキニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは、場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され；
ただしＲ¹、Ｒ²、及びＲ³は、全てがＨであることはなく；そして
Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ-、及び-ＯＭ(ここでＭはカチオンである)を含む]
の構造を有するラセミ性β-アミノ酸又はその塩；
アミノ・アクセプター；及び
構造特異的β-アミノ酸トランスアミナーゼと接触させ、そして
当該保持されたβ-アミノ酸から当該β-ケト酸誘導体を分離することを含む、前記方法。
【０１４０】
[0252] ７０. バリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる群から選ばれる微生物に由来する精製された立体選択的β-トランスアミナーゼ。
[0253] ７１. バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物に由来する、実施態様７０に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0254] ７２. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は、配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列と１５００ヌクレオチドに渡って少なくとも９７％の同一性を有する、実施態様７１に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0255] ７３. バリオボラックス・パラドキサスに由来する、実施態様７１に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0256] ７４. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が配列番号１を含む、バリオボラックス・パラドキサスに由来する実施態様７３に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0257] ７５. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が配列番号１からなる、バリオボラックス・パラドキサスに由来する実施態様７３に記載の精製され立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
【０１４１】
[0258] ７６. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡの配列と１５００ヌクレオチドに渡って少なくとも９７％の同一性を有する、実施態様７１に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0259] ７７. ロドコッカス・オパクスに由来する実施態様７１に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0260] ７８. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号２を含む、ロドコッカス・オパクスに由来する、実施態様７７に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0261] ７９. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号２からなる、ロドコッカス・オパクスに由来する、実施態様７７に記載の精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0262] ８０. アルカリゲネス属の微生物に由来する、精製された立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼ。
【０１４２】
[0263] ８１. アルカリゲネス・ユートロフスに由来する、実施態様８０に記載の精製された立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼ。
[0264] ８２. 前記立体特異的β-トランスアミナーゼを含む細胞ホモジェネートから立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であって、当該方法が、当該細胞ホモジェネートを沈殿剤と接触させて、立体特異的β-トランスアミナーゼを含む沈殿を生成することを含む、前記方法。
[0265] ８３. 前記沈殿剤が、硫酸アンモニウムである、実施態様８２に記載の方法。
[0266] ８４. 前記沈殿が、クロマトグラフィーによりさらに精製される、実施態様８２に記載の方法。
【０１４３】
[0267] ８５. 前記沈殿が、疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製される、実施態様８２に記載の方法。
[0268] ８６. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ブチル・セファロースＦＦレジンで行われる、実施態様８５に記載の方法。
[0269] ８７. 前記沈殿が、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製される、実施態様８２に記載の方法。
[0270] ８８. 前記サイズ排除クロマトグラフィーが、ＴＳＫ Ｇ３００ＳＷレジンで行われる、実施態様９７に記載の方法。
[0271] ８９. 前記沈殿が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製される、実施態様８２に記載の方法。
【０１４４】
[0272] ９０. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ブチル・セファロースＦＦレジンで行われ、そして前記サイズ排除クロマトグラフィーが、ＴＳＫ Ｇ３００ＳＷレジンで行われる、実施態様８９に記載の方法。
【０１４５】
[0273] ９１. 前記細胞ホモジェネートが、バリオボラックス、ノルカディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる群から選ばれる微生物から得られる、実施態様８２に記載の方法により製造される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0274] ９２. 前記細胞ホモジェネートが、バリオボラックス・パラドキサス、バリオボラックス・パラドキサスＧＣ亜群Ａ、ノルカディア・アステロイデス、コマモナス・テリゲーナ、シュードモナス・メンドシナ、コマモナス・アシドボランス、及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる微生物から得られる、実施態様９１に記載の方法により製造される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0275] ９３. 前記細胞ホモジェネートが、バリオボラックス・パラドキサスから得られる、実施態様９２に記載の方法により製造される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0276] ９４. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１を含む、バリオボラックス・パラドキサスにより産生される実施態様９３に記載の立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0277] ９５. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１からなる、バリオボラックス・パラドキサスにより産生される実施態様９３に記載の立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
【０１４６】
[0278] ９６. 前記細胞ホモジェネートが、ロドコッカス・オパクスから得られる、実施態様９２に記載の方法により製造される立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0279] ９７. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号２を含む、ロドコッカス・オパクスにより産生される実施態様９６に記載の立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0280] ９８. 前記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号２からなる、ロドコッカス・オパクスにより産生される実施態様９６に記載の立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
[0281] ９９. 前記細胞ホモジェネートが、アルカリゲネス属の微生物から得られる、実施態様８２に記載の方法により製造される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼ。
[0282] １００. 前記微生物がアルカリゲネス・ユートロフスである、実施態様９９に記載の方法により製造される立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼ。
【０１４７】
[0283] １０１. ４５〜５５ｋＤａのサブユニット分子量を有する、実施態様８２の方法により製造されるβ-トランスアミナーゼ。
[0284] １０２. 立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から、立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であって、当該方法が以下のステップ：
疎水性相互作用物質上に立体特異的β-トランスアミナーゼを吸着させ、そして
溶出緩衝液を使用して、疎水性相互作用物質から当該立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む、前記方法。
[0285] １０３. 立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から、立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であって、当該方法が以下のステップ：
サイズ排除物質上に立体特異的β-トランスアミナーゼを吸着し、そして
溶出緩衝液を使用して、当該サイズ排除物質から当該立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む、前記方法。
[0286] １０４. β-トランスアミナーゼを発現する１以上の微生物について、微生物の個体数を増大させる方法であって、当該方法は、β-アミノ酸又はその塩を選択的窒素源として含むカルチャー培地中で微生物の個体数を増大させることを含む、前記方法。
[0287] １０５. 前記β-トランスアミナーゼが、立体特異的β-トランスアミナーゼである、実施態様１０４に記載の方法。
【０１４８】
[0288] １０６. 前記立体特異的β-トランスアミナーゼが、Ｄ-β-トランスアミナーゼである、実施態様１０５に記載の方法。
[0289] １０７. 前記立体特異的β-トランスアミナーゼが、Ｌ-β-トランスアミナーゼである、実施態様１０５に記載の方法。
[0290] １０８. 前記β-アミノ酸が、Ｄ-β-アミノ酸、Ｌ-β-アミノ酸、又はそれらの混合体からなる群から選ばれる、実施態様１０４に記載の方法。
[0291] １０９. 前記β-アミノ酸が、Ｄ-β-フェニルアラニン及びＬ-βフェニルアラニン、又はそれらの混合体からなる群から選ばれる、実施態様１０８に記載の方法。
【０１４９】
[0292] １１０. 前記カルチャー培地が、無機塩、炭素源、及び窒素源を含み、ここで前記β-アミノ酸又はその塩が、選択的濃縮に使用される窒素源である、実施態様１０４に記載の方法。
[0293] １１１. 前記カルチャー培地が、無機塩、炭素源、及び窒素源を含み、ここで前記β-アミノ酸又はその塩が、窒素源及び炭素源である、実施態様１０４に記載の方法。
[0294] １１２. 前記微生物の個体が、土壌から収集される、実施態様１０４に記載の方法。
[0295] １１３. バリオボラックス・パラドキサスを含む精製されたカルチャーであって、当該バリオボラックス・パラドキサスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号１を含む、前記カルチャー。
[0296] １１４. ロドコッカス・オパクスを含む精製されたカルチャーであって、当該ロドコッカス・オパクスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号２を含む、前記カルチャー。
[0297] １１５. 配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製された核酸、又はその相補体。
【０１５０】
[0298] １１６. 実施態様１１５のＲＮＡ相当物を含む、精製された核酸。
[0299] １１７. 実施態様１１５に記載の核酸に高度に厳密な条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸。
[0300] １１８. 配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するもの。
[0301] １１９.実施態様１１８のＲＮＡ相当物を含む精製された核酸。
[0302] １２０. 高度に厳密な条件下で、実施態様１１８に記載の核酸に特異的にハイブリッド形成する核酸。
【０１５１】
[0303] １２１. 配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製された核酸、又はその相補体。
[0304] １２２. 実施態様１２１に記載のＲＮＡ相当物を含む、精製された核酸。
[0305] １２３. 高度に厳密な条件下で、実施態様１２１に記載の核酸に特異的にハイブリッド形成する核酸。
[0306] １２４. 配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の断片を含む核酸断片、又はその相補体であって、３００〜１５００ヌクレオチド長を有するもの。
[0307] １２５. 実施態様１２４に記載のＲＮＡ相当物を含む、精製された核酸。
【０１５２】
[0308] １２６. 高度に厳密な条件下で、実施態様１２４に記載の核酸に特異的にハイブリッド形成する核酸。
[0309] １２７. 以下の：
第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで当該第一核酸が配列番号１の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含むか、或いは配列番号１の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含み、
当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し、そして
当該第一核酸に対するハイブリッド形成の存在を検出する
を含む、核酸の検出方法。
[0310] １２８. 前記第一核酸が、配列番号１の少なくとも１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１２７に記載の方法。
[0311] １２９. 前記第一核酸が、配列番号１の少なくとも１５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１２７に記載の方法。
【０１５３】
[0312] １３０. 前記第一核酸が、配列番号１の少なくとも２００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１２７に記載の方法。
[0313] １３１. 前記第一核酸が、配列番号１の少なくとも２５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１２７に記載の方法。
[0314] １３２. 前記第一核酸が、配列番号１の少なくとも３００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１２７に記載の方法。
[0315] １３３. 以下の：
第一核酸を、細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで当該第一核酸が配列番号２の少なくとも５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含むか、或いは配列番号２の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含み、
当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し、そして
当該第一核酸に対するハイブリッド形成の存在を検出する
を含む、核酸の検出方法。
[0316] １３４. 前記第一核酸が、配列番号２の少なくとも１００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１３３に記載の方法。
[0317] １３５. 前記第一核酸が、配列番号２の少なくとも１５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１３３に記載の方法。
[0318] １３６. 前記第一核酸が、配列番号２の少なくとも２００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１３３に記載の方法。
[0319] １３７. 前記第一核酸が、配列番号２の少なくとも２５０個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１３３に記載の方法。
[0320] １３８. 前記第一核酸が、配列番号２の少なくとも３００個のヌクレオチド、そのＲＮＡ相当物、又はそれらの全長相補体を含む、実施態様１３３に記載の方法。
【０１５４】
一般的な材料と方法
[0321] ラセミ体のβ-フェニルアラニンは、Aldrich Chemical Companyから購入した。ピルビン酸ナトリウム及びα-ケトグルタレートはSigma Chemical Company(St. Louis, MO)から購入した。鏡像異性的に純粋であるＬ-又は(Ｒ)-３-アミノフェニルプロピオン酸、Ｄ-又は(Ｓ)-３-アミノ-３-フェニルプロピオン酸、Ｄ-又は(Ｒ)-３-アミノ-５-フェニル-ペンタン酸、及びＬ-又は(Ｓ)-３-アミノ-５-フェニル-ペンタン酸は、PepTech Corporation (Cambridge, MA)から購入した。Ｄ-又は(Ｒ)-２フェニルグリシン及びＬ-又は（Ｓ）-２-フェニルグリシンをＳｉｇｍａから購入した。バクト・アガー及び乾燥培地をDifcoから購入した。タンパク質測定用のブラッドフォード試薬及びウシ血清アルブミン溶液をSigmaから購入した。他の全ての試薬は、分析品質であった。
[0322] ほかに記載がない限り、全てのパーツは重量により計量され、そして温度は摂氏(℃)である。
【０１５５】
微生物
[0323] 当該研究において特徴づけられる微生物は、以下に記載される選択的濃縮により環境サンプルから単離された。
【０１５６】
カルチャー培地
[0324] 濃縮培養をスレーターの濃縮培地(Slaterら、1979)で行った。当該培地は、１.５ｇ／ＬのＫ₂ＨＰＯ₄、０.５ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０.５ｇ／Ｌの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、０.２ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及びMilli-Q(商標)H₂O(Milli-Qは、Millipore Corporationの純水システムについての商標である)に溶解した１０.０ｍｌのトレース溶液、pH７.０で構成される。トレース溶液は、１２.０ｇ／ＬのＮａ₂ＥＤＴＡ-２Ｈ₂Ｏ、２.０ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１.０ｇ／ＬのＣａＣｌ₂、１０.０ｇ／ＬのＮａ₂ＳＯ₄、０.４ｇ／ＬのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.４ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、０.１ｇ／ＬのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０.１ｇ／ＬのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、及び０.５ｍｌ・Ｈ₂ＳＯ₄を含むＭｉｌｌｉ-Ｑ(商標)Ｈ₂Ｏで構成される。全ての炭素源及び窒素源が１ｇ/Ｌになるように０.２２μＭろ過されたストック溶液を加えた。固体培地は、同じ内容で２０ｇ/ＬのDifco Bacto Noble Agarを加えてなった。
【０１５７】
[0325] 酵素活性スクリーニングに使用されるカルチャーを、２ｇ/Ｌで加えられたＤ,Ｌ-β-フェニルアラニンを有するＭＳＢ培地(Stanierら、１９５７)中で成長させた。ＭＳＢ中で成長できない単離株を、２ｇ/ＬのＤＬ-β-フェニルアラニンを含む栄養倍地中で成長させた。ＭＳＢ培地は、４０ｍｌ/ｌ溶液Ａ、２０ｍｌ/ｌ溶液Ｂ、５ｍｌ/ｌ溶液Ｃを含むＭｉｌｌｉ-Ｑ(商標)Ｈ₂Ｏで構成された。培地のｐＨは、７.２であった。炭素源を、滅菌溶液から加えた。溶液Ａは、１４１.２ｇ／ＬのＮａ₂ＨＰＯ₄、及び１３６.０ｇ/ＬのＫＨ₂ＰＯ₄を含むＭｉｌｌｉＱ・Ｈ₂Ｏで構成された。溶液Ｂは、１０ｇ/Ｌのニトリロトリ酢酸、２９.３ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄-７Ｈ₂Ｏ、３.３３ｇ／ＬのＣａＣｌ₂-２Ｈ₂Ｏ、０.００９２５ｇ／Ｌ(ＮＨ₄)₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ、０.０９９ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５０ｍｌ/Ｌのメタル４４(Metals 44)溶液と数滴のＨ₂ＳＯ₄を含むＭｉｌｌｉ-Ｑ(商標)Ｈ₂Ｏで構成される。溶液Ｃは、６０ｇの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を含む０.３ＬのＭｉｌｌｉＱ・Ｈ₂Ｏで構成される。メタル４４溶液は、０.２５ｇのＥＤＴＡ、０.１０９５ｇのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.１５４ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０.５ｇのＦｅＳＯ₄-７Ｈ₂Ｏ、０.０３９２ｇのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０.０２４８ｇのＣｏ(ＮＯ₃)₂・６Ｈ₂Ｏ、０.０１７７ｇのＮａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ、２滴のＨ₂ＳＯ₄を含む１００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ・Ｈ₂Ｏで構成される。
【０１５８】
[0326] 栄養培地をディフコのバクト栄養ブロス（Difco Bacto Nutrient Broth）又はディフコのバクト栄養アガー（Difco Bacto Nutrient Agar）から、製造元により記載される通りに調製した。酵母-モルト培地を、液体培地用にディフコのバクトＹＭブロス（Difco Bacto YM Broth）から調製するか、又は固体培地用に２０ｇ/Lのディフコ・バクト・アガー（Difco Bacto Agar）で調製した。
【０１５９】
[0327] タンパク質精製研究用の細胞集団の製造において使用されるスケール・アップ条件は、種々の添加物を加えたＭＳＢ培地中におけるフラスコ振盪研究から決定された。最終的に、１０リットルの発酵についての条件は、３０℃で、ｐＨ７.０、４００ｒｐｍの攪拌であり、溶解された酸素は１００％に設定され、そして３０％超に維持され、５００ｍＢの圧力で、１〜２ｇ/Ｌの間にグルコースが制御され、そして典型的には１２５ｍｇ(Ｒ,Ｓ)-β-フェニルアラニンが発酵時間１０時間経過毎に加えられた。バッチ条件は、５.６５ｇ/ＬのＫ₂ＨＰＯ₄、５.４４ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、２ｇ／ＬのＤＬ-β-フェニルアラニン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｍＬのＵＣＯＮ・ＬＢ６２５の消泡剤を含む。１２１℃で滅菌後、３０分間冷却し、１０ｍｌのＳＲ-００５・１０％微量金属溶液、１０ｍｌのＳＲ-００１(４.０ｍｇ/ｍｌ)ＣａＣｌ₂溶液、１０ｍｌのＳＲ-００２(０.３ｇ/ｍｌ)ＭｇＳＯ₄溶液、及び１０ｇ/ＬのＳＲ-００８(５０％)グルコース溶液を加えた。ＳＲ-００５微量金属溶液は、０.５ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０.２ｇ／ＬのＨ₃ＢＯ₃、０.８ｇ／ＬのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０.７ｇ／ＬのＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、０.７ｇ／ＬのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０.４ｇ／ＬのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３７.８ｇ／ＬのＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、３.４ｍｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄を含む１Ｌの蒸留Ｈ₂Ｏで構成される。当該培地を９.５リットル含むタンクは、邪魔板のついた２.８ｌのファーンバッハ・フラスコ中で好気的に一晩増殖させた同様の培地の５００ｍｌの種培養を無菌的に移すことにより植菌された。
【０１６０】
分析方法
[0328] ブラッドフォード試薬を使用して、タンパク質の測定を行い、そしてウシ血清アルブミンタンパク質標準平均吸光度 対 濃度に基づいて評価された。吸光度の読み取りを、１０×４×４５ｍｍプラスチック製Sarstedtキュベットを使用して、Hewlett Packard 8453 分光光度計で行った。Sigmaにより提供される手順に正確に従った。
【０１６１】
[0329] 逆相ＨＰＬＣ分析を、ＶＹＤＡＣ ２１８ＴＰ Ｃ１８、４.６×１５０ｍｍ カラム(The Separations Group, Hesperia, CA) を使用して、Hewlett Packard 1100 HPLCシステム上で行った。基質及び生成物の分離を、０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含むＨＰＬＣ品質の１０％メタノール及び０.１％トリフルオロ酢酸を含む９０％ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏの定組成溶離を使用して行われた。４０％メタノール/０.１％トリフルオロ酢酸及び６０％ＭｉｌｌｉＱ Ｈ₂Ｏ/０.１％トリフルオロ酢酸への直線勾配を５分間続けた。４０％メタノール/０.１％ＴＦＡ及び６０％ＭｉｌｌｉＱＨ₂Ｏ/０.１％トリフルオロ酢酸の定組成溶離を１４分間続けた。β-フェニルアラニン及び３-ケト-３-フェニルプロピオン酸は、それぞれ４分及び７.５分であった。ＵＶ検出は、２５４ｎＭで行われた。
【０１６２】
[0330] アミノ酸鏡像異性体のキラル分析は、(Ｓ,Ｓ)ウェルク(Whelk)-Ｏ１,４.６×２５０ｍｍカラム(Retis, Morton Grove, IL)を使用して、Hewlett Packard 1100 HPLCシステム上で行われた。鏡像異性体の分離は、６０％イソプロピル・アルコール溶出を使用して、定組成溶離を達成した。第一に、アミノ酸を２.５２Ｍ・ＨＣｌを含む無水エタノールで完全に反応することによりエステル化した。エステル溶液を次に乾燥するまで濃縮し、そして１-ナフトイル・クロリドで誘導体化した。ナフトイル化Ｄ-及びＬ-フェニルアラニン・エチル・エステルの保持時間は、それぞれ１４.７分及び１６.７分であった。ＵＶ検出を２９０ｎＭで行った。
【０１６３】
[0331] キラル分析は、Hewlett Packard 1100 HPLCシステム上でEclipse XDB-C8 4.6×150 mmカラム(Agilent Technologies)を使用することにより行われた。サンプルを、マーフィー試薬(Ｎ-α(２,４-ジニトロ-５-フルオロフェニル)アラニンアミドを使用して誘導体化した。５０％〜１００％のメタノール勾配を使用して、ジアステレオマーを分離し、当該溶媒を０.１％トリフルオロ酢酸で酸性化した。検出を３３０ｎｍで行った。
【０１６４】
[0332] 質量及び構造の確認は、ＬＣ/ＭＳ及びＧＣ/ＭＳにより、標準技術を使用して達成した。分析サービスセンター、Pfizer Corporatonが当該分析を行った。
【０１６５】
β-トランスアミナーゼ・アミノ化活性アッセイ
[0333] Ｄ-β-フェニルアラニンの産生をもたらすアミノ化活性は、以下のアッセイ・システム：１００ｍＭリン酸カリウム、３-ケト-３-フェニルプロピオネート(濃度を変化させる)、２０ｍＭ・Ｌ-グルタミン酸、０.２ｍＭリン酸ピリドキサール、１００ｍＭ・Ｌ-アスバラギン酸、５０Ｕオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、４０〜５０Ｕグルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、１０ｍＭ・ＭｇＣｌ₂、ｐＨ８.０中に、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌのタンパク質を加えることによりアッセイした。当該アッセイは、３７℃で攪拌しながら実行した。あらかじめ決められた時間点において、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌの０.１Ｎ・ＨＣｌを加え、そして酸性化されたサンプルを微小遠心機において最高スピードで３分間遠心した。当該上清溶液をＨＰＬＣサンプル・バイアル中に移した。３-ケト-３-フェニルプロピオネートのβ-フェニルアラニンへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。３-ケト-３-フェニルプロピオネートを、Ｒｏｃｈｅから購入したブタ肝臓エステラーゼ(Chirazyme E-2)を使用して、ベンゾイル酢酸エチルから製造した。酵素が３-ケト-３-フェニルプロピオン酸をアミノ基転移することにより得られるβ-フェニルアラニンは、分離及び検出後にＨＰＬＣから回収された。回収された体積を乾燥するまで蒸発した。これらの回収された分画を、本物の試料と並んで質量分析にかけ、そしてキラルＨＰＬＣを使用するキラル分析用に誘導体化した。図２は、立体特異的Ｄ-β-アミノ・トランスフェラーゼの存在下で３-ケト-３-フェニルプロピオン酸及びグルタメートからＤ-β-フェニルアラニンを生物触媒的に合成するための反応スキームを示す。
【０１６６】
[0334] Ｌ-β-フェニルアラニン産生に対するアミノ化活性を、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌのタンパク質を以下のアッセイシステム：１００ｍＭリン酸カリウム、３-ケト-３-フェニルプロピオネート(濃度を変化させる)、２０ｍＭ・Ｌ-アラニン、０.２ｍＭリン酸ピリドキサール、５０Ｕピルベートデカルボキシラーゼ、ｐＨ８.０に加えることにより評価した。当該アッセイを３７℃で攪拌しながら実行した。あらかじめ決められた時間点において、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌの０.１Ｎ・ＨＣｌを加え、そして酸性化されたサンプルを、微小遠心において最大スピードで３分間遠心した。上清溶液をＨＰＬＣサンプルバイアル中に回収した。３-ケト-３-フェニルプロピオネートのβ-フェニルアラニンへの変換は、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。３-ケト-３-フェニルプロピオネートを、ロシュから購入したブタ肝臓エステラーゼ(Chirazyme E-2)を使用して定量した。図３は、立体特異的L-β-アミノ・トランスフェラーゼの存在下で３-ケト-３-フェニルプロピオン酸及びＬ-アラニンから、Ｌ-β-フェニルアラニン及びピルベートの生物触媒性合成についての反応スキームを示す。
【０１６７】
[0335] 図４及び６は、本物のＤＬ-β-フェニルアラニンから得た質量スペクトルデーターを示す。バリオボラックス・パラドキサス酵素を使用する酵素的アミノ基転移反応の分析からのＨＰＬＣ分画を、回収し、そして乾燥するまで蒸発した。図５及び７は、これらのサンプルから得られた質量スペクトルデーターを表す。新たに単離された酵素を使用して生物酵素的に製造されたβ-フェニルアラニンは、本物のβ-フェニルアラニンに構造的に同一であるということが当該データーから明らかである。
【０１６８】
β-トランスアミナーゼ測定活性アッセイ
[0336] β-トランスアミナーゼ検出活性は、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌタンパク質を、以下のアッセイシステム：１００ｍＭ・リン酸カリウム、２ｍｇ/ｍｌＤＬ-β-フェニルアラニン、１０ｍｇ/ｍｌα-ケトグルタレート、又はピルビン酸、０.１ｍＭ・リン酸ピリドキサール、ｐＨ８.０中に加えることにより評価された。当該アッセイは、３７℃で攪拌しながら実行した。前もって決められた時間点で、０.１ｍｌサンプルをとり、０.１Ｎ・ＨＣｌを加え、そして酸性化されたサンプルは、微小遠心において、最大のスピードで３分間遠心した・上清溶液をＨＰＬＣサンプル・バイアル中に移した。ＤＬ-β-フェニルアラニンの３-ケト-３-フェニルプロピオネートへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。
【０１６９】
核酸ハイブリッド形成
[0337] 本明細書中に使用されるとき、２個の分子が逆平行、二本鎖核酸構造を形成できるならば、２個の核酸分子は、特異的に互いにハイブリッド形成できると記載される。核酸分子は、完全な相補性を示す場合、他の核酸分子の「相補体」と記載される。本明細書中に使用されるとき、当該１の分子の全ヌクレオチドが、もう一方のヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すと記載される。２個の分子は、少なくとも慣用の「低い厳密度」条件下で、互いにアニールされた状態で残ることを許容するために十分な安定性で互いにハイブリッド形成できる場合、「最小の相補性」であると呼ばれる。同様に、当該分子は、それらが慣用の「高度に厳密な」条件下で互いにアニールされた状態で残ることを許容する十分な安定性で互いにハイブリッド形成できる場合、「相補的」であるといわれる。慣用の厳密条件は、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)、及びHaymesら、(Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985)により記載される。完全な相補性からの逸脱は、そうした逸脱が、当該分子が二本鎖構造を形成する可能性を完全に妨げない限りは、それゆえ許容される。
【０１７０】
[0338] ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切な厳密条件、例えば約４５℃にて６×クエン酸ナトリウム生理食塩水(ＳＳＣ)、続いて５０℃にて２×ＳＳＣでの洗浄は、当業者に周知であるか、又はCurrent Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見つけることができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃での約２×ＳＳＣのどちらかと言うと低い厳密度〜５０℃での０.２×ＳＳＣの高い厳密度から選ばれうる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２度での低い厳密度条件から約６５℃での高い厳密度条件まで増大されうる。温度と塩の両方が変えられてもよく、又は一方が変化する間、温度又は塩濃度のどちらかが一定に保たれることもある。対応する核酸の長さに依存して、低い、中間の、及び高度に厳密なＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成反応を促進する条件はまた、当該技術分野に周知である。
【０１７１】
実施例
[0339] 以下の実施例は、本発明をかなり詳細に記載するが、本発明はこれらの特異的な実施例に限定されないということは理解されるであろう。様々なほかの例は、本開示を読んだ後に、本発明の精神と範囲から逸脱することなく当業者に明らかであろう。こうした他の例の全ては、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるということが意図される。
【０１７２】
実施例１ カルチャーの増殖及び単離
[0340] Foristell, Missouriの２の位置からの環境サンプルを収集し、そして４℃で貯蔵した。１のサンプルを、鳥の檻又は小屋に近い領域、つまり高濃度の窒素に富む化合物に晒される領域から収集した。別のサンプルは、たい肥積みの近くの領域、つまり腐りかけの落ち葉、並びに他の腐りかけの有機物質に晒されている領域から収集した。５グラムの土壌サンプルを、２５０ｍｌの邪魔板付き振盪フラスコ中の５０ｍｌの１００ｍＭ・ＫＰＯ₄緩衝液ｐＨ７.０中に植菌した。好気的に２００ｒｐｍ、２８℃で１８時間振盪し、フラスコの中身を２〜３時間静置した。
【０１７３】
[0341] 静置された土壌混合液からの各上清１ｍｌを、２５０ｍｌの邪魔板付き振盪フラスコ中の２５ｍｌのスレーター濃縮培地中に植菌した。各土壌サンプルを６種の濃縮条件：１ｍｇ/ｍｌのＤＬ-β-フェニルアラニンを含む１ｍｇ/ｍｌのα-ケトグルタレート、１ｍｇ/ｍｌのＤＬ-β-フェニルアラニンを含む１ｍｇ/ｍｌピルビン酸ナトリウム、窒素源を加えない１ｍｇ/ｍｌのα-ケトグルタレート、窒素源を加えない１ｍｇ/ｍｌのピルビン酸ナトリウム、１ｍｇ/ｍｌのＤＬ-β-フェニルアラニン、又は添加なし中に植菌した。全てのフラスコを、好気的に２００ｒｐｍ、２８℃で６日間攪拌した。
【０１７４】
[0342] 各第一フラスコ(「１回目」)の１ｍｌを、２５ｍｌの同じ濃縮培地中に植菌した。これらのフラスコを、好気的に、２００ｒｐｍ、２８℃で４８時間振盪した。各第二フラスコ(「２回目」)の１ｍｌを２５ｍｌの同じ濃縮倍地中に植菌した。これらの「３回目」カルチャーを、好気的に２００ｒｐｍ、２８℃で４８時間振盪した。３回目の濃縮カルチャーの３回目を、連続的に１０倍希釈して、炭素又は窒素を加えないスレ-ター濃縮倍地中に１０^-8にした。各希釈液の１００μＬの量を、３回目のカルチャー液体培地と同じ組成の固体化したスレ-ター濃縮倍地上に、撒いた。これらのアガー・プレートをパラフィルム(商標)で密封して、２８℃でインキュベーションした。
【０１７５】
[0343] ３回目の濃縮から成長した個々の代表的なコロニーを、滅菌植菌耳を使用して拾い上げ、そして外見が細菌又は酵母様である場合は栄養アガープレート上に移し、或いは外見が真菌様であるならばＹＭアガー・プレート上に移した。拾い上げた各単離コロニーは、土壌サンプル起源、炭素及び窒素濃縮源、及び単離体が拾い上げられた順番に対応する名前を与えられた。プレートをパラフィルム(商標)で密封し、そして２８℃で一晩インキュベーションした。全てのコロニーを、同じ組成の栄養に富むアガープレート上に単離するために、ストリークした。単離されたコロニーを収集し、そして同じ培地組成の２ｍｌの液体カルチャーに植菌し、そして一晩２８℃で好気的に成長させた。全ての単離体を次に８０℃で２５％グリセロール・ストックとして貯蔵した。
【０１７６】
実施例２- トランスアミナーゼ活性についての微生物のスクリーニング
[0344] 環境分離株、並びに市販の微生物を、ＤＬ-β-フェニルアラニンに対するトランスアミナーゼ活性についてスクリーニングした。各生物の１の凍結グリセロール・バイアルを使用して、２ｇ/Ｌ・ＤＬ-β-フェニルアラニンを含む２５０ｍｌフラスコ中の２５ｍｌＭＳＢ液体培地に植菌するか、又は特定の株が最小培地中で低い成長度を示す場合、２ｇ/Ｌ・ＤＬ-β-フェニルアラニンを含む栄養ブロス中に植菌した。生物の増殖は、２８℃の好気的条件下で、１/１０フラスコ体積の下で獲得した。生物の増殖は、目で見て懸濁するまで、典型的には２４〜４８時間後までモニターした。
【０１７７】
[0345] カルチャーを２等分した。全細胞生物変換アッセイでは、カルチャーの半分を８０００×ｇ以下で１０分間４℃にて遠心することによりペレット化した。上清を捨て、そして細胞の塊を２５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８.０で２回洗浄した。洗浄された細胞を、次にトランスアミナーゼ生物変換アッセイ緩衝液中に、元のカルチャーの二倍の細胞濃度で懸濁した。トランスアミナーゼ・生物変換アッセイ緩衝液は、１００ｍＭリン酸カリウム、１０ｍｇ/ｍｌ・ＤＬ-β-フェニルアラニン、及び１０ｍｇ/ｍｌα-ケトグルタレート、ｐＨ８.０からなった。生物変換は、２８℃で、２００ｒｐｍの攪拌で４８時間実行した。４８時間の反応時間において、１ｍｌのサンプルをとり、そして細胞を遠心により取り除いた。上清溶液をＨＰＬＣサンプルバイアル中に回収した。ＤＬ-β-フェニルアラニンから３-ケト-３-フェニルプロピオネートへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。
【０１７８】
[0346] 粗製細胞ホモジェネートを微生物カルチャーの残りの半分から調製した。当該細胞をペレット化し、そして全細胞アッセイ方法と同じく１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で二回洗浄した。洗浄された細胞ペレットを、Ｆｒｅｎｃｈ圧力細胞破壊緩衝液中にペレット体積の３倍の体積で懸濁した。Ｆｒｅｎｃｈ圧力細胞破壊緩衝液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８.０、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニル・フルオリド(ＰＭＳＦ)、及び０.１ｍｇ/ｍｌデオキシリボヌクレアーゼを含むＭｉｌｌｉ-Ｑ・Ｈ₂Ｏからなった。全ての操作は、氷と接触させて行った。１５０００〜２００００ｐｓｉで、Ｆｒｅｎｃｈ圧力細胞を通すことにより、細胞を破裂させた。細胞破片を、エッペンドルフ微小遠心中で最高スピードで１５分間遠心することにより取り除いた。上清を新しいチューブに収集し、そして氷上においた。粗製細胞ホモジェネートのタンパク質濃度を、標準のブラッドフォードタンパク質アッセイ条件を使用して測定した。粗製細胞ホモジェネートのトランスアミナーゼ活性は、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌタンパク質を、以下のアッセイシステム：１００ｍＭリン酸カリウム、０.５ｍＭジチオスレイトール、２ｍｇ/ｍｌＤＬ-β-フェニルアラニン、１０ｍｇ/ｍｌα-ケトグルタレート、又はピルビン酸ナトリウム、０.１ｍＭ・リン酸ピリドキサール、ｐＨ８.０中に加えることにより、アッセイした。生物変換を、２８℃で４８時間２００ｒｐｍで攪拌して行った。４８時間の反応時間で、１ｍｌのサンプルをとり、そして細胞を遠心により取り除いた。上清溶液を、ＨＰＬＣサンプルバイアル中に回収した。ＤＬ-β-フェニルアラニンから３-ケト-３-フェニルプロピオネートへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。
【０１７９】
[0347] ＤＬ-β-フェニルアラニンを唯一の窒素源として含む倍地中での選択的濃縮は、５８の形態学的に異なる土壌分離株をもたらした。使用された選択的濃縮プロセスの性質のため、β-フェニルアラニン上での成長に責任を有する酵素メカニズムを決定することはできなかった。分離株を、全細胞アッセイ並びに粗製細胞ホモジェネート酵素アッセイを使用して、ＤＬ-β-フェニルアラニンに対する一般的なデアミナーゼ活性についてスクリーニングした。濃縮メカニズムに基づく可能な反応スキームを、図１に示す。粗製細胞ホモジェネートアッセイが、β-トランスアミナーゼ発現分離株の特異的な同定を標的とする一方で、デヒドロゲナーゼ及びライアーゼメカニズムの同定を標的としない。全細胞アッセイは、３種の潜在的なメカニズム全てを標的とした。
【０１８０】
[0348] 表１及び表２は、粗製細胞ホモジェネート及び全細胞デアミナーゼ活性からのデーターを示す。結果は、粗製ホモジェネートアッセイ(表１)については、ｍｇタンパク質あたりの３-ケト-３-フェニルプロピオン酸の量( Ａ₂₅₄でのピーク領域)として報告される。逆相ＨＰＬＣ分析の４８時間点から全細胞アッセイについては、Ａ₆₆₀あたりの３-ケト-３-フェニルプロピオン酸の量(Ａ２５４でのピーク領域)として報告される。
【０１８１】
【表１】

【０１８２】
【表２】

【０１８３】
[0349] 異なる分離株の活性は、粗製細胞ホモジェネートを酵素源として使用するとき明らかに異なる。しかしながら、多くの場合、酵素が、粗製細胞ホモジェネートに比べて、全細胞から調製される場合に、得られる結果の間で違いが示される。例えば分離株ｃｐ-ＰｙｒｂＰｈｅ-Ｉ６は、他の分離株と比較して、粗製細胞ホモジェネートとしてアッセイされる際、(Ｒ,Ｓ)-β-フェニルアラニンに対する最も高い活性を有した。当該分離株は、全体細胞アッセイでは、他の分離株に比較して、ＤＬ-β-フェニルアラニンに対して最も低いデアミナーゼ活性のうちの１つを有した。
【０１８４】
実施例３- ＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧ分析による微生物の同定
[0350] 精製された微生物の分類学的同定を、各微生物における脂肪酸のプロファイルを既知の微生物と比較すること(ＧＣ-ＦＡＭＥ)、並びに種々の異なる炭素源における増殖パターン(ＢＩＯＬＯＧ分析)により行った。行われた微生物同定は、ＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧ実験データーを、以下に記載されるように最新のデーターベースと比較することに基づく。未知微生物の分類学上の同定及び分類を容易にするＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧデータの使用が、比較された(Barnett, S. J.; Alami, Y.; Singleton, I. ; Ryder, M. H. Diversification of Pseudorncanas corrugata 2140 produces new phenotypes altered in GC- FAME、BIOLOG、and in vitro inhibition profiles and taxonomic identification. Can. J. Microbiol. (1999)、45 (4)、287-298)。
【０１８５】
[0351] ＢＩＯＬＯＧは、市販される微生物の同定のための自動化代謝特徴づけシステムである。当該システムは、種々の炭素源及び代謝指示薬を配置した９６ウェル・マイクロタイタープレートからなる。各ウェルにおけるテトラゾリウム色素は、微生物により炭素源が酸化されるときに暗紫色になる。当該試験は、植菌された各微生物の代謝の形跡を与える陽性(紫色)及び陰性ウェルの特徴的なパターンをもたらす。基質に対する活性のパターンは、既知の微生物の基質と比較され、既知のプロファイルとの適合に基づいて、同定を行った。幾つかのデーターベースは、比較を容易にするために使用され、例えば、好気性菌、嫌気性菌、グラム陽性菌及びグラム陰性菌、酵母、放線菌、及び乳酸菌を含む(www.biolog.com/bacteriaid.htm)。
【０１８６】
[0352] 脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィー(ＧＣ-ＦＡＭＥ)、又は脂肪酸分析は、工業及び臨床適用において重要な微生物の同定のための有効なツールである。ＧＣ-ＦＡＭＥは、細胞壁の固有の脂肪酸組成に基づいた、酵母、真菌、嫌気性菌、及び好気性菌、微生物、マイコバクテリウム、及び放線菌の同定方法である(www. microbeinotech.com)。(９〜２０個の炭素鎖長の)脂肪酸は、培養されたサンプルから抽出され、そして対応するメチルエステルへの変換される。当該メチル・エステルは、ガスクロマトグラフィーによる分離にかけられ、そして存在する脂肪酸のタイプ及び濃度が記録された。クロマトグラフィー・プロファイルは、パターン認識プログラムをとおして、２６００を超える種及び亜種から収集されたデーターを含む微生物データーベースと比較される。コンピューターが作成した報告は、脂肪酸プロファイル、最適のデーターベース適合のリストを、適合の信頼レベルを示す統計的確率の数値と共に含む。
【０１８７】
[0353] 未知の微生物を同定するために使用されるＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧは、数千の細菌種から収集されたデーターを表す。データーベース中の各細菌種は、平均化された数百のサンプルから集められたデーターを表して、各細菌種に固有の特徴セットを決定する。
【０１８８】
[0354] 類似及び距離係数は、データーベース中の仮想の「平均」生物への類似性及び距離を指す。データーベース中の平均生物は、類似係数１と距離係数０を有する。近種は、それぞれ類似係数１と距離係数０の付近であり、より近い種は、データーベース中の平均生物と一致する。よい適合は、０.５を超える類似係数を有し、そして７未満の距離係数を有する種である。
【０１８９】
[0355] 他の分離株に比べて、β-フェニルアラニンに対する最も高いβ-トランスアミナーゼ活性を示す１１の土壌分離株は、同定のために選ばれた。新たにストリークされた栄養アガープレートを、Microbe Inotech Laboratories, Inc, St. Louis, MO. にかけた。微生物同定を、最新のデーターのＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧ実験データーの比較に基づいて行った。表３は、Microbe Inotech Laboratories, Inc.から受けた結果を示す。分類にかけられた１１の株のうち、５の明らかに区別される属が存在し、そして６の異なる属及び種名が存在した。
【０１９０】
【表３】

【０１９１】
表４は、１１の土壌分離株のＧＣ-ＦＡＭＥ及びＢＩＯＬＯＧ分析により得られた結果を要約する。幾つかの分離株の同定は、ＢＩＯＬＯＧ分析によって決められなかった。
【０１９２】
【表４】

【０１９３】
実施例４- １６Ｓ ｒＲＮＡ配列による微生物の同定
[0356] リボゾーマルＤＮＡ配列は、２の精製された微生物の分類学的同定を容易にするために使用された (Kolbert, C. P. and D. H. Persing. 1999. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. C. Opinions in Microbiol. 2: 299-305)；Patel, J. B., D. G. B. Leonard, X. Pan, J. M. Musser, R. E. Bergman and I. Nachamkin. 2000. Sequence-Based Identification of Mycobacterium Species Using the MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification System. J. Clin. Micro. 38: 246-251)。２種の微生物の１６Ｓ-ｒＲＮＡ遺伝子(ｒＤＮＡ)の全長ＤＮＡ配列はまた、ＭＩＤＩ Ｌａｂｓ(Newark, DE)により決定され、そして全ての既知の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のデーターベースと比較された。
【０１９４】
[0357] ＣＣ-ＫＧｂＰｈｅ-１１４及びＣＰ-ＰｙｒｂＰｈｅ-Ｉ４と名付けられる２種の微生物をＭＩＤＩ Ｌａｂｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥに提出し、そして１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子(ｒＤＮＡ)の全長ＤＮＡ配列を決定した。１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子の配列は以下に示される(表５、６、及び７)。
【０１９５】
【表５】

【０１９６】
【表６】

【０１９７】
【表７】

【０１９８】
[0358] これらの二種の微生物は、既知の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列へのデーターベース適合により、バリオボラックス・パラドキサス[CC-KGbPhe-Ｉ14株](配列番号:1)及びロドコッカス・オパクス[CP-PyrbPhe-I4](配列番号２)と同定された。ＧＣ-ＦＡＭＥ分析が、後者の種[CP-PyrbPhe-I4]をコマモナス・アシドボランス(最新の細菌命名法[承認リスト、改変リスト]２００３年３月ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellculturen GmbH)において、デルフチア・アシドボランスとしても知られている)として同定し、そして同じ種についてのＢＩＯＬＯＧ分析が決定できなかったということに注意してください。
【０１９９】
実施例５-酵素精製
[0359] 多量のＤ-β-アミノ・トランスフェラーゼを、以下に記載される方法を使用して、バリオボラックス・パラドキサス(表８)として同定される微生物から製造した。同一の方法を使用して、アルカリゲネス・ユートロフスから多量のＬ-β-アミノ・トランスフェラーゼを精製した。立体特異的(Ｄ-又はＬ-β-アミノ・トランスフェラーゼ)、基質特異性(精製されたアミノ・ドナー及びアミノ・アクセプター)、及び必要なコファクターを、以下に概説される方法を使用して各酵素調製品について決定した。
【０２００】
【表８】

【０２０１】
[0360] １の１０Ｌの発酵器を使用して、タンパク質精製のための細胞集団を産生した。発酵後の細胞の分離から得られる細胞ペーストを、細胞ペースト体積の３倍のFrench圧力細胞破壊緩衝液中に懸濁した。細胞を組織ホモジェナイザーを使用して再懸濁した。細胞を次に１６０００psiにおいて微小流体機を２回通して破壊した。得られたホモジェネート中の細胞破片及び破壊されていない細胞を、８０００×ｇで２０分間遠心することにより取り除いた。細胞ホモジェネートからの上清を４℃で貯蔵した。
【０２０２】
[0361] 酵素精製における第一ステップとして、粗製細胞ホモジェネートの硫酸アンモニウム沈殿を使用した。４℃において、攪拌しながら硫酸アンモニウムを３０％に飽和になるまで加えた。当該３０％硫酸アンモニウム溶液を、さらに約１６時間攪拌させた。沈殿を４℃で、３時間１００００×ｇで遠心することにより取り除いた。当該３０％硫酸アンモニウム沈殿からの上清溶液を、４℃で回収し、そして貯蔵した。
【０２０３】
[0362] 次に当該トランスアミナーゼ活性を、３０％の硫酸アンモニウム((ＮＨ₄)₂ＳＯ₄)を含む(Sartobran P ０.８/０.２μｍろ過ユニットで)ろ過された１５００ｍｌの発酵抽出液から、部分的に精製した。当該抽出液３４０ｍｌを、１.２M硫酸アンモニウム、２５ｍM・Tris、pH８.１で平衡化された１７０ｍｌのベッド体積のブチル・セファロースFFカラム(３.２×１９.８ｃｍ)上にロードした。流速は５ｍｌ/分であり、そして、ロードした後に、４カラム分の体積(CV)の平衡化緩衝液で洗浄を行った。勾配溶出を、１０ＣＶで、１.２Ｍ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２５ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.１〜２５ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.１の勾配で行った。カラムクロマトグラフィーを、２５０ｍｌまでを含む最後のロード体積で合計４回繰返した。各１３ｍｌの９５個の分画を回収し(〜０.１ＣＶ)、そしてトランスアミナーゼ活性についてアッセイした。活性の２つのピークを、３５〜５５(ピークＡ)の分画間及び７５〜９５(ピークＢ)の分画間で検出した。全てのピークＡ分画を、単一ピークＡプール中に貯蔵し(６２０ｍｌ、０.５１ｍｇタンパク質/ｍｌ)、そしてピークＢ活性プールについても(６７０ｍｌ、０.２ｍｇタンパク質/ｍｌ)貯蔵した。各プールを、５０ｃｍ²１０Ｋ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬセルロース膜及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステムを使用し、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ９.５に対して、２０〜２５ｐｓｉで限外ろ過/ダイアフィルトレーションをして、もとのタンパク質の濃度の２倍にした。
【０２０４】
[0363] ブチル・セファロースＦＦカラムから得た１回ダイアフィルトレーションされた活性プールを、直接８０ｍｌのベッド体積のＱセファロースＨＰカラム(２.６×１.５ｃｍ)上にロードした。プールＡ活性のみを、ロード前に平衡緩衝液(２０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ９.５)で１：１希釈した。カラムを、２０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ９.５〜２０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ９.５の１０ＣＶ勾配で溶出した。９０個の８ｍｌ分画(０.１ＣＶ)を回収し、そしてトランスアミナーゼ活性についてアッセイした。プールＡ活性は、分画５５〜８５(１２０ｍｌ)で溶出した。プールＢ活性は、分画６５〜７５(６８ｍｌ)で溶出した。各Ｑカラム活性プールを、１/４プール体積に濃縮し、そして凍結した。
【０２０５】
[0364] ＱセファロースＨＰカラムからの各プールの活性は、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.０の移動層を使用して、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム(７.８ｍｍ×３０ｃｍ)を１ｍｌ/分で使用するサイズ排除ＨＰＬＣによりさらに精製された。各々１００μＬの複数の注入をクロマトグラフィーし、そして０.５ｍｌの分画を合計５又は１０回の実行から回収した。ＨＰＬＣ溶出液を各実行についての同じ分画中に収集することによって、全体のピークの回収を行い、そしてトランスアミナーゼ活性についてアッセイした。Ａ及びＢの両方の活性は、分画１９〜２１でおよそ５０Ｋ ＭＷで溶出した。
【０２０６】
実施例６- Ｄ-β-アミノ・トランスフェラーゼの基質特異性の測定
[0365] バリオボラックス・パラドキサス(ＣＣ-ＫＧｂＰｈｅ-Ｉ１４)から半精製されたβ-アミノ・トランスフェラーゼ酵素を、１００ｍＭリン酸カリウム、２ｍｇ/ｍｌＤＬ-β-フェニルアラニン、１０ｍｇ/ｍｌα-ケト-アクセプター、及び０.１ｍＭリン酸ピリドキサール、ｐＨ８.０からなるアッセイ中において、アミノ・ドナーとしてＤ-β-フェニルアラニンを使用してアッセイした。当該反応を、３７℃で１時間、穏和に攪拌して行った。１時間の反応時間において、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌの０.１Ｎ・ＨＣｌを加えることにより酸性化し、そして遠心した。上清溶液をＨＰＬＣサンプル・バイアル中に回収した。ＤＬ-β-フェニルアラニンから３-ケト-３-フェニルプロピオネートへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。以下のケト酸：
α-ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸、３-オキソアジピン酸、２-オキソアジピン酸、１,３-アセトンジカルボン酸、及び４-ケトピメリン酸を活性についてスクリーニングした。種々のケト・アクセプターを使用するＤ-β-フェニルアラニンから３-ケト-３-フェニルプロピオン酸への変換の相対割合は、α-ケトグルタレート、実験的に決定された好ましいアクセプターを使用した割合の百分率として報告する。相対割合を表９に示す。
【０２０７】
【表９】

【０２０８】
[0366] 次にバリオボラックス・パラドキサス由来の半精製β-アミノ・トランスフェラーゼ酵素の同じ調製品を、１００ｍＭリン酸カリウム、１０ｍｇ/ｍｌα-ケトグルタレート、２ｍｇ/ｍｌアミノ・ドナー、及び０.１ｍＭリン酸ピリドキサール、ｐＨ８.０からなるアッセイ中において、α-ケトグルタレートをケト・アクセプターとして使用して、アッセイした。当該反応を、３７℃で穏和に１時間攪拌して行った。１時間の反応時間で、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌの０.１Ｎ・ＨＣｌを加えて酸性化し、そして遠心した。上清溶液をＨＰＬＣサンプルバイアル中に収集した。アミノ酸の対応するケトンへの変換を、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。(アミノ・ドナーとしての)以下のアミノ酸：α-(Ｄ)-フェニルアラニン、α-(Ｌ)-フェニルアラニン、β-(Ｄ)-フェニルアラニン、β-(Ｌ)-フェニルアラニン、(Ｄ)-３-アミノ-５-フェニルペンタン酸、及び(Ｌ)-３-アミノ-５-フェニルペンタン酸を活性についてスクリーニングした。β-(Ｄ)-フェニルアミン及び(Ｄ)-３-アミノ-５-フェニルペンタン酸のみが、これらの条件下で酵素の基質であった。
【０２０９】
実施例７- L-β-アミノ・トランスフェラーゼ基質特異性の決定
[0367] アルカリゲネス・ユートロフス(ＣＰ-ＰｙｒｂＰｈｅ-I２)の粗製細胞ホモジェネート調製品を、１ｇ/ｌのＤ,Ｌ-β-フェニルアラニンを加えた栄養ブロス中で成長された細胞から作った。無細胞ホモジェネートを、基質特異性を決定するために設計されたアッセイにおいて使用した。当該アッセイは、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌタンパク質、１０ｍｇ/ｍｌケト受容体、１ｍｇ/ｍｌアミノドナー、０.１ｍＭリン酸ピリドキサール、及び１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８.０を含んだ。当該反応を、穏和に攪拌しながら１時間３７℃で行った。１時間の反応時間において、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌの０.１ＮＨＣｌを加えて酸性化し、そして遠心した。上清溶液をＨＰＬＣサンプル・バイアル中に回収した。アミノ酸の対応するケトンへの変換は、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。酵素活性を、１時間におけるアミノ・ドナーの変換割合として計測した。一連の反応において、酵素活性は、α-ケトグルタレート又はピルベートをケト・アクセプターとして使用し、そして(Ｄ)-又は(Ｌ)-β-フェニルアラニンをアミノ・ドナーとして使用して、リン酸ピリドキサールを含めて又は含めないで計測した。アルカリゲネス・ユートロフスからのＬ-β-アミノ・トランスフェラーゼは、リン酸ピリドキサールの必要性を示し、ピルビネートをケトアクセプターとしてのα-ケトグルタレートとして好み、そして(Ｄ)-エナンチオマーについて(Ｌ)-β-フェニルアラニンを使用する(表１０のデーターは、図８及び図９においてグラフで表される)。
【０２１０】
【表１０】

【０２１１】
[0368] 当該同一の粗製細胞ホモジェネートの分離アッセイにおいて、当該特定の酵素が、Ｌ-アラニンをアミノ・ドナーとして使用して３-ケト-３フェニルプロピオン酸からβ-フェニルアラニンを産生を触媒できるということを示した。当該アッセイは、０.１〜０.３ｍｇ/ｍｌタンパク質、１０ｍｇ/ｍｌケト・アクセプター、２００ｍＭアミノ・ドナー、０.１ｍＭリン酸ピリドキサール、及び１００ｍＭリン酸カリウムをｐＨ８.０で含んだ。平衡への到達からの逆反応を妨げるために、０.１ユニットのピルベートデカルボキシラーゼを含めた。当該反応を、３７℃で２４時間ゆっくり攪拌することで行った。２４時間の反応時間において、０.１ｍｌのサンプルをとり、０.１ｍｌ・０.１Ｎ・ＨＣｌを加えることで酸性化し、そして遠心した。上清溶液をＨＰＬＣサンプルバイアルに集めた。アミノ酸の対応するケトンへの変換は、逆相ＨＰＬＣを使用して定量した。スクリーニングされたアミノ・ドナーは、(Ｌ)-アラニン、(Ｄ)-アラニン、及びβ-アラニンであった。(Ｌ)アラニンのみが、β-フェニルアラニンの産生におけるアミノ・ドナーとして、酵素により利用された。
【０２１２】
実施例８- β-アミノ酸の立体特異的合成における基質特異性の測定
[0369] バリオボラックス・パラドキサス及びアルカリゲネス・ユートロフスから単離されたＤ-及びＬ-β-アミノ・トランスフェラーゼ酵素の基質特異性は、それぞれβ-アミノ酸の立体特異的合成において、(表１１から選ばれる)アミノ・アクセプターの存在下で種々のアミノ・ドナー(グルタミン酸、アスバラギン酸、及び/又はアラニン)を使用して試験され、(上記実施例８及び９に記載される方法を使用して)対応するアミノ酸産物を形成した。
【０２１３】
【表１１】

【０２１４】
実施例９- β-アミノ酸の鏡像異性体濃縮における基質特異性の測定
[0370] β-アミノ酸のラセミ混合体からのβ-アミノ酸の鏡像異性体濃縮を促進するためのＤ-及びＬ-β-アミノ・トランスフェラーゼ酵素の利用は、(表１２から選ばれる)アミノ・アクセプターの存在下で種々のアミノ・アクセプター(α-ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、及び/又はピルビン酸)を使用して試験されて、(上記実施例８及び９において記載される方法を使用して)対応するβ-アミノ酸産物を形成する。
【０２１５】
【表１２】

【０２１６】
実施例１０-バリオボラックス・パラドキサス・β-アミノ・トランスフェラーゼを使用した基質の分離
細胞ライセートの調製
培地調製
[0371] 栄養ブロス(ＮＢ)、基礎培地を、１リットルの脱イオン水あたり８グラムを溶解し、１００μＬのＵＣＯＮ ＬＢ６２５ポリアルキレン・グリコール消泡剤/リットルを加え、そして加熱滅菌することにより調製した。ストック溶液を、２０ｍｌの脱イオン水あたり１グラムのラセミ性β-フェニルアラニンを溶解し、その間、攪拌し、そして２ＮのＮａＯＨを加えてｐＨを約１０に維持することにより調製した。溶解後、ストック溶液のｐＨを２Ｎ・ＨＣｌを加えることにより８に減らし、そして０.２ミクロン上の０.８ミクロンフィルターを通すことによりフィルター滅菌した。次に室温に維持された滅菌栄養ブロスに、滅菌ろ液を１リットルあたり２〜３ｇのβフェニルアラニンの終濃度になるまで加えた。
【０２１７】
カルチャー増殖
[0372] バリオボラックス・パラドキサスを、β-フェニルアラニンを加えた栄養ブロス中で成長させた。典型的に、５００ｍｌのβ-フェニルアラニンを加えた栄養ブロスを、シリコーン・スポンジ・フォーム・クロージャー(silicone sponge foam closure)を取り付けた２.８ｌファーンバッハフラスコに加えた。カルチャーを植菌し、そして２００ｒｐｍ、５.０８センチ(２インチ)のストロークで、２６度にて十分に増殖するまで振盪した。
【０２１８】
カルチャーの回収
[0373] 細胞を約２４０００×ｇで１０分間遠心することにより回収した。上清をデカンタで取り除き、そして細胞ペレットはしっかりとした固体ではないので、残った透明の液体をピペットで取り除いた。次に大体元の体積と同じ１％ＮａＣｌ(ｗ/ｖ)を含むｐＨ７.０の５０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁することにより、細胞を洗浄した。遠心及び上清の除去を繰返した。得られた細胞ペレットを、次に約３５ｍｌの同じ緩衝液中に懸濁し、そして４３０００×ｇで１０分間遠心して、しっかりとした細胞ペレットをもたらした。上清をデカンタで取り除いた。再懸濁に使用された約５ｍｌの緩衝液を、細胞ペレットに加え、そして緩衝液及び細胞ペレットを激しくかき混ぜて細胞スラリーを作った。
【０２１９】
細胞破壊
[0374] ２００００ｐｓｉで行われるアベスチン装置(Avestin device)により、細胞スラリーを溶解させた。当該アベスチン装置にロードする前に、少量のＤＮＡｓｅＩを懸濁液に加えた。当該細胞スラリーを１回装置に通し、非定量的顕微鏡評価に基づいて、良好な溶解を達成した。
【０２２０】
無細胞ライセートの調製
[0375] 破壊された細胞スラリーを、４３０００×ｇで１０分間遠心した。透明な上清を取り、そして取っておき、そして残りのスラリーを再び遠心して、更に透明な上清を得た。両方の透明な上清を合わせて攪拌しながら、ｐＨを６.４から８.０へと２Ｎ・ＮａＯＨで調節した。ｐＨ調節上清をそのまま使用するか、又は２回まで凍結融解した後に使用した。
【０２２１】
反応緩衝液の調製
[0376] ０.３Ｍトリシン、１５ｍＭ・ＭｇＳＯ₄、淡黄色与えるために十分なリン酸ピリドキサール、及び０.３Ｍグルタメート(脱アミノ化反応用)、又は０.３Ｍの２-ケトグルタル酸一カリウム塩(合成反応用)からなる緩衝液を調製した。
【０２２２】
バリオボラックス・パラドキサスを用いた合成又は脱アミノ化反応
[0377] 緩衝液のある量を、２倍量のライセートと混合し、そして当該混合液を次に、１ｍｇ/ｍｌの濃度を与えるように前もって測られた基質に加えた。典型的に１ｍｌのスケールで２６℃にて、ゆっくり攪拌して反応を行った。
【０２２３】
反応サンプル・プロセッシング
[0378] １０μＬの２Ｎ・ＨＣｌを、プラスチック製のスクリューキャップのついたバイアルに加え、そして９０μｌのサンプルを次に加えた。混合液のｐＨを４以下にし、そして混合液を微小遠心機で最大スピードにて約２分間遠心して、沈殿物を取り除いた。
【０２２４】
[0379] サンプルを、マーフィー試薬、Ｎ-(２,４-ジニトロ-５-フルオロフェニル)-Ｌ-アラニンアミドを使用して誘導体化した。１０ｍｇ/ｍｌの当該試薬のアセトン溶液ストックを調製した。２０又は４０μＬのいずれかの生物変換サンプルを２０μＬの１.３Ｍ・ＫＨＣＯ₃に加えた。これに、８０μｌのストック試薬溶液を加え、当該バイアルをしっかり密封し、そして７０℃で１０分間熱した。必要に応じて、室温に冷却した後に、熱したサンプルを遠心して、固体を取り除いた。Eclipse SCB-C8カラム４.６×１５０ｍｍを使用して、５０％メタノールから１００％メタノールまでの水中のメタノール勾配で溶出して、上清を分析した。両方の溶媒を０.１％トリフルオロ酢酸で酸性化した。
【０２２５】
[0380] 分離実験では、消費されたピークの領域(ケト酸に変換された)は、変換が行われていないという仮定の元、未消費ピークの残りの領域と比較される。
【０２２６】
[0381] 合成実験では、β-ケト酸がβ-アミノ酸に変換される合成実験では、ピーク(単数又は複数)の領域は、β-フェニルアラニンについて得られた標準曲線と比較された。
【０２２７】
[0382] ベータ・アミノ酸の分離又は合成を計測する個々の実験は、以下に記載される。分離実験についての結果は、表１３に要約される。
【０２２８】
実験１
[0383] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２３時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの８２％が消費されていた。
【０２２９】
実験２
[0384] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、ｐ-メトキシ-β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２３時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの８０％が消費されていた。
実験３
[0385] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、ｍ-ニトロ-β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２３時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの９５％が消費されていた。
【０２３０】
実験４
[0386] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、ｐ-フルオロ-β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２３時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの８２％が消費されていた。
実験５
[0387] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、ｏ-フルオロ-β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと６７時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの９９％が消費されていた。
【０２３１】
実験6
[0388] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-４-メチルペンタン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと４８時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの６５％が消費されていた。
実験７
[0389] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-シクロへキシルプロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの９９％超が消費されていた。
【０２３２】
実験８
[0390] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-シクロプロピルプロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２２時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの９８％が消費されていた。
実験９
[0391] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと５時間インキュベーションし、その後、後に溶出するピークの９９％超が消費されていた。
【０２３３】
実験１０
[0392] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、ｐ-ニトロ-β-フェニルアラニンを、バリオボラックス・パラドキサス由来の硫酸ナトリウムで精製されたベータ-アミノ・トランスフェラーゼとインキュベーションした。３０分後、後に溶出するピークのおよそ９８％が消費され；１時間後、当該ピークは検出されなかった。１８時間後、先に溶出する立体異性体の濃度に検出できる変化は存在しなかった。
【０２３４】
実験１１
[0393] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、β-フェニルアラニンを、アルカリゲネス・ユートロフスからの細胞ライセートでインキュベーションした。５時間後、先に溶出するピークのおよそ９７％が消費される。１日後、先に溶出するピークは検出できず、そして後に溶出する立体異性体の濃度に検出できる変化はなかった。
実験１２
[0394] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-シクロへキシル・プロパン酸を、アルカリゲネス・ユートロフス由来の細胞ライセートとインキュベーションした。２２時間後、先に溶出するピークの約３７％が消費されていた。
【０２３５】
実験１３
[0395] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-シクロプロピルプロパン酸を、アルカリゲネス・ユートロフス由来の細胞ライセートとインキュベーションした。２２時間後、先に溶出するピークの約４２％が消費されていた。
実験１４
[0396] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(３-チエニル)プロパン酸を、アルカリゲネス・ユートロフス由来の細胞ライセートと２１時間インキュベーションした。その後、先に溶出するピークの約８２％が消費されていた。
【０２３６】
実験１５
[0397] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(２-フリル)プロパン酸を、アルカリゲネス・ユートロフス由来の細胞ライセートと２１時間インキュベーションした。その後、先に溶出するピークの約７２％が消費されていた。
【０２３７】
実験１６
[0398] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(２-ナフチル)プロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと５分間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークの５０％が消費されていた。
実験１７
[0399] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(２-ベンゾフリル))プロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと５時間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークの９８％が消費されていた。
【０２３８】
実験１８
[0400] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(３-ピリジル)プロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと５分間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークの９５％超が消費されていた。
実験１９
[0401] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノ-３-(４-フェノキシフェニル)プロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと５分間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークの５８％が消費されていた。
【０２３９】
実験２０
[0402] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、３-アミノヘキサン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと1時間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークの９９％超が消費されていた。
【０２４０】
実験２１
[0403] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、２-アミノシクロヘキサンカルボン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと１９時間インキュベーションした。その後、後に溶出するピーク(単数又は複数)の９９％超が消費されており、前に溶出する各ペアの２個のジアステレオ異性体のピークは残っていた。
【０２４１】
実験２２
[0404] 分離について上に記載されるプロトコルを使用して、２-アミノシクロペンタンカルボン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートと２４時間インキュベーションした。その後、１ペアのジアステレオマーのうちの先に溶出するピークの４５％超が消費され、そして他のペアのジアステレオマーのうちの先に溶出するピークの２０％が消費されていた。
【０２４２】
実験２３
[0405] 合成について上に記載されるプロトコルを使用して、o-フルオロ-フェニル-２-オキソプロパン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の硫酸ナトリウム精製されたβ-アミノ・トランスフェラーゼと３時間インキュベーションした。その後、後に溶出するピークのみが観測され、それはβ-フェニルアラニンを標準として使用しておよそ０.０２ｍｇ/ｍｌに相当した。
【０２４３】
実験２４
[0406] 合成について上に記載されるプロトコルを使用して、約５０ｍMの終濃度の３-オキソへキサン酸を、約６０ｍMグルタミン酸の存在下で、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセートとインキュベーションした。１９時間後、後の溶出ピークのみが観察され、それはβ-フェニルアラニンを標準として使用して、約１ｍｇ/ｍｌの３-アミノヘキサン酸に相当した。
【０２４４】
実験２５
[0407] 合成について上に記載されるプロトコルを使用して、約４５ｍMの終濃度の３-(２-フルオロベンゼン)ベータ-オキソプロパン酸を、約８４ｍMアラニンの存在下で、アルカリゲネス・ユートロフス由来の細胞ライセートとインキュベーションした。４７時間後、先の溶出ピーク 対 後の溶出ピークは、約２.５：１の割合で観測され、そしてベータ-フェニルアラニンを標準として使用して、約０.１ｍｇ/ｍｌの２-フルオロ-ベータ-フェニルアラニンに相当した。
【０２４５】
実験２６
[0408] 合成について上に記載されるプロトコルを使用して、０.２５５Ｍの３-アミノ-３-シクロプロピルプロピオン酸を、バリオボラックス・パラドキサス由来の細胞ライセート及び０.４５Mのアルファ-ケトグルタレート、ｐＨ８.１とインキュベーションした。１８.２時間後、先に溶出するピークの９９.５％を観察した。６.５ｍｌの生物変換における残りの立体異性体を、イオン交換クロマトグラフィーに吸着し、そして水酸化アンモニウムで溶出することによる単離は、８０ｍｇの単一(先に溶出する)立体異性体を、９５％超のキラル純度で与えた。
【表１３】

【０２４６】
参考文献
[0409] 本明細書中に引用される全ての参考文献、特許、又は出願は、その全てを援用される。
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【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】[0077] 図１は、生物体に使用され、β-アミノ酸を合成するための亢進された能力を有するトランスアミナーゼ、デヒドロゲナーゼ、及びアンモニア・リアーゼが関与するβ-フェニルアラニンの酵素的脱アミノ化についての３種の反応スキームを示す。これらの反応メカニズムを指針として使用して、濃縮による微生物の選別のための条件を開発した。濃縮は、βフェニルアラニンを液体培養液中の唯一の窒素源として使用することに基づき、これらの又は他の未知の酵素システムを有する微生物種が、当該システムを欠いている種を超えた成長により選択的に濃縮されるということを可能にする。
【図２】[0078] 図２は、立体特異的Ｄ-β-アミノ・トランスフェラーゼの存在下において、３-ケト-３-フェニルプロピオン酸及びグルタメートの生物触媒合成のための反応スキームを示す。 アスバラギン酸は、ａｓｐ-オキサロ酢酸トランスアミナーゼの存在下でα-ケトグルタレートをグルタメート及びオキサロアセテートに変換する共役反応におけるアミノ・ドナーとして使用される。オキサロアセテートは、オキサロアセテートデカルボキシラーゼの存在下でピルベート及びＣＯ₂に変換され、α-ケトグルタレートの増加を最小にし、そしてＤ-β-フェニルアラニンの増加を最大にする。
【図３】[0079] 図３は、立体異性Ｌ-β-アミノ・トランスフェラーゼの存在下における３-ケトー３-フェニルプロピオン酸及びＬ-アラニンからのＬ-β-フェニルアラニン及びピルベートの生物触媒合成の反応スキームを示す。ピルベートは、共役反応においてＣＯ₂及びアセトアルデヒドに変換されて、Ｌ-β-フェニルアラニンの蓄積を最大にする。
【図４】[0080] 図４は、質量分析により、Ｄ,Ｌ-β-フェニルアラニンの本物のサンプルから得られた断片スペクトルであり、１６６.２ダルトンの原子量を有する種が多く存在することを示す。
【図５】[0081] 図５は、質量分析により、酵素学的に製造されたβ-フェニルアラニンのサンプルから得られた断片スペクトルである。３-ケト-３-フェニルプロピオン酸、Ｌ-グルタメート、及びリン酸ピリドキサールは、当該反応が終了するまで、Ｄ-β-トランスアミナーゼ調製品と反応した。β-フェニルアラニンは、ＬＣ/ＭＳ分析用に、ＨＰＬＣに基づく分離からの溶出する物質を収集することにより、当該酵素反応から回収された。最も多い化学種は、１６６.２ダルトンの原子量を有する。
【図６】[0082] 図６は、質量分析により、ＤＬ-β-フェニルアラニンの本物サンプルから得られた断片スペクトルである。本物サンプルの理論上の質量は、ＤＬ-β-フェニルアラニンの理論上の質量と一致する。
【図７】[0083] 図７は、質量分析により、図５に記載されたＤ-β-フェニルアラニンの酵素的に産生されたサンプルからえられた断片スペクトルである。本物サンプルの理論上の質量は、ＤＬ-β-フェニルアラニンの理論上の質量に適合する。
【図８】[0084] 図８は、アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)から単離された(Ｒ)-β-フェニルアラニン特異的トランスアミナーゼの基質特異性を示す。粗製細胞ホモジェネートを、最少塩培養液(ＭＳＢ)中で成長させたアルカリゲネス・ユートロフス(株ＣＰ-ＰｙｒｂＰｈｅ-Ｉ２)細胞から調製した。ラセミ混合体Ｄ,Ｌ-β-フェニルアランから、Ｄ-又はＬ-β-フェニルアラニンを、対応するケトンに変換することは、種々の基質(ピルベート、ピルベート＋コファクター・リン酸ピリドキサール(ＰＬＰ)、αケト-グルタレート、α-ケト・グルタレート+リン酸ピリドキサール)の存在下で計測した。反応において消費されたＤ-β-フェニルアラニン(Ｓ-ｂ-Ｐｈｅ)又はＬ-β-フェニルアラニン(Ｒ-ｂ-Ｐｈｅ)の量を、１時間で計測した。Ｌ-β-フェニルアラニン(Ｒ-ｂ-Ｐｈｅ)の変換割合は、Ｄ-β-フェニルアラニン(Ｓ-ｂ-Ｐｈｅ)の変換割合より大きい。リン酸ピリドキサールは、この反応割合を高め、そしてピルベートは、アルファ・ケト・グルタレートに比較して好ましい基質である。
【図９】[0085] 図９は、アルカリゲネス・ユートロフスから単離された(Ｒ)-β-フェニルアラニン特異的トランスアミナーゼの基質特異性を示す。粗製細胞ホモジェネートを、栄養培養液(ＮＢ)にけるアルカリゲネス・ユートロフス(株ＣＰ-ＰｙｒｂＰｈｅ-Ｉ２)細胞から調製した。当該アッセイ条件は、図８の説明に記載される条件と同じである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-アミノ酸又はその塩の立体選択的合成方法であって、当該方法が、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下で、アミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させて、当該アミノ・アクセプターからβ-アミノ酸鏡像異性体又はその塩を形成することを含む、前記方法。
【請求項２】
β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下で、アミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させることにより産生される当該アミノ・ドナーの対応するケト形態を、当該β-トランスアミナーゼと反応しない化合物を産生するために適切な条件下で反応させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β-アミノ酸鏡像異性体が、Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体及びＬ-β-アミノ酸鏡像異性体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記β-アミノ酸が、以下の式Ｉ：
【化１】

で表される化合物であり、そして前記アミノ・アクセプターが、以下の式ＩＩ：
【化２】

[両式中、
Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキルラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらは場合により水素、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され；
但しＲ¹、Ｒ²、及びＲ³の全てが、Ｈであることはなく；そして
Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
β-アミノ酸又はその塩の立体選択的合成方法であって、当該方法は、β-アミノ酸トランスアミナーゼの存在下でアミノ・ドナーとアミノ・アクセプターを接触させて、当該アミノ・アクセプターからβ-アミノ酸鏡像異性体又はその塩を立体選択的に形成することを含み、
ここで当該β-アミノ酸又はその塩が、以下の式ＩＩＩ：
【化３】

で表される化合物であり、そして当該アミノ・アクセプターが、以下の式ＩＶ：
【化４】

[両式中、Ｒ⁴は、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
で表される化合物である、前記方法。
【請求項６】
Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＬ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性体濃縮する方法であって、当該方法が、立体選択的Ｌ-β-トランスアミナーゼの存在下で上記Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体をアミノ・アクセプターと接触させて、当該Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体の少なくとも一部を、対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体中におけるＤ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大させることを含み、当該モル比が１：１を超える、前記方法。
【請求項７】
Ｌ-β-アミノ酸鏡像異性体及びその対応するＤ-β-アミノ酸鏡像異性体を含む混合体を鏡像異性体濃縮する方法であって、当該方法が、立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼの存在下で上記Ｄ-β-アミノ酸鏡像異性体をアミノ・アクセプターと接触させて、当該Ｄ-βアミノ酸鏡像異性体の少なくとも一部を、対応するβ-ケト酸に変換し、それにより濃縮混合体中におけるＬ-β-アミノ酸鏡像異性体 対 Ｄ-アミノ酸鏡像異性体のモル比を増大させることを含み、当該モル比が１：１を超える、前記方法。
【請求項８】
鏡像異性体濃縮されたβ-アミノ酸又はその塩の製造方法であって、ラセミ性β-アミノ酸の鏡像異性体を、対応するβ-ケト酸誘導体１の鏡像異性体に変換するために適切な条件下で、
以下の：
(ｉ) 以下の式Ｉ：
【化５】

[式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、水素、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_2-8アルケニル、Ｃ_3-12シクロアルキル、Ｃ_6-12アリール、Ｃ_3-12ヘテロシクリル、Ｃ_6-12アリール-Ｃ_1-8アルキル、及びＣ_3-12ヘテロシクリル-Ｃ_1-8アルキル・ラジカルからなる群から独立して選ばれ；
ここで、当該ラジカルの全ては、水酸基、低級アルコキシ、低級アルキル、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、トリフルオロメチル、アミノ、アシルオキシ、フェニル、ベンジル、ナフチル、キノリン、イソキノリン(これらの基は場合によりハロゲン、ニトロ、チオ、低級アルコキシ、及び低級アルキルで場合により置換される)で場合により置換され、
但し、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は全てがＨであることはなく、そして
Ｒ⁴が、水酸基、Ｏ^-、及び-ＯＭ(基中、Ｍはカチオンである)を含む]
で表される構造を有するラセミ性β-アミノ酸又はその塩；
(ｉｉ) アミノ・アクセプター；及び
(ｉｉｉ) 立体特異的β-アミノ酸トランスアミナーゼ
を接触させ、それにより当該βアミノ酸の反対の鏡像異性体が、実質的に鏡像異性体濃縮形態で保持され、そして当該保持されたβ-アミノ酸からβ-ケト酸誘導体を分離することを含む、前記方法。
【請求項９】
立体特異的β-トランスアミナーゼを含む組成物から立体特異的β-トランスアミナーゼを精製する方法であって、当該方法が以下のステップ：
(ａ) 当該立体特異的β-トランスアミナーゼを疎水性相互作用物質及びサイズ排除物質からなる群から選ばれる物質溶に吸着し、そして
(ｂ) 溶出緩衝液を使用して、ステップ(ａ)の物質から立体特異的β-トランスアミナーゼを溶出する
を含む、前記方法。
【請求項１０】
β-トランスアミナーゼを発現する１以上の微生物から微生物の個体数を増大する方法であって、当該方法が、β-アミノ酸又はその塩を選択的窒素源として含むカルチャー培地中で、微生物の個体数を増大させることを含む、前記方法。
【請求項１１】
バリオボラックス・パラドキサス及びロドコッカス・オパクスからなる群から選ばれる精製されたカルチャーであって、
ここで当該バリオボラックス・パラドキサスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号１を含み、そして
当該ロドコッカス・オパクスの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列が、配列番号２を含む、前記カルチャー。
【請求項１２】
核酸の検出方法であって、以下の：
(ａ) 第一核酸を細胞から得られるか又は細胞に由来する第二核酸とインキュベーションし、ここで当該第一核酸が以下の：
配列番号１の少なくとも５０個のヌクレオチド、配列番号１の少なくとも５０個のヌクレオチドのＲＮＡ相当物、それらの全長相補体
配列番号１の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％の同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、それらの全長相補体、
配列番号２の少なくとも５０個のヌクレオチド、配列番号２の少なくとも５０個のヌクレオチドのＲＮＡ相当物、それらの全長相補体、
配列番号２の約１００個のヌクレオチドに少なくとも９７％の同一性を有する核酸、そのＲＮＡ相当物、及びそれらの全長相補体、
からなる群から選ばれ、
(ｂ) 当該第一核酸と当該第二核酸との間のハイブリッド形成を許容し；そして
(ｃ) 当該第一核酸へのハイブリッド形成の存在を検出する
を含む、前記方法。
【請求項１３】
バリオボラックス、ノカルディア、コマモナス、ロドコッカス、及びシュードモナスからなる群から選ばれる微生物に由来する精製された立体選択的Ｄ-β-トランスアミナーゼ。
【請求項１４】
配列番号１に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製された核酸、又はその相補体。
【請求項１５】
配列番号２に記載される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含む精製された核酸、又はその相補体。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００７−５２６７５１（Ｐ２００７−５２６７５１Ａ）
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８３９３（Ｐ２００６−５１８３９３）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２１８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６３３
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（３０３０５０９６４）ファルマシア　コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】