「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）を阻害する方法
【課題】固形腫瘍、白血病、変性疾患、免疫抑制疾患から成る群から選択される疾患の予防または治療に使用される薬物を提供する。
【解決手段】黒色腫阻害活性物質（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｌｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＭＩＡ）の活性を阻害するペプチド、抗体（抗体Ｎｏ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗体Ｎｏ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗体Ｎｏ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗体Ｎｏ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））から成る群から選択される少なくとも１種）および抗体フラグメント。
【解決手段】黒色腫阻害活性物質（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｌｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＭＩＡ）の活性を阻害するペプチド、抗体（抗体Ｎｏ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗体Ｎｏ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗体Ｎｏ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗体Ｎｏ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））から成る群から選択される少なくとも１種）および抗体フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）の活性を阻害するペプチドおよび抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫阻害活性物質（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｌｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＭＩＡ）ポリペプチドは１９８９年に黒色腫腫瘍細胞の成長を阻害する因子として発見された。黒色腫阻害活性物質（ＭＩＡ）タンパク質は、ヒト黒色腫細胞株ＨＴＺ−１９の組織培養上清から精製された成長阻害活性物質の中に見出された（Ｂｏｇｄａｈｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９８９； ４９： ５３５８−５３６３）。ＭＩＡの抗増殖作用はまた、他の腫瘍細胞および末梢血単核球においても実証された（Ｊａｃｈｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ， ４１： １１５）。
【０００３】
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験と、同様に免疫組織化学法が、ＭＩＡを骨格系の成長域内の発生胚に局在し、またＭＩＡは軟骨細胞の周辺で発現し、分泌され、蓄積する。
【０００４】
発生中のマウスでは、発現は骨格系の形成と相関し、生後に次第に消失し、例外として乳腺系の成熟中に再び発現する。
【０００５】
しかし、腫瘍の場合には、ＭＩＡは調べた悪性黒色腫のすべてによって発現し血清中に分泌されることが見出されたが、基底細胞がんおよび扁平上皮細胞がんを含む他の皮膚腫瘍や、または正常メラニン細胞およびケラチン生成細胞では見られなかった。
【０００６】
「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）は１３１アミノ酸前駆体分子として翻訳され、分泌シグナルの切断後、成熟した１０７アミノ酸タンパク質へ加工される。ＭＩＡは、転移性黒色腫ステージＩＩＩおよびＩＶを有する患者において、臨床的に有用なパラメータを提供する（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｈａｕｔａｒｚｔ. １９９８； ４９： ７６２−７６９； Ｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ.， Ｏｎｃｏｌ.Ｒｅｓ. １９９９； １１： ５５−６１； Ｄｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.， Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ. ９９９； １７： １８９１−１８９６）。ＭＩＡは黒色腫細胞株の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することによって抗腫瘍活性を導くと説明された（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９４； ５４： ５６９５−５７０１； Ｂｏｇｄａｈｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.１９８９； ４９： ５３５８−５３６３）。しかし、他の研究は、腫瘍抑制因子と一致しない発現パターンを明らかにしている。野生型ＭＩＡ タンパク質遺伝子の発現は正常皮膚およびメラニン細胞では検出されなかったが、メラニン細胞腫瘍の進行と関連していた（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９５； ５５： ６２３７−６２４３）。より近年では、ＭＩＡ タンパク質 は黒色腫細胞のフィブロネクチンおよびラミニンへの接着を特異的に阻害し、それによってこれらの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分へのインテグリンの結合部位をマスキングしてｉｎ ｖｉｖｏの浸潤および転移を促進することが示唆された（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ. １９９９； １８７： ４４６−４５４； Ｇｕｂａ ｅｔ ａｌ.， Ｂｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ２０００； ８３： １２１６−１２２２）。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏの成長阻害活性は、そのタンパク質が細胞株の組織培養シャーレ表面へのｉｎ ｖｉｔｒｏの接着に干渉する能力を反映する（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９４； ５４： ５６９５−５７０１）。
【０００７】
Ｗｅｉｌｂａｃｈ ｅｔ ａｌ. （１９９０ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５０； ６９８１−８６）はさらに、ＭＩＡがＳ期を延長することおよび細胞をＧ２コンパートメントで停止させることによって細胞増殖を阻害することを実証した。
【０００８】
ヒト ｒＭＩＡは、ＩＬ−２−またはＰＨＡ−誘導性末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）増殖を用量依存的に阻害する。さらに、自家性または同種異系ＬＡＫ細胞毒性はＭＩＡによって阻害されている（Ｊａｃｈｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ， ４１： １１５）.
【０００９】
Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ. （１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５４； ５６９５−５７０１） は、ＭＩＡが悪性黒色腫細胞に対し強力な腫瘍細胞成長阻害因子として作用することを確認し、さらにこの観察を他の神経外胚葉性腫瘍に拡張し、ＭＩＡは未来の抗がん治療物質として魅力的でありうると結論した。
【００１０】
ＭＩＡ発現の黒色腫進行との臨床的相関はＢｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.（１９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５７； ３１４９−５３； １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９； ２６９１−３）によって発見され、ＭＩＡ濃度の上昇が黒色腫ステージＩおよびＩＩの１３−２３％に、しかし疾患ステージＩＩＩまたはステージＩＶの１００％に示された。
【００１１】
Ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５５； ６２３７−４３）は、非転移性細胞株におけるＭＩＡｍＲＮＡ発現、および黒色腫転移病変における色素沈着とＭＩＡｍＲＮＡ発現の逆相関を見出した。
【００１２】
溶液中の 組み換えヒト ＭＩＡの３次元構造が近年、多次元ＮＭＲ分光法によって決定され、ＭＩＡはＳＨ３領域様折りたたみを取ることが知られる最初の細胞外タンパク質であることが明らかになった。これらの研究はまた、ＭＩＡの結合折りたたみと、インテグリン結合で示唆されている部分フィブロネクチンペプチドとの間の特異的相互作用の証拠を与えた。ＭＩＡは、局所腫瘍環境内でインテグリンとＥＣＭ分子との間の特異的相互作用を阻害することによって浸潤および転移を促進するタンパク質のますます大きくなっているファミリーに属するように見える。
【００１３】
さらに、ヒトＭＩＡタンパク質の１.４オングストローム分解能結晶構造が、多波長異常分散法（ＭＡＤ）を用いたＸ線タンパク質結晶構造解析によって決定された（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ.， ＰＮＡＳ ２００１ Ｍａｙ ８；９８ （１０）：５５１５−５５２０）。その構造は従来のＭＩＡのＳＨ３様折りたたみを支持する。
【００１４】
プロリンに富むペプチドはＳＨ３領域のリガンドであるという考えは、いくつかの実験によって支持されている（たとえばＲｅｎ ｅｔ ａｌ.， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， １１５７−１１６１， １９９３； Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ.， Ｃｅｌｌ ７５， ２５−２６， １９９３を参照）。Ｙｕと共同研究者は（Ｃｅｌｌ ７６， ９３３−９４５， １９９４）、ＳＨ３−リガンド相互作用の特異性は非プロリンペプチド残基の非保存タンパク質側鎖との相互認識に起因する可能性があること示している。Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ. （Ｎａｔ.Ｓｔｒｕｃｔ.Ｂｉｏｌ １（８）， ５４６−５５１， １９９４）は、そのような特異的相互作用をＳＨ３領域タンパク質の複合体において見出すことができなかった。
【００１５】
Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ. （ＰＮＡＳ ２００１ Ｍａｙ ８；９８ （１０）：５５１５−５５２０）は、ＭＩＡがプロリンに富むペプチドと結合する能力をファージディスプレイを用いることによって試験したが、偏向ポリプロリンらせんファージディスプレイライブラリから有意なペプチド結合物質を特定することはできなかった。
【００１６】
これらのデータとは対照的に、下記に説明する本発明は主に、ＳＨ３領域への結合のための共通配列を持たない、高含量のプロリンを有するリガンドに基づく。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の一実施例は、「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）の活性を阻害する、配列ＩＤ番号１から５７の配列を有するペプチドから成る群から選択されるペプチドである。
【００１８】
これらのペプチドは好ましくは ＭＩＡへの結合によってＭＩＡを阻害する。
【００１９】
好ましい一実施例では、当該ペプチドは配列リスト群：Ａに記載の高含量のプロリンおよび／または配列リスト群Ｂに記載の高含量のＴｒｐ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒを含む。驚くべきことに、リガンドペプチドは、ＰＸＸＰのようなＳＨ３領域共通結合配列モチーフを必ずしも含まない。しかし、配列リスト群Ｂのペプチドはアミノ酸Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒの高い含量を示し、タンパク質ＭＩＡとの追加のπ相互作用を可能にする。
【００２０】
さらに本発明は、１個の追加のアミノ酸が存在するかまたはペプチドのアミノ酸の１個が欠失しているペプチドを包含する。
【００２１】
別の一実施例では、本発明は１個のアミノ酸が１個の天然アミノ酸で置換されているペプチドを包含する。天然アミノ酸とは、天然タンパク質およびペプチド中に通常存在する２０種類のアミノ酸である。
【００２２】
さらに１個以上のアミノ酸を１個の非天然アミノ酸で置換することができる。そのような非天然アミノ酸は天然アミノ酸を基礎とするが、１個以上の原子がＣ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｅから選択された最大５０原子を含む官能基で置換されている。
【００２３】
そのような天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロスレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンである。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためにはいくつかの方法が当該分野で知られている。
【００２４】
別の一実施例では、当該ペプチドは修飾することができる。適当な修飾は、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキシル化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（γ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化およびプレニル化から成る群から選択される。
【００２５】
本発明のペプチドは薬物として特に有用であり、したがって、本発明のペプチドの少なくとも１つを含む薬物もまた本発明の一部を成す。
【００２６】
ＭＩＡの阻害はまた、抗体または抗体フラグメントを介して達成することができる。したがって、そのような抗体または抗体フラグメント含む薬物もまた本発明の一部である。
【００２７】
特に有用なのは、抗インテグリン抗体リストの抗体Ｎｏ.１から４に記載の、インテグリンに結合する抗体または抗体フラグメントである：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））。これらの抗体または抗体フラグメントはα４および５−インテグリンに対して向けることができる。そのような抗体はＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ， ＮＹ）， ＵＳＡ）およびケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ.）（カリフォルニア州テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）， ＵＳＡ）から市販されている。抗体フラグメントは、抗体の適当な部分を含むが大きさがより小さいペプチドである。適当なフラグメントはＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントである。
【００２８】
ペプチド、抗体、または抗体フラグメントは下記から成る群から選択された物質と組み合わせることができる：
ａ）免疫刺激物質：インターロイキン−２（Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ. １９９７； １６：４９４）、インターフェロン−α（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ.１９９９；１７：９６８−９７５） インターフェロン−γ、インターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）
ｂ）化学治療剤：タキサン（タキソール（ブリストル・マイヤーズスクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ））、タキソテール （アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ））、テモダール（シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））、イントロン−Ａ（シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））、ニトロソ尿素、ダカルビジン、フォテムスチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、アンスラサイクリン、 ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンデシン）、シスプラチン（ＤＤＰ） （ＤｅｌＰｒｅｔｅ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ. １９８３； １２：１３４３.； Ｌｅｇｈａ， ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ. １９８９； ６４： ２０２４−２０２９； Ｃｏｃｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ.， Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ. １９９２； ３２７：５１６−５２３）
ｃ）遺伝子導入に適当な遺伝子治療薬： インターロイキン−７ （Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ. １９９４ Ｓｅｐ；５（９）：１１６１−８）、インターロイキン−２ （Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ.， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９ Ｍａｒ；６（３）：３５０−６３）、インターロイキン−４ （Ａｒｉｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９， Ｄｅｃ １０；１０（１８）：２９０７−１６）、インターロイキン−１２ （Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１ Ａｐｒ １０；１２（６）：６７１−８４）、インターフェロン−γ（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９， Ｊｕｌ−Ａｕｇ；６（４）：３２２−３０； Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｓｅｐ；７（９）：１２２０−３０）、ＧＭ−ＣＳＦ （Ｋｕｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００１ Ｓｅｐ；５０（７）：３７３−８１， Ｌｏｕｄｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００１， Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；３（５）：４５８−６７）、ｐ５３ （Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｊｕｌ；７（７）：１０６９−７６）、ＭＨＣクラスＩ（Ｎａｂｅｌ Ｇｊｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９６ Ｄｅｃ ２４；９３（２６）：１５３８８−９３）、ＨＳＶ−ｔｋ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９８ Ｎｏｖ ２０；９（１７）：２５８５−９４； Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ.， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｆｅｂ １０；１１（３）：４８７−５０３）、Ｂ７ （Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９５ Ｊａｎ；６（１）：８７−１０６）
ｄ）抗血管新生剤および／または抗浸潤剤
ｅ）ワクチン： キャンサーバクス（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，. Ｃａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ. １９９６； ４６：２２５−２４４）、メラシン、シェリング・プラウ／コリクサ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ／Ｃｏｒｉｘａ）（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９５； ３６：２２３）
【００２９】
ペプチド、抗体、または抗体フラグメント単独または上記の物質と組み合わせて、腫瘍の予防または治療のための医薬の調製に用いることができる。
【００３０】
好ましくは、ペプチド、抗体、または抗体フラグメントは全身的に投与される（たとえば静脈注射または皮下注射または経口で）。それらはまた、腫瘍または他の疾患に冒された部位または器官に局所的に投与することもできる。適当な用量は１〜５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲にある。
【００３１】
薬物送達を最適化するための好ましい一実施例では、ペプチドは生分解性高分子に封入することができる。そのような方法は当業者に既知である。適当な高分子には、ポリエステル（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｊ. Ｐｈａｒｍａ. Ｓｃｉ.， ９０： １０； Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｄｒｕｇ Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. ４５： １； Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. ７９： ９１９， Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ.， １９９４， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ ２８： １２１， Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， １９８５， Ｂｉｏｍｅｄ. Ｍａｔｅｒ. Ｒｅｓ. １９： ９４１； Ｅ. Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ. Ｒ. Ｌａｎｇｅｒ， ＰＮＡＳ ９０： ４１７６， １９９３）、ポリアミノ酸 （Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ.， １９７９， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ２０； Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ.， １９９１， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ １６： ４３）、シアノアクリル酸ポリアルキル （Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ａｄｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ. Ｒｅｖ. １０： １４１）、ポリファゼン（Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｃｈｅｍ. Ｅｎｇ. Ｎｅｗｓ ６２： ２２， Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １１２： ７８３）、ポリラクチドとアスパラギン酸の共重合体（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ １１： ２６９）、またはポリエチレンオキサイド（Ｙｏｕｘｉｎ ＆ Ｋｉｓｓｅｌ， １９９３， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ ２７： ２４３）が挙げられる。
【００３２】
さらに好ましいのは、生分解性両親媒性ミクロスフィア （Ｂｏｕｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ.， １９９９， Ｉｎｔ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａ.， １８１：１５９−１７２）、両親媒性共重合体、たとえばポリオキシエチレンミクロスフィア、ポリオキシプロピレンミクロスフィア、 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ナノ粒子（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ.， １９９９， Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， １８５： ９３−１０１）、ポリラクチドミクロスフィア、 ポリエチレングリコール（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ.， １９９９ Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， １８５ （１９９９） ９３−１０１）、ポリエチレンオキサイド（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， １９９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６２： １０９−１１４）、ポリホスファゼン・ナノ粒子 （Ｃａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， ２１１： ５７−６５）， および／またはその組み合わせおよび／または誘導体である。
【００３３】
本発明のペプチド、抗体および抗体フラグメントは、下記から成る群から選択される疾患の予防または治療に用いることができる：
１．固形腫瘍、たとえば皮膚のがん（黒色腫を含む）、頭部および頸部がん、肉腫（骨肉腫および軟骨肉腫を含む）、網膜芽腫、乳がん、卵巣がん、小細胞気管支性／肺がん、非小細胞気管支性／肺がん、食道がん、大腸がん、結腸直腸がん、胃がん、小腸がん、肝がん、腎臓のがん、膵がん、胆のうがん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、中皮腫、前立腺がん、精巣がん、脳がん
２．白血病、たとえば骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫
３．変性疾患、たとえば関節炎、軟骨および骨の変性／傷害
４．免疫抑制疾患、たとえば ＨＩＶ感染、骨髄抑制性疾患、毛細血管拡張性運動失調症、ディジョージ症候群、ブルトン病、先天性無ガンマグロブリン血症、複合型免疫不全疾患、ウィスコット・アルドリッチ症候群、補体不全、白血球減少症。
【００３４】
本発明のペプチド、抗体および抗体フラグメントはさらに、前駆体細胞（たとえば間葉性幹細胞、血球、軟骨細胞、神経細胞）の誘導および／または拡大に用いることができる。
【００３５】
微生物的に精製されたＭＩＡで９６ウェルプレートを被覆し、下記のモノクローナル抗体の１μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした：α２−、α３−、α４−、α５−、α６−、αｖ−およびβ１−インテグリン阻害抗体、α２−、α４−、α５−、α６−、αｖ−およびβ１−インテグリン非阻害抗体、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｅ−カドヘリン、上皮成長因子受容体またはβ−ガラクトシダーゼ抗体および２種類の異なるＭＩＡ抗体。ＰＢＳ／ＢＳＡで５回洗浄後、各モノクローナル抗体の結合はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗血清によって検出され、次いでＡＢＴＳ （ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて視覚化し、３０分後にＯＤ４０５ｎｍにて定量した。
【実施例】
【００３６】
実施例１
ファージディスプレイ
ファージディスプレイスクリーニングを、ヘプタペプチドおよびドデカペプチドファージディスプレイライブラリ（バイオラブズ、カリフォルニア州ビバリー（ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＣＡ）ＵＳＡ）を用いて取扱説明書にしたがって実施した。組み換えヒトＭＩＡで、高タンパク質結合９６ウェルプレートのウェルを、ウェル当たり１０マイクログラムの濃度で被覆した。結合ファージはＭＩＡ被覆プレート中での６０分間室温にてのインキュベートによって選択した。各回の選択について、ウェル当たり２ｘ１０１１個のファージを加えた。結合しないファージはＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）で１０分間５回洗浄することによって除去した；結合したファージはｒｈＭＩＡ（組み換えヒトＭＩＡ）を１００μｇ／ｍｌの濃度で加えることによって溶出した。溶出したファージは増幅し、バイオパニングを４回繰り返した。結合クローンはファージ挿入部を配列決定することによって特徴づけた。
【００３７】
結果
ファージディスプレイ スクリーニングの結果は、複数のプロリンを含むヘプタペプチドを有するクローンの割合が高いことを明らかにした。単離され配列決定された４０のクローンのうち、１１ （２７．５％）が２個以上のプロリンを含んだ。ドデカペプチド ファージディスプレイライブラリを用いて、ペプチド配列ＩＤ番号１６ （ｐｄｐ１２）を含む５つの配列が同定された（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ. ２００１； ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９， 表ＩＩ）。
【００３８】
実施例２
ＭＩＡイムノアッセイ
ＭＩＡで９６ウェルプレートを被覆し、下記の抗体の１μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした： 抗α ２−インテグリン （Ｐ１Ｅ６、ＤＡＫＯ、ハンブルグ、ドイツ）、抗α ２−インテグリン （Ａ２−１１Ｅ１０、ＵＢＩ、ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、ＵＳＡ）、抗α ３−インテグリン （Ｐ１Ｂ５、ＤＡＫＯ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗α ４−インテグリン （Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、抗α ４−インテグリン （Ｂ−５Ｇ１０、ＵＢＩ、ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、ＵＳＡ）、抗α ４−インテグリン （Ｐ４Ｃ２、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ４−インテグリン （Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ４−インテグリン （ＡＢ１９２４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ５−インテグリン （Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）ＵＳＡ）、抗α ５−インテグリン （Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ５−インテグリン （ＡＢ１９４９、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ６−インテグリン （Ａ６−ＥＬＥ、ＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）ＵＳＡ）、抗α ６−インテグリン （ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｄｒ. Ｅ. Ｋｌｅｉｎ、Ｗuｒｚｂｕｒｇ）、抗α−ｖ−インテグリン （Ｐ３Ｇ８ 、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α−ｖ−インテグリン （ＡＢ１９３０、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α−ｖ−β ３−インテグリン （Ｌｖ ２３０）、抗 α−ｖ β ３−インテグリン （ＬＭ６０９、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗β １−インテグリン （６Ｓ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗β １−インテグリン （ＡＢ１９５２、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗ＨＬＡ−ＤＲ− （ＣＲ３７４３、ＤＡＫＯ、ハンブルグ、ドイツ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体 （ＭＬＣＡ、ユーロ・ダイアグノスティカ、ドイツ）および抗ＥＧＦ受容体抗体 （クローンＦ４、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、ドイツ）および２種類の異なる抗ＭＩＡ 抗体 （Ｄｒ. Ｂ. Ｋａｌｕｚａ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で５回洗浄後、各モノクローナル抗体の結合はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗血清によって検出され、次いでＡＢＴＳ （２.２'−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホナート）） （ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて視覚化し、３０分後にＯＤ４０５ｎｍにて定量した。特異性の対照として同種の分析を行うのに変性ＭＩＡを用いた。
【００３９】
結果
驚くべきことに、ＭＩＡに結合するすべてのペプチド／タンパク質がある種のインテグリンのための結合部位として働き、ＭＩＡとこれらのインテグリンのリガンド結合ポケットが三次元ホモロジーを共有する可能性を提起する。この可能性に対応して、我々は、インテグリンの結合ポケットを不活性化するモノクローナル抗体 （Ｈｅｍｌｅｒ， ｅｔ ａｌ.， １９８７ Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６２， １１４７８−１１４８５）がＭＩＡと交差反応するかどうかを調べた。並行して、結合ポケットの外のエピトープを認識する抗インテグリン抗体（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５， １７１８−１７２０； Ｔｅｉｘｉｄｏ， ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６７， １７８６−１７９１； Ｆａｌｃｉｏｎｉ， ｅｔ ａｌ.， １９８６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４６， ５７７２−５７７８）およびインテグリン以外の細胞表面エピトープ（Ｅ−Ｃａｄ、ＥＧＦ−ＲｅｃおよびＨＬＡ−ＤＲ）を認識する抗体を用いて対照を実施した。２種類のモノクローナル抗ＭＩＡ抗体を用いて陽性対照反応を実施した。これらの免疫反応からの結果によって、α４−およびα５−インテグリンの結合ポケットを不活性化する４種類の抗体（抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、および抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）））は、他のすべてのインテグリンおよび細胞表面分子抗体と対照的に、ＭＩＡと特異的に交差反応することが明らかになった（出版用に提出、２００２； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.）、図１参照。これらの結果は、α４β１−およびα５β１−インテグリン受容体の活性化された結合ポケットはＭＩＡと顕著な３次元ホモロジーを共有することを強く示唆する。
【００４０】
ＭＩＡタンパク質の３次元構造および正確な折りたたみの重要性を実証するため、還元ＭＩＡタンパク質を用いて同じ分析を繰り返した。ＭＩＡ折りたたみに２個のシステイン結合が必須であることが知られているため、還元条件はそのタンパク質の変性に結びつく。未変性ＭＩＡと交差反応する抗体は変性したＭＩＡタンパク質と結合することができなかった。さらに、抗インテグリン抗体の同一の組を用いてウェスタンブロット分析を実施した。ここでも、未変性ＭＩＡタンパク質を検出する抗体はどれも還元条件下でＭＩＡと反応しなかった（出版用に提出、２００２； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.）。
【００４１】
実施例３
Ｉｎ ｖｉｖｏ転移分析
配列ＩＤ番号：１６および配列ＩＤ番号：２２がＢ１６ 黒色腫細胞のｉｎ ｖｉｖｏの転移能力 に及ぼす影響を測定するため、実験的転移分析を用いた （Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ. １１， ４１７−４２１）。単分散腫瘍細胞の静脈注射（個体当たり１ｘ１０５細胞）を同系Ｃ５７Ｂｌ６マウスに実施した（各ペプチドおよび対照についてｎ＝１２）。ペプチド （５５０ μｇ／個体）またはＰＢＳを毎日注射した。１８日後マウスを屠殺し、肺を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、ホルマリンで固定し、肺表面上の視認できる腫瘍塊を計数しそして腫瘍面積を測定した。
【００４２】
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のＭＩＡ発現レベルは、高度に浸潤性の表現型と厳密に相関した（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， １９９６， Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７１， ４９０−４９５； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.，１９９９， Ｊ. ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １８７， ４４６−４５４）。さらにｉｎ ｖｉｖｏ試験は、黒色腫の浸潤および転移にＭＩＡが必要であることを示している（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ. １１， ４１７−４２１.， Ｇｕｂａ， ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｂｒ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ８３， １２１６−１２２２）。我々はしたがって、ＭＩＡと相互作用するフィブロネクチンエピトープを同定した我々の実験に基づいてＭＩＡ阻害ペプチドを設計することを目指した（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ.， ２００１； ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９）。ＭＩＡと交差反応することが以前に示されたフィブロネクチン由来ペプチドを、ボイデンチャンバー分析で、ＭＩＡの存在下および非存在下で黒色腫細胞浸潤に及ぼす影響について試験した。結果は明らかに、ペプチド配列ＩＤ番号：２２、２３、および２４がｂｌｏｃｋＭＩＡ機能を阻害すること、さらに、配列ＩＤ番号：２３および２４が腫瘍細胞接着も阻害することを示した。加えて、我々はファージディスプレイ スクリーニングから得られたペプチド 配列のいくつかを試験し、ペプチド 配列ＩＤ番号：１６が治療的ＭＩＡ阻害の潜在的に興味深い候補であることを見出した。それは黒色腫細胞接着には影響を示さず、しかしＭＩＡ機能を強力に阻害した。
【００４３】
我々は次いで、ペプチド配列ＩＤ番号：１６および２２の、ｉｎ ｖｉｖｏの転移の成長に及ぼす影響を、Ｂ１６／Ｃ５７Ｂｌ６モデルを用いて試験した。黒色腫の黒い肺結節の数は治療群と未治療対照群の間で有意に変化しなかった（１９３±１３（対照）；２４９±２６（配列ＩＤ番号：２２）；１９８±１９（配列ＩＤ番号：１６））。しかし、結節の大きさには有意な変化が見られた。そのペプチドで治療された動物は、対照動物と比較して有意に小さい腫瘍結節を生じた（１１９.９±９.９５（対照）；８７.１５±５.３２、ｐ＝０.００４２（配列ＩＤ番号：２２）；７８.１±５.０３、ｐ＝０.０００３（配列ＩＤ番号：１６））。
【００４４】
実施例４
組み換えＭＩＡ タンパク質の発現および精製
ヒトＭＩＡ（Ｇ２５からＱ１３１）の１０８残基を発現している発現プラスミドｐＱＥ４０−ＭＩＡを導入された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）細胞を吸光度Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０.６まで増殖させ、１ｍＭイソプロピル−１−チオ−_−Ｄ−ガラクトピラノシドによって４時間誘導し、超音波で細胞破砕した。タンパク質は、以前に出版された通り、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）封入体から再生された（Ｊａｅｎｉｃｋｅ， Ｒ. & Ｒｕｄｏｌｐｈ， Ｒ. （１９８６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ. １３１：２１８−５０， ２１８−２５０）。再折りたたみヒトＭＩＡを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、Ｓ−セファロースファストフロー（シグマ）（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｓｉｇｍａ））でさらに精製した。最後に、ゲル濾過を スーパーデックス２００プレップグレード（シグマ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅ （Ｓｉｇｍａ））で実施した。ヒトＭＩＡを含む画分を合わせて濃縮した。精製タンパク質はＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＨＰＬＣによって検査され、純度９５％であることが示された。
【００４５】
実施例５
ＭＩＡのタンパク質結晶構造へのペプチドのドッキング
タンパク質ＭＩＡへのペプチドのバーチャルドッキングのために、配列ＩＤ番号：１〜５５のペプチド配列と、ｐｄｂコード１Ｉ１Ｊの結晶構造（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ.， ２００１， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８， ５５１５−５５２０）を用いている。ペプチドとタンパク質の両方は、分子画像ソフトＳＹＢＹＬ（トライポス（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ.）セントルイス、ＵＳＡ）を用いてイオン化している。タンパク質ＭＩＡのドッキング部位はそのタンパク質にアミノ酸Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ａｓｐ２９、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ３２、Ａｒｇ４２、Ｌｅｕ５２、Ａｒｇ５７、Ｌｅｕ５８、Ｐｈｅ５９、Ｇｌｙ５７、Ｔｙｒ７８、Ｐｈｅ７９、Ｐｒｏ８０、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ８２、Ｉｌｅ８３、およびＡｒｇ８５を当てはめて定義されている。ドッキングはプログラム４スキャン（４Ｓｃａｎ）（４ＳＣ ＧｍｂＨ、マルティンスリート、ドイツ）を用いて実施した。各ペプチドについて結合エネルギーおよび結合に関与するペプチドリガンドとタンパク質の両方のアミノ酸を分析している。ペプチドリガンドは結合エネルギーで並べている。
【００４６】
結果
驚くべきことに、配列ＩＤ番号：１〜５７のリガンドペプチドは必ずしも、ＰＸＸＰのようなＳＨ３−領域共通結合配列モチーフを含まない。
【００４７】
以前に公表された結果とは対照的に、ＭＩＡタンパク質への結合に関与するアミノ酸配列モチーフ（リガンド）は、配列ＩＤ番号：０１〜１１、配列ＩＤ番号：１３〜２０、配列ＩＤ番号：２２〜３１、配列ＩＤ番号：３５〜３６、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：４０〜４４、配列ＩＤ番号：４６〜４９、配列ＩＤ番号：５１〜５７において、少なくとも１個のプロリンアミノ酸残基を有する「プロリン間配列モチーフ」と定義することができる。
【００４８】
ＭＩＡのタンパク質結晶構造（コード１Ｉ１Ｊ； Ｌｏｕｇｈｅｅｄ， ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９８， ５５１５−５５２０）へのペプチド配列ＩＤ番号：１〜５５のバーチャルドッキングに基づいて、「プロリン間配列モチーフ」の機能的役割およびペプチドの結合部位の両方を特定することができる。
【００４９】
すべてのペプチドは、配列ＩＤ番号：２２、４３、４８を除き、水素結合とファンデルワールス結合の両方によってその全長にわたってＭＩＡと結合し相互作用する。プロリン アミノ酸残基（リガンド） はこれらの両極のペプチド間ねじれ角に達するのに関与し、それによってリガンドの結合を支持する。プロリンは主に、水素結合でなくファンデルワールス複合体相互作用に関与する。
【００５０】
ペプチドは好ましくは、タンパク質表面のＡｒｇ４２、Ａｓｐ２９、およびＧｌｎ２８ （ヒト ＭＩＡ）の３つのアミノ酸残基に結合する。この「ＭＩＡ結合３つ組」との結合はリガンドの立体構造のねじれを強化する。驚くべきことに、Ａｒｇ４２残基（ＭＩＡ）はＳＨ３−タンパク質ファミリー内で保存されていない。
【００５１】
配列グループＡのペプチド（配列ＩＤ番号：１〜２４）は、配列グループＢ（１２.０％）と比較してより高い含量のプロリン（２２.４％）を含み、したがってタンパク質への結合のためのより高い立体構造的可塑性を示す。
【００５２】
配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）はこのことを、アミノ酸 Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒのより高い含量で埋め合わせている。配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）の、上記のＭＩＡ結合３つ組との結合は、アミノ酸残基Ｔｙｒ３０（ＭＩＡ）のこれらのアミノ酸側鎖（リガンド）とのπ相互作用によって強化される。配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）は８.５％Ｔｒｐ、７.９％Ｈｉｓ、および３.０％Ｔｙｒを含む（グループＡ：２.５％Ｔｒｐ、３.８％Ｈｉｓ、０.８％Ｔｙｒ）。
【００５３】
本発明の配列グループＡおよびＢのペプチド群は高含量のＬｅｕ （１１％）、Ｓｅｒ （１０％）、およびＴｈｒ （９％）を含む。
【００５４】
配列リスト
ＭＩＡの機能の阻害は、好ましくは下記のアミノ酸配列を含む分子を用いることによって達成される：
配列リスト群：Ａ
- 配列ＩＤ番号：０１ ＶＰＨＩＰＰＮ
- 配列ＩＤ番号：０２ ＭＰＰＴＱＶＳ
- 配列ＩＤ番号：０３ ＱＭＨＰＷＰＰ
- 配列ＩＤ番号：０４ ＱＰＰＦＷＱＦ
- 配列ＩＤ番号：０５ ＴＰＰＱＧＬＡ
- 配列ＩＤ番号：０６ ＩＰＰＹＮＴＬ
- 配列ＩＤ番号：０７ ＡＶＲＰＡＰＬ
- 配列ＩＤ番号：０８ ＧＡＫＰＨＰＱ
- 配列ＩＤ番号：０９ ＱＱＬＳＰＬＰ
- 配列ＩＤ番号：１０ ＧＰＰＰＳＰＶ
- 配列ＩＤ番号：１１ ＬＰＬＴＰＬＰ
- 配列ＩＤ番号：１２ ＱＬＮＶＮＨＱＡＲＡＤＱ
- 配列ＩＤ番号：１３ ＴＳＡＳＴＲＰＥＬＨＹＰ
- 配列ＩＤ番号：１４ ＴＦＬＰＨＱＭＨＰＷＰＰ
- 配列ＩＤ番号：１５ ＶＰＨＩＰＰＮＳＭＡＬＴ
- 配列ＩＤ番号：１６ ＲＬＴＬＬＶＬＩＭＰＡＰ
- 配列ＩＤ番号：１７ ＲＫＬＰＰＲＰＲＲ
- 配列ＩＤ番号：１８ ＶＬＡＳＱＩＡＴＴＰＳＰ
- 配列ＩＤ番号：１９ ＴＰＬＴＫＬＰＳＶＮＨＰ
- 配列ＩＤ番号：２０ ＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴ
- 配列ＩＤ番号：２１ ＥＱＤＳＲＱＧＱＥＬＴＫＫＧＬ
- 配列ＩＤ番号：２２ ＥＴＴＩＶＩＴＷＴＰＡＰＲ
- 配列ＩＤ番号：２３ ＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴ
- 配列ＩＤ番号：２４ ＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲ
配列ＩＤ番号：０１から配列ＩＤ番号：２４はＳｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ.， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９によって公表されたペプチドを指し、ここで配列ＩＤ番号：０１から配列ＩＤ番号：１６はファージディスプレイによって得られた。
配列ＩＤ番号：１７から配列ＩＤ番号：２４は本研究で試験した他のペプチドであり、対照ペプチド（配列ＩＤ番号：２０および配列ＩＤ番号：２１）、ＰＩ３キナーゼＳＨ３領域結合ペプチド（配列ＩＤ番号：１７）およびフィブロネクチン由来ペプチド（配列ＩＤ番号：２２から配列ＩＤ番号：２４）を含む。
配列リスト群： Ｂ
- 配列ＩＤ番号：２５ ＹＮＬＰＫＶＳＳＮＬＳＰ
- 配列ＩＤ番号：２６ ＭＰＰＴＱＶＳＫＦＲＬＩ
- 配列ＩＤ番号：２７ ＡＮＩＤＡＴＰＬＦＬＲＡ
- 配列ＩＤ番号：２８ ＬＬＲＴＴＥＴＬＰＭＦＬ
- 配列ＩＤ番号：２９ ＳＡＬＥＰＬＶ
- 配列ＩＤ番号：３０ ＧＳＰＴＰＮＡ
- 配列ＩＤ番号：３１ ＡＰＳＨＡＴＨ
- 配列ＩＤ番号：３２ ＴＴＶＧＨＳＤ
- 配列ＩＤ番号：３３ ＴＨＦＳＴＦＴ
- 配列ＩＤ番号：３４ ＳＬＬＬＤＴＳ
- 配列ＩＤ番号：３５ ＳＶＡＭＫＡＨＫＰＬＬＰ
- 配列ＩＤ番号：３６ ＮＴＩＰＧＦＡＳＫＳＬＤ
- 配列ＩＤ番号：３７ ＶＳＮＹＫＦＹＳＴＴＳＳ
- 配列ＩＤ番号：３８ ＶＳＲＨＱＳＷＨＰＨＤＬ
- 配列ＩＤ番号：３９ ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲ
- 配列ＩＤ番号：４０ ＨＮＡＳＰＳＷＧＳＰＶＭ
- 配列ＩＤ番号：４１ ＳＨＰＷＮＡＱＲＥＬＳＶ
- 配列ＩＤ番号：４２ ＨＨＷＰＦＷＲＴＬＰＬＳ
- 配列ＩＤ番号：４３ ＷＨＴＫＦＬＰＲＹＬＰＳ
- 配列ＩＤ番号：４４ ＮＮＴＳＦＴＶＶＰＳＶＰ
- 配列ＩＤ番号：４５ ＳＨＬＳＴＷＫＷＷＱＮＲ
- 配列ＩＤ番号：４６ ＦＨＷＨＰＲＬＷＰＬＰＳ
- 配列ＩＤ番号：４７ ＷＨＷＴＹＧＷＲＰＰＡＭ
- 配列ＩＤ番号：４８ ＦＨＷＲＹＰＬＰＬＰＧＱ
- 配列ＩＤ番号：４９ ＷＨＷＰＬＦＩＰＮＴＴＡ
- 配列ＩＤ番号：５０ ＷＨＮＧＩＷＷＨＹＧＶＲ
- 配列ＩＤ番号：５１ ＨＨＬＮＹＬＷＰＷＴＲＶ
- 配列ＩＤ番号：５２ ＦＷＨＲＷＳＴＦＰＥＱＰ
- 配列ＩＤ番号：５３ ＷＨＭＳＹＦＷＴＲＰＰＱ
- 配列ＩＤ番号：５４ ＦＨＬＮＷＰＳＲＡＤＹＬ
- 配列ＩＤ番号：５５ ＷＨＫＮＴＮＷＰＷＲＴＬ
- 配列ＩＤ番号：５６ ＡＬＳＰＳＱＳＨＰＶＲＳ
- 配列ＩＤ番号：５７ ＧＴＱＳＴＡＩＰＡＰＴＤ
配列ＩＤ番号：２５から配列ＩＤ：番号５７はファージディスプレイによって得られた。
抗インテグリン抗体リスト
ＭＩＡの機能の阻害はまた下記の抗α４−および抗α５−インテグリン−抗体不活性化の使用によって達成されることが好ましい：
抗体ＮＯ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）
抗体ＮＯ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
抗体ＮＯ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）
抗体ＮＯ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は抗α４−および抗α５−インテグリン阻害抗体のＭＩＡとの特異的交差反応を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）の活性を阻害するペプチドおよび抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫阻害活性物質（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｌｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＭＩＡ）ポリペプチドは１９８９年に黒色腫腫瘍細胞の成長を阻害する因子として発見された。黒色腫阻害活性物質（ＭＩＡ）タンパク質は、ヒト黒色腫細胞株ＨＴＺ−１９の組織培養上清から精製された成長阻害活性物質の中に見出された（Ｂｏｇｄａｈｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９８９； ４９： ５３５８−５３６３）。ＭＩＡの抗増殖作用はまた、他の腫瘍細胞および末梢血単核球においても実証された（Ｊａｃｈｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ， ４１： １１５）。
【０００３】
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験と、同様に免疫組織化学法が、ＭＩＡを骨格系の成長域内の発生胚に局在し、またＭＩＡは軟骨細胞の周辺で発現し、分泌され、蓄積する。
【０００４】
発生中のマウスでは、発現は骨格系の形成と相関し、生後に次第に消失し、例外として乳腺系の成熟中に再び発現する。
【０００５】
しかし、腫瘍の場合には、ＭＩＡは調べた悪性黒色腫のすべてによって発現し血清中に分泌されることが見出されたが、基底細胞がんおよび扁平上皮細胞がんを含む他の皮膚腫瘍や、または正常メラニン細胞およびケラチン生成細胞では見られなかった。
【０００６】
「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）は１３１アミノ酸前駆体分子として翻訳され、分泌シグナルの切断後、成熟した１０７アミノ酸タンパク質へ加工される。ＭＩＡは、転移性黒色腫ステージＩＩＩおよびＩＶを有する患者において、臨床的に有用なパラメータを提供する（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｈａｕｔａｒｚｔ. １９９８； ４９： ７６２−７６９； Ｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ.， Ｏｎｃｏｌ.Ｒｅｓ. １９９９； １１： ５５−６１； Ｄｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.， Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ. ９９９； １７： １８９１−１８９６）。ＭＩＡは黒色腫細胞株の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することによって抗腫瘍活性を導くと説明された（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９４； ５４： ５６９５−５７０１； Ｂｏｇｄａｈｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.１９８９； ４９： ５３５８−５３６３）。しかし、他の研究は、腫瘍抑制因子と一致しない発現パターンを明らかにしている。野生型ＭＩＡ タンパク質遺伝子の発現は正常皮膚およびメラニン細胞では検出されなかったが、メラニン細胞腫瘍の進行と関連していた（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９５； ５５： ６２３７−６２４３）。より近年では、ＭＩＡ タンパク質 は黒色腫細胞のフィブロネクチンおよびラミニンへの接着を特異的に阻害し、それによってこれらの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分へのインテグリンの結合部位をマスキングしてｉｎ ｖｉｖｏの浸潤および転移を促進することが示唆された（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９７； ５７： ３１４９−３１５３； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ. １９９９； １８７： ４４６−４５４； Ｇｕｂａ ｅｔ ａｌ.， Ｂｒ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ ２０００； ８３： １２１６−１２２２）。このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏの成長阻害活性は、そのタンパク質が細胞株の組織培養シャーレ表面へのｉｎ ｖｉｔｒｏの接着に干渉する能力を反映する（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９４； ５４： ５６９５−５７０１）。
【０００７】
Ｗｅｉｌｂａｃｈ ｅｔ ａｌ. （１９９０ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５０； ６９８１−８６）はさらに、ＭＩＡがＳ期を延長することおよび細胞をＧ２コンパートメントで停止させることによって細胞増殖を阻害することを実証した。
【０００８】
ヒト ｒＭＩＡは、ＩＬ−２−またはＰＨＡ−誘導性末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）増殖を用量依存的に阻害する。さらに、自家性または同種異系ＬＡＫ細胞毒性はＭＩＡによって阻害されている（Ｊａｃｈｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ， ４１： １１５）.
【０００９】
Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ. （１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５４； ５６９５−５７０１） は、ＭＩＡが悪性黒色腫細胞に対し強力な腫瘍細胞成長阻害因子として作用することを確認し、さらにこの観察を他の神経外胚葉性腫瘍に拡張し、ＭＩＡは未来の抗がん治療物質として魅力的でありうると結論した。
【００１０】
ＭＩＡ発現の黒色腫進行との臨床的相関はＢｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.（１９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５７； ３１４９−５３； １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９； ２６９１−３）によって発見され、ＭＩＡ濃度の上昇が黒色腫ステージＩおよびＩＩの１３−２３％に、しかし疾患ステージＩＩＩまたはステージＩＶの１００％に示された。
【００１１】
Ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ. （１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５５； ６２３７−４３）は、非転移性細胞株におけるＭＩＡｍＲＮＡ発現、および黒色腫転移病変における色素沈着とＭＩＡｍＲＮＡ発現の逆相関を見出した。
【００１２】
溶液中の 組み換えヒト ＭＩＡの３次元構造が近年、多次元ＮＭＲ分光法によって決定され、ＭＩＡはＳＨ３領域様折りたたみを取ることが知られる最初の細胞外タンパク質であることが明らかになった。これらの研究はまた、ＭＩＡの結合折りたたみと、インテグリン結合で示唆されている部分フィブロネクチンペプチドとの間の特異的相互作用の証拠を与えた。ＭＩＡは、局所腫瘍環境内でインテグリンとＥＣＭ分子との間の特異的相互作用を阻害することによって浸潤および転移を促進するタンパク質のますます大きくなっているファミリーに属するように見える。
【００１３】
さらに、ヒトＭＩＡタンパク質の１.４オングストローム分解能結晶構造が、多波長異常分散法（ＭＡＤ）を用いたＸ線タンパク質結晶構造解析によって決定された（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ.， ＰＮＡＳ ２００１ Ｍａｙ ８；９８ （１０）：５５１５−５５２０）。その構造は従来のＭＩＡのＳＨ３様折りたたみを支持する。
【００１４】
プロリンに富むペプチドはＳＨ３領域のリガンドであるという考えは、いくつかの実験によって支持されている（たとえばＲｅｎ ｅｔ ａｌ.， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， １１５７−１１６１， １９９３； Ｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ.， Ｃｅｌｌ ７５， ２５−２６， １９９３を参照）。Ｙｕと共同研究者は（Ｃｅｌｌ ７６， ９３３−９４５， １９９４）、ＳＨ３−リガンド相互作用の特異性は非プロリンペプチド残基の非保存タンパク質側鎖との相互認識に起因する可能性があること示している。Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ. （Ｎａｔ.Ｓｔｒｕｃｔ.Ｂｉｏｌ １（８）， ５４６−５５１， １９９４）は、そのような特異的相互作用をＳＨ３領域タンパク質の複合体において見出すことができなかった。
【００１５】
Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ. （ＰＮＡＳ ２００１ Ｍａｙ ８；９８ （１０）：５５１５−５５２０）は、ＭＩＡがプロリンに富むペプチドと結合する能力をファージディスプレイを用いることによって試験したが、偏向ポリプロリンらせんファージディスプレイライブラリから有意なペプチド結合物質を特定することはできなかった。
【００１６】
これらのデータとは対照的に、下記に説明する本発明は主に、ＳＨ３領域への結合のための共通配列を持たない、高含量のプロリンを有するリガンドに基づく。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の一実施例は、「黒色腫阻害活性物質」（ＭＩＡ）の活性を阻害する、配列ＩＤ番号１から５７の配列を有するペプチドから成る群から選択されるペプチドである。
【００１８】
これらのペプチドは好ましくは ＭＩＡへの結合によってＭＩＡを阻害する。
【００１９】
好ましい一実施例では、当該ペプチドは配列リスト群：Ａに記載の高含量のプロリンおよび／または配列リスト群Ｂに記載の高含量のＴｒｐ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒを含む。驚くべきことに、リガンドペプチドは、ＰＸＸＰのようなＳＨ３領域共通結合配列モチーフを必ずしも含まない。しかし、配列リスト群Ｂのペプチドはアミノ酸Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒの高い含量を示し、タンパク質ＭＩＡとの追加のπ相互作用を可能にする。
【００２０】
さらに本発明は、１個の追加のアミノ酸が存在するかまたはペプチドのアミノ酸の１個が欠失しているペプチドを包含する。
【００２１】
別の一実施例では、本発明は１個のアミノ酸が１個の天然アミノ酸で置換されているペプチドを包含する。天然アミノ酸とは、天然タンパク質およびペプチド中に通常存在する２０種類のアミノ酸である。
【００２２】
さらに１個以上のアミノ酸を１個の非天然アミノ酸で置換することができる。そのような非天然アミノ酸は天然アミノ酸を基礎とするが、１個以上の原子がＣ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｅから選択された最大５０原子を含む官能基で置換されている。
【００２３】
そのような天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロスレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンである。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためにはいくつかの方法が当該分野で知られている。
【００２４】
別の一実施例では、当該ペプチドは修飾することができる。適当な修飾は、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキシル化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（γ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化およびプレニル化から成る群から選択される。
【００２５】
本発明のペプチドは薬物として特に有用であり、したがって、本発明のペプチドの少なくとも１つを含む薬物もまた本発明の一部を成す。
【００２６】
ＭＩＡの阻害はまた、抗体または抗体フラグメントを介して達成することができる。したがって、そのような抗体または抗体フラグメント含む薬物もまた本発明の一部である。
【００２７】
特に有用なのは、抗インテグリン抗体リストの抗体Ｎｏ.１から４に記載の、インテグリンに結合する抗体または抗体フラグメントである：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））。これらの抗体または抗体フラグメントはα４および５−インテグリンに対して向けることができる。そのような抗体はＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ， ＮＹ）， ＵＳＡ）およびケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ.）（カリフォルニア州テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）， ＵＳＡ）から市販されている。抗体フラグメントは、抗体の適当な部分を含むが大きさがより小さいペプチドである。適当なフラグメントはＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントである。
【００２８】
ペプチド、抗体、または抗体フラグメントは下記から成る群から選択された物質と組み合わせることができる：
ａ）免疫刺激物質：インターロイキン−２（Ａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ. １９９７； １６：４９４）、インターフェロン−α（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ.１９９９；１７：９６８−９７５） インターフェロン−γ、インターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）
ｂ）化学治療剤：タキサン（タキソール（ブリストル・マイヤーズスクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ））、タキソテール （アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ））、テモダール（シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））、イントロン−Ａ（シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））、ニトロソ尿素、ダカルビジン、フォテムスチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、アンスラサイクリン、 ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンデシン）、シスプラチン（ＤＤＰ） （ＤｅｌＰｒｅｔｅ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ. １９８３； １２：１３４３.； Ｌｅｇｈａ， ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ. １９８９； ６４： ２０２４−２０２９； Ｃｏｃｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ.， Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ. １９９２； ３２７：５１６−５２３）
ｃ）遺伝子導入に適当な遺伝子治療薬： インターロイキン−７ （Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ. １９９４ Ｓｅｐ；５（９）：１１６１−８）、インターロイキン−２ （Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ.， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９ Ｍａｒ；６（３）：３５０−６３）、インターロイキン−４ （Ａｒｉｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９， Ｄｅｃ １０；１０（１８）：２９０７−１６）、インターロイキン−１２ （Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１ Ａｐｒ １０；１２（６）：６７１−８４）、インターフェロン−γ（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９， Ｊｕｌ−Ａｕｇ；６（４）：３２２−３０； Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｓｅｐ；７（９）：１２２０−３０）、ＧＭ−ＣＳＦ （Ｋｕｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００１ Ｓｅｐ；５０（７）：３７３−８１， Ｌｏｕｄｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００１， Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；３（５）：４５８−６７）、ｐ５３ （Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ.， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｊｕｌ；７（７）：１０６９−７６）、ＭＨＣクラスＩ（Ｎａｂｅｌ Ｇｊｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９６ Ｄｅｃ ２４；９３（２６）：１５３８８−９３）、ＨＳＶ−ｔｋ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９８ Ｎｏｖ ２０；９（１７）：２５８５−９４； Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ.， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｆｅｂ １０；１１（３）：４８７−５０３）、Ｂ７ （Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９５ Ｊａｎ；６（１）：８７−１０６）
ｄ）抗血管新生剤および／または抗浸潤剤
ｅ）ワクチン： キャンサーバクス（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ.，. Ｃａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ. １９９６； ４６：２２５−２４４）、メラシン、シェリング・プラウ／コリクサ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ／Ｃｏｒｉｘａ）（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ.， Ｐｒｏｃ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９５； ３６：２２３）
【００２９】
ペプチド、抗体、または抗体フラグメント単独または上記の物質と組み合わせて、腫瘍の予防または治療のための医薬の調製に用いることができる。
【００３０】
好ましくは、ペプチド、抗体、または抗体フラグメントは全身的に投与される（たとえば静脈注射または皮下注射または経口で）。それらはまた、腫瘍または他の疾患に冒された部位または器官に局所的に投与することもできる。適当な用量は１〜５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲にある。
【００３１】
薬物送達を最適化するための好ましい一実施例では、ペプチドは生分解性高分子に封入することができる。そのような方法は当業者に既知である。適当な高分子には、ポリエステル（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｊ. Ｐｈａｒｍａ. Ｓｃｉ.， ９０： １０； Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｄｒｕｇ Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. ４５： １； Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｓｃｉ. ７９： ９１９， Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ.， １９９４， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ ２８： １２１， Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， １９８５， Ｂｉｏｍｅｄ. Ｍａｔｅｒ. Ｒｅｓ. １９： ９４１； Ｅ. Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ.， Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ. Ｒ. Ｌａｎｇｅｒ， ＰＮＡＳ ９０： ４１７６， １９９３）、ポリアミノ酸 （Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ.， １９７９， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ２０； Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ.， １９９１， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ １６： ４３）、シアノアクリル酸ポリアルキル （Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ａｄｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ. Ｒｅｖ. １０： １４１）、ポリファゼン（Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｃｈｅｍ. Ｅｎｇ. Ｎｅｗｓ ６２： ２２， Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １１２： ７８３）、ポリラクチドとアスパラギン酸の共重合体（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ.， １９９０， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ １１： ２６９）、またはポリエチレンオキサイド（Ｙｏｕｘｉｎ ＆ Ｋｉｓｓｅｌ， １９９３， Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ ２７： ２４３）が挙げられる。
【００３２】
さらに好ましいのは、生分解性両親媒性ミクロスフィア （Ｂｏｕｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ.， １９９９， Ｉｎｔ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａ.， １８１：１５９−１７２）、両親媒性共重合体、たとえばポリオキシエチレンミクロスフィア、ポリオキシプロピレンミクロスフィア、 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ナノ粒子（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ.， １９９９， Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， １８５： ９３−１０１）、ポリラクチドミクロスフィア、 ポリエチレングリコール（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ.， １９９９ Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， １８５ （１９９９） ９３−１０１）、ポリエチレンオキサイド（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， １９９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６２： １０９−１１４）、ポリホスファゼン・ナノ粒子 （Ｃａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｉｎｔ. Ｊ. ｏｆ Ｐｈａｒｍａ.， ２１１： ５７−６５）， および／またはその組み合わせおよび／または誘導体である。
【００３３】
本発明のペプチド、抗体および抗体フラグメントは、下記から成る群から選択される疾患の予防または治療に用いることができる：
１．固形腫瘍、たとえば皮膚のがん（黒色腫を含む）、頭部および頸部がん、肉腫（骨肉腫および軟骨肉腫を含む）、網膜芽腫、乳がん、卵巣がん、小細胞気管支性／肺がん、非小細胞気管支性／肺がん、食道がん、大腸がん、結腸直腸がん、胃がん、小腸がん、肝がん、腎臓のがん、膵がん、胆のうがん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、中皮腫、前立腺がん、精巣がん、脳がん
２．白血病、たとえば骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫
３．変性疾患、たとえば関節炎、軟骨および骨の変性／傷害
４．免疫抑制疾患、たとえば ＨＩＶ感染、骨髄抑制性疾患、毛細血管拡張性運動失調症、ディジョージ症候群、ブルトン病、先天性無ガンマグロブリン血症、複合型免疫不全疾患、ウィスコット・アルドリッチ症候群、補体不全、白血球減少症。
【００３４】
本発明のペプチド、抗体および抗体フラグメントはさらに、前駆体細胞（たとえば間葉性幹細胞、血球、軟骨細胞、神経細胞）の誘導および／または拡大に用いることができる。
【００３５】
微生物的に精製されたＭＩＡで９６ウェルプレートを被覆し、下記のモノクローナル抗体の１μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした：α２−、α３−、α４−、α５−、α６−、αｖ−およびβ１−インテグリン阻害抗体、α２−、α４−、α５−、α６−、αｖ−およびβ１−インテグリン非阻害抗体、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｅ−カドヘリン、上皮成長因子受容体またはβ−ガラクトシダーゼ抗体および２種類の異なるＭＩＡ抗体。ＰＢＳ／ＢＳＡで５回洗浄後、各モノクローナル抗体の結合はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗血清によって検出され、次いでＡＢＴＳ （ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて視覚化し、３０分後にＯＤ４０５ｎｍにて定量した。
【実施例】
【００３６】
実施例１
ファージディスプレイ
ファージディスプレイスクリーニングを、ヘプタペプチドおよびドデカペプチドファージディスプレイライブラリ（バイオラブズ、カリフォルニア州ビバリー（ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＣＡ）ＵＳＡ）を用いて取扱説明書にしたがって実施した。組み換えヒトＭＩＡで、高タンパク質結合９６ウェルプレートのウェルを、ウェル当たり１０マイクログラムの濃度で被覆した。結合ファージはＭＩＡ被覆プレート中での６０分間室温にてのインキュベートによって選択した。各回の選択について、ウェル当たり２ｘ１０１１個のファージを加えた。結合しないファージはＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）で１０分間５回洗浄することによって除去した；結合したファージはｒｈＭＩＡ（組み換えヒトＭＩＡ）を１００μｇ／ｍｌの濃度で加えることによって溶出した。溶出したファージは増幅し、バイオパニングを４回繰り返した。結合クローンはファージ挿入部を配列決定することによって特徴づけた。
【００３７】
結果
ファージディスプレイ スクリーニングの結果は、複数のプロリンを含むヘプタペプチドを有するクローンの割合が高いことを明らかにした。単離され配列決定された４０のクローンのうち、１１ （２７．５％）が２個以上のプロリンを含んだ。ドデカペプチド ファージディスプレイライブラリを用いて、ペプチド配列ＩＤ番号１６ （ｐｄｐ１２）を含む５つの配列が同定された（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ. ２００１； ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９， 表ＩＩ）。
【００３８】
実施例２
ＭＩＡイムノアッセイ
ＭＩＡで９６ウェルプレートを被覆し、下記の抗体の１μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした： 抗α ２−インテグリン （Ｐ１Ｅ６、ＤＡＫＯ、ハンブルグ、ドイツ）、抗α ２−インテグリン （Ａ２−１１Ｅ１０、ＵＢＩ、ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、ＵＳＡ）、抗α ３−インテグリン （Ｐ１Ｂ５、ＤＡＫＯ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗α ４−インテグリン （Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、抗α ４−インテグリン （Ｂ−５Ｇ１０、ＵＢＩ、ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、ＵＳＡ）、抗α ４−インテグリン （Ｐ４Ｃ２、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ４−インテグリン （Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ４−インテグリン （ＡＢ１９２４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ５−インテグリン （Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）ＵＳＡ）、抗α ５−インテグリン （Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ５−インテグリン （ＡＢ１９４９、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α ６−インテグリン （Ａ６−ＥＬＥ、ＵＢＩ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）ＵＳＡ）、抗α ６−インテグリン （ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｄｒ. Ｅ. Ｋｌｅｉｎ、Ｗuｒｚｂｕｒｇ）、抗α−ｖ−インテグリン （Ｐ３Ｇ８ 、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α−ｖ−インテグリン （ＡＢ１９３０、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α−ｖ−β ３−インテグリン （Ｌｖ ２３０）、抗 α−ｖ β ３−インテグリン （ＬＭ６０９、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗β １−インテグリン （６Ｓ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗β １−インテグリン （ＡＢ１９５２、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗ＨＬＡ−ＤＲ− （ＣＲ３７４３、ＤＡＫＯ、ハンブルグ、ドイツ）、抗Ｅ−カドヘリン抗体 （ＭＬＣＡ、ユーロ・ダイアグノスティカ、ドイツ）および抗ＥＧＦ受容体抗体 （クローンＦ４、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、ドイツ）および２種類の異なる抗ＭＩＡ 抗体 （Ｄｒ. Ｂ. Ｋａｌｕｚａ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で５回洗浄後、各モノクローナル抗体の結合はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗血清によって検出され、次いでＡＢＴＳ （２.２'−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホナート）） （ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて視覚化し、３０分後にＯＤ４０５ｎｍにて定量した。特異性の対照として同種の分析を行うのに変性ＭＩＡを用いた。
【００３９】
結果
驚くべきことに、ＭＩＡに結合するすべてのペプチド／タンパク質がある種のインテグリンのための結合部位として働き、ＭＩＡとこれらのインテグリンのリガンド結合ポケットが三次元ホモロジーを共有する可能性を提起する。この可能性に対応して、我々は、インテグリンの結合ポケットを不活性化するモノクローナル抗体 （Ｈｅｍｌｅｒ， ｅｔ ａｌ.， １９８７ Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６２， １１４７８−１１４８５）がＭＩＡと交差反応するかどうかを調べた。並行して、結合ポケットの外のエピトープを認識する抗インテグリン抗体（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５， １７１８−１７２０； Ｔｅｉｘｉｄｏ， ｅｔ ａｌ.， １９９２， Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６７， １７８６−１７９１； Ｆａｌｃｉｏｎｉ， ｅｔ ａｌ.， １９８６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４６， ５７７２−５７７８）およびインテグリン以外の細胞表面エピトープ（Ｅ−Ｃａｄ、ＥＧＦ−ＲｅｃおよびＨＬＡ−ＤＲ）を認識する抗体を用いて対照を実施した。２種類のモノクローナル抗ＭＩＡ抗体を用いて陽性対照反応を実施した。これらの免疫反応からの結果によって、α４−およびα５−インテグリンの結合ポケットを不活性化する４種類の抗体（抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、および抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）））は、他のすべてのインテグリンおよび細胞表面分子抗体と対照的に、ＭＩＡと特異的に交差反応することが明らかになった（出版用に提出、２００２； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.）、図１参照。これらの結果は、α４β１−およびα５β１−インテグリン受容体の活性化された結合ポケットはＭＩＡと顕著な３次元ホモロジーを共有することを強く示唆する。
【００４０】
ＭＩＡタンパク質の３次元構造および正確な折りたたみの重要性を実証するため、還元ＭＩＡタンパク質を用いて同じ分析を繰り返した。ＭＩＡ折りたたみに２個のシステイン結合が必須であることが知られているため、還元条件はそのタンパク質の変性に結びつく。未変性ＭＩＡと交差反応する抗体は変性したＭＩＡタンパク質と結合することができなかった。さらに、抗インテグリン抗体の同一の組を用いてウェスタンブロット分析を実施した。ここでも、未変性ＭＩＡタンパク質を検出する抗体はどれも還元条件下でＭＩＡと反応しなかった（出版用に提出、２００２； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.）。
【００４１】
実施例３
Ｉｎ ｖｉｖｏ転移分析
配列ＩＤ番号：１６および配列ＩＤ番号：２２がＢ１６ 黒色腫細胞のｉｎ ｖｉｖｏの転移能力 に及ぼす影響を測定するため、実験的転移分析を用いた （Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ. １１， ４１７−４２１）。単分散腫瘍細胞の静脈注射（個体当たり１ｘ１０５細胞）を同系Ｃ５７Ｂｌ６マウスに実施した（各ペプチドおよび対照についてｎ＝１２）。ペプチド （５５０ μｇ／個体）またはＰＢＳを毎日注射した。１８日後マウスを屠殺し、肺を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、ホルマリンで固定し、肺表面上の視認できる腫瘍塊を計数しそして腫瘍面積を測定した。
【００４２】
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のＭＩＡ発現レベルは、高度に浸潤性の表現型と厳密に相関した（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， １９９６， Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７１， ４９０−４９５； Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.，１９９９， Ｊ. ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １８７， ４４６−４５４）。さらにｉｎ ｖｉｖｏ試験は、黒色腫の浸潤および転移にＭＩＡが必要であることを示している（Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ. １１， ４１７−４２１.， Ｇｕｂａ， ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｂｒ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ８３， １２１６−１２２２）。我々はしたがって、ＭＩＡと相互作用するフィブロネクチンエピトープを同定した我々の実験に基づいてＭＩＡ阻害ペプチドを設計することを目指した（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ.， ２００１； ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９）。ＭＩＡと交差反応することが以前に示されたフィブロネクチン由来ペプチドを、ボイデンチャンバー分析で、ＭＩＡの存在下および非存在下で黒色腫細胞浸潤に及ぼす影響について試験した。結果は明らかに、ペプチド配列ＩＤ番号：２２、２３、および２４がｂｌｏｃｋＭＩＡ機能を阻害すること、さらに、配列ＩＤ番号：２３および２４が腫瘍細胞接着も阻害することを示した。加えて、我々はファージディスプレイ スクリーニングから得られたペプチド 配列のいくつかを試験し、ペプチド 配列ＩＤ番号：１６が治療的ＭＩＡ阻害の潜在的に興味深い候補であることを見出した。それは黒色腫細胞接着には影響を示さず、しかしＭＩＡ機能を強力に阻害した。
【００４３】
我々は次いで、ペプチド配列ＩＤ番号：１６および２２の、ｉｎ ｖｉｖｏの転移の成長に及ぼす影響を、Ｂ１６／Ｃ５７Ｂｌ６モデルを用いて試験した。黒色腫の黒い肺結節の数は治療群と未治療対照群の間で有意に変化しなかった（１９３±１３（対照）；２４９±２６（配列ＩＤ番号：２２）；１９８±１９（配列ＩＤ番号：１６））。しかし、結節の大きさには有意な変化が見られた。そのペプチドで治療された動物は、対照動物と比較して有意に小さい腫瘍結節を生じた（１１９.９±９.９５（対照）；８７.１５±５.３２、ｐ＝０.００４２（配列ＩＤ番号：２２）；７８.１±５.０３、ｐ＝０.０００３（配列ＩＤ番号：１６））。
【００４４】
実施例４
組み換えＭＩＡ タンパク質の発現および精製
ヒトＭＩＡ（Ｇ２５からＱ１３１）の１０８残基を発現している発現プラスミドｐＱＥ４０−ＭＩＡを導入された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）細胞を吸光度Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０.６まで増殖させ、１ｍＭイソプロピル−１−チオ−_−Ｄ−ガラクトピラノシドによって４時間誘導し、超音波で細胞破砕した。タンパク質は、以前に出版された通り、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）封入体から再生された（Ｊａｅｎｉｃｋｅ， Ｒ. & Ｒｕｄｏｌｐｈ， Ｒ. （１９８６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ. １３１：２１８−５０， ２１８−２５０）。再折りたたみヒトＭＩＡを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、Ｓ−セファロースファストフロー（シグマ）（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｓｉｇｍａ））でさらに精製した。最後に、ゲル濾過を スーパーデックス２００プレップグレード（シグマ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅ （Ｓｉｇｍａ））で実施した。ヒトＭＩＡを含む画分を合わせて濃縮した。精製タンパク質はＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＨＰＬＣによって検査され、純度９５％であることが示された。
【００４５】
実施例５
ＭＩＡのタンパク質結晶構造へのペプチドのドッキング
タンパク質ＭＩＡへのペプチドのバーチャルドッキングのために、配列ＩＤ番号：１〜５５のペプチド配列と、ｐｄｂコード１Ｉ１Ｊの結晶構造（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ ｅｔ ａｌ.， ２００１， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８， ５５１５−５５２０）を用いている。ペプチドとタンパク質の両方は、分子画像ソフトＳＹＢＹＬ（トライポス（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ.）セントルイス、ＵＳＡ）を用いてイオン化している。タンパク質ＭＩＡのドッキング部位はそのタンパク質にアミノ酸Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ａｓｐ２９、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ３２、Ａｒｇ４２、Ｌｅｕ５２、Ａｒｇ５７、Ｌｅｕ５８、Ｐｈｅ５９、Ｇｌｙ５７、Ｔｙｒ７８、Ｐｈｅ７９、Ｐｒｏ８０、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ８２、Ｉｌｅ８３、およびＡｒｇ８５を当てはめて定義されている。ドッキングはプログラム４スキャン（４Ｓｃａｎ）（４ＳＣ ＧｍｂＨ、マルティンスリート、ドイツ）を用いて実施した。各ペプチドについて結合エネルギーおよび結合に関与するペプチドリガンドとタンパク質の両方のアミノ酸を分析している。ペプチドリガンドは結合エネルギーで並べている。
【００４６】
結果
驚くべきことに、配列ＩＤ番号：１〜５７のリガンドペプチドは必ずしも、ＰＸＸＰのようなＳＨ３−領域共通結合配列モチーフを含まない。
【００４７】
以前に公表された結果とは対照的に、ＭＩＡタンパク質への結合に関与するアミノ酸配列モチーフ（リガンド）は、配列ＩＤ番号：０１〜１１、配列ＩＤ番号：１３〜２０、配列ＩＤ番号：２２〜３１、配列ＩＤ番号：３５〜３６、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：４０〜４４、配列ＩＤ番号：４６〜４９、配列ＩＤ番号：５１〜５７において、少なくとも１個のプロリンアミノ酸残基を有する「プロリン間配列モチーフ」と定義することができる。
【００４８】
ＭＩＡのタンパク質結晶構造（コード１Ｉ１Ｊ； Ｌｏｕｇｈｅｅｄ， ｅｔ ａｌ.， ２００１， Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９８， ５５１５−５５２０）へのペプチド配列ＩＤ番号：１〜５５のバーチャルドッキングに基づいて、「プロリン間配列モチーフ」の機能的役割およびペプチドの結合部位の両方を特定することができる。
【００４９】
すべてのペプチドは、配列ＩＤ番号：２２、４３、４８を除き、水素結合とファンデルワールス結合の両方によってその全長にわたってＭＩＡと結合し相互作用する。プロリン アミノ酸残基（リガンド） はこれらの両極のペプチド間ねじれ角に達するのに関与し、それによってリガンドの結合を支持する。プロリンは主に、水素結合でなくファンデルワールス複合体相互作用に関与する。
【００５０】
ペプチドは好ましくは、タンパク質表面のＡｒｇ４２、Ａｓｐ２９、およびＧｌｎ２８ （ヒト ＭＩＡ）の３つのアミノ酸残基に結合する。この「ＭＩＡ結合３つ組」との結合はリガンドの立体構造のねじれを強化する。驚くべきことに、Ａｒｇ４２残基（ＭＩＡ）はＳＨ３−タンパク質ファミリー内で保存されていない。
【００５１】
配列グループＡのペプチド（配列ＩＤ番号：１〜２４）は、配列グループＢ（１２.０％）と比較してより高い含量のプロリン（２２.４％）を含み、したがってタンパク質への結合のためのより高い立体構造的可塑性を示す。
【００５２】
配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）はこのことを、アミノ酸 Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒのより高い含量で埋め合わせている。配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）の、上記のＭＩＡ結合３つ組との結合は、アミノ酸残基Ｔｙｒ３０（ＭＩＡ）のこれらのアミノ酸側鎖（リガンド）とのπ相互作用によって強化される。配列グループＢのペプチド（配列ＩＤ番号：２５〜５７）は８.５％Ｔｒｐ、７.９％Ｈｉｓ、および３.０％Ｔｙｒを含む（グループＡ：２.５％Ｔｒｐ、３.８％Ｈｉｓ、０.８％Ｔｙｒ）。
【００５３】
本発明の配列グループＡおよびＢのペプチド群は高含量のＬｅｕ （１１％）、Ｓｅｒ （１０％）、およびＴｈｒ （９％）を含む。
【００５４】
配列リスト
ＭＩＡの機能の阻害は、好ましくは下記のアミノ酸配列を含む分子を用いることによって達成される：
配列リスト群：Ａ
- 配列ＩＤ番号：０１ ＶＰＨＩＰＰＮ
- 配列ＩＤ番号：０２ ＭＰＰＴＱＶＳ
- 配列ＩＤ番号：０３ ＱＭＨＰＷＰＰ
- 配列ＩＤ番号：０４ ＱＰＰＦＷＱＦ
- 配列ＩＤ番号：０５ ＴＰＰＱＧＬＡ
- 配列ＩＤ番号：０６ ＩＰＰＹＮＴＬ
- 配列ＩＤ番号：０７ ＡＶＲＰＡＰＬ
- 配列ＩＤ番号：０８ ＧＡＫＰＨＰＱ
- 配列ＩＤ番号：０９ ＱＱＬＳＰＬＰ
- 配列ＩＤ番号：１０ ＧＰＰＰＳＰＶ
- 配列ＩＤ番号：１１ ＬＰＬＴＰＬＰ
- 配列ＩＤ番号：１２ ＱＬＮＶＮＨＱＡＲＡＤＱ
- 配列ＩＤ番号：１３ ＴＳＡＳＴＲＰＥＬＨＹＰ
- 配列ＩＤ番号：１４ ＴＦＬＰＨＱＭＨＰＷＰＰ
- 配列ＩＤ番号：１５ ＶＰＨＩＰＰＮＳＭＡＬＴ
- 配列ＩＤ番号：１６ ＲＬＴＬＬＶＬＩＭＰＡＰ
- 配列ＩＤ番号：１７ ＲＫＬＰＰＲＰＲＲ
- 配列ＩＤ番号：１８ ＶＬＡＳＱＩＡＴＴＰＳＰ
- 配列ＩＤ番号：１９ ＴＰＬＴＫＬＰＳＶＮＨＰ
- 配列ＩＤ番号：２０ ＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴ
- 配列ＩＤ番号：２１ ＥＱＤＳＲＱＧＱＥＬＴＫＫＧＬ
- 配列ＩＤ番号：２２ ＥＴＴＩＶＩＴＷＴＰＡＰＲ
- 配列ＩＤ番号：２３ ＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴ
- 配列ＩＤ番号：２４ ＮＳＬＬＶＳＷＱＰＰＲＡＲ
配列ＩＤ番号：０１から配列ＩＤ番号：２４はＳｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ.， ２００１， ＥＭＢＯ Ｊ. ２０： ３４０−３４９によって公表されたペプチドを指し、ここで配列ＩＤ番号：０１から配列ＩＤ番号：１６はファージディスプレイによって得られた。
配列ＩＤ番号：１７から配列ＩＤ番号：２４は本研究で試験した他のペプチドであり、対照ペプチド（配列ＩＤ番号：２０および配列ＩＤ番号：２１）、ＰＩ３キナーゼＳＨ３領域結合ペプチド（配列ＩＤ番号：１７）およびフィブロネクチン由来ペプチド（配列ＩＤ番号：２２から配列ＩＤ番号：２４）を含む。
配列リスト群： Ｂ
- 配列ＩＤ番号：２５ ＹＮＬＰＫＶＳＳＮＬＳＰ
- 配列ＩＤ番号：２６ ＭＰＰＴＱＶＳＫＦＲＬＩ
- 配列ＩＤ番号：２７ ＡＮＩＤＡＴＰＬＦＬＲＡ
- 配列ＩＤ番号：２８ ＬＬＲＴＴＥＴＬＰＭＦＬ
- 配列ＩＤ番号：２９ ＳＡＬＥＰＬＶ
- 配列ＩＤ番号：３０ ＧＳＰＴＰＮＡ
- 配列ＩＤ番号：３１ ＡＰＳＨＡＴＨ
- 配列ＩＤ番号：３２ ＴＴＶＧＨＳＤ
- 配列ＩＤ番号：３３ ＴＨＦＳＴＦＴ
- 配列ＩＤ番号：３４ ＳＬＬＬＤＴＳ
- 配列ＩＤ番号：３５ ＳＶＡＭＫＡＨＫＰＬＬＰ
- 配列ＩＤ番号：３６ ＮＴＩＰＧＦＡＳＫＳＬＤ
- 配列ＩＤ番号：３７ ＶＳＮＹＫＦＹＳＴＴＳＳ
- 配列ＩＤ番号：３８ ＶＳＲＨＱＳＷＨＰＨＤＬ
- 配列ＩＤ番号：３９ ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲ
- 配列ＩＤ番号：４０ ＨＮＡＳＰＳＷＧＳＰＶＭ
- 配列ＩＤ番号：４１ ＳＨＰＷＮＡＱＲＥＬＳＶ
- 配列ＩＤ番号：４２ ＨＨＷＰＦＷＲＴＬＰＬＳ
- 配列ＩＤ番号：４３ ＷＨＴＫＦＬＰＲＹＬＰＳ
- 配列ＩＤ番号：４４ ＮＮＴＳＦＴＶＶＰＳＶＰ
- 配列ＩＤ番号：４５ ＳＨＬＳＴＷＫＷＷＱＮＲ
- 配列ＩＤ番号：４６ ＦＨＷＨＰＲＬＷＰＬＰＳ
- 配列ＩＤ番号：４７ ＷＨＷＴＹＧＷＲＰＰＡＭ
- 配列ＩＤ番号：４８ ＦＨＷＲＹＰＬＰＬＰＧＱ
- 配列ＩＤ番号：４９ ＷＨＷＰＬＦＩＰＮＴＴＡ
- 配列ＩＤ番号：５０ ＷＨＮＧＩＷＷＨＹＧＶＲ
- 配列ＩＤ番号：５１ ＨＨＬＮＹＬＷＰＷＴＲＶ
- 配列ＩＤ番号：５２ ＦＷＨＲＷＳＴＦＰＥＱＰ
- 配列ＩＤ番号：５３ ＷＨＭＳＹＦＷＴＲＰＰＱ
- 配列ＩＤ番号：５４ ＦＨＬＮＷＰＳＲＡＤＹＬ
- 配列ＩＤ番号：５５ ＷＨＫＮＴＮＷＰＷＲＴＬ
- 配列ＩＤ番号：５６ ＡＬＳＰＳＱＳＨＰＶＲＳ
- 配列ＩＤ番号：５７ ＧＴＱＳＴＡＩＰＡＰＴＤ
配列ＩＤ番号：２５から配列ＩＤ：番号５７はファージディスプレイによって得られた。
抗インテグリン抗体リスト
ＭＩＡの機能の阻害はまた下記の抗α４−および抗α５−インテグリン−抗体不活性化の使用によって達成されることが好ましい：
抗体ＮＯ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）
抗体ＮＯ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
抗体ＮＯ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）
抗体ＮＯ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は抗α４−および抗α５−インテグリン阻害抗体のＭＩＡとの特異的交差反応を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＡと結合する抗体または抗体フラグメントを含む薬物。
【請求項２】
抗体がα４およびα５−インテグリンに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の薬物。
【請求項３】
抗体が
抗体Ｎｏ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）
抗体Ｎｏ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
抗体Ｎｏ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）
抗体Ｎｏ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２の薬物。
【請求項４】
さらに免疫刺激物質、化学治療剤、遺伝子治療剤、抗血管新生剤、抗浸潤剤およびワクチン剤から成る群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１から３のいずれか１つに記載の薬物。
【請求項５】
固形腫瘍、白血病、変性疾患、免疫抑制疾患から成る群から選択される疾患の予防または治療に使用される、請求項１から４のいずれか１つに記載の薬物。
【請求項６】
固形腫瘍が黒色腫および他のＭＩＡ過剰発現腫瘍である、請求項５に記載の薬物。
【請求項７】
ＭＩＡの阻害に使用される、α４−および／またはα５−インテグリンに対して向けられた抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
前駆体細胞の刺激および／または誘導に使用される、α４−および／またはα５−インテグリンに対して向けられた抗体または抗体フラグメント。
【請求項１】
ＭＩＡと結合する抗体または抗体フラグメントを含む薬物。
【請求項２】
抗体がα４およびα５−インテグリンに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の薬物。
【請求項３】
抗体が
抗体Ｎｏ.１：抗α４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）
抗体Ｎｏ.２：抗α４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
抗体Ｎｏ.３：抗α５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）
抗体Ｎｏ.４：抗α５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））
から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２の薬物。
【請求項４】
さらに免疫刺激物質、化学治療剤、遺伝子治療剤、抗血管新生剤、抗浸潤剤およびワクチン剤から成る群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１から３のいずれか１つに記載の薬物。
【請求項５】
固形腫瘍、白血病、変性疾患、免疫抑制疾患から成る群から選択される疾患の予防または治療に使用される、請求項１から４のいずれか１つに記載の薬物。
【請求項６】
固形腫瘍が黒色腫および他のＭＩＡ過剰発現腫瘍である、請求項５に記載の薬物。
【請求項７】
ＭＩＡの阻害に使用される、α４−および／またはα５−インテグリンに対して向けられた抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
前駆体細胞の刺激および／または誘導に使用される、α４−および／またはα５−インテグリンに対して向けられた抗体または抗体フラグメント。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２４７９０９（Ｐ２００８−２４７９０９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９５０９３（Ｐ２００８−９５０９３）
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【分割の表示】特願２００３−５６４０７７（Ｐ２００３−５６４０７７）の分割
【原出願日】平成１４年１月２９日（２００２．１．２９）
【出願人】（５０４２８２７４０）アンティセンス ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【分割の表示】特願２００３−５６４０７７（Ｐ２００３−５６４０７７）の分割
【原出願日】平成１４年１月２９日（２００２．１．２９）
【出願人】（５０４２８２７４０）アンティセンス ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【Ｆターム（参考）】
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