アチサン骨格を有するジテルペン化合物、その製造方法及びこれを含む医薬組成物
【課題】新たなサイトカイン産生制御剤の提供。
【解決手段】式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物又はサイトカイン産生制御剤。式（１）
（式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表わす。）
【解決手段】式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物又はサイトカイン産生制御剤。式（１）
（式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、又は、Ｃ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表わす。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アチサン骨格を有するジテルペン化合物を含む医薬組成物及びサイトカイン産生制御剤に関する。
また、本発明は、アチサン骨格を有するジテルペン化合物の製造方法に関する。
さらに、本発明は、アチサン骨格を有する新規なジテルペン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインとは、細胞から分泌され、細胞間の情報伝達に働く低分子量のタンパク質の総称である。
サイトカインの生理機能としては、免疫応答の制御作用、抗腫作用、抗ウィルス作用、細胞増殖・分化の調節作用等が挙げられ、その産生バランスが崩れると、様々な疾患の発症や進展をもたらすことが知られている。例えば、サイトカインが過剰産生すると、リウマチ、骨粗鬆症、動脈硬化症、糖尿病合併症等の慢性疾患が発症することが分かっている。
【０００３】
また、サイトカインは免疫療法剤、増血剤として使用され、サイトカインを投与することによって、各種疾患の治療効果が得られることも知られている。しかし、大量のサイトカインを生体組織から単離したり高純度で生産することは難しく、外部からのサイトカインの投与はあまり実用的ではない。
【０００４】
そのため、生体内におけるサイトカインの産生を抑制したり、促進させたりすることのできるサイトカイン産生制御剤が必要とされている。
【０００５】
ところで、サイトカイン等のヒトの自然免疫系に作用する有効成分を感度よくスクリーニングする方法として、ショウジョウバエを用いたスクリーニング方法が知られている（特許文献１）。そして、この方法を利用して、サイトカインの１種であるケモカインの産生を阻害する化合物が見い出されている（特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１２１１５５号公報
【特許文献２】特開２００５−１８７４５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、ケモカイン以外にも多数のサイトカインが存在し、用途によっては、サイトカインの産生阻害だけではなく、産生促進が必要となる場合がある。したがって、特許文献２に記載の化合物だけでは、生体内におけるサイトカインの産生を十分に制御することはできない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、種々のサイトカインの産生を抑制したり、促進させたりすることのできる新たなサイトカイン産生制御剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、サイトカインの産生異常や免疫低下に起因する各種疾患等の予防薬又は治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために様々な物質をスクリーニングした結果、アチサン骨格を有する式（１）で表わされるジテルペン化合物がサイトカイン産生に影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、アチサン骨格を有する式（１）で表わされるジテルペン化合物を、バンレイシ科、バンレイシ属の植物であるチェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）からの抽出物からの単離により製造できることを見い出した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、各種サイトカインの産生を抑制したり促進させることができるので、サイトカインの産生異常により発生する種々の疾患を予防又は治療したり、生体に免疫を賦活することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明について具体的に説明する。
本発明の医薬組成物、サイトカイン産生制御剤は、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む。
【００１２】
式（１）
【化７】
【００１３】
式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して制御（抑制又は促進）作用を示す。
ここで、本発明のサイトカイン産生制御剤が産生を制御できるサイトカインに限定はないが、特に、ＮＦ−κＢやＮＦ−ＡＴ等の転写因子により発現誘導されるサイトカインに対して強い制御作用を示す。このようなサイトカイン類としては、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２３、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＭＣＰ−１、ＭＣＡＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＧＲＯ−α等が挙げられるが、これに限定されない。
【００１４】
式（１）において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ、１〜３位、６、７位、１１〜１５位の炭素に結合した水素のいずれかと置換してもよい置換基であり、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表す。
また、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数であり、好ましくは、ｎ＝ｍ＝ｌ＝０である。
【００１５】
式（１）において、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表す。
式（１）で表されるジテルペン化合物は、Ｒ１を適宜選択することにより、そのサイトカイン産生制御作用の程度を調整することができる。
例えば、Ｒ１が、水素又はアセチル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物のサイトカイン産生制御作用が大きくなる。特に、式（１）で表されるジテルペン化合物のうち、Ｒ１がアセチル基であるもの、例えば、以下の式（３）で表されるジテルペン化合物は、サイトカイン産生制御作用が極めて大きい。なお、式（３）で表されるジテルペン化合物は新規化合物である。
【００１６】
式（３）
【化８】
【００１７】
式（１）において、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基であり、好ましくは、メトキシカルボニル基、アルデヒド基、ヒドロキシメチル基である。
式（１）で表されるジテルペン化合物においては、Ｒ２を適宜選択することにより、そのサイトカイン産生制御作用が産生抑制であるか産生促進であるかを決定することができる。
例えば、Ｒ２がメトキシカルボニル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物は低濃度領域でサイトカイン産生促進効果を示す。
一方、Ｒ２がアルデヒド基やヒドロキシメチル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物はサイトカイン産生抑制作用を示す。
【００１８】
また、Ｒ１が水素で、Ｒ２がアルデヒド基であるジテルペン化合物５（後述する）は、高濃度領域においてはサイトカイン産生制御活性を失うか、又は、サイトカイン産生制御活性が転換する。
このように、式（１）で表されるジテルペン化合物は、Ｒ１とＲ２を適宜組み合わせることにより、様々なサイトカイン産生制御作用を示すことができる。
【００１９】
また、式（１）で表されるジテルペン化合物は、特に、式（２）の立体構造式で表される立体構造を有することが好ましい。
【００２０】
式（２）
【化９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【００２１】
なお、本発明において、「Ｃ１−Ｃ６炭化水素基」とは、炭素数が１ないし６個の直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和の炭化水素基をいい、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−エチルブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基等のアルケニル基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−エチニル−２−プロピニル基、１−メチル−２−プロピニル基等のアルキニル基等が挙げられる。
好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基である。
【００２２】
本発明において、「Ｃ１−Ｃ６アシル基」とは、水素又は炭素数が１ないし５個の直鎖状または分枝状の炭化水素基の末端にカルボニル基が結合した基をいい、例えば、アルデヒド基（ホルミル基）、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバロイル基等が挙げられる。
好ましくは、アルデヒド基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバロイル基である。
【００２３】
本発明において、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基」とは、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基の末端にカルボニル基が結合した基をいう。
ここで、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基とは、炭素数が１ないし５個の直鎖状または分枝状の炭化水素基の末端に酸素原子が結合した基をいい、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉｓｏ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，１−ジメチルプロポキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｉｓｏ−ヘキシルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、１−エチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、１，１，２−トリメチルプロポキシ基、１，２，２−トリメチルプロポキシ基、１−エチル−１−メチルプロポキシ基、１−エチル−２−メチルプロポキシ基等が挙げられる。
好ましい「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基」は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉｓｏ−プロポキシカルボニル基である。
【００２４】
本発明において、「置換基を有していてもよい」「基」とは、その基の一部の水素が他の置換基で置換されていてもよいものをいう。
このような置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、オキソ基、アルコキシ基等が挙げられる。
【００２５】
以下に、式（１）で表されるジテルペン化合物の特に好ましい具体例を示す。
【００２６】
ジテルペン化合物１
【化１０】
【００２７】
ジテルペン化合物２
【化１１】
【００２８】
ジテルペン化合物３
【化１２】
【００２９】
ジテルペン化合物４
【化１３】
【００３０】
ジテルペン化合物５
【化１４】
【００３１】
ジテルペン化合物６
【化１５】
【００３２】
次に、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物、サイトカイン産生制御剤について説明する。
【００３３】
式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して抑制又は促進作用を示すので、ヒト又はヒト以外の動物のサイトカインの産生異常に起因する疾患の治療又は予防のための医薬組成物の有効成分として使用することができる。
このようなサイトカインの産生異常に起因する疾患としては、例えば、ウイルス感染症、心筋梗塞、リウマチ、骨粗鬆症、動脈硬化症、糖尿病合併症、敗血症、多発性骨髄腫、心房粘液腫、子宮頚癌、臓器移植後拒絶反応、肝硬変、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）等が挙げられる。
【００３４】
式（１）で表されるジテルペン化合物がサイトカインの産生を促進するものである場合には、これを投与した生体に免疫を賦活することができるので、免疫低下に起因する疾患の予防のための医薬組成物の有効成分として使用することができる。このような免疫低下に起因する疾患としては、例えば、インフルエンザやスペイン風邪等が挙げられる。また、臓器移植の際に用いられる獲得免疫抑制剤（例えば、タクロリムス、サイクロスポリン等）により抵抗力が低下した状態にある患者に対し、式（１）で表されるジテルペン化合物を投与することにより、感染症を抑制することもできる。
【００３５】
また、式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して抑制又は促進作用を示すので、サイトカイン産生制御剤（サイトカイン産生抑制剤又はサイトカイン産生促進剤）として使用することができる。
【００３６】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤は、例えば、免疫賦活剤として、健康食品等の食品（飲料を含む）や飼料等に添加することができる。
また、式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤は、抗昆虫剤として、農薬等に添加することができる。本発明のサイトカイン産生制御剤を予め農作物に散布しておくと、農作物に集まった昆虫の免疫機能を低下させることができるので、農作物の病気が発生した場合、免疫機能の低下した昆虫は病気に感染し、健康な農作物に病原菌等を伝播させることなく死滅し、被害の発生を最小限に抑えることができる。また、農作物に被害を与える病原昆虫については、免疫機能が低下しているため通常よりも少量の殺虫剤によって安易に駆除できる。
【００３７】
式（１）で表されるジテルペン化合物を医薬組成物やサイトカイン産生制御剤として用いる場合、式（１）で表されるジテルペン化合物をそのまま、又は、慣用の担体・添加剤等と共に、ヒト又はヒト以外の動物に投与することができる。
【００３８】
その投与量は、ジテルペン化合物の種類、投与目的、投与対象（患者の症状、年齢、体重、性別等）等に応じて適宜決定することができ、例えば、成人１日当たり１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲とするのが好ましい。この場合、１日１回又は数回に分けて投与することができる。
式（１）で表されるジテルペン化合物が、添加濃度に依存してサイトカインの産生制御作用が変化するもの、例えば、ジテルペン化合物５、である場合には、投与量を適宜調整することにより、サイトカイン産生制御作用を調整することができる。
【００３９】
また、その投与方法に限定はなく、経口又は非経口的に投与することができる。
さらに、投与剤型は、投与方法、投与目的、投与対象（患者の症状、年齢、体重等）等に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、トローチ剤、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
【００４０】
これらの製剤は、いずれも慣用の製剤技術（例えば、日本薬局方に規定する方法等）によって製造することができる。
これらの製剤は、薬学的に許容されている添加物を含むことができる。このような薬剤学上許容されている添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解促進剤、懸濁剤、乳化剤等が挙げられる。
【００４１】
次に、式（１）で表されるジテルペン化合物の製造方法について説明する。
本発明においては、バンレイシ科、バンレイシ属の植物であるチェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）から抽出物を抽出する工程と、該抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程と、を含む方法により式（１）で表されるジテルペン化合物を製造することができる。
【００４２】
本発明において原料として用いるチェリモヤは、生のものでもよいし、乾燥物であってもよいが、小片化した乾燥物であることが好ましい。
また、チェリモヤの抽出部位としては、ジテルペン化合物を有意量含有している部位であれば限定はなく、例えば、果実、茎、葉、根、花又は種子等の任意の部位が挙げられるが、果実が好ましく、特に、果皮、種子を取り除いた果肉が好ましい。
【００４３】
チェリモヤから抽出物を抽出する方法に限定はなく、例えば、液相抽出、気相抽出等が挙げられる。
液相抽出の場合、抽出溶媒としては、チェリモヤに含まれる式（１）で表されるジテルペン化合物を抽出できるものであれば限定はない。しかし、式（１）で表されるジテルペン化合物は難水溶性であるものが多いため、抽出溶媒としては、有機溶媒が好ましく、特にエタノール、メタノール等の低級アルコールが好ましい。
【００４４】
抽出温度、抽出時間は、チェリモヤの抽出部位や粉砕・切断の程度、抽出方法、抽出溶媒の種類等に応じて適宜決定できるが、目安としては、抽出温度は４〜６０℃程度であり、抽出時間は３０分〜１０日間程度である。
【００４５】
得られた抽出物からジテルペン化合物を単離する方法に限定はなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、高速液体クロマトグラフィーやシリカゲルカラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーによって分離することができる。
カラムクロマトグラフィーに用いる展開溶媒としては、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム等を慣用の展開溶媒を用いることができる。
【００４６】
カラムクロマトグラフィーを用いて化合物を単離するには、カラムクロマトグラフィーによって分離した複数の画分（フラクション）の中から、目的の化合物を含む画分を選択する必要がある。本発明においては、各画分のサイトカイン産生抑制又は産生促進作用を測定し、最も強いサイトカイン産生抑制又は促進作用を示す画分を選択することにより、式（１）で表されるジテルペン化合物を含有する画分を選択することができる。
もっとも、クロマトグラフィーで分離するたびに、各画分のサイトカイン産生抑制又は促進作用を測定することは煩雑である。そこで、本発明においては、式（１）で表されるジテルペン化合物を含有する画分を選択するための指標として、サイトカイン産生抑制又は産生促進作用に代えて、特許文献１に記載されるようなショウジョウバエを用いた自然免疫活性評価系により評価される自然免疫活性を利用することが好ましい。
【００４７】
本発明においては、チェリモヤの抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程の後に、さらに、単離したジテルペン化合物の一部の官能基、特に、４位、１７位に結合する置換基（Ｒ１、Ｒ２）、を公知の方法により他の置換基に変換する工程を設け、チェリモヤから抽出したジテルペン化合物から所望のサイトカイン産生制御作用を有するジテルペン化合物に変換してもよい。
ここで、公知の方法としては、例えば、還元処理、脱アセチル化処理等が挙げられるが、これに限定されない。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
なお、実施例において用いた装置、試薬、表記方法は以下のとおりである。
比旋光度は日本分光Ｐ−１０３０型旋光計を用いて測定した。マススペクトルは日本電子ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ ３０３型質量分析計及びＪＭＳ−７００型質量分析計を使用した。ＮＭＲスペクトルの測定は日本電子ＪＥＯＬ ＥＣＡ−６００型核磁気共鳴装置及びＪＥＯＬ ＡＬ−４００型核磁気共鳴装置を使用し、内部標準物質としてＴＭＳを用いた。化学シフト値はｐｐｍで表し、結合様式は、一重線：ｓ、二重線：ｄ、三重線：ｔ、四重線：ｑ、二分裂した二重線：ｄｄ、多重線：ｍ、幅広いシグナル：ｂｒ．で表した。カラムクロマトグラフィーはＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（７０−２３０ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ、Ｍｅｒｃｋ）、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ（ｎａｃａｌａｉ）を用いた。ＧＰＣ ＨＰＬＣはＬＣ−９０８Ｗ（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用い、そのカラムとしてＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（φ２０ｍｍｘ６００ｍｍ）（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＪＡＩＧＥＬ−１Ｈ（φ２１．５ｍｍｘ５００ｍｍ）（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いた。ＴＬＣはＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ２５４（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）、ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ ＲＰ−１８ Ｆ２５４Ｓ（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）を用い、検出はＵＶ（２５４，３６５ｎｍ）照射下における蛍光及びアニスアルデヒド硫酸溶液噴霧後の加熱発色により行った。試薬は、市販のものを精製せずにそのまま用いた。
【００４９】
[参考例１] 自然免疫活性の評価
以下の実施例において、カラムクロマトグラフィーにより分離した複数の画分の中から、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む画分を選択する際に利用した各試料（画分）の自然免疫活性を評価するために、各試料について自然免疫系の抗菌ペプチドであるディプテリシン遺伝子のレポータータンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの発現量を測定した。具体的な手順を以下に示す。
（ｉ）培地の調製
ショウジョウバエの脂肪体を培養するための培地として、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ‘ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（ＧＩＢＣＯ）（ショウジョウバエの細胞培養用培地）に、２０％の牛胎児血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）と、１％の抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ： ＧＩＢＣＯ）を添加したものを用意した。
自然免疫の活性化に用いるリポ多糖（ＬＰＳ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように精製水に溶解し、培地中に最終濃度が１％（１０μｇ／ｍＬ）となるように添加した。また、試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液とし、培地中に最終濃度が０．５％（０．５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。
【００５０】
（ｉｉ）解剖と培養
ショウジョウバエの雌のみを選択し、頭部を切断して抗菌ペプチドの産生器官である脂肪体を露出させた。このようにして得た脂肪体を、１ウェルあたり１００μＬの培地の入った９６ウェルプレートの各ウェルに１匹ずつ入れ、２５℃で１２時間培養した。なお、培養は１試料につき、６匹分行った。
（ｉｉｉ）β−ガラクトシダーゼ定量に用いる分析試料の調製
１２時間培養した後、脂肪体を２００μＬのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．８）の入った５００μＬのエッペンドルフチューブに入れ、超音波破砕機（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ ＸＬ ： ＭＩＳＯＮＩＸ）を用いてホモジナイズしてβ−ガラクトシダーゼを抽出した。次いで、抽出物を遠心分離（９１７０×ｇ、１０ｍｉｎ．、４℃ ＭＸ−３００：ＴＯＭＹ）し、上清１６０μＬを採取し、分析試料とした。
（ｉｖ）β−ガラクトシダーゼの定量
（ｉｉｉ）で得た分析試料中のβ−ガラクトシダーゼを、酵素反応により定量した。
検量線作成用標準溶液として、β−ガラクトシダーゼを０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）＋ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで希釈して、β−ガラクトシダーゼの濃度間隔が１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬとなるように調製した溶液を用意した。標準溶液及び分析試料を測定用チューブに２０μＬずつ分注し、それらに酵素の基質であるＧａｌａｃｔｏｎ ｐｌｕｓ（ＴＲＯＰＩＸ）をｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで８０倍に希釈したものを８０μＬ添加して、正確に１時間、室温で撹拌した。その後、標準溶液及び分析試料にｅｎｈａｎｃｅｒであるＥｍｅｒａｌｄ ＩＩ（ＴＲＯＰＩＸ）を０．２５Ｍ ＮａＯＨで８倍に希釈したものを１００μＬ加え、直ちにルミノメーター（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ ９６Ｖ：Ｂｅｌｔｈｏｌｄ）で標準溶液及び分析試料の化学発光を測定した。標準溶液を用いて作成した検量線を利用して、分析試料中のβ−ガラクトシダーゼの量を定量した。
【００５１】
（ｖ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質の定量
ショウジョウバエの脂肪体の大きさの個体差を補正するため、それぞれの分析試料のタンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ量を算出した。
検量線作成用標準溶液として、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを精製水で希釈して、ＢＳＡ濃度が０．５、０．４、０．２５、０．１２５、０．０５（ｍｇ／ｍＬ）となるように調製した溶液を用意した。標準溶液及び分析試料を１０μＬずつ９６ウェルプレートに分注し、それらに５倍希釈したｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ）２００μＬを加えて室温で約１０分間放置した後、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥＲＥＡＤＥＲ ＭＯＤＥＬ ６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、標準溶液及び分析試料の５９５ｎｍの吸光度を測定した。標準溶液を用いて作成した検量線を利用して、分析試料中のタンパク質量を定量し、分析試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ量を算出した。
（ｖｉ）評価
１試料につき６匹分の培養を行い、それらの分析試料のうち、単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量が最大のものと最小のものを除いた４つの分析試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を算出し、これを用いて自然免疫活性を評価した。
培地にＤＭＳＯとＬＰＳのみを添加した対照試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を１００％、培地にＤＭＳＯのみを添加したブランク試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を０％として、各試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量を対照試料に対する相対値（％）で表し、これを各試料の自然免疫活性を評価する値とした。
【００５２】
[参考例２] 細胞毒性の評価（細胞生存率の測定）
以下の実施例において、試料の細胞毒性は以下のようにして評価した。
（ｉ）培地の調製
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ‘ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（ＧＩＢＣＯ）に、牛胎児血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を２０％（ｖ／ｖ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ）を１％（ｖ／ｖ）となるように加えて培地を調製した。
この培地中に、ＤＭＳＯに溶解させた試料を最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）になるように添加した。また、対照試料として、培地中にＤＭＳＯのみを添加したものを用意した。
（ｉｉ）細胞の培養
９６ウェルプレートの各ウェルに、試料を添加した培地を１００μＬずつ分注し、その中にＳ２細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように蒔いた。また、ブランク試料として、細胞を蒔かないものを用意した。その後、２５℃で２４時間培養を行った。
なお、細胞の培養は、一試料につき６ウェルずつ行った。
（ｉｉｉ）生細胞数の測定
２４時間培養後、ＭＴＴ試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を各ウェルに１０μＬずつ分注した。分注直後に、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥＲＥＡＤＥＲ ＭＯＤＥＬ ６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した（０ｈの吸光度とする）。その後、２５℃で４時間培養を行い、再び４５０ｎｍの吸光度を測定した（４ｈの吸光度とする）。
（ｉｖ）評価
各ウェルの４ｈの吸光度から０ｈの吸光度を差し引き、培地にＤＭＳＯのみを添加した対照試料の吸光度変化を１００％、培地のみで細胞を蒔いていないブランク試料の吸光度変化を０％として、各ウェルの吸光度変化を対照試料に対する相対値（％）で表した。６ウェルの生細胞生存率の平均値を算出し、これを試料の生細胞生存率とした。
【００５３】
[実施例１] 式（１）で表されるジテルペン化合物１の製造及び同定
（ジテルペン化合物１の製造）
（ｉ）抽出工程
チェリモヤ果肉の凍結乾燥物３８６．６１ｇを２Ｌのメタノール（ＭｅＯＨ）を加え、７０ｒｐｍで攪拌しながら室温で１日抽出した。抽出したＭｅＯＨを濾過し、これを減圧濃縮して、ＭｅＯＨ抽出物１６９．５１ｇを得た。
このＭｅＯＨ抽出物に１３００ｍＬの水を加え、１３００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いて３回抽出し、ＥｔＯＡｃ層を減圧留去して、ＥｔＯＡｃ可溶画分２１．５ｇを得た。
【００５４】
（ｉｉ）単離工程
（ｉ）で得た酢酸エチル可溶画分から、図１に示す手順で白色固体物質ＡＣ−１を単離した。
まず、ＥｔＯＡｃ可溶画分（２１．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ−１（６７０９．１ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−９：１））、Ｅ−２（６０７３．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ−３（４１８８．０ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ−４（１４５６．０ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ−５（１０８４．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ−６（１４５０．３ｍｇ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（４：１））、Ｅ−７（５２５．８ｍｇ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（４：１−０：１））、Ｅ−８（７２２．４ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を、参考例１に記載した手順で試料濃度３．３μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ−４が最も強く自然免疫を抑制した。
次に、画分Ｅ−４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４−１（１５２．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−９：１））、Ｅ４−２（１１４．３ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（９：１−４：１））、Ｅ４−３（９３．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４−４（２８２．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１−２：１））、Ｅ４−５（５９０．５ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１−１：１））、Ｅ４−６（１０７．６ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ４−７（９４．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ４−８（９１．５ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を、試料濃度０．５μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ４−５が最も強く自然免疫を抑制した。
【００５５】
続いて、画分Ｅ４−５をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４５−１（２２．８ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−２（９６．７ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−３（１０６．１ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−４（１５０．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−５（６７．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅＥｔＯＡｃ（４：１−２：１））、Ｅ４５−６（１０９．６ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１−１：１））、Ｅ４５−７（４８．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を試料濃度０．５μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ４５−２及び３が最も強く自然免疫を抑制した。
さらに、この画分４５−２とＥ４５−３を混合してシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４５２−１（１．０ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：２−０：１））、Ｅ４５２−２（８２．８ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−３（２３．２ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−４（２７．４ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−５（５６．１ｍｇ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：０−４９：１））、Ｅ４５２−６（９．７ｍｇ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（４９：１））、Ｅ４５２−７（２．８ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を試料濃度０．５μｇ／ｍＬとして測定した結果、画分Ｅ４５２−３及び４が最も強く自然免疫を抑制した。
なお、画分Ｅ４５２−３及び４、特に、画分Ｅ４５２−３は、試料濃度５．０μｇ／ｍＬにおいて細胞生存率に影響を与えなかった。以下に、画分Ｅ４５２−１〜７の自然免疫活性と細胞生存率を示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
画分Ｅ４５２−３及び４について、それぞれ、薄層クロマトグラフィーを用いて分析を行った結果、これらの中に２種の物質が共通に含まれていることが判明した。そこで画分Ｅ４５２−３をＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０、Ｅｌｕｔａｎｔ：ＣＨ３ＣＮ、Ｆｌｏｗｒａｔｅ：５ｍＬ／ｍｉｎ）で分離し、画分Ｅ４５２３−１（０．３ｍｇ）、Ｅ４５２３−２（１８．８ｍｇ）、Ｅ４５２３−３（０．５ｍｇ）、Ｅ４５２３−４（１．１ｍｇ）を得た。次いで、画分Ｅ４５２３−２をＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：ＪＡＩＧＥＬ−１Ｈ、Ｅｌｕｔａｎｔ：ＣＨＣｌ３、Ｆｌｏｗｒａｔｅ：３．５ｍＬ／ｍｉｎ）で分離し、画分Ｅ４５２３２−１（０．１ｍｇ）、Ｅ４５２３２−２（０．７ｍｇ）、Ｅ４５２３２−３（４．０ｍｇ）、Ｅ４５２３２−４（９．８ｍｇ）、Ｅ４５２３２−５（２．１ｍｇ）、Ｅ４５２３２−６（０．１ ｍｇ）、Ｅ４５２３２−７（０．２ｍｇ）を得た。さらに画分Ｅ４５２３２−３、４及び５を混合してシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−４：１）、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２０：３）の溶出画分より白色固体であるＡＣ−１（４．３ｍｇ）を単離した。
【００５８】
（ジテルペン化合物１の同定）
ＡＣ−１についてＨＲＥＩＭＳを測定したところ、ｍ／ｚ３９２．２５５０に分子イオンピークが観測された。これにより、ＡＣ−１の分子式はＣ２３Ｈ３６Ｏ５であると推測した。
次いで、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、及びＨＭＱＣスペクトルより、ＡＣ−１中には、２個のエステルカルボニル炭素、１個の酸素原子が結合した４級炭素、１個のオキシメチレン炭素、１個のメトキシル炭素、３個の４級炭素、９個のメチレン炭素、３個のメチン炭素及び３個のメチル炭素が存在することが判明した。
続いて、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹより、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１６】
【００５９】
そこでまず、Ａ環部をＨＭＢＣスペクトルにより解析した。
ＨＭＢＣスペクトルでは、Ｈ−１８からＣ−３、−４、−５及び−１９への相関が観測され、これにより、Ｃ−３〜５、１８、１９の間に結合が存在することが明らかとなった。また、メトキシ基のプロトンからＣ−１９への相関が観測され、これにより、Ｃ−１９がメトキシカルボニルを形成していることが判明した。さらに、Ｈ−２０からＣ−１、−５、−９及び−１０への相関が観測され、これにより、Ｃ−１、５、９、１０、２０の間に結合が存在することが明らかとなった。さらにまた、Ｈ−１からＣ−２、３への相関が観測され、これにより、Ｃ−１〜３の間に結合が存在することが判明し、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１７】
【００６０】
次に、Ｃ環部をＨＭＢＣスペクトルにより解析した。
ＨＭＢＣスペクトルでは、Ｈ−１７からＣ−１２、−１５、−１６及びアセチル基のカルボニル炭素への相関が観測され、これにより、Ｃ−１２、１５、１６、１７の間に結合が存在することと、Ｃ−１７にアセチル基が結合していることが判明した。また、Ｈ−１３からＣ−８、−１４への相関、及び、Ｈ−１５からＣ−８への相関が観測され、これにより、Ｃ−１３−Ｃ−１４−Ｃ−８−Ｃ−１５間に結合が存在することが明らかとなり、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１８】
【００６１】
最後に、Ａ、Ｃ環部を連結したＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−１１からＣ−８、−９への相関及びＨ−１５からＣ−９への相関が観測され、これにより、Ｃ−１１−Ｃ−９−Ｃ−８、の間に結合が存在することが明らかとなった．また、Ｈ−６、１５からＣ−７への相関、及び、Ｈ−７からＣ−８への相関が観測され、これにより、Ｃ−６−Ｃ−７−Ｃ−８の間に結合が存在することが判明した。以上より、ＡＣ−１は、以下に示す平面構造であることが判明した。
【化１９】
【００６２】
ＡＣ−１の１７位においてアセトキシ基の代わりに水酸基が結合している化合物（ｍｅｔｈｙｌ １７−ｈｙｄｒｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ｏａｔｅ）は既知である。そこで、該既知化合物とＡＣ−１を比較するため、ＡＣ−１にメタノール中で炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、ＡＣ−１の１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ＡＣ−１´を得た。このようにして誘導したＡＣ−１´の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び比旋光度（［α］Ｄ２４−６３．９（ｃ０．３９０、ＣＨＣｌ３））を測定したところ、既知化合物のデータ（［α］Ｄ１９−８１．３（ｃ０．８、ＣＨＣｌ３））と一致した。これにより、ＡＣ−１が、ジテルペン化合物１（ｍｅｔｈｙｌ １７−ａｃｅｔｏｘｙ−１６β−ａｃｅｔｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ｏａｔｅ）であることが確認できた。
【００６３】
以下に、ＡＣ−１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを示す。
【表２】
【００６４】
[実施例２] 式（１）で表されるジテルペン化合物２の製造及び同定
（ジテルペン化合物２の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２及び３に次いで強い自然免疫活性を示す画分Ｅ４５−４（１５０．２ｍｇ）を得た。画分Ｅ４５−４は、試料濃度５．０μｇ／ｍＬにおいて細胞生存率に全く影響を与えなかった。以下に画分Ｅ４５−１〜７の自然免疫活性と細胞生存率を示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
次いで、画分Ｅ４５−４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：４）、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：４）の溶出画分より白色固体のＡＣ−２（１７．１ｍｇ）を単離した。
【００６７】
（ジテルペン化合物２の同定）
ＡＣ−２について、ＨＲＥＩＭＳを測定したところ、ｍ／ｚ３６２．２４４０に分子イオンピークが観測されたため、ＡＣ−２の分子式はＣ２２Ｈ３４Ｏ４であると推測した。
次いで、ＡＣ−２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＡＣ−１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定においてみられたメトキシ基のシグナル（δ３．６２）が消失し、代わりにアルデヒド由来のシグナル（δ９．７４）が出現した。また、ＡＣ−２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＡＣ−１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定においてみられたメトキシカルボニルのカルボニル炭素のシグナル（δ１７８．０）とメトキシル炭素のシグナル（δ５１．１）が消失し、代わりにアルデヒド炭素のシグナル（δ２０５．７）が出現した。
以上より、ＡＣ−２は、ＡＣ−１のメトキシカルボニル基がアルデヒド基に変化した以下に示す平面構造であることが判明した。
【化２０】
【００６８】
ここで、ＡＣ−２の１７位においてアセトキシ基の代わりに水酸基が結合している化合物（１７−ｈｙｄｒｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ａｌ）が既知である。そこで、この既知化合物とＡＣ−２を比較するため、ＡＣ−２をメタノール中で炭酸ジカリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、その１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ＡＣ−２´を得た。このようにして誘導したＡＣ−２´の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び比旋光度（［α］Ｄ２５−４４．３（ｃ０．３０９、ＣＨＣｌ３））を測定したところ、既知化合物のデータ（［α］Ｄ２５−４６．７（ｃ０．１５、ＣＨＣｌ３））と一致した。これにより、ＡＣ−２が、ジテルペン化合物２（１７−ａｃｅｔｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ａｌ）であることが確認できた。
【００６９】
以下に、ＡＣ−２の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを示す。
【表４】
【００７０】
[実施例３] 式（１）で表されるジテルペン化合物３の製造及び同定
ジテルペン化合物２をＭｅＯＨ中で水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を用いて還元することにより、その４位に結合しているアルデヒド基をヒドロキシメチル基に変換し、ＡＣ−３を得た。実際に行った手順を以下に示す。
（ジテルペン化合物３の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ １０．９ｍｇを得、ＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、ＮａＢＨ４１．７ｍｇを加え、室温で２０分間攪拌した。反応液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で酸性化した後、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（４９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：０−４９：１）の溶出画分よりＡＣ−３ ４．２ｍｇを得た。
【００７１】
（ジテルペン化合物３の同定）
比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳの解析の結果、ＡＣ−３はジテルペン化合物３（１７−ａｃｅｔｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎｅ−１６β，１９−ｄｉｏｌ）であることが確認できた。
【００７２】
以下にＡＣ−３の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータを示す。
Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｏｌｉｄ．［α］Ｄ２７−５０．９（ｃ０．３０５，ｐｙｒｉｄｉｎｅ）． １Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５） δ５．７５−５．８７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．５３−５．６７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），３．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），２．４０（１Ｈ，ｓ），２．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），１．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），１．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），１．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），１．３７−１．７０（１１Ｈ，ｍ），１．１９（３Ｈ，ｓ），０．９２−１．０２（３Ｈ，ｍ），１．００（３Ｈ，ｓ），０．７６（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１３．１，４．２Ｈｚ）． １３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５） δ１７１．２，７９．２，６９．３，６４．１，５７．２，５６．９，５４．０，４６．５，４５．０，４２．９，４０．６，３９．６，３９．３，３７．６，３６．２，２８．１，２６．７，２１．１，２０．９，１８．７，１８．６，１８．５． ＬＲＥＩＭＳｍ／ｚ３６４（０．０３，Ｍ＋），３４６（３），３１５（３２），２９１（４３），２７３（８２），２５５（１００）． ＨＲＥＩＭＳｍ／ｚ３６４．２６１４［Ｍ］＋（３６４．２６２２ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３６Ｏ４）．
【００７３】
[実施例４] 式（１）で表されるジテルペン化合物４〜６の製造
ジテルペン化合物１〜３をＭｅＯＨ中で炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、その１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ジテルペン化合物４〜６を得た。実際に行った手順を以下に示す。
（ジテルペン化合物４の製造）
実施例１において製造したジテルペン化合物１ ６．２ｍｇをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３２．６ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）の溶出画分よりＡＣ−４ ４．２ｍｇを得た。
（ジテルペン化合物５の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ ８．７ｍｇを得、これをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３２．５ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をＯＤＳ０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（２：１−１：２）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（２：１）の溶出画分を得た。さらにこの画分を、シリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１−９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）の溶出画分よりＡＣ−５ １．２ｍｇを得た。
（ジテルペン化合物６の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ ９．８ｍｇを得、これをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、ＮａＢＨ４１．８ｍｇを加え、室温で２０分攪拌した。溶媒を留去した後、再びＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３３．１ｍｇを加え、室温で１時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ(４：１−１：１)、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ(１：１)、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨの溶出画分よりＡＣ−６ ２．５ｍｇを得た。
【００７４】
（ジテルペン化合物４〜６の同定）
比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳの解析の結果、ＡＣ−４〜６は、それぞれ、ジテルペン化合物４〜６であることが確認できた。ＡＣ−４〜６の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータを図２〜４に示す。
【００７５】
[実施例５] ジテルペン化合物１〜６のサイトカイン産生制御作用の確認 １
（試験方法）
ジテルペン化合物１〜６のＩＬ−８の産生抑制効果を確認するために、以下の試験を行った。
９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣに、ジテルペン化合物１〜６を、それぞれ、１．５μＭ、１５μＭ及び１５０μＭとなるように添加した１８個の試料を用意し、３時間インキュベーションした。続いて、ヒトＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１６時間インキュベーションした後、培養液中のＩＬ−８の濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
また、比較のため、ヒトＴＮＦ−α、ジテルペン化合物いずれも添加しない試料と、ヒトＴＮＦ−αのみ添加し、ジテルペン化合物を添加しない試料を用意した。
（結果）
各試料におけるＩＬ−８産生量を図５に示す。図５において、縦軸は培養液中のＩＬ−８濃度、横軸は各ジテルペン化合物の添加濃度である。
図５より、ジテルペン化合物１、４は、低添加添加濃度領域でＩＬ−８の産生を促進し、ジテルペン化合物２、３、５及び６はＩＬ−８の産生を抑制することが確認できた。
また、ジテルペン化合物５は、高添加濃度領域において、ＩＬ−８産生制御作用が抑制から促進に転換した。
【００７６】
[実施例６] ジテルペン化合物１〜６のサイトカイン産生制御作用の確認 ２
（試験方法）
ジテルペン化合物１〜６のＭＣＰ−１産生抑制効果を確認するために、以下の試験を行った。
９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣにジテルペン化合物１〜６を、それぞれ、１．５μＭ、１５μＭ及び１５０μＭとなるように添加した１８個の試料を用意し、３時間インキュベーションした。続いて、ヒトＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１６時間インキュベーションした後、培養液中のＭＣＰ−１の濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。 また、比較のため、ヒトＴＮＦ−α、ジテルペン化合物いずれも添加しない試料と、ヒトＴＮＦ−αのみ添加し、ジテルペン化合物を添加しない試料を用意した。
（結果）
各試料におけるＭＣＰ−１産生量を図６に示す。図６において、縦軸は培養液中のＭＣＰ−１の濃度、横軸は各ジテルペンの添加濃度である。
図６より、ジテルペン化合物１、４は低添加濃度領域でＭＣＰ−１の産生を促進し、ジテルペン化合物２、３、５及び６は、ＭＣＰ−１の産生を抑制することが確認できた。
また、ジテルペン化合物５は、高添加濃度領域において、ＭＣＰ−１産生抑制作用を失った。
さらに、実施例５、６の結果の比較から、ジテルペン化合物１〜６は、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の産生に対して、ほぼ同様の傾向の産生制御作用を示すことが確認できた。
【００７７】
[参考例３]
参考のため、ジテルペン化合物１〜６の、種々の濃度における自然免疫活性、細胞毒性を測定した。なお、自然免疫活性、細胞毒性は、参考例１、参考例２に記載した方法と同様にして測定した。
また、ジテルペン化合物１、２については、さらに、転写・翻訳活性（熱刺激により誘導されるβ−ガラクトシダーゼの産生量）を測定した。なお、転写・翻訳活性は、「（ｉ）培地の調製」においてＬＰＳを培地に添加しなかった点、「（ｖｉ）評価」において対照試料として培地にＤＭＳＯのみ添加したものを用い、ブランク試料として培地にＴ−２ｔｏｘｉｎを１００μＭとなるように添加したものを用いた点、及び、「（ｉｉ）解剖と培養」を以下のように変更した点以外は参考例１と同様にして測定した。
（ｉｉ）解剖と培養
ショウジョウバエの幼虫が入ったチューブを３０℃のインキュベーターに２２分間入れて、幼虫に熱刺激を与えた。幼虫に熱刺激が加わらないように４℃以下の低温条件下で、幼虫の頭部を切断して抗菌ペプチドの産生器官である脂肪体を露出させた。このようにして得た脂肪体を、１ウェルあたり１００μＬの培地の入った９６ウェルプレートの各ウェルに１匹ずつ入れ、２５℃で１８時間培養した。なお、培養は１試料につき、６匹分行った。
結果を図７に示す。図７において、□、○、△は、それぞれ、自然免疫活性、細胞生存率、転写・翻訳活性を表し、縦軸は各ジテルペン化合物の自然免疫活性、細胞生存率、又は転写・翻訳活性（対照試料に対する相対値（％））であり、横軸は各ジテルペン化合物の添加濃度である。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生異常に起因する各種疾患の治療薬や予防薬、又は、免疫低下に起因する疾患の予防薬の有効成分として用いることができる。
また、本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、免疫賦活剤として、食品や動物用飼料に添加することができる。
さらに、本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、抗昆虫剤として、農薬に添加することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】チェリモヤの抽出物からのジテルペン化合物の単離手順を示す図である。
【図２】ＡＣ−４の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図３】ＡＣ−５の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図４】ＡＣ−６の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図５】ジテルペン化合物１〜６のＩＬ−８産生制御作用を示すグラフである。
【図６】ジテルペン化合物１〜６のＭＣＰ−１産生制御作用を示すグラフである。
【図７】ジテルペン化合物１〜６の自然免疫活性、細胞毒性、転写・翻訳活性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アチサン骨格を有するジテルペン化合物を含む医薬組成物及びサイトカイン産生制御剤に関する。
また、本発明は、アチサン骨格を有するジテルペン化合物の製造方法に関する。
さらに、本発明は、アチサン骨格を有する新規なジテルペン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインとは、細胞から分泌され、細胞間の情報伝達に働く低分子量のタンパク質の総称である。
サイトカインの生理機能としては、免疫応答の制御作用、抗腫作用、抗ウィルス作用、細胞増殖・分化の調節作用等が挙げられ、その産生バランスが崩れると、様々な疾患の発症や進展をもたらすことが知られている。例えば、サイトカインが過剰産生すると、リウマチ、骨粗鬆症、動脈硬化症、糖尿病合併症等の慢性疾患が発症することが分かっている。
【０００３】
また、サイトカインは免疫療法剤、増血剤として使用され、サイトカインを投与することによって、各種疾患の治療効果が得られることも知られている。しかし、大量のサイトカインを生体組織から単離したり高純度で生産することは難しく、外部からのサイトカインの投与はあまり実用的ではない。
【０００４】
そのため、生体内におけるサイトカインの産生を抑制したり、促進させたりすることのできるサイトカイン産生制御剤が必要とされている。
【０００５】
ところで、サイトカイン等のヒトの自然免疫系に作用する有効成分を感度よくスクリーニングする方法として、ショウジョウバエを用いたスクリーニング方法が知られている（特許文献１）。そして、この方法を利用して、サイトカインの１種であるケモカインの産生を阻害する化合物が見い出されている（特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１２１１５５号公報
【特許文献２】特開２００５−１８７４５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、ケモカイン以外にも多数のサイトカインが存在し、用途によっては、サイトカインの産生阻害だけではなく、産生促進が必要となる場合がある。したがって、特許文献２に記載の化合物だけでは、生体内におけるサイトカインの産生を十分に制御することはできない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、種々のサイトカインの産生を抑制したり、促進させたりすることのできる新たなサイトカイン産生制御剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、サイトカインの産生異常や免疫低下に起因する各種疾患等の予防薬又は治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために様々な物質をスクリーニングした結果、アチサン骨格を有する式（１）で表わされるジテルペン化合物がサイトカイン産生に影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、アチサン骨格を有する式（１）で表わされるジテルペン化合物を、バンレイシ科、バンレイシ属の植物であるチェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）からの抽出物からの単離により製造できることを見い出した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、各種サイトカインの産生を抑制したり促進させることができるので、サイトカインの産生異常により発生する種々の疾患を予防又は治療したり、生体に免疫を賦活することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明について具体的に説明する。
本発明の医薬組成物、サイトカイン産生制御剤は、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む。
【００１２】
式（１）
【化７】
【００１３】
式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して制御（抑制又は促進）作用を示す。
ここで、本発明のサイトカイン産生制御剤が産生を制御できるサイトカインに限定はないが、特に、ＮＦ−κＢやＮＦ−ＡＴ等の転写因子により発現誘導されるサイトカインに対して強い制御作用を示す。このようなサイトカイン類としては、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２３、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＭＣＰ−１、ＭＣＡＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＧＲＯ−α等が挙げられるが、これに限定されない。
【００１４】
式（１）において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ、１〜３位、６、７位、１１〜１５位の炭素に結合した水素のいずれかと置換してもよい置換基であり、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表す。
また、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数であり、好ましくは、ｎ＝ｍ＝ｌ＝０である。
【００１５】
式（１）において、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表す。
式（１）で表されるジテルペン化合物は、Ｒ１を適宜選択することにより、そのサイトカイン産生制御作用の程度を調整することができる。
例えば、Ｒ１が、水素又はアセチル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物のサイトカイン産生制御作用が大きくなる。特に、式（１）で表されるジテルペン化合物のうち、Ｒ１がアセチル基であるもの、例えば、以下の式（３）で表されるジテルペン化合物は、サイトカイン産生制御作用が極めて大きい。なお、式（３）で表されるジテルペン化合物は新規化合物である。
【００１６】
式（３）
【化８】
【００１７】
式（１）において、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６のアシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基であり、好ましくは、メトキシカルボニル基、アルデヒド基、ヒドロキシメチル基である。
式（１）で表されるジテルペン化合物においては、Ｒ２を適宜選択することにより、そのサイトカイン産生制御作用が産生抑制であるか産生促進であるかを決定することができる。
例えば、Ｒ２がメトキシカルボニル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物は低濃度領域でサイトカイン産生促進効果を示す。
一方、Ｒ２がアルデヒド基やヒドロキシメチル基である場合、式（１）で表されるジテルペン化合物はサイトカイン産生抑制作用を示す。
【００１８】
また、Ｒ１が水素で、Ｒ２がアルデヒド基であるジテルペン化合物５（後述する）は、高濃度領域においてはサイトカイン産生制御活性を失うか、又は、サイトカイン産生制御活性が転換する。
このように、式（１）で表されるジテルペン化合物は、Ｒ１とＲ２を適宜組み合わせることにより、様々なサイトカイン産生制御作用を示すことができる。
【００１９】
また、式（１）で表されるジテルペン化合物は、特に、式（２）の立体構造式で表される立体構造を有することが好ましい。
【００２０】
式（２）
【化９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【００２１】
なお、本発明において、「Ｃ１−Ｃ６炭化水素基」とは、炭素数が１ないし６個の直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和の炭化水素基をいい、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−エチルブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基等のアルケニル基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−エチニル−２−プロピニル基、１−メチル−２−プロピニル基等のアルキニル基等が挙げられる。
好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基である。
【００２２】
本発明において、「Ｃ１−Ｃ６アシル基」とは、水素又は炭素数が１ないし５個の直鎖状または分枝状の炭化水素基の末端にカルボニル基が結合した基をいい、例えば、アルデヒド基（ホルミル基）、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバロイル基等が挙げられる。
好ましくは、アルデヒド基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバロイル基である。
【００２３】
本発明において、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基」とは、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基の末端にカルボニル基が結合した基をいう。
ここで、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ基とは、炭素数が１ないし５個の直鎖状または分枝状の炭化水素基の末端に酸素原子が結合した基をいい、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉｓｏ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，１−ジメチルプロポキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｉｓｏ−ヘキシルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、１−エチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、１，１，２−トリメチルプロポキシ基、１，２，２−トリメチルプロポキシ基、１−エチル−１−メチルプロポキシ基、１−エチル−２−メチルプロポキシ基等が挙げられる。
好ましい「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基」は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉｓｏ−プロポキシカルボニル基である。
【００２４】
本発明において、「置換基を有していてもよい」「基」とは、その基の一部の水素が他の置換基で置換されていてもよいものをいう。
このような置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、オキソ基、アルコキシ基等が挙げられる。
【００２５】
以下に、式（１）で表されるジテルペン化合物の特に好ましい具体例を示す。
【００２６】
ジテルペン化合物１
【化１０】
【００２７】
ジテルペン化合物２
【化１１】
【００２８】
ジテルペン化合物３
【化１２】
【００２９】
ジテルペン化合物４
【化１３】
【００３０】
ジテルペン化合物５
【化１４】
【００３１】
ジテルペン化合物６
【化１５】
【００３２】
次に、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物、サイトカイン産生制御剤について説明する。
【００３３】
式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して抑制又は促進作用を示すので、ヒト又はヒト以外の動物のサイトカインの産生異常に起因する疾患の治療又は予防のための医薬組成物の有効成分として使用することができる。
このようなサイトカインの産生異常に起因する疾患としては、例えば、ウイルス感染症、心筋梗塞、リウマチ、骨粗鬆症、動脈硬化症、糖尿病合併症、敗血症、多発性骨髄腫、心房粘液腫、子宮頚癌、臓器移植後拒絶反応、肝硬変、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）等が挙げられる。
【００３４】
式（１）で表されるジテルペン化合物がサイトカインの産生を促進するものである場合には、これを投与した生体に免疫を賦活することができるので、免疫低下に起因する疾患の予防のための医薬組成物の有効成分として使用することができる。このような免疫低下に起因する疾患としては、例えば、インフルエンザやスペイン風邪等が挙げられる。また、臓器移植の際に用いられる獲得免疫抑制剤（例えば、タクロリムス、サイクロスポリン等）により抵抗力が低下した状態にある患者に対し、式（１）で表されるジテルペン化合物を投与することにより、感染症を抑制することもできる。
【００３５】
また、式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生に対して抑制又は促進作用を示すので、サイトカイン産生制御剤（サイトカイン産生抑制剤又はサイトカイン産生促進剤）として使用することができる。
【００３６】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤は、例えば、免疫賦活剤として、健康食品等の食品（飲料を含む）や飼料等に添加することができる。
また、式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤は、抗昆虫剤として、農薬等に添加することができる。本発明のサイトカイン産生制御剤を予め農作物に散布しておくと、農作物に集まった昆虫の免疫機能を低下させることができるので、農作物の病気が発生した場合、免疫機能の低下した昆虫は病気に感染し、健康な農作物に病原菌等を伝播させることなく死滅し、被害の発生を最小限に抑えることができる。また、農作物に被害を与える病原昆虫については、免疫機能が低下しているため通常よりも少量の殺虫剤によって安易に駆除できる。
【００３７】
式（１）で表されるジテルペン化合物を医薬組成物やサイトカイン産生制御剤として用いる場合、式（１）で表されるジテルペン化合物をそのまま、又は、慣用の担体・添加剤等と共に、ヒト又はヒト以外の動物に投与することができる。
【００３８】
その投与量は、ジテルペン化合物の種類、投与目的、投与対象（患者の症状、年齢、体重、性別等）等に応じて適宜決定することができ、例えば、成人１日当たり１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲とするのが好ましい。この場合、１日１回又は数回に分けて投与することができる。
式（１）で表されるジテルペン化合物が、添加濃度に依存してサイトカインの産生制御作用が変化するもの、例えば、ジテルペン化合物５、である場合には、投与量を適宜調整することにより、サイトカイン産生制御作用を調整することができる。
【００３９】
また、その投与方法に限定はなく、経口又は非経口的に投与することができる。
さらに、投与剤型は、投与方法、投与目的、投与対象（患者の症状、年齢、体重等）等に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、トローチ剤、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
【００４０】
これらの製剤は、いずれも慣用の製剤技術（例えば、日本薬局方に規定する方法等）によって製造することができる。
これらの製剤は、薬学的に許容されている添加物を含むことができる。このような薬剤学上許容されている添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解促進剤、懸濁剤、乳化剤等が挙げられる。
【００４１】
次に、式（１）で表されるジテルペン化合物の製造方法について説明する。
本発明においては、バンレイシ科、バンレイシ属の植物であるチェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）から抽出物を抽出する工程と、該抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程と、を含む方法により式（１）で表されるジテルペン化合物を製造することができる。
【００４２】
本発明において原料として用いるチェリモヤは、生のものでもよいし、乾燥物であってもよいが、小片化した乾燥物であることが好ましい。
また、チェリモヤの抽出部位としては、ジテルペン化合物を有意量含有している部位であれば限定はなく、例えば、果実、茎、葉、根、花又は種子等の任意の部位が挙げられるが、果実が好ましく、特に、果皮、種子を取り除いた果肉が好ましい。
【００４３】
チェリモヤから抽出物を抽出する方法に限定はなく、例えば、液相抽出、気相抽出等が挙げられる。
液相抽出の場合、抽出溶媒としては、チェリモヤに含まれる式（１）で表されるジテルペン化合物を抽出できるものであれば限定はない。しかし、式（１）で表されるジテルペン化合物は難水溶性であるものが多いため、抽出溶媒としては、有機溶媒が好ましく、特にエタノール、メタノール等の低級アルコールが好ましい。
【００４４】
抽出温度、抽出時間は、チェリモヤの抽出部位や粉砕・切断の程度、抽出方法、抽出溶媒の種類等に応じて適宜決定できるが、目安としては、抽出温度は４〜６０℃程度であり、抽出時間は３０分〜１０日間程度である。
【００４５】
得られた抽出物からジテルペン化合物を単離する方法に限定はなく、公知の方法を用いることができる。具体的には、高速液体クロマトグラフィーやシリカゲルカラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーによって分離することができる。
カラムクロマトグラフィーに用いる展開溶媒としては、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム等を慣用の展開溶媒を用いることができる。
【００４６】
カラムクロマトグラフィーを用いて化合物を単離するには、カラムクロマトグラフィーによって分離した複数の画分（フラクション）の中から、目的の化合物を含む画分を選択する必要がある。本発明においては、各画分のサイトカイン産生抑制又は産生促進作用を測定し、最も強いサイトカイン産生抑制又は促進作用を示す画分を選択することにより、式（１）で表されるジテルペン化合物を含有する画分を選択することができる。
もっとも、クロマトグラフィーで分離するたびに、各画分のサイトカイン産生抑制又は促進作用を測定することは煩雑である。そこで、本発明においては、式（１）で表されるジテルペン化合物を含有する画分を選択するための指標として、サイトカイン産生抑制又は産生促進作用に代えて、特許文献１に記載されるようなショウジョウバエを用いた自然免疫活性評価系により評価される自然免疫活性を利用することが好ましい。
【００４７】
本発明においては、チェリモヤの抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程の後に、さらに、単離したジテルペン化合物の一部の官能基、特に、４位、１７位に結合する置換基（Ｒ１、Ｒ２）、を公知の方法により他の置換基に変換する工程を設け、チェリモヤから抽出したジテルペン化合物から所望のサイトカイン産生制御作用を有するジテルペン化合物に変換してもよい。
ここで、公知の方法としては、例えば、還元処理、脱アセチル化処理等が挙げられるが、これに限定されない。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
なお、実施例において用いた装置、試薬、表記方法は以下のとおりである。
比旋光度は日本分光Ｐ−１０３０型旋光計を用いて測定した。マススペクトルは日本電子ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ ３０３型質量分析計及びＪＭＳ−７００型質量分析計を使用した。ＮＭＲスペクトルの測定は日本電子ＪＥＯＬ ＥＣＡ−６００型核磁気共鳴装置及びＪＥＯＬ ＡＬ−４００型核磁気共鳴装置を使用し、内部標準物質としてＴＭＳを用いた。化学シフト値はｐｐｍで表し、結合様式は、一重線：ｓ、二重線：ｄ、三重線：ｔ、四重線：ｑ、二分裂した二重線：ｄｄ、多重線：ｍ、幅広いシグナル：ｂｒ．で表した。カラムクロマトグラフィーはＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（７０−２３０ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ、Ｍｅｒｃｋ）、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ（ｎａｃａｌａｉ）を用いた。ＧＰＣ ＨＰＬＣはＬＣ−９０８Ｗ（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用い、そのカラムとしてＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（φ２０ｍｍｘ６００ｍｍ）（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＪＡＩＧＥＬ−１Ｈ（φ２１．５ｍｍｘ５００ｍｍ）（Ｊａｐａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いた。ＴＬＣはＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ２５４（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）、ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ ＲＰ−１８ Ｆ２５４Ｓ（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）を用い、検出はＵＶ（２５４，３６５ｎｍ）照射下における蛍光及びアニスアルデヒド硫酸溶液噴霧後の加熱発色により行った。試薬は、市販のものを精製せずにそのまま用いた。
【００４９】
[参考例１] 自然免疫活性の評価
以下の実施例において、カラムクロマトグラフィーにより分離した複数の画分の中から、式（１）で表されるジテルペン化合物を含む画分を選択する際に利用した各試料（画分）の自然免疫活性を評価するために、各試料について自然免疫系の抗菌ペプチドであるディプテリシン遺伝子のレポータータンパク質であるβ−ガラクトシダーゼの発現量を測定した。具体的な手順を以下に示す。
（ｉ）培地の調製
ショウジョウバエの脂肪体を培養するための培地として、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ‘ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（ＧＩＢＣＯ）（ショウジョウバエの細胞培養用培地）に、２０％の牛胎児血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）と、１％の抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ： ＧＩＢＣＯ）を添加したものを用意した。
自然免疫の活性化に用いるリポ多糖（ＬＰＳ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように精製水に溶解し、培地中に最終濃度が１％（１０μｇ／ｍＬ）となるように添加した。また、試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液とし、培地中に最終濃度が０．５％（０．５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。
【００５０】
（ｉｉ）解剖と培養
ショウジョウバエの雌のみを選択し、頭部を切断して抗菌ペプチドの産生器官である脂肪体を露出させた。このようにして得た脂肪体を、１ウェルあたり１００μＬの培地の入った９６ウェルプレートの各ウェルに１匹ずつ入れ、２５℃で１２時間培養した。なお、培養は１試料につき、６匹分行った。
（ｉｉｉ）β−ガラクトシダーゼ定量に用いる分析試料の調製
１２時間培養した後、脂肪体を２００μＬのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．８）の入った５００μＬのエッペンドルフチューブに入れ、超音波破砕機（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ ＸＬ ： ＭＩＳＯＮＩＸ）を用いてホモジナイズしてβ−ガラクトシダーゼを抽出した。次いで、抽出物を遠心分離（９１７０×ｇ、１０ｍｉｎ．、４℃ ＭＸ−３００：ＴＯＭＹ）し、上清１６０μＬを採取し、分析試料とした。
（ｉｖ）β−ガラクトシダーゼの定量
（ｉｉｉ）で得た分析試料中のβ−ガラクトシダーゼを、酵素反応により定量した。
検量線作成用標準溶液として、β−ガラクトシダーゼを０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）＋ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで希釈して、β−ガラクトシダーゼの濃度間隔が１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬとなるように調製した溶液を用意した。標準溶液及び分析試料を測定用チューブに２０μＬずつ分注し、それらに酵素の基質であるＧａｌａｃｔｏｎ ｐｌｕｓ（ＴＲＯＰＩＸ）をｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで８０倍に希釈したものを８０μＬ添加して、正確に１時間、室温で撹拌した。その後、標準溶液及び分析試料にｅｎｈａｎｃｅｒであるＥｍｅｒａｌｄ ＩＩ（ＴＲＯＰＩＸ）を０．２５Ｍ ＮａＯＨで８倍に希釈したものを１００μＬ加え、直ちにルミノメーター（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＢ ９６Ｖ：Ｂｅｌｔｈｏｌｄ）で標準溶液及び分析試料の化学発光を測定した。標準溶液を用いて作成した検量線を利用して、分析試料中のβ−ガラクトシダーゼの量を定量した。
【００５１】
（ｖ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質の定量
ショウジョウバエの脂肪体の大きさの個体差を補正するため、それぞれの分析試料のタンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ量を算出した。
検量線作成用標準溶液として、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを精製水で希釈して、ＢＳＡ濃度が０．５、０．４、０．２５、０．１２５、０．０５（ｍｇ／ｍＬ）となるように調製した溶液を用意した。標準溶液及び分析試料を１０μＬずつ９６ウェルプレートに分注し、それらに５倍希釈したｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ）２００μＬを加えて室温で約１０分間放置した後、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥＲＥＡＤＥＲ ＭＯＤＥＬ ６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、標準溶液及び分析試料の５９５ｎｍの吸光度を測定した。標準溶液を用いて作成した検量線を利用して、分析試料中のタンパク質量を定量し、分析試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ量を算出した。
（ｖｉ）評価
１試料につき６匹分の培養を行い、それらの分析試料のうち、単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量が最大のものと最小のものを除いた４つの分析試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を算出し、これを用いて自然免疫活性を評価した。
培地にＤＭＳＯとＬＰＳのみを添加した対照試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を１００％、培地にＤＭＳＯのみを添加したブランク試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量の平均値を０％として、各試料の単位タンパク質あたりのβ−ガラクトシダーゼ産生量を対照試料に対する相対値（％）で表し、これを各試料の自然免疫活性を評価する値とした。
【００５２】
[参考例２] 細胞毒性の評価（細胞生存率の測定）
以下の実施例において、試料の細胞毒性は以下のようにして評価した。
（ｉ）培地の調製
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ‘ｓ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（ＧＩＢＣＯ）に、牛胎児血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を２０％（ｖ／ｖ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ）を１％（ｖ／ｖ）となるように加えて培地を調製した。
この培地中に、ＤＭＳＯに溶解させた試料を最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）になるように添加した。また、対照試料として、培地中にＤＭＳＯのみを添加したものを用意した。
（ｉｉ）細胞の培養
９６ウェルプレートの各ウェルに、試料を添加した培地を１００μＬずつ分注し、その中にＳ２細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように蒔いた。また、ブランク試料として、細胞を蒔かないものを用意した。その後、２５℃で２４時間培養を行った。
なお、細胞の培養は、一試料につき６ウェルずつ行った。
（ｉｉｉ）生細胞数の測定
２４時間培養後、ＭＴＴ試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を各ウェルに１０μＬずつ分注した。分注直後に、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥＲＥＡＤＥＲ ＭＯＤＥＬ ６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した（０ｈの吸光度とする）。その後、２５℃で４時間培養を行い、再び４５０ｎｍの吸光度を測定した（４ｈの吸光度とする）。
（ｉｖ）評価
各ウェルの４ｈの吸光度から０ｈの吸光度を差し引き、培地にＤＭＳＯのみを添加した対照試料の吸光度変化を１００％、培地のみで細胞を蒔いていないブランク試料の吸光度変化を０％として、各ウェルの吸光度変化を対照試料に対する相対値（％）で表した。６ウェルの生細胞生存率の平均値を算出し、これを試料の生細胞生存率とした。
【００５３】
[実施例１] 式（１）で表されるジテルペン化合物１の製造及び同定
（ジテルペン化合物１の製造）
（ｉ）抽出工程
チェリモヤ果肉の凍結乾燥物３８６．６１ｇを２Ｌのメタノール（ＭｅＯＨ）を加え、７０ｒｐｍで攪拌しながら室温で１日抽出した。抽出したＭｅＯＨを濾過し、これを減圧濃縮して、ＭｅＯＨ抽出物１６９．５１ｇを得た。
このＭｅＯＨ抽出物に１３００ｍＬの水を加え、１３００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いて３回抽出し、ＥｔＯＡｃ層を減圧留去して、ＥｔＯＡｃ可溶画分２１．５ｇを得た。
【００５４】
（ｉｉ）単離工程
（ｉ）で得た酢酸エチル可溶画分から、図１に示す手順で白色固体物質ＡＣ−１を単離した。
まず、ＥｔＯＡｃ可溶画分（２１．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ−１（６７０９．１ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−９：１））、Ｅ−２（６０７３．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ−３（４１８８．０ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ−４（１４５６．０ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ−５（１０８４．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ−６（１４５０．３ｍｇ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（４：１））、Ｅ−７（５２５．８ｍｇ、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（４：１−０：１））、Ｅ−８（７２２．４ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を、参考例１に記載した手順で試料濃度３．３μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ−４が最も強く自然免疫を抑制した。
次に、画分Ｅ−４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４−１（１５２．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−９：１））、Ｅ４−２（１１４．３ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（９：１−４：１））、Ｅ４−３（９３．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４−４（２８２．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１−２：１））、Ｅ４−５（５９０．５ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１−１：１））、Ｅ４−６（１０７．６ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１））、Ｅ４−７（９４．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ）、Ｅ４−８（９１．５ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を、試料濃度０．５μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ４−５が最も強く自然免疫を抑制した。
【００５５】
続いて、画分Ｅ４−５をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４５−１（２２．８ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−２（９６．７ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−３（１０６．１ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−４（１５０．２ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１））、Ｅ４５−５（６７．９ｍｇ、ｈｅｘａｎｅＥｔＯＡｃ（４：１−２：１））、Ｅ４５−６（１０９．６ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１−１：１））、Ｅ４５−７（４８．７ｍｇ、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を試料濃度０．５μｇ／ｍＬで測定した結果、画分Ｅ４５−２及び３が最も強く自然免疫を抑制した。
さらに、この画分４５−２とＥ４５−３を混合してシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、画分Ｅ４５２−１（１．０ｍｇ、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：２−０：１））、Ｅ４５２−２（８２．８ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−３（２３．２ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−４（２７．４ｍｇ、ＣＨＣｌ３）、Ｅ４５２−５（５６．１ｍｇ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：０−４９：１））、Ｅ４５２−６（９．７ｍｇ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（４９：１））、Ｅ４５２−７（２．８ｍｇ、ＭｅＯＨ）を得た。それぞれの画分の自然免疫活性を試料濃度０．５μｇ／ｍＬとして測定した結果、画分Ｅ４５２−３及び４が最も強く自然免疫を抑制した。
なお、画分Ｅ４５２−３及び４、特に、画分Ｅ４５２−３は、試料濃度５．０μｇ／ｍＬにおいて細胞生存率に影響を与えなかった。以下に、画分Ｅ４５２−１〜７の自然免疫活性と細胞生存率を示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
画分Ｅ４５２−３及び４について、それぞれ、薄層クロマトグラフィーを用いて分析を行った結果、これらの中に２種の物質が共通に含まれていることが判明した。そこで画分Ｅ４５２−３をＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０、Ｅｌｕｔａｎｔ：ＣＨ３ＣＮ、Ｆｌｏｗｒａｔｅ：５ｍＬ／ｍｉｎ）で分離し、画分Ｅ４５２３−１（０．３ｍｇ）、Ｅ４５２３−２（１８．８ｍｇ）、Ｅ４５２３−３（０．５ｍｇ）、Ｅ４５２３−４（１．１ｍｇ）を得た。次いで、画分Ｅ４５２３−２をＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：ＪＡＩＧＥＬ−１Ｈ、Ｅｌｕｔａｎｔ：ＣＨＣｌ３、Ｆｌｏｗｒａｔｅ：３．５ｍＬ／ｍｉｎ）で分離し、画分Ｅ４５２３２−１（０．１ｍｇ）、Ｅ４５２３２−２（０．７ｍｇ）、Ｅ４５２３２−３（４．０ｍｇ）、Ｅ４５２３２−４（９．８ｍｇ）、Ｅ４５２３２−５（２．１ｍｇ）、Ｅ４５２３２−６（０．１ ｍｇ）、Ｅ４５２３２−７（０．２ｍｇ）を得た。さらに画分Ｅ４５２３２−３、４及び５を混合してシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：０−４：１）、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２０：３）の溶出画分より白色固体であるＡＣ−１（４．３ｍｇ）を単離した。
【００５８】
（ジテルペン化合物１の同定）
ＡＣ−１についてＨＲＥＩＭＳを測定したところ、ｍ／ｚ３９２．２５５０に分子イオンピークが観測された。これにより、ＡＣ−１の分子式はＣ２３Ｈ３６Ｏ５であると推測した。
次いで、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、及びＨＭＱＣスペクトルより、ＡＣ−１中には、２個のエステルカルボニル炭素、１個の酸素原子が結合した４級炭素、１個のオキシメチレン炭素、１個のメトキシル炭素、３個の４級炭素、９個のメチレン炭素、３個のメチン炭素及び３個のメチル炭素が存在することが判明した。
続いて、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹより、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１６】
【００５９】
そこでまず、Ａ環部をＨＭＢＣスペクトルにより解析した。
ＨＭＢＣスペクトルでは、Ｈ−１８からＣ−３、−４、−５及び−１９への相関が観測され、これにより、Ｃ−３〜５、１８、１９の間に結合が存在することが明らかとなった。また、メトキシ基のプロトンからＣ−１９への相関が観測され、これにより、Ｃ−１９がメトキシカルボニルを形成していることが判明した。さらに、Ｈ−２０からＣ−１、−５、−９及び−１０への相関が観測され、これにより、Ｃ−１、５、９、１０、２０の間に結合が存在することが明らかとなった。さらにまた、Ｈ−１からＣ−２、３への相関が観測され、これにより、Ｃ−１〜３の間に結合が存在することが判明し、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１７】
【００６０】
次に、Ｃ環部をＨＭＢＣスペクトルにより解析した。
ＨＭＢＣスペクトルでは、Ｈ−１７からＣ−１２、−１５、−１６及びアセチル基のカルボニル炭素への相関が観測され、これにより、Ｃ−１２、１５、１６、１７の間に結合が存在することと、Ｃ−１７にアセチル基が結合していることが判明した。また、Ｈ−１３からＣ−８、−１４への相関、及び、Ｈ−１５からＣ−８への相関が観測され、これにより、Ｃ−１３−Ｃ−１４−Ｃ−８−Ｃ−１５間に結合が存在することが明らかとなり、ＡＣ−１は、以下に示す部分構造を有することが判明した。
【化１８】
【００６１】
最後に、Ａ、Ｃ環部を連結したＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−１１からＣ−８、−９への相関及びＨ−１５からＣ−９への相関が観測され、これにより、Ｃ−１１−Ｃ−９−Ｃ−８、の間に結合が存在することが明らかとなった．また、Ｈ−６、１５からＣ−７への相関、及び、Ｈ−７からＣ−８への相関が観測され、これにより、Ｃ−６−Ｃ−７−Ｃ−８の間に結合が存在することが判明した。以上より、ＡＣ−１は、以下に示す平面構造であることが判明した。
【化１９】
【００６２】
ＡＣ−１の１７位においてアセトキシ基の代わりに水酸基が結合している化合物（ｍｅｔｈｙｌ １７−ｈｙｄｒｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ｏａｔｅ）は既知である。そこで、該既知化合物とＡＣ−１を比較するため、ＡＣ−１にメタノール中で炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、ＡＣ−１の１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ＡＣ−１´を得た。このようにして誘導したＡＣ−１´の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び比旋光度（［α］Ｄ２４−６３．９（ｃ０．３９０、ＣＨＣｌ３））を測定したところ、既知化合物のデータ（［α］Ｄ１９−８１．３（ｃ０．８、ＣＨＣｌ３））と一致した。これにより、ＡＣ−１が、ジテルペン化合物１（ｍｅｔｈｙｌ １７−ａｃｅｔｏｘｙ−１６β−ａｃｅｔｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ｏａｔｅ）であることが確認できた。
【００６３】
以下に、ＡＣ−１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを示す。
【表２】
【００６４】
[実施例２] 式（１）で表されるジテルペン化合物２の製造及び同定
（ジテルペン化合物２の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２及び３に次いで強い自然免疫活性を示す画分Ｅ４５−４（１５０．２ｍｇ）を得た。画分Ｅ４５−４は、試料濃度５．０μｇ／ｍＬにおいて細胞生存率に全く影響を与えなかった。以下に画分Ｅ４５−１〜７の自然免疫活性と細胞生存率を示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
次いで、画分Ｅ４５−４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：４）、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３（１：４）の溶出画分より白色固体のＡＣ−２（１７．１ｍｇ）を単離した。
【００６７】
（ジテルペン化合物２の同定）
ＡＣ−２について、ＨＲＥＩＭＳを測定したところ、ｍ／ｚ３６２．２４４０に分子イオンピークが観測されたため、ＡＣ−２の分子式はＣ２２Ｈ３４Ｏ４であると推測した。
次いで、ＡＣ−２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＡＣ−１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定においてみられたメトキシ基のシグナル（δ３．６２）が消失し、代わりにアルデヒド由来のシグナル（δ９．７４）が出現した。また、ＡＣ−２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＡＣ−１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定においてみられたメトキシカルボニルのカルボニル炭素のシグナル（δ１７８．０）とメトキシル炭素のシグナル（δ５１．１）が消失し、代わりにアルデヒド炭素のシグナル（δ２０５．７）が出現した。
以上より、ＡＣ−２は、ＡＣ−１のメトキシカルボニル基がアルデヒド基に変化した以下に示す平面構造であることが判明した。
【化２０】
【００６８】
ここで、ＡＣ−２の１７位においてアセトキシ基の代わりに水酸基が結合している化合物（１７−ｈｙｄｒｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ａｌ）が既知である。そこで、この既知化合物とＡＣ−２を比較するため、ＡＣ−２をメタノール中で炭酸ジカリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、その１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ＡＣ−２´を得た。このようにして誘導したＡＣ−２´の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び比旋光度（［α］Ｄ２５−４４．３（ｃ０．３０９、ＣＨＣｌ３））を測定したところ、既知化合物のデータ（［α］Ｄ２５−４６．７（ｃ０．１５、ＣＨＣｌ３））と一致した。これにより、ＡＣ−２が、ジテルペン化合物２（１７−ａｃｅｔｏｘｙ−１６β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎ−１９−ａｌ）であることが確認できた。
【００６９】
以下に、ＡＣ−２の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを示す。
【表４】
【００７０】
[実施例３] 式（１）で表されるジテルペン化合物３の製造及び同定
ジテルペン化合物２をＭｅＯＨ中で水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を用いて還元することにより、その４位に結合しているアルデヒド基をヒドロキシメチル基に変換し、ＡＣ−３を得た。実際に行った手順を以下に示す。
（ジテルペン化合物３の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ １０．９ｍｇを得、ＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、ＮａＢＨ４１．７ｍｇを加え、室温で２０分間攪拌した。反応液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で酸性化した後、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（４９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：０−４９：１）の溶出画分よりＡＣ−３ ４．２ｍｇを得た。
【００７１】
（ジテルペン化合物３の同定）
比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳの解析の結果、ＡＣ−３はジテルペン化合物３（１７−ａｃｅｔｏｘｙ−ｅｎｔ−ａｔｉｓａｎｅ−１６β，１９−ｄｉｏｌ）であることが確認できた。
【００７２】
以下にＡＣ−３の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータを示す。
Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｏｌｉｄ．［α］Ｄ２７−５０．９（ｃ０．３０５，ｐｙｒｉｄｉｎｅ）． １Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５） δ５．７５−５．８７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．５３−５．６７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），３．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），２．４０（１Ｈ，ｓ），２．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），１．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），１．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），１．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），１．３７−１．７０（１１Ｈ，ｍ），１．１９（３Ｈ，ｓ），０．９２−１．０２（３Ｈ，ｍ），１．００（３Ｈ，ｓ），０．７６（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１３．１，４．２Ｈｚ）． １３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５） δ１７１．２，７９．２，６９．３，６４．１，５７．２，５６．９，５４．０，４６．５，４５．０，４２．９，４０．６，３９．６，３９．３，３７．６，３６．２，２８．１，２６．７，２１．１，２０．９，１８．７，１８．６，１８．５． ＬＲＥＩＭＳｍ／ｚ３６４（０．０３，Ｍ＋），３４６（３），３１５（３２），２９１（４３），２７３（８２），２５５（１００）． ＨＲＥＩＭＳｍ／ｚ３６４．２６１４［Ｍ］＋（３６４．２６２２ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３６Ｏ４）．
【００７３】
[実施例４] 式（１）で表されるジテルペン化合物４〜６の製造
ジテルペン化合物１〜３をＭｅＯＨ中で炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を作用させて脱アセチル化することにより、その１７位のアセトキシ基を水酸基に変換し、ジテルペン化合物４〜６を得た。実際に行った手順を以下に示す。
（ジテルペン化合物４の製造）
実施例１において製造したジテルペン化合物１ ６．２ｍｇをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３２．６ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）の溶出画分よりＡＣ−４ ４．２ｍｇを得た。
（ジテルペン化合物５の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ ８．７ｍｇを得、これをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３２．５ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をＯＤＳ０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（２：１−１：２）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（２：１）の溶出画分を得た。さらにこの画分を、シリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１−９：１）、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９：１）の溶出画分よりＡＣ−５ １．２ｍｇを得た。
（ジテルペン化合物６の製造）
実施例１と同様にして、画分Ｅ４５−２ ９．８ｍｇを得、これをＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、ＮａＢＨ４１．８ｍｇを加え、室温で２０分攪拌した。溶媒を留去した後、再びＭｅＯＨ２．０ｍＬに溶かし、Ｋ２ＣＯ３３．１ｍｇを加え、室温で１時間攪拌した。ＭｅＯＨを留去し、残渣にＥｔＯＡｃと水を加えて１回分配し、ＥｔＯＡｃ層の溶媒を留去した。残渣をシリカゲル０．５ｇを担体とするカラムクロマトグラフィーに付し、ｈｅｘａｎｅ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ(４：１−１：１)、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨで順次溶出させ、ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ(１：１)、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨの溶出画分よりＡＣ−６ ２．５ｍｇを得た。
【００７４】
（ジテルペン化合物４〜６の同定）
比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳの解析の結果、ＡＣ−４〜６は、それぞれ、ジテルペン化合物４〜６であることが確認できた。ＡＣ−４〜６の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータを図２〜４に示す。
【００７５】
[実施例５] ジテルペン化合物１〜６のサイトカイン産生制御作用の確認 １
（試験方法）
ジテルペン化合物１〜６のＩＬ−８の産生抑制効果を確認するために、以下の試験を行った。
９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣに、ジテルペン化合物１〜６を、それぞれ、１．５μＭ、１５μＭ及び１５０μＭとなるように添加した１８個の試料を用意し、３時間インキュベーションした。続いて、ヒトＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１６時間インキュベーションした後、培養液中のＩＬ−８の濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
また、比較のため、ヒトＴＮＦ−α、ジテルペン化合物いずれも添加しない試料と、ヒトＴＮＦ−αのみ添加し、ジテルペン化合物を添加しない試料を用意した。
（結果）
各試料におけるＩＬ−８産生量を図５に示す。図５において、縦軸は培養液中のＩＬ−８濃度、横軸は各ジテルペン化合物の添加濃度である。
図５より、ジテルペン化合物１、４は、低添加添加濃度領域でＩＬ−８の産生を促進し、ジテルペン化合物２、３、５及び６はＩＬ−８の産生を抑制することが確認できた。
また、ジテルペン化合物５は、高添加濃度領域において、ＩＬ−８産生制御作用が抑制から促進に転換した。
【００７６】
[実施例６] ジテルペン化合物１〜６のサイトカイン産生制御作用の確認 ２
（試験方法）
ジテルペン化合物１〜６のＭＣＰ−１産生抑制効果を確認するために、以下の試験を行った。
９６ウェルプレートで培養したＨＵＶＥＣにジテルペン化合物１〜６を、それぞれ、１．５μＭ、１５μＭ及び１５０μＭとなるように添加した１８個の試料を用意し、３時間インキュベーションした。続いて、ヒトＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１６時間インキュベーションした後、培養液中のＭＣＰ−１の濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。 また、比較のため、ヒトＴＮＦ−α、ジテルペン化合物いずれも添加しない試料と、ヒトＴＮＦ−αのみ添加し、ジテルペン化合物を添加しない試料を用意した。
（結果）
各試料におけるＭＣＰ−１産生量を図６に示す。図６において、縦軸は培養液中のＭＣＰ−１の濃度、横軸は各ジテルペンの添加濃度である。
図６より、ジテルペン化合物１、４は低添加濃度領域でＭＣＰ−１の産生を促進し、ジテルペン化合物２、３、５及び６は、ＭＣＰ−１の産生を抑制することが確認できた。
また、ジテルペン化合物５は、高添加濃度領域において、ＭＣＰ−１産生抑制作用を失った。
さらに、実施例５、６の結果の比較から、ジテルペン化合物１〜６は、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の産生に対して、ほぼ同様の傾向の産生制御作用を示すことが確認できた。
【００７７】
[参考例３]
参考のため、ジテルペン化合物１〜６の、種々の濃度における自然免疫活性、細胞毒性を測定した。なお、自然免疫活性、細胞毒性は、参考例１、参考例２に記載した方法と同様にして測定した。
また、ジテルペン化合物１、２については、さらに、転写・翻訳活性（熱刺激により誘導されるβ−ガラクトシダーゼの産生量）を測定した。なお、転写・翻訳活性は、「（ｉ）培地の調製」においてＬＰＳを培地に添加しなかった点、「（ｖｉ）評価」において対照試料として培地にＤＭＳＯのみ添加したものを用い、ブランク試料として培地にＴ−２ｔｏｘｉｎを１００μＭとなるように添加したものを用いた点、及び、「（ｉｉ）解剖と培養」を以下のように変更した点以外は参考例１と同様にして測定した。
（ｉｉ）解剖と培養
ショウジョウバエの幼虫が入ったチューブを３０℃のインキュベーターに２２分間入れて、幼虫に熱刺激を与えた。幼虫に熱刺激が加わらないように４℃以下の低温条件下で、幼虫の頭部を切断して抗菌ペプチドの産生器官である脂肪体を露出させた。このようにして得た脂肪体を、１ウェルあたり１００μＬの培地の入った９６ウェルプレートの各ウェルに１匹ずつ入れ、２５℃で１８時間培養した。なお、培養は１試料につき、６匹分行った。
結果を図７に示す。図７において、□、○、△は、それぞれ、自然免疫活性、細胞生存率、転写・翻訳活性を表し、縦軸は各ジテルペン化合物の自然免疫活性、細胞生存率、又は転写・翻訳活性（対照試料に対する相対値（％））であり、横軸は各ジテルペン化合物の添加濃度である。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、サイトカインの産生異常に起因する各種疾患の治療薬や予防薬、又は、免疫低下に起因する疾患の予防薬の有効成分として用いることができる。
また、本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、免疫賦活剤として、食品や動物用飼料に添加することができる。
さらに、本発明の式（１）で表されるジテルペン化合物は、抗昆虫剤として、農薬に添加することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】チェリモヤの抽出物からのジテルペン化合物の単離手順を示す図である。
【図２】ＡＣ−４の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図３】ＡＣ−５の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図４】ＡＣ−６の比旋光度、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＬＲＥＩＭＳ、ＨＲＥＩＭＳのデータである。
【図５】ジテルペン化合物１〜６のＩＬ−８産生制御作用を示すグラフである。
【図６】ジテルペン化合物１〜６のＭＣＰ−１産生制御作用を示すグラフである。
【図７】ジテルペン化合物１〜６の自然免疫活性、細胞毒性、転写・翻訳活性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物。
式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項２】
式（１）において、Ｒ１が、水素又はアセチル基であり、Ｒ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
式（１）で表されるジテルペン化合物が、式（２）で表される化合物である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
式（２）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【請求項４】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤。
式（１）
【化３】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項５】
式（１）において、Ｒ１が、水素又はアセチル基であり、Ｒ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項４に記載のサイトカイン産生制御剤。
【請求項６】
式（１）で表されるジテルペン化合物が、式（２）で表される化合物である請求項４又は５に記載のサイトカイン産生制御剤。
式（２）
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のサイトカイン産生制御剤を含む食品。
【請求項８】
式（１）で表されるジテルペン化合物の製造方法であって、
チェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）から抽出物を抽出する工程と、
該抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程と、
を含む方法。
式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項９】
前記抽出物から単離した式（１）で表されるジテルペン化合物の一部の置換基を変換する工程をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式（３）で表されるジテルペン化合物。
式（３）
【化６】
（式中、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。）
【請求項１１】
式（３）におけるＲ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項１０に記載のジテルペン化合物。
【請求項１】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含む医薬組成物。
式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項２】
式（１）において、Ｒ１が、水素又はアセチル基であり、Ｒ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
式（１）で表されるジテルペン化合物が、式（２）で表される化合物である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
式（２）
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【請求項４】
式（１）で表されるジテルペン化合物を含むサイトカイン産生制御剤。
式（１）
【化３】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項５】
式（１）において、Ｒ１が、水素又はアセチル基であり、Ｒ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項４に記載のサイトカイン産生制御剤。
【請求項６】
式（１）で表されるジテルペン化合物が、式（２）で表される化合物である請求項４又は５に記載のサイトカイン産生制御剤。
式（２）
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ、ｍ、ｌは、式（１）における定義と同じである。）
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のサイトカイン産生制御剤を含む食品。
【請求項８】
式（１）で表されるジテルペン化合物の製造方法であって、
チェリモヤ（Ａｎｎｏｎａ Ｃｈｅｒｉｍｏｌａ Ｍｉｌｌ．）から抽出物を抽出する工程と、
該抽出物から式（１）で表されるジテルペン化合物を単離する工程と、
を含む方法。
式（１）
【化５】
（式中、Ｒ１は、水素、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。また、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６の炭化水素基を表し、ｎは０〜３の整数、ｍは０〜２の整数、ｌは０〜５の整数である。）
【請求項９】
前記抽出物から単離した式（１）で表されるジテルペン化合物の一部の置換基を変換する工程をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式（３）で表されるジテルペン化合物。
式（３）
【化６】
（式中、Ｒ２は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６アシル基、又は、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ６炭化水素基を表す。）
【請求項１１】
式（３）におけるＲ２が、メトキシカルボニル基、アルデヒド基又はヒドロキシメチル基のいずれかである請求項１０に記載のジテルペン化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２１４２０５（Ｐ２００８−２１４２０５Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６１９（Ｐ２００７−５０６１９）
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（３９１０２６０５８）ザ・コカ−コーラ・カンパニー (238)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＯＣＡ−ＣＯＬＡ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（３９１０２６０５８）ザ・コカ−コーラ・カンパニー (238)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＯＣＡ−ＣＯＬＡ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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