少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドを含む薬学的組成物およびキット、ならびにアミロイド関連疾患を診断および処置するための前記ペプチドの使用方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＩ型糖尿病などのアミロイド関連疾患を診断、予防、および処置するために使用することができるペプチドおよびそれに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド物質沈着（これはまたアミロイド斑形成とも呼ばれる）は、アルツハイマー病、プリオンに関連した脳障害、ＩＩ型糖尿病、家族性アミロイドーシスおよび軽鎖アミロイドーシスを含む、関連性のない様々な病理学的状態の中心的な特徴である。
【０００３】
アミロイド物質は、直径が約８０Å〜１００Åである一定しない長さの堅い非分岐タンパク質性原繊維の密な網状構造から構成される。アミロイド原繊維は、その長軸が原繊維の長軸に直交する逆平行のβ−プリーツシートに配置されたポリペプチド鎖のコア構造を含有する［Ｂｏｔｈ他（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：７８７〜９３；Ｇｌｅｎｎｅｒ（１９８０）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３０２：１２８３〜９２］。
【０００４】
約２０個のアミロイド原繊維タンパク質がこれまでにインビボで同定され、特異的な疾患と相関づけられている。これらのタンパク質は互いにアミノ酸配列相同性をほとんど有しておらず、しかしながら、アミロイド原繊維のコア構造は本質的には同じである。アミロイド原繊維のこの共通するコア構造、およびアミロイド沈着物における共通物質の存在は、アミロイド物質の特定の形態を特徴づけるデータが、アミロイド物質の他の形態にもまた関係することがあり、従って、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー痴呆またはアルツハイマー病、およびプリオンに関連した脳障害などのアミロイド関連疾患に対する薬物を開発するための鋳型設計において具体化され得ることを示唆している。
【０００５】
さらに、アミロイド沈着物は、インビボでは不活性ではないようであり、むしろ、代謝回転の動的状態にあり、そして、原繊維の形成が停止される場合、退行することさえもあり得る［Ｇｉｌｌｍｏｒｅ他（１９９７）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、９９：２４５〜５６］。
【０００６】
従って、アミロイドポリペプチドの産生を阻害するか、またはアミロイドーシスを阻害するために設計された治療は、アミロイド関連疾患を処置するために有用であり得る。
【０００７】
アミロイドポリペプチドの産生の阻害−アミロイドポリペプチドの産生の直接的な阻害が、例えば、ヒト小島アミロイドポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって達成され得る。インビトロでは、小島アミロイドポリペプチドのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加またはアンチセンス相補的ＤＮＡの発現は、細胞のインスリンのｍＲＮＡ含有量およびタンパク質含有量を増大させており、これにより、この方法の潜在的な有効性が明らかにされている［Ｋｕｌｋａｒｎｉ他（１９９６）、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５１：３４１〜８；Ｎｏｖｉａｌｓ他（１９９８）、Ｐａｎｃｒｅａｓ、１７：１８２〜６］。しかしながら、そのようなアンチセンス分子のインビボ有効性を明らかにする実験結果は何ら明らかにされていない。
【０００８】
アミロイド原繊維の形成の阻害−小島アミロイドを含むアミロイドは、血清アミロイドＰ成分、アポリポタンパク質Ｅおよびパールカンなどの潜在的な安定化物質または保護物質を含有する。発達中のアミロイド原繊維に対するそれらの結合を阻止することにより、アミロイド形成タンパク質の特定部分に対して特異的な抗体による処置［Ｓｏｌｏｍｏｎ他（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４１０９〜１２］が可能であるように、アミロイド形成を阻害することができる［Ｋａｈｎ他（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２４１〜５３］。
【０００９】
下記には、アミロイド構造を脱安定化する能力を有する薬物を操作するための現在の試みがまとめられている。
【００１０】
脱安定化化合物−ヘパリン硫酸がすべてのアミロイドの成分として同定されており、ヘパリン硫酸はまた、炎症に関連するアミロイド誘導のごく初期段階においても関係している。Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙおよび共同研究者（Ｍａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１：１４３〜１４８、１９９５）は、ヘパリン硫酸が炎症関連のアミロイド前駆体およびアルツハイマー病（ＡＤ）のβ−ペプチドと相互作用することを妨害する低分子量のアニオン性のスルホネート化合物またはスルフェート化合物の使用を記載した。ヘパリン硫酸は、アミロイドタンパク質の折りたたみパターンに特徴的な増大したβ−シート構造を受け入れるために可溶性アミロイド前駆体（ＳＡＡ２）に特異的な影響を及ぼす。これらのアニオン性のスルホネート化合物またはスルフェート化合物は、電子顕微鏡写真によってモニターされたとき、ヘパリンにより加速されるＡβ原繊維形成を阻害することが示され、また、事前に形成された原繊維をインビトロで分解することができた。さらに、これらの化合物は、急性モデルおよび慢性モデルにおいてインビボで、マウスの脾臓での炎症関連のアミロイドの進行を実質的に停止させた。しかしながら、最も強力な化合物［すなわち、ポリ（ビニルスルホネート）］は急性毒性を示した。類似する毒性が、免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）患者においてアミロイド再吸収を誘導することが認められている別の化合物ＩＤＯＸ（アントラサイクリン ４’−ヨード−４’−デオキシドキソルビシン）に関して観測されている［Ｍｅｒｌｉｎｉ他（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］。
【００１１】
脱安定化抗体−抗β−アミロイドモノクローナル抗体が、インビトロでβ−アミロイド斑を脱凝集し、β−アミロイド斑の形成を予防することにおいて効果的であることが示されている（米国特許第５６８８５６１号）。しかしながら、そのような抗体のインビボでの有効性を明らかにする実験結果は何ら明らかにされていない。
【００１２】
脱安定化ペプチド−β−プリーツシートを破壊する合成ペプチド（「β−シート破壊剤」）を加えることにより、原繊維が解離し、アミロイドーシスが妨げられたという発見［Ｓｏｔｏ他（１９９８）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、４：８２２〜６］は、臨床的観点から特に有望である。簡単に記載すると、５残基のペプチドにより、アミロイドβ−タンパク質の原繊維形成が阻害され、事前に形成された原繊維がインビトロで分解され、そして、細胞培養において原繊維により誘導されるニューロンの死が妨げられた。さらに、このβ−シート破壊剤ペプチドは、アミロイドβ−タンパク質の沈着をインビボで著しく減少させ、そしてアミロイドーシスのラット脳モデルにおいてアミロイド原繊維の形成を完全に阻止した。
【００１３】
小分子−アミロイドポリペプチドと結合し、これによりタンパク質の本来の折りたたみを安定化させる小分子の使用の可能性が、トランスチレチン（ＴＴＲ）タンパク質の場合に試みられている［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１２９６５〜１２９６０；Ｏｚａ（１９９９）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、９：１〜６］。これまでに、チロキシンおよびフルフェナム酸などの分子が、アミロイド形成をもたらす立体配座変化を妨げることができることが明らかにされている。しかしながら、動物モデルにおけるこれらの化合物の使用は、未だ立証されておらず、また、これらのリガンドと結合することができる、ＴＴＲ以外のタンパク質が血液中に存在するために損なわれ得る。
【００１４】
抗酸化剤−別の提案された治療は、酸化ストレスを回避し、アミロイドタンパク質をその還元状態（すなわち、モノマーおよびダイマー）で維持するために抗酸化剤を摂取することであった。亜硫酸塩の使用は、ＴＴＲのより安定なモノマーをインビトロおよびインビボの両方でもたらすことが示されていた［Ａｌｔｌａｎｄ（１９９９）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：１８３〜１８８］。しかしながら、抗酸化作用の完全な特徴づけは依然として得られておらず、可能な治療法に関する結果の解釈は困難なままである。
【００１５】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、米国特許第６３５９１１２号（Ｋａｐｕｒｎｉｏｔｕ）の教示に反して、アミロイド原繊維へのペプチド凝集が芳香族相互作用によって支配されることを明らかにしている。そのような知見は、アミロイド関連疾患を診断および処置するために使用することができるペプチドを効率的かつ正確に設計することを可能にする。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の１つの局面によれば、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
【００１７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、アミノ酸配列はさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、アミノ酸配列はさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される。
【００２０】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、生理学的条件のもとで自己凝集することができるペプチドが提供される。
【００２４】
本発明のさらにまた別の局面によれば、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドが提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の局面によれば、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。
【００２６】
本発明のさらなる局面によれば、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１および配列番号２１〜配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。
【００２７】
本発明のさらにまたさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明のなおさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供される。
【００２９】
記載される好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、ペプチドは、生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である。
【００３０】
本発明のさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供され、この場合、ペプチドは、生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である。
【００３１】
本発明のなおさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供され、この場合、ペプチドは、薬学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である。
【００３３】
記載される好ましい実施形態のなおさらなる特徴によれば、ペプチドは核酸構築物から発現される。
【００３４】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００３５】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００３６】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００３７】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００３８】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００３９】
本発明のなおさらなる局面によれば、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物が提供される。
【００４０】
本発明のなおさらなる局面によれば、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物が提供される。
【００４１】
本発明のなおさらなる局面によれば、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物が提供される。
【００４２】
本発明のなおさらなる局面によれば、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を含む抗体または抗体フラグメントが提供される。
【００４３】
本発明のなおさらなる局面によれば、アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を有する抗体または抗体フラグメントを有効成分として含む薬学的組成物が提供される。
【００４４】
本発明のなおさらなる局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を有する抗体または抗体フラグメントの治療有効量を個体に与えることを含む方法が提供される。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ペプチドはさらに、少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端に含む。
【００４６】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ペプチドは直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである。
【００４７】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ペプチドはさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む。
【００４８】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、β−破壊剤アミノ酸はプロリンである。
【００４９】
本発明は、ＩＩ型糖尿病などのアミロイド関連疾患を診断および処置するために使用することができる新規なペプチド、組成物および方法を提供することによって、現在知られている形態の様々な欠点に対処することに成功している。
【００５０】
図面の簡単な説明
本明細書では一例として添付の図面を参照しながら本発明を説明する。図面に示す詳細は一例であって、本発明の好ましい態様の具体例を挙げる目的しかなく、本発明の原理および概念的特徴を最も有効かつ理解しやすいと考えられる形で説明するために記載するものである。この点に関して、本発明の構成上の詳細は、本発明の基本的理解に必要な程度にしか詳しく説明していないが、本明細書と図面を合わせて検討することにより、当業者には、本発明のいくつかの形態を実際に具体化する方法が明らかになるだろう。
図１は多数のアミロイドタンパク質に由来するペプチド群の、ＫｙｔｅおよびＤｏｌｉｔｔｌｅの尺度を使用して推定されるような、自己集合能とその疎水性とを示す模式図である。分析されたペプチドの疎水性とアミロイド形成能との間には相関が何ら認められないことに留意すること。このペプチド群における潜在的なアミロイド原繊維形成能に対する唯一の明らかな目安は、芳香族性と最小長さの組合せである。
図２は阻害性芳香族試薬のＲｏ４７−１８１６／００１（図２ａ）、チオフラビンＴ（図２ｂ）およびＣＲ色素（図２ｃ）とのアミロイド結合を模式的に示す。
図３はヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰと本発明の合成ペプチドとの間での一次配列比較の模式図である。図３ａはヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰの配列アラインメントである。ブロック部は、配列間で大きな不一致を示す７アミノ酸の部分配列を示す。「基本アミロイド形成ユニット」が太字によって表され、下線が引かれている。図３ｂは野生型ＩＡＰＰペプチド（配列番号１）の化学構造を示す。図３ｃは、基本アミロイド形成ユニットに由来するペプチドの一次配列および配列番号を示す。
図４は原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。下記の記号が使用される：黒四角−Ｎ１Ａ、白丸−Ｇ３Ａ、黒丸−野生型、白三角−Ｌ６Ａ、白四角−Ｉ５Ａ、および黒三角−Ｆ２Ａ。
図５は光散乱によって測定されたときの会合したＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の平均粒子サイズを示すヒストグラムである。それぞれの柱は３回〜５回の独立した測定の結果を表す。
図６は事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。通常場および偏光場での顕微鏡写真が、下記の寝かせたペプチド懸濁物のそれぞれについてそれぞれ示される：Ｎ１Ａペプチド（図６ａ〜図６ｂ）、Ｆ２Ａペプチド（図６ｃ〜図６ｄ）、Ｇ３Ａペプチド（図６ｅ〜図６ｆ）、野生型ペプチド（図６ｇ〜図６ｈ）、Ｉ５Ａペプチド（図６ｉ〜図６ｊ）、およびＬ６Ａペプチド（図６ｋ〜図６ｌ）。
図７は「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である：Ｎ１Ａペプチド（図７ａ）、Ｆ２Ａペプチド（図７ｂ）、Ｇ３Ａペプチド（図７ｃ）、野生型ペプチド（図７ｄ）、Ｉ５Ａペプチド（図７ｅ）、およびＬ６Ａペプチド（図７ｆ）。示されるスケールバーは１００ｎｍを表す。
図８ａは野生型ｈＩＡＰＰと、細菌のコドン使用頻度に従って改変された対応する配列との核酸配列アラインメントである。改変された塩基には下線が引かれている。
図８ｂは４８ｋＤａのＭＢＰ−ＩＡＰＰタンパク質の細胞質発現のために使用されるｐＭＡＬｃ２ｘ−ＮＮベクターの模式図である。Ｖ８ Ｅｋ切断部位および（Ｈｉｓ）６タグがｍａｌＥタグのベクター配列のＣ末端に融合されている。ＭＢＰを除くためのＸａ因子切断部位が示されている。
図９はＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質の細菌発現および精製を示すタンパク質ゲルＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色である。細菌細胞抽出物が調製され、タンパク質がアミロース樹脂カラムで精製された。２５μｇのタンパク質を含むサンプルがレーン１〜３のそれぞれに加えられ、これに対して、５μｇのタンパク質がレーン４〜５のそれぞれに加えられた。タンパク質が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色により可視化された。分子量マーカーを左側に示す。レーン１−０．５ｍＭのＩＰＧＴで誘導されたＭＢＰ可溶性抽出物、レーン２−０．１ｍＭのＩＰＧＴで誘導されたＭＢＰ−ＩＡＰＰ可溶性抽出物、レーン３−０．５ｍＭのＩＰＧＴで誘導されたＭＢＰ−ＩＡＰＰ可溶性抽出物、レーン４−精製ＭＢＰ、レーン５−精製ＭＢＰ−ＩＡＰＰ。矢印はＭＢＰ−ＩＡＰＰを示す。
図１０はｈＩＡＰＰにおける推定されるアミロイド形成配列を示すドットブロット画像（図１０ａ）およびそのデンシトメトリー定量（図１０ｂ）である。
図１１は原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチド（配列番号１４〜１９）の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。下記の記号が使用される：黒四角−ＦＬＶＨＳＳ、白丸−ＦＬＶＨＳ、黒菱形−ＮＦＬＶＨＳＳ、白三角−ＮＦＬＶＨＳＳＮＮ、白四角−ＦＬＶＨ、および黒三角−ＮＦＬＶＨ。
図１２は事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。偏光場での顕微鏡写真が、下記の１日寝かせたペプチド懸濁物のそれぞれについて示される：ＮＦＬＶＨＳＳＮＮペプチド（図１２ａ）、ＮＦＬＶＨＳＳ（図１２ｂ）、ＦＬＶＨＳＳ（図１２ｃ）、ＮＦＬＶＨ（図１２ｄ）、ＦＬＶＨＳ（図１２ｅ）、およびＦＬＶＨ（図１２ｆ）。
図１３は「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。ＮＦＬＶＨＳＳＮＮペプチド（図１３ａ）、ＮＦＬＶＨＳＳ（図１３ｂ）、ＦＬＶＨＳＳ（図１３ｃ）、ＮＦＬＶＨ（図１３ｄ）、ＦＬＶＨＳ（図１３ｅ）、およびＦＬＶＨ（図１３ｆ）。示されるスケールバーは１００ｎｍを表す。
図１４はフーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。ＮＦＬＶＨＳＳＮＮペプチド（図１４ａ）、ＮＦＬＶＨＳＳ（図１４ｂ）、ＦＬＶＨＳＳ（図１４ｃ）、ＮＦＬＶＨ（図１４ｄ）、ＦＬＶＨＳ（図１４ｅ）、およびＦＬＶＨ（図１４ｆ）。
図１５はメジンの以前に報告されたアミロイド形成ペプチドフラグメントの化学構造である［Ｈａｅｇｇｑｖｉｓｔ（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：８６６９〜８６７４］。
図１６は原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、メジン由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。図１６ａは短期間の速度論アッセイを示す。図１６ｂは長期間の速度論アッセイを示す。
図１７は「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。ＮＦＧＳＶＱＦＡ−図１７ａ、ＮＦＧＳＶＱ−図１７ｂ、ＮＦＧＳＶ−図１７ｃ、ＦＧＳＶＱ−図１７ｄ、ＧＳＶＱ−図１７ｅ、およびＦＧＳＶ−図１７ｆ。示されるスケールバーは１００ｎｍを表す。
図１８は事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。偏光場での顕微鏡写真が、下記の寝かせたペプチド懸濁物のそれぞれについて示される：ＮＦＧＳＶＱＦＡ−図１８ａ、ＮＦＧＳＶＱ−図１８ｂ、ＮＦＧＳＶ−図１８ｃ、ＦＧＳＶＱ−図１８ｄ、ＧＳＶＱ−図１８ｅ、およびＦＧＳＶ−図１８ｆ。
図１９はメジンのヘキサペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図１９ａは、原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、メジン由来アラニン変異型の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。図１９ｂは、「寝かせた」メジン由来のアラニン変異型の電子顕微鏡写真であり、スケールバーは１００ｎｍを表す。図１９ｃは、事前に会合させたメジン由来ペプチド変異型へのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
図２０はヒトカルシトニンのアミノ酸配列（図２０ａ）およびヒトカルシトニンのアミロイド形成ペプチドフラグメントの化学構造（図２０ｂ）である。カルシトニンのオリゴマー化状態およびホルモン活性にとって重要である残基１７および残基１８には下線が付されている［Ｋａｚａｎｔｚｉｓ（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９：７８０〜７９１］。
図２１は「寝かせた」カルシトニン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。ＤＦＮＫＦ−図２１ａ、ＤＦＮＫ−図２１ｂ、ＦＮＫＦ−図２１ｃ、およびＤＦＮ−図２１ｄ。示されるスケールバーは１００ｎｍを表す。
図２２は事前に会合させたカルシトニン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。偏光場での顕微鏡写真が、下記の寝かせたペプチド懸濁物のそれぞれについて示される：ＤＦＮＫＦ−図２２ａ、ＤＦＮＫ−図２２ｂ、ＦＮＫＦ−図２２ｃ、およびＤＦＮ−図２２ｄ。
図２３はフーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性カルシトニン凝集物における二次構造を示すグラフである。
図２４はカルシトニンのペンタペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図２４ａは、「寝かせた」カルシトニン由来のアラニン変異型の電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。図２４ｂは、事前に会合させたカルシトニン由来のペプチド変異型へのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。図２４ｃは、フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの変異型ペプチドにおける二次構造を示すグラフである。
図２５は「寝かせた」ラクトトランスフェリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図２６は「寝かせた」血清アミロイドＡタンパク質由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図２７は「寝かせた」ＢｒｉＬ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図２８は「寝かせた」ゲルゾリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図２９は「寝かせた」血清アミロイドＰ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３０は「寝かせた」免疫グロブリン軽鎖由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３１は「寝かせた」シスタチンＣ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３２は「寝かせた」トランスチレチン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３３は「寝かせた」リゾチーム由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３４は「寝かせた」フィブリノーゲン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３５は「寝かせた」インスリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３６は「寝かせた」プロラクチン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３７は「寝かせた」β２ミクログロブリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。スケールバーは１００ｎｍを表す。
図３８はＩＡＰＰの己会合に対する阻害ペプチドの作用を示すグラフである。四角−野生型（ｗｔ）ＩＡＰＰペプチド；三角−ｗｔ−ＩＡＰＰ＋阻害ペプチド；丸−ペプチドなし。
図３９は原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチド（配列番号４６〜４９）の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
図４０は７日間寝かせた後のＩＡＰＰアナログの濁度を示すヒストグラム図を示す。
図４１は「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。ＮＦＧＡＩＬＳＳ−図４１ａ、ＮＦＧＡＩＬＳＳ−図４１ｂ、ＮＩＧＡＩＬＳＳ−図４１ｃ、ＮＬＧＡＩＬＳＳ−図４１ｄ、ＮＶＧＡＩＬＳＳ−図４１ｅ、およびＮＡＧＡＩＬＳＳ−図４１ｆ。示されるスケールバーは１００ｎｍを表す。
図４２は最小のアミロイド形成配列ＳＮＮＸＧＡＩＬＳＳ（Ｘ＝システイン以外の任意の天然アミノ酸）のアナログに対するＩＡＰＰ−ＮＦＧＡＩＬＳＳの結合を示す。図４２ａは結合させたペプチドアレイの短期間の暴露を示す。図４２ｂは結合させたペプチドアレイの長期間の暴露を示す。図４２ｃは、デンシトメトリーおよび任意単位を使用する、短期間の暴露（図４２ａ）の定量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明は、ＩＩ型糖尿病などのアミロイド関連疾患を診断または処置するための新規なペプチド、それに対する抗体、それらを含む組成物、およびそれぞれの使用方法に関する。
【００５２】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示すか、または図面に示す各構成成分の構築および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、限定的であると見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００５４】
アミロイド原繊維形成を妨げるか、またはアミロイド物質を分解するための数多くの治療方法が先行技術に記載されている。しかしながら、現在の治療方法は、細胞毒性、非特異性および送達といった壁によって制限されている。
【００５５】
本発明を実施に移している間に、また、ＩＩ型糖尿病などのアミロイド関連疾患に対する新規な治療様式について探し求めている間に、本発明者は、原繊維形成を行わせるアミロイド形成性のペプチドに特徴的な配列を同定した。この発見は、秩序のあるアミロイド形成には、非特異的な疎水性相互作用を伴う以前に記載された機構［Ｐｅｔｋｏｖａ（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１６７４２〜１６７４７］ではなく、むしろ、分子相互作用の特異的なパターンが関係していることを示唆している。
【００５６】
本明細書中下記に、そして下記の実施例の節にさらに例示されるように、本発明者は、アミロイド形成における芳香族残基に対する非常に重要な役割を考えていた。アミロイド形成プロセスにおける芳香族残基の関与は、分子認識および自己会合におけるπのそのような相互作用の十分に確立された役割と一致している［Ｇｉｌｌａｒｄ他（１９９７）、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：１９３３〜４０；ＣｌａｅｓｓｅｎｓおよびＳｔｏｄｄａｒｔ（１９９７）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１０：２５４〜７２；Ｓｈｅｔｔｙ他（１９９６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８：１０１９〜２７；ＭｃＧｕａｇｈｅｙ他（１９９８）、πスタッキング相互作用：タンパク質における機能、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、１５４５８〜１５４６３；ＳｕｎおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ（１９９６）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、１００：１３３４８〜６６］。πスタッキング相互作用は、平面の芳香族環の間で形成される非結合の相互作用である。そのような秩序だったスタッキング構造の形成に伴う立体的な制約が、超分子構造の形成をもたらす自己会合プロセスにおいて基本的な役割を有している。そのようなπスタッキング相互作用は、おそらくはエントロピー駆動によるものであるが、ＤＮＡの二重らせん構造の安定化、タンパク質の三次構造のコア充填および安定化、ホスト−ゲスト相互作用、ならびに溶液中でのポルフィリン凝集などの多くの生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしている［アミロイド原繊維の自己会合におけるπスタッキング相互作用の可能な役割についてのさらなる総説については、Ｇａｚｉｔ（２００２）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１６：７７〜８３を参照のこと］。
【００５７】
アミロイドの自己会合を媒介するために十分である芳香族配列を同定することにより、アミロイド斑の形成によって特徴づけられる疾患を処置または診断するために利用することができる非常に有効な診断用ペプチド、予防用ペプチドおよび治療用ペプチドを作製することが初めて可能になる。
【００５８】
従って、本発明の１つの局面によれば、配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、原繊維への自己凝集が可能であるペプチドが提供される。本明細書中下記にさらに記載されるように、自己凝集能を有するペプチドおよびその改変体は診断用および治療用に利用することができる。
【００５９】
配列番号７に示す配列は、実施例の節に示す結果によって示されるように、アミロイド原繊維の形成にとって非常に重要である少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含む。芳香族アミノ酸の疎水性ではなく、むしろ芳香族性が、実施例の節の実施例３６〜３９に示すように、アミロイドの自己会合における支配的な化学的特徴であることが理解される。
【００６０】
芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、フェニルグリシン、あるいは、それらの修飾体、前駆体または機能的な芳香族部分を含む（しかしこれらに限定されない）任意の天然に存在する芳香族残基または合成された芳香族残基であり得る。本発明によって使用され得る芳香族残基の例を下記の表２に示す。
【００６１】
下記の実施例の節に示す結果によって明らかにされるように、本発明は、様々な程度の自己凝集速度論および凝集物構造を示すペプチドの設計を容易にする。
【００６２】
本明細書中で使用される表現「自己凝集」は、水溶液中で凝集物（例えば、原繊維）を形成するペプチドの能力を示す。自己凝集するペプチドの能力、ならびにそのような自己凝集の速度論およびタイプにより、アミロイド疾患の処置または診断でのペプチドの使用が決定される。
【００６３】
凝集速度論および凝集物構造は、作製されたペプチドの特異的な残基組成およびおそらくは長さ（図１参照）によって主に決定されるので、本発明は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０〜１９、配列番号２１〜２２、配列番号２５もしくは配列番号２７〜４５に示す配列を含むより長いペプチド（例えば、１０アミノ酸〜５０アミノ酸）、または、これらの配列のいずれかを含むより短いペプチド（２アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基）の両方を包含する。その自己凝集性のために、これらのペプチドは強力な診断試薬として使用することができる。
【００６４】
アミロイド形成の速度を速めるために、本発明のペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの極性の電荷を有していないアミノ酸をさらに含み、そのようなアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、あるいはそれらの天然の誘導体または合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（表２参照）。
【００６５】
さらに、本発明のペプチドは、少なくとも１対の正電荷を有しているアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）および負電荷を有しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）をさらに含むことができる（例えば、配列番号２７〜２９）。そのようなアミノ酸組成は好適であり得る。これは、実施例の節の実施例２１に示すように、反対の電荷の間での静電的相互作用により、秩序のある逆平行構造の形成が誘導され得ると考えられるからである。
【００６６】
本発明者らは、原繊維形成を支配する配列特徴を同定しているので、本発明の教示はまた、原繊維には凝集せず、原繊維形成を防止もしくは減少させること、または、以前に形成された原繊維を破壊することのいずれかが可能であり、従って、治療薬として使用することができるペプチドの設計を可能にする。
【００６７】
例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５または配列番号３０によって包含されるペプチドを治療のために利用することができる。なぜならこれは、下記の実施例の節に示すように、そのようなペプチドは、野生型ペプチドと比較したとき、凝集を示さず（配列番号９）、または、遅い凝集速度論を示す（配列番号９および配列番号１０）からである。アミロイド形成は非常に遅いプロセスであるので、これらのペプチド配列は、生理学的条件のもとでアミロイドーシスを完全に阻害するか、または著しく遅らせると考えられる。
【００６８】
本明細書に用いる用語「ペプチド」とは、天然ペプチド（分解産物、合成ペプチド又は組換えペプチドのいずれか）並びにペプチドを生体中でより安定又はより細胞内への浸透が可能なように修飾していてもよいペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイドなどのペプチド擬似体（典型的には、合成ペプチド）を含む。このような修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾が挙げられるがこれらに限定されず、ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨ、骨格修飾及び残基修飾が挙げられるがこれらに限定されない。ペプチド擬似体化合物を調製する方法は、当該技術分野ではよく知られており、例えばＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｃ．Ａ． Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２， Ｆ． Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ出版（１９９２）に特定され、これは本明細書中に完全に記載されている参考文献により取り込まれている。この局面でのさらなる詳細を以下に記載する。
【００６９】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を、例えばＮ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ_２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは例えばメチルなどのアルキル基）、カルバ結合（−ＣＨ_２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−ＣＯ−）（式中、Ｒは炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖）により置換してもよい。
【００７０】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれにおいて生じてもよく、同時に数カ所（２〜３）で生じてもよい。
【００７１】
天然芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅが、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレルアニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環状メチル化誘導体、Ｐｈｅ又はｏ−メチル−Ｔｙｒのハロゲン化誘導体などの合成非天然酸で置換してもよい。
【００７２】
上記よりさらに、本発明のペプチドは１つ以上の修飾されたアミノ酸または１つ以上の非アミノ酸モノマ−（例えば脂肪酸、炭水化物複合体など）も含んでもよい。
【００７３】
本明細書中及び請求の範囲の部分中に用いる用語「アミノ酸」又は「複数アミノ酸」とは、２０個の天然に生じるアミノ酸であって、これらのアミノ酸はしばしば翻訳後にｉｎ ｖｉｖｏで修飾され、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホスレオニンが挙げられ、及び２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシン及びオルニチンなどの、しかしこれらに限定されない他の通常にはないアミノ酸を含むものと理解されるべきである。さらに、用語「アミノ酸」はＤ−及びＬ−アミノ酸の両者を含む。
【００７４】
以下の表１及び２は、本発明において用いられる天然に生じるアミノ酸（表１）及び慣用でない又は修飾アミノ酸（表２）を挙げる。
【表１】

【表２】



【００７５】
本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチドが可溶性の形態であることが要求される治療薬または診断薬において利用されるので、本発明のペプチドは、好ましくは、１つ以上の非天然型または天然型の極性アミノ酸を含み、そのようなアミノ酸には、そのヒドロキシル含有側鎖によりペプチドの溶解性を増大させることができるセリンおよびトレオニンが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
治療用の場合、本発明のペプチドは、好ましくは、約−１２０度〜−１４０度の典型的なβ−シートφ角ではなく、約−６０度〜＋２５度の限定されたφ角によって特徴づけられ、それによりアミロイド原繊維のβ−シート構造を破壊する、少なくとも１つのβ−シート破壊剤アミノ酸残基（プロリンなど）をさらに含む（例えば、配列番号４５、背景の節を参照のこと）。
【００７７】
本発明のペプチドは、好ましくは、直鎖状形態で利用されるが、環化がペプチド特性を大きく妨害しない場合には、環状形態のペプチドもまた利用され得ることが理解される。
【００７８】
環状ペプチドは、環状形態で合成され得るか、または所望される条件（例えば、生理学的条件）のもとで環状形態を取るように構成され得るかのいずれかである。
【００７９】
従って、本発明は、原繊維の会合を導くアミロイドペプチドの構造的決定因子の正体に関する結論的データを提供する。
【００８０】
そのため、本発明により、アミロイドーシスの予防／処置または診断のために利用することができる様々なペプチド配列の設計が可能になる。
【００８１】
本発明者は数多くのアミロイド関連タンパク質において本発明のコンセンサスな芳香族配列（配列番号７）を同定することができたことが理解される（実施例の節の実施例６〜３５を参照のこと）。従って、本発明により、本質的にすべてのアミロイド形成タンパク質のアミロイド形成フラグメントを正確に同定することが可能になる。
【００８２】
さらに、小さい芳香族分子、例えば、Ｒｏ４７−１８１６／００１［Ｋｕｎｅｒ他（２０００）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１６７３〜８、図２ａ参照］および３−ｐ−トルオイル−２−［４’−（３−ジエチルアミノプロポキシ）フェニル］ベンゾフラン［Ｔｗｙｍａｎ（１９９９）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０：９３８３〜９３８４］などが、アルツハイマー病のβ−ポリペプチドの重合を阻害することにおいて有効であることが明らかにされており［Ｆｉｎｄｅｉｓ他（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５０３：７６〜８４］、その一方で、芳香族要素を含有するアミロイド特異的色素、例えば、コンゴーレッド（図２ｂ）およびチオフラビンＴ（図２ｃ）などが一般的なアミロイド形成阻害剤であるという事実は、本発明の認識モチーフを、アミロイドの自己会合のためには十分であることを実証している。
【００８３】
本発明のペプチドを得ることができることにより、アミロイド斑を解離させるために、またはアミロイド斑の形成を予防するために使用することができる、本発明のペプチドに対する抗体を作製することが可能になる（米国特許第５６８８５６１号）。
【００８４】
用語「抗体」は、完全な抗体分子、ならびに、マクロファージに結合することができるその機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖなどを示す。これらの機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：（ｉ）Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、完全な軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって製造することができるフラグメント；（ｉｉ）Ｆａｂ’、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、完全な軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメント；抗体分子１個あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２、完全な抗体を、その後の還元を伴うことなく、酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）_２は、２つのＦａｂ’フラグメントが２つのジスルフィド結合によって互いに結合している二量体である；（ｉｖ）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして規定される；および（ｖ）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子。
【００８５】
これらのフラグメントを作製する様々な方法がこの分野では知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８（これは参考として組み込まれる）を参照のこと）。
【００８６】
抗体（すなわち、モノクローナルおよびポリクローナル）を作製する様々な方法がこの分野では広く知られている。抗体は、この分野で知られているいくつかの方法のいずれか１つによって作製することができる。そのような方法では、抗体分子のインビボ産生の誘導、開示されているように免疫グロブリンライブラリーまたは非常に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすること［Ｏｒｌａｎｄｉ Ｄ．Ｒ．他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６：３８３３〜３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．他（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９］、あるいは、培養での連続した細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を用いることができる。これらには、限定されないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれる［Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．他（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ Ｄ．他（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１：３１〜４２；Ｃｏｔｅ Ｒ．Ｊ．他（１９８３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８０：２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．他（１９８４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６２：１０９〜１２０］。
【００８７】
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物もしくは他のタンパク質発現システム）での発現によって調製することができる。
【００８８】
抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）_２として示される５Ｓフラグメントを得るためにペプシンによる抗体の酵素切断によって作製することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを作製するために、チオール還元剤と、そして必要な場合には、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基に対する保護基とを使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断では、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよび１つのＦｃフラグメントが直接生じる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（そのような特許はその全体が参考として本明細書により組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ、Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５９もまた参照のこと。フラグメントが、完全な抗体により認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは、他の酵素的技術、化学的技術または遺伝学的技術などもまた使用することができる。
【００８９】
Ｆｖフラグメントは、Ｖ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されるように非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学試薬によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む。これらの単鎖の抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによってつながれたＶ_ＨドメインおよびＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後、発現ベクターは、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組み換え宿主細胞により、リンカーペプチドが２つのＶドメインをつないでいる単一のペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これらはその全体が参考として本明細書により組み込まれる）によって記載される。
【００９０】
別の形態の抗体フラグメントは、１つだけの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）を、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【００９１】
ヒトへの適用の場合、本発明の抗体は、好ましくは、ヒト化される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補的決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または導入されたＣＤＲ配列もしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべての可変ドメイン、または少なくとも１つの可変ドメイン、典型的には２つの可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【００９２】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源からその中に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、導入可変ドメインから典型的には選ばれる導入残基として示されることが多い。ヒト化は、本質的には、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］に従って行うことができる。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的には全体ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
【００９３】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原刺激したとき、ヒト抗体の産生が観測され、その抗体産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべてのことにおいてヒトで見られる抗体産生と非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号に記載され、また、下記の科学的刊行物に記載される：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）。
【００９４】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のペプチドに対する１つの具体的な使用は、アミロイド斑形成に関連する疾患の予防または処置である。
【００９５】
従って、本発明のさらにまた別の局面によれば、個体におけるアミロイド関連疾患を処置する方法が提供される。本発明による好ましい個体対象は哺乳動物であり、例えば、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒトなどである。
【００９６】
用語「処置する」は、アミロイド斑形成を減少させるか、もしくは予防すること、または、罹患組織における斑の出現を実質的に減少させることを示す。表現「アミロイド斑」は、原繊維アミロイド、ならびに、凝集したが、原繊維ではないアミロイド（以降、「プロト原繊維アミロイド」、これもまた病原性であり得る）を示す。例えば、凝集したが、必ずしも原繊維ではない形態のＩＡＰＰが、培養において毒性であることが見出された。Ａｎａｇｕｉａｎｏおよび共同研究者［（２００２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：１１３３８〜４３］によって示されるように、プロト原繊維ＩＡＰＰは、パーキンソン病の病理発生に関係しているプロト原繊維α−シヌセリンと同様に、合成された小胞を細孔様機構によって透過した。ＩＡＰＰアミロイド細孔の形成は、早期のＩＡＰＰオリゴマーの形成およびその消失からアミロイド原繊維の出現までと一時的に相関していた。これらの結果は、プロト原繊維ＩＡＰＰが、他のプロト原繊維タンパク質がアルツハイマー病およびパーキンソン病の発症にとって重要であるようにＩＩ型糖尿病にとって重要であり得ることを示唆している。
【００９７】
本発明に従って処置されるアミロイド関連疾患には、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病（ＡＤ）、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、前徴アルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、髄様ガン、大動脈の医学的ガン腫、インスリン注射アミロイドーシス、プリオン全身性アミロイドーシス、慢性炎症アミロイドーシス、ハンチントン病、老年性全身性アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、遺伝性腎アミロイドーシス、家族性英国痴呆、フィンランド遺伝性アミロイドーシス、家族性非神経障害性アミロイドーシス［Ｇａｚｉｔ（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、９：１６６７〜１６７５］、そして、プリオン病（ヒツジおよびヤギのスクレイピー、ならびに、ウシ類のウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含む）［ＷｉｌｅｓｍｉｔｈおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７２：２１〜３８］、そして、ヒトのプリオン病（これには、（ｉ）クールー、（ｉｉ）クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（ｉｉｉ）ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）および（ｉｖ）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）が含まれる）［Ｇａｊｄｕｓｅｋ（１９７７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７：９４３〜９６０；Ｍｅｄｏｒｉ、Ｔｒｉｔｓｃｈｌｅｒ他（１９９２）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３２６：４４４〜４４９］が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の方法は、本発明のペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む。ペプチドは、様々な送達方法のいずれか１つを使用して与えることができる。様々な送達方法および好適な配合物が、薬学的組成物に関して本明細書中下記に記載される。
【００９９】
アミロイド疾患を処置するために用いられたとき、本発明のペプチドは、原繊維形成を防止するために、または、原繊維形成を減少させるために、または、事前に形成された凝集物を競合的に脱安定化させることにより、形成された凝集物を脱凝集するために好適なアミノ酸配列を含むことが理解される。例えば、配列番号４５は、アミロイド疾患（特にＩＩ型糖尿病）を処置するために利用することができる。これは、下記の実施例の節の実施例３５に示すように、そのような配列が、阻害ペプチドの存在下ではチオフラビンＴと結合するアミロイド形成ペプチドの能力が低いことによって明らかであるように、ＩＡＰＰの自己会合を妨害するからである。
【０１００】
あるいは、配列番号１０または配列番号１１に示すペプチドは、下記の実施例の節に示すように、ペプチドにおけるロイシンまたはイソロイシンのいずれかの置換により、非常に遅い凝集速度論が誘発されるので、ＩＩ型糖尿病の強力な阻害剤として使用することができる。インビボでのアミロイド形成は非常に遅いプロセスであるので、生理学的条件のもとでは、全長ＩＡＰＰの場面においてイソロイシンまたはロイシンをアラニンに置換したときには、原繊維化が生じないと考えられる。
【０１０１】
あるいは、自己凝集性ペプチド、例えば、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２８〜配列番号３０に示すペプチドなどをアミロイド原繊維化の強力な阻害剤として使用することができる。これは、そのようなペプチドは、アミロイドフラグメントによって形成されるホモ分子会合体ほどには秩序を有していないヘテロ分子複合体を形成することができるからである。
【０１０２】
短いペプチドフラグメントを治療で使用する際の大きな障害の１つは、立体特異的な細胞プロテアーゼによるそのタンパク質分解的分解であるので、本発明のペプチドは、好ましくは、天然アミノ酸のＤ−異性体から合成されることが理解される［すなわち、インベルソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドアナログ、Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１２６０１〜５；Ｇａｚｉｔ（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、９：１６６７〜１６７５］。
【０１０３】
さらに、本発明のペプチドには、そのレトロアナログ、インベルソアナログおよびレトロ−インベルソアナログが含まれる。ホルモンの完全なレトロ−インベルソアナログまたは延長された部分的なレトロ−インベルソアナログは、生物学的活性を保持または増強することが一般に見出されていることが理解される。レトロ反転化はまた、酵素阻害剤の合理的な設計の分野に適用されている（米国特許第６２６１５６９号を参照のこと）。
【０１０４】
本明細書中で使用される「レトロペプチド」は、本来のペプチド配列とは反対方向で組み立てられる、Ｌ−アミノ酸残基から構成されるペプチドを示す。
【０１０５】
天然に存在するポリペプチドのレトロインベルソ改変では、α−炭素立体化学が対応のＬ−アミノ酸のα−炭素立体化学とは逆であるアミノ酸、すなわち、Ｄ−アミノ酸またはＤ−ａｌｌｏ−アミノ酸からの、本来のペプチド配列とは逆の順序での合成的な組み立てが伴う。従って、レトロインベルソアナログは、逆になった末端および逆方向のペプチド結合を有し、その一方で、本来のペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーを本質的に維持している。
【０１０６】
さらに、アミロイド原繊維形成における主要な争点の１つは、本来の形態から積み重なったβ鎖構造へのアミロイドポリペプチドの移行であるので、阻害ペプチドは、好ましくは、立体効果のためにペプチド骨格を制約するＮ−メチル化アミノ酸を含む［Ｋａｐｕｒｎｉｏｔｕ（２００２）、３１５：３３９〜３５０］。例えば、アミノイソ酪酸（Ａｉｂまたはメチルアラニン）は、短い天然ペプチドにおけるα−ヘリックス構造を安定化することが知られている。さらに、Ｎ−メチル化はまた、分子間のＮＨからＣＯへのＨ結合能に影響を及ぼし、従って、Ｈ結合を形成する相互作用によって安定化される多層β鎖の形成を抑制する。
【０１０７】
コリル基などの有機基を本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加することは、治療ペプチドの効力および生物利用性（例えば、神経変性疾患の場合における血液脳関門の横断）を改善することが示されているので好ましいと理解される［Ｆｉｎｄｅｉｓ（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：６７９１〜６８００］。さらに、電荷を有しているアミノ酸を認識モチーフに導入することにより、アミロイド原繊維のさらなる成長を阻害する静電的反発を生じさせることができる［Ｌｏｗｅ（２００１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０：７８８２〜７８８９］。
【０１０８】
本明細書中上記に述べたように、本発明の抗体はまた、アミロイド関連疾患を処置するために使用することができる。
【０１０９】
本発明のペプチドおよび／または抗体は、そのものとして、または、薬学的に受容可能なキャリアと混合されている薬学的組成物の一部として個体に与えることができる。
【０１１０】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、本明細書の記載する有効成分の１つまたは複数と、他の化学成分（例えば生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤）との製剤を指す。医薬組成物の目的は生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１１１】
本明細書において「有効成分」という用語は、生物学的効果を説明できるペプチドまたは抗体調製物を指す。
【０１１２】
以下、交互に用いられる「生理学的に受容可能なキャリア」および「医薬的に許容できるキャリア」という用語は、生物にとって著しい刺激の原因にならず、かつ投与される化合物の生物活性および特性を抑止しないキャリアまたは希釈剤を指す。アジュバントがこれらの用語に含まれる。医薬的に許容できるキャリアに含まれる成分の１つは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機媒体および水性媒体の両方で広範囲の可溶性を有する生物適合ポリマーでありうる［Ｍｕｔｔｅｒら（１９７９）］。
【０１１３】
本明細書において「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例には炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールなどがあるが、これらに限るわけではない
【０１１４】
薬物の製剤および投与に関する技術は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見いだすことができ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
適当な投与経路としては、例えば経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻腔送達、腸管送達または腸管外送達（筋肉内注射、皮下注射、および骨髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注入、または眼内注射を含む）などを挙げることができる。
【０１１６】
また、全身的な方法よりもむしろ、例えば患者の体の特定の領域に直接調製物を注射する局所的な方法で調製物を投与してもよい。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は当技術分野で周知の方法により、例えば通常の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥法などを利用して製造することができる。
【０１１８】
本発明で使用される医薬組成物は、有効成分を医薬として使用できる製剤に加工しやすくする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容できるキャリアを使って、常法により製剤化することができる。適切な製剤は選択した投与経路に依存する。
【０１１９】
注射の場合は、水性溶液（好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理食塩水緩衝液などの生体適合緩衝液）に、本発明の有効成分を製剤化することができる。経粘膜投与の場合は、浸透される壁に適切な浸透剤を製剤中に添加する。そのような浸透剤は当技術分野では広く知られている。
【０１２０】
経口投与の場合は、活性化合物を当技術分野で周知の医薬的に許容できるキャリアと混合することにより、化合物を容易に製剤化することができる。前記キャリアを使用することにより、本発明の化合物を、患者による経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口用医薬品は固形の賦形剤を使用し、随意に、得られた混合物を粉砕し、所望により適当な補助剤を添加してから、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠の核錠を得ることによって、製造することができる。適切な賦形剤には、充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類、セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容できるポリマーがある。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１２１】
糖衣錠の核錠には適当なコーティングが施される。この目的には濃厚な糖溶液を使用することができ、その糖溶液は、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。識別のためまたは活性成分量の様々な組合わせを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠剤皮に染料または顔料を加えてもよい。
【０１２２】
経口使用が可能な医薬組成物には、ゼラチン製の押込み式カプセル剤ならびにゼラチンと可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）とでできた軟密封カプセル剤が含まれる。押込み式カプセル剤は、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により安定剤と混合した活性成分を含むことができる。軟カプセル剤の場合は、有効成分を適当な液体（脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁することができる。さらに安定剤を加えてもよい。経口投与用製剤は全て、選択した投与経路に適した投与量でなければならない。
【０１２３】
経口腔粘膜投与の場合、本組成物は常法によって製剤化された錠剤または口中錠の形態をとることができる。
【０１２４】
鼻腔吸入による投与の場合、本発明で使用するための有効成分は、適当な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を使って、加圧容器または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、バルブを設けて、計量した量を送達することによって、決定することができる。本化合物と適当な粉末基剤（乳糖またはデンプンなど）との粉末混合物を含む、ディスペンサーの（例えばゼラチン製）カプセルおよびカートリッジを処方することもできる。
【０１２５】
本明細書に記載の調製物は、例えばボーラス注射または持続注入などによる非経口投与用に製剤化することもできる。注射用製剤は、例えばアンプルなどに一回量型として、または多用量容器に入れて、所望により保存剤を添加して提供することができる。本組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションであることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの調剤用薬剤を含んでもよい。
【０１２６】
非経口投与用の医薬組成物として、水溶性活性調製物の水溶液が挙げられる。また、有効成分の懸濁液を適当な油性または水性注射懸濁液として調製することもできる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームなどがある。水溶性注射懸濁剤は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含んでもよい。所望により、本懸濁剤は、高濃度溶液の調製物を得ることができるように、適当な安定化剤または化合物の溶解度を増加させる有効成分をさらに含んでもよい。
【０１２７】
また、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で構成させる粉末の形態をとってもよい。
【０１２８】
本発明の調製物は、例えば通常の坐剤用基剤（カカオ脂または他のグリセリドなど）を使って、坐剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０１２９】
本発明で使用するのに好適な医薬組成物は、有効成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より具体的には、治療有効量とは、病気の症状を予防、緩和または改善するのに有効な、あるいは処置される対象の生存を延長させるのに有効な有効成分の量を意味する。
【０１３０】
治療有効量の決定は当業者の能力の範囲内でよい。
【０１３１】
本発明の方法において使用される調製物に関して、治療有効量または用量は、まずインビトロアッセイによって推定することができる。例えば、用量を、動物モデルで策定することができ、そのような情報を使って、ヒトで有効な用量をより正確に決定することができる。
【０１３２】
本明細書に記載する有効成分の毒性および治療効力は、標準的なインビトロ薬学的手法により、細胞培養または実験動物で決定することができる。これらのインビトロ、細胞培養アッセイおよび動物実験で得られたデータは、ヒトに使用する用量範囲の策定に利用することができる。投与量は、利用する投与経路に依存して、この範囲内で変動しうる。個々の医師は患者の状態を考慮して正確な処方、投与経路および投与量を選択することができる（例えば「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（１９７５）第１章、第１頁のＦｉｎｇｌらの記事を参照されたい）。
【０１３３】
処置すべき状態の重症度および反応性に応じて、投与は単回投与または複数回投与とすることができる。この場合、処置は数日〜数週間または治癒が達成されるか疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。
【０１３４】
投与すべき組成物の量は、当然ながら、処置対象、病気の重症度、投与方法、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１３５】
また、適合する医薬キャリア中に調剤された本発明の調製物を含む組成物を製造し、適当な容器に入れ、表示された状態の処置に関する表示をすることができる。
【０１３６】
本発明の組成物は、所望により、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサー装置、例えばＦＤＡ認可キットとして提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属箔またはプラスチック箔からなってもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与上の注意を添付してもよい。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指定された形式で容器に添付された、組成物の形状またはヒトもしくは動物への投与に関する当局の認可を示す通知を載せてもよい。そのような通知は、例えば処方薬に関して米国食品医薬品局によって許可されたラベリング、または許可された添付書類であることができる。
【０１３７】
本発明のペプチドまたは抗体はまた、本明細書中上記に記載される任意の好適な投与様式を用いて個体に投与された核酸構築物から発現させることができることが理解される（すなわち、インビボ遺伝子治療）。あるいは、核酸構築物が、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組み換えなど）および必要とされる場合には発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、個体に戻される（すなわち、エクスビボ遺伝子治療）。
【０１３８】
本発明のペプチドまたは抗体の細胞発現を可能にするために、本発明の核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用調節エレメントを含む。本明細書中で使用される表現「シス作用調節エレメント」は、トランス作用調節因子と結合し、その下流に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくは、プロモーター）を示す。
【０１３９】
任意の利用可能なプロモーターを本発明の方法論によって使用することができる。本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞タイプ特異的および／または組織特異的なプロモーターの例には、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ他（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３：２３５〜２７５］、特にＴ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ他（１９８９）、ＥＭＢＯ Ｊ．、８：７２９〜７３３］および免疫グロブリンのプロモーター［Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３７２９〜７４０］、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ニューロフィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ他（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５４７３〜５４７７］など、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ他（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２〜９１６］、または乳腺特異的プロモーター、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号）などが含まれる。本発明の核酸構築物はさらにエンハンサーを含むことができ、エンハンサーは、プロモーター配列の近くまたは遠くに存在させることができ、プロモーターからの転写をアップレギュレーションするように機能し得る。
【０１４０】
本発明の方法論の構築物はさらに、好ましくは、適切な選択マーカーおよび／または複製起点を含む。好ましくは、利用される構築物はシャトルベクターであり、これは、大腸菌（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）においてともに増殖することができ、細胞における増殖、選ばれた遺伝子および組織における組み込みのために適合性を有する。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
【０１４１】
現在好ましいインビボ核酸導入技術には、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および脂質に基づくシステムなどのウイルス構築物または非ウイルス構築物によるトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介導入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント（１つまたは複数）、または、選択的スプライシング、核ＲＮＡの核外輸送、もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を調節する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在していない場合、パッキングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、そして、使用されるウイルスに対して適切なプラス鎖プライマー結合部位およびマイナス鎖プライマー結合部位を含む。さらに、そのような構築物は、典型的には、ペプチドまたは抗体を、それらが存在する宿主細胞から分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を行わせるシグナル、ならびに１つ以上の制限部位、および翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッキングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。非ウイルスである他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリジンおよびデンドリマーなど）。
【０１４２】
本発明のペプチドの自己凝集性のために、そのようなペプチドはまた、生物学的サンプルにおけるアミロイド原繊維／斑の強力な検出剤として使用することができると考えられる。これは、特徴的な神経原繊維変化（ＮＦＴ）および神経炎性局面について脳組織が死後に調べられた後に明確な診断がなされ得るだけであるアルツハイマー病などのアミロイド関連疾患にとって特に重要である。
【０１４３】
従って、本発明のさらにまた別の局面によれば、生物学的サンプルにおけるアミロイド原繊維の存在または存在しないことを検出する方法が提供される。
【０１４４】
この方法は、生物学的サンプルを、アミロイド原繊維と共凝集することができる本発明のペプチドとインキュベーションし、その後、そのペプチドを検出し、それにより、生物学的サンプルにおけるアミロイド原繊維の存在または存在しないことを検出することによって行われる。立体配座的な集合体を認識することができる様々なペプチド試薬がこの分野では知られており、そのいくつかが、Ｂｕｒｓａｖｉｃｈ（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５（３）：５４１〜５８；Ｂａｌｔｚｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１０１（１０）：３１５３〜６３に総説される。
【０１４５】
検出のために利用される生物学的サンプルは、任意の身体サンプル、例えば、血液（血清または血漿など）、唾液、腹水、胸水、尿、生検試料、単離された細胞、および／または細胞膜調製物などであり得る。組織生検物および体液を哺乳動物から得る様々な方法がこの分野では広く知られている。
【０１４６】
本発明のペプチドは、凝集物形成のために好適な条件（すなわち、緩衝液、温度、インキュベーション時間など）のもとで生物学的サンプルと接触させられる。例えば、好適な条件が、実施例の節の実施例２に記載される。生物学的サンプルとのインキュベーションの前にペプチドを事前に凝集させないために様々な対策が取られる。この目的のために、新しく調製されたペプチドストックが好ましくは使用される。
【０１４７】
生物学的サンプル内のタンパク質複合体を、この分野で知られているいくつかの方法のいずれか１つによって検出することができ、そのような方法では、生化学的および／または光学的な検出スキームを用いることができる。
【０１４８】
複合体の検出を容易にするために、本発明のペプチドは、好ましくはタグまたは抗体によって標識される。標識化は、標識化方法に依存して、凝集体形成の前に、または凝集体形成と同時に、または凝集体形成の後に行うことができることが理解される。本明細書中で使用される用語「タグ」は、定量可能な活性または特性を示す分子をいう。タグは、フルオレセインなどの化学的蛍光体、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは関連タンパク質などのポリペプチド蛍光体（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を含む蛍光性分子であり得る。そのような場合、タグは、好適な励起光を当てたときに生じるその蛍光によって定量することができる。あるいは、タグは、エピトープタグ、すなわち、特異的な抗体が、他の細胞エピトープと実質的に交差反応することなく結合することができる極めて特有のポリペプチド配列であり得る。そのようなエピトープタグには、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグ、ストレプトアビジンタグなどが含まれる。
【０１４９】
あるいは、凝集物の検出を本発明の抗体によって行うことができる。
【０１５０】
従って、本発明のこの局面により、アミロイド原繊維を含むことが疑われる身体組織または体液などの生物学的サンプルをアッセイまたはスクリーニングする方法が提供される。
【０１５１】
そのような検出方法はまた、アミロイド沈着の予防または分解において有用な強力な薬物を発見するためのアッセイにおいて利用され得ることが理解される。例えば、本発明は、試験化合物の高処理能スクリーニングのために使用することができる。典型的には、本発明の共凝集するペプチドは、アッセイ体積を減少させるために放射標識される。その後、競合アッセイが、試験化合物による標識の置換をモニターすることによって行われる［Ｈａｍ（１９９６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８：４５０６〜７；Ｅｓｌｅｒ（１９９６）、Ｃｈｅｍ．２７１：８５４５〜８］。
【０１５２】
本発明のペプチドはまた、インビボでのアミロイド沈着の強力な検出剤として使用され得ることが理解される。アミロイド沈着物と結合することができる設計されたペプチドは、非放射能的に標識されるか、または放射性同位体で標識されるが、この分野で広く知られているように、本明細書中上記で議論されたアミロイド関連疾患の発症または存在を診断するために個体に投与することができる。アミロイド沈着物またはアミロイド様沈着物に対するそのような標識されたペプチドの投与後の結合を、この分野で知られているインビボ画像化技術によって検出することができる。
【０１５３】
本発明のペプチドは診断キットまたは治療キットに含めることができる。例えば、特定の疾患関連タンパク質またはそれに対する抗体のペプチドセットを、適切な緩衝液および保存剤とともに１つ以上の容器に包装することができ、そして、診断のために、または治療的処置を行うために使用することができる。
【０１５４】
従って、ペプチドは、それぞれを単一の容器において混合することができ、またはそれぞれを個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０１５５】
さらに、安定化剤、緩衝剤、遮断剤などの他の添加剤もまた加えることができる。
【０１５６】
そのようなキットのペプチドはまた、ビーズ、アレイ基体（例えば、チップ）などの固体支持体に結合させることができ、診断目的のために使用することができる。
【０１５７】
キットに含まれるか、または基体に固定化されるペプチドは、本明細書中上記に記載されるような検出可能な標識に結合させることができる。
【０１５８】
キットはまた、試験された対象が、目的とするアミロイドポリペプチドに関連する状態、異常または疾患に罹患しているかどうか、あるいはそのような状態、異常または疾患を発症する危険性を有するかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０１５９】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例の実験により支持される。
【０１６０】
実施例
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
【０１６１】
一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編、“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ、１９９４；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ編、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、１９８４；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用される）を参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。
【０１６２】
（実施例１）
ｈＩＡＰＰ基本アミロイド形成ユニットのアラニンスキャン−原理およびペプチド合成
膵臓アミロイドがＩＩ型糖尿病患者の９５％以上に見出される。膵臓アミロイドは、３７アミノ酸長の小島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：４５５７６５５）の凝集によって形成され、その細胞毒性が疾患の発達に直接的に関連している。ＩＡＰＰアミロイドの形成は、可溶性ＩＡＰＰから凝集β−シートへの立体配座の移行を介して進行する、核形成に依存した重合プロセスに従っている。近年、ＩＡＰＰのヘキサペプチド（２２〜２７）（ＮＦＧＡＩＬ、配列番号１１１）（これはまた「基本アミロイド形成ユニット」と呼ばれる）がβ−シート含有アミロイド原繊維の形成に十分であることが示されている［Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓ他（２０００）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９５：１０５５〜１０７１］。
【０１６３】
この「基本アミロイド形成ユニット」を構成する残基の特異的な役割に対するさらなる洞察を得るために、体系的なアラニンスキャンを行った。その疎水性またはβ−シート構造を形成する傾向を大きく変化させることなく、ペプチドの分子境界を特異的に変化させるためにアミノ酸をアラニンで置換した。アラニンスキャンを、ヒトＩＡＰＰに特有な区域の場面において行った（図３ａ）。この区域には、全長ポリペプチドにおいてＮＦＧＡＩＬモチーフの後に２つのセリン残基が含まれる。これらの８アミノ酸のペプチド配列を使用した。これは、これよりも短いペプチドは疎水性であり、そのため、溶解性が低くなっているからである。図３ｂには、野生型ペプチドの化学構造の概略図を示し、一方、図３ｃには、作製した種々の変異型ペプチドにおけるアミノ酸置換を示す。
【０１６４】
方法および試薬−ペプチド合成をＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ、米国）によって行った。ペプチド配列が正しいことを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ Ｉ分光計を使用してイオンスプレー質量分析法によって確認した。ペプチドの純度を、水および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）における１０％から７０％へのアセトニトリルの直線勾配を使用して、Ｃ_１８カラムでの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認した。
【０１６５】
（実施例２）
濁度測定によってモニターされたときのＩＡＰＰペプチドフラグメントおよび変異型誘導体の凝集の速度論
ＩＡＰＰペプチド由来フラグメントの自己会合を研究するために、凝集および不溶化の速度論を、４０５ｎｍでの濁度測定を使用してモニターした。
【０１６６】
速度論的凝集アッセイ−新しいペプチドストック溶液を、凍結乾燥形態のペプチドをＤＭＳＯ（脱凝集化溶媒）に１００ｍＭの濃度で溶解させることによって調製した。何らかの事前の凝集を避けるために、新しいストック溶液を、実験前に毎回その度、調製した。ペプチドストック溶液はアッセイ緩衝液に希釈され、９６ウエルプレートに下記のように入れられた：２μｌのペプチドストック溶液が９８μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）に加えられ、２％ＤＭＳＯの存在下でのペプチドの２ｍＭの最終濃度にした。濁度データを４０５ｎｍで測定した。２％ＤＭＳＯを含む緩衝液溶液がブランクとして使用した。濁度が数個の時間点について室温で測定した。
【０１６７】
結果−図４ａに示すように、野生型ペプチドフラグメント（配列番号１）は、熟成させていないＩＡＰＰヘキサペプチドについて以前に報告されたプロフィルと非常に類似する凝集速度論プロフィルを示した［Ｔｅｎｉｄｉｓ他（２０００）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９５：１０５５〜７１］。そのようなプロフィルは、核形成に依存した重合機構［ＪａｒｒｅｔｔおよびＬａｎｓｂｕｒｙ（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：６８６５〜７０］を強く示している。２０分の遅れ時間の後、野生型ペプチドは不溶性原繊維に自己会合した。ペプチドＧ３Ａ（配列番号４）は、野生型ペプチドのプロフィルと本質的に同じプロフィルを示した。Ｎ１Ａペプチド（配列番号２）は、野生型ペプチドのプロフィルと比較した場合、異なる速度論プロフィルを有するにもかかわらず、より大きい凝集速度論を媒介した。興味深いことに、Ｎ１Ａの凝集は、核形成依存性がより小さいようであった。イソロイシンまたはロイシンのアラニンへの置換（それぞれ、ペプチドＩ５Ａ（配列番号５）およびペプチドＬ６Ａ（配列番号６））は凝集速度論を低下させたが、凝集速度論を完全には止めなかった。フェニルアラニン残基のアラニンへの置換（ペプチドＦ２Ａ、配列番号３）は、ペプチドの凝集能の完全な喪失をもたらした。Ｆ２Ａペプチドは水系アッセイ緩衝液において完全に可溶性であった。
【０１６８】
まとめると、アミロイド形成フラグメントの速度論的凝集研究により、ＩＡＰＰの活性フラグメントによるアミロイド形成プロセスにおけるフェニルアラニン残基に対する大きな役割が示唆された。
【０１６９】
（実施例３）
凝集物の平均粒子サイズの測定
濁度アッセイは、様々なペプチドの凝集能および速度論に関して重要な評価をももたらす一方で、形成された実際の凝集物のサイズに関する情報をもたらさなかった。アミロイド構造の見かけの流体力学的直径は、アミロイド構造の不規則性のために変化するが、それにもかかわらず、形成された構造の大きさの程度に関する明らかな目安をもたらすことができ、また、様々なペプチドによって形成される構造を比較するための量的な基準を与えることができる。
【０１７０】
従って、様々なペプチドによって形成された凝集物の平均サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）実験を使用して測定した。
【０１７１】
方法−濃度が１０ｍＭである新しく調製したペプチドストック溶液を１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に希釈し、さらに０．２μｍのフィルターでろ過して、１００μＭペプチドおよび１％ＤＭＳＯの最終濃度にした。粒子サイズ測定が、レーザー光源のＡＬＶ−ＮＩＢＳ／ＨＰＰＳ非侵襲的後方散乱装置を用いて行われた。自動補正データが、平均見かけ流体力学的直径を得るために、ＡＬＶ−ＮＩＢＳ／ＨＰＰＳソフトウエアを使用して近似した。
【０１７２】
結果−様々なペプチドによって形成された構造体の平均見かけ流体力学的直径を図５に示す。
【０１７３】
まとめると、様々なペプチドによって形成された構造体の見かけ流体力学的直径は、濁度アッセイによって得られた結果と一致しているようであった。濁度アッセイの場合のように、野生型ペプチドおよびＧ３Ａペプチドは、非常に類似する流体力学的直径の粒子を形成させた。類似する構造を、Ｎ１Ａ、Ｉ５ＡおよびＬ６Ａの誘導体ペプチドに関して観測した。従って、濁度アッセイと一致して、ＤＬＳ実験は、大きな粒子が、示した実験条件のもとでは、Ｆ２Ａペプチドによって形成されなかったことを明瞭に示している。
【０１７４】
（実施例４）
コンゴーレッド（ＣＲ）結合アッセイによる野生型ペプチドおよび誘導体のアミロイド形成能の試験
偏光顕微鏡観察と組み合わせられたコンゴーレッド（ＣＲ）染色を、本発明のペプチドのアミロイド形成性を試験するために使用した。アミロイド原繊維は一般に、特に原繊維ＩＡＰＰはＣＲと結合し、金色／緑色の複屈折を偏光下で示す［Ｃｏｏｐｅｒ（１９７４）、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３１：２３２〜８；Ｌａｎｓｂｕｒｙ（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：６８６５〜７０］。
【０１７５】
方法および試薬−１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で４日間インキュベーションしたペプチド溶液をガラス製の顕微鏡スライドガラス上で乾燥させた。染色を、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）における１ｍＭのＣＲを加え、その後、１分間インキュベーションすることにより行った。過剰なＣＲを除くために、スライドガラスを二回蒸留水で洗浄し、乾燥させた。８０％エタノール（ｖ／ｖ）に溶解させた飽和ＣＲ溶液を、凝集性が悪いペプチドについて使用した。そのような場合、染色を、洗浄することなく行った。複屈折を、偏光ステージを備えたＷＩＬＤ Ｍａｋｒｏｓｋｏｐ ｍ４２０（ｘ７０）を使用して測定した。
【０１７６】
結果−野生型、Ｎ１ＡおよびＧ３ＡのペプチドはＣＲと結合して、特徴的な緑色／金色の複屈折を示した（通常の場については図６ｇ、図６ａおよび図６ｅを、そして偏光下での顕微鏡観察については図６ｈ、図６ｂおよび図６ｆをそれぞれ参照のこと）。Ｉ５ＡおよびＬ６ＡのペプチドはＣＲと結合し、そして、希ではあったが、特徴的な複屈折を示した（通常の場についてはそれぞれ図６ｉおよび図６ｋ、そして偏光についてはそれぞれ図６ｊおよび図６ｌ）。ペプチドＦ２Ａ（ＮＡＧＡＩＬ）はＣＲ結合能を示さなかった（通常の場について図６ｃ、そして偏光については図６ｄ）。ＣＲで染色した乾燥後の緩衝液溶液を陰性コントロールとして使用した（通常の光および偏光について図６ｍおよび図６ｎをそれぞれを参照のこと）。興味深いことに、結合性の大きな違いが、陰性コントロールおよびＦ２Ａペプチドについては観察されなかった。
【０１７７】
Ｆ２Ａペプチドは原繊維を形成することができないことを実証するために、１４日間インキュベーションしたペプチド溶液を結合アッセイにおいて使用した。ある程度の凝集が、２週間にわたりペプチドを「寝かせた」後で目視により観察されたが、ＣＲ染色はアミロイド構造を何ら示さなかった（結果は示されず）。同じ条件のもとで、野生型ペプチドのインキュベーションは著しいＣＲ複屈折をもたらした。
【０１７８】
（実施例５）
原繊維形成性のペプチドおよび変異型の超微細構造分析
様々なペプチドの潜在的原繊維形成能を電子顕微鏡観察分析によって評価した。
【０１７９】
方法−ペプチド溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）における２ｍＭのペプチド）を室温で一晩インキュベーションした。原繊維形成を、２００メッシュの銅グリッドに置き、カーボン安定化ホルムバールフィルム（ＳＰＩ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）で覆った１０μｌのサンプルを使用して評価した。２０秒〜３０秒のインキュベーションの後、過剰な液体を除き、グリッドを２％酢酸ウラニル水溶液でネガティブ染色した。サンプルを、８０ｋＶで稼働するＪＥＯＬ １２００ＥＸ電子顕微鏡で調べた。
【０１８０】
結果−の電子顕微鏡観察分析を行った。以前の結果と一致して、フィラメント構造が、無定形の原繊維を生じさせたＦ２Ａ（図７ｂ）を除くすべてのペプチドについて観察された（図７ａ〜図７ｆ）。Ｉ５ＡペプチドおよびＬ６Ａペプチドによって形成された原繊維（それぞれ、図７ｅおよび図７ｆ）の出現頻度は、野生型ペプチド（図７ｄ）、Ｎ１ＡペプチドおよびＧ３Ａペプチド（それぞれ、図７ａおよび図７ｃ）の出現頻度と比較して低かった。Ｆ２Ａ、Ｉ５ＡおよびＬ６Ａのペプチドについて示されるＥＭ場はまれにしか観察されなかったが、これらの画像によって示された結果は、前節に示された量的結果を裏付けており、従って、原繊維形態学の定性的分析を提供している。
【０１８１】
野生型、Ｎ１ＡおよびＧ３Ａのペプチドについて観察されたもつれた網状構造は、これらの原繊維の速い形成速度論によって説明することができる（実施例２参照）。より明瞭な構造およびより長い原繊維が、低頻度にもかかわらず、Ｉ５ＡペプチドおよびＬ６Ａペプチドについて観察された。これらのより長い原繊維は、より秩序だった原繊維の組織化を可能にする、より遅い速度論の結果であり得る。
【０１８２】
まとめると、電子顕微鏡観察およびＣＲ分析の定性的結果は、ヘキサアミロイドペプチドにおけるフェニルアラニン残基がそのアミロイド形成能のために非常に重要であることを強く示唆している。
【０１８３】
（実施例６）
ｈＩＡＰＰの基本アミロイド形成ユニットにおける認識ドメインのマッピング−原理およびＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質合成
潜在的な認識ドメインを体系的にマッピングおよび比較するために、ｈＩＡＰＰの配列全体にわたる２８個のメンブランスポットの重複するペプチド（すなわち、ｈＩＡＰＰ_１〜１０、ｈＩＡＰＰ_２〜１１、・・・、ｈＩＡＰＰ_{２８〜３７}）のアレイと相互作用するｈＩＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：４５５７６５５）の能力を検討した［Ｍａｚｏｒ（２００２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２２：１０１３〜２４１］。
【０１８４】
材料および実験手順
細菌株−大腸菌株ＴＧ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を分子クローニングおよびプラスミド増殖のために使用した。細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）をタンパク質過剰発現のために使用した。
【０１８５】
合成ＩＡＰＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質の操作−細菌のコドン使用頻度を含むように改変さしたヒトＩＡＰＰの合成ＤＮＡ配列（配列番号５８）を、８個の重複するプライマー（配列番号５０〜５７）をアニーリングすることによって作製した。ＰＣＲが、９５℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクルによって行われた。アニーリング生成物を連結し、ＩＡＰＰ１プライマー（配列番号５０）およびＩＡＰＰ８プライマー（配列番号５７）を使用して増幅した。その後、ＭＢＰ−ＩＡＰＰ（ＭＢＰ ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：２６５４０２１）融合配列を、ＩＡＰＰ合成テンプレートを使用して構築し、その後、このテンプレートを、ＹＡＲ２（配列番号６０）プライマーおよびＹＡＲ１プライマー（配列番号５９）を使用して増幅し、それにより、Ｖ８ Ｅｋ切断部位および（Ｈｉｓ）_６タグをＩＡＰＰのＮ末端に挿入した。２つのプライマーはＮｏｔＩおよびＮｃｏＩのクローニング部位をそれぞれ含んだ。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＭＡＬｃ２ｘ−ＮＮ発現ベクターに連結した。ｐＭＡＬｃ２ｘ−ＮＮ発現ベクターは、ｐＭＡＬｃ−ＮＮ^１９のポリリンカー部位をｐＭＡＬｃ２ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）にクローン化することによって構築した［ＢＡＣＨ（２００１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１２：７９〜９３］。
【０１８６】
タンパク質の発現および精製−強いＰｔａｃプロモーターの下流にＭＢＰ−ＩＡＰＰをコードする発現プラスミドｐＭＡＬｃ２ｘ−ＩＡＰＰによって形質転換した大腸菌ＢＬ２１細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％（Ｗ／Ｖ）のグルコースを補充した２００ｍｌのＬＢ培地で生育させた。Ａ_６００＝０．８の光学密度に達すると、タンパク質の発現を、３０℃で３時間、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。
【０１８７】
細胞抽出物を、以前の記載［Ｇａｚｉｔ（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：２６５２〜２６５７］のように、凍結−融解、その後の短時間の超音波処理を使用して、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）において調製した。タンパク質抽出物を、２０，０００ｇでの遠心分離によって清澄化し、４℃で保存した。ＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質を、抽出物をアミロース樹脂カラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）に通すことによって精製し、同じ緩衝液における２０ｍＭのマルトースによる溶出によって回収した。精製したＭＢＰ−ＩＡＰＰは４℃で保存した。タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準としてＰｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅプラス試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を使用して測定した。ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰのタンパク質画分をＳＤＳ／１２％ポリアクリルアミドゲルで分析し、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）で染色した。
【０１８８】
ＭＢＰ−ＩＡＰＰ内のジスルフィド結合が酸化されているかどうかを調べるために、精製したＭＢＰタンパク質およびＭＢＰ−ＩＡＰＰタンパク質を５当量のＮ−ヨードアセチル−Ｎ’−（８−スルホ−１−ナフチル）エチレンジアミン（ＩＡＥＤＡＮＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）と暗所において室温で一晩反応させた。遊離した色素を、標識されたタンパク質から、ＱｕｉｃｋＳｐｉｎ Ｇ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムでのゲルろ過クロマトグラフィーによって分離した。その後、ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰの蛍光を測定した。小さい蛍光標識化が検出されただけであった（平均して、タンパク質分子あたり０．１未満のプローブ分子）。ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰの標識化の間には大きな差は認められなかった。このことは、発現したＩＡＰＰ分子におけるジスルフィド架橋は大部分が酸化されていたことを示唆していた。
【０１８９】
結果
組み換えＭＢＰ−ＩＡＰＰの発現および精製−完全なｈＩＡＰＰを細菌において発現させる以前の試みは成功していなかったので、タンパク質を、ｈＩＡＰＰを発現時に所望されない凝集から保護するＭＢＰ融合体として発現させた［Ｂａｃｈ（２００１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１２：７９〜９３］。融合タンパク質の合成は、図８ａに示すように細菌のコドン使用頻度を使用して行った。得られた融合配列を、図８ｂに示すようにｐＭＡＬｃ２ｘ−ＮＮにクローン化して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。生育条件、細胞抽出物調製およびタンパク質精製は、本明細書中上記に記載するように行った。ＩＰＴＧによる誘導により、可溶性画分における高レベルのＭＢＰ−ＩＡＰＰの蓄積がもたらされ、５％未満のＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質が細胞抽出物の不溶性画分に見出された（データは示さず）。ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰの典型的な精製工程から得られた一部分を図９に示す。示されるように、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅで染色したＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルをデンシトメーターでスキャンすることによって計算すると、４８ｋＤａのＭＢＰ−ＩＡＰＰが総可溶性タンパク質の２５％にまで蓄積していた。振とうフラスコにおいて３０℃で誘導すると（Ａ_６００＝２．０）、ＭＢＰ−ＩＡＰＰが１Ｌの細胞培養あたり約１５０ｍｇのレベルで細胞質に可溶性タンパク質として蓄積した。精製時の喪失にもかかわらず、ＭＢＰ−ＩＡＰＰが８０ｍｇ／ｌ・細胞の収量でほぼ均一に精製した。ＩＡＰＰのさらなる適用および好都合な均一性精製のために、ＭＢＰタグを除くためのＸａ因子切断部位に加えて、さらなるＨｉｓ−Ｔａｇもまた含まれていた（図８ｂ）。このＨｉｓ−Ｔａｇは、ＩＡＰＰ配列のＮ末端のＬｙｓ残基でのＥｋ Ｖ８切断によって除くことができ、これにより、野生型ＩＡＰＰの放出が得られる。
【０１９０】
（実施例７）
ｈＩＡＰＰポリペプチドにおける分子認識配列の同定
ＩＡＰＰペプチドアレイの構築−ｈＩＡＰＰ_１〜３７の連続した重複する配列に対応するデカマー（配列番号６１〜８８）を、ＳＰＯＴ技術（Ｊｅｒｉｎｉ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を使用してセルロースメンブランマトリックス上で合成した。ペプチドは、Ｃ末端のアミノ酸を介してＷｈａｔｍａｎ５０セルロース支持体（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、英国）に共有結合させた。ペプチド分解に対する安定性がより大きく、また、生来的な認識モチーフの提示がより良好であるので、Ｎ末端のアセチル化をペプチドスキャンのために使用した。
【０１９１】
ペプチド合成−ペプチド合成を、Ｐｅｐｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｔａｅｊｅｏｎ、韓国）によって行われた固相合成法を使用して行った。ペプチド配列が正しいことを、ＨＰ１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ［Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ］を使用してイオンスプレー質量分析法によって確認した。ペプチドの純度を、水および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）における０％から１００％へのアセトニトリルの３０分の直線勾配を１ｍｌ／分の流速で使用して、Ｃ_１８カラムでの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認した。
【０１９２】
結合研究−セルロース上でのペプチドアレイを、最初に、Ｔｒｉｓ緩衝化生理的食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）における５％（Ｖ／Ｖ）の脱脂乳でブロッキングした。その後、セルロースメンブランを、同じブロッキング緩衝液において４℃で１２時間、１０μｇ／ｍｌのＭＢＰ−ＩＡＰＰ_１〜３７の存在下でインキュベーションした。次いで、セルロースメンブランをＴＢＳにおける０．０５％ツイーン２０で繰り返し洗浄した。セルロースメンブランに結合したＭＢＰ−ＩＡＰＰ_１〜３７を抗ＭＢＰモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）により検出した。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を二次抗体として使用した。免疫ブロットを、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅウエスタンブロット化学発光試薬（ＮＥＮ、米国）を製造者の説明書に従って使用して発色させ、シグナルを、デンシトメトリーを使用して定量した。再使用のためのセルロースメンブランの再生を、６２．５ｍＭのＴｒｉｓ、２％のＳＤＳ、１００Ｍｍの２−メルカプトエタノールを含む再生緩衝液Ｉ（ｐＨ６．７）と、８Ｍの尿素、１％のＳＤＳ、０．１％の２−メルカプトエタノールを含む再生緩衝液ＩＩとで順次洗浄することによって行った。洗浄工程の効率を、記載したように、メンブランを化学発光試薬と接触することによってモニターした。
【０１９３】
結果
ＩＡＰＰポリペプチドにおける結合性配列の同定−ｈＩＡＰＰ分子間の分子間認識を媒介するＩＡＰＰ分子における構造モチーフを同定するために、ｈＩＡＰＰ_１〜３７分子のアミノ酸１〜１０からアミノ酸２８〜３７に対応する２８個の可能な重複するデカマーをセルロースメンブランマトリックス上で合成した。セルロースメンブランに結合させたペプチドをＭＢＰ−ｈＩＡＰＰ_１〜３７と一晩インキュベーションした。セルロースメンブランを高塩緩衝液で洗浄した後、セルロースメンブラン上の免疫ブロットを分析し、結合をデンシトメトリーによって定量した（図１０ｂ）。合成時のペプチドカップリング効率が変化し得るので、測定された結合は半定量的であることが理解される。
【０１９４】
図１０ａ〜図１０ｂに示すように、多数のペプチドセグメントが、ＭＢＰ−ＩＡＰＰに対する結合を示した。ＩＡＰＰポリペプチドの中心に位置するアミノ酸配列（すなわち、ｈＩＡＰＰ_７〜１６〜ｈＩＡＰＰ_{１２〜２１}）が、ＭＢＰ−ＩＡＰＰ_１〜３７に対する最も顕著な結合を示した。別の結合性領域をＩＡＰＰのＣ末端部分（ｈＩＡＰＰ_{１９〜２８}〜ｈＩＡＰＰ_{２１〜３０}）において同定したが、この場合の結合はそれほど顕著でなかった。さらに第３の結合スポットがＩＡＰＰのＮ末端部分（ｈＩＡＰＰ_２〜１１）に存在したが、この場合、中心のモチーフの近くでの典型的な分布は明らかではなかった。このことは、この結果が偽であり得ることを示唆している。ブロットを過度に感光させた後でさえも（データは示さず）、（ｈＩＡＰＰ_１〜１０またはｈＩＡＰＰ_３〜１２のいずれに対しても）このペプチドの近くにおける結合は検出されなかった。さらに、ジスルフィド架橋に対して２〜１１の領域の非常に近いところでは、生理学的条件のもとでの原繊維化のプロセスが可能でないと考えられる。
【０１９５】
アレイ化したペプチドと結合する際のＭＢＰ自体の関与を除外するために、ペプチドが結合したセルロースメンブランをＭＢＰだけとインキュベーションし、免疫ブロッティングによって分析した。結合はメンブランの発色後には確認されなかった（示さず）。
【０１９６】
これらの結果により、ｈＩＡＰＰの以前に明らかにされた結合モチーフ［すなわち、基本アミロイド形成ユニット、ｈＩＡＰＰ２０〜２９、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１３：５０３６〜４０；Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９５：１０５５〜１０７１；ＡｚｒｉｅｌおよびＧａｚｉｔ（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３４１５６〜３４１６１］に加えて、ｈＩＡＰＰ内における分子認識の主要な中心ドメインを同定した。ペプチドアレイの結合分布のプロフィル（図１０ｂ）は、ＮＦＶＬＨ（配列番号１７）がコアの認識モチーフとして役立ち得ることを示唆している。
【０１９７】
（実施例８）
濁度測定によってモニターしたときのｈＩＡＰＰペプチドフラグメントの凝集速度論の特徴づけ
ｈＩＡＰＰペプチドアレイに対する組み換えＭＢＰ−ｈＩＡＰＰ融合タンパク質の結合分析（実施例７）により、推定の自己会合ドメインをｈＩＡＰＰタンパク質の中心部分において同定した。
【０１９８】
アミロイド原繊維を形成することができる最小の構造モチーフを同定するために、この推定の自己会合ドメインに含まれる一連のペプチドを、４０５ｎｍでの濁度測定を使用してモニターしたときの凝集について試験した。
【０１９９】
下記の表３には、調べたペプチドを示す。
【表３】

【０２００】
材料および実験手順
速度論的凝集アッセイ−新しく調製したペプチドストック溶液を、凍結乾燥形態のペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することによって作製した。何らかの事前の凝集を避けるために、新しいストック溶液をそれぞれの実験のために調製した。ペプチドストック溶液を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレートのウエルにおいて、下記のようにアッセイ緩衝液に希釈した。８μｌのペプチドストック溶液を９２μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）に加えた（従って、ペプチドの最終濃度は８％のＤＭＳＯの存在下で８ｍｇ／ｍｌであった）。濁度データを４０５ｎｍで集めた。試験サンプルと同じ量のＤＭＳＯを含有する緩衝液溶液をブランクとして使用し、ブランクを結果から差し引いた。濁度を、ＴＨＥＲＭＯｍａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して室温で連続的に測定した。
【０２０１】
結果
濁度アッセイを、水性媒体において凝集する様々なペプチド（表３）の能力を測定するために行った。種々のペプチドフラグメントの新しいストック溶液をＤＭＳＯにおいて作製し、その後、Ｔｒｉｓ緩衝液溶液に希釈し、濁度を、タンパク質凝集の目安として、２時間にわたってモニターした。図１１に示すように、ＮＦＬＶＨＳＳ、ＦＬＶＨＳＳおよびＦＬＶＨＳのペプチドは大きい濁度を示した。ＮＦＧＡＩＬの短いペプチドによるアミロイド形成については以前［Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、上記］に報告されていたが、遅れ時間は非常に短いか、または全くなく、従って、これらの実験条件下では検出できず、しかしながら、凝集速度論プロフィルは、ヘキサペプチドｈＩＡＰＰ_{２２〜２７}（ＮＦＧＡＩＬ）について観測された凝集速度論プロフィルと類似したことが理解される。他方で、ペプチドＮＦＬＶＨＳＳＮＮは非常に遅い濁度を示し、一方、ＮＦＬＶＨおよびＦＬＶＨはほとんど全く濁度を示していない。著しくより長くインキュベーションした後でさえ、有意な濁度は、後者の２つのペプチドに関しては観測されなかった。アミロイド原繊維形成のないことは、部分的に荷電したヒスチジン残基の静電的反発のためであると考えられる。
【０２０２】
（実施例９）
コンゴーレッド（ＣＰ）結合アッセイによるｈＩＡＰＰペプチドのアミロイド形成性の試験
偏光顕微鏡観察と組み合わせられたコンゴーレッド（ＣＰ）染色を、本発明のペプチドのアミロイド形成性を試験するために利用した。アミロイド原繊維はＣＲと結合して、金色／緑色の複屈折を偏光下で示す［Ｐｕｃｈｔｌｅｒ（１９６６）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、１０：３５５〜３６４］。
【０２０３】
材料および実験手順
コンゴーレッド染色および複屈折−少なくとも１日間寝かせた、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）における８ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液の１０μＬの懸濁物をガラス製の顕微鏡スライドガラスの上で一晩乾燥させた。染色を、以前の記載［Ｐｕｃｈｔｌｅｒ（１９６６）、上記］のように、８０％エタノール（ｖ／ｖ）溶液における飽和コンゴーレッド（ＣＲ）およびＮａＣｌの１０μＬの懸濁液を加えることによって行った。溶液を０．４５μｍのフィルターによりろ過した。その後、スライドガラスを数時間乾燥させた。複屈折を、直交偏光子を備えるＳＺＸ−１２実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて測定した。
【０２０４】
結果
コンゴーレッド染色および複屈折−濁度アッセイ（実施例８参照）において形成された凝集物の何らかの可能なアミロイド性を明らかにするために、ＣＲ複屈折アッセイを行った。ペプチドフラグメントを、ＣＲによる染色、および直交偏光子を備えた光学顕微鏡のもとでの試験によってアミロイド形成性について調べた。速度論的アッセイの結果と一致して、また、図１２ｂ〜ｃおよび図１２ｅに示すように、ＮＦＬＶＨＳＳ、ＦＬＶＨＳＳおよびＦＬＶＨＳのペプチドは典型的な複屈折を示した。これに対して、ＮＦＬＶＨＳＳＮＮ、ＮＦＬＶＨおよびＦＬＶＨのペプチドは非常に弱い複屈折を示したか、または複屈折を全く示さなかった（図１２ａ、図１２ｄおよび図１２ｆ）。ペプチドＮＦＬＶＨＳＳＮＮはより弱い特徴的な複屈折を示した（図１２ａ）。ペプチドＮＦＬＶＨはサンプルの縁において強い不鮮明な染色を示した（図１２ｄ）。ペプチドＦＬＶＨは複屈折を示さなかった（図１２ｆ）。ＦＬＶＨペプチドが、長い遅れ時間のためにアミロイド原繊維を形成しないかどうかを試験するために、５日間寝かせたペプチド溶液のサンプルを調べた。サンプルペプチドをまた、水溶液において、非常に高い濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）で試験したが、複屈折はすべての場合に検出されなかった。このことは、このペプチドはアミロイドを形成しないことを示している（データは示さず）。
【０２０５】
（実施例１０）
原繊維形成ｈＩＡＰＰペプチドの超微細構造分析
様々なペプチドの潜在的原繊維形成能を電子顕微鏡観察分析によって評価した。
【０２０６】
材料および実験手順
透過電子顕微鏡観察−少なくとも１日間寝かせた、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）における８ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液の１０μＬサンプルを４００メッシュの銅グリッド（ＳＰＩ ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に置き、カーボン安定化ホルムバールフィルムによって覆った。１分後、過剰な液体を除き、その後、グリッドを２％酢酸ウラニル水溶液でさらに２分間ネガティブ染色した。サンプルを、８０ｋＶで稼働するＪＯＥＬ １２００ＥＸ電子顕微鏡で調べた。
【０２０７】
結果
様々なペプチドによって形成された構造をさらに特徴づけるために、ネガティブ染色での顕微鏡観察を行った。以前の結果と一致して、無定形の凝集物が見出されるだけのＦＬＶＨペプチドを除いて、すべてのペプチドフラグメントが原繊維構造を示した（図１３ａ〜図１３ｆ）。ＮＦＬＶＨＳＳＮＮペプチドは、上記に記載するように、全長ペプチドによって形成されるフィラメントと類似する長い薄いコイル状フィラメントを示した（図１３ａ）。ＮＦＬＶＨＳＳ、ＦＬＶＨＳＳ、ＦＬＶＨＳのペプチドは、ＮＦＧＡＩＬフラグメントについて記載されるように、長い幅広いリボン様原繊維を示した［Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、上記；それぞれ、図１３ｃ〜図１３ｅ］。ＮＦＬＶＨペプチドによって形成された原繊維は薄くて短く、フィラメントではなく、むしろ、プロトフィラメントであると見なすことができる。その出現は、はるかにより低い頻度であり、ＥＭ写真は、一般的な視野ではなく、かなり希な事象を表している（図１３ｄ）。図１３ｆに示すように、ＦＬＶＨペプチドは無定形凝集物の形成を媒介した。
【０２０８】
（実施例１１）
ｈＩＡＰＰペプチドフラグメントの二次構造分析
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）を、ｈＩＡＰＰアミロイド形成ペプチド原繊維および非原繊維ペプチドの二次構造を明らかにするために行った。
【０２０９】
材料および実験手順
フーリエ変換赤外分光法−赤外スペクトルを、ＤＴＧＳ検出器を備えるＮｉｃｏｌｅｔ社のＮｅｘｕｓ４７０ＦＴ−ＩＲ分光計を使用して記録した。寝かせたペプチド溶液のサンプルを、濁度アッセイから採取し、その後、ＣａＦ_２ウインドウ（Ｓｉｇｍａ）プレート上に懸濁し、真空乾燥させた。ペプチド沈着物を二回蒸留水で再懸濁し、続いて乾燥させて、薄いフィルムを形成させた。この再懸濁手順を２回繰り返して、水素から重水素への交換が最大になることを確実にした。測定値を、４ｃｍ^−１の分解能および２０００回の走査平均化を使用して得た。透過率極小値をＯＭＮＩＣ分析プログラム（Ｎｉｃｏｌｅｔ）によって決定した。
【０２１０】
結果
ＦＴ−ＩＲ研究−図１４ａ〜図１４ｆに示すように、原繊維ペプチドはすべてが、β−シート構造について典型的な十分に明らかにされた極小バンドを１６２０ｃｍ^−１〜１６４０ｃｍ^−１付近に有するＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。これに対して、それ以外の方法により原繊維について出現を有しないテトラペプチドＦＬＶＨのスペクトルは、ランダムコイル構造の典型である。ＮＦＬＶＨＳＳＮＮペプチドのスペクトルは、β−シート含有量が大きいことを示す１６２１ｃｍ^−１における透過率極小、ならびに、非β構造の存在を示唆する１６４０ｃｍ^−１および１６６５ｃｍ^−１における極小を示した。別の小さい極小が、逆平行のβ−シートを示す１６８８ｃｍ^−１において観測された（図１４ａ）。ＮＦＬＶＨＳＳペプチドのスペクトルは大きな極小バンドを１９２９ｃｍ^−１および１６７５ｃｍ^−１に示した。このスペクトルは逆平行のβ−シート構造の典型である（図１４ｂ）。類似するスペクトルが、１６２５ｃｍ^−１における大きな極小および１６７６ｃｍ^−１における小さい極小を伴ってペプチドＦＬＶＨＳについて観測された（図１４ｅ）。ＦＬＶＨＳＳペプチドのスペクトルはまた、大きな極小を１６２６ｃｍ^−１に示した。このスペクトルはまた、いくつかの小さい極小を１６３７ｃｍ^−１〜１６７６ｃｍ^−１付近に有したが、それらは、シグナルよりもノイズに類似する形状を有した（図１４ｃ）。ＮＦＬＶＨペプチドのスペクトルは、１６３６ｃｍ^−１における極小（これもまたβ−シートを示す）を示したが、それ以外のスペクトルと比較したとき、非β構造の存在を示し得るこのバンドは、１６５４ｃｍ^−１および１６６９ｃｍ^−１における観測された極小と同様に、移動していた（図１４ｄ）。対照的に、ＦＬＶＨペプチドのスペクトルは、１６２０ｃｍ^−１〜１６４０ｃｍ^−１に極小を示さず、しかし、ランダムコイル構造に典型的な１６４６ｃｍ^−１〜１６７５ｃｍ^−１の付近に多数の極小を示した（図１４ｆ）。
【０２１１】
ＦＬＶＨテトラペプチドがアミロイド原繊維を全く形成することができないか、または、検出することができない原繊維形成が遅い速度論の結果であるかを調べるために、同じ実験条件においてペプチドの溶液を２ヶ月間にわたってインキュベーションし、原繊維の存在を調べた。しかしながら、アミロイド原繊維形成の証拠は、ＥＭ顕微鏡観察、ＣＲ染色またはＦＴ−ＩＲ分光法を使用して検出されなかった。これらの結果は、エネルギーを考慮することにより、テトラペプチドが原繊維を形成することができないことを示唆し得る。すなわち、３つのペプチド結合から構成される鎖のスタッキングのエネルギー寄与は、オリゴマー化のエントロピー損失よりも小さい。
【０２１２】
まとめると、超微細構造の観察結果は、濁度アッセイおよびコンゴーレッド複屈折アッセイによって明らかされるような知見と一致している。同時に、実験データにより、アミロイド形成能が強い、ｈＩＡＰＰペプチド内の新規のペンタペプチドエレメント、すなわち、ＦＬＶＨＳペプチドを同定した。興味深いことに、ｈＩＡＰＰポリペプチドの同じ中心ドメインに見出されたＮＦＬＶＨペプチドがアミロイド形成性であることが見出されたが、原繊維を形成するその能力はやや劣っていた。
【０２１３】
（実施例１２）
メジンの最小アミロイド形成ペプチドフラグメントの同定
背景
メジン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：５１７４５５７）は、大動脈中膜アミロイド沈着物の主要構成成分である［Ｈａｅｇｇｑｖｉｓｔ（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：８６７４〜８６６９］。以前の研究では、大動脈中膜アミロイドが５０歳を超える患者の９７％に見出されていた［Ｍｕｃｃｈｉａｎｏ（１９９２）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４０：８１１〜８７７］。しかしながら、そのようなアミロイド沈着物の病理学的役割は依然として不明である。これらのアミロイドは、老齢に関係づけられる大動脈血管の低下した弾性において役割を果たしていることが示唆されていた［Ｍｕｃｃｈｉａｎｏ（１９９２）、上記；Ｈａｅｇｇｑｖｉｓｔ（１９９９）、上記］。研究では、トリプシン消化ペプチドＮＦＧＳＶＱＦＶが中膜アミロイド形成ペプチドとして明瞭に同定されたが、依然としてアミロイド形成性であるペプチドの最小配列、およびアミロイド形成プロセスを媒介する分子的決定因子は明らかにされなかった。そのような情報は、メジンの特定の場合における原繊維化プロセスを真に理解するために重要であり、しかしまた、一般にはアミロイド原繊維のプロセスに対するパラダイムとしても重要である。
【０２１４】
メジンの最小の活性フラグメントを、発表されたオクタペプチドに由来する短縮化されたアナログの機能的および構造的な分析を使用して決定した［Ｈａｅｇｇｑｖｉｓｔ（１９９９）、上記］。
【０２１５】
材料および実験手順
ペプチド合成は実施例７に記載した。
【０２１６】
下記の表４には、調べたペプチドを示す。
【表４】

【０２１７】
結果
分子認識および自己会合のプロセスを媒介するために必要となる分子情報を保持するメジンの構造エレメントに対するさらなる洞察を得るために、インビトロでアミロイド原繊維を形成するメジンの短いペプチドフラグメントおよびそのアナログの能力を調べた。図１５ａには、調べた最も大きいペプチドフラグメントの化学構造の概略図を示す。
【０２１８】
（実施例１３）
メジン由来ペプチドフラグメントの凝集の速度論
濁度アッセイを、実施例８に記載したように行った。
【０２１９】
様々なメジン由来ペプチドの凝集能に関する最初の洞察を得るために、濁度アッセイを行った。アミロイド形成オクタペプチドおよびその短縮化アナログの新しく作製したストック液をＤＭＳＯにおいて調製した。その後、ペプチドを水溶液に希釈し、濁度を、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度を追跡することによってモニターした。図１６ａに示すように、ＮＦＧＳＶペンタペプチドは、インキュベーションの数分以内に最も大きい程度の凝集を示した。溶液の物理的試験により、ペプチドはゲル構造を形成したことを示した。ＮＦＧＳＶＱＶオクタペプチドの凝集の速度論は速すぎて、測定することができなかった。これは、濁度が、水溶液への希釈により直ちに既に観測されたからである（図１６ａ〜図１６ｂ）。類似する速い速度論が、ＧＳＶＱテトラペプチドに関してもまた観測された。ＮＦＧＳＶＱ、ＦＧＳＶＱおよびＦＧＳＶの短縮化ペプチドは、約３０分かけて濁度の穏やかな増大を示し（図１６ｂ）、その後、わずかに減少した。このことは、大きな凝集物の沈降によって説明することができる。まとめると、そのような速度論および濁度値は、類似するサイズのアミロイド形成ペプチドに関して以前に観測されたものと類似していた（ＡｚｒｉｅｌおよびＧａｚｉｔ、２００１）。
【０２２０】
（実施例１４）
メジン由来ペプチドフラグメントの超微細構造分析
電子顕微鏡観察分析を、実施例１０に記載したように行った。
【０２２１】
メジン由来ペプチドフラグメントの原繊維化能を、ネガティブ染色を使用する電子顕微鏡観察（ＥＭ）によって行った。ペプチドフラグメントのストック溶液を懸濁し、４日間寝かせた。原繊維構造が、ＮＦＧＳＶＱＦＡオクタペプチドを含有する溶液（図１７ａ）および短縮化ＮＦＧＳＶＱを含有する溶液（図１７ｂ）の両方で明瞭に認められた。両方の場合において、構造は、ＩＡＰＰポリペプチドおよびβ−アミロイド（Ａβ）ポリペプチドのような、はるかに長いポリペプチドに関して観測された構造と類似していた。より短いゲル形成性のＮＦＧＳＶペンタペプチドは典型的なアミロイド構造を形成しなかったが、繊維状構造の網状構造を形成した（図１７ｃ）。繊維状網状構造が、最近、グルタチオンペプチドのゲル化のときに観測されたことには留意しなければならない［ＬｙｏｎおよびＡｔｋｉｎｓ（２００１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：４４０８〜４４１３］。典型的な原繊維を、広範囲の調査にもかかわらず、ＦＧＳＶＱペンタペプチド、ＧＳＶＱテトラペプチドまたはＦＧＳＶテトラペプチドを含有する溶液では検出することができなかった。ＦＧＳＶＱペプチドの場合（図１７ｄ）、幾分かの原繊維的な秩序だった構造を認めることができる一方で、典型的なアミロイド形成ペプチドによって形成された構造とは著しく異なっていたが、ＧＳＶＱペプチドおよびＦＧＳＶペプチドの場合、原繊維構造を見出すことができなかった（それぞれ、図１７ｅおよび図１７ｆ）。
【０２２２】
（実施例１５）
コンゴーレッド（ＣＲ）結合アッセイによるメジン由来ペプチドのアミロイド形成能の試験
ＣＲ染色を、実施例９に記載したように行った。
【０２２３】
ＣＲ染色を、様々なメジン由来ペプチドによって形成された構造が典型的な複屈折を示すかどうかを明らかにするために行った。図１８ｂに示すように、ＮＦＧＳＶＱヘキサペプチドはＣＲと結合し、特徴的な明るい強い緑色−金色の複屈折を示した。ＮＦＧＳＶＱＦＶオクタペプチドもまた、ヘキサペプチドに関して観測された複屈折よりも典型的ではないが、著しい複屈折を示した（図１８ａ）。ゲル形成性のＮＦＧＳＶペプチド沈殿物は非常に低い程度の複屈折を示した（図１８ｃ）。ＦＧＳＶＱおよびＦＧＳＶのペプチドは、ＣＲにより染色しても、複屈折を示さなかった（それぞれ、図１８ｄおよび図１８ｆ）。それらの２つのペプチドと陰性コントロール（すなわち、ペプチドを含まない緩衝液溶液）との間には著しい差は明らかになかった。興味深いことに、予想外の高レベルの複屈折がＧＳＶＱテトラペプチドに関して観測され（図１８ｅ）、一方で、それから形成された構造の形態（図１８ｅ）は、アミロイド原繊維の形態とは明らかに異なっていた。このことは、これらの構造が、強い複屈折において反映される著しい程度の秩序を有し得ることを示している。
【０２２４】
（実施例１６）
メジンの自己会合に対するフェニルアラニン置換の影響
最小のアミロイド形成ヘキサペプチドによるアミロイド原繊維形成のプロセスにおけるフェニルアラニン残基について考えられる役割を解明するために、フェニルアラニンのアミノ酸をアラニンで置換した。アラニン置換ペプチドを調製し、メジンの様々なフラグメントについて記載したのと同じ方法で調べた。図１９ａに示すように、著しく低下した濁度が、野生型のヘキサペプチドと比較したとき、アラニン置換ペプチドに関して観測された。ＮＡＧＳＶＱペプチドの寝かせた溶液をＥＭによって可視化しても、明らかな原繊維構造を検出することはできなかった（図１９ｂ）。これは、野生型ペプチド（図１７ｂ）に関して認められる非常に多い原繊維構造とは完全に対照的である。さらに、可視化した構造は、上記に記載したようなＮＦＧＳＶペプチドおよびＦＧＳＶＱペプチド（図１７ｃ〜図１７ｄ）に関して観測されたような秩序度を何ら示さず、しかし、ＦＧＳＶテトラペプチド（図１７ｅ）に関して観測されたような完全に非原繊維の構造と非常に類似していた。興味深いことに、ある程度の複屈折を、（ＧＳＶＱペプチド（図１８ｅ）に関して観測されたように）アラニン置換ペプチドによっても依然として検出することができる（図１９ｃ）。これらの結果は、ＣＲ染色がアミロイド形成の単独の指標として使用されることに関してさらなる疑いをもたらしている［Ｋｈｕｒａｎａ（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２２７１５〜２２７２１］。
【０２２５】
まとめると、これらの結果は、アミロイド原繊維を形成することができるメジンの短縮化フラグメントがヘキサペプチドＮＦＧＳＶＱ（配列番号２１）であることを示している。だが、より短いペンタペプチドフラグメントのＮＦＧＳＶ（配列番号２２）が、アミロイドに典型的でない繊維状構造の網状構造を示した。アミロイド形成性のＮＦＧＳＶＱヘキサペプチドは、小島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ、実施例１〜５を参照のこと）の最小のアミロイド形成フラグメントに著しく類似している。総合すると、結果は、アミロイド原繊維の形成をもたらす自己会合プロセスにおけるスタッキング相互作用の仮定された役割と一致し、また、アミロイド原繊維とβ−ヘリックス構造との間の示唆された相関と一致している。
【０２２６】
（実施例１７）
ヒトカルシトニンの最小アミロイド形成ペプチドフラグメントの同定
ヒトカルシトニン（ｈＣＴ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：１７９８８０）は、甲状腺のＣ細胞によって産生されている、カルシウムの恒常性に関与する３２アミノ酸長のポリペプチドホルモンである［ＡｕｓｔｉｎおよびＨｅａｌｔｈ（１９８１）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３０４：２６９〜２７８；Ｃｏｐｐ（１９７０）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３２：６１〜８６；Ｚａｉｄｉ（２００２）、Ｂｏｎｅ、３０：６５５〜６６３］。ｈＣＴから構成されるアミロイド原繊維が甲状腺の髄様ガンと関連することが見出されている［Ｋｅｄａｒ（１９７６）、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｓｃｉ．、１２：１１３７；Ｂｅｒｇｅｒ（１９８８）、Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、４１２：５４３〜５５１；Ａｒｖｉｎｔｅ（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：６４１５〜６４２２］。興味深いことに、合成ｈＣＴは、甲状腺に見出される沈着物に類似する形態を有するアミロイド原繊維をインビトロで形成することが見出されている［Ｋｅｄａｒ（１９７６）、上記；Ｂｅｒｇｅｒ（１９８８）、上記；Ａｒｖｉｎｔｅ（１９９３）、上記；Ｂｅｎｖｅｎｇｅ（１９９４）、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１７：１１９〜１２２；Ｂａｕｅｒ（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：１２２７６〜１２２８２；Ｋａｎａｏｒｉ（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：１２１３８〜４３；Ｋａｍｉｈａｒａ（２０００）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、９：８６７〜８７７］。アミロイド形成のインビトロプロセスは媒体のｐＨによって影響される［２３］。電子顕微鏡観察実験により、ｈＣＴによって形成された原繊維は直径が約８０Åであり、長さが数マイクロメートルにまでなることが解明されている。原繊維は互いに会合していることが多く、インビトロでのアミロイド形成は媒体のｐＨによって影響される［Ｋａｍｉｈａｒａ（２０００）、上記］。
【０２２７】
カルシトニンは、パジェット病および骨粗鬆症を含む様々な疾患に対する薬物として使用されている。しかしながら、ｈＣＴが生理学的ｐＨの水溶液において会合し、アミロイド原繊維を形成しやすいことは、薬物としてのその効率的な使用に対する大きな制限である［Ａｕｓｔｉｎ（１９８１）、上記；Ｃｏｐｐ（１９７０）、上記；Ｚａｉｄｉ（２００２）、上記］。サケＣＴ［Ｚａｉｄｉ（２００２）、上記］は、ｈＣＴに対する臨床的に使用されている代替物であるが、配列相同性が低いために、処置された患者において免疫原反応を生じさせている。従って、ｈＣＴによるアミロイド形成の機構を理解し、かつこのプロセスを抑制することは、アミロイド形成機構の関連においてだけでなく、カルシトニンの改善された治療的使用に対するステップとしても非常に重要である。
【０２２８】
円偏光二色性（ＣＤ）研究により、水中では、単量体ｈＣＴは室温で秩序のある二次構造をほとんど有していないことが明らかにされている［Ａｒｖｉｎｔｅ（１９９３）、上記］。しかしながら、円偏光二色性、蛍光および赤外分光法を使用するｈＣＴの研究により、原繊維化したｈＣＴ分子がα−ヘリックスおよびβ−シートの両方の二次構造成分を有することが解明された［Ｂａｕｅｒ（１９９４）、上記］。ＮＭＲ分光法による研究では、ＴＦＥ／Ｈ_２Ｏのような、様々な構造を促進する溶媒において、ｈＣＴが、主に残基範囲８〜２２において両親媒性のα−ヘリックスの立体配座を取っていることが示されている［Ｍｅａｄｏｗｓ（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１２４７〜１２５４；Ｍｏｔｔａ（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０４４４〜１０４５０］。ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ中では、中心領域における短い二重鎖の逆平行のβ−シート形態が残基１６〜２１によって作製される［Ｍｏｔｔａ（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：２３６４〜７１］。
【０２２９】
この構造データ、およびアミロイド形成プロセスにおける芳香族残基の提案された役割に基づいて、本発明者は、カルシトニンの自己会合を媒介するために十分である短いペプチドフラグメントを同定した［Ｒｅｃｈｅｓ（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：３５４７５〜８０］。
【０２３０】
調べたペプチド−酸性ｐＨに対するアミロイド形成の以前に報告された感受性［Ｋａｎａｏｒｉ（１９９５）、上記］に基づいて、低いｐＨでプロトン化を受ける負電荷を有しているアミノ酸がアミロイド形成プロセスにおいて重要な役割を果たし得ることが示唆されていた。ｈＣＴにおける唯一の負電荷を有しているアミノ酸はＡｓｐ^１５である（図２０ａ）。さらに、ｈＣＴのオリゴマー化状態および生物活性におけるＬｙｓ^１８およびＰｈｅ^１９の残基に対する非常に重要な役割が最近示された［Ｋａｚａｎｔｚｉｓ（２６９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９：７８０〜９１］。２つのフェニルアラニン残基がその領域に存在することと一緒になって、ｈＣＴにおけるアミロイド形成決定因子の構造分析がアミノ酸１５〜１９に向けられた。図２０ｂには、最長ペプチドの化学構造の概略図を示し、下記の表５には、この研究で使用した様々なペプチドフラグメントを示す。
【表５】

【０２３１】
（実施例１８）
カルシトニン由来ペプチドフラグメントの超微細構造分析
電子顕微鏡観察分析を、実施例１０に記載したように行った。
【０２３２】
カルシトニン由来ペプチドフラグメントの原繊維化能を、ネガティブ染色を使用して電子顕微鏡観察（ＥＭ）によって行った。ペプチドフラグメントのストック溶液を０．０２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）に懸濁し、２日間寝かせ、ネガティブ染色した。全長ポリペプチドによって形成される原繊維構造［Ａｒｖｉｎｔｅ（１９９３）、上記；Ｂｅｎｖｅｎｇｅ（１９９４）、上記；Ｂａｕｅｒ（１９９４）、上記；Ｋａｎａｏｒｉ（１９９５）、上記；Ｋａｍｉｈａｒａ（２０００）、上記］と類似する原繊維構造が、ＤＦＮＫＦペンタペプチドを含有する溶液において高頻度で明瞭に認められた（図２１ａ）。より短いＤＦＮＫテトラペプチドもまた原繊維構造を形成した（図２１ｂ）。しかしながら、形成された構造は、ＤＦＮＫＦペンタペプチドによって形成された原繊維構造と比較した場合、それほど秩序を有していなかった。ＤＦＮＫによって形成された原繊維構造の量もまた、ＤＦＮＫＦペンタペプチドと比較して少なかった。明らかな原繊維は、広範囲の調査にもかかわらず、ＦＮＫＦテトラペプチドおよびＤＦＮトリペプチドを含有する溶液を使用すると検出することができなかった。ＦＮＫＦテトラペプチの場合、無定形の凝集物のみを見出すことができた（図２１ｃ）。ＤＦＮトリペプチドは、ゲル形成性のトリペプチドによって形成される構造［Ｌｙｏｎ（２００１）、上記］と類似した、より大きな秩序を有する構造を形成した（図２１ｄ）。ＦＮＫＦテトラペプチドおよびＤＦＮトリペプチドのペプチドが原繊維を一切形成することができないかどうか、または観測結果が遅い速度論の結果であるかどうかを調べるために、同じ実験条件で、ペプチドの溶液を２週間にわたってインキュベーションした。この場合もまた、明らかな原繊維を検出することができなかった（データは示さず）。
【０２３３】
（実施例１９）
コンゴーレッド（ＣＲ）結合アッセイによるカルシトニン由来ペプチドのアミロイド形成能の試験
ＣＲ染色を、実施例９に記載したように行った。
【０２３４】
ＣＲ染色を、様々なｈＣＴ由来ペプチドにより形成された構造が典型的な複屈折を示すかどうかを明らかにするために行った。図２２ａ〜図２２ｄに示すように、すべての調べたペプチドがある程度の複屈折を示した。しかしながら、緑色の複屈折がＤＦＮＫＦペンタペプチドに関して観測され、この複屈折は明瞭であり、かつ強かった（図２２ａ）。それ以外のペプチドに関して観測された複屈折のレベルはより低く、しかし、ペプチドを含有しないコントロール溶液を使用して複屈折を検出することができなかったので、有意であった。ＤＦＮＫテトラペプチドのより低いレベルの複屈折（図２２ｂ）は、ＥＭを使用して観測されるように（図２１ｂ）、より低い程度の原繊維化と一致していた。しかしながら、ＦＮＫＦテトラペプチドおよびＤＦＮトリペプチドに関して観測される複屈折はある程度の秩序だった構造を表し得ることが理解される［Ｌｙｏｎ（２００１）上記］。
【０２３５】
（実施例２０）
凝集したｈＣＴ由来ペプチドの二次構造
ＦＴ−ＩＲ分光法を、実施例１１に記載したように行った。
【０２３６】
アミロイド沈着物は、β−プリーツシート構造が多い原繊維に特徴的である。様々なペプチドフラグメントによって形成された二次構造に関する量的な情報を得るために、ＦＴ−ＩＲ分光法を使用した。寝かせたペプチド溶液を、実施例１１に記載したように、ＣａＦ_２プレート上で乾燥させ、薄いフィルムを形成させた。図２３に示すように、ＤＦＮＫＦペンタペプチドは、（１６３９ｃｍ^−１および１６６９ｃｍ^−１に）二重の極小を示し、そして、逆平行のβ−シート構造と一致し、かつ小島アミロイドポリペプチドのアミロイド形成性のヘキサペプチドフラグメントのスペクトル［Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、上記］と著しく類似する、アミドＩのＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。ＤＦＮＫテトラペプチドに関して観測されたアミドＩのスペクトル（図２３）は、β−シート構造にとってそれほど典型的ではなかった。ＤＦＮＫテトラペプチドは、逆平行のβ−シートを反映し得る１６６６ｃｍ^−１における極小を示した一方で、β−シート構造に関して典型的に観測される１６２０ｃｍ^−１〜１６４０ｃｍ^−１付近の典型的な極小を有していなかった。ＦＮＫＦテトラペプチドは、秩序のない構造に典型的であり、かつ、小島アミロイドポリペプチドの短い非アミロイド形成フラグメントのスペクトル［Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、上記］に類似するＦＴ−ＩＲスペクトルを示した（図２３）。ＤＦＮトリペプチドは、（１６４２ｃｍ^−１および１６７３ｃｍ^−１に）二重の極小を示し（図２３）、そして、β−シート構造およびランダム構造の混合と一致する、アミドＩのＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。このことはさらに、ＥＭ可視化によって観測される構造が、β−シート構造エレメントから主に構成されたある程度の秩序だった構造を表し得ることを示している。
【０２３７】
（実施例２１）
カルシトニン由来ペプチドの自己会合に対するフェニルアラニン置換の影響
カルシトニンの自己会合プロセスにおけるフェニルアラニン残基に対する考えられる役割を洞察するために、フェニルアラニンのアミノ酸をペンタペプチド（配列番号３１）の場面においてアラニンで置換した。ＤＡＮＫＦペンタペプチドの寝かせた溶液をＥＭによって可視化しても、明らかな原繊維構造を検出することができなかった（図２４ａ）。可視化した構造は、（ＦＮＫＦテトラペプチドに関して認められる無定形の凝集物と比較したとき）、ある程度の秩序を示し、しかしながら、緑色−金色の複屈折を観測することができなかった（図２４ｂ）。ＤＡＮＫＡペンタペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトルは、ＦＮＫＦテトラペプチドおよび他の短い非アミロイド形成ペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトル（これは秩序のない構造に典型的である［Ｔｅｎｉｄｉｓ（２０００）、上記］）と類似していた。まとめると、フェニルアラニンからアラニンへの置換の影響は、小島アミロイドポリペプチドの短いアミロイド形成性のフラグメントの場面におけるそのような変化の影響［Ａｚｒｉｅｌ（２００１）、上記］と非常に類似している。
【０２３８】
まとめると、ｈＣＴ由来ペンタペプチド（配列番号２７）は、十分に秩序だったアミロイド原繊維を形成することができることが明らかにされた。電子顕微鏡観察の可視化により認められるような典型的な原繊維構造（図２１ａ）、ＣＲにより染色したときの非常に強い緑色の複屈折（図２２ａ）、および典型的な逆平行β−シート構造（図２３ａ）、これらのすべてが、ＤＦＮＫＦペンタペプチドが非常に強力なアミロイド形成因子であることを示している。自己会合することができる他のペンタペプチドを本明細書中上記に示した。それでも、複屈折の程度および電子顕微鏡観察による形態学に関して、ｈＣＴフラグメントは、β−アミロイド（Ａβ）ポリペプチドの強力なアミロイド形成フラグメントのＫＬＶＦＦＡＥ［Ｂａｌｂａｃｈ（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：１３７４８〜５９］と類似する最も大きいアミロイド形成能を有するペンタペプチドであるようである。リジンおよびアスパラギン酸における反対の荷電の間における静電的相互作用により、秩序だった逆平行構造の形成が誘導されると考えられる。興味深いことに、ＤＦＮＫポリペプチドは、ＤＦＮＫＦペプチドと比較した場合、著しく低下したアミロイド形成能を示した。ペンタペプチドが強力なアミロイド形成因子のための下限であると考えられる。このことは、ＩＡＰＰの２つのペンタペプチド（ＮＦＬＶＨおよびＦＬＶＨＳ）がアミロイド原繊維を形成することができ、しかし、それらの共有する共通部分（テトラペプチドＦＬＶＨ）はそのような原繊維を形成することができないことを明らかにする最近の結果と一致している（実施例１〜５を参照のこと）。
【０２３９】
（実施例２２）
ラクトトランスフェリンからのアミロイド形成ペプチドの同定
ラクトトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：２４８９５２８０）によるアミロイド原繊維形成は家族性上皮下角膜アミロイド形成に関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、ラクトトランスフェリン由来ペプチドのＬＦＮＱＴＧ（配列番号３２）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２４０】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２４１】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するラクトトランスフェリン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図２５に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、ラクトトランスフェリンのＬＦＮＱＴＧがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２４２】
（実施例２３）
血清アミロイドＡタンパク質からのアミロイド形成ペプチドの同定
血清アミロイドＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：１３４１６７）の断片は慢性炎症アミロイドーシスの症例のアミロイド状態で見出されている［Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ他（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１８２：２７〜３３］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、血清アミロイドＡタンパク質由来ペプチドのＳＦＦＳＦＬ（配列番号３３）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２４３】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２４４】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成する血清アミロイドＡタンパク質由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図２６に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、血清アミロイドＡタンパク質のＳＦＦＳＦＬがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２４５】
（実施例２４）
ＢｒｉＬからのアミロイド形成ペプチドの同定
ヒトＢＲＩ遺伝子は第１３染色体上に位置する。ＢｒｉＬ遺伝子生成物（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：１２６４３３４３）のアミロイド原繊維はニューロンの機能不全及び痴呆と関連する（Ｖｉｄａｌ他（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、７７６〜７８１）。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、ＢｒｉＬ由来ペプチドのＦＥＮＫＦ（配列番号３４）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２４６】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２４７】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するＢｒｉＬ由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図２７に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、ＢｒｉＬのＦＥＮＫＦがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２４８】
（実施例２５）
ゲルソリンからのアミロイド形成ペプチドの同定
ゲルソリンタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：４５０４１６５）の断片はフィンランド遺伝性アミロイドーシスの症例のアミロイド状態で見出されている［ＭａｕｒｙおよびＮｕｒｍｉａｈｏ−Ｌａｓｓｉｌａ（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１８３：２２７〜３１］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、ゲルソリン由来ペプチドのＳＦＮＮＧ（配列番号３５）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２４９】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２５０】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するゲルソリン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図２８に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、ＢｒｉＬのＳＦＮＮＧがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２５１】
（実施例２６）
血清アミロイドＰからのアミロイド形成ペプチドの同定
ベータアミロイドによるアミロイド原繊維形成は血清アミロイドＰ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：２１４４８８４）との相互作用によって促進される。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、血清アミロイドＰ由来ペプチドのＬＱＮＦＴＬ（配列番号３６）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２５２】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２５３】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成する血清アミロイドＰ由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図２９に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、血清アミロイドＰのＬＱＮＦＴＬがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２５４】
（実施例２７）
免疫グロブリン軽鎖からのアミロイド形成ペプチドの同定
免疫グロブリン軽鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：６２５５０８）によるアミロイド原繊維の形成は一次全身性アミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、免疫グロブリン軽鎖由来ペプチドのＴＬＩＦＧＧ（配列番号３７）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２５５】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２５６】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成する免疫グロブリン軽鎖由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３０に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、免疫グロブリン軽鎖のＴＬＩＦＧＧがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２５７】
（実施例２８）
シスタチンＣからのアミロイド形成ペプチドの同定
シスタチンＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：４４９０９４４）によるアミロイド原繊維の形成は遺伝性の脳のアミロイドアンギオパチーと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、シスタチンＣ由来ペプチドのＲＡＬＤＦＡ（配列番号３８）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２５８】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２５９】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するシスタチンＣ由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３１に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、シスタチンＣのＲＡＬＤＦＡがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２６０】
（実施例２９）
トランスサイレチンからのアミロイド形成ペプチドの同定
トランスサイレチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：７２０９５）によるアミロイド原繊維の形成は家族性アミロイド多発神経障害と関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、トランスサイレチン由来ペプチドのＧＬＶＦＶＳ（配列番号３９）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２６１】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２６２】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するトランスサイレチン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３２に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、トランスサイレチンのＧＬＶＦＶＳがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２６３】
（実施例３０）
リゾチームからのアミロイド形成ペプチドの同定
リゾチーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：２９９０３３）によるアミロイド原繊維の形成は家族性非神経障害性アミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、リゾチーム由来ペプチドのＧＴＦＱＩＮ（配列番号４０）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２６４】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２６５】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するリゾチーム由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３３に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、リゾチームのＧＴＦＱＩＮがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２６６】
（実施例３１）
フィブリノーゲンからのアミロイド形成ペプチドの同定
フィブリノーゲン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：１１７６１６２９）によるアミロイド原繊維の形成は遺伝性腎アミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、フィブリノーゲン由来ペプチドのＳＧＩＦＴＮ（配列番号４１）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２６７】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２６８】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するフィブリノーゲン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３４に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、フィブリノーゲンのＳＧＩＦＴＮがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２６９】
（実施例３２）
インシュリンからのアミロイド形成ペプチドの同定
インシュリン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：２２９１２２）によるアミロイド原繊維の形成は注射局在アミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、インシュリン由来ペプチドのＥＲＧＦＦ（配列番号４２）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２７０】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２７１】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するインシュリン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３５に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、インシュリンのＥＲＧＦＦがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２７２】
（実施例３３）
プロラクチンからのアミロイド形成ペプチドの同定
プロラクチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：４５０６１０５）によるアミロイド原繊維の形成は下垂体アミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、プロラクチン由来ペプチドのＲＤＦＬＤＲ（配列番号４３）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２７３】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２７４】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するプロラクチン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３６に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、プロラクチンのＲＤＦＬＤＲがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２７５】
（実施例３４）
ベータ−２−ミクロチューブリンからのアミロイド形成ペプチドの同定
ベータ−２−ミクロチューブリン（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ｇｉ：７００６５）によるアミロイド原繊維の形成は血液透析関係のアミロイドーシスと関連する［ＳａｃｃｈｅｔｔｉｎｉおよびＫｅｌｌｙ（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、１：２６７〜７５］。アミロイドの自己会合における芳香族残基の提案された役割に基づいて、ベータ−２−ミクロチューブリン由来ペプチドのＳＮＦＬＮ（配列番号４４）のアミロイド形成特性を調べた。
【０２７６】
材料および実験手順−実施例７および実施例１０に記載した。
【０２７７】
結果−原繊維超分子の超微細構造を形成するベータ−２−ミクロチューブリン由来ペプチドの能力を特徴づけるために、ネガティブ染色での電子顕微鏡観察分析を行った。図３７に示すように、穏和な条件のもとで、フィラメント状構造を、選択したペプチドについて観測した。このことは、ベータ−２−ミクロチューブリンのＳＮＦＬＮがポリペプチドの自己会合のために重要であることを示唆している。これらの結果はさらに、本発明によりアミロイド形成ペプチドの配列を予測することができることを実証している。
【０２７８】
（実施例３５）
本発明の教示に従って同定したアミロイド形成ペプチドのアミロイド形成の阻害
全長ポリペプチドによるアミロイド形成を阻害する、本発明の教示に従って同定したＩＡＰＰのアミロイド形成ペプチドの能力を、ペプチド配列ＮＦＬＶＨＰＰ（配列番号４５）に示すように、β−破壊剤のプロリン残基を認識配列に付加することによって調べた。
【０２７９】
阻害剤の存在下および非存在下でのアミロイド原繊維形成の程度を、分子指示剤としてチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を使用して評価した。ＴｈＴ色素の蛍光の程度は、溶液中のアミロイド原繊維の量に直接的に相関する［ＬｅＶｉｎｅ Ｈ ３ｒｄ．（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２：４０４〜４１０］。ＩＡＰＰ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）における４μＭのｈＩＡＰＰ）を、４０μＭの改変ペプチド（すなわち、ＮＦＬＶＨＰＰ）の存在下または非存在下、室温でインキュベーションした。原繊維形成を、この溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に３μＭのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を含有する溶液に１０倍希釈し、ＬＳ５０Ｂ分光蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用して４５０ｎｍでの励起による４８０ｎｍにおける蛍光を測定することによって測定した。コントロールとして、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）をＴｈＴ溶液に希釈し、蛍光を、記載したように測定した。
【０２８０】
結果−図３８に示すように、ＩＡＰＰは単独では、アミロイド形成タンパク質について予想されるように高レベルのＴｈＴの蛍光を示したが、阻害ペプチドの存在下では蛍光が著しく増大した。従って、これらの結果により、ＮＦＬＶＨ配列がＩＡＰＰポリペプチドにおけるアミロイド形成決定因子として確認される。
【０２８１】
（実施例３６）
アミロイドの会合における疎水性残基の重要性
ＩＡＰＰの基本アミロイド形成ユニットにおける芳香族残基の重要性を実施例１〜実施例５において明らかにした。記載したように、フェニルアラニンをアラニンに置換すると、アミロイド形成フラグメント（ＮＡＧＡＩＬ、配列番号９）がインビトロでアミロイド原繊維を形成する能力がなくなった。この観測の結果、他の短いアミロイド関連配列における芳香族残基の顕著な存在（実施例１２〜実施例３５）、ならびに、化学および生化学における自己会合プロセスにおけるπスタッキングの広く知られている役割に基づいて、芳香族残基のスタッキングがアミロイド原繊維形成プロセスにおいて役割を果たし得ることが示唆されている［Ｇａｚｉｔ（２００２）、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１６：７７〜８３］。
【０２８２】
研究を、さらに、フェニルアラニン残基が、その芳香族性のためにというよりは、その疎水的性質のために重要であるかどうか示すために拡張した。ＩＡＰＰの基本アミロイド形成ユニット（すなわち、ＮＦＧＡＩＬペプチド）の自己会合に対する疎水性残基によるフェニルアラニン置換による影響を検討した。
【０２８３】
この研究で使用したペプチドおよびその表示の一覧を下記の表６に示す。
【表６】

【０２８４】
これらの疎水性アミノ酸はフェニルアラニンと類似の疎水性を有するか、または、フェニルアラニンよりもさらにわずかに疎水性が大きい［Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ（１９８１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：８４９〜８５５；Ｋｙｔｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３２；Ｒａｄｚｉｃｋａ（１９８８）］が、それらは芳香族性でないことが理解される。さらに、バリンおよびイソロイシンは、β−シートの多いアミロイド原繊維の形成にとって重要であると推定される非常に強いβ−シート形成因子であると見なされている［Ｃｈｏｕ（１９７４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２１１〜２２２；Ｃｈｏｕ（１９７８）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１〜２７６］。
【０２８５】
（実施例３７）
濁度測定によってモニターしたときの、疎水性に改変されたｈＩＡＰＰペプチドフラグメントの凝集速度論の特徴づけ
実験手順−実施例８に記載したように行った。
【０２８６】
結果
疎水性に改変されたＩＡＰＰ由来ペプチドアナログの凝集能に対する洞察を得るために、濁度アッセイを行った。野生型ペプチドおよび様々なペプチド変異型の新しく作製したストック溶液をＤＭＳＯ中で作製した。その後、ペプチドを緩衝液溶液に希釈し、濁度を、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度を追跡することによってモニターした。図３９に示すように、濁度の著しい増大が、水溶液へのその希釈後数分以内に、野生型のＮＦＧＡＩＬＳＳオクタペプチドについて観測された。凝集曲線の形状は、濁度の急速な増大が最初の１時間に存在し、その後、モニターされたインキュベーション時間全体にわたる濁度のはるかにより遅い増大を伴う飽和曲線の形状に類似していた。これは、おそらく、自由な構成要素の数を律速因子とする迅速な凝集プロセスを反映している。対照的に、アナログペプチドはどれも、何ら意味のある凝集挙動を明らかにせず、また、すべての疎水性アナログならびにアラニン置換アナログの濁度は、少なくとも２４時間にわたって非常に低いままであった（図３９）。
【０２８７】
疎水性アナログの非凝集挙動が極めて遅い速度論の結果であるかどうか明らかにするために、ペプチドアナログの溶液を同じ実験条件で１週間にわたってインキュベーションし、終点の濁度値を測定した。図３０に示すように、やや低い程度の濁度がＮＩＧＡＩＬＳＳに関して観測され、より低い程度が、濁度の低下する順に、ＮＬＧＡＩＬＳＳ、ＮＡＧＡＩＬＳＳおよびＮＶＧＡＩＬＳＳのペプチドについて観測された。しかしながら、ＮＩＧＡＩＬＳＳの場合でさえ、濁度の程度は、野生型のＮＦＧＡＩＬＳＳタンパク質と比較して著しく低下していた（図４０）。さらに、より低い程度の凝集が、疎水性が大きいβ−シート形成因子のバリンへの置換に関して観測されたので、凝集能と疎水性またはβ−シート形成傾向との間には相関が何ら認められなかった。ＮＦＧＡＩＬＳＳ野生型ペプチドの終点濁度値のわずかな低下は、２４時間のインキュベーションの後で得られた値と比較した場合、キュベット表面に付着する非常に大きい凝集物が形成したことを反映し得る。
【０２８８】
（実施例３８）
疎水性に改変されたｈＩＡＰＰペプチドフラグメントの超微細構造分析
電子顕微鏡観察分析を、実施例１０に記載したように行った。
【０２８９】
様々なアナログペプチドによって形成された何らかの可能な構造の超微細構造可視化を５日間のインキュベーションの後で行った。この構造分析は、様々な凝集物を個々に可視化するので、最も高感度な方法を表す。その目的のために、形成された構造の存在および特徴を、凝集アッセイ（実施例３２）においてインキュベーションした同じペプチド溶液を用いて、ネガティブ染色を使用して電子顕微鏡観察によって調べた。予想されたように、十分な秩序を有する原繊維が野生型ペプチドのＮＦＧＡＩＬＳＳペプチドフラグメントに関して観測された（図４１ａ〜図４１ｂ）。いくつかの無定形の凝集物もまた、改変したフラグメントに関して認めることができた（図４１ｃ〜図４１ｆ）。しかしながら、それらの構造は、顕微鏡グリッドでは著しく多くなかった。より大きい凝集性構造が、アラニンアナログと比較した場合、より疎水性の置換体に関して観測された。それでも、上記で述べたように、ＮＦＧＡＩＬＳＳペプチドに関して認められた秩序だった原繊維構造とは異なり、これらの凝集物は極めて希であり、秩序だった構造を有していなかった（図４１ｃ〜図４１ｆ）。それらの不規則で、散発的な構造は、かなり疎水性の分子を長くインキュベーションした後で予想されるような、ある程度の非特異的な凝集と一致している。
【０２９０】
（実施例３９）
ＩＡＰＰの自己会合におけるフェニルアラニンの特異的な機能の決定
ＩＡＰＰの自己会合におけるフェニルアラニン残基の特異的な役割を決定するために、メンブラン型結合アッセイを、「基本アミロイド形成ユニット」を認識する全長ｈＩＡＰＰの能力を促進させる分子決定因子を体系的に調査するために行った。この目的のために、フェニルアラニン位を体系的に変化させたペプチド（配列番号９１〜１１０）のアレイと相互作用するＭＢＰ−ＩＡＰＰ（実施例６参照）の能力を検討した。
【０２９１】
材料および実験手順−実施例６〜実施例７を参照のこと。
【０２９２】
結果
ＳＮＮＸＧＡＩＬＳＳモチーフ（配列番号９０）（式中、Ｘは、システインを除く任意の天然アミノ酸である）に対応するペプチドアレイを構築した。図４２ａに示すように、ＭＢＰ−ＩＡＰＰの結合を、芳香族性のトリプトファン残基およびフェニルアラニン残基をＸ位に含有するペプチドについて明瞭に観測した（図４２ａ）。興味深いことに、結合はまた、フェニルアラニンがアルギニンおよびリジンなどの塩基性アミノ酸で置換したときにも観測された。対照的に、その位置の疎水性置換体のいずれに関しても、結合は、メンブランに長時間曝された後でさえも観測されなかった（図４２ｂ）。
【０２９３】
短時間の暴露での結合を、デンシトメトリーを使用して評価した（図４２ｃ）。しかし、合成時のカップリング効率、従って、スポットあたりのペプチドの量が変化し得るので、測定した結合は半定量的であるとして解釈しなければならないことが理解される。しかしながら、この場合、様々なペプチド変化体の間における結合の差が顕著であることが極めて明瞭であった。
【０２９４】
まとめると、これらの観測結果のすべてが、アミロイド形成プロセスの促進における芳香族残基の役割を実証している。
【０２９５】
本発明をその特定態様に関して説明したが、多くの代替、変更および変形態様が当業者にとって明白であることは明らかである。したがって、特許請求の範囲の精神およびその広い範囲に包含されるそれらの代替、変更および変形態様は、全て本発明に包含されるものとする。本明細書で言及した刊行物、特許および特許出願は全て、具体的かつ個別的な表示の有無にかかわらず、参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。また、本願で行う参考文献の引用および記載は、当該参考文献を本発明に対する先行技術として利用できるとの自認ではないと解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１】多数のアミロイドタンパク質に由来するペプチド群の、ＫｙｔｅおよびＤｏｌｉｔｔｌｅの尺度を使用して推定されるような、自己集合能とその疎水性とを示す模式図である。
【図２ａ】阻害性芳香族試薬のＲｏ４７−１８１６／００１とのアミロイド結合を模式的に示す。
【図２ｂ】チオフラビンＴとのアミロイド結合を模式的に示す。
【図２ｃ】ＣＲ色素とのアミロイド結合を模式的に示す。
【図３ａ】ヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰと本発明の合成ペプチドとの間での一次配列比較の模式図である。図３ａはヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰの配列アラインメントである。
【図３ｂ】ヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰと本発明の合成ペプチドとの間での一次配列比較の模式図である。図３ｂは野生型ＩＡＰＰペプチド（配列番号１）の化学構造を示す。
【図３ｃ】ヒトＩＡＰＰおよび齧歯類ＩＡＰＰと本発明の合成ペプチドとの間での一次配列比較の模式図である。図３ｃは、基本アミロイド形成ユニットに由来するペプチドの一次配列および配列番号を示す。
【図４ａ】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図４ｂ】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図５】光散乱によって測定されたときの会合したＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の平均粒子サイズを示すヒストグラムである。
【図６ａ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｂ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｃ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｄ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｅ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｆ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｇ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｈ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｉ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｊ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｋ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｌ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｍ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図６ｎ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図７ａ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図７ｂ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図７ｃ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図７ｄ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図７ｅ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図７ｆ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドおよび誘導体の電子顕微鏡写真である。
【図８ａ】野生型ｈＩＡＰＰと、細菌のコドン使用頻度に従って改変された対応する配列との核酸配列アラインメントである。
【図８ｂ】４８ｋＤａのＭＢＰ−ＩＡＰＰタンパク質の細胞質発現のために使用されるｐＭＡＬｃ２ｘ−ＮＮベクターの模式図である。
【図９】ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＩＡＰＰ融合タンパク質の細菌発現および精製を示すタンパク質ゲルＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色である。
【図１０ａ】ｈＩＡＰＰにおける推定されるアミロイド形成配列を示すドットブロット画像である。
【図１０ｂ】ｈＩＡＰＰにおける推定されるアミロイド形成配列を示すデンシトメトリー定量である。
【図１１】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチド（配列番号１４〜１９）の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図１２ａ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１２ｂ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１２ｃ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１２ｄ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１２ｅ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１２ｆ】事前に会合させたＩＡＰＰペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１３ａ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１３ｂ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１３ｃ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１３ｄ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１３ｅ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１３ｆ】「寝かせた」ＩＡＰＰペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１４ａ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１４ｂ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１４ｃ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１４ｄ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１４ｅ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１４ｆ】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性ＩＡＰＰ凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図１５】メジンの以前に報告されたアミロイド形成ペプチドフラグメントの化学構造である。
【図１６ａ】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、メジン由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図１６ｂ】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、メジン由来ペプチドの凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図１７ａ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１７ｂ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１７ｃ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１７ｄ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１７ｅ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１７ｆ】「寝かせた」メジン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図１８ａ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｂ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｃ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｄ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｅ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｆ】事前に会合させたメジン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図１９ａ】メジンのヘキサペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図１９ａは、原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、メジン由来アラニン変異型の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図１９ｂ】メジンのヘキサペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図１９ｂは、「寝かせた」メジン由来のアラニン変異型の電子顕微鏡写真である。
【図１９ｃ】メジンのヘキサペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図１９ｃは、事前に会合させたメジン由来ペプチド変異型へのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２０ａ】ヒトカルシトニンのアミノ酸配列である。
【図２０ｂ】ヒトカルシトニンのアミロイド形成ペプチドフラグメントの化学構造である。
【図２１ａ】「寝かせた」カルシトニン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図２１ｂ】「寝かせた」カルシトニン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図２１ｃ】「寝かせた」カルシトニン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図２１ｄ】「寝かせた」カルシトニン由来ペプチドの電子顕微鏡写真である。
【図２２ａ】事前に会合させたカルシトニン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２２ｂ】事前に会合させたカルシトニン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２２ｃ】事前に会合させたカルシトニン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２２ｄ】事前に会合させたカルシトニン由来ペプチドへのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２３】フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの不溶性カルシトニン凝集物における二次構造を示すグラフである。
【図２４ａ】カルシトニンのペンタペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図２４ａは、「寝かせた」カルシトニン由来のアラニン変異型の電子顕微鏡写真である。
【図２４ｂ】カルシトニンのペンタペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図２４ｂは、事前に会合させたカルシトニン由来のペプチド変異型へのコンゴーレッドの結合を示す顕微鏡写真である。
【図２４ｃ】カルシトニンのペンタペプチドのアミロイド形成フラグメントのアミロイド形成特性に対するアラニン変異の影響を示す。図２４ｃは、フーリエ変換赤外分光法によって測定されたときの変異型ペプチドにおける二次構造を示すグラフである。
【図２５】「寝かせた」ラクトトランスフェリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図２６】「寝かせた」血清アミロイドＡタンパク質由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図２７】「寝かせた」ＢｒｉＬ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図２８】「寝かせた」ゲルゾリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図２９】「寝かせた」血清アミロイドＰ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３０】「寝かせた」免疫グロブリン軽鎖由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３１】「寝かせた」シスタチンＣ由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３２】「寝かせた」トランスチレチン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３３】「寝かせた」リゾチーム由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３４】「寝かせた」フィブリノーゲン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３５】「寝かせた」インスリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３６】「寝かせた」プロラクチン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３７】「寝かせた」β２ミクログロブリン由来ペプチドの自己会合を示す電子顕微鏡写真である。
【図３８】ＩＡＰＰの己会合に対する阻害ペプチドの作用を示すグラフである。
【図３９】原繊維形成の間の時間を関数とする４０５ｎｍでの光の吸光度、従って、ＩＡＰＰ由来ペプチド（配列番号４６〜４９）の凝集速度論を反映する吸光度を示すグラフである。
【図４０】７日間寝かせた後のＩＡＰＰアナログの濁度を示すヒストグラム図を示す。
【図４１ａ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４１ｂ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４１ｃ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４１ｄ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４１ｅ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４１ｆ】「寝かせた」ＩＡＰＰアナログの電子顕微鏡写真である。
【図４２ａ−ｂ】最小のアミロイド形成配列ＳＮＮＸＧＡＩＬＳＳ（Ｘ＝システイン以外の任意の天然アミノ酸）のアナログに対するＩＡＰＰ−ＮＦＧＡＩＬＳＳの結合を示す。図４２ａは結合させたペプチドアレイの短期間の暴露を示す。図４２ｂは結合させたペプチドアレイの長期間の暴露を示す。図４２ｃは、デンシトメトリーおよび任意単位を使用する、短期間の暴露（図４２ａ）の定量を示す。
【図４２ｃ】最小のアミロイド形成配列ＳＮＮＸＧＡＩＬＳＳ（Ｘ＝システイン以外の任意の天然アミノ酸）のアナログに対するＩＡＰＰ−ＮＦＧＡＩＬＳＳの結合を示す。図４２ｃは、デンシトメトリーおよび任意単位を使用する、短期間の暴露（図４２ａ）の定量を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２９７】
配列番号１〜６は合成ペプチドの配列である。
配列番号７はコンセンサス配列であり、第１アミノ酸は任意の芳香族アミノ酸であり、第２アミノ酸はグリシン以外の任意のアミノ酸であり、第３〜第５アミノ酸は任意のアミノ酸である。
配列番号８〜４９は合成ペプチドの配列である。
配列番号５０〜５７及び５９〜６０は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号５８は細菌での発現のための改変されたＩＡＰＰ ｃＤＮＡの配列である。
配列番号６１〜８９は合成ペプチドの配列である。
配列番号９０はペプチドアレイコンセンサス配列である。
配列番号９１〜１１１は合成ペプチドの配列である。
【配列表】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、生理学的条件のもとで自己凝集することができるペプチド。
【請求項１３】
少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドがさらに少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチド。
【請求項１８】
ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２３】
少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１および配列番号２１〜配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２８】
少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項２７に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項２７に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含む前記ペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが核酸構築物から発現される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法。
【請求項４６】
前記ペプチドが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドが核酸構築物から発現される請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法であり、前記ペプチドが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である方法。
【請求項５３】
前記ペプチドが核酸構築物から発現される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法。
【請求項５９】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ペプチドが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１および配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記ペプチドの治療有効量を個体に与えることを含む方法であり、前記ペプチドが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である方法。
【請求項６５】
前記ペプチドが核酸構築物から発現される請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含む前記ペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項７１】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７２】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項７６に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項７６に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項７６に記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項７９に記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項８２】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項８１に記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項８１に記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項８１に記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項８４に記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項８７】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項８９】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項９０】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項８９に記載の薬学的組成物。
【請求項９１】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項９２】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項９１に記載の薬学的組成物。
【請求項９３】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項９１に記載の薬学的組成物。
【請求項９４】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項９１に記載の薬学的組成物。
【請求項９５】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項９４に記載の薬学的組成物。
【請求項９６】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドを有効成分として含み、かつ、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項９７】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項９６に記載の薬学的組成物。
【請求項９８】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項９６に記載の薬学的組成物。
【請求項９９】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項９６に記載の薬学的組成物。
【請求項１００】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項９９に記載の薬学的組成物。
【請求項１０１】
少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を有し、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物。
【請求項１０２】
プロモーターをさらに含む請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１０３】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１０４】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１０５】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１０５に記載の核酸構築物。
【請求項１０７】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１０５に記載の核酸構築物。
【請求項１０８】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１０９】
ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１１０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１０１に記載の核酸構築物。
【請求項１１１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１１０に記載の核酸構築物。
【請求項１１２】
配列番号８、配列番号１０〜配列番号１１、配列番号２１〜配列番号２２および配列番号２５からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物。
【請求項１１３】
プロモーターをさらに含む請求項１１２に記載の核酸構築物。
【請求項１１４】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項１１２に記載の核酸構築物。
【請求項１１５】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１１２に記載の核酸構築物。
【請求項１１６】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１１５に記載の核酸構築物。
【請求項１１７】
配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸構築物。
【請求項１１８】
プロモーターをさらに含む請求項１１７に記載の核酸構築物。
【請求項１１９】
前記ペプチドがそのＣ末端に結合された少なくとも２つのセリン残基をさらに含む請求項１１７に記載の核酸構築物。
【請求項１２０】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１１７に記載の核酸構築物。
【請求項１２１】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１２０に記載の核酸構築物。
【請求項１２２】
少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を含む抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２３】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２４】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２５】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１２４に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２６】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１２４に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２７】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２８】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２９】
前記ペプチドが少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３０】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３１】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１２２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３２】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１３１に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３３】
アミロイド関連疾患を処置または予防するための薬学的組成物であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を有する抗体または抗体フラグメントを有効成分として含む薬学的組成物。
【請求項１３４】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１３５】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１３６】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１３５に記載の薬学的組成物。
【請求項１３７】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１３５に記載の薬学的組成物。
【請求項１３８】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１３９】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４０】
前記ペプチドが少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４１】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４２】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１３３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４３】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１４２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４４】
個体におけるアミロイド関連疾患を処置または予防する方法であって、少なくとも３個でかつ１５個未満のアミノ酸残基を含み、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドと結合することができる抗原認識領域を有する抗体または抗体フラグメントの治療有効量を個体に与えることを含む方法。
【請求項１４５】
前記アミノ酸配列がさらに、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの天然の誘導体からなる群から選択される極性の電荷を有していないアミノ酸を含む請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記アミノ酸配列がさらに、少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸および少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸を含む請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記少なくとも１つの正電荷を有しているアミノ酸は、リジン、アルギニン、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記少なくとも１つの負電荷を有しているアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ならびにそれらの天然の誘導体および合成された誘導体からなる群から選択される請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記アミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号１２〜配列番号１９および配列番号２７〜配列番号４５からなる群から選択される請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ペプチドが少なくとも２つのセリン残基をそのＣ末端にさらに含む請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ペプチドが直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドである請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ペプチドがさらに、少なくとも１つのβ−破壊剤アミノ酸を含む請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５４】
前記β−破壊剤アミノ酸がプロリンである請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗体または抗体フラグメントが生理学的に受容可能なキャリアもまた含む薬学的組成物の有効成分である請求項１４４に記載の方法。

【図１】

【図２ａ】

【図２ｂ】

【図２ｃ】

【図３ａ】

【図３ｂ】

【図３ｃ】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図５】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図６ｃ】

【図６ｄ】

【図６ｅ】

【図６ｆ】

【図６ｇ】

【図６ｈ】

【図６ｉ】

【図６ｊ】

【図６ｋ】

【図６ｌ】

【図６ｍ】

【図６ｎ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図７ｃ】

【図７ｄ】

【図７ｅ】

【図７ｆ】

【図８ａ】

【図８ｂ】

【図９】

【図１０ａ】

【図１０ｂ】

【図１１】

【図１２ａ】

【図１２ｂ】

【図１２ｃ】

【図１２ｄ】

【図１２ｅ】

【図１２ｆ】

【図１３ａ】

【図１３ｂ】

【図１３ｃ】

【図１３ｄ】

【図１３ｅ】

【図１３ｆ】

【図１４ａ】

【図１４ｂ】

【図１４ｃ】

【図１４ｄ】

【図１４ｅ】

【図１４ｆ】

【図１５】

【図１６ａ】

【図１６ｂ】

【図１７ａ】

【図１７ｂ】

【図１７ｃ】

【図１７ｄ】

【図１７ｅ】

【図１７ｆ】

【図１８ａ】

【図１８ｂ】

【図１８ｃ】

【図１８ｄ】

【図１８ｅ】

【図１８ｆ】

【図１９ａ】

【図１９ｂ】

【図１９ｃ】

【図２０ａ】

【図２０ｂ】

【図２１ａ】

【図２１ｂ】

【図２１ｃ】

【図２１ｄ】

【図２２ａ】

【図２２ｂ】

【図２２ｃ】

【図２２ｄ】

【図２３】

【図２４ａ】

【図２４ｂ】

【図２４ｃ】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１ａ】

【図４１ｂ】

【図４１ｃ】

【図４１ｄ】

【図４１ｅ】

【図４１ｆ】

【図４２ａ−ｂ】

【図４２ｃ】

【公表番号】特表２００６−５０６９４２（Ｐ２００６−５０６９４２Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５６３４５６（Ｐ２００３−５６３４５６）
【出願日】平成１５年１月３０日（２００３．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００３／００００７９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０６３７６０
【国際公開日】平成１５年８月７日（２００３．８．７）
【出願人】（５０４２９２０１５）テル　アヴィヴ　ユニヴァーシティ　フューチャー　テクノロジー　ディヴェロップメント　エル．ピー． (7)
【Ｆターム（参考）】