アルカリプロテアーゼ
【課題】液体洗剤中での安定性が向上したアルカリプロテアーゼの提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、アミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、アミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することであるが、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（特許文献１参照）。斯かるアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１）。
【０００５】
ところで、洗浄剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は粉末洗剤に比べて、溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットがある。液体洗剤には粉末洗剤には無い上記のような利点があるが、その反面プロテアーゼなどの酵素の安定的な配合に関しては粉末洗剤には無い技術的な困難さがあることが広く知られている。元来、液体中で常温保存すること自体が、タンパク質の変性を招きやすい上に、液体洗剤には界面活性剤、脂肪酸、溶剤等が含有され、pHも弱アルカリ性であり、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。また、プロテアーゼはタンパク質分解酵素であるが故に自己消化の問題も有しており、液体洗剤中での安定保存を更に困難なものにしている。
【０００６】
このような技術的な課題に対して、カルシウムイオン、ホウ砂、ホウ酸、ホウ素化合物、ギ酸などのカルボン酸、ポリオール等の酵素安定化剤を加えることは公知である。また、プロテアーゼの活性を阻害することにより、自己消化の問題を解決すべく検討もなされており、４−置換フェニルボロン酸（特許文献２）や、ある種のペプチドアルデヒド及びホウ素組成物（特許文献３）によるプロテアーゼの可逆的阻害による安定化法が報告されている。また、デキストランで化学修飾したプロテアーゼが、界面活性剤を含む水溶液中での安定性を向上させ得ることが報告されている（非特許文献２）。
【０００７】
しかし、カルシウムイオン、ホウ酸などの酵素安定化剤の添加によってもプロテアーゼの安定性は十分ではなく、阻害剤も酵素種によって阻害効率が異なる上に製造コストを考慮すると液体洗剤組成物として課題を解決する方法とは言い難い。同様に酵素の化学修飾も製造コストの面で難があった。酵素安定化剤、阻害剤、化学修飾など種々の方策が検討されてきているが、コスト的にはプロテアーゼ自身の液体洗剤中での安定性を向上させることが最も望ましい。
【０００８】
一般的な液体洗剤組成としては界面活性剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、溶剤、香料、蛍光染料などが挙げられるが、最も酵素の安定性を損なう物質は界面活性剤であり、通常陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤から成る場合が多い。非イオン界面活性剤は概して酵素に対しての傷害性は大きくはないが、陰イオン界面活性剤は疎水部分が酵素に侵入し、酵素の疎水性相互作用を破壊することに加え、酵素を安定化しているカルシウムイオンなどの２価金属を補足するために酵素への傷害性は非常に高いと考えられている（非特許文献３）。
【０００９】
従って、陰イオン界面活性剤に対しての耐性を向上させることは、液体洗剤中での安定性を向上させる上で非常に重要な因子となっている。
【特許文献１】国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【特許文献２】特表平１１−５０７６８０号公報
【特許文献３】特表２０００−５０６９３３号公報
【非特許文献１】Saekiら, Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 313-319, 2000
【非特許文献２】Cosmetics&Toiletries magazine, 111, p79-88, 1996
【非特許文献３】Detergent Enzyme : A Challenge! In Handbook of Detergents part A, New York, p639-690, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、液体洗剤中での安定性が向上したアルカリプロテアーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼＫＰ４３に特徴的なアミノ酸残基のうち、ある特定のアミノ酸残基の置換により、代表的な陰イオン界面活性剤であるＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム）の安定性が向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
２）上記アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
３）上記遺伝子を含有する組換えベクター。
４）上記組換えベクターを含有する形質転換体。
５）上記アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＬＡＳ等の陰イオン界面活性剤を配合した液体洗剤中でも活性を有し、かつ比活性が高く、洗浄剤配合用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼを意味するが、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、例えば、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる（国際公開第９９／１８２１８号パンフレット）。
【００１６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと同等の機能を有するものが挙げられる。
斯かるアルカリプロテアーゼとしては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと同等の機能を有するものが包含される。
具体的には、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０[バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０３]、プロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕や、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００３−１２５７８３号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−０５７１９５号公報に記載の変異プロテアーゼ、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位をセリンに置換した変異体、８９位をヒスチジンに置換した変異体、１２０位をアルギニンに置換した変異体、６３位及び１８７位をセリンに置換した変異体、２２６位をチロシンに置換した変異体、２９６位をバリンに置換した変異体、３０４位をセリンに置換した変異体（特開２００４-３０５１７５号公報）、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５位をヒスチジンに置換した変異体、１６位をスレオニン又はグルタミンに置換した変異体、１６６位をグリシンに置換した変異体、１６７位をバリンに置換した変異体、３４６位をアルギニンに置換した変異体、４０５位をアスパラギン酸に置換した変異体（特開２００４-３０５１７６号公報）、などが挙げられる。
このうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが有する次の何れかの酵素学的性質を有するのが好ましい。１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中（２０mMグリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存性を示す。３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害される。４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。
【００１７】
なお、アミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００１８】
従って、本発明のアルカリプロテアーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位のアミノ酸残基（アラニン残基）が、システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基に置換されたもの、１９５位のアミノ酸残基（チロシン残基）がロイシン又はイソロイシン残基に置換されたもの、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位に相当する位置のアミノ酸残基がシステイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基に置換されたもの、１９５位に相当する位置のアミノ酸残基がロイシン又はイソロイシン残基に置換されたものが包含される。
尚、１３３位又はこれに相当する位置、１９５位又はこれに相当する位置のアミノ酸置換は、何れか一方でも双方を同時に行っても良い。
【００１９】
ここで、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行なうことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２０】
すなわち、上記方法でアミノ酸配列を整列させ、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位のアミノ酸残基（アラニン残基）に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては１３３位のアラニン残基、プロテアーゼＫＰ９８６５においては１３３位のアラニン残基というように特定することができる。また同様に、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９５位のアミノ酸残基（チロシン残基）に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては１９５位のチロシン残基、プロテアーゼＫＰ９８６５においては１９５位のチロシン残基というように特定することができる。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとして示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。
【００２２】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号１）に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えば国際公開第９９／１８２１８号パンフレット、国際公開第９８／５６９２７号パンフレット記載の方法に従って行なえばよい。
【００２３】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラ)等を用いて行なうことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２４】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００２５】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、親アルカリプロテアーゼに比べ、陰イオン界面活性剤等を配合した液体洗剤中でも活性を有し、かつ比活性が高いという性質を新に獲得したものである。
従って、本発明のアルカリプロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
【００２６】
洗浄剤組成物中への本発明品プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５０００ＰＵが配合できるが、経済性等を考慮し、５００ＰＵ以下が好ましい。
【００２７】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明品プロテアーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、プロペラーゼ、プラフェクト（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル、ステインザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、プラスター（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ、ライペックス（登録商標；ノボザイムズ社）が挙げられる。
【００２８】
洗浄剤組成物中で本発明品プロテアーゼ以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５００ＰＵが好ましい。セルラーゼを併用する場合は、特開平１０−３１３８５９号公報の段落〔００２０〕に記載の酵素活性測定方法より決定される単位（ＫＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり３００〜３００００００ＫＵが好ましい。
【００２９】
またアミラーゼを併用する場合は、特開平１１−４３６９０号公報の段落〔００４０〕記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位（ＩＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５０〜５０００００ＩＵが好ましい。
【００３０】
さらにリパーゼを併用する場合は、特表平８−５０００１３号公報の実施例１記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位（ＬＵ）づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１００００〜１００００００ＬＵが好ましい。
【００３１】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００３２】
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
【００３３】
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００３４】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３６】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００３７】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【００３８】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００３９】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００４０】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００４１】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４２】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明品プロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
【００４３】
斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
実施例１
バチルス エスピー KSM-KP43株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約2.0kb（配列番号１）に対して成熟酵素領域の（１）195位、（２）133位に部位特異的変異を導入するプライマーをそれぞれデザインした。
（１）195位にロイシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）とプライマー２（配列番号４）を、
195位にイソロイシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号５）及びプライマー５（配列番号７）とプライマー２（配列番号４）を、
（２）133位にシステインを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー７（配列番号９）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にグリシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー８（配列番号１０）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にアスパラギン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー９（配列番号１１）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にグルタミン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー１０（配列番号１２）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にプロリンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー１１（配列番号１３）とプライマー２（配列番号４）を、
それぞれ用いPCRを行った。
【００４５】
プライマー１にはセンス鎖の5’末端側にBamHIリンカーを、プライマー２にはアンチセンス鎖の5’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー３とプライマー４及びプライマー５、更にプライマー６とプライマー７、プライマー８、プライマー９、プライマー１０及びプライマー１１はそれぞれの５’末端から10〜15bpの長さで互いに相補するようにデザインした。PCRのDNAポリメラーゼとして、Pyrobest (タカラ)を用い、PCRの条件は94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をPCR product purification kit（ロッシュ）にて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、94℃で2分間DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、リコンビナントPCRを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー１とプライマー４によりPCRを行なった。94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaI（ロッシュ）により切断した。増幅DNA断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドpHA64（特許第349293号：プロモーター64の下流にBamHI、XbaI切断部位を有する）と混合した後、Ligation High（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルス エスピー KSM9865株（FERM P-18566）を形質転換した。
【００４６】
9865株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地[スキムミルク(ディフコ)1%（w/v）、バクトトリプトン(ディフコ)1%、酵母エキス（ディフコ）0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%、炭酸ナトリウム0.05%、テトラサイクリン15ppm]に生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、5mlの種母培地[6.0%（w/v）ポリペプトンS、0.05%酵母エキス、1.0%マルトース、0.02%硫酸マグネシウム7水和物、0.1%リン酸2水素カリウム、0.25%炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に植菌し、30℃で16時間振盪培養を行った。次いで30mlの主培地[8%ポリペプトンS、0.3%酵母エキス、10%マルトース、0.04%硫酸マグネシウム7水和物、0.2%リン酸2水素カリウム、1.5%無水炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に種母培養液を1%（v/v）植菌し、30℃で3日間振盪培養を行った。
得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た後に、2mM塩化カルシウムを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−トヨパール（東ソー）カラムにかけ、非吸着画分を回収することにより、ほぼ均一なプロテアーゼを得た。タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。
【００４７】
終濃度50mM トリス塩酸緩衝液(pH8)、終濃度5% LAS、終濃度0.05% 塩化カルシウムを含有する水溶液に、得られたプロテアーゼを500μgタンパク質量加え、計1mlとし安定性評価用サンプルとした。調製した安定性評価用サンプルをただちに適宜希釈した後、プロテアーゼ活性を測定し、初発の活性とした。
安定性評価用サンプルを30℃にて保持した後、経時的にプロテアーゼ活性を測定し、初発の活性に対する保存後の活性の割合を残存活性（%）とした。
野生型酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清のLAS耐性値と比較することにより、変異プロテアーゼのLAS耐性を評価した（表１、表２）。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体はLAS耐性を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDS-PAGEにより認められる分子量が43,000±2,000であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００５１】
＜プロテアーゼ活性測定法＞
100mM AAPL（タンパク研究所;Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNAジメチルスルホキシドに溶解:終濃度3mMとして使用）及び200mM ホウ酸緩衝液（pH10.5:終濃度50mMとして使用）及び適宜希釈した安定性評価用サンプル50μlを加え、100μlに調製後、マイクロプレートリーダー（Versa Max:Molecular Devices社製）にて30℃、15分間振盪しながら414nmの吸光度を経時的に測定し、単位時間当たりの吸光度の変化（OD414/min）を求めた。得られた傾きに酵素の希釈率を乗じた値をプロテアーゼの力価とした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することであるが、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（特許文献１参照）。斯かるアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１）。
【０００５】
ところで、洗浄剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は粉末洗剤に比べて、溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットがある。液体洗剤には粉末洗剤には無い上記のような利点があるが、その反面プロテアーゼなどの酵素の安定的な配合に関しては粉末洗剤には無い技術的な困難さがあることが広く知られている。元来、液体中で常温保存すること自体が、タンパク質の変性を招きやすい上に、液体洗剤には界面活性剤、脂肪酸、溶剤等が含有され、pHも弱アルカリ性であり、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。また、プロテアーゼはタンパク質分解酵素であるが故に自己消化の問題も有しており、液体洗剤中での安定保存を更に困難なものにしている。
【０００６】
このような技術的な課題に対して、カルシウムイオン、ホウ砂、ホウ酸、ホウ素化合物、ギ酸などのカルボン酸、ポリオール等の酵素安定化剤を加えることは公知である。また、プロテアーゼの活性を阻害することにより、自己消化の問題を解決すべく検討もなされており、４−置換フェニルボロン酸（特許文献２）や、ある種のペプチドアルデヒド及びホウ素組成物（特許文献３）によるプロテアーゼの可逆的阻害による安定化法が報告されている。また、デキストランで化学修飾したプロテアーゼが、界面活性剤を含む水溶液中での安定性を向上させ得ることが報告されている（非特許文献２）。
【０００７】
しかし、カルシウムイオン、ホウ酸などの酵素安定化剤の添加によってもプロテアーゼの安定性は十分ではなく、阻害剤も酵素種によって阻害効率が異なる上に製造コストを考慮すると液体洗剤組成物として課題を解決する方法とは言い難い。同様に酵素の化学修飾も製造コストの面で難があった。酵素安定化剤、阻害剤、化学修飾など種々の方策が検討されてきているが、コスト的にはプロテアーゼ自身の液体洗剤中での安定性を向上させることが最も望ましい。
【０００８】
一般的な液体洗剤組成としては界面活性剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、溶剤、香料、蛍光染料などが挙げられるが、最も酵素の安定性を損なう物質は界面活性剤であり、通常陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤から成る場合が多い。非イオン界面活性剤は概して酵素に対しての傷害性は大きくはないが、陰イオン界面活性剤は疎水部分が酵素に侵入し、酵素の疎水性相互作用を破壊することに加え、酵素を安定化しているカルシウムイオンなどの２価金属を補足するために酵素への傷害性は非常に高いと考えられている（非特許文献３）。
【０００９】
従って、陰イオン界面活性剤に対しての耐性を向上させることは、液体洗剤中での安定性を向上させる上で非常に重要な因子となっている。
【特許文献１】国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【特許文献２】特表平１１−５０７６８０号公報
【特許文献３】特表２０００−５０６９３３号公報
【非特許文献１】Saekiら, Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 313-319, 2000
【非特許文献２】Cosmetics&Toiletries magazine, 111, p79-88, 1996
【非特許文献３】Detergent Enzyme : A Challenge! In Handbook of Detergents part A, New York, p639-690, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、液体洗剤中での安定性が向上したアルカリプロテアーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼＫＰ４３に特徴的なアミノ酸残基のうち、ある特定のアミノ酸残基の置換により、代表的な陰イオン界面活性剤であるＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム）の安定性が向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
２）上記アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
３）上記遺伝子を含有する組換えベクター。
４）上記組換えベクターを含有する形質転換体。
５）上記アルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＬＡＳ等の陰イオン界面活性剤を配合した液体洗剤中でも活性を有し、かつ比活性が高く、洗浄剤配合用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼを意味するが、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１５】
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、例えば、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる（国際公開第９９／１８２１８号パンフレット）。
【００１６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと同等の機能を有するものが挙げられる。
斯かるアルカリプロテアーゼとしては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと同等の機能を有するものが包含される。
具体的には、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０[バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０３]、プロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕や、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００３−１２５７８３号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−０５７１９５号公報に記載の変異プロテアーゼ、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位をセリンに置換した変異体、８９位をヒスチジンに置換した変異体、１２０位をアルギニンに置換した変異体、６３位及び１８７位をセリンに置換した変異体、２２６位をチロシンに置換した変異体、２９６位をバリンに置換した変異体、３０４位をセリンに置換した変異体（特開２００４-３０５１７５号公報）、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５位をヒスチジンに置換した変異体、１６位をスレオニン又はグルタミンに置換した変異体、１６６位をグリシンに置換した変異体、１６７位をバリンに置換した変異体、３４６位をアルギニンに置換した変異体、４０５位をアスパラギン酸に置換した変異体（特開２００４-３０５１７６号公報）、などが挙げられる。
このうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが有する次の何れかの酵素学的性質を有するのが好ましい。１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中（２０mMグリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存性を示す。３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害される。４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。
【００１７】
なお、アミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００１８】
従って、本発明のアルカリプロテアーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位のアミノ酸残基（アラニン残基）が、システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基に置換されたもの、１９５位のアミノ酸残基（チロシン残基）がロイシン又はイソロイシン残基に置換されたもの、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位に相当する位置のアミノ酸残基がシステイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基に置換されたもの、１９５位に相当する位置のアミノ酸残基がロイシン又はイソロイシン残基に置換されたものが包含される。
尚、１３３位又はこれに相当する位置、１９５位又はこれに相当する位置のアミノ酸置換は、何れか一方でも双方を同時に行っても良い。
【００１９】
ここで、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行なうことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２０】
すなわち、上記方法でアミノ酸配列を整列させ、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位のアミノ酸残基（アラニン残基）に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては１３３位のアラニン残基、プロテアーゼＫＰ９８６５においては１３３位のアラニン残基というように特定することができる。また同様に、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９５位のアミノ酸残基（チロシン残基）に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０においては１９５位のチロシン残基、プロテアーゼＫＰ９８６５においては１９５位のチロシン残基というように特定することができる。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとして示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。
【００２２】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号１）に対して変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えば国際公開第９９／１８２１８号パンフレット、国際公開第９８／５６９２７号パンフレット記載の方法に従って行なえばよい。
【００２３】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(タカラ)等を用いて行なうことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２４】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００２５】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、親アルカリプロテアーゼに比べ、陰イオン界面活性剤等を配合した液体洗剤中でも活性を有し、かつ比活性が高いという性質を新に獲得したものである。
従って、本発明のアルカリプロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
【００２６】
洗浄剤組成物中への本発明品プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５０００ＰＵが配合できるが、経済性等を考慮し、５００ＰＵ以下が好ましい。
【００２７】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明品プロテアーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、プロペラーゼ、プラフェクト（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル、ステインザイム（登録商標；ノボザイムズ社）、プラスター（登録商標；ジェネンコア社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ、ライペックス（登録商標；ノボザイムズ社）が挙げられる。
【００２８】
洗浄剤組成物中で本発明品プロテアーゼ以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜５００ＰＵが好ましい。セルラーゼを併用する場合は、特開平１０−３１３８５９号公報の段落〔００２０〕に記載の酵素活性測定方法より決定される単位（ＫＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり３００〜３００００００ＫＵが好ましい。
【００２９】
またアミラーゼを併用する場合は、特開平１１−４３６９０号公報の段落〔００４０〕記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位（ＩＵ）に基づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５０〜５０００００ＩＵが好ましい。
【００３０】
さらにリパーゼを併用する場合は、特表平８−５０００１３号公報の実施例１記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位（ＬＵ）づき、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１００００〜１００００００ＬＵが好ましい。
【００３１】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００３２】
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０質量％配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。
【００３３】
本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００３４】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３６】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００３７】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【００３８】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００３９】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００４０】
（６）蛍光剤
本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００４１】
（７）その他の成分
本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４２】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明品プロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
【００４３】
斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
実施例１
バチルス エスピー KSM-KP43株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約2.0kb（配列番号１）に対して成熟酵素領域の（１）195位、（２）133位に部位特異的変異を導入するプライマーをそれぞれデザインした。
（１）195位にロイシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）とプライマー２（配列番号４）を、
195位にイソロイシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー３（配列番号５）及びプライマー５（配列番号７）とプライマー２（配列番号４）を、
（２）133位にシステインを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー７（配列番号９）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にグリシンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー８（配列番号１０）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にアスパラギン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー９（配列番号１１）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にグルタミン酸を導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー１０（配列番号１２）とプライマー２（配列番号４）を、
133位にプロリンを導入するにはプライマー１（配列番号３）とプライマー６（配列番号８）及びプライマー１１（配列番号１３）とプライマー２（配列番号４）を、
それぞれ用いPCRを行った。
【００４５】
プライマー１にはセンス鎖の5’末端側にBamHIリンカーを、プライマー２にはアンチセンス鎖の5’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー３とプライマー４及びプライマー５、更にプライマー６とプライマー７、プライマー８、プライマー９、プライマー１０及びプライマー１１はそれぞれの５’末端から10〜15bpの長さで互いに相補するようにデザインした。PCRのDNAポリメラーゼとして、Pyrobest (タカラ)を用い、PCRの条件は94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をPCR product purification kit（ロッシュ）にて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、94℃で2分間DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、リコンビナントPCRを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー１とプライマー４によりPCRを行なった。94℃で2分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaI（ロッシュ）により切断した。増幅DNA断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドpHA64（特許第349293号：プロモーター64の下流にBamHI、XbaI切断部位を有する）と混合した後、Ligation High（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルス エスピー KSM9865株（FERM P-18566）を形質転換した。
【００４６】
9865株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地[スキムミルク(ディフコ)1%（w/v）、バクトトリプトン(ディフコ)1%、酵母エキス（ディフコ）0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天1.5%、炭酸ナトリウム0.05%、テトラサイクリン15ppm]に生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、5mlの種母培地[6.0%（w/v）ポリペプトンS、0.05%酵母エキス、1.0%マルトース、0.02%硫酸マグネシウム7水和物、0.1%リン酸2水素カリウム、0.25%炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に植菌し、30℃で16時間振盪培養を行った。次いで30mlの主培地[8%ポリペプトンS、0.3%酵母エキス、10%マルトース、0.04%硫酸マグネシウム7水和物、0.2%リン酸2水素カリウム、1.5%無水炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリン]に種母培養液を1%（v/v）植菌し、30℃で3日間振盪培養を行った。
得られた培養液を遠心分離し、培養上清を得た後に、2mM塩化カルシウムを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−トヨパール（東ソー）カラムにかけ、非吸着画分を回収することにより、ほぼ均一なプロテアーゼを得た。タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。
【００４７】
終濃度50mM トリス塩酸緩衝液(pH8)、終濃度5% LAS、終濃度0.05% 塩化カルシウムを含有する水溶液に、得られたプロテアーゼを500μgタンパク質量加え、計1mlとし安定性評価用サンプルとした。調製した安定性評価用サンプルをただちに適宜希釈した後、プロテアーゼ活性を測定し、初発の活性とした。
安定性評価用サンプルを30℃にて保持した後、経時的にプロテアーゼ活性を測定し、初発の活性に対する保存後の活性の割合を残存活性（%）とした。
野生型酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清のLAS耐性値と比較することにより、変異プロテアーゼのLAS耐性を評価した（表１、表２）。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体はLAS耐性を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDS-PAGEにより認められる分子量が43,000±2,000であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００５１】
＜プロテアーゼ活性測定法＞
100mM AAPL（タンパク研究所;Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNAジメチルスルホキシドに溶解:終濃度3mMとして使用）及び200mM ホウ酸緩衝液（pH10.5:終濃度50mMとして使用）及び適宜希釈した安定性評価用サンプル50μlを加え、100μlに調製後、マイクロプレートリーダー（Versa Max:Molecular Devices社製）にて30℃、15分間振盪しながら414nmの吸光度を経時的に測定し、単位時間当たりの吸光度の変化（OD414/min）を求めた。得られた傾きに酵素の希釈率を乗じた値をプロテアーゼの力価とした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の（ａ）１３３位、及び／又は（ｂ）１９５位のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換された請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【請求項３】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）１３３位若しくはこれに相当する位置、及び／又は（ｂ）１９５位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されたアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の（ａ）１３３位、及び／又は（ｂ）１９５位のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換された請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。
（ａ）位置：システイン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン残基
（ｂ）位置：ロイシン又はイソロイシン残基
【請求項３】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【公開番号】特開２００９−３４０６２（Ｐ２００９−３４０６２Ａ）
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０２９３８（Ｐ２００７−２０２９３８）
【出願日】平成１９年８月３日（２００７．８．３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３日（２００７．８．３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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