アルギンオリゴ糖及びその誘導体、並びにそれらの調製と用途
本発明は重合度が２〜２２のアルギンオリゴ糖及びその誘導体を提供し、上記アルギンオリゴ糖はβ−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により形成されている。それを酸化分解させることにより、還元末端１位がカルボキシル基である誘導体が得られる。本発明はさらにアルギンオリゴ糖及びその誘導体の調製方法を提供している。この方法は、アルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度約１００〜１２０℃の条件で約２〜６時間反応させる工程；反応終了後、ｐＨ値を７に調節する工程を含む。得られたオリゴ糖を酸化剤によって酸化分解して酸化分解生成物を得る。本発明のアルギンオリゴ糖及びその誘導体は、老年性痴呆症と糖尿病の予防／治療薬物用製薬に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギンオリゴ糖及びその誘導体、並びにそれらの調製と老年性痴呆、糖尿病の治療での応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
老年性痴呆と糖尿病は、現在人類の健康に深刻な危害を加える多発病であり、よくある病気であり、特に世界の老年人数の日々増加に伴って、その発病率は年々高くなり、老年性痴呆と糖尿病の予防と治療はますます重要になっている。
【０００３】
現在、老年性痴呆の予防と治療の薬物として、中枢興奮剤、コリン機能を改善できる物質、脳の血液循環改善剤、漢方薬とピロリドン類化合物などがある。しかし、その多くが治療効果があまりなく、特異性が強くない、あるいは副作用が大きく、内服時吸収がよくない、血液脳関門を通しにくい、特に応急処置するだけで根本的な治療にならないという様々な問題点があるため、それらの普及及び応用が制限されている。臨床常用の糖尿病予防と治療の薬物としては、主にインシュリンと内服の糖分を減らす薬物があり、多くが使用性が低い上、副作用が大きいなどの欠点が存在している。特にＩＩ型の糖尿病の治療で使える有効な薬物が非常に不足しているのが現実である。研究によって、老年性痴呆及びＩＩ型糖尿病の発病過程は、類でんぷんタンパク（β−ａｍｙｌｏｉｄ、以下Ａβ、およびａｍｙｌｉｎと称する）が堆積して形成する神経原線維濃縮体及びその誘発する自由基酸化損失と関係する。そのため、アミロイド線維の形成と毒性を拮抗することは老年性痴呆とＩＩ型の糖尿病の予防と治療の有効な方法である。
【０００４】
アルギンは褐藻植物細胞壁の主要な構成成分であり、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸が１，４グリコシド結合で結合して形成した直鎖状アニオン性多糖である。アルギンは高分子化合物で、分子量が比較的に大きく、普通は数万〜数百万ドルトンである。アルギンは豊富に存在しており、すでに食品、化学、医薬などに幅広く利用されている。最近の研究では、アルギンが多様な生理活性を有していることが明らかになったが、分子量がわりに大きいため、その薬物での応用がある程度制限されている。従って、各種の分解方法により調製されたアルギンオリゴ糖は、糖化学、糖生物学、糖産業と糖類薬物研究などの分野において重要な研究価値を持っている。多糖類の分解方法としては、様々で、例えば酵素分解法、化学分解法と物理分解法がある。酵素分解法はアルギン特異性の酵素を必要とするため、その応用には制限がある。物理分解法は、通常ほかの分解方法と一緒に使い、分解生成物の極限の分子量は５０，０００Ｄａ付近であるため、オリゴ糖をつくりにくい。糖分解に使用する化学分解法として、主には酸加水分解法と酸化分解法があるが、酸分解法は、通常、常温常圧で行うため、分子量４０００以下のオリゴ糖を獲得しにくく、その応用は制限されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、上記の情況に鑑みて鋭意研究を行った結果、高温高圧条件で酸加水分解を行うことによって、分子量４０００以下のアルギンオリゴ糖を獲得できることを見出し、さらに酸化剤存在条件で還元末端１位がカルボキシル基である誘導体を調製し、本発明の完成に至った。
【０００６】
つまり、本発明は、１種類の低分子量アルギンオリゴ糖及びその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類、並びにこれら化合物の調製方法を提供することを目的としている。さらに、本発明は、上記の低分子量アルギンオリゴ糖及びその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類を含有する老年性痴呆症と糖尿病の予防治療用薬物を提供することを目的としている。
【０００７】
本発明は、下記構造式（Ｉ）に示されるアルギンオリゴ糖及びその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類に関しており、上記アルギンオリゴ糖は、β−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により連結されてなる。
【化１】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【０００８】
本発明中、上記アルギンオリゴ糖誘導体の一例は、下記の構造式（ＩＩ）で示される化合物であり、その還元末端１位はカルボキシル基である。
【化２】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【０００９】
上記の式（Ｉ）と（ＩＩ）において、ｎ＝２〜１０であることが好ましく、ｎ＝４〜８であることがさらに好ましい。４糖から１２糖（より好ましくは６糖から１０糖）の生理効果が比較的に高い原因はまだ不明であるが、それらが機体細胞に識別及び受け入れやすいからであると考えられる。
【００１０】
また、上記アルギンオリゴ糖誘導体として、例えば、β−Ｄ−マンヌロン酸の一部水酸基が硫酸エステル化された誘導体が挙げられる。
【００１１】
上記アルギンオリゴ糖及びその誘導体の製薬学的に許容される塩類として、これら化合物のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。その中、ナトリウム塩が特に好ましい。上記製薬学的に許容される塩類は通常の方法で得ることができる。
【００１２】
また、本発明は、アルギナート水溶液を高圧釜の中で、ｐＨ２〜６、反応温度約１００〜１２０℃の条件で約２〜６時間反応させ、反応終了後、ｐＨ値を７に調節することを特徴とする上記アルギンオリゴ糖及びその誘導体の調製方法に関する。その酸化分解生成物はアルギンオリゴ糖溶液に酸化剤を添加し、反応させて得られたものである。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態では、０．５〜５％のアルギン酸ナトリウム水溶液を、高圧釜の中で、ｐＨ４、反応温度１１０℃の条件で４時間加熱し、反応させた。反応終了後、反応液を吸いとり、自然冷却して、ＮａＯＨ溶液でｐＨ値を７に調節した。攪拌しながら濾液をゆっくりと濾液体積の４倍の工業用アルコールに入れ、一晩放置した。アルコール沈殿物質を吸引ろ過により乾燥させ、無水エタノールで洗浄し、脱水して得られた白い濾過ケークをオーブン中にて６０℃で乾燥してアルギンオリゴ糖の粗製物を得た。アルギンオリゴ糖の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液に調製して、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩処理を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を合一し、減圧濃縮と脱塩の後、さらに冷凍乾燥によって得た。
【００１４】
構造式（ＩＩ）に示される誘導体の調製方法は、上記のアルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度１００〜１２０℃の条件で２〜６時間反応させた後、更に酸化剤を添加し、反応温度１００〜１２０℃の条件で１５分〜２時間反応させる。一実施形態では、５０ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液に２５ｍｌの５％硫酸銅溶液を添加し、すぐ均一に混合し、そして直ちに５％のアルギンオリゴ糖溶液４０ｍｌを添加し、沸騰水浴中で、れんがの赤色のような沈殿がそれ以上発生しない頃まで加熱した。遠心分離により、沈殿物を取り除き、少量の上清液を取って上記の割合で５％の硫酸銅溶液と１０％水酸化ナトリウム溶液に添加し、れんがの赤色の沈殿が発生するかを検査した。発生しなかった場合、上清液に４倍体積の９５％エタノールを添加して一晩放置沈殿させ、沈殿物を吸引ろ過の後、乾燥させ、さらに無水エタノールで繰り返し脱水してから、オーブン中、６０℃で乾燥させた。上記の構造式（Ｉ）で示されるアルギンオリゴ糖の調製と同じ分離方法で分離する。
【００１５】
また、本発明は、有効な量の上記アルギンオリゴ糖またはその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類と製薬学的に許容されるキャリアーを含む１種類の薬学用組成物を提供する。
【００１６】
上記の薬学用組成物は老年性痴呆病の予防と治療の薬物であってもよい。
【００１７】
それ以外に、上記の組成物は、β−アミロイド線維形成阻害剤およびアミロイド線維破砕促進剤であってもよい。
【００１８】
上記の薬学用組成物は、更に糖尿病の予防と治療の薬物であってもよい。
【００１９】
また、上述の薬学用組成物は、膵島アミロイド線維形成阻害剤、膵島アミロイドポリペプチド阻害剤として使用することができる。本発明のアルギンオリゴ糖を用いて、老年性痴呆病と糖尿病の予防と治療用薬物を作り出すことは、老年性痴呆病と糖尿病の予防と治療に効果的な薬物が欠乏している現状の解決に非常に重要な意義を持つといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（１）アルギンオリゴ糖の調製
アルギン酸ナトリウムの塩（重量平均分子量８，２３５Ｄａ、中国海洋大学蘭太薬業有限公司提供）を１ｇ取り、蒸留水を添加して１％溶液にし、塩酸でｐＨ値を４に調節して、高圧釜の中、１１０℃で４時間加熱した。取り出して冷却した後に、ｐＨ値をＮａＯＨ溶液で７に調節し、攪拌しながら濾液をゆっくりと濾液体積の４倍の工業用アルコールに入れ、一晩放置した。アルコール沈殿物質を吸引ろ過により乾燥させ、無水エタノールで洗浄、脱水して得られた白い濾過ケークをオーブン中、６０℃で乾燥してアルギンオリゴ糖の粗製物を得た。
【００２１】
アルギンオリゴ糖の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液にして、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩処理を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を収集して、減圧濃縮とＧ−１０カラムによる脱塩を行い、ゲル粒子外部の体積成分をさらにＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ１０ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で分離させ、冷凍乾燥によって系列のアルギンオリゴ糖を得た。
【００２２】
（２）アルギンオリゴ糖の酸化分解生成物の調製
５ｇの上記調製のアルギンオリゴ糖を５％の溶液に調製した。５０ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液に２５ｍｌの５％硫酸銅溶液を添加し、すぐ均一に混合し、そして直ちに５％のアルギンオリゴ糖溶液４０ｍｌを添加し、沸騰水浴中で、れんがの赤色の沈殿がそれ以上発生しなくなるまで加熱した。遠心分離により、沈殿物を取り除き、少量の上清液を取って上記の割合で５％の硫酸銅溶液と１０％水酸化ナトリウム溶液に添加し、れんが赤色の沈殿が発生するかを検査した。発生しなかった場合、上清液に４倍体積の９５％エタノールを添加して一晩放置沈殿させ、沈殿物を吸引ろ過で乾燥させ、さらに無水エタノールで繰り返し脱水してからオーブン中、６０℃で乾燥させることによってアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の粗製物を得た。
【００２３】
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液にして、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を収集して、減圧濃縮とＧ−１０カラムによる脱塩を行い、ゲル粒子外部の体積成分をさらにＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ１０ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で分離させ、凍結乾燥によって系列のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物を得た（図２）。
【００２４】
（３）アルギンオリゴ糖の構造決定
上記のアルギンオリゴ糖調製中得られた画分が含有するアルギンオリゴ糖に対し、構造決定を行った。その結果、このシリーズのアルギンオリゴ糖はβ−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により結合されたアルギンオリゴ糖であることが確認された。その構造式は以下である。
【化３】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【００２５】
次に溶出液の第２９２ｍＬ前後画分（図１中の“６”で表された画分、以下、組成成分６という）を例として、上記アルギンオリゴ糖の構造解析を説明する。
【００２６】
１．紫外吸収スペクトル
上記溶出液の第２９２ｍＬ前後画分に含まれるアルギンオリゴ糖を適当な濃度まで希釈し、ＵＶ−２１０２紫外−可視分光光度計を用いて、１９０ｎｍ〜４００ｎｍの間でスキャンした結果、当該画分が紫外群に特異的な吸収ピークがないことが確認された。このことは構造中に共役二重結合が存在しないことを示している。しかし、１９０〜２００ｎｍ付近に非特異的な吸収が存在しているため、脱塩を行う時、当該群域の紫外光で分析することができる。
【００２７】
２．赤外スペクトル
０．５ｍｇ上記画分のオリゴ糖を取り、ＫＢｒで製錠し、ＮＥＸＵＳ−４７０型赤外分光計によって赤外線スペクトル測定を行った。その結果、３４２０．７９、３２１４．６４、２９２４．６１ｃｍ−１に水酸基の対称伸縮振動、また１６００．２５ｃｍ−１にカルボキシル酸塩のカルボニル基による対称的な伸縮振動がそれぞれ確認され、１４０６．５４ｃｍ−１に水酸基の変角振動、１１４６．４２ｃｍ−１にカルボキシル基の炭素酸素結合の対称伸縮振動、１０４５．７７ｃｍ−１にアンヒドロエーテルの逆対称伸縮振動、８０４．０２ｃｍ−１にマンヌロン酸の環状骨格の逆対称伸縮振動が確認された。この化合物が、カルボキシル基、水酸基とマンヌロン酸の環状骨格を含有する構造を有していることを表している。
【００２８】
３．質量スペクトル分析
質量スペクトル分析に用いたのはＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＢＩＦＬＥＸ ＩＩ型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計であり、質量スペクトル図（図２、そのデータは表１に示している）で示しているように、ｍ／ｚ：１０７３．９のピークは分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：１０９６．６のピークは［Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−１、ｍ／ｚ：１０２８．０のピークは［Ｍ−Ｈ２Ｏ−ＣＯ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：８２１．２のピークは［Ｍ−ＭａｎＡ−ＣＨ２Ｏ−２Ｈ２Ｏ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：７０４．３のピークは［Ｍ−２ＭａｎＡ−Ｈ２Ｏ−Ｈ］−１で、ｍ／ｚ：６３４．４のピークは［Ｍ−２ＭａｎＡ−２（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ−Ｈ］−１で、ｍ／ｚ：５３６．５のピークは［Ｍ−２Ｈ］２−、ｍ／ｚ：３５７．４のピークは［Ｍ−３Ｈ］３−である。上記画分が含有するオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳにおける分子イオンピークはｍ／ｚ：１０７３．９であるため、その分子量が１０７４であることが示唆された。
【００２９】
【表１】
【００３０】
４．アルギンオリゴ糖のＮＭＲスペクトル測定
式（Ｉ）で示されるアルギンオリゴ糖（ｎ＝４）を取り、ＪＮＭ−ＥＣＰ６００型ＮＭＲ分析計を用いてＮＭＲスペクトル測定を行った。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲの結果を表２と表３に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
以上の測定結果により、上記画分が含有するアルギンオリゴ糖はマンヌロン酸６糖であることが確定でき、下記の化学構造式（Ｉａ）の通りである。
【化４】
【００３４】
５．アルギンオリゴ糖サンプル中のマンヌロン酸含有量の測定（１Ｈ−ＮＭＲ法）
高解像度の１Ｈ−ＮＭＲを用いて、アルギンオリゴ糖の組成成分を分析した。アノマー炭素のシグナルの強度によって、アルギンオリゴ糖サンプル中のマンヌロン酸とグルロン酸の比率（Ｍ／Ｇ）を定量分析した。乾燥させたサンプルを３〜５ｍｇ取り、中性のｐＤの条件でＤ２Ｏに溶解させ、０．３ｍｇ ＥＤＴＡを添加して、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ−３００型ＮＭＲ分析計で測定した。スペクトルは７０℃で記録され、Ｄ２Ｏのピークが異なるプロトン共振群から遠く離れるようにした。シグナル相対強度をピーク面積積分値で表示する。その結果、Ｍ残基のＨ−１シグナルは４．６４ｐｐｍと４．６６ｐｐｍ（それぞれＭＭ、ＭＧ、配列中のＭ残基のＨ−１シグナル）。Ｇ残基のＨ−１シグナルは全てが５．０５ｐｐｍのところ（２重ピーク）にあり、サンプルのＭとＧの相対含有量は、両者のＨ−１ピークの強度で表すことができ、公式は次の通りである。
【００３５】
【数１】
【００３６】
その中、Ｉはピークの強度であり、ピーク面積の積分値で表示される。
【００３７】
この方法により測定したアルギンオリゴ糖サンプル中のＤ−マンヌロン酸相対含有量は９８．０７％、アルギンオリゴ糖サンプルが主にマンヌロン酸から形成されたことを示唆した。
【００３８】
（４）アルギンオリゴ糖の酸化分解生成物の構造決定
上記のアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物調製で得られた画分に含有されているアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物に対し構造決定を行った。その結果、この系列のアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物はβ−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により形成されたアルギンオリゴ糖誘導体であることが確認された。その構造式は以下の通りである。
【化５】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【００３９】
次に組成成分６を例にして、上記アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の構造解析を説明する。
【００４０】
１．紫外吸収スペクトル
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物を適量取り、蒸留水で一定の濃度の溶液を調製して、島津製のＵＶ−２６０型紫外分光光度計（１９０ｎｍ〜７００ｎｍ）紫外可視分光光度計で全波長のスキャンを行った。測定により、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物は、紫外と可視光域に特徴の吸収ピークを示さなかった。
【００４１】
２．赤外スペクトル
ＮＩＣＯＬＥ ＮＥＸＵＳ−４７０型赤外分光計によって赤外線スペクトル測定を行った。その結果を表４に示している。
【００４２】
【表４】
【００４３】
３．１Ｈ−ＮＭＲ分析
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕａｎｃｅ ＤＰＸ−３００型ＮＭＲスペクトルメーターを用い、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の水素と炭素のスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、スペクトル図は主にβ−Ｄ−マンヌロン酸の６個の水素原子のシグナルから構成され、各シグナル分裂を帰属した後、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物は主にマンヌロン酸から構成されていることを確認した。もし、還元末端１位がアルデヒド基であれば、Ｈ−１αとβの化学シフトはそれぞれ５．１１と４．８１ｐｐｍである。アルギンオリゴ糖の還元末端１位がアルデヒド基からカルボキシル基に酸化するため、Ｈ−１は消えてしまい、それぞれの５．１１と４．８１ｐｐｍにあるシグナルもなくなる。１３Ｃ−ＮＭＲの結果により、サンプルのスペクトル図は主にβ−Ｄ−マンヌロン酸６個の炭素原子のシグナルから構成され、各シグナル分裂を帰属した後、中間体の分子は主にマンヌロン酸から構成されていることが判った。中間体のスペクトルと比べた結果、マンヌロン酸特有の還元末端Ｃ−１シグナル（９４ｐｐｍ）がなくなっていた。還元末端Ｃ−１のシグナルが低磁場の１７５．８１ｐｐｍにシフトされていた。これはアルギンオリゴ糖の還元末端１位がアルデヒド基からカルボキシル基に酸化したため、そのＣ−１の化学シフトがアルデヒド基の９４ｐｐｍ付近からカルボキシル基の炭素の１７５．８１ｐｐｍに変化したからである。
【００４４】
４．質量スペクトル分析
質量スペクトル分析に用いたのはＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＢＩＦＬＥＸ ＩＩ型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計、結果は図４に示した通りである。図から、ｍ／ｚ：１１１３．７のピークは［Ｍ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１１１３．７のピークは［Ｍ−Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０８３．７のピークは［Ｍ−ＣＨ２Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０６７．６のピークは［Ｍ−ＣＨ２Ｏ−Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０５３．６ピークは［Ｍ−２（ＣＨ２Ｏ）＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：９７９．６のピークは［Ｍ−３（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ２＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：９２１．６のピークは［Ｍ−４（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ２−ＣＯ＋Ｎａ］＋１であることが分かる。アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の質量スペクトル解析を表５に示した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの図におけるｍ／ｚ：１１１３．７のピークが［Ｍ＋Ｎａ］＋１であることは、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の分子量が１０９０．７であることを示唆している。酸分解アルギンオリゴ糖（分子量１０７５）と比べて１６多い、つまり分子中で酸素が１つ多い、従って、アルギンオリゴ糖調製過程で酸化されたと考えられる。
【００４７】
以上の結果から、このアルギンオリゴ糖酸化分解生産物の構造式は式（ＩＩａ）であると判断した。
【化６】
【００４８】
（５）アルギンオリゴ糖の老年性痴呆症（ＡＤ）に対する治療効果の評価
以下の実験に用いるアルギンオリゴ糖はＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム分離後の６糖である。
【００４９】
１．アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０誘発痴呆動物モデル体内に与える影響
１８〜２２ｇのオスのＢａｌｂ／ｃマウス（山東大学実験動物センター提供）を取り、重量測定して６群、即ちコントロール群、モデル群、およびアルギンオリゴ糖投与量が低い、中、高い（１５、３０、６０のｍｇ／ｋｇ）の３つの群、陽性コントロールの０．２ｍｇ／ｋｇ、ＨＢＹ（河南竹林衆生製薬公司予豫中製薬工場が生産）投与群に分けた。動物を群に分けた後、３日目から０．５ｍｌ／２０ｇの量で相応の薬物を与え始め、コントロール群、モデル群には等量の生理食塩水を与え、毎日１回、実験が終わるまで続けた。
【００５０】
薬を与え初めてから８日目、コントロール群以外のすべてのマウスの側脳室内へ、Jhoo JHらのβ-amyloid (1−42)-induced learning and memory deficits in mice:involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. Behavioural Brain Research (2004) 155: 185-196に記載された方法を参照し、Ａβ１−４０を注射し、マウス学習能力機能障害モデルを作った。そしてＭｏｒｒｉｓ水迷路テスト、及びステップスルーテストと脳組織生化指標の測定によって薬剤のマウス学習能力機能に対する影響を評価した。その結果（表６）、モデル群とコントロール群に比べて、ゴール到達時間（潜伏期）は明らかにあるいはきわめて明らかな相違（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）を示し、マウスの側脳室内へのＡβ１−４０注射が成功し、痴呆モデルが得られたことを示唆した。第１日に各処理群中、アルギンオリゴ糖投与量１５ｍｇ／ｋｇの群を除いて、他の群はモデル群より短縮の傾向があって、その中アルギンオリゴ糖投与量６０ｍｇ／ｋｇの群は、モデル群よりゴール到達時間が著しく短縮（Ｐ＜０．０５）した。第２、３日、各薬剤投与群すべてがモデル群よりゴール到達時間が短縮し、その中のアルギンオリゴ糖投与量６０ｍｇ／ｋｇの群とＨＢＹは統計学の有意差（Ｐ＜０．０５）に達した。
【００５１】
【表６】
【００５２】
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路テストの４日目に、ゴール部を取り除いて、動物が６０秒内に元のゴール部のところに滞在する滞留時間比率の測定を行った結果、モデル群は著しくコントロール群より低い（Ｐ＜０．０５）が、アルギンオリゴ糖６０ｍｇ／ｋｇ群の動物の滞留時間は明らかにモデル群より長い（Ｐ＜０．０５）。その結果を表７に示した。
【００５３】
【表７】
【００５４】
Ａβのモデルを作った後の２５日目からステップスルーテストを行った。訓練する時、暗い室へ通る扉を開けて、暗い室内の底部グリルに通電した（３６ｖ）。それぞれ各群の動物を取って、頭部外向けに実験箱の中に入れ、動物の四つの足が暗い室に入った後に触電されるようにした。２４時間後に同じ方法で実験して、マウスが暗い室に入り電気刺激を受けるまでかかる時間（潜伏期）と所定時間内（３ｍｉｎ）に触電を受ける回数（誤った回数）を記録した。
【００５５】
図５、６はステップスルーテストの結果を示した。各群の実験回数は８で、その値は平均数±標準偏差、＃はコントロール群と比べて統計学の差（ｐ＜０．０５）がある、＊はモデル群と比べて統計学の差（ｐ＜０．０５）があることを示している。この結果から、側脳室内へＡβ１−４０注入痴呆モデル群は、モデル群と比較して、マウスの潜伏期は明らかに短縮（Ｐ＜０．０１）し、さらに、誤った回数は明らかに増加（Ｐ＜０．０５）し、側脳室内へＡβ１−４０注入痴呆モデルの作製が成功していることを示している。しかし、３０、６０ｍｇ／ｋｇアルギンオリゴ糖投与群及び陽性のＨＢＹ投与群マウスの潜伏期は明らかに延長し、しかも三つのアルギンオリゴ糖投与群及び陽性薬剤投与群マウスの誤った回数も明らかに減少していた。これはアルギンオリゴ糖がＡβ１−４０動物の学習能力機能障害を明らかに改善する機能を有することを示した。
【００５６】
アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０動物の生化学指標に対する影響
動物を水泳実験が終わった後、頭を切り落としてからすぐに氷上で皮質とヒポキャンパス（海馬）を分離して、液体窒素により１時間急速冷凍した後、−８０℃の冷蔵庫に保存する。実験するとき、皮質とヒポキャンパスそれぞれに生理食塩水で１０％と５％の均一の懸濁液を調製して、３６００回転／分で遠心分離して得た上清液をＭＤＡ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、ＧＳＨ−ＰＸ、Ｎａ＋Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＡｃｈＥとＣＨＡＴ活性測定に供した。ＣＨＡＴは同位元素標識合成法を採用し、そのほかの指標と総タンパクの測定は南京建成生物工程研究所生産の試薬箱で測定した。
【００５７】
（１）コリンアセチル基転移酵素（ＣｈＡＴ）の活性
Ａβモデルの大脳皮質のＣｈＡＴ活性は、コントロール群より著しく低い（Ｐ＜０．０５）。アルギンオリゴ糖とＨＢＹを手術前及び手術後に投与することによって、いずれもＣｈＡＴ活性を上昇させることができる。その中、アルギンオリゴ糖３０、６０ｍｇ／ｋｇとＨＢＹの治療効果は、大脳皮質に明らかな統計学の有意差を有する。結果を表８に示した。
【００５８】
【表８】
【００５９】
（２）活性酸素除去酵素（ＳＯＤ）活性
モデルマウスの脳内ＳＯＤ活性は、コントロール群より低く、その抗酸化活性低下を示唆しているが、まだ統計学の有意差を備えない。６０ｍｇ／ｋｇのアルギンオリゴ糖による予防と治療群の大脳皮質とヒポキャンパスの二つの部位のＳＯＤ活性が著しく上昇し、アルギンオリゴ糖抗痴呆メカニズムは脳の抗酸化活性の上昇と関係していることを示唆した。結果を表９に示した。
【００６０】
【表９】
【００６１】
（３）メチレンジオキシアンフェタミンＭＤＡの含有量
モデル群のマウスの皮質とヒポキャンパスのＭＤＡ含有量はコントロール群と比較して著しい差がない。早期にアルギンオリゴ糖を投与し、治療を続けたマウスの脳内ＭＤＡ含有量は低下していた。３０、６０ｍｇ／ｋｇの群とＨＢＹ群のＭＤＡは著しく低下し、２種類の薬物のいずれも脳内の酸化ダメージとフリーラジカル損害現象を改善できることを示唆し、脳組織を酸化損害から保護することができる。結果を表１０に示した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
４）ＧＳＨ−ＰＸ活性
モデル群マウスの皮質とヒポキャンパス部位のＧＳＨ−ＰＸ活性はコントロール群より低く、その中、ヒポキャンパス部位は著しい差を示した（Ｐ＜０．０５）。アルギンオリゴ糖を与えた後にある程度高くなり、その中、アルギンオリゴ糖６０ｍｇ／ｋｇ群の皮質、ＨＢＹ群のヒポキャンパスの酵素活性はモデルと比較して著しい差を示した（ｐ＜０．０５）。結果を表１１に示した。
【００６４】
【表１１】
【００６５】
５）Ｎａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ活性
モデル群マウスの皮質とヒポキャンパスのＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性は、コントロール群より著しく低く、Ａβが脳内神経細胞のエネルギー代謝に対して顕著な影響を与えていることを示唆した。早期にアルギンオリゴ糖を投与し、治療を続けたマウスの脳内のこの酵素の活性が著しく上昇し、３つの投与量群はいずれも大脳皮質のＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性が著しく上昇し、さらに、高投与量群はヒポキャンパス部位のＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性を顕著に高めることができ、当該治療効果はＨＢＹより強い。よって、脳内のエネルギー代謝のレベルを高めることは、アルギンオリゴ糖が脳の機能を保護し、さらに抗痴呆効果を発揮する一つの手段であると考えられる。結果を表１２に示した。
【００６６】
【表１２】
【００６７】
２．アルギンオリゴ糖の体外におけるＡβ誘発神経細胞損害に対する保護機能
Banker GAらのRat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977, 126:397-425に記載の方法を参照して初代細胞の皮質神経細胞を育成し、培養後１週間から実験を行い始めた。すなわち、８日目に細胞液の交換を行い、細胞中へ最終濃度が０、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖を添加して、３７℃でインキュベートして２４時間育てた後に、老化したＡβ２５−３５（Ａβ２５−３５を滅菌した超純水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍｌにして、３７℃で７日間放置老化して得られた老化Ａβを分けて詰めた後に−２０℃で冷凍保存した）を添加し、最終濃度３０μＭにした後、２４時間育成を続けた。その後、１０μｌ、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを添加し、３７℃で４時間インキュベートしてから上清液を取り除いて、１５０μｌ ＤＭＳＯを添加してマイクロプレートリーダーにて波長５７０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍを測定することによって吸収値を測定した。
【００６８】
その結果、３０μＭの老化Ａβ２５−３５と初代神経細胞を２４時間インキュベートした後に、細胞ＭＴＴの還元が明らかに下がり、細胞生存率は５４．５±８．９％（ｐ＜０．００１）まで下がったが、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖で２４時間前処理することでＡβ２５−３５の細胞に対する毒性損害が明らかに改善でき、しかも薬物の投与量の増加に伴い、このような改善作用はもっと明らかになり、その中、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の作用はもっとも顕著であった（細胞生存率はそれぞれ７２．０±１１．２％、７７．１±８．１％および８２．３±１１．６％）。
【００６９】
アルギンオリゴ糖は、神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対しても初代神経細胞同様の結果を得た。３０μＭの老化Ａβ２５−３５（図７）および２μＭの老化Ａβ１−４０（図８）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と４８時間作用した結果、明らかに細胞の損害を引き起こし、細胞の数が減少し、部分細胞が丸くなって、部分の浮遊状態の細胞が見られ、細胞の生存率はそれぞれ７３．３±９．４％、６４．１±２．５％まで下がった。しかし、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖は、それに対して明らかな抑制作用を持ち、細胞の懸浮が減少し、生存率が増加していた。
【００７０】
以上の実験から、アルギンオリゴ糖は、体内では、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤマウスの逃避潜伏期を顕著に縮短できるとともに、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤマウスの元ゴール部を通過する回数を増加させ、最初に元ゴール部の位置に到達する時間を短縮させ、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤ動物の学習能力に顕著な改善作用がある；同時に、アルギンオリゴ糖は、体外では、Ａβの初代培養と神経細胞に対する損害を低減できる。これは、アルギンオリゴ糖がＡＤに対して一定の予防と治療の作用を持っていることを示唆した。
【００７１】
４）アルギンオリゴ糖の抗ＡＤ作用メカニズムの研究
１．アルギンオリゴ糖のＡβ２５−３５が引き起こすＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の死亡に対する影響
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２×１０５個／穴で６穴プレートに接種し、細胞が解け合った後に０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖を添加して２４時間作用させる。さらに、最終濃度が３０μＭの老化Ａβ２５−３５（Ｓｉｇｍａ社の製品）を添加して４８時間引き続き育成して、消化、細胞収集し、１２００回転で５分遠心分離の後、上清を除去、ｐＨ７．２の燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄、１００ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社の製品）と５μｇ／ｍｌＰＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社の製品）の混合液２００μｌを添加して４℃で３０分インキュベートした。フローサイトメーター（米国ＢＤ社の製品）で測定を行って、すべての試料を８０００細胞ずつ計った。
【００７２】
その結果、３０μＭの老化Ａβ２５−３５でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を４８時間刺激した後、明らかに細胞死亡を引き起こし、死亡率は２４．８±１．９％、しかし、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖で２４時間前処理することによって、Ａβ２５−３５が引き起こした細胞死亡を抑えることができ、死亡率はそれぞれ１０．２±１．３％と５．１±０．７％になった。
【００７３】
アルギンオリゴ糖の抗Ａβ２５−３５が引き起こす神経細胞の死亡作用のメカニズムをさらに検討した結果、アルギンオリゴ糖はＡβ２５−３５が引き起こした神経細胞内の遊離状カルシウムイオン濃度の上昇を顕著に抑えることができ、自由基を生成し、細胞脂質過酸化生成物の含有量を高め、ミトコンドリア膜電位の減少および細胞死促進タンパク質とＣａｓｐａｓｅ−３タンパク活性を上昇させ、さらに死促進阻害タンパクの活性を上昇させた。このことは、アルギンオリゴ糖のＡβ細胞毒性損害に対する拮抗は、その酸化により細胞内の遊離状カルシウムイオン濃度の上昇を抑え、さらに死亡阻害タンパクの活性を上昇させ、ダウンストリーム死促進タンパク質の活性を阻断して、最終的には細胞死亡を抑えることを示唆した。
【００７４】
２．分子レベルにおけるアルギンオリゴ糖の抗Ａβ神経毒性作用メカニズムの検討
（１）アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維形成に対する影響
新しく調製したＡβ１−４０と０、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖をＴＢＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に混合して、３７℃で２４時間インキュベートしてからＴｈ−Ｔを添加して、蛍光分光光度計を用い、λｅｘ＝４５０ｎｍ、λｅｍ＝４８０ｎｍでＴｈ−Ｔ蛍光の強さを測定した。
【００７５】
その結果、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の全てがＡβ１−４０の集中を抑えることができ、中でも１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の抑制作用が最も強かった。その蛍光の強度はそれぞれ１０．４６±０．９４、９．１８±１．３２と７．８１±１．３８（ｐ値はそれぞれ＜０．０５、０．０５と０．００１）。同時に、電子顕微鏡技術を採用してアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維形成に対する影響を観察した。その結果を図９に示した。その結果も同様にアルギンオリゴ糖がＡβ１−４０アミロイド線維形成を顕著に抑えることができることを示していた。同じ方法を用いて実験した結果、アルギンオリゴ糖はヘパリン促Ａβ１−４０アミロイド線維形成にも顕著な抑制作用があることを確認した。結果を図９に示した。図面において、ＡはＡβ１−４０を２４時間インキュベートした結果、ＢはＡβ１−４０とヘパリンを混合して２４時間インキュベートした結果、ＣはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖を２４時間共同インキュベートした結果、ＤはＡβ１−４０とヘパリン及びアルギンオリゴ糖を２４時間共同インキュベートした結果、ＥはＡβ１−４０を４８時間インキュベートした結果、ＦはＢはＡβ１−４０とヘパリンを混合して４８時間インキュベートした結果、ＧはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖を４８時間共同インキュベートした結果、ＨはＡβ１−４０とヘパリン及びアルギンオリゴ糖を４８時間共同インキュベートした結果を示している。
【００７６】
（２）アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維破壊に対する影響
Ａβ１−４０を無菌超純水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製してからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分けて入れ、３７℃で７日間放置し、老化させた。１ｍｇ／ｍｌの老化Ａβ１−４０を取りアルギンオリゴ糖と混合し、３７℃で３日間インキュベートして、試料を２％酢酸ウランでネガティブ染色し、Ａβ１−４０アミロイド線維の形態をＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡で観察した。その結果、Ａβ１−４０が７日間老化した後に互いに交錯、集中して組んでアミロイド線維を形成していたが、アミロイド線維化Ａβ１−４０にアルギンオリゴ糖を添加して３日間インキュベートしたものは、Ａβアミロイド線維量が明らかに減少し、アミロイド線維が断裂、短かくなっていた。その結果を図１０に示した。ＡはＡβ、ＢはヘパリンとＡβ，Ｃはアルギンオリゴ糖とＡβ共同インキュベートしたものである。
【００７７】
（３）アルギンオリゴ糖のＡβ立体構造の変化に対する影響
無菌ＴＢＳ（ｐＨ７．４，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、Ａβ１−４０を２５０μｇ／ｍｌ濃度に調製し、それぞれ３５０μｌ／管でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分け入れ、それぞれに１００μｇ／ｍｌ濃度の無菌アルギンオリゴ糖を添加し、均一に混合後、３７℃で１２時間放置してから、Ｊ−５００Ａ型ＣＤ計（日本ＪＡＳＣＯ社製）で立体構造の変化を分析した。
【００７８】
結果を図１０に示した。ＡはＡβ１−４０、Ｂは老化Ａβ１−４０とヘパリンの混合物、ＣはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖の分析図である。その結果から、Ａβ１−４０は３７℃で１２時間放置しておくと完全にβ−折り畳み構造を取り、アルギンオリゴ糖が、明らかに、Ａβ１−４０がα−螺旋構造からβ−折り畳み構造に変更するのを抑制できることが明らかになった。
【００７９】
（４）アルギンオリゴ糖とＡβの相互作用の検討
ＳＰＲ技術（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）により、２５℃、５μｌ／ｍｉｎの流速でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流過させた（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、３．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．００５％（Ｖ／Ｖ）トゥイーン−２０、ｐＨ７．４）。Ａβ１−４０をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの充填液に調製し、分け詰めた後に３７℃に置く。それぞれ放置してから０、０．５、１、２、４、６日目にＡβ１−４０を取り、それを５段階の濃度倍率に希釈してから、２５℃、５μｌ／ｍｉｎの流速でアルギンオリゴ糖のチップ（注射体積は１０μｌ）を通過しながら、Ａβとアルギンオリゴ糖の結合曲線を記録した。２Ｍ ＮａＣｌを用いてチップを再生する。
【００８０】
その結果、アルギンオリゴ糖と異なる重合度のＡβすべてが結合していて、アルギンオリゴ糖と新鮮なＡβとの結合能力が最も弱く、その結合ＫＤ値は６．８５Ｅ−０７Ｍ、しかし、Ａβの老化時間の延長に伴って、アルギンオリゴ糖とＡβとの結合能力が次第に増加し（ＫＤ値がそれぞれ１．０７Ｅ−０７、９．０６Ｅ−０８、５．４３Ｅ−０８、２．１５Ｅ−０８、１．４５Ｅ−０８Ｍ）、２日間後、増加幅は減少して、概ね安定状態に達した。
【００８１】
さらに検討を行った結果、アルギンオリゴ糖は、Ｈｉｓ１３〜Ｌｙｓ１６によりＡβ全長の分子と相互作用し、Ｓｅｒ２６〜Ｌｙｓ２８によりＡβ２５−３５と結合することがわかった。アルギンオリゴ糖と新鮮なＡβとの結合は、そのＡβ立体構造の変化に対する抑制、さらにアミロイド線維形成に対する抑制の重要な原因であり、アルギンオリゴ糖と老化Ａβとの結合は、そのＡβ１−４０アミロイド線維破壊に対する抑制の重要な原因であることが判った。
【００８２】
以上の検討により、アルギンオリゴ糖は、Ａβ分子との結合によって、Ａβアミロイド線維の形成を抑制し、Ａβ１−４０アミロイド線維破壊を促進して、さらに、Ａβが引き起こす神経細胞のカルシウムイオンの超荷重を抑えて、その自由基の形成を除去し、神経細胞の死亡を抑え、神経細胞を損害から保護し、それによって抗老年性痴呆の作用を発揮することがわかった。
【００８３】
（５）アルギンオリゴ糖の抗糖尿病作用の検討
１．アルギンオリゴ糖の体外におけるアミリン損害膵島β細胞に対する保護作用
ヒト膵島β細胞ＮＩＴ株を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用い、１×１０４個／穴で９６穴アッセイプレートで接種して培養し、細胞混合後、０、１０、５０、１００μｇ／ｍのアルギンオリゴ糖を添加して２４時間作用させる。続いて、最終濃度が３０μＭの老化アミリン（ａｍｙｌｉｎ）（略称ＩＡＰＰ）を添加し、４８時間引き続き培養した後に、ＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。その結果、アルギンオリゴ糖で２４時間前処理することで、ＩＡＰＰの細胞に対する毒性作用を顕著に改善でき、細胞の生存を強化でき、しかも薬物の投与量の増加に伴って、このような改善作用ももっと顕著になっている。結果は図１２に示した通りである。一群ごとの実験回数は６で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃＃はコントロール群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はＩＡＰＰ群と比較して統計学の差（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）があることを表示している。アルギンオリゴ糖は、ＩＡＰＰの膵島β細胞の損害に対する拮抗作用を有することを示唆している。
【００８４】
２．アルギンオリゴ糖の体内におけるストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスモデルに対する影響
体重１８〜２２ｇオスのＮＩＨマウス６０匹を、正常な群、モデル群、アルギンオリゴ糖５０、１５０、４５０ｍｇ／ｋｇ投与群と５ｍｇ／ｋｇグリベンクラミド投与群に分けた。試験当日、正常な群以外の動物に１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔注射した。連続して１０日間相応の薬物を投与して、１１日目に眼球をとって血を取り、血糖濃度を測った。その結果、各薬物投与群マウスの血糖濃度は明らかにモデル群より低い。従って、アルギンオリゴ糖は、ストレプトゾトシンによる糖尿病マウスモデルに対して一定の治療の作用を有することを示唆している（表１３）。
【００８５】
【表１３】
【００８６】
重合度が２〜２２のアルギンオリゴ糖及びその酸化分解生成物或いはその混合物を用いて、体内外における抗老年性痴呆症と抗糖尿病の実験を行ったところ、類似の実験結果が得られた。図１３〜１６はアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＡβ１−４０を脳内注射による痴呆マウスの行為学測定結果を示す。一群ごとの実験回数は８で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃及び＃＃はコントロール群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はモデル群と比較して統計学の相違（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）があることを示している。このことから、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物は痴呆動物の学習能力を顕著に増加できることを示唆している。図１７は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＩＡＡＰ（ａｍｙｌｉｎ）損害膵島β細胞ＮＩＴ株に対する保護作用を測定した結果である。一群ごとの実験回数は６で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃＃はコントロール群と比較した統計学の相違（ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はＩＡＰＰ群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）があることを示している。このことから、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物は糖尿病に顕著な予防／治療の効果を有することを示唆している。
【００８７】
（６）統計学による処理
以上のデータをＳｔａｔｖｉｅｗ統計処理ソフトで分析した。その結果を“平均値±標準偏差”（Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ±ＳＥ）で表し、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較を行った。
【００８８】
上記薬学的な結果により、通常の製剤手段で、有効な量の本発明のアルギンオリゴ糖と製薬学的に許容されるキャリアーとを混合することによって、薬学用組成物を製造できる。上述の薬学用組成物は、膵島アミロイド線維形成阻害剤、膵島アミロイドポリペプチド阻害剤などを含む。本発明のアルギンオリゴ糖は老年性痴呆症と糖尿病の予防／治療薬物の応用に非常に重要な意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、酸分解後のＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラムによる本発明のアルギンオリゴ糖の溶出曲線である。
【図２】図２は、本発明のアルギンオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ図である。
【図３】図３は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラムによる溶出曲線である。
【図４】図４は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ図（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）である。
【図５】図５は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０による学習能力障害マウスの避暗潜伏期を示す図面である。
【図６】図６は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０による学習能力障害のマウスの避暗誤まった回数を示す図面である。
【図７】図７は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ２５−３５損害神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対して保護作用を示す図面である。
【図８】図８は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０損害神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対して保護作用を示す図面である。
【図９】図９は、本発明のアルギンオリゴ糖の正常およびヘパリン促Ａβ１−４０アミロイド線維形成に対する抑制作用を示す図面である。
【図１０】図１０は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維の破壊に対する影響を示す図面である。
【図１１】図１１は、本発明のアルギンオリゴ糖の溶液における２５０μｇ／ｍｌ Ａβ１−４０の立体構造の変化に対する影響を示す図面である。
【図１２】図１２は、本発明のアルギンオリゴ糖のＩＡＡＰが引き起こすＮＩＴ細胞損害に対する保護作用を示す図面である。
【図１３】図１３は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおけるゴール到達時間に対する影響を示す図面である。
【図１４】図１４は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおける水泳距離に対する影響を示す図面である。
【図１５】図１５は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおける初回ゴール部到着時間に対する影響を示す図面である。
【図１６】図１６は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおけるゴール部を通り抜ける回数に対する影響を示す図面である。
【図１７】図１７は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＩＡＡＰが引き起こすＮＩＴ細胞損害に対する保護作用を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギンオリゴ糖及びその誘導体、並びにそれらの調製と老年性痴呆、糖尿病の治療での応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
老年性痴呆と糖尿病は、現在人類の健康に深刻な危害を加える多発病であり、よくある病気であり、特に世界の老年人数の日々増加に伴って、その発病率は年々高くなり、老年性痴呆と糖尿病の予防と治療はますます重要になっている。
【０００３】
現在、老年性痴呆の予防と治療の薬物として、中枢興奮剤、コリン機能を改善できる物質、脳の血液循環改善剤、漢方薬とピロリドン類化合物などがある。しかし、その多くが治療効果があまりなく、特異性が強くない、あるいは副作用が大きく、内服時吸収がよくない、血液脳関門を通しにくい、特に応急処置するだけで根本的な治療にならないという様々な問題点があるため、それらの普及及び応用が制限されている。臨床常用の糖尿病予防と治療の薬物としては、主にインシュリンと内服の糖分を減らす薬物があり、多くが使用性が低い上、副作用が大きいなどの欠点が存在している。特にＩＩ型の糖尿病の治療で使える有効な薬物が非常に不足しているのが現実である。研究によって、老年性痴呆及びＩＩ型糖尿病の発病過程は、類でんぷんタンパク（β−ａｍｙｌｏｉｄ、以下Ａβ、およびａｍｙｌｉｎと称する）が堆積して形成する神経原線維濃縮体及びその誘発する自由基酸化損失と関係する。そのため、アミロイド線維の形成と毒性を拮抗することは老年性痴呆とＩＩ型の糖尿病の予防と治療の有効な方法である。
【０００４】
アルギンは褐藻植物細胞壁の主要な構成成分であり、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸が１，４グリコシド結合で結合して形成した直鎖状アニオン性多糖である。アルギンは高分子化合物で、分子量が比較的に大きく、普通は数万〜数百万ドルトンである。アルギンは豊富に存在しており、すでに食品、化学、医薬などに幅広く利用されている。最近の研究では、アルギンが多様な生理活性を有していることが明らかになったが、分子量がわりに大きいため、その薬物での応用がある程度制限されている。従って、各種の分解方法により調製されたアルギンオリゴ糖は、糖化学、糖生物学、糖産業と糖類薬物研究などの分野において重要な研究価値を持っている。多糖類の分解方法としては、様々で、例えば酵素分解法、化学分解法と物理分解法がある。酵素分解法はアルギン特異性の酵素を必要とするため、その応用には制限がある。物理分解法は、通常ほかの分解方法と一緒に使い、分解生成物の極限の分子量は５０，０００Ｄａ付近であるため、オリゴ糖をつくりにくい。糖分解に使用する化学分解法として、主には酸加水分解法と酸化分解法があるが、酸分解法は、通常、常温常圧で行うため、分子量４０００以下のオリゴ糖を獲得しにくく、その応用は制限されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、上記の情況に鑑みて鋭意研究を行った結果、高温高圧条件で酸加水分解を行うことによって、分子量４０００以下のアルギンオリゴ糖を獲得できることを見出し、さらに酸化剤存在条件で還元末端１位がカルボキシル基である誘導体を調製し、本発明の完成に至った。
【０００６】
つまり、本発明は、１種類の低分子量アルギンオリゴ糖及びその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類、並びにこれら化合物の調製方法を提供することを目的としている。さらに、本発明は、上記の低分子量アルギンオリゴ糖及びその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類を含有する老年性痴呆症と糖尿病の予防治療用薬物を提供することを目的としている。
【０００７】
本発明は、下記構造式（Ｉ）に示されるアルギンオリゴ糖及びその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類に関しており、上記アルギンオリゴ糖は、β−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により連結されてなる。
【化１】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【０００８】
本発明中、上記アルギンオリゴ糖誘導体の一例は、下記の構造式（ＩＩ）で示される化合物であり、その還元末端１位はカルボキシル基である。
【化２】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【０００９】
上記の式（Ｉ）と（ＩＩ）において、ｎ＝２〜１０であることが好ましく、ｎ＝４〜８であることがさらに好ましい。４糖から１２糖（より好ましくは６糖から１０糖）の生理効果が比較的に高い原因はまだ不明であるが、それらが機体細胞に識別及び受け入れやすいからであると考えられる。
【００１０】
また、上記アルギンオリゴ糖誘導体として、例えば、β−Ｄ−マンヌロン酸の一部水酸基が硫酸エステル化された誘導体が挙げられる。
【００１１】
上記アルギンオリゴ糖及びその誘導体の製薬学的に許容される塩類として、これら化合物のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。その中、ナトリウム塩が特に好ましい。上記製薬学的に許容される塩類は通常の方法で得ることができる。
【００１２】
また、本発明は、アルギナート水溶液を高圧釜の中で、ｐＨ２〜６、反応温度約１００〜１２０℃の条件で約２〜６時間反応させ、反応終了後、ｐＨ値を７に調節することを特徴とする上記アルギンオリゴ糖及びその誘導体の調製方法に関する。その酸化分解生成物はアルギンオリゴ糖溶液に酸化剤を添加し、反応させて得られたものである。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態では、０．５〜５％のアルギン酸ナトリウム水溶液を、高圧釜の中で、ｐＨ４、反応温度１１０℃の条件で４時間加熱し、反応させた。反応終了後、反応液を吸いとり、自然冷却して、ＮａＯＨ溶液でｐＨ値を７に調節した。攪拌しながら濾液をゆっくりと濾液体積の４倍の工業用アルコールに入れ、一晩放置した。アルコール沈殿物質を吸引ろ過により乾燥させ、無水エタノールで洗浄し、脱水して得られた白い濾過ケークをオーブン中にて６０℃で乾燥してアルギンオリゴ糖の粗製物を得た。アルギンオリゴ糖の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液に調製して、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩処理を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を合一し、減圧濃縮と脱塩の後、さらに冷凍乾燥によって得た。
【００１４】
構造式（ＩＩ）に示される誘導体の調製方法は、上記のアルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度１００〜１２０℃の条件で２〜６時間反応させた後、更に酸化剤を添加し、反応温度１００〜１２０℃の条件で１５分〜２時間反応させる。一実施形態では、５０ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液に２５ｍｌの５％硫酸銅溶液を添加し、すぐ均一に混合し、そして直ちに５％のアルギンオリゴ糖溶液４０ｍｌを添加し、沸騰水浴中で、れんがの赤色のような沈殿がそれ以上発生しない頃まで加熱した。遠心分離により、沈殿物を取り除き、少量の上清液を取って上記の割合で５％の硫酸銅溶液と１０％水酸化ナトリウム溶液に添加し、れんがの赤色の沈殿が発生するかを検査した。発生しなかった場合、上清液に４倍体積の９５％エタノールを添加して一晩放置沈殿させ、沈殿物を吸引ろ過の後、乾燥させ、さらに無水エタノールで繰り返し脱水してから、オーブン中、６０℃で乾燥させた。上記の構造式（Ｉ）で示されるアルギンオリゴ糖の調製と同じ分離方法で分離する。
【００１５】
また、本発明は、有効な量の上記アルギンオリゴ糖またはその誘導体あるいはそれらの製薬学的に許容される塩類と製薬学的に許容されるキャリアーを含む１種類の薬学用組成物を提供する。
【００１６】
上記の薬学用組成物は老年性痴呆病の予防と治療の薬物であってもよい。
【００１７】
それ以外に、上記の組成物は、β−アミロイド線維形成阻害剤およびアミロイド線維破砕促進剤であってもよい。
【００１８】
上記の薬学用組成物は、更に糖尿病の予防と治療の薬物であってもよい。
【００１９】
また、上述の薬学用組成物は、膵島アミロイド線維形成阻害剤、膵島アミロイドポリペプチド阻害剤として使用することができる。本発明のアルギンオリゴ糖を用いて、老年性痴呆病と糖尿病の予防と治療用薬物を作り出すことは、老年性痴呆病と糖尿病の予防と治療に効果的な薬物が欠乏している現状の解決に非常に重要な意義を持つといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（１）アルギンオリゴ糖の調製
アルギン酸ナトリウムの塩（重量平均分子量８，２３５Ｄａ、中国海洋大学蘭太薬業有限公司提供）を１ｇ取り、蒸留水を添加して１％溶液にし、塩酸でｐＨ値を４に調節して、高圧釜の中、１１０℃で４時間加熱した。取り出して冷却した後に、ｐＨ値をＮａＯＨ溶液で７に調節し、攪拌しながら濾液をゆっくりと濾液体積の４倍の工業用アルコールに入れ、一晩放置した。アルコール沈殿物質を吸引ろ過により乾燥させ、無水エタノールで洗浄、脱水して得られた白い濾過ケークをオーブン中、６０℃で乾燥してアルギンオリゴ糖の粗製物を得た。
【００２１】
アルギンオリゴ糖の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液にして、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩処理を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を収集して、減圧濃縮とＧ−１０カラムによる脱塩を行い、ゲル粒子外部の体積成分をさらにＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ１０ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で分離させ、冷凍乾燥によって系列のアルギンオリゴ糖を得た。
【００２２】
（２）アルギンオリゴ糖の酸化分解生成物の調製
５ｇの上記調製のアルギンオリゴ糖を５％の溶液に調製した。５０ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液に２５ｍｌの５％硫酸銅溶液を添加し、すぐ均一に混合し、そして直ちに５％のアルギンオリゴ糖溶液４０ｍｌを添加し、沸騰水浴中で、れんがの赤色の沈殿がそれ以上発生しなくなるまで加熱した。遠心分離により、沈殿物を取り除き、少量の上清液を取って上記の割合で５％の硫酸銅溶液と１０％水酸化ナトリウム溶液に添加し、れんが赤色の沈殿が発生するかを検査した。発生しなかった場合、上清液に４倍体積の９５％エタノールを添加して一晩放置沈殿させ、沈殿物を吸引ろ過で乾燥させ、さらに無水エタノールで繰り返し脱水してからオーブン中、６０℃で乾燥させることによってアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の粗製物を得た。
【００２３】
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の粗製物を１０％の溶液に調製し、９５％のエタノール溶液で沈殿させ、その沈殿物を無水エタノールで洗浄、乾燥した後、５％の溶液にして、３μｍのフィルターで不純物を濾過除去し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で脱塩を行った。移動相は０．２ｍｏｌ・Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３、各画分を収集して、洗浄液を硫酸−カルバゾール法で分析し、糖含有画分を収集して、減圧濃縮とＧ−１０カラムによる脱塩を行い、ゲル粒子外部の体積成分をさらにＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ１０ゲル濾過カラム（１．６×１８０ｃｍ）で分離させ、凍結乾燥によって系列のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物を得た（図２）。
【００２４】
（３）アルギンオリゴ糖の構造決定
上記のアルギンオリゴ糖調製中得られた画分が含有するアルギンオリゴ糖に対し、構造決定を行った。その結果、このシリーズのアルギンオリゴ糖はβ−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により結合されたアルギンオリゴ糖であることが確認された。その構造式は以下である。
【化３】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【００２５】
次に溶出液の第２９２ｍＬ前後画分（図１中の“６”で表された画分、以下、組成成分６という）を例として、上記アルギンオリゴ糖の構造解析を説明する。
【００２６】
１．紫外吸収スペクトル
上記溶出液の第２９２ｍＬ前後画分に含まれるアルギンオリゴ糖を適当な濃度まで希釈し、ＵＶ−２１０２紫外−可視分光光度計を用いて、１９０ｎｍ〜４００ｎｍの間でスキャンした結果、当該画分が紫外群に特異的な吸収ピークがないことが確認された。このことは構造中に共役二重結合が存在しないことを示している。しかし、１９０〜２００ｎｍ付近に非特異的な吸収が存在しているため、脱塩を行う時、当該群域の紫外光で分析することができる。
【００２７】
２．赤外スペクトル
０．５ｍｇ上記画分のオリゴ糖を取り、ＫＢｒで製錠し、ＮＥＸＵＳ−４７０型赤外分光計によって赤外線スペクトル測定を行った。その結果、３４２０．７９、３２１４．６４、２９２４．６１ｃｍ−１に水酸基の対称伸縮振動、また１６００．２５ｃｍ−１にカルボキシル酸塩のカルボニル基による対称的な伸縮振動がそれぞれ確認され、１４０６．５４ｃｍ−１に水酸基の変角振動、１１４６．４２ｃｍ−１にカルボキシル基の炭素酸素結合の対称伸縮振動、１０４５．７７ｃｍ−１にアンヒドロエーテルの逆対称伸縮振動、８０４．０２ｃｍ−１にマンヌロン酸の環状骨格の逆対称伸縮振動が確認された。この化合物が、カルボキシル基、水酸基とマンヌロン酸の環状骨格を含有する構造を有していることを表している。
【００２８】
３．質量スペクトル分析
質量スペクトル分析に用いたのはＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＢＩＦＬＥＸ ＩＩ型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計であり、質量スペクトル図（図２、そのデータは表１に示している）で示しているように、ｍ／ｚ：１０７３．９のピークは分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：１０９６．６のピークは［Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−１、ｍ／ｚ：１０２８．０のピークは［Ｍ−Ｈ２Ｏ−ＣＯ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：８２１．２のピークは［Ｍ−ＭａｎＡ−ＣＨ２Ｏ−２Ｈ２Ｏ−Ｈ］−１、ｍ／ｚ：７０４．３のピークは［Ｍ−２ＭａｎＡ−Ｈ２Ｏ−Ｈ］−１で、ｍ／ｚ：６３４．４のピークは［Ｍ−２ＭａｎＡ−２（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ−Ｈ］−１で、ｍ／ｚ：５３６．５のピークは［Ｍ−２Ｈ］２−、ｍ／ｚ：３５７．４のピークは［Ｍ−３Ｈ］３−である。上記画分が含有するオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳにおける分子イオンピークはｍ／ｚ：１０７３．９であるため、その分子量が１０７４であることが示唆された。
【００２９】
【表１】
【００３０】
４．アルギンオリゴ糖のＮＭＲスペクトル測定
式（Ｉ）で示されるアルギンオリゴ糖（ｎ＝４）を取り、ＪＮＭ−ＥＣＰ６００型ＮＭＲ分析計を用いてＮＭＲスペクトル測定を行った。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲの結果を表２と表３に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【表３】
【００３３】
以上の測定結果により、上記画分が含有するアルギンオリゴ糖はマンヌロン酸６糖であることが確定でき、下記の化学構造式（Ｉａ）の通りである。
【化４】
【００３４】
５．アルギンオリゴ糖サンプル中のマンヌロン酸含有量の測定（１Ｈ−ＮＭＲ法）
高解像度の１Ｈ−ＮＭＲを用いて、アルギンオリゴ糖の組成成分を分析した。アノマー炭素のシグナルの強度によって、アルギンオリゴ糖サンプル中のマンヌロン酸とグルロン酸の比率（Ｍ／Ｇ）を定量分析した。乾燥させたサンプルを３〜５ｍｇ取り、中性のｐＤの条件でＤ２Ｏに溶解させ、０．３ｍｇ ＥＤＴＡを添加して、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ−３００型ＮＭＲ分析計で測定した。スペクトルは７０℃で記録され、Ｄ２Ｏのピークが異なるプロトン共振群から遠く離れるようにした。シグナル相対強度をピーク面積積分値で表示する。その結果、Ｍ残基のＨ−１シグナルは４．６４ｐｐｍと４．６６ｐｐｍ（それぞれＭＭ、ＭＧ、配列中のＭ残基のＨ−１シグナル）。Ｇ残基のＨ−１シグナルは全てが５．０５ｐｐｍのところ（２重ピーク）にあり、サンプルのＭとＧの相対含有量は、両者のＨ−１ピークの強度で表すことができ、公式は次の通りである。
【００３５】
【数１】
【００３６】
その中、Ｉはピークの強度であり、ピーク面積の積分値で表示される。
【００３７】
この方法により測定したアルギンオリゴ糖サンプル中のＤ−マンヌロン酸相対含有量は９８．０７％、アルギンオリゴ糖サンプルが主にマンヌロン酸から形成されたことを示唆した。
【００３８】
（４）アルギンオリゴ糖の酸化分解生成物の構造決定
上記のアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物調製で得られた画分に含有されているアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物に対し構造決定を行った。その結果、この系列のアルギンオリゴ糖の酸化分解生成物はβ−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により形成されたアルギンオリゴ糖誘導体であることが確認された。その構造式は以下の通りである。
【化５】
式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である。
【００３９】
次に組成成分６を例にして、上記アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の構造解析を説明する。
【００４０】
１．紫外吸収スペクトル
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物を適量取り、蒸留水で一定の濃度の溶液を調製して、島津製のＵＶ−２６０型紫外分光光度計（１９０ｎｍ〜７００ｎｍ）紫外可視分光光度計で全波長のスキャンを行った。測定により、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物は、紫外と可視光域に特徴の吸収ピークを示さなかった。
【００４１】
２．赤外スペクトル
ＮＩＣＯＬＥ ＮＥＸＵＳ−４７０型赤外分光計によって赤外線スペクトル測定を行った。その結果を表４に示している。
【００４２】
【表４】
【００４３】
３．１Ｈ−ＮＭＲ分析
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕａｎｃｅ ＤＰＸ−３００型ＮＭＲスペクトルメーターを用い、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の水素と炭素のスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、スペクトル図は主にβ−Ｄ−マンヌロン酸の６個の水素原子のシグナルから構成され、各シグナル分裂を帰属した後、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物は主にマンヌロン酸から構成されていることを確認した。もし、還元末端１位がアルデヒド基であれば、Ｈ−１αとβの化学シフトはそれぞれ５．１１と４．８１ｐｐｍである。アルギンオリゴ糖の還元末端１位がアルデヒド基からカルボキシル基に酸化するため、Ｈ−１は消えてしまい、それぞれの５．１１と４．８１ｐｐｍにあるシグナルもなくなる。１３Ｃ−ＮＭＲの結果により、サンプルのスペクトル図は主にβ−Ｄ−マンヌロン酸６個の炭素原子のシグナルから構成され、各シグナル分裂を帰属した後、中間体の分子は主にマンヌロン酸から構成されていることが判った。中間体のスペクトルと比べた結果、マンヌロン酸特有の還元末端Ｃ−１シグナル（９４ｐｐｍ）がなくなっていた。還元末端Ｃ−１のシグナルが低磁場の１７５．８１ｐｐｍにシフトされていた。これはアルギンオリゴ糖の還元末端１位がアルデヒド基からカルボキシル基に酸化したため、そのＣ−１の化学シフトがアルデヒド基の９４ｐｐｍ付近からカルボキシル基の炭素の１７５．８１ｐｐｍに変化したからである。
【００４４】
４．質量スペクトル分析
質量スペクトル分析に用いたのはＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＢＩＦＬＥＸ ＩＩ型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計、結果は図４に示した通りである。図から、ｍ／ｚ：１１１３．７のピークは［Ｍ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１１１３．７のピークは［Ｍ−Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０８３．７のピークは［Ｍ−ＣＨ２Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０６７．６のピークは［Ｍ−ＣＨ２Ｏ−Ｏ＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：１０５３．６ピークは［Ｍ−２（ＣＨ２Ｏ）＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：９７９．６のピークは［Ｍ−３（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ２＋Ｎａ］＋１、ｍ／ｚ：９２１．６のピークは［Ｍ−４（ＣＨ２Ｏ）−ＣＯ２−ＣＯ＋Ｎａ］＋１であることが分かる。アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の質量スペクトル解析を表５に示した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの図におけるｍ／ｚ：１１１３．７のピークが［Ｍ＋Ｎａ］＋１であることは、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の分子量が１０９０．７であることを示唆している。酸分解アルギンオリゴ糖（分子量１０７５）と比べて１６多い、つまり分子中で酸素が１つ多い、従って、アルギンオリゴ糖調製過程で酸化されたと考えられる。
【００４７】
以上の結果から、このアルギンオリゴ糖酸化分解生産物の構造式は式（ＩＩａ）であると判断した。
【化６】
【００４８】
（５）アルギンオリゴ糖の老年性痴呆症（ＡＤ）に対する治療効果の評価
以下の実験に用いるアルギンオリゴ糖はＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラム分離後の６糖である。
【００４９】
１．アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０誘発痴呆動物モデル体内に与える影響
１８〜２２ｇのオスのＢａｌｂ／ｃマウス（山東大学実験動物センター提供）を取り、重量測定して６群、即ちコントロール群、モデル群、およびアルギンオリゴ糖投与量が低い、中、高い（１５、３０、６０のｍｇ／ｋｇ）の３つの群、陽性コントロールの０．２ｍｇ／ｋｇ、ＨＢＹ（河南竹林衆生製薬公司予豫中製薬工場が生産）投与群に分けた。動物を群に分けた後、３日目から０．５ｍｌ／２０ｇの量で相応の薬物を与え始め、コントロール群、モデル群には等量の生理食塩水を与え、毎日１回、実験が終わるまで続けた。
【００５０】
薬を与え初めてから８日目、コントロール群以外のすべてのマウスの側脳室内へ、Jhoo JHらのβ-amyloid (1−42)-induced learning and memory deficits in mice:involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. Behavioural Brain Research (2004) 155: 185-196に記載された方法を参照し、Ａβ１−４０を注射し、マウス学習能力機能障害モデルを作った。そしてＭｏｒｒｉｓ水迷路テスト、及びステップスルーテストと脳組織生化指標の測定によって薬剤のマウス学習能力機能に対する影響を評価した。その結果（表６）、モデル群とコントロール群に比べて、ゴール到達時間（潜伏期）は明らかにあるいはきわめて明らかな相違（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）を示し、マウスの側脳室内へのＡβ１−４０注射が成功し、痴呆モデルが得られたことを示唆した。第１日に各処理群中、アルギンオリゴ糖投与量１５ｍｇ／ｋｇの群を除いて、他の群はモデル群より短縮の傾向があって、その中アルギンオリゴ糖投与量６０ｍｇ／ｋｇの群は、モデル群よりゴール到達時間が著しく短縮（Ｐ＜０．０５）した。第２、３日、各薬剤投与群すべてがモデル群よりゴール到達時間が短縮し、その中のアルギンオリゴ糖投与量６０ｍｇ／ｋｇの群とＨＢＹは統計学の有意差（Ｐ＜０．０５）に達した。
【００５１】
【表６】
【００５２】
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路テストの４日目に、ゴール部を取り除いて、動物が６０秒内に元のゴール部のところに滞在する滞留時間比率の測定を行った結果、モデル群は著しくコントロール群より低い（Ｐ＜０．０５）が、アルギンオリゴ糖６０ｍｇ／ｋｇ群の動物の滞留時間は明らかにモデル群より長い（Ｐ＜０．０５）。その結果を表７に示した。
【００５３】
【表７】
【００５４】
Ａβのモデルを作った後の２５日目からステップスルーテストを行った。訓練する時、暗い室へ通る扉を開けて、暗い室内の底部グリルに通電した（３６ｖ）。それぞれ各群の動物を取って、頭部外向けに実験箱の中に入れ、動物の四つの足が暗い室に入った後に触電されるようにした。２４時間後に同じ方法で実験して、マウスが暗い室に入り電気刺激を受けるまでかかる時間（潜伏期）と所定時間内（３ｍｉｎ）に触電を受ける回数（誤った回数）を記録した。
【００５５】
図５、６はステップスルーテストの結果を示した。各群の実験回数は８で、その値は平均数±標準偏差、＃はコントロール群と比べて統計学の差（ｐ＜０．０５）がある、＊はモデル群と比べて統計学の差（ｐ＜０．０５）があることを示している。この結果から、側脳室内へＡβ１−４０注入痴呆モデル群は、モデル群と比較して、マウスの潜伏期は明らかに短縮（Ｐ＜０．０１）し、さらに、誤った回数は明らかに増加（Ｐ＜０．０５）し、側脳室内へＡβ１−４０注入痴呆モデルの作製が成功していることを示している。しかし、３０、６０ｍｇ／ｋｇアルギンオリゴ糖投与群及び陽性のＨＢＹ投与群マウスの潜伏期は明らかに延長し、しかも三つのアルギンオリゴ糖投与群及び陽性薬剤投与群マウスの誤った回数も明らかに減少していた。これはアルギンオリゴ糖がＡβ１−４０動物の学習能力機能障害を明らかに改善する機能を有することを示した。
【００５６】
アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０動物の生化学指標に対する影響
動物を水泳実験が終わった後、頭を切り落としてからすぐに氷上で皮質とヒポキャンパス（海馬）を分離して、液体窒素により１時間急速冷凍した後、−８０℃の冷蔵庫に保存する。実験するとき、皮質とヒポキャンパスそれぞれに生理食塩水で１０％と５％の均一の懸濁液を調製して、３６００回転／分で遠心分離して得た上清液をＭＤＡ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、ＧＳＨ−ＰＸ、Ｎａ＋Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＡｃｈＥとＣＨＡＴ活性測定に供した。ＣＨＡＴは同位元素標識合成法を採用し、そのほかの指標と総タンパクの測定は南京建成生物工程研究所生産の試薬箱で測定した。
【００５７】
（１）コリンアセチル基転移酵素（ＣｈＡＴ）の活性
Ａβモデルの大脳皮質のＣｈＡＴ活性は、コントロール群より著しく低い（Ｐ＜０．０５）。アルギンオリゴ糖とＨＢＹを手術前及び手術後に投与することによって、いずれもＣｈＡＴ活性を上昇させることができる。その中、アルギンオリゴ糖３０、６０ｍｇ／ｋｇとＨＢＹの治療効果は、大脳皮質に明らかな統計学の有意差を有する。結果を表８に示した。
【００５８】
【表８】
【００５９】
（２）活性酸素除去酵素（ＳＯＤ）活性
モデルマウスの脳内ＳＯＤ活性は、コントロール群より低く、その抗酸化活性低下を示唆しているが、まだ統計学の有意差を備えない。６０ｍｇ／ｋｇのアルギンオリゴ糖による予防と治療群の大脳皮質とヒポキャンパスの二つの部位のＳＯＤ活性が著しく上昇し、アルギンオリゴ糖抗痴呆メカニズムは脳の抗酸化活性の上昇と関係していることを示唆した。結果を表９に示した。
【００６０】
【表９】
【００６１】
（３）メチレンジオキシアンフェタミンＭＤＡの含有量
モデル群のマウスの皮質とヒポキャンパスのＭＤＡ含有量はコントロール群と比較して著しい差がない。早期にアルギンオリゴ糖を投与し、治療を続けたマウスの脳内ＭＤＡ含有量は低下していた。３０、６０ｍｇ／ｋｇの群とＨＢＹ群のＭＤＡは著しく低下し、２種類の薬物のいずれも脳内の酸化ダメージとフリーラジカル損害現象を改善できることを示唆し、脳組織を酸化損害から保護することができる。結果を表１０に示した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
４）ＧＳＨ−ＰＸ活性
モデル群マウスの皮質とヒポキャンパス部位のＧＳＨ−ＰＸ活性はコントロール群より低く、その中、ヒポキャンパス部位は著しい差を示した（Ｐ＜０．０５）。アルギンオリゴ糖を与えた後にある程度高くなり、その中、アルギンオリゴ糖６０ｍｇ／ｋｇ群の皮質、ＨＢＹ群のヒポキャンパスの酵素活性はモデルと比較して著しい差を示した（ｐ＜０．０５）。結果を表１１に示した。
【００６４】
【表１１】
【００６５】
５）Ｎａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ活性
モデル群マウスの皮質とヒポキャンパスのＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性は、コントロール群より著しく低く、Ａβが脳内神経細胞のエネルギー代謝に対して顕著な影響を与えていることを示唆した。早期にアルギンオリゴ糖を投与し、治療を続けたマウスの脳内のこの酵素の活性が著しく上昇し、３つの投与量群はいずれも大脳皮質のＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性が著しく上昇し、さらに、高投与量群はヒポキャンパス部位のＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素活性を顕著に高めることができ、当該治療効果はＨＢＹより強い。よって、脳内のエネルギー代謝のレベルを高めることは、アルギンオリゴ糖が脳の機能を保護し、さらに抗痴呆効果を発揮する一つの手段であると考えられる。結果を表１２に示した。
【００６６】
【表１２】
【００６７】
２．アルギンオリゴ糖の体外におけるＡβ誘発神経細胞損害に対する保護機能
Banker GAらのRat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977, 126:397-425に記載の方法を参照して初代細胞の皮質神経細胞を育成し、培養後１週間から実験を行い始めた。すなわち、８日目に細胞液の交換を行い、細胞中へ最終濃度が０、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖を添加して、３７℃でインキュベートして２４時間育てた後に、老化したＡβ２５−３５（Ａβ２５−３５を滅菌した超純水に溶解し、濃度１ｍｇ／ｍｌにして、３７℃で７日間放置老化して得られた老化Ａβを分けて詰めた後に−２０℃で冷凍保存した）を添加し、最終濃度３０μＭにした後、２４時間育成を続けた。その後、１０μｌ、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを添加し、３７℃で４時間インキュベートしてから上清液を取り除いて、１５０μｌ ＤＭＳＯを添加してマイクロプレートリーダーにて波長５７０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍを測定することによって吸収値を測定した。
【００６８】
その結果、３０μＭの老化Ａβ２５−３５と初代神経細胞を２４時間インキュベートした後に、細胞ＭＴＴの還元が明らかに下がり、細胞生存率は５４．５±８．９％（ｐ＜０．００１）まで下がったが、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖で２４時間前処理することでＡβ２５−３５の細胞に対する毒性損害が明らかに改善でき、しかも薬物の投与量の増加に伴い、このような改善作用はもっと明らかになり、その中、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の作用はもっとも顕著であった（細胞生存率はそれぞれ７２．０±１１．２％、７７．１±８．１％および８２．３±１１．６％）。
【００６９】
アルギンオリゴ糖は、神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対しても初代神経細胞同様の結果を得た。３０μＭの老化Ａβ２５−３５（図７）および２μＭの老化Ａβ１−４０（図８）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と４８時間作用した結果、明らかに細胞の損害を引き起こし、細胞の数が減少し、部分細胞が丸くなって、部分の浮遊状態の細胞が見られ、細胞の生存率はそれぞれ７３．３±９．４％、６４．１±２．５％まで下がった。しかし、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖は、それに対して明らかな抑制作用を持ち、細胞の懸浮が減少し、生存率が増加していた。
【００７０】
以上の実験から、アルギンオリゴ糖は、体内では、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤマウスの逃避潜伏期を顕著に縮短できるとともに、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤマウスの元ゴール部を通過する回数を増加させ、最初に元ゴール部の位置に到達する時間を短縮させ、側脳室にＡβ１−４０注入のＡＤ動物の学習能力に顕著な改善作用がある；同時に、アルギンオリゴ糖は、体外では、Ａβの初代培養と神経細胞に対する損害を低減できる。これは、アルギンオリゴ糖がＡＤに対して一定の予防と治療の作用を持っていることを示唆した。
【００７１】
４）アルギンオリゴ糖の抗ＡＤ作用メカニズムの研究
１．アルギンオリゴ糖のＡβ２５−３５が引き起こすＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の死亡に対する影響
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２×１０５個／穴で６穴プレートに接種し、細胞が解け合った後に０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖を添加して２４時間作用させる。さらに、最終濃度が３０μＭの老化Ａβ２５−３５（Ｓｉｇｍａ社の製品）を添加して４８時間引き続き育成して、消化、細胞収集し、１２００回転で５分遠心分離の後、上清を除去、ｐＨ７．２の燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄、１００ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社の製品）と５μｇ／ｍｌＰＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社の製品）の混合液２００μｌを添加して４℃で３０分インキュベートした。フローサイトメーター（米国ＢＤ社の製品）で測定を行って、すべての試料を８０００細胞ずつ計った。
【００７２】
その結果、３０μＭの老化Ａβ２５−３５でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を４８時間刺激した後、明らかに細胞死亡を引き起こし、死亡率は２４．８±１．９％、しかし、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖で２４時間前処理することによって、Ａβ２５−３５が引き起こした細胞死亡を抑えることができ、死亡率はそれぞれ１０．２±１．３％と５．１±０．７％になった。
【００７３】
アルギンオリゴ糖の抗Ａβ２５−３５が引き起こす神経細胞の死亡作用のメカニズムをさらに検討した結果、アルギンオリゴ糖はＡβ２５−３５が引き起こした神経細胞内の遊離状カルシウムイオン濃度の上昇を顕著に抑えることができ、自由基を生成し、細胞脂質過酸化生成物の含有量を高め、ミトコンドリア膜電位の減少および細胞死促進タンパク質とＣａｓｐａｓｅ−３タンパク活性を上昇させ、さらに死促進阻害タンパクの活性を上昇させた。このことは、アルギンオリゴ糖のＡβ細胞毒性損害に対する拮抗は、その酸化により細胞内の遊離状カルシウムイオン濃度の上昇を抑え、さらに死亡阻害タンパクの活性を上昇させ、ダウンストリーム死促進タンパク質の活性を阻断して、最終的には細胞死亡を抑えることを示唆した。
【００７４】
２．分子レベルにおけるアルギンオリゴ糖の抗Ａβ神経毒性作用メカニズムの検討
（１）アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維形成に対する影響
新しく調製したＡβ１−４０と０、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖をＴＢＳ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に混合して、３７℃で２４時間インキュベートしてからＴｈ−Ｔを添加して、蛍光分光光度計を用い、λｅｘ＝４５０ｎｍ、λｅｍ＝４８０ｎｍでＴｈ−Ｔ蛍光の強さを測定した。
【００７５】
その結果、１０、５０、１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の全てがＡβ１−４０の集中を抑えることができ、中でも１００μｇ／ｍｌのアルギンオリゴ糖の抑制作用が最も強かった。その蛍光の強度はそれぞれ１０．４６±０．９４、９．１８±１．３２と７．８１±１．３８（ｐ値はそれぞれ＜０．０５、０．０５と０．００１）。同時に、電子顕微鏡技術を採用してアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維形成に対する影響を観察した。その結果を図９に示した。その結果も同様にアルギンオリゴ糖がＡβ１−４０アミロイド線維形成を顕著に抑えることができることを示していた。同じ方法を用いて実験した結果、アルギンオリゴ糖はヘパリン促Ａβ１−４０アミロイド線維形成にも顕著な抑制作用があることを確認した。結果を図９に示した。図面において、ＡはＡβ１−４０を２４時間インキュベートした結果、ＢはＡβ１−４０とヘパリンを混合して２４時間インキュベートした結果、ＣはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖を２４時間共同インキュベートした結果、ＤはＡβ１−４０とヘパリン及びアルギンオリゴ糖を２４時間共同インキュベートした結果、ＥはＡβ１−４０を４８時間インキュベートした結果、ＦはＢはＡβ１−４０とヘパリンを混合して４８時間インキュベートした結果、ＧはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖を４８時間共同インキュベートした結果、ＨはＡβ１−４０とヘパリン及びアルギンオリゴ糖を４８時間共同インキュベートした結果を示している。
【００７６】
（２）アルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維破壊に対する影響
Ａβ１−４０を無菌超純水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製してからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分けて入れ、３７℃で７日間放置し、老化させた。１ｍｇ／ｍｌの老化Ａβ１−４０を取りアルギンオリゴ糖と混合し、３７℃で３日間インキュベートして、試料を２％酢酸ウランでネガティブ染色し、Ａβ１−４０アミロイド線維の形態をＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡で観察した。その結果、Ａβ１−４０が７日間老化した後に互いに交錯、集中して組んでアミロイド線維を形成していたが、アミロイド線維化Ａβ１−４０にアルギンオリゴ糖を添加して３日間インキュベートしたものは、Ａβアミロイド線維量が明らかに減少し、アミロイド線維が断裂、短かくなっていた。その結果を図１０に示した。ＡはＡβ、ＢはヘパリンとＡβ，Ｃはアルギンオリゴ糖とＡβ共同インキュベートしたものである。
【００７７】
（３）アルギンオリゴ糖のＡβ立体構造の変化に対する影響
無菌ＴＢＳ（ｐＨ７．４，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、Ａβ１−４０を２５０μｇ／ｍｌ濃度に調製し、それぞれ３５０μｌ／管でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分け入れ、それぞれに１００μｇ／ｍｌ濃度の無菌アルギンオリゴ糖を添加し、均一に混合後、３７℃で１２時間放置してから、Ｊ−５００Ａ型ＣＤ計（日本ＪＡＳＣＯ社製）で立体構造の変化を分析した。
【００７８】
結果を図１０に示した。ＡはＡβ１−４０、Ｂは老化Ａβ１−４０とヘパリンの混合物、ＣはＡβ１−４０とアルギンオリゴ糖の分析図である。その結果から、Ａβ１−４０は３７℃で１２時間放置しておくと完全にβ−折り畳み構造を取り、アルギンオリゴ糖が、明らかに、Ａβ１−４０がα−螺旋構造からβ−折り畳み構造に変更するのを抑制できることが明らかになった。
【００７９】
（４）アルギンオリゴ糖とＡβの相互作用の検討
ＳＰＲ技術（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）により、２５℃、５μｌ／ｍｉｎの流速でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流過させた（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、３．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．００５％（Ｖ／Ｖ）トゥイーン−２０、ｐＨ７．４）。Ａβ１−４０をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの充填液に調製し、分け詰めた後に３７℃に置く。それぞれ放置してから０、０．５、１、２、４、６日目にＡβ１−４０を取り、それを５段階の濃度倍率に希釈してから、２５℃、５μｌ／ｍｉｎの流速でアルギンオリゴ糖のチップ（注射体積は１０μｌ）を通過しながら、Ａβとアルギンオリゴ糖の結合曲線を記録した。２Ｍ ＮａＣｌを用いてチップを再生する。
【００８０】
その結果、アルギンオリゴ糖と異なる重合度のＡβすべてが結合していて、アルギンオリゴ糖と新鮮なＡβとの結合能力が最も弱く、その結合ＫＤ値は６．８５Ｅ−０７Ｍ、しかし、Ａβの老化時間の延長に伴って、アルギンオリゴ糖とＡβとの結合能力が次第に増加し（ＫＤ値がそれぞれ１．０７Ｅ−０７、９．０６Ｅ−０８、５．４３Ｅ−０８、２．１５Ｅ−０８、１．４５Ｅ−０８Ｍ）、２日間後、増加幅は減少して、概ね安定状態に達した。
【００８１】
さらに検討を行った結果、アルギンオリゴ糖は、Ｈｉｓ１３〜Ｌｙｓ１６によりＡβ全長の分子と相互作用し、Ｓｅｒ２６〜Ｌｙｓ２８によりＡβ２５−３５と結合することがわかった。アルギンオリゴ糖と新鮮なＡβとの結合は、そのＡβ立体構造の変化に対する抑制、さらにアミロイド線維形成に対する抑制の重要な原因であり、アルギンオリゴ糖と老化Ａβとの結合は、そのＡβ１−４０アミロイド線維破壊に対する抑制の重要な原因であることが判った。
【００８２】
以上の検討により、アルギンオリゴ糖は、Ａβ分子との結合によって、Ａβアミロイド線維の形成を抑制し、Ａβ１−４０アミロイド線維破壊を促進して、さらに、Ａβが引き起こす神経細胞のカルシウムイオンの超荷重を抑えて、その自由基の形成を除去し、神経細胞の死亡を抑え、神経細胞を損害から保護し、それによって抗老年性痴呆の作用を発揮することがわかった。
【００８３】
（５）アルギンオリゴ糖の抗糖尿病作用の検討
１．アルギンオリゴ糖の体外におけるアミリン損害膵島β細胞に対する保護作用
ヒト膵島β細胞ＮＩＴ株を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用い、１×１０４個／穴で９６穴アッセイプレートで接種して培養し、細胞混合後、０、１０、５０、１００μｇ／ｍのアルギンオリゴ糖を添加して２４時間作用させる。続いて、最終濃度が３０μＭの老化アミリン（ａｍｙｌｉｎ）（略称ＩＡＰＰ）を添加し、４８時間引き続き培養した後に、ＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。その結果、アルギンオリゴ糖で２４時間前処理することで、ＩＡＰＰの細胞に対する毒性作用を顕著に改善でき、細胞の生存を強化でき、しかも薬物の投与量の増加に伴って、このような改善作用ももっと顕著になっている。結果は図１２に示した通りである。一群ごとの実験回数は６で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃＃はコントロール群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はＩＡＰＰ群と比較して統計学の差（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）があることを表示している。アルギンオリゴ糖は、ＩＡＰＰの膵島β細胞の損害に対する拮抗作用を有することを示唆している。
【００８４】
２．アルギンオリゴ糖の体内におけるストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスモデルに対する影響
体重１８〜２２ｇオスのＮＩＨマウス６０匹を、正常な群、モデル群、アルギンオリゴ糖５０、１５０、４５０ｍｇ／ｋｇ投与群と５ｍｇ／ｋｇグリベンクラミド投与群に分けた。試験当日、正常な群以外の動物に１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔注射した。連続して１０日間相応の薬物を投与して、１１日目に眼球をとって血を取り、血糖濃度を測った。その結果、各薬物投与群マウスの血糖濃度は明らかにモデル群より低い。従って、アルギンオリゴ糖は、ストレプトゾトシンによる糖尿病マウスモデルに対して一定の治療の作用を有することを示唆している（表１３）。
【００８５】
【表１３】
【００８６】
重合度が２〜２２のアルギンオリゴ糖及びその酸化分解生成物或いはその混合物を用いて、体内外における抗老年性痴呆症と抗糖尿病の実験を行ったところ、類似の実験結果が得られた。図１３〜１６はアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＡβ１−４０を脳内注射による痴呆マウスの行為学測定結果を示す。一群ごとの実験回数は８で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃及び＃＃はコントロール群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はモデル群と比較して統計学の相違（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）があることを示している。このことから、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物は痴呆動物の学習能力を顕著に増加できることを示唆している。図１７は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＩＡＡＰ（ａｍｙｌｉｎ）損害膵島β細胞ＮＩＴ株に対する保護作用を測定した結果である。一群ごとの実験回数は６で、その値は平均数±標準偏差で表示し、＃＃はコントロール群と比較した統計学の相違（ｐ＜０．０１）を示し、＊および＊＊はＩＡＰＰ群と比較した統計学の差（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）があることを示している。このことから、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物は糖尿病に顕著な予防／治療の効果を有することを示唆している。
【００８７】
（６）統計学による処理
以上のデータをＳｔａｔｖｉｅｗ統計処理ソフトで分析した。その結果を“平均値±標準偏差”（Ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ±ＳＥ）で表し、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較を行った。
【００８８】
上記薬学的な結果により、通常の製剤手段で、有効な量の本発明のアルギンオリゴ糖と製薬学的に許容されるキャリアーとを混合することによって、薬学用組成物を製造できる。上述の薬学用組成物は、膵島アミロイド線維形成阻害剤、膵島アミロイドポリペプチド阻害剤などを含む。本発明のアルギンオリゴ糖は老年性痴呆症と糖尿病の予防／治療薬物の応用に非常に重要な意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、酸分解後のＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラムによる本発明のアルギンオリゴ糖の溶出曲線である。
【図２】図２は、本発明のアルギンオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ図である。
【図３】図３は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲル濾過カラムによる溶出曲線である。
【図４】図４は、アルギンオリゴ糖酸化分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ図（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）である。
【図５】図５は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０による学習能力障害マウスの避暗潜伏期を示す図面である。
【図６】図６は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０による学習能力障害のマウスの避暗誤まった回数を示す図面である。
【図７】図７は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ２５−３５損害神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対して保護作用を示す図面である。
【図８】図８は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０損害神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対して保護作用を示す図面である。
【図９】図９は、本発明のアルギンオリゴ糖の正常およびヘパリン促Ａβ１−４０アミロイド線維形成に対する抑制作用を示す図面である。
【図１０】図１０は、本発明のアルギンオリゴ糖のＡβ１−４０アミロイド線維の破壊に対する影響を示す図面である。
【図１１】図１１は、本発明のアルギンオリゴ糖の溶液における２５０μｇ／ｍｌ Ａβ１−４０の立体構造の変化に対する影響を示す図面である。
【図１２】図１２は、本発明のアルギンオリゴ糖のＩＡＡＰが引き起こすＮＩＴ細胞損害に対する保護作用を示す図面である。
【図１３】図１３は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおけるゴール到達時間に対する影響を示す図面である。
【図１４】図１４は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおける水泳距離に対する影響を示す図面である。
【図１５】図１５は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおける初回ゴール部到着時間に対する影響を示す図面である。
【図１６】図１６は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物がＡβ１−４０脳内注射による痴呆マウスのＭｏｒｒｉｓ水迷路テストにおけるゴール部を通り抜ける回数に対する影響を示す図面である。
【図１７】図１７は、本発明のアルギンオリゴ糖酸化分解生成物の混合物のＩＡＡＰが引き起こすＮＩＴ細胞損害に対する保護作用を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である）
で示されるアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩であって、前記アルギンオリゴ糖は、β−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により連結されてなる、アルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記アルギンオリゴ糖誘導体が下記の構造式（ＩＩ）
【化２】
（式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である）
で示され、還元末端１位がカルボキシル基であることを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項３】
上記ｎ＝２〜１２、さらに好ましくはｎ＝４〜８であることを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項４】
アルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度約１００〜１２０℃の条件で約２〜６時間反応させ；
反応終了後、ｐＨ値を約７に調節する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩の調製方法。
【請求項５】
前記アルギナートがアルギン酸ナトリウムであり、ｐＨ４、反応温度１１０℃の条件で４時間反応させることを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
ｐＨ値を７に調節した後、エタノールで沈殿を生じさせ、得られた沈殿物質を吸引ろ過し、脱水、乾燥、脱塩を行うことを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項７】
アルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度１００〜１２０℃の条件で２〜６時間反応させた後、更に酸化剤を添加し、反応温度１００〜１２０℃の条件で１５分〜２時間反応させることを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項８】
上記酸化剤が水酸化銅であり、１００℃で３０分反応させることを特徴とする請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載されたアルギンオリゴ糖またはその誘導体と製薬学的に許容されるキャリアーを含有する薬学用組成物。
【請求項１０】
前記薬学用組成物が、老年性痴呆症の予防と治療用薬物、β−アミロイド線維形成阻害剤、糖尿病の予防と治療用薬物、アミロイド線維破壊促進剤、膵島アミロイド線維形成阻害剤のいずれか一種類であることを特徴とする請求項９に記載の薬学用組成物。
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である）
で示されるアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩であって、前記アルギンオリゴ糖は、β−Ｄ−マンヌロン酸がα−１，４グリコシド結合により連結されてなる、アルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記アルギンオリゴ糖誘導体が下記の構造式（ＩＩ）
【化２】
（式中、ｎは０あるいは１〜１９の整数である）
で示され、還元末端１位がカルボキシル基であることを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項３】
上記ｎ＝２〜１２、さらに好ましくはｎ＝４〜８であることを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩。
【請求項４】
アルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度約１００〜１２０℃の条件で約２〜６時間反応させ；
反応終了後、ｐＨ値を約７に調節する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアルギンオリゴ糖またはその誘導体、あるいはそれらの製薬学的に許容される塩の調製方法。
【請求項５】
前記アルギナートがアルギン酸ナトリウムであり、ｐＨ４、反応温度１１０℃の条件で４時間反応させることを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
ｐＨ値を７に調節した後、エタノールで沈殿を生じさせ、得られた沈殿物質を吸引ろ過し、脱水、乾燥、脱塩を行うことを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項７】
アルギナート水溶液を高圧釜の中、ｐＨ２〜６、反応温度１００〜１２０℃の条件で２〜６時間反応させた後、更に酸化剤を添加し、反応温度１００〜１２０℃の条件で１５分〜２時間反応させることを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
【請求項８】
上記酸化剤が水酸化銅であり、１００℃で３０分反応させることを特徴とする請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載されたアルギンオリゴ糖またはその誘導体と製薬学的に許容されるキャリアーを含有する薬学用組成物。
【請求項１０】
前記薬学用組成物が、老年性痴呆症の予防と治療用薬物、β−アミロイド線維形成阻害剤、糖尿病の予防と治療用薬物、アミロイド線維破壊促進剤、膵島アミロイド線維形成阻害剤のいずれか一種類であることを特徴とする請求項９に記載の薬学用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５３０７１８（Ｐ２００７−５３０７１８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４２３８（Ｐ２００７−５０４２３８）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７７６
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６３２２９５０）中国海洋大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７７６
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６３２２９５０）中国海洋大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
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