アルコール消費の複合化した代謝産物の分析
少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するための方法、システム、キットおよび使用が提供される。クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの所定量の内部標準を試料に加えるステップと、重水素化クレアチニンを試料に加えるステップと、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の所定量の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するステップとを含む。さらに、この方法は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するステップと、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つの代謝産物の量を正規化するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７６，５３９号の利益を主張し、この出願の内容は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本出願人の教示は、試料中のエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
採取源（ｓｏｕｒｃｅ）から得られる試料中の代謝産物を検出および定量化することにより、採取源中に存在する物質についての情報を得ることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本出願人の教示の一態様によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法が提供される。この方法は、所定量の少なくとも１つの内部標準を加えるステップと、重水素化クレアチニンを試料に加えるステップと、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの所定量の内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するステップとを含む。さらに、この方法は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するステップと、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップとを含む。
【０００５】
別の態様では、質量分析計を用いて採取源中のエタノール代謝をモニターして採取源由来の試料を分析するためのシステムが提供される。試料は、採取源の身体状態の指標となることができるクレアチニンを含む。このシステムは、試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈し、所定量の内部標準を少なくとも１つの希釈された試料に加え、重水素化クレアチニンを試料に加え、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定し、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて試料中の少なくとも１つの代謝産物の量を定量化し、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化し、およびクレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するように構成された制御装置を備える。
【０００６】
本出願人の教示の別の態様によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するためのキットが提供される。このキットは、以下のうち少なくとも１つを備える：試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェック、取扱説明書およびそれらの組合せ。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
当業者には、下記の図面が例証目的のものにすぎないことは理解されよう。図面は、本出願人の教示の範囲をいかなる形でも制限しないことを意図したものである。類似した言及は、類似または対応する部分を指すことを意図したものである。
【図１】希釈した尿マトリックスの計算濃度を基準マトリックス中の試料の計算濃度と比較するグラフである。
【図２】６つの分析対象物の構造を示す図である。
【図３】自動較正溶液調製の前処理法の説明である。
【図４】自動較正溶液調製の前処理法の説明である。
【図５】デュアルカラム配管設備（ｄｕａｌ ｃｏｌｕｍｎ ｐｌｕｍｂｉｎｇ）の配置を模式的に示す図である。
【図６】デュアルカラム配管設備（ｄｕａｌ ｃｏｌｕｍｎ ｐｌｕｍｂｉｎｇ）の配置を模式的に示す図である。
【図７】１０ポートバルブの配置を模式的に示す図である。
【図８】多様な国における標準飲酒量を示す一覧である。
【図９】多様な国における標準飲酒量を示す一覧である。
【図１０】ビールおよび赤ワインの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１１】ブラジル産ラムの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１２】ポーランド産ラガービールの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１３】イタリア産赤ワインの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１４】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【図１５】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【図１６】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（種々の実施形態の説明）
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法が提供される。この方法は、所定量の少なくとも１つの内部標準を試料に加えるステップと、重水素化クレアチニンを試料に加えるステップとを含むことができる。この方法は、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するステップを含むことができる。この方法は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて、試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するステップとを含むことができる。この方法は、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップを含むことができる。
【０００９】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、試料は、哺乳動物などの採取源から得ることができる。例えば、哺乳動物は、ヒト、霊長動物または他の実験動物であってもよく、試料は、尿、唾液、乳汁、血液または他の生体液および組織であってもよい。乳汁、血液または他の生体液および組織などの試料は、本出願人の方法において使用する前に脂質およびタンパク質を除去するために前処理してもよい。
【００１０】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、代謝産物は、エタノール代謝産物であってもよく、例えば、採取源中に存在するエタノールの指標となるものであってもよい。代謝産物は、採取源中に存在する物質が複合化した状態のものであってもよい。例えば、採取源（哺乳動物など）がエタノールを消費したとすると、代謝産物は、硫酸エチルおよび／またはエチルグルクロニドであってもよい。
【００１１】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、出願人の教示の多様な実施形態において行われる検出および測定は、例えば、質量分析計（例えば、トリプル四重極（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を備える質量分析計など）を使用して行うことができる。他の種類の質量分析計としては、多様な種類のイオントラップ、線形イオントラップ、飛行時間分析器、磁場型の装置が挙げられ、これらもすべて使用することができよう。
【００１２】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、試料の成分は、試料の「濃さ」または濃度の結果としてさまざまな濃度で現れることがある。例えば、尿の濃さは、例えば、採取源の身体状態を反映することがある。例えば、この濃さは、採取源の身体活動量、水分消費量、塩摂取量、筋量または腎機能を反映することがある。試料中の特定の成分（クレアチニンまたはヒドロコルチゾンなど）は、採取源の身体状態の指標となることができる。試料は、尿、血液または血漿を含んでもよい。これらの成分を使用して、代謝産物の検出量を正規化できる。代謝産物の検出量を正規化することにより、代謝産物をより正確に定量化できる。
【００１３】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準は、試料の分析の前に試料に加えることができる。内部標準は、関心成分の化学構造によく似た化学構造を有する公知の量の化学物質を含むことができる。内部標準の化学物質は、どのような検出様式を用いることによっても検出できる可能のある追加成分を含むことができる。例えば、構造体の少なくとも１つの水素原子を重水素原子と置き換えることができると考えられるが、重水素原子を用いると、質量分析により、よく似た化学物質とは別々に検出することが可能になる。好ましくは、複数の重水素原子を使用できる。内部標準である公知の量の化学物質の定量化を用いて、関心成分を同定および／または定量化できる。
【００１４】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、内部標準は、例えば、ＨＰＬＣ前処理法として、手作業または自動で加えることができる。内部標準は希釈でき、例えば、内部標準は、例えばＨＰＬＣ法により手作業または自動のいずれかで連続的に希釈できる。内部標準は、試料中の成分の化学構造によく似た化学構造を有する化学物質を含むことができる。例えば、この化学物質は、クレアチニン、ヒドロキシコルチゾン、硫酸エチルまたはエチルグルクロニドによく似た構造を有することができる。内部標準の化学物質は、同定、検出および／または定量化されるように改変できる。例えば、この方法と共に質量分析計を使用する場合、化学物質を重水素化してもよい。したがって、内部標準は、重水素化クレアチニン、重水素化ヒドロキシコルチゾン、重水素化エチルグルクロニドおよび／または重水素化硫酸エチルを含むことができる。
【００１５】
出願人の教示の多様な実施形態による方法は、内部標準を加える前および／または後のいずれかで、試料の少なくとも１つの希釈または連続希釈を含むことができる。希釈は、手作業および／または自動で行うことができる。本出願人の教示の多様な実施形態によれば、この方法は自動化できる。例えば、尿試料の自動希釈および較正曲線試料セットの自動調製。
【００１６】
出願人の教示の多様な実施形態による方法は、例えば、アルコール飲料として消費された、採取源（哺乳動物など）の体内のアルコールの時間およびレベルを予測するために使用できる。本出願人の教示の多様な実施形態によれば、この方法は、哺乳動物などの採取源の体内のアルコールをモニターするために使用できる。
【００１７】
出願人の教示の多様な実施形態によれば、採取源中のエタノール代謝をモニターするためのシステムが提供される。このシステムは、採取源由来の試料を分析するための質量分析計の使用を含むことができる。試料は、採取源の身体状態の指標となるクレアチニンを含むことができる。このシステムは、試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈するように構成された制御装置を備えることができる。この制御装置は、所定量の内部標準を少なくとも１つの希釈された試料に加えるように構成されていてもよく、重水素化クレアチニンを試料に加えるように構成されていてもよい。制御装置は、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するように構成されていてもよい。制御装置は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて、試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するように構成されていてもよい。制御装置は、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するように構成されていてもよく、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するように構成されていてもよい。
【００１８】
出願人の教示の多様な実施形態によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するために部品のキットが提供されてもよい。このキットは、以下のうち少なくとも１つを備える：試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェックおよびそれらの組合せ。典型的には、品質管理チェックは、特定のイオン数が得られるように、所定の低濃度、中濃度および高濃度の溶液を用いて作製できる。
【００１９】
本出願人の教示の態様は、以下の実施例に照らせばさらに理解できるが、この実施例は、本出願人の教示の範囲をいかなる形でも制限しないものとして解釈されるべきである。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
この実施例に用いられる方法により、６つの化学種が４分未満のうちに検出された：エチルアルコール消費による複合化した尿中代謝産物である（１）エチルグルクロニドおよび（２）硫酸エチル、ならびにそれらのｄ５−重水素化された内部標準、「尿の濃さ」の指標であるクレアチニン、および内部標準としてのｄ３−重水素化クレアチニン。これらの代謝産物の濃度を尿１Ｌ当たりクレアチニン１ｇに正規化した。
【００２１】
例えば、較正溶液は、特注構成のＳｈｉｍａｄｚｕ前処理プログラムを用いて、尿中または溶媒中で標準が１：１で混合されているストック溶液を連続的に希釈することにより、自動的に調製した。尿はエチルグルクロニドのシグナルの急上昇を抑制できるので、未希釈の尿中の標準溶液からは、溶媒のみの中のシグナルと比較しておよそ１／１０〜１／１５のシグナルが得られる。ところが、１：１０希釈により、元のシグナルは回復される。この理由から、試料を希釈してマトリックス効果を低下させる必要があった。尿試料は、以下のように処理した：
図３および４に記載の要領で前処理プログラムを用いることにより人的過誤および可能性のある汚染を最低限に抑えながら、各尿試料（１００μＬ）を、内部標準を含有する溶液（８０％水＋２０％アセトニトリル）２００μＬおよびアセトニトリル７００μＬと混合した。図１は、１：１０希釈によりマトリックス抑制が低下する（応答対濃度）ことを示すものである。マトリックス抑制が存在すると、希釈された尿マトリックスの計算濃度（ピンク）は、基準マトリックス（青）中の試料の計算濃度を下回ることになると考えられるが、この実験においてはこうした事実はなかったことから、用いられる希釈の程度は、分析において妥当である。
【００２２】
以下の文献に従い、エチルグルクロニドおよび硫酸エチルの量をクレアチニンの量（１００ｍｇ／ｄＬまたは１，０００ｍｇ／Ｌ）に調節した：「Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｐｈａｔｅ − Ａ Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ − ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」、Ｓ． Ｄｒｅｓｅｎ、Ｗ． ＷｅｉｎｍａｎｎおよびＦ． Ｍ． Ｗｕｒｓｔ、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ． Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００４、１５巻、１６４４〜１６４８頁。この論文では代謝産物はクレアチニンに正規化されたもののクレアチニンは代替的な手法を用いて測定されたのに対し、本出願人の教示では、クレアチニンは、同じＬＣ−ＭＳ／ＭＳの実行を用いて代謝産物と同時に測定した。図２は、６つの分析対象物の構造を示すものである。
【００２３】
この試験用に使用した装置としては、以下から成るＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＩＬ−ＨＴ Ｄｕａｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる：ＣＢＭ−２０Ａ制御装置１台、ＬＣ−２０ＡＤポンプ４台、ＳＩＬ−２０ＡＣ自動サンプラー１台、ＦＣＶ−２０ＡＨ２バルブ２個付きのＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン１台およびＤＧＵ−２０Ａ３オンライン脱気装置１台。ラインから塩を投入している間、ＭＳ源に溶媒を送達するために、追加のポンプＬＣ−１０ＡＤｖｐおよび脱気装置ＤＧＵ１４Ａを使用した。この試験のために採用した質量分析計は、マルチプルリアクションモニタリングモード（ＭＲＭ）下で動作するＡＰＩ−３２００（商標）トリプル四重極システムであり、このシステムで、一連の前駆体および独特な断片のイオン対を回転順に次々にモニターした。以下に従い、化学種１つにつき最低２つのイオン対をモニターした：欧州のＧＬＰガイドライン「Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ １２ Ａｕｇｕｓｔ ２００２ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９６／２３／ＥＣ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ」、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、Ｌ２２１／１２、２００２年８月１７日、２００２／６５７／ＥＣ、ｆｏｒ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＭＳ／ＭＳ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。
【００２４】
試薬
クレアチニンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ”、製品番号Ｃ−４２５５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から入手可能であった。Ｄ３−クレアチニンは、Ｃ／Ｄ／Ｎ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ：製品番号Ｄ−３６８９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｎｉｓｏｔｏｐｅｓ．ｃｏｍ）から入手可能であった。エチルグルクロニド（ｄ０およびｄ５）は、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、８１１ Ｐａｌｏｍａ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ Ａ、Ｒｏｕｎｄ Ｒｏｃｋ、Ｔｅｘａｓ７８６６４、ＵＳＡから入手可能であった。エチル硫酸ナトリウム塩は、東京化成工業株式会社、東京都北区豊島６−１５−９（Ｅ０２７７）から入手可能であった。Ｄ５−硫酸エチルは、ｄ５−エタノール（Ｃ／Ｄ／Ｎ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．、製品番号Ｄ−１０８ １１６μＬ、１．９６ｍＭ）をリアクティバイアル中で硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号３８００７５、１０６μＬ、１．９３ｍＭ）に加えて、８０℃で６０分間加熱することにより合成した。それを水中で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、これを使用して標準溶液を調製した。ギ酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（製品番号Ｆ−２００）から入手可能であった。ギ酸は、ＥＭＤ（ＡｎａｌａＲ（登録商標）、９８〜１００％、製品番号Ｂ１０１１５）から入手可能であった。アセトニトリル（ＢＡＫＥＲ ＡＮＡＬＹＺＥＤ（登録商標）９０１７−０３）は、ＪＴ Ｂａｋｅｒから入手した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｑ １８ＭΩ脱イオン水を使用した。
【００２５】
ＨＰＬＣ法
ハイスループットな分析を実現するために、デュアルカラム液体クロマトグラフィーシステムを使用した。５番目のポンプがクリーン溶媒をＭＳに送る間、初期および後期のＬＣ溶出剤を排液槽（ｗａｓｔｅ）へよけるように、質量分析計に取り付けられた切替バルブ（ｄｉｖｅｒｔｅｒ ｖａｌｖｅ）も使用した。
【００２６】
移動相Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび第３すすぎ液溶液は、７０％アセトニトリル＋３０％水＋１０ｍＭギ酸アンモニウムから構成され、少量のギ酸を加えてｐＨが５．０に調節されたものを、流速０．３５ｍＬ／分で使用した（アイソクラチック）。ポンプ５は、同じ組成を使用した。第１すすぎ液は、８０％水＋２０％アセトニトリル＋５００ｎｇ／ｍＬのｄ５−エチルグルクロニド＋１００ｎｇ／ｍＬのｄ５−硫酸エチル＋１，５００ｎｇ／ｍＬのｄ３−クレアチニンから構成されていた。第２すすぎ液は、アセトニトリル（１００％）から構成されていた。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ＨＩＬＩＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）シリカ３ミクロン、３．０×１００ｍｍ、マッチングガードカラム付きであり、これを５０℃で加熱した。
【００２７】
図３および４は、自動較正溶液調製（１：１希釈）の前処理法を示すものである。
【００２８】
図５〜７は、試料を自動的にカラム１または２の上に注入でき（それぞれ図５および６）、バルブ配置により試料をよけて、化合物は溶出していないが尿マトリックスは溶出している時点で流入物をアセトニトリルに置き換えることができるようなシステム配置を示す。
【００２９】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステムおよび標準的な７０バイアルトレイを使用して、表１に示す自動試料希釈の前処理を自動的に行った。このプログラムを変更すれば、１０５バイアルトレイまたは１７５バイアルトレイを使用できる。
【００３０】
アルコール消費実験−バックグラウンド値
アルコール代謝産物の定量は、アルコール消費、典型的にはアルコール飲料の消費による指標として使用できる。特定の他の食品、医薬および器具は、それを使用した場合にも、代謝産物となり、アルコール飲料に由来する値を超え、それを上回る値を増やす可能性があると考えられるアルコールを含有する。アルコールを含有する医薬およびデザートの、エチルグルクロニド（Ｅｔ−Ｇ）および硫酸エチル（Ｅｔ−Ｓ）の値への影響の仕方を定量するため、志願者には、（１）病院で手を消毒するためのアルコールゲル、（２）Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎ（登録商標）咳止めシロップ、（３）口腔洗浄液、（４）ティラミスケーキ、（５）顔のクレンジング用布、（６）シェリーのトライフル、（７）アイリッシュコーヒー（クリーム入りのコーヒーに１杯の蒸留酒を入れたもの）、（８）肉の調理に使用する赤ワインおよび（９）ビールで照りを付けたハム（ｈａｍ ｗｉｔｈ ｂｅｅｒ ｇｌａｚｅ）を、すべて普通の使用法で使用するように依頼した。
【００３１】
使用または消費の前後に、尿試料を回収した。Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎ以外は、志願者の尿試料中で測定可能な量のＥｔ−ＧまたはＥｔ−Ｓは発見されなかった。Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎを摂取してから２時間後および７時間後に回収した尿試料は、Ｅｔ−Ｓの増加を示したがＥｔ−Ｇの増加は示さなかった。
【００３２】
したがって、消費量が妥当である限り、この方法では偽陽性値は生じそうにない。
【００３３】
アルコール消費実験
多様な国における標準飲酒量を図８および９に示す。
【００３４】
航空会社のパイロット、機械オペレーター、アルコール離脱プログラムを受けている患者による多様な消費シナリオを模擬的に再現するために、以下の酒を食事と共に消費するよう志願者に依頼した。食事の選択は、各志願者の裁量に任せた。
【００３５】
（１）フランス産赤ワイン（２５０ｍＬ、アルコール含有量１２％）＋ポルトガル産赤ワイン（１００ｍＬ、１７．５％）を女性志願者が消費した。
【００３６】
（２）カナダ産ラガービール１本（３５５ｍＬ、５％）＋オンタリオ産赤ワイン（１．２Ｌ、１３．５％）を女性志願者が消費した。
【００３７】
（３）オンタリオ産ラガービール２本（７１０ｍＬ、５％）＋オンタリオ産白ワイン（１．２Ｌ、１３．５％）を男性志願者が消費した。
【００３８】
（４）ポーランド産ラガービール（Ｚｙｗｉｅｃ、５．５％、１Ｌ）を男性志願者が消費した。
【００３９】
（５）「アサヒ」ラガービール１缶（５００ｍＬ、５％）＋「月桂冠」日本酒４００ｍＬ（４００ｍＬ、１６％）を男性志願者が消費した。
【００４０】
（６）Ａｐｐｌｅｔｏｎホワイトジャマイカラム（２０％、１８０ｍＬ、２時間かけて）を男性志願者が消費した。
【００４１】
（７）フランス産赤ワイン（およそ５００ｍＬ、１２％）を男性志願者が消費した。
【００４２】
（８）Ｐｅｄｒａ９０、ブラジル産ラム（１００ｍＬ、３９％）を男性志願者が消費した。
【００４３】
（９）イングリッシュジン（５０ｍＬ、４０％）を男性志願者が消費した。
【００４４】
（１０）ポートワイン（１００ｍＬ、１８％）を女性志願者が消費した。
【００４５】
（１１）中国産もち米酒（４００ｍＬ、１４％）を男性志願者が消費した。
【００４６】
（１２）英国産Ｇｕｉｎｎｅｓｓビール（６００ｍＬ、５％）を男性志願者が消費した。
【００４７】
（１３）Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｒｉｓｈ Ｃｒｅａｍのオンザロック（およそ３００ｍＬ、１７％）を男性志願者が消費した。
【００４８】
（１４）シングルモルトのスコッチウィスキー（６０ｍＬ、４０％）を男性志願者が消費した。
【００４９】
（１５）テキーラ（１２５ｍＬ、４０％）を女性志願者が消費した。
【００５０】
アルコール飲料の消費前後に尿試料を回収した。体積を記録し、尿の一部をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に４℃で１５ｍＬの遠心管中に保存した。上記の要領で試料を分析し、尿中のエタノール代謝産物（硫酸塩およびグルクロニド）の濃度として、時間の経過と共にプロットした。これは、消費後、時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すものである。図１０〜１３は、選択されたケースについての当該曲線を示すものである。尿中の代謝産物の濃度は、消費直後、測定可能に増加し、消費してから少なくとも２０時間後に正常に戻ることが示される。上昇した代謝産物の濃度は、消費の指標となる。濃度をクレアチニンに正規化するこの方法により、硫酸エチルおよびグルクロニドの減衰曲線間の良好な一致が示される。図１４は、尿体積および測定された代謝産物濃度が異なる場合のクレアチニンの変化を示すものである。
【００５１】
尿のエタノール代謝産物濃度の測定により、消費後の上昇したレベルを明らかにする一方、この濃度を消費体積に関連付けるためには、正規化された代謝産物の、尿排出量への物質収支、さらには、摂取された総エタノールから形成される代謝産物量への物質収支を求めることが必要である。
【００５２】
代謝されたエタノールの比率を評価するために、物質収支を調べた。ある例では、ビールおよび赤ワイン（エタノール１４１．８ｇ）の消費の１０１時間後、２３．８４ｍｇを超える硫酸エチルおよび７２．８６ｍｇのエチルグルクロニドが形成され、排出された。化学量論組成は以下のとおりである：
Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋Ｈ２ＳＯ４→Ｃ２Ｈ５ＯＳＯ３Ｈ
４６ ９８ １２６
４６：１２６＝１４１．８（ｇ）：Ｘ Ｘ＝（１２６／４６）×１４１．８（ｇ）＝３８８．４（ｇ）
（０．０２３８４ｇ）／（３８８．４ｇ）×１００＝０．００６１４（％）
同様に、エチルグルクロニドについては、
４６：２２２＝１４１．８（ｇ）：Ｙ Ｙ＝（２２２）／（４６）×１４１．８（ｇ）＝６８４．３（ｇ）
（０．０７２８６ｇ）／（６８４．３ｇ）×１００＝０．０１０６（％）
計算から、０．００６１％のエタノールが硫酸エチルに転換され、０．０１０６％のエタノールがエチルグルクロニドに転換され、尿の系中に排出されたことが示される。アルコールの大部分は二酸化炭素および水に転換されると言われている。
【００５３】
別の事例では、女性志願者がフランス産赤ワイン（２５０ｍＬ、１２％）およびポルトガル産ポートワイン（１００ｍＬ、１７．５％）を３０分ほどで消費した。
【００５４】
消費されたアルコールの合計量は３７．４７８グラムであった。４６．４５時間にわたり尿試料を回収し、各排出物の体積を測定および記録した。
【００５５】
導入されたアルコール：２５０ｍＬ×１２（％）／１００×０．７８９（ｇ／ｍＬ）＋１００ｍＬ×１７．５（％）／１００×０．７８９（ｇ／ｍＬ）＝３７．４８グラムのエタノール
検出された硫酸エチル１１．０９１ｍｇ…０．０１０％
男性志願者が冷えた「アサヒスーパードライ」ビール１缶（５００ｍＬ、５％）に続いて温かい「月桂冠」日本酒（４００ｍＬ、１６％）をおよそ２時間で消費した際に、正規化の重要性が例証された。
【００５６】
彼の系に導入された総エタノールは、５００×０．０５×０．７８９＋４００×０．１６×０．７８９＝７０．２１１ｇであった。
【００５７】
図１５および１６に示すように、彼のクレアチニン濃度および排尿体積（これは試料中の濃度に大きく影響する）は本試験の経過中に変化したことから、正規化の重要性が示唆された。
【００５８】
この実施例から、アルコール飲料を消費した後、アルコール消費の指標として、少なくとも消費２０時間後の尿中のエタノール代謝産物、エチルグルクロニドおよび硫酸エチルの量を測定することが可能であることが示された。多様な飲料および志願者をテストした。無意識なアルコール消費（例えば、咳止めシロップまたは食品からの）の効果を評価したところ、その効果はごくわずかであることが見出された。尿体積および尿の濃さへの正規化の効果は実証され、この正規化により良好な結果がもたらされることが示された。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７６，５３９号の利益を主張し、この出願の内容は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本出願人の教示は、試料中のエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
採取源（ｓｏｕｒｃｅ）から得られる試料中の代謝産物を検出および定量化することにより、採取源中に存在する物質についての情報を得ることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本出願人の教示の一態様によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法が提供される。この方法は、所定量の少なくとも１つの内部標準を加えるステップと、重水素化クレアチニンを試料に加えるステップと、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの所定量の内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するステップとを含む。さらに、この方法は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するステップと、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップとを含む。
【０００５】
別の態様では、質量分析計を用いて採取源中のエタノール代謝をモニターして採取源由来の試料を分析するためのシステムが提供される。試料は、採取源の身体状態の指標となることができるクレアチニンを含む。このシステムは、試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈し、所定量の内部標準を少なくとも１つの希釈された試料に加え、重水素化クレアチニンを試料に加え、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定し、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて試料中の少なくとも１つの代謝産物の量を定量化し、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化し、およびクレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するように構成された制御装置を備える。
【０００６】
本出願人の教示の別の態様によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するためのキットが提供される。このキットは、以下のうち少なくとも１つを備える：試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェック、取扱説明書およびそれらの組合せ。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
当業者には、下記の図面が例証目的のものにすぎないことは理解されよう。図面は、本出願人の教示の範囲をいかなる形でも制限しないことを意図したものである。類似した言及は、類似または対応する部分を指すことを意図したものである。
【図１】希釈した尿マトリックスの計算濃度を基準マトリックス中の試料の計算濃度と比較するグラフである。
【図２】６つの分析対象物の構造を示す図である。
【図３】自動較正溶液調製の前処理法の説明である。
【図４】自動較正溶液調製の前処理法の説明である。
【図５】デュアルカラム配管設備（ｄｕａｌ ｃｏｌｕｍｎ ｐｌｕｍｂｉｎｇ）の配置を模式的に示す図である。
【図６】デュアルカラム配管設備（ｄｕａｌ ｃｏｌｕｍｎ ｐｌｕｍｂｉｎｇ）の配置を模式的に示す図である。
【図７】１０ポートバルブの配置を模式的に示す図である。
【図８】多様な国における標準飲酒量を示す一覧である。
【図９】多様な国における標準飲酒量を示す一覧である。
【図１０】ビールおよび赤ワインの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１１】ブラジル産ラムの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１２】ポーランド産ラガービールの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１３】イタリア産赤ワインの消費後の時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すグラフである。
【図１４】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【図１５】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【図１６】尿体積および代謝産物の測定濃度が異なる場合のクレアチニンの変化の例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（種々の実施形態の説明）
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法が提供される。この方法は、所定量の少なくとも１つの内部標準を試料に加えるステップと、重水素化クレアチニンを試料に加えるステップとを含むことができる。この方法は、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するステップを含むことができる。この方法は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて、試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するステップとを含むことができる。この方法は、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップを含むことができる。
【０００９】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、試料は、哺乳動物などの採取源から得ることができる。例えば、哺乳動物は、ヒト、霊長動物または他の実験動物であってもよく、試料は、尿、唾液、乳汁、血液または他の生体液および組織であってもよい。乳汁、血液または他の生体液および組織などの試料は、本出願人の方法において使用する前に脂質およびタンパク質を除去するために前処理してもよい。
【００１０】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、代謝産物は、エタノール代謝産物であってもよく、例えば、採取源中に存在するエタノールの指標となるものであってもよい。代謝産物は、採取源中に存在する物質が複合化した状態のものであってもよい。例えば、採取源（哺乳動物など）がエタノールを消費したとすると、代謝産物は、硫酸エチルおよび／またはエチルグルクロニドであってもよい。
【００１１】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、出願人の教示の多様な実施形態において行われる検出および測定は、例えば、質量分析計（例えば、トリプル四重極（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）を備える質量分析計など）を使用して行うことができる。他の種類の質量分析計としては、多様な種類のイオントラップ、線形イオントラップ、飛行時間分析器、磁場型の装置が挙げられ、これらもすべて使用することができよう。
【００１２】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、試料の成分は、試料の「濃さ」または濃度の結果としてさまざまな濃度で現れることがある。例えば、尿の濃さは、例えば、採取源の身体状態を反映することがある。例えば、この濃さは、採取源の身体活動量、水分消費量、塩摂取量、筋量または腎機能を反映することがある。試料中の特定の成分（クレアチニンまたはヒドロコルチゾンなど）は、採取源の身体状態の指標となることができる。試料は、尿、血液または血漿を含んでもよい。これらの成分を使用して、代謝産物の検出量を正規化できる。代謝産物の検出量を正規化することにより、代謝産物をより正確に定量化できる。
【００１３】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準は、試料の分析の前に試料に加えることができる。内部標準は、関心成分の化学構造によく似た化学構造を有する公知の量の化学物質を含むことができる。内部標準の化学物質は、どのような検出様式を用いることによっても検出できる可能のある追加成分を含むことができる。例えば、構造体の少なくとも１つの水素原子を重水素原子と置き換えることができると考えられるが、重水素原子を用いると、質量分析により、よく似た化学物質とは別々に検出することが可能になる。好ましくは、複数の重水素原子を使用できる。内部標準である公知の量の化学物質の定量化を用いて、関心成分を同定および／または定量化できる。
【００１４】
本出願人の教示の多様な実施形態によれば、内部標準は、例えば、ＨＰＬＣ前処理法として、手作業または自動で加えることができる。内部標準は希釈でき、例えば、内部標準は、例えばＨＰＬＣ法により手作業または自動のいずれかで連続的に希釈できる。内部標準は、試料中の成分の化学構造によく似た化学構造を有する化学物質を含むことができる。例えば、この化学物質は、クレアチニン、ヒドロキシコルチゾン、硫酸エチルまたはエチルグルクロニドによく似た構造を有することができる。内部標準の化学物質は、同定、検出および／または定量化されるように改変できる。例えば、この方法と共に質量分析計を使用する場合、化学物質を重水素化してもよい。したがって、内部標準は、重水素化クレアチニン、重水素化ヒドロキシコルチゾン、重水素化エチルグルクロニドおよび／または重水素化硫酸エチルを含むことができる。
【００１５】
出願人の教示の多様な実施形態による方法は、内部標準を加える前および／または後のいずれかで、試料の少なくとも１つの希釈または連続希釈を含むことができる。希釈は、手作業および／または自動で行うことができる。本出願人の教示の多様な実施形態によれば、この方法は自動化できる。例えば、尿試料の自動希釈および較正曲線試料セットの自動調製。
【００１６】
出願人の教示の多様な実施形態による方法は、例えば、アルコール飲料として消費された、採取源（哺乳動物など）の体内のアルコールの時間およびレベルを予測するために使用できる。本出願人の教示の多様な実施形態によれば、この方法は、哺乳動物などの採取源の体内のアルコールをモニターするために使用できる。
【００１７】
出願人の教示の多様な実施形態によれば、採取源中のエタノール代謝をモニターするためのシステムが提供される。このシステムは、採取源由来の試料を分析するための質量分析計の使用を含むことができる。試料は、採取源の身体状態の指標となるクレアチニンを含むことができる。このシステムは、試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈するように構成された制御装置を備えることができる。この制御装置は、所定量の内部標準を少なくとも１つの希釈された試料に加えるように構成されていてもよく、重水素化クレアチニンを試料に加えるように構成されていてもよい。制御装置は、少なくとも１つのエタノール代謝産物、試料中の少なくとも１つの内部標準、重水素化クレアチニンおよびクレアチニンを検出および測定するように構成されていてもよい。制御装置は、少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて、試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するように構成されていてもよい。制御装置は、重水素化クレアチニンの測定値を用いて試料中のクレアチニンの量を定量化するように構成されていてもよく、クレアチニンの測定値を用いて少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するように構成されていてもよい。
【００１８】
出願人の教示の多様な実施形態によれば、クレアチニンを含む試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するために部品のキットが提供されてもよい。このキットは、以下のうち少なくとも１つを備える：試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェックおよびそれらの組合せ。典型的には、品質管理チェックは、特定のイオン数が得られるように、所定の低濃度、中濃度および高濃度の溶液を用いて作製できる。
【００１９】
本出願人の教示の態様は、以下の実施例に照らせばさらに理解できるが、この実施例は、本出願人の教示の範囲をいかなる形でも制限しないものとして解釈されるべきである。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
この実施例に用いられる方法により、６つの化学種が４分未満のうちに検出された：エチルアルコール消費による複合化した尿中代謝産物である（１）エチルグルクロニドおよび（２）硫酸エチル、ならびにそれらのｄ５−重水素化された内部標準、「尿の濃さ」の指標であるクレアチニン、および内部標準としてのｄ３−重水素化クレアチニン。これらの代謝産物の濃度を尿１Ｌ当たりクレアチニン１ｇに正規化した。
【００２１】
例えば、較正溶液は、特注構成のＳｈｉｍａｄｚｕ前処理プログラムを用いて、尿中または溶媒中で標準が１：１で混合されているストック溶液を連続的に希釈することにより、自動的に調製した。尿はエチルグルクロニドのシグナルの急上昇を抑制できるので、未希釈の尿中の標準溶液からは、溶媒のみの中のシグナルと比較しておよそ１／１０〜１／１５のシグナルが得られる。ところが、１：１０希釈により、元のシグナルは回復される。この理由から、試料を希釈してマトリックス効果を低下させる必要があった。尿試料は、以下のように処理した：
図３および４に記載の要領で前処理プログラムを用いることにより人的過誤および可能性のある汚染を最低限に抑えながら、各尿試料（１００μＬ）を、内部標準を含有する溶液（８０％水＋２０％アセトニトリル）２００μＬおよびアセトニトリル７００μＬと混合した。図１は、１：１０希釈によりマトリックス抑制が低下する（応答対濃度）ことを示すものである。マトリックス抑制が存在すると、希釈された尿マトリックスの計算濃度（ピンク）は、基準マトリックス（青）中の試料の計算濃度を下回ることになると考えられるが、この実験においてはこうした事実はなかったことから、用いられる希釈の程度は、分析において妥当である。
【００２２】
以下の文献に従い、エチルグルクロニドおよび硫酸エチルの量をクレアチニンの量（１００ｍｇ／ｄＬまたは１，０００ｍｇ／Ｌ）に調節した：「Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｐｈａｔｅ − Ａ Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ − ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」、Ｓ． Ｄｒｅｓｅｎ、Ｗ． ＷｅｉｎｍａｎｎおよびＦ． Ｍ． Ｗｕｒｓｔ、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ． Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００４、１５巻、１６４４〜１６４８頁。この論文では代謝産物はクレアチニンに正規化されたもののクレアチニンは代替的な手法を用いて測定されたのに対し、本出願人の教示では、クレアチニンは、同じＬＣ−ＭＳ／ＭＳの実行を用いて代謝産物と同時に測定した。図２は、６つの分析対象物の構造を示すものである。
【００２３】
この試験用に使用した装置としては、以下から成るＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＩＬ−ＨＴ Ｄｕａｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる：ＣＢＭ−２０Ａ制御装置１台、ＬＣ−２０ＡＤポンプ４台、ＳＩＬ−２０ＡＣ自動サンプラー１台、ＦＣＶ−２０ＡＨ２バルブ２個付きのＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン１台およびＤＧＵ−２０Ａ３オンライン脱気装置１台。ラインから塩を投入している間、ＭＳ源に溶媒を送達するために、追加のポンプＬＣ−１０ＡＤｖｐおよび脱気装置ＤＧＵ１４Ａを使用した。この試験のために採用した質量分析計は、マルチプルリアクションモニタリングモード（ＭＲＭ）下で動作するＡＰＩ−３２００（商標）トリプル四重極システムであり、このシステムで、一連の前駆体および独特な断片のイオン対を回転順に次々にモニターした。以下に従い、化学種１つにつき最低２つのイオン対をモニターした：欧州のＧＬＰガイドライン「Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ １２ Ａｕｇｕｓｔ ２００２ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９６／２３／ＥＣ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ」、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、Ｌ２２１／１２、２００２年８月１７日、２００２／６５７／ＥＣ、ｆｏｒ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＭＳ／ＭＳ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。
【００２４】
試薬
クレアチニンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ”、製品番号Ｃ−４２５５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から入手可能であった。Ｄ３−クレアチニンは、Ｃ／Ｄ／Ｎ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ：製品番号Ｄ−３６８９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｎｉｓｏｔｏｐｅｓ．ｃｏｍ）から入手可能であった。エチルグルクロニド（ｄ０およびｄ５）は、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、８１１ Ｐａｌｏｍａ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ Ａ、Ｒｏｕｎｄ Ｒｏｃｋ、Ｔｅｘａｓ７８６６４、ＵＳＡから入手可能であった。エチル硫酸ナトリウム塩は、東京化成工業株式会社、東京都北区豊島６−１５−９（Ｅ０２７７）から入手可能であった。Ｄ５−硫酸エチルは、ｄ５−エタノール（Ｃ／Ｄ／Ｎ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．、製品番号Ｄ−１０８ １１６μＬ、１．９６ｍＭ）をリアクティバイアル中で硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号３８００７５、１０６μＬ、１．９３ｍＭ）に加えて、８０℃で６０分間加熱することにより合成した。それを水中で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、これを使用して標準溶液を調製した。ギ酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（製品番号Ｆ−２００）から入手可能であった。ギ酸は、ＥＭＤ（ＡｎａｌａＲ（登録商標）、９８〜１００％、製品番号Ｂ１０１１５）から入手可能であった。アセトニトリル（ＢＡＫＥＲ ＡＮＡＬＹＺＥＤ（登録商標）９０１７−０３）は、ＪＴ Ｂａｋｅｒから入手した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｑ １８ＭΩ脱イオン水を使用した。
【００２５】
ＨＰＬＣ法
ハイスループットな分析を実現するために、デュアルカラム液体クロマトグラフィーシステムを使用した。５番目のポンプがクリーン溶媒をＭＳに送る間、初期および後期のＬＣ溶出剤を排液槽（ｗａｓｔｅ）へよけるように、質量分析計に取り付けられた切替バルブ（ｄｉｖｅｒｔｅｒ ｖａｌｖｅ）も使用した。
【００２６】
移動相Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび第３すすぎ液溶液は、７０％アセトニトリル＋３０％水＋１０ｍＭギ酸アンモニウムから構成され、少量のギ酸を加えてｐＨが５．０に調節されたものを、流速０．３５ｍＬ／分で使用した（アイソクラチック）。ポンプ５は、同じ組成を使用した。第１すすぎ液は、８０％水＋２０％アセトニトリル＋５００ｎｇ／ｍＬのｄ５−エチルグルクロニド＋１００ｎｇ／ｍＬのｄ５−硫酸エチル＋１，５００ｎｇ／ｍＬのｄ３−クレアチニンから構成されていた。第２すすぎ液は、アセトニトリル（１００％）から構成されていた。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ＨＩＬＩＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）シリカ３ミクロン、３．０×１００ｍｍ、マッチングガードカラム付きであり、これを５０℃で加熱した。
【００２７】
図３および４は、自動較正溶液調製（１：１希釈）の前処理法を示すものである。
【００２８】
図５〜７は、試料を自動的にカラム１または２の上に注入でき（それぞれ図５および６）、バルブ配置により試料をよけて、化合物は溶出していないが尿マトリックスは溶出している時点で流入物をアセトニトリルに置き換えることができるようなシステム配置を示す。
【００２９】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステムおよび標準的な７０バイアルトレイを使用して、表１に示す自動試料希釈の前処理を自動的に行った。このプログラムを変更すれば、１０５バイアルトレイまたは１７５バイアルトレイを使用できる。
【００３０】
アルコール消費実験−バックグラウンド値
アルコール代謝産物の定量は、アルコール消費、典型的にはアルコール飲料の消費による指標として使用できる。特定の他の食品、医薬および器具は、それを使用した場合にも、代謝産物となり、アルコール飲料に由来する値を超え、それを上回る値を増やす可能性があると考えられるアルコールを含有する。アルコールを含有する医薬およびデザートの、エチルグルクロニド（Ｅｔ−Ｇ）および硫酸エチル（Ｅｔ−Ｓ）の値への影響の仕方を定量するため、志願者には、（１）病院で手を消毒するためのアルコールゲル、（２）Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎ（登録商標）咳止めシロップ、（３）口腔洗浄液、（４）ティラミスケーキ、（５）顔のクレンジング用布、（６）シェリーのトライフル、（７）アイリッシュコーヒー（クリーム入りのコーヒーに１杯の蒸留酒を入れたもの）、（８）肉の調理に使用する赤ワインおよび（９）ビールで照りを付けたハム（ｈａｍ ｗｉｔｈ ｂｅｅｒ ｇｌａｚｅ）を、すべて普通の使用法で使用するように依頼した。
【００３１】
使用または消費の前後に、尿試料を回収した。Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎ以外は、志願者の尿試料中で測定可能な量のＥｔ−ＧまたはＥｔ−Ｓは発見されなかった。Ｒｏｂｉｔｕｓｓｉｎを摂取してから２時間後および７時間後に回収した尿試料は、Ｅｔ−Ｓの増加を示したがＥｔ−Ｇの増加は示さなかった。
【００３２】
したがって、消費量が妥当である限り、この方法では偽陽性値は生じそうにない。
【００３３】
アルコール消費実験
多様な国における標準飲酒量を図８および９に示す。
【００３４】
航空会社のパイロット、機械オペレーター、アルコール離脱プログラムを受けている患者による多様な消費シナリオを模擬的に再現するために、以下の酒を食事と共に消費するよう志願者に依頼した。食事の選択は、各志願者の裁量に任せた。
【００３５】
（１）フランス産赤ワイン（２５０ｍＬ、アルコール含有量１２％）＋ポルトガル産赤ワイン（１００ｍＬ、１７．５％）を女性志願者が消費した。
【００３６】
（２）カナダ産ラガービール１本（３５５ｍＬ、５％）＋オンタリオ産赤ワイン（１．２Ｌ、１３．５％）を女性志願者が消費した。
【００３７】
（３）オンタリオ産ラガービール２本（７１０ｍＬ、５％）＋オンタリオ産白ワイン（１．２Ｌ、１３．５％）を男性志願者が消費した。
【００３８】
（４）ポーランド産ラガービール（Ｚｙｗｉｅｃ、５．５％、１Ｌ）を男性志願者が消費した。
【００３９】
（５）「アサヒ」ラガービール１缶（５００ｍＬ、５％）＋「月桂冠」日本酒４００ｍＬ（４００ｍＬ、１６％）を男性志願者が消費した。
【００４０】
（６）Ａｐｐｌｅｔｏｎホワイトジャマイカラム（２０％、１８０ｍＬ、２時間かけて）を男性志願者が消費した。
【００４１】
（７）フランス産赤ワイン（およそ５００ｍＬ、１２％）を男性志願者が消費した。
【００４２】
（８）Ｐｅｄｒａ９０、ブラジル産ラム（１００ｍＬ、３９％）を男性志願者が消費した。
【００４３】
（９）イングリッシュジン（５０ｍＬ、４０％）を男性志願者が消費した。
【００４４】
（１０）ポートワイン（１００ｍＬ、１８％）を女性志願者が消費した。
【００４５】
（１１）中国産もち米酒（４００ｍＬ、１４％）を男性志願者が消費した。
【００４６】
（１２）英国産Ｇｕｉｎｎｅｓｓビール（６００ｍＬ、５％）を男性志願者が消費した。
【００４７】
（１３）Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｒｉｓｈ Ｃｒｅａｍのオンザロック（およそ３００ｍＬ、１７％）を男性志願者が消費した。
【００４８】
（１４）シングルモルトのスコッチウィスキー（６０ｍＬ、４０％）を男性志願者が消費した。
【００４９】
（１５）テキーラ（１２５ｍＬ、４０％）を女性志願者が消費した。
【００５０】
アルコール飲料の消費前後に尿試料を回収した。体積を記録し、尿の一部をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に４℃で１５ｍＬの遠心管中に保存した。上記の要領で試料を分析し、尿中のエタノール代謝産物（硫酸塩およびグルクロニド）の濃度として、時間の経過と共にプロットした。これは、消費後、時間の経過に伴う代謝産物の生成を示すものである。図１０〜１３は、選択されたケースについての当該曲線を示すものである。尿中の代謝産物の濃度は、消費直後、測定可能に増加し、消費してから少なくとも２０時間後に正常に戻ることが示される。上昇した代謝産物の濃度は、消費の指標となる。濃度をクレアチニンに正規化するこの方法により、硫酸エチルおよびグルクロニドの減衰曲線間の良好な一致が示される。図１４は、尿体積および測定された代謝産物濃度が異なる場合のクレアチニンの変化を示すものである。
【００５１】
尿のエタノール代謝産物濃度の測定により、消費後の上昇したレベルを明らかにする一方、この濃度を消費体積に関連付けるためには、正規化された代謝産物の、尿排出量への物質収支、さらには、摂取された総エタノールから形成される代謝産物量への物質収支を求めることが必要である。
【００５２】
代謝されたエタノールの比率を評価するために、物質収支を調べた。ある例では、ビールおよび赤ワイン（エタノール１４１．８ｇ）の消費の１０１時間後、２３．８４ｍｇを超える硫酸エチルおよび７２．８６ｍｇのエチルグルクロニドが形成され、排出された。化学量論組成は以下のとおりである：
Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋Ｈ２ＳＯ４→Ｃ２Ｈ５ＯＳＯ３Ｈ
４６ ９８ １２６
４６：１２６＝１４１．８（ｇ）：Ｘ Ｘ＝（１２６／４６）×１４１．８（ｇ）＝３８８．４（ｇ）
（０．０２３８４ｇ）／（３８８．４ｇ）×１００＝０．００６１４（％）
同様に、エチルグルクロニドについては、
４６：２２２＝１４１．８（ｇ）：Ｙ Ｙ＝（２２２）／（４６）×１４１．８（ｇ）＝６８４．３（ｇ）
（０．０７２８６ｇ）／（６８４．３ｇ）×１００＝０．０１０６（％）
計算から、０．００６１％のエタノールが硫酸エチルに転換され、０．０１０６％のエタノールがエチルグルクロニドに転換され、尿の系中に排出されたことが示される。アルコールの大部分は二酸化炭素および水に転換されると言われている。
【００５３】
別の事例では、女性志願者がフランス産赤ワイン（２５０ｍＬ、１２％）およびポルトガル産ポートワイン（１００ｍＬ、１７．５％）を３０分ほどで消費した。
【００５４】
消費されたアルコールの合計量は３７．４７８グラムであった。４６．４５時間にわたり尿試料を回収し、各排出物の体積を測定および記録した。
【００５５】
導入されたアルコール：２５０ｍＬ×１２（％）／１００×０．７８９（ｇ／ｍＬ）＋１００ｍＬ×１７．５（％）／１００×０．７８９（ｇ／ｍＬ）＝３７．４８グラムのエタノール
検出された硫酸エチル１１．０９１ｍｇ…０．０１０％
男性志願者が冷えた「アサヒスーパードライ」ビール１缶（５００ｍＬ、５％）に続いて温かい「月桂冠」日本酒（４００ｍＬ、１６％）をおよそ２時間で消費した際に、正規化の重要性が例証された。
【００５６】
彼の系に導入された総エタノールは、５００×０．０５×０．７８９＋４００×０．１６×０．７８９＝７０．２１１ｇであった。
【００５７】
図１５および１６に示すように、彼のクレアチニン濃度および排尿体積（これは試料中の濃度に大きく影響する）は本試験の経過中に変化したことから、正規化の重要性が示唆された。
【００５８】
この実施例から、アルコール飲料を消費した後、アルコール消費の指標として、少なくとも消費２０時間後の尿中のエタノール代謝産物、エチルグルクロニドおよび硫酸エチルの量を測定することが可能であることが示された。多様な飲料および志願者をテストした。無意識なアルコール消費（例えば、咳止めシロップまたは食品からの）の効果を評価したところ、その効果はごくわずかであることが見出された。尿体積および尿の濃さへの正規化の効果は実証され、この正規化により良好な結果がもたらされることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法であって、前記試料がクレアチニンを含み、
（ｉ）所定量の少なくとも１つの内部標準を前記試料に加えるステップと、
（ｉｉ）重水素化クレアチニンを前記試料に加えるステップと、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのエタノール代謝産物、前記試料中の前記少なくとも１つの所定量の内部標準、前記重水素化クレアチニンおよび前記クレアチニンを検出および測定するステップと、
（ｉｖ）前記少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて前記試料中の前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、
（ｖ）前記重水素化クレアチニンの測定値を用いて前記試料中の前記クレアチニンの量を定量化するステップと、
（ｖｉ）前記クレアチニンの測定値を用いて前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が唾液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が哺乳動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出および測定するステップが質量分析計により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記質量分析計がトリプル四重極を備える、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの代謝産物がエチルグルクロニドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化エチルグルクロニドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの代謝産物が硫酸エチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化硫酸エチルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの内部標準を加える前に前記試料を希釈できる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
採取源中のアルコールの時間およびレベルを予測するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１６】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
採取源中のアルコールをモニターするための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１８】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
質量分析計を用いて採取源由来のエタノール代謝をモニターして前記採取源由来の試料を分析するためのシステムであって、前記試料が、前記採取源の身体状態の指標となるクレアチニンを含み、
（ｉ）前記試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈し、
（ｉｉ）所定量の内部標準を前記少なくとも１つの希釈された試料に加え、
（ｉｉｉ）重水素化クレアチニンを前記試料に加え、
（ｉｖ）少なくとも１つのエタノール代謝産物、前記試料中の前記少なくとも１つの内部標準、前記重水素化クレアチニンおよび前記クレアチニンを検出および測定し、
（ｖ）前記少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて前記試料中の前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化し、
（ｖｉ）前記重水素化クレアチニンの測定値を用いて前記試料中のクレアチニンの量を定量化し、および
（ｖｉｉ）前記クレアチニンの測定値を用いて前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化する
ように構成された制御装置を備えるシステム。
【請求項２０】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記採取源がヒトである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記質量分析計がトリプル四重極を備える、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記試料が尿である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記試料が唾液である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２５】
前記試料が血液／血漿である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのエタノール代謝産物がエチルグルクロニドである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化エチルグルクロニドである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのエタノール代謝産物が硫酸エチルである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化硫酸エチルである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの内部標準を加える前に前記試料が希釈される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３１】
試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するためのキットであって、前記試料がクレアチニンを含み、試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェック、取扱説明書およびそれらの組合せのうち少なくとも１つを備えるキット。
【請求項３２】
本明細書中および組み込まれている添付書類中に記載され、参照され、例示されまたは示される新規性の任意およびすべての特徴。
【請求項１】
試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化する方法であって、前記試料がクレアチニンを含み、
（ｉ）所定量の少なくとも１つの内部標準を前記試料に加えるステップと、
（ｉｉ）重水素化クレアチニンを前記試料に加えるステップと、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのエタノール代謝産物、前記試料中の前記少なくとも１つの所定量の内部標準、前記重水素化クレアチニンおよび前記クレアチニンを検出および測定するステップと、
（ｉｖ）前記少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて前記試料中の前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化するステップと、
（ｖ）前記重水素化クレアチニンの測定値を用いて前記試料中の前記クレアチニンの量を定量化するステップと、
（ｖｉ）前記クレアチニンの測定値を用いて前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が唾液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が哺乳動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出および測定するステップが質量分析計により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記質量分析計がトリプル四重極を備える、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの代謝産物がエチルグルクロニドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化エチルグルクロニドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの代謝産物が硫酸エチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化硫酸エチルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの内部標準を加える前に前記試料を希釈できる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
採取源中のアルコールの時間およびレベルを予測するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１６】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
採取源中のアルコールをモニターするための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１８】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
質量分析計を用いて採取源由来のエタノール代謝をモニターして前記採取源由来の試料を分析するためのシステムであって、前記試料が、前記採取源の身体状態の指標となるクレアチニンを含み、
（ｉ）前記試料を少なくとも１回、所定量だけ自動的に希釈し、
（ｉｉ）所定量の内部標準を前記少なくとも１つの希釈された試料に加え、
（ｉｉｉ）重水素化クレアチニンを前記試料に加え、
（ｉｖ）少なくとも１つのエタノール代謝産物、前記試料中の前記少なくとも１つの内部標準、前記重水素化クレアチニンおよび前記クレアチニンを検出および測定し、
（ｖ）前記少なくとも１つの内部標準の測定値を用いて前記試料中の前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を定量化し、
（ｖｉ）前記重水素化クレアチニンの測定値を用いて前記試料中のクレアチニンの量を定量化し、および
（ｖｉｉ）前記クレアチニンの測定値を用いて前記少なくとも１つのエタノール代謝産物の量を正規化する
ように構成された制御装置を備えるシステム。
【請求項２０】
前記採取源が哺乳動物である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記採取源がヒトである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記質量分析計がトリプル四重極を備える、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記試料が尿である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記試料が唾液である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２５】
前記試料が血液／血漿である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのエタノール代謝産物がエチルグルクロニドである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化エチルグルクロニドである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのエタノール代謝産物が硫酸エチルである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの内部標準が重水素化硫酸エチルである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの内部標準を加える前に前記試料が希釈される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項３１】
試料中の少なくとも１つのエタノール代謝産物を定量化および正規化するためのキットであって、前記試料がクレアチニンを含み、試料、重水素化された内部標準、較正標準、品質管理チェック、取扱説明書およびそれらの組合せのうち少なくとも１つを備えるキット。
【請求項３２】
本明細書中および組み込まれている添付書類中に記載され、参照され、例示されまたは示される新規性の任意およびすべての特徴。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５４０９１１（Ｐ２０１０−５４０９１１Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２６１２４（Ｐ２０１０−５２６１２４）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１７２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４３１４９
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００７５４５７）ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１７２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４３１４９
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００７５４５７）ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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