アレルギー処置用生ワクチン
【課題】アレルギー性疾患の予防および／または治療のための生ワクチンに使用できる形質転換乳酸菌を提供する。
【解決手段】 （１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを含むＤＮＡ分子を有する、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)またはストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属する形質転換細菌。
【解決手段】 （１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを含むＤＮＡ分子を有する、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)またはストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属する形質転換細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換乳酸菌、ダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。より詳しくは、本発明は、アレルギー性疾患の予防および／または治療のために使用できる形質転換乳酸菌、特にラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する乳酸菌、ダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヨーグルトは、ヨーグルトを消費する健常なヒトに病原性を示さない様々な細菌（しばしば、乳酸菌と称される）を含む。これらの細菌としては、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)、及びストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するものがある。これらの細菌によっては経口用の生ワクチンとして有用であると推測されてきた。例えば、非特許文献１を参照。
【非特許文献１】Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４４：１８３−１９２， １９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、このような経口用の生ワクチンが特定の疾患または症状の処置または予防に有効に使用できるという証拠はいままでなかった。
【０００４】
したがって、本発明は、上記事情をかんがみてなされたものであり、アレルギー性疾患の予防および／または治療のための生ワクチンに使用できる形質転換乳酸菌を提供することを目的とするものである。
【０００５】
本発明の他の目的は、このような形質転換乳酸菌を用いたチリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、タンパク質由来のアレルゲンを発現する組み換え乳酸菌が動物モデルにおいてそのアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを誘導できることを知得した。また、本発明者らは、このようなトレランスは、アレルゲンの暴露に関連する症状である、機能再亢進(hyperreactivity)及び炎症を十分抑制できることをも知得した。このような知見に基づいて、本発明を達成した。
【０００７】
したがって、本発明の第一は、（１）タンパク質由来のアレルゲン(protein allergen)をコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結される(operably linked)（即ち、該アレルゲンを発現するように配置される）プロモーターを含むＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌に関するものである。
【０００８】
本発明において、乳酸菌は、特に制限されるものではなく、公知の乳酸菌が使用できる。具体的には、本発明で使用できる乳酸菌としては、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属するもの、例えば、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)、ラクトバチルス カゼイ(L. casei)、ラクトバチルス プランタルム(L. plantarum)、発酵乳酸杆菌(L. fermentum)、ラクトバチルス デルブリュッキー(L. delbrueckii)、ラクトバチルス ジョンソニー ＬＪＩ(L. johnsonii LJI)、ラクトバチルス ルーテリ(L. reuteri)、及びラクトバチルス ブルガリクス(L. bulgaricus)；ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するもの、例えば、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)；ならびにビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属するもの、例えば、ビフィドバクテリウム インファンチス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム ロングム(B. longum)、ビフィドバクテリウム プソイドロングム(B. pseudolongum)、ビフィドバクテリウム ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム ラクティス Ｂｂ−１２(B. lactis Bb-12)、及びビフィドバクテリウム アドレッセンティス(B. adolescentis)などが挙げられる。また、乳酸菌は、Salminen et al. Br. J. Neutr. 80:147-171, 1998に記載されるような共生体(probiotics)である、ラクトバチルス ＧＧ(Lactobacillus GG)であってもよい。これらの乳酸菌のうち、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属するもの、特にラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、及びストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するもの、特にストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)が好ましく使用される。
【０００９】
本発明において、アレルゲンは、どのようなアレルゲンでもよく特に制限されるものではない。具体的には、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(D. farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(D. microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(L. destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei)、及びビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)等の一般的なチリダニ(dust mite)由来のアレルゲン；ならびに花粉、カビ、動物のフケ、及び昆虫などの他の空中を浮揚するアレルゲン（空中アレルゲン）などが挙げられる。これらのうち、チリダニ由来のアレルゲン、より好ましくはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンが、本発明におけるアレルゲンとして好ましく使用される。また、アレルゲンは、タンパク質（ポリペプチド）由来のアレルゲンであることが好ましい。この際、チリダニ由来の様々なタンパク質（ポリペプチド）由来のアレルゲンが同定されており、例えば、Ｄｅｒ ｐ １またはＤｅｒ ｐ ２、及びＤｅｒ ｐ ５タンパク質などのアレルゲンをコード化する遺伝子がクローニングされており、これらを本発明においてタンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列として好ましく使用できる。これらのアレルゲンのうち、チリダニ由来のアレルゲン、より好ましくはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲン、特に好ましくはＤｅｒ ｐ ５アレルゲンが本発明で好ましく使用される。
【００１０】
なお、本発明で特に好ましく使用されるＤｅｒ ｐ ５アレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)のグループ（Ｄｅｒ ｐ）アレルゲンのうちの一つであり、そのアミノ酸配列は、下記のとおりである（また、Lin et al. (1994) J Allergy Clin Immunol 94:989-96をも参照）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明において、細菌中でアレルゲンを発現させるのに使用できるプロモーターは、細菌細胞で所望のアレルゲンの発現を指示できるものであれば特に制限されるものではないが、一般的には構成プロモーター(constitutive promoter)である。このようなプロモーターとしては、例えば、エリストマイシン耐性プロモーター、ＩｄｈＬプロモーター、及びＰ２５プロモーターなどが挙げられる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の形質転換乳酸菌を被検者に投与し、さらにアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを被検者で誘導するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することによって、アレルゲンに暴露される被検者（例えば、ヒト等の哺乳動物）におけるＩｇＥの産生の抑制方法を包含するものである。
【００１４】
したがって、本発明の第二は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。また、本発明の第三は、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。
【００１５】
本発明において、トレランスは、次にアレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制することを包含する。なお、本明細書において、「トレランス(tolerance)」は、哺乳動物が一つのアレルゲンまたは複数のアレルゲンに暴露された際に過敏な免疫反応を有さない状態として定義される。
【００１６】
さらに、本発明は、本発明の形質転換乳酸菌を被検者に投与し、さらに、次にアレルゲンに暴露される際の被検者の気管支肺の鬱血を和らげる（即ち、測定可能な量で抑制する）のに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することによって、アレルゲンに暴露される被検者（例えば、ヒト等の哺乳動物）における気管支肺の鬱血の緩和方法を包含するものである。
【００１７】
したがって、本発明の第四は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【００１８】
本発明において、アレルゲンを発現する細菌の投与経路は特に制限されず、細菌（乳酸菌）は、通常、一般的な経路で、例えば、経口で、舌下に、または鼻腔内に、投与されるが、好ましくは経口で投与される。
【００１９】
また、細菌は、ヨーグルトまたはヨーグルト組成物として投与されることが好ましい。
【００２０】
本明細書において、「乳酸菌(lactic acid bacterium)」は、工業的な食品発酵においてその使用が、さらにはその共生特性(probiotic properties)がよく知られているグラム陽性細菌を意味する。なお、本明細書では、乳酸菌を「ＬＡＢ」とも称する。本発明のＬＡＢ及び方法は、アレルギー、特にチリダニに対するアレルギーに対する安全なワクチンを提供するのに使用できる。一般的な人々によって定期的にかつ安全に消費される細菌を使用しているため、このような高い安全性が得られる。
【００２１】
本明細書において、「アレルゲン」ということばは、タイプＩ中間超過敏反応(Type I intermediate hypersensitivity reaction)を引き起こす物質として定義される。
【００２２】
また、本明細書において、「空中アレルゲン」ということばは、少なくとも下記特性、即ち、活性レアギン反応を誘発する特異的な抗原系列、及び感受性のある被検者での明らかな組織の変化を引き起こしうるような周囲の暴露レベルを有するものとして定義される。空中アレルゲンは、呼吸器系の、皮膚の、または結膜のアレルギーを引き起こしうる空中を浮揚する粒子である。例えば、ブタクサの花粉の水溶性画分は呼吸器系及び結膜の粘膜に作用し、また、ブタクサの花粉の脂溶性アレルゲンは接触した皮膚に一般的な接触性皮膚炎を引き起こしうる。
【００２３】
本明細書において、「共生体(probiotic)」は、宿主の固有のミクロフローラを改善することによって宿主の健康状態に好ましい影響を与える生きた微生物である。生育しうる細菌株を共生体として分類するための一致した選択基準は存在しない。共生細菌及び特定の株を単離、規定するために使用される一般的な基準としては下記がある：（ｉ）ヒトを源とした属；（ｉｉ）胆汁、酸、酵素及び酸素に対する安定性；（ｉｉｉ）腸粘膜への付着能；（ｉｖ）ヒトの胃腸管における集落形成の潜在能力；（ｖ）抗菌物質の産生；および（ｖｉ）明白な有効性及び安全性。
【００２４】
本明細書において、「ヨーグルト」または「ヨーグルト組成物」は、ラクトバチルス ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)及びストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)によってミルク中に乳酸を発酵して得られる凝固ミルク製品として規定される。
【００２５】
本明細書において、「形質転換」ということばは、細胞中に技術によって挿入され、その細胞から発達する生物体のゲノムの一部となるＤＮＡ配列を含む細胞として定義される。
【００２６】
また、本明細書において、「プロモーター」ということばは、例えば、細胞中の異種配列に操作により連結された際に、少なくとも一つの状況(context)で転写を指示する(direct)ことができるヌクレオチド配列をいう。換言すると、プロモーターは、プロモーター配列が異なる状況(context)で異種配列の上流に位置した際の転写を指示できる限り、転写する下流の配列なしで存在できる。
【００２７】
本明細書において、「被検者」ということばは、ヒト及び非ヒト動物を包含するものである。被検者としては、具体的には、アレルギー疾患を有する患者などの、ヒトがある。
【００２８】
このような本発明によって処置できるアレルギー疾患としては、鼻炎、副鼻腔炎、喘息、過敏性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、結膜炎、じんま疹、湿疹、皮膚炎、アナフィラキシー、血管性浮腫、アレルギー性頭痛及び片頭痛、ならびにＩｇＥが仲介するアレルギーが関わる胃腸系疾患などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２９】
なお、本発明の他の態様または利点は詳細な説明や特許請求の範囲の記載から明らかであろう。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌；Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌またはストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)；（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌または乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法；（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法；ならびにチリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【００３１】
本発明の形質転換乳酸菌は、動物モデルにおいてアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを誘導でき、ゆえにアレルギー性疾患を治療および／または予防のために処置するためのワクチンとして使用できる。また、本発明の形質転換乳酸菌により誘導されるトレランスは、アレルゲンの暴露に関連する２種の症状である、機能再亢進及び炎症を抑制するため、本発明の形質転換乳酸菌は、気道の炎症または機能亢進の処置に、さらにはアレルゲンに暴露された被検者におけるＩｇＥの産生の抑制に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、一以上のタンパク質由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を用いた生アレルゲンワクチンに関するものである。すなわち、本発明の第一は、（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌に関するものである。本発明の第二は、Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌に関するものである。本発明の第三は、Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌に関するものである。本発明の第四は、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第五はチリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第六は、（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第七は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。なお、適当なタンパク質由来のアレルゲン、乳酸菌、または適当なプロモーター等の発現ベクターの使用は、本発明の概念に含まれる。
【００３３】
本発明において、特定のアレルギーを処置するために発現される特異的なアレルゲンは、望ましくない免疫反応がタンパク質アレルゲンを標的にしているか否かに依存するであろう。免疫反応の引き金になるタンパク質アレルゲンを同定すれば、当業者は、アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列をミルクに特異的な発現ベクター中にクローニングすることができる。この発現ベクターは、さらに、乳酸菌中に導入された後、次に起こるべき症状（例えば、皮膚の炎症または気管支肺の炎症）を改善するまたは予防するために個体に投与される。
【００３４】
本発明において、このようなアレルゲンは、どのようなアレルゲンでもよく、特に制限されるものではない。具体的には、上記したのと同様である。
【００３５】
ここで、気道の機能再亢進を評価、定量するための実験的なプロトコルを以下に説明する。なお、気管支肺の炎症を評価する他の方法は当該分野において既知である。アレルギー性喘息は、気道の機能再亢進及び炎症の双方の特徴を有する。気道の機能再亢進は肺のテスト（侵襲性または非侵襲性方法）の変化によって測定できる。また、気道の炎症は、気道の炎症細胞、特に好酸球及び好中球の浸潤によって、および病理の変化によって測定できる。
【００３６】
場合によっては、単一のタンパク質由来のアレルゲンを同定する必要がない場合もある。例えば、単一の源由来の複数のタンパク質アレルゲンを、その源に対する免疫学的なトレランスを誘導する（例えば、様々なアレルギー性タンパク質から構成される、貝などの、食物に対するアレルギーを処置する）のに使用できる。このような複数のアレルゲンは、（一以上のＤＮＡベクターを用いて）同一の細菌内で、または異なる細菌内で発現させることができるが、この際、それぞれは同一の源由来の異なるアレルゲンを発現する。このような状況下では、当業者は、別々のアレルゲン源やその源に存在する２以上のアレルギー性タンパク質を知ればよいのである。
【００３７】
乳酸菌は、遺伝子操作をすることができ、また、異種タンパク質を発現させることができる限り、特に制限されることなく、いずれの乳酸菌をも本発明において使用できる。例えば、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する幾つかの適当な種が、Pouwels et al., J. Biotechnol. 44:183-192, 1996に記載される。
【００３８】
本発明において、乳酸菌は、特に制限されるものではなく、公知の乳酸菌が使用できる。具体的には、上記したのと同様である。
【００３９】
本明細書に記載される実験的な知見により、乳酸菌（ＬＡＢ）中に発現ベクターを確立することができた。最も一般的な発現ベクターは、ＬＡＢでは適当ではない。これは、幾つかのプロモーターのみがＬＡＢ中で作動できるからである。これらのプロモーターは、構成プロモーターであることが好ましい、即ち、遺伝子によってコード化されたアレルゲンの発現を構成的に誘導(constitutively drive)できることが好ましい。このようなアレルゲン遺伝子は、臨床上重要なアレルゲン、特に空中アレルゲンであってもよい。本発明は、アレルゲンに特異的なＩｇＥの合成を抑制することによってアレルギー性の炎症をダウンレギュレーションすることができる。したがって、本方法は、ＩｇＥが仲介するアレルギー疾患を処置することができる。本発明において、生ワクチンは、ヨーグルト等の消費可能なまたは食用の形態を有する一以上の共生体を含んでもよい。
【００４０】
本発明において、細菌中でアレルゲンを発現させるのに使用できるプロモーターは、細菌細胞で所望のアレルゲンの発現を指示できるものであれば特に制限されるものではないが、一般的には構成プロモーター(constitutive promoter)であり、例えば、エリストマイシン耐性プロモーター、ＩｄｈＬプロモーター、及びＰ２５プロモーターなどが挙げられる。
【００４１】
アレルゲンのさらなる討論及びこれらの生理学的な効果に関しては、Aas et al., Allergy 33:3, 1978; Goldin et al., Br. J. Nut. 80:S203-S207, 1998; 及び Kailasapathy et al., J. Immunol. Cell Biol. 78:80-88, 2000を参照。
【００４２】
さらに詳述するものではないが、当業者は、上記開示及び下記に記載される形質転換ミルクを用いた有効な処置の開示に基づいて、本発明を十分使用できるものである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。下記実施例は、当業者がどのようにして生細菌ワクチンを生産する形質転換動物を製造、使用するかを単に詳細に説明するものであり、本発明を制限するものではない。ここで開示されるすべての文献、公報などは参考のためにここに引用される。
【００４４】
実施例１
１．方法および材料
＜ＤＮＡの操作＞
ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)及びラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)中でＤｅｒ ｐ ５を発現させるためのプロモーターを得るために、２種のＤＮＡ断片をＰＣＲによって形成した。このＰＣＲに使用されたプライマーは下記のとおりであった。プライマーＰＵＣ１２３３は、ｐＬＰ３５３７における４１１９〜４０９６番目のヌクレオチドに相補的であり、配列：ＣＴＴＡＣＧＴＣＡ ＣＧＴＣＴＴＧＣＧＣ（配列番号１）を有する。なお、ｐＬＰ３５３７及びそのヌクレオチドの番号は、Posno et al., Appl. Env. Microbiol. 57:2764,2766, 1991に記載される。また、プライマーｐＳＤは、ｐＬＰ３５３７の３６５８〜３６７９番目のヌクレオチドと同じであり、配列：ＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴ ＴＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧ（配列番号２）を有する。プライマーｐＳＤの５’末端にさらに６個のヌクレオチドを設計して、得られたＰＣＲ断片中にＢｇｌＩＩ部位を作製した。
【００４５】
各ＰＣＲ反応混合物は、約０．１μｇのプラスミドｐＬＰ３５３７、０．２５μｇの各プライマー、０．２ｍＭのデオキシリボヌクレオシド３リン酸、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含んだ。増幅は、ミニサイクラー(MiniCycler)(MJ Research; Watertown, MA)を用いて、９４℃で１分間、５５℃で２分間、及び７２℃で２分間を３０サイクル行なった。これらの反応によって、プライマーを含む０．４ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（プライマーｐＳＤ中に存在する部位）及びＢｇｌＩＩで処理し、アガロースゲルで精製した。これらのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで直線状にされたプラスミドｐＬＰ３５３７及びｐＣＭＶＤの４０５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ断片と連結した。なお、ｐＣＭＶＤは、Hsu et al., Nature Medicine 2:540-544, 1996に記載される。このようにして得られたプラスミドｐＳＤＤｅｒｐ５は、Ｄｅｒ ｐ ５をコード化するｃＤＮＡ配列に融合した断片を含み、これを増幅した。
【００４６】
＜形質転換＞
細菌株に、Walker et al., FEMS Microbiol. Lett. 138:233-237, 1996に記載される方法を用いてエレクトロポレーションによって形質転換した。このようにしてｐＳＤＤｅｒｐ５が形質転換された乳酸菌について、形質転換されたラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)では「ＬＡ−ｇｍ」と、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)では「ＳＴ−ｇｍ」と、それぞれ、称した。形質転換されなかった細菌は、それぞれ、「ＬＡ」及び「ＳＴ」と称した。
【００４７】
＜細菌の培養＞
ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)（ＡＴＣＣ ４３５６）を、ＭＲＳブロス及び寒天で３７℃で培養した。大腸菌株ＤＨ５α(E. coli strain DH5α)は、ＬＢブロス及び寒天で３７℃に維持した。抗生物質であるアンピシリン及びエリスロマイシンをSigma (St. Louis)より購入した。大腸菌(E. coli)の選択のために、アンピシリン及びエリスロマイシンを、それぞれ、５０μｇ／ｍｌ及び５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。また、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)の選択では、エリスロマイシンを５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。さらに、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)（これもＡＴＣＣから得た）を、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)の場合と同様にして、培養、処理した。
【００４８】
＜動物の研究＞
６及び８週齢の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、College of Medicine, National Taiwan University (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME.から創設)の動物飼育センター(animal-breeding center)から得た。これらのマウスを各実験用に６群に分けた（表１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】
Lin et al., J. Allergy Clin. Immunol. 94:989-996, 1994に記載されるのと同様にして精製された組み換えＤｅｒ ｐ ５ １０μｇを腹腔内に注射することによって、動物を能動的に感作した。マウスには、２週間にわたって、毎週３日間、ＬＡ−ｇｍまたはＳＴ−ｇｍ ＬＡＢを経口摂取させた。感作してから２１日目に、動物に、２０分間、０．１％のＤｅｒ ｐ ５−グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質をまたはＰＢＳのエアロゾルを暴露した。吸入によるチャレンジから８時間後に、肺の耐性を５０分間測定し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び血清を集めた。
【００５１】
＜Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａ及びＩｇＥの測定＞
Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａ及びＩｇＥの量を、Hsu et al., Int. Immunol. 8:14051411, 1996に記載されるのと同様にしてＥＬＩＳＡによって測定した。タンパク質結合プレートを、Hsu et al., Nature Medicine 2:540-544, 1996に記載されるのと同様にして、コーティングバッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．２）における精製Ｄｅｒ ｐ ５溶液（５μｇ／ｍｌ）１００μｌで被覆した。４℃で一晩、インキュベートした後、プレートを３回洗浄して、２５℃で２時間、ＰＢＳにおける３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングした。試験動物の血清を、ＩｇＧの測定用では１：１００に、また、ＩｇＥの測定用では１：１０に、それぞれ、希釈した。各サンプルを２連で分析した。４℃で一晩、インキュベートした後、ビオチン共役ラット抗マウスＩｇＥ(biotin-conjugated rat anti-mouse IgE)(Pharmingen, San Diego, CA)またはラット抗マウスＩｇＧ２ａ(Pharmingen)のいずれかを０．０５％ゼラチンバッファーで希釈し、さらに１時間かけて、各試験ウェルに添加した。アビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)を１：１０００に希釈し、ウェルに添加して、２５℃で１時間、インキュベートした。次に、これらのウェルを６回洗浄した。
【００５２】
呈色反応を、ｐ−ニトロフェニルホスフェート２ナトリウム(p-nitrophenylphosphate, disodium)(Sigma)を添加することによって発色させた。プレートを、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー(microplate reader)(Metertech, Taiwan)で読んだ。読み取りは、４ｍｇの水酸化アルミニウムにおける１０μｇのＤｅｒ ｐ ５を初めに腹腔内に注射し、同じ投与量及び配合で２１日目に追加投与した(boost)、６匹のマウスから集めた標準血清を参考にした。この標準シグナル（抗体の応答に関するポジティブコントロール）を、１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌに標準化した（図１参照）。
【００５３】
＜気道の応答性を測定するための非侵襲性の方法＞
気圧計による全身の体積変動記録法(barometric whole body plethysmography)（ＷＢＰ）(Buxco, Troy, NY, USA)を用いて、意識のある、拘束されていないマウスにおける吸入されたメタコリンに対する応答を、Hamelmann et al., Am. J. Respir. crit. Care Med. 156:766-775, 1997に記載されるのと同様にして、測定した。メタコリンは、気道の耐性を向上することが知られている薬剤である。読み取る前に、メインのチャンバー中に１ｍｌの空気を迅速に注入して、ボックスを較正し、ＷＢＰから１ｍｖのシグナルを得た。ボックスの圧力(box pressure)／時間の曲線が０ポイントを横切ったら、吸気をスタートとし呼気を終わりとすることを確立することによって、吸気及び呼気を記録した。吸気の開始を、ボックスの圧力シグナルの上昇吸気相の２レベルから得られる直線から外挿することによって決定した。吸気の時間（ＴＩ）を、吸気の開始から吸気の終了までの時間として規定した；また、呼気の時間（Ｔｅ）を、吸気の終了から次の吸気の開始までの時間として規定した。ネガティブまたはポジティブな方向で１回の呼吸中に生じる最大のボックス圧力シグナルは、それぞれ、ピーク吸気圧力(peak inspiratory pressure)（ＰＩＰ）またはピーク呼気圧力(peak expiratory pressure)（ＰＥＰ）として規定された。１０回の呼吸毎の記録を外挿して、１分当たりの呼吸の呼吸数を規定した。休止時間（Ｔｒ）を、全体の呼気の圧力シグナル（呼気中のボックス圧力シグナル下での領域）の３６％に到達する時間として規定した。この閾値は、受動的な呼気でのピーク容積の３６％減衰に対する容積シグナルの減衰の時間定数の相間関係として機能する。Ｐａｕｓｅ及び向上した休止(enhanced pause)（Ｐｅｎｈ）は、下記式によって規定、算出される。
【００５４】
【数１】
【００５５】
気道の応答性の指数として、Ｐｅｎｈの増加を測定した。マウスを得て、３分間、平均をとった(average)。ガス形成した生理食塩水(aerosized saline)を、メタコリンの濃度を上げた（１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲）後、ネブライザーで噴霧し、３分間、吸収させた。各噴霧後に、読み取りを行なった後、３分間、平均をとった。気道の応答性は、メタコリンの投与毎のＰｅｎｈとして表わした。
【００５６】
＜気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるサイトカインの評価＞
上記したのと同様にして肺の機能を測定した後、マウスにカニューレを挿入して、気管切開により導入されたポリエチレンチューブにより０．９％滅菌生理食塩水の０．５ｍｌのアルコートで５回、洗浄した。この洗浄液を遠心（４℃で１０分間、５００ｇ）して、細胞ペレットを０．５ｍｌのハンクス液中に再懸濁した。９０μｌの０．４％トリパンブルーに１０μｌの細胞懸濁液を添加し、ニューバウアーチャンバー(Newbauer chamber)内で光学顕微鏡で計測することによって、全細胞数を得た。識別した細胞の計測を、ロイ染色(Leu's stain)によって染色されたサイトスピン(cytospin)調製物から行なった。細胞を同定し、標準的な形態学的な差異を肉眼で検査することによって、好酸球、リンパ球、好中球、及びマクロファージに分類した。５００個の細胞を４００倍の倍率で計測して、各細胞型の割合（％）及び絶対数(absolute number)を算出した。
【００５７】
ＢＡＬＦ中のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、組み換えサイトカインに関する標準曲線を用いてｐｇ／ｍｌで表わした。捕捉及びビオチン化に関するモノクローナル抗体(monoclonal Ab)は、下記のとおりであった：Ｒ４−６Ａ２（ＩＮＦ−γに関する捕捉抗体(capture antibody)の名称）及びＸＭＧ１．２（ＩＮＦ−γに関するビオチン化の名称）、これらは、PharMingen, San Diego, CAより市販；ならびに１１Ｂ１１（ＩＬ−４に関する捕捉抗体(capture antibody)の名称）及びＢＶＤ６（ＩＬ−４に関するビオチン化の名称）、これらは、PharMingenより市販。なお、検出限界は、１８ｐｇ／ｍｌであった。
【００５８】
＜統計学的分析＞
ＡＮＯＶＡを行ない、群間の相違を比較した。分散分析後、ダンカン複数範囲テスト(Duncan multiple range test)を用いて、実験群及びコントロール群間の相違を識別した。ｐ＜０．０５を用いて、統計学上有意な相違を示した。
【００５９】
２．結果
＜インビボでのアレルゲンに特異的なＩｇＥ応答の阻害＞
賦形剤（非組み換え細菌）、ｐＳＤＤｅｒｐ５を形質転換された細菌、及び組み換えＤｅｒ ｐ ５を投与されたマウスを、１週間、アレルゲンとしてのＤｅｒ ｐ ５で腹腔内で感作した後、感作してから３週間目に吸入によりワクチンを投与、チャレンジした。アレルゲンのチャレンジから３週間目の血清における抗Ｄｅｒ ｐ ５ ＩｇＥの存在を、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。これらの結果を図１に要約する。Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥは、賦形剤で処置した群に比して有意に増加した。これに対して、ｐＳＤＤｅｒｐ５で処置したマウスは、Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの合成を８０％以上阻害していることが示された。別の実験で、Ｄｅｒ ｐ ２をチャレンジしたｐＳＤＤｅｒｐ５処置マウスは依然としてＤｅｒ ｐ ２に特異的なＩｇＥを産生していたことから、遺伝子により修飾された乳酸菌によるＩｇＥ合成の阻害はＤｅｒ ｐ ５アレルゲンに特異的であることが分かった。したがって、アレルゲンを発現する乳酸菌を直接経口摂取することによって、アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生は効率良く阻害できた。さらに、このような抑制効果は、組み換えアレルゲン単独（図１におけるＣ群参照）の経口摂取に比べて非常に優れており、また、ワクチンに組み換えアレルゲンを含ませても、アレルゲンを発現する細菌単独を経口投与する効果を測定可能なレベルには向上しなかった（図１におけるＢ群及びＤ群を比較）。なお、実験群の中でＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａの産生の有意な差異は認められなかった。
【００６０】
＜インビボでの気道の機能再亢進（ＡＨＲ）の抑制＞
生乳酸菌ワクチンの効能及び特異性を気道（気管支肺）の機能再亢進の測定を用いて評価した。ガス形成したメタコリンに対する気道の応答性を、意識のある、拘束されていないマウスで最後の吸入によるチャレンジを行なってから８時間、インビボで測定した。すべてのマウスについて、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲のメタコリンに対して完全な用量反応曲線(dose-response)が得られた。すべてのマウス群で、基礎的なＰｅｎｈ値及び生理食塩水エアロゾル誘導Ｐｅｎｈ値において、有意な差異は認められなかった。ネガティブなワクチンコントロール動物（Ａ群、Ｃ群、及びＥ群）では、Ｄｅｒ ｐ ５によるチャレンジによって、ベースラインに比してメタコリンに対する気道の応答性の有意な上昇が誘導された。これに対して、ＬＡ−ｇｍまたはＳＴ−ｇｍによる処置（Ｂ群、Ｄ群、及びＦ群）では、１０〜１００ｍｇ／ｍｌのメタコリンの投与量で、ＡＨＲが有意に阻害された（図２）。したがって、Ｄｅｒ ｐ ５で誘導されるＡＨＲは、アレルゲンを発現する乳酸菌の投与によって、排除できる。
【００６１】
メタコリンによるチャレンジ後の気道の耐性の向上は、気道の機能亢進(hyperactivity)と相間する。細胞の浸潤（例えば、好中球及び好酸球の浸潤）の増加は、気道の炎症と相間する。気道の機能亢進及び炎症は双方とも、アレルギー性喘息の特徴である。
【００６２】
＜気管支肺の細胞数に関するワクチン効果＞
チャレンジ後の気管支肺洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞数を、アレルゲンの暴露に応答した気管支肺管への細胞浸潤の測定結果として用いた（図３）。アレルゲンを発現する細菌を投与した動物（Ｂ群及びＤ群）のＢＡＬＦにおける好酸球及び好中球の数は、賦形剤で処置したＡ群及び組み換えアレルゲンで処置したＣ群に比して、有意に少なかった。マクロファージ及びリンパ球の数は、これらの実験群で有意な差異は認められなかった。したがって、Ｄｅｒ ｐ ５のチャレンジによって好酸球及び好中球の浸潤が誘導されるが、このような浸潤は生乳酸菌ワクチンによって有意に阻害できることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】は、アレルゲンでチャレンジされた様々な動物群におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥ及びＩｇＧを示す棒グラフである。この際、動物群Ａ〜Ｆの組成を表１に示す。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の統計学的な有意性を表わす。
【図２】は、異なるワクチンを投与され、様々な濃度のメタコリン（Ｍｃｈ）で処置された動物のＰｅｎｈを示す棒グラフである。この際、値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５の統計学的な有意性を表わす。
【図３】は、異なるワクチンを投与され、アレルゲンをチャレンジされた動物における様々な型の白血球の数を示す棒グラフである。この際、値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５の統計学的な有意性を表わす。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換乳酸菌、ダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。より詳しくは、本発明は、アレルギー性疾患の予防および／または治療のために使用できる形質転換乳酸菌、特にラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する乳酸菌、ダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヨーグルトは、ヨーグルトを消費する健常なヒトに病原性を示さない様々な細菌（しばしば、乳酸菌と称される）を含む。これらの細菌としては、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)、及びストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するものがある。これらの細菌によっては経口用の生ワクチンとして有用であると推測されてきた。例えば、非特許文献１を参照。
【非特許文献１】Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４４：１８３−１９２， １９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、このような経口用の生ワクチンが特定の疾患または症状の処置または予防に有効に使用できるという証拠はいままでなかった。
【０００４】
したがって、本発明は、上記事情をかんがみてなされたものであり、アレルギー性疾患の予防および／または治療のための生ワクチンに使用できる形質転換乳酸菌を提供することを目的とするものである。
【０００５】
本発明の他の目的は、このような形質転換乳酸菌を用いたチリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法及び気管支肺の鬱血の緩和方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、タンパク質由来のアレルゲンを発現する組み換え乳酸菌が動物モデルにおいてそのアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを誘導できることを知得した。また、本発明者らは、このようなトレランスは、アレルゲンの暴露に関連する症状である、機能再亢進(hyperreactivity)及び炎症を十分抑制できることをも知得した。このような知見に基づいて、本発明を達成した。
【０００７】
したがって、本発明の第一は、（１）タンパク質由来のアレルゲン(protein allergen)をコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結される(operably linked)（即ち、該アレルゲンを発現するように配置される）プロモーターを含むＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌に関するものである。
【０００８】
本発明において、乳酸菌は、特に制限されるものではなく、公知の乳酸菌が使用できる。具体的には、本発明で使用できる乳酸菌としては、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属するもの、例えば、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)、ラクトバチルス カゼイ(L. casei)、ラクトバチルス プランタルム(L. plantarum)、発酵乳酸杆菌(L. fermentum)、ラクトバチルス デルブリュッキー(L. delbrueckii)、ラクトバチルス ジョンソニー ＬＪＩ(L. johnsonii LJI)、ラクトバチルス ルーテリ(L. reuteri)、及びラクトバチルス ブルガリクス(L. bulgaricus)；ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するもの、例えば、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)；ならびにビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属するもの、例えば、ビフィドバクテリウム インファンチス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム ロングム(B. longum)、ビフィドバクテリウム プソイドロングム(B. pseudolongum)、ビフィドバクテリウム ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム ラクティス Ｂｂ−１２(B. lactis Bb-12)、及びビフィドバクテリウム アドレッセンティス(B. adolescentis)などが挙げられる。また、乳酸菌は、Salminen et al. Br. J. Neutr. 80:147-171, 1998に記載されるような共生体(probiotics)である、ラクトバチルス ＧＧ(Lactobacillus GG)であってもよい。これらの乳酸菌のうち、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属するもの、特にラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、及びストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属するもの、特にストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)が好ましく使用される。
【０００９】
本発明において、アレルゲンは、どのようなアレルゲンでもよく特に制限されるものではない。具体的には、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(D. farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(D. microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(L. destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei)、及びビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)等の一般的なチリダニ(dust mite)由来のアレルゲン；ならびに花粉、カビ、動物のフケ、及び昆虫などの他の空中を浮揚するアレルゲン（空中アレルゲン）などが挙げられる。これらのうち、チリダニ由来のアレルゲン、より好ましくはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンが、本発明におけるアレルゲンとして好ましく使用される。また、アレルゲンは、タンパク質（ポリペプチド）由来のアレルゲンであることが好ましい。この際、チリダニ由来の様々なタンパク質（ポリペプチド）由来のアレルゲンが同定されており、例えば、Ｄｅｒ ｐ １またはＤｅｒ ｐ ２、及びＤｅｒ ｐ ５タンパク質などのアレルゲンをコード化する遺伝子がクローニングされており、これらを本発明においてタンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列として好ましく使用できる。これらのアレルゲンのうち、チリダニ由来のアレルゲン、より好ましくはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲン、特に好ましくはＤｅｒ ｐ ５アレルゲンが本発明で好ましく使用される。
【００１０】
なお、本発明で特に好ましく使用されるＤｅｒ ｐ ５アレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)のグループ（Ｄｅｒ ｐ）アレルゲンのうちの一つであり、そのアミノ酸配列は、下記のとおりである（また、Lin et al. (1994) J Allergy Clin Immunol 94:989-96をも参照）：
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明において、細菌中でアレルゲンを発現させるのに使用できるプロモーターは、細菌細胞で所望のアレルゲンの発現を指示できるものであれば特に制限されるものではないが、一般的には構成プロモーター(constitutive promoter)である。このようなプロモーターとしては、例えば、エリストマイシン耐性プロモーター、ＩｄｈＬプロモーター、及びＰ２５プロモーターなどが挙げられる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の形質転換乳酸菌を被検者に投与し、さらにアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを被検者で誘導するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することによって、アレルゲンに暴露される被検者（例えば、ヒト等の哺乳動物）におけるＩｇＥの産生の抑制方法を包含するものである。
【００１４】
したがって、本発明の第二は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。また、本発明の第三は、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。
【００１５】
本発明において、トレランスは、次にアレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制することを包含する。なお、本明細書において、「トレランス(tolerance)」は、哺乳動物が一つのアレルゲンまたは複数のアレルゲンに暴露された際に過敏な免疫反応を有さない状態として定義される。
【００１６】
さらに、本発明は、本発明の形質転換乳酸菌を被検者に投与し、さらに、次にアレルゲンに暴露される際の被検者の気管支肺の鬱血を和らげる（即ち、測定可能な量で抑制する）のに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することによって、アレルゲンに暴露される被検者（例えば、ヒト等の哺乳動物）における気管支肺の鬱血の緩和方法を包含するものである。
【００１７】
したがって、本発明の第四は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【００１８】
本発明において、アレルゲンを発現する細菌の投与経路は特に制限されず、細菌（乳酸菌）は、通常、一般的な経路で、例えば、経口で、舌下に、または鼻腔内に、投与されるが、好ましくは経口で投与される。
【００１９】
また、細菌は、ヨーグルトまたはヨーグルト組成物として投与されることが好ましい。
【００２０】
本明細書において、「乳酸菌(lactic acid bacterium)」は、工業的な食品発酵においてその使用が、さらにはその共生特性(probiotic properties)がよく知られているグラム陽性細菌を意味する。なお、本明細書では、乳酸菌を「ＬＡＢ」とも称する。本発明のＬＡＢ及び方法は、アレルギー、特にチリダニに対するアレルギーに対する安全なワクチンを提供するのに使用できる。一般的な人々によって定期的にかつ安全に消費される細菌を使用しているため、このような高い安全性が得られる。
【００２１】
本明細書において、「アレルゲン」ということばは、タイプＩ中間超過敏反応(Type I intermediate hypersensitivity reaction)を引き起こす物質として定義される。
【００２２】
また、本明細書において、「空中アレルゲン」ということばは、少なくとも下記特性、即ち、活性レアギン反応を誘発する特異的な抗原系列、及び感受性のある被検者での明らかな組織の変化を引き起こしうるような周囲の暴露レベルを有するものとして定義される。空中アレルゲンは、呼吸器系の、皮膚の、または結膜のアレルギーを引き起こしうる空中を浮揚する粒子である。例えば、ブタクサの花粉の水溶性画分は呼吸器系及び結膜の粘膜に作用し、また、ブタクサの花粉の脂溶性アレルゲンは接触した皮膚に一般的な接触性皮膚炎を引き起こしうる。
【００２３】
本明細書において、「共生体(probiotic)」は、宿主の固有のミクロフローラを改善することによって宿主の健康状態に好ましい影響を与える生きた微生物である。生育しうる細菌株を共生体として分類するための一致した選択基準は存在しない。共生細菌及び特定の株を単離、規定するために使用される一般的な基準としては下記がある：（ｉ）ヒトを源とした属；（ｉｉ）胆汁、酸、酵素及び酸素に対する安定性；（ｉｉｉ）腸粘膜への付着能；（ｉｖ）ヒトの胃腸管における集落形成の潜在能力；（ｖ）抗菌物質の産生；および（ｖｉ）明白な有効性及び安全性。
【００２４】
本明細書において、「ヨーグルト」または「ヨーグルト組成物」は、ラクトバチルス ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)及びストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)によってミルク中に乳酸を発酵して得られる凝固ミルク製品として規定される。
【００２５】
本明細書において、「形質転換」ということばは、細胞中に技術によって挿入され、その細胞から発達する生物体のゲノムの一部となるＤＮＡ配列を含む細胞として定義される。
【００２６】
また、本明細書において、「プロモーター」ということばは、例えば、細胞中の異種配列に操作により連結された際に、少なくとも一つの状況(context)で転写を指示する(direct)ことができるヌクレオチド配列をいう。換言すると、プロモーターは、プロモーター配列が異なる状況(context)で異種配列の上流に位置した際の転写を指示できる限り、転写する下流の配列なしで存在できる。
【００２７】
本明細書において、「被検者」ということばは、ヒト及び非ヒト動物を包含するものである。被検者としては、具体的には、アレルギー疾患を有する患者などの、ヒトがある。
【００２８】
このような本発明によって処置できるアレルギー疾患としては、鼻炎、副鼻腔炎、喘息、過敏性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、結膜炎、じんま疹、湿疹、皮膚炎、アナフィラキシー、血管性浮腫、アレルギー性頭痛及び片頭痛、ならびにＩｇＥが仲介するアレルギーが関わる胃腸系疾患などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２９】
なお、本発明の他の態様または利点は詳細な説明や特許請求の範囲の記載から明らかであろう。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌；Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌またはストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)；（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌または乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法；（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法；ならびにチリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。
【００３１】
本発明の形質転換乳酸菌は、動物モデルにおいてアレルゲンに対する免疫学的なトレランスを誘導でき、ゆえにアレルギー性疾患を治療および／または予防のために処置するためのワクチンとして使用できる。また、本発明の形質転換乳酸菌により誘導されるトレランスは、アレルゲンの暴露に関連する２種の症状である、機能再亢進及び炎症を抑制するため、本発明の形質転換乳酸菌は、気道の炎症または機能亢進の処置に、さらにはアレルゲンに暴露された被検者におけるＩｇＥの産生の抑制に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、一以上のタンパク質由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を用いた生アレルゲンワクチンに関するものである。すなわち、本発明の第一は、（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌に関するものである。本発明の第二は、Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌に関するものである。本発明の第三は、Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌に関するものである。本発明の第四は、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第五はチリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第六は、（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法に関するものである。本発明の第七は、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法に関するものである。なお、適当なタンパク質由来のアレルゲン、乳酸菌、または適当なプロモーター等の発現ベクターの使用は、本発明の概念に含まれる。
【００３３】
本発明において、特定のアレルギーを処置するために発現される特異的なアレルゲンは、望ましくない免疫反応がタンパク質アレルゲンを標的にしているか否かに依存するであろう。免疫反応の引き金になるタンパク質アレルゲンを同定すれば、当業者は、アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列をミルクに特異的な発現ベクター中にクローニングすることができる。この発現ベクターは、さらに、乳酸菌中に導入された後、次に起こるべき症状（例えば、皮膚の炎症または気管支肺の炎症）を改善するまたは予防するために個体に投与される。
【００３４】
本発明において、このようなアレルゲンは、どのようなアレルゲンでもよく、特に制限されるものではない。具体的には、上記したのと同様である。
【００３５】
ここで、気道の機能再亢進を評価、定量するための実験的なプロトコルを以下に説明する。なお、気管支肺の炎症を評価する他の方法は当該分野において既知である。アレルギー性喘息は、気道の機能再亢進及び炎症の双方の特徴を有する。気道の機能再亢進は肺のテスト（侵襲性または非侵襲性方法）の変化によって測定できる。また、気道の炎症は、気道の炎症細胞、特に好酸球及び好中球の浸潤によって、および病理の変化によって測定できる。
【００３６】
場合によっては、単一のタンパク質由来のアレルゲンを同定する必要がない場合もある。例えば、単一の源由来の複数のタンパク質アレルゲンを、その源に対する免疫学的なトレランスを誘導する（例えば、様々なアレルギー性タンパク質から構成される、貝などの、食物に対するアレルギーを処置する）のに使用できる。このような複数のアレルゲンは、（一以上のＤＮＡベクターを用いて）同一の細菌内で、または異なる細菌内で発現させることができるが、この際、それぞれは同一の源由来の異なるアレルゲンを発現する。このような状況下では、当業者は、別々のアレルゲン源やその源に存在する２以上のアレルギー性タンパク質を知ればよいのである。
【００３７】
乳酸菌は、遺伝子操作をすることができ、また、異種タンパク質を発現させることができる限り、特に制限されることなく、いずれの乳酸菌をも本発明において使用できる。例えば、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する幾つかの適当な種が、Pouwels et al., J. Biotechnol. 44:183-192, 1996に記載される。
【００３８】
本発明において、乳酸菌は、特に制限されるものではなく、公知の乳酸菌が使用できる。具体的には、上記したのと同様である。
【００３９】
本明細書に記載される実験的な知見により、乳酸菌（ＬＡＢ）中に発現ベクターを確立することができた。最も一般的な発現ベクターは、ＬＡＢでは適当ではない。これは、幾つかのプロモーターのみがＬＡＢ中で作動できるからである。これらのプロモーターは、構成プロモーターであることが好ましい、即ち、遺伝子によってコード化されたアレルゲンの発現を構成的に誘導(constitutively drive)できることが好ましい。このようなアレルゲン遺伝子は、臨床上重要なアレルゲン、特に空中アレルゲンであってもよい。本発明は、アレルゲンに特異的なＩｇＥの合成を抑制することによってアレルギー性の炎症をダウンレギュレーションすることができる。したがって、本方法は、ＩｇＥが仲介するアレルギー疾患を処置することができる。本発明において、生ワクチンは、ヨーグルト等の消費可能なまたは食用の形態を有する一以上の共生体を含んでもよい。
【００４０】
本発明において、細菌中でアレルゲンを発現させるのに使用できるプロモーターは、細菌細胞で所望のアレルゲンの発現を指示できるものであれば特に制限されるものではないが、一般的には構成プロモーター(constitutive promoter)であり、例えば、エリストマイシン耐性プロモーター、ＩｄｈＬプロモーター、及びＰ２５プロモーターなどが挙げられる。
【００４１】
アレルゲンのさらなる討論及びこれらの生理学的な効果に関しては、Aas et al., Allergy 33:3, 1978; Goldin et al., Br. J. Nut. 80:S203-S207, 1998; 及び Kailasapathy et al., J. Immunol. Cell Biol. 78:80-88, 2000を参照。
【００４２】
さらに詳述するものではないが、当業者は、上記開示及び下記に記載される形質転換ミルクを用いた有効な処置の開示に基づいて、本発明を十分使用できるものである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。下記実施例は、当業者がどのようにして生細菌ワクチンを生産する形質転換動物を製造、使用するかを単に詳細に説明するものであり、本発明を制限するものではない。ここで開示されるすべての文献、公報などは参考のためにここに引用される。
【００４４】
実施例１
１．方法および材料
＜ＤＮＡの操作＞
ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)及びラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)中でＤｅｒ ｐ ５を発現させるためのプロモーターを得るために、２種のＤＮＡ断片をＰＣＲによって形成した。このＰＣＲに使用されたプライマーは下記のとおりであった。プライマーＰＵＣ１２３３は、ｐＬＰ３５３７における４１１９〜４０９６番目のヌクレオチドに相補的であり、配列：ＣＴＴＡＣＧＴＣＡ ＣＧＴＣＴＴＧＣＧＣ（配列番号１）を有する。なお、ｐＬＰ３５３７及びそのヌクレオチドの番号は、Posno et al., Appl. Env. Microbiol. 57:2764,2766, 1991に記載される。また、プライマーｐＳＤは、ｐＬＰ３５３７の３６５８〜３６７９番目のヌクレオチドと同じであり、配列：ＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴ ＴＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧ（配列番号２）を有する。プライマーｐＳＤの５’末端にさらに６個のヌクレオチドを設計して、得られたＰＣＲ断片中にＢｇｌＩＩ部位を作製した。
【００４５】
各ＰＣＲ反応混合物は、約０．１μｇのプラスミドｐＬＰ３５３７、０．２５μｇの各プライマー、０．２ｍＭのデオキシリボヌクレオシド３リン酸、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含んだ。増幅は、ミニサイクラー(MiniCycler)(MJ Research; Watertown, MA)を用いて、９４℃で１分間、５５℃で２分間、及び７２℃で２分間を３０サイクル行なった。これらの反応によって、プライマーを含む０．４ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（プライマーｐＳＤ中に存在する部位）及びＢｇｌＩＩで処理し、アガロースゲルで精製した。これらのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで直線状にされたプラスミドｐＬＰ３５３７及びｐＣＭＶＤの４０５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ断片と連結した。なお、ｐＣＭＶＤは、Hsu et al., Nature Medicine 2:540-544, 1996に記載される。このようにして得られたプラスミドｐＳＤＤｅｒｐ５は、Ｄｅｒ ｐ ５をコード化するｃＤＮＡ配列に融合した断片を含み、これを増幅した。
【００４６】
＜形質転換＞
細菌株に、Walker et al., FEMS Microbiol. Lett. 138:233-237, 1996に記載される方法を用いてエレクトロポレーションによって形質転換した。このようにしてｐＳＤＤｅｒｐ５が形質転換された乳酸菌について、形質転換されたラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)では「ＬＡ−ｇｍ」と、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)では「ＳＴ−ｇｍ」と、それぞれ、称した。形質転換されなかった細菌は、それぞれ、「ＬＡ」及び「ＳＴ」と称した。
【００４７】
＜細菌の培養＞
ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)（ＡＴＣＣ ４３５６）を、ＭＲＳブロス及び寒天で３７℃で培養した。大腸菌株ＤＨ５α(E. coli strain DH5α)は、ＬＢブロス及び寒天で３７℃に維持した。抗生物質であるアンピシリン及びエリスロマイシンをSigma (St. Louis)より購入した。大腸菌(E. coli)の選択のために、アンピシリン及びエリスロマイシンを、それぞれ、５０μｇ／ｍｌ及び５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。また、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)の選択では、エリスロマイシンを５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。さらに、ストレプトコッカス サーモフィルス(S. thermophilus)（これもＡＴＣＣから得た）を、ラクトバチルス アシドフィルス(L. acidophilus)の場合と同様にして、培養、処理した。
【００４８】
＜動物の研究＞
６及び８週齢の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、College of Medicine, National Taiwan University (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME.から創設)の動物飼育センター(animal-breeding center)から得た。これらのマウスを各実験用に６群に分けた（表１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】
Lin et al., J. Allergy Clin. Immunol. 94:989-996, 1994に記載されるのと同様にして精製された組み換えＤｅｒ ｐ ５ １０μｇを腹腔内に注射することによって、動物を能動的に感作した。マウスには、２週間にわたって、毎週３日間、ＬＡ−ｇｍまたはＳＴ−ｇｍ ＬＡＢを経口摂取させた。感作してから２１日目に、動物に、２０分間、０．１％のＤｅｒ ｐ ５−グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質をまたはＰＢＳのエアロゾルを暴露した。吸入によるチャレンジから８時間後に、肺の耐性を５０分間測定し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び血清を集めた。
【００５１】
＜Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａ及びＩｇＥの測定＞
Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａ及びＩｇＥの量を、Hsu et al., Int. Immunol. 8:14051411, 1996に記載されるのと同様にしてＥＬＩＳＡによって測定した。タンパク質結合プレートを、Hsu et al., Nature Medicine 2:540-544, 1996に記載されるのと同様にして、コーティングバッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．２）における精製Ｄｅｒ ｐ ５溶液（５μｇ／ｍｌ）１００μｌで被覆した。４℃で一晩、インキュベートした後、プレートを３回洗浄して、２５℃で２時間、ＰＢＳにおける３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングした。試験動物の血清を、ＩｇＧの測定用では１：１００に、また、ＩｇＥの測定用では１：１０に、それぞれ、希釈した。各サンプルを２連で分析した。４℃で一晩、インキュベートした後、ビオチン共役ラット抗マウスＩｇＥ(biotin-conjugated rat anti-mouse IgE)(Pharmingen, San Diego, CA)またはラット抗マウスＩｇＧ２ａ(Pharmingen)のいずれかを０．０５％ゼラチンバッファーで希釈し、さらに１時間かけて、各試験ウェルに添加した。アビジン−アルカリホスファターゼ(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)を１：１０００に希釈し、ウェルに添加して、２５℃で１時間、インキュベートした。次に、これらのウェルを６回洗浄した。
【００５２】
呈色反応を、ｐ−ニトロフェニルホスフェート２ナトリウム(p-nitrophenylphosphate, disodium)(Sigma)を添加することによって発色させた。プレートを、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー(microplate reader)(Metertech, Taiwan)で読んだ。読み取りは、４ｍｇの水酸化アルミニウムにおける１０μｇのＤｅｒ ｐ ５を初めに腹腔内に注射し、同じ投与量及び配合で２１日目に追加投与した(boost)、６匹のマウスから集めた標準血清を参考にした。この標準シグナル（抗体の応答に関するポジティブコントロール）を、１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌに標準化した（図１参照）。
【００５３】
＜気道の応答性を測定するための非侵襲性の方法＞
気圧計による全身の体積変動記録法(barometric whole body plethysmography)（ＷＢＰ）(Buxco, Troy, NY, USA)を用いて、意識のある、拘束されていないマウスにおける吸入されたメタコリンに対する応答を、Hamelmann et al., Am. J. Respir. crit. Care Med. 156:766-775, 1997に記載されるのと同様にして、測定した。メタコリンは、気道の耐性を向上することが知られている薬剤である。読み取る前に、メインのチャンバー中に１ｍｌの空気を迅速に注入して、ボックスを較正し、ＷＢＰから１ｍｖのシグナルを得た。ボックスの圧力(box pressure)／時間の曲線が０ポイントを横切ったら、吸気をスタートとし呼気を終わりとすることを確立することによって、吸気及び呼気を記録した。吸気の開始を、ボックスの圧力シグナルの上昇吸気相の２レベルから得られる直線から外挿することによって決定した。吸気の時間（ＴＩ）を、吸気の開始から吸気の終了までの時間として規定した；また、呼気の時間（Ｔｅ）を、吸気の終了から次の吸気の開始までの時間として規定した。ネガティブまたはポジティブな方向で１回の呼吸中に生じる最大のボックス圧力シグナルは、それぞれ、ピーク吸気圧力(peak inspiratory pressure)（ＰＩＰ）またはピーク呼気圧力(peak expiratory pressure)（ＰＥＰ）として規定された。１０回の呼吸毎の記録を外挿して、１分当たりの呼吸の呼吸数を規定した。休止時間（Ｔｒ）を、全体の呼気の圧力シグナル（呼気中のボックス圧力シグナル下での領域）の３６％に到達する時間として規定した。この閾値は、受動的な呼気でのピーク容積の３６％減衰に対する容積シグナルの減衰の時間定数の相間関係として機能する。Ｐａｕｓｅ及び向上した休止(enhanced pause)（Ｐｅｎｈ）は、下記式によって規定、算出される。
【００５４】
【数１】
【００５５】
気道の応答性の指数として、Ｐｅｎｈの増加を測定した。マウスを得て、３分間、平均をとった(average)。ガス形成した生理食塩水(aerosized saline)を、メタコリンの濃度を上げた（１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲）後、ネブライザーで噴霧し、３分間、吸収させた。各噴霧後に、読み取りを行なった後、３分間、平均をとった。気道の応答性は、メタコリンの投与毎のＰｅｎｈとして表わした。
【００５６】
＜気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるサイトカインの評価＞
上記したのと同様にして肺の機能を測定した後、マウスにカニューレを挿入して、気管切開により導入されたポリエチレンチューブにより０．９％滅菌生理食塩水の０．５ｍｌのアルコートで５回、洗浄した。この洗浄液を遠心（４℃で１０分間、５００ｇ）して、細胞ペレットを０．５ｍｌのハンクス液中に再懸濁した。９０μｌの０．４％トリパンブルーに１０μｌの細胞懸濁液を添加し、ニューバウアーチャンバー(Newbauer chamber)内で光学顕微鏡で計測することによって、全細胞数を得た。識別した細胞の計測を、ロイ染色(Leu's stain)によって染色されたサイトスピン(cytospin)調製物から行なった。細胞を同定し、標準的な形態学的な差異を肉眼で検査することによって、好酸球、リンパ球、好中球、及びマクロファージに分類した。５００個の細胞を４００倍の倍率で計測して、各細胞型の割合（％）及び絶対数(absolute number)を算出した。
【００５７】
ＢＡＬＦ中のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、組み換えサイトカインに関する標準曲線を用いてｐｇ／ｍｌで表わした。捕捉及びビオチン化に関するモノクローナル抗体(monoclonal Ab)は、下記のとおりであった：Ｒ４−６Ａ２（ＩＮＦ−γに関する捕捉抗体(capture antibody)の名称）及びＸＭＧ１．２（ＩＮＦ−γに関するビオチン化の名称）、これらは、PharMingen, San Diego, CAより市販；ならびに１１Ｂ１１（ＩＬ−４に関する捕捉抗体(capture antibody)の名称）及びＢＶＤ６（ＩＬ−４に関するビオチン化の名称）、これらは、PharMingenより市販。なお、検出限界は、１８ｐｇ／ｍｌであった。
【００５８】
＜統計学的分析＞
ＡＮＯＶＡを行ない、群間の相違を比較した。分散分析後、ダンカン複数範囲テスト(Duncan multiple range test)を用いて、実験群及びコントロール群間の相違を識別した。ｐ＜０．０５を用いて、統計学上有意な相違を示した。
【００５９】
２．結果
＜インビボでのアレルゲンに特異的なＩｇＥ応答の阻害＞
賦形剤（非組み換え細菌）、ｐＳＤＤｅｒｐ５を形質転換された細菌、及び組み換えＤｅｒ ｐ ５を投与されたマウスを、１週間、アレルゲンとしてのＤｅｒ ｐ ５で腹腔内で感作した後、感作してから３週間目に吸入によりワクチンを投与、チャレンジした。アレルゲンのチャレンジから３週間目の血清における抗Ｄｅｒ ｐ ５ ＩｇＥの存在を、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。これらの結果を図１に要約する。Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥは、賦形剤で処置した群に比して有意に増加した。これに対して、ｐＳＤＤｅｒｐ５で処置したマウスは、Ｄｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの合成を８０％以上阻害していることが示された。別の実験で、Ｄｅｒ ｐ ２をチャレンジしたｐＳＤＤｅｒｐ５処置マウスは依然としてＤｅｒ ｐ ２に特異的なＩｇＥを産生していたことから、遺伝子により修飾された乳酸菌によるＩｇＥ合成の阻害はＤｅｒ ｐ ５アレルゲンに特異的であることが分かった。したがって、アレルゲンを発現する乳酸菌を直接経口摂取することによって、アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生は効率良く阻害できた。さらに、このような抑制効果は、組み換えアレルゲン単独（図１におけるＣ群参照）の経口摂取に比べて非常に優れており、また、ワクチンに組み換えアレルゲンを含ませても、アレルゲンを発現する細菌単独を経口投与する効果を測定可能なレベルには向上しなかった（図１におけるＢ群及びＤ群を比較）。なお、実験群の中でＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＧ２ａの産生の有意な差異は認められなかった。
【００６０】
＜インビボでの気道の機能再亢進（ＡＨＲ）の抑制＞
生乳酸菌ワクチンの効能及び特異性を気道（気管支肺）の機能再亢進の測定を用いて評価した。ガス形成したメタコリンに対する気道の応答性を、意識のある、拘束されていないマウスで最後の吸入によるチャレンジを行なってから８時間、インビボで測定した。すべてのマウスについて、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲のメタコリンに対して完全な用量反応曲線(dose-response)が得られた。すべてのマウス群で、基礎的なＰｅｎｈ値及び生理食塩水エアロゾル誘導Ｐｅｎｈ値において、有意な差異は認められなかった。ネガティブなワクチンコントロール動物（Ａ群、Ｃ群、及びＥ群）では、Ｄｅｒ ｐ ５によるチャレンジによって、ベースラインに比してメタコリンに対する気道の応答性の有意な上昇が誘導された。これに対して、ＬＡ−ｇｍまたはＳＴ−ｇｍによる処置（Ｂ群、Ｄ群、及びＦ群）では、１０〜１００ｍｇ／ｍｌのメタコリンの投与量で、ＡＨＲが有意に阻害された（図２）。したがって、Ｄｅｒ ｐ ５で誘導されるＡＨＲは、アレルゲンを発現する乳酸菌の投与によって、排除できる。
【００６１】
メタコリンによるチャレンジ後の気道の耐性の向上は、気道の機能亢進(hyperactivity)と相間する。細胞の浸潤（例えば、好中球及び好酸球の浸潤）の増加は、気道の炎症と相間する。気道の機能亢進及び炎症は双方とも、アレルギー性喘息の特徴である。
【００６２】
＜気管支肺の細胞数に関するワクチン効果＞
チャレンジ後の気管支肺洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞数を、アレルゲンの暴露に応答した気管支肺管への細胞浸潤の測定結果として用いた（図３）。アレルゲンを発現する細菌を投与した動物（Ｂ群及びＤ群）のＢＡＬＦにおける好酸球及び好中球の数は、賦形剤で処置したＡ群及び組み換えアレルゲンで処置したＣ群に比して、有意に少なかった。マクロファージ及びリンパ球の数は、これらの実験群で有意な差異は認められなかった。したがって、Ｄｅｒ ｐ ５のチャレンジによって好酸球及び好中球の浸潤が誘導されるが、このような浸潤は生乳酸菌ワクチンによって有意に阻害できることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】は、アレルゲンでチャレンジされた様々な動物群におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥ及びＩｇＧを示す棒グラフである。この際、動物群Ａ〜Ｆの組成を表１に示す。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の統計学的な有意性を表わす。
【図２】は、異なるワクチンを投与され、様々な濃度のメタコリン（Ｍｃｈ）で処置された動物のＰｅｎｈを示す棒グラフである。この際、値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５の統計学的な有意性を表わす。
【図３】は、異なるワクチンを投与され、アレルゲンをチャレンジされた動物における様々な型の白血球の数を示す棒グラフである。この際、値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表わされる。また、図中、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５の統計学的な有意性を表わす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌。
【請求項２】
該乳酸菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項１に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項３】
該乳酸菌は、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)である、請求項２に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項４】
該乳酸菌は、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属する、請求項１に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項５】
該乳酸菌は、ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)である、請求項４に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項６】
該タンパク質由来のアレルゲンは、チリダニ由来のアレルゲンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項７】
該チリダニは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)である、請求項６に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項８】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５である、請求項７に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項９】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項１０】
Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌。
【請求項１１】
Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌。
【請求項１２】
（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項１３】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該細菌は、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該アレルゲンは、タンパク質由来のアレルゲンである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５アレルゲンである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該細菌は、経口で投与される、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該細菌は、ヨーグルトとして投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項２４】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該チリダニ由来のアレルゲンは、デルマトフィルス属(Dermatophagoides genus)に属するチリダニ由来のアレルゲンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
該細菌は、経口で投与される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該細菌は、ヨーグルト組成物として投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該被検者は、ヒトである、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項３１】
チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法。
【請求項３２】
該細菌はラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属し、かつ該チリダニ由来のアレルゲンはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生を抑制するのに使用される、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌。
【請求項３４】
空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生を抑制するのに使用される、（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌。
【請求項３５】
チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血を緩和するのに使用される、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌。
【請求項３６】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項３７】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項３３、３５または３６に記載の細菌。
【請求項３８】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項３７に記載の細菌。
【請求項３９】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５アレルゲンである、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項４０】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項３４または３９に記載の細菌。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細菌を含むヨーグルト。
【請求項１】
（１）タンパク質由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターからなるＤＮＡ分子を有する形質転換乳酸菌であって、十分量の該乳酸菌の摂取により次に該タンパク質由来のアレルゲンに暴露される際の被検者におけるタンパク質由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換乳酸菌。
【請求項２】
該乳酸菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項１に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項３】
該乳酸菌は、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)である、請求項２に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項４】
該乳酸菌は、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)に属する、請求項１に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項５】
該乳酸菌は、ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)である、請求項４に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項６】
該タンパク質由来のアレルゲンは、チリダニ由来のアレルゲンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項７】
該チリダニは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)である、請求項６に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項８】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５である、請求項７に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項９】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換乳酸菌。
【請求項１０】
Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)細菌。
【請求項１１】
Ｄｅｒ ｐ ５を発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子を有する形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌であって、十分量の該細菌の摂取により次にＤｅｒ ｐ ５に暴露される際の被検者におけるＤｅｒ ｐ ５に特異的なＩｇＥの産生が抑制される形質転換ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌。
【請求項１２】
（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項１３】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該細菌は、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該アレルゲンは、タンパク質由来のアレルゲンである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５アレルゲンである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該細菌は、経口で投与される、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該細菌は、ヨーグルトとして投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次に該アレルゲンに暴露される際の被検者におけるアレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項２４】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該チリダニ由来のアレルゲンは、デルマトフィルス属(Dermatophagoides genus)に属するチリダニ由来のアレルゲンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
該細菌は、経口で投与される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該細菌は、ヨーグルト組成物として投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該被検者は、ヒトである、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌を被検者に投与し；さらに、次に該空中アレルゲンに暴露される際の被検者における空中アレルゲンに特異的なＩｇＥの産生を抑制するのに十分な量の空中アレルゲンを被検者で発現することからなる、空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生の抑制方法。
【請求項３１】
チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌を被検者に投与し；さらに、次にアレルゲンに暴露される際に被検者の気管支肺の鬱血を和らげるのに十分な量のアレルゲンを被検者で発現することからなる、チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血の緩和方法。
【請求項３２】
該細菌はラクトバチルス属(genus Lactobacillus)に属し、かつ該チリダニ由来のアレルゲンはヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生を抑制するのに使用される、（１）チリダニ由来のアレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌。
【請求項３４】
空中アレルゲンに暴露される被検者におけるＩｇＥの産生を抑制するのに使用される、（１）空中アレルゲンをコード化するヌクレオチド配列および（２）該ヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターを有する非病原性のグラム陽性細菌。
【請求項３５】
チリダニ由来のアレルゲンに暴露される被検者における気管支肺の鬱血を緩和するのに使用される、チリダニ由来のアレルゲンを発現する乳酸菌。
【請求項３６】
該細菌は、ラクトバチルス属(genus Lactobacillus)、ストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、またはビフィドバクテリウム属(genus Bifidobacterium)に属する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項３７】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、デルマトフィルス ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putesentiae)、レピドグリファス ドメスチカス(Lepidoglyphus domesticus)、レピドグリファス デストラクター(Lepidoglyphus destructor)、アカラス シロ(Acarus siro)、ユーログリファス マイネイ(Euroglyphus maynei）、またはビオミア トロピカリス(Biomia tropicalis)由来のアレルゲンである、請求項３３、３５または３６に記載の細菌。
【請求項３８】
該チリダニ由来のアレルゲンは、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)由来のアレルゲンである、請求項３７に記載の細菌。
【請求項３９】
該アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ ５アレルゲンである、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項４０】
該プロモーターは、構成プロモーターである、請求項３４または３９に記載の細菌。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細菌を含むヨーグルト。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１００７５１（Ｐ２００９−１００７５１Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１２７８９（Ｐ２００８−３１２７８９）
【出願日】平成２０年１２月９日（２００８．１２．９）
【分割の表示】特願２００２−２６１１（Ｐ２００２−２６１１）の分割
【原出願日】平成１４年１月９日（２００２．１．９）
【出願人】（５０１４８４０５７）ゲンモント バイオテクノロジー コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＭＯＮＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月９日（２００８．１２．９）
【分割の表示】特願２００２−２６１１（Ｐ２００２−２６１１）の分割
【原出願日】平成１４年１月９日（２００２．１．９）
【出願人】（５０１４８４０５７）ゲンモント バイオテクノロジー コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＭＯＮＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．
【Ｆターム（参考）】
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