イムノフュージンとしての新脈管形成インヒビターの発現および輸送
【課題】種々の哺乳動物宿主細胞における新脈管形成インヒビターの効率的な生成および分泌を促進する新規なＤＮＡを提供すること。
【解決手段】免疫グロブリンＦｃ−新脈管形成インヒビター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）が開示される。この新脈管形成インヒビターは、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、またはエンドスタチン活性を有するコラーゲンXVIIIフラグメントであり得る。このヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター中に挿入され、哺乳動物細胞中で発現され得る。このようなヌクレオチド配列の発現によって生成され得る免疫グロブリンＦｃ−新脈管形成インヒビター融合タンパク質のファミリーも開示される。このようなヌクレオチド配列および融合タンパク質を新脈管形成によって媒介される状態の処置に用いる方法もまた開示される。
【解決手段】免疫グロブリンＦｃ−新脈管形成インヒビター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）が開示される。この新脈管形成インヒビターは、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、またはエンドスタチン活性を有するコラーゲンXVIIIフラグメントであり得る。このヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター中に挿入され、哺乳動物細胞中で発現され得る。このようなヌクレオチド配列の発現によって生成され得る免疫グロブリンＦｃ−新脈管形成インヒビター融合タンパク質のファミリーも開示される。このようなヌクレオチド配列および融合タンパク質を新脈管形成によって媒介される状態の処置に用いる方法もまた開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、新脈管形成インヒビターを含む融合タンパク質を作製および使用するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および新脈管形成インヒビターを含む、イムノフュージン（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）と呼ばれる融合タンパク質を作製および使用するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
２つの強力な新脈管形成インヒビターであるアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５）およびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）が発見され、そして原発性腫瘍によって本来生成されることが見出された。両方のタンパク質は、内皮細胞増殖の特異的なインヒビターであり、そして腫瘍に栄養を与える新規の血管の形成である新脈管形成をブロックすることによって腫瘍増殖を阻害する。研究により、これらの新脈管形成インヒビターが非常に高い用量でさえも非毒性であり、そしてこれらが転移の増殖を抑制し得、そして原発性腫瘍が休眠した顕微鏡状態まで後退し得ることが示された。両方のインヒビターは、ずっと大きなインタクトな分子のタンパク質分解性フラグメントとして同定された。アンギオスタチンは、プラスミノーゲンのフラグメントであり、そしてエンドスタチンはコラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメントであることが見出された。
【０００３】
これらの２つのタンパク質は、癌の分野において大きな興味を生じてきた。なぜなら、これらは、明らかな副作用も薬物耐性も伴わずに、マウスにおいて多くの異なる型の腫瘍の増殖を抑制することが示されているからである。伝統的な化学療法は一般に、癌細胞の遺伝的不安定性により主に引き起こされる、後天性薬物耐性をもたらす。癌細胞を標的とするよりも、新脈管形成インヒビターを用いる治療は、腫瘍の増殖を支持する正常な内皮細胞を標的とする。内皮細胞は遺伝的に安定であるので、新脈管形成インヒビター治療がより少ない薬物耐性をもたらし得ることは可能である。研究により、エンドスタチンを用いる長期の抗新脈管形成治療に暴露したマウスにおいて薬物耐性が発達しなかったことが示される。さらに、マウスにおける反復サイクルのエンドスタチン処置は、長期の腫瘍休眠および治療中止後に腫瘍の再発がないことをもたらした（Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：４０４）。
【０００４】
マウスにおける有望な結果にもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルス、酵母および哺乳動物発現系を用いて商業的品質の、臨床グレードの可溶性の活性なアンギオスタチンおよびエンドスタチンを生成することは可能ではなかった。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現は、不確定の組成の不溶性のタンパク質凝集物を生じた。このタンパク質凝集物は、ヒト注射できない。他の生成方法（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系）は、非常に低レベルのこの組換えタンパク質を生じた（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）。
【０００５】
今日までのこの発現系の乏しい収量は、アンギオスタチンおよびエンドスタチンの両方が、ずっと大きなタンパク質の内部フラグメントであることにより説明され得る。短縮型タンパク質は、前駆体分子から切断される残基がなければ適切には折り畳まれないのかもしれない。例えば、アンギオスタチンは、多数のジスルフィド結合を形成する、２６個のシステイン残基を有する。アンギオスタチンの発現は、独力では、これらの多数のジスルフィド結合が、分泌経路において正しく形成するのに最適な環境を提供しないかもしれない。また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成されるこの組換えエンドスタチンタンパク質は、おそらく、エンドスタチンの疎水性に起因して、透析の間に沈澱した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）．
それらの現在の形態におけるアンギオスタチンおよびエンドスタチンの使用に関する主要な障害は、所望の臨床結果を達成するためには、比較的多量のタンパク質を、数週間から数ヶ月にわたって毎日注射しなければならないことである。例えば、最近のマウスモデルでは、２０ｍｇ／ｋｇ／日のエンドスタチンの投薬量が、最適な効力を実証するために必要とされる（Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：４０４）。エンドスタチンおよびアンギオスタチンを臨床的に試験する差し迫った必要性があることを考慮すると、大量の臨床的グレードの物質を生成し得る生成方法が重要である。
【０００６】
哺乳動物細胞における融合タンパク質の高レベルの発現を生じるために用いられている１つの発現系は、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域および標的タンパク質をコードする、ＤＮＡ構築物である。この構築物の融合産物は一般に、「イムノフュージン」と呼ばれる。以下を含むいくつかの標的タンパク質がイムノフュージンとして成功裏に発現されている：ＩＬ２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、βＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥレセプター、ＰＳＭＡおよびｇｐ１２０。これらの発現構築物は、その開示が本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５４１，０８７号および米国特許第５，７２６，０４４号に開示される。
【０００７】
哺乳動物細胞において組換え融合タンパク質を発現する主要な目的は、新規なまたは有用な特性（例えば、適切な折り畳み、溶解度の増加、インビボにおけるサイトカインまたは毒素の標的化、Ｆｃレセプター結合、補体結合、プロテインＡ結合、循環半減期の増加および血液脳関門を通過する能力の増加）をハイブリッド分子に付与しようとすることであった。哺乳動物細胞において生成された組換え融合タンパク質の例としては、サイトカイン免疫結合体（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２３０）、、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）（Ｃａｐｏｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５）、イムノトキシン（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４）、および神経成長因子結合体（Ｆｒｉｄｅｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３７３）が挙げられる。上記の刊行物の各々は、本明細書中に参考として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、種々の哺乳動物宿主細胞における新脈管形成インヒビターの効率的な生成および分泌を促進する新規なＤＮＡを提供することである。本発明の別の目的はまた、非天然の、生合成の、またはそうではない人工のタンパク質（例えば、合理的な設計によって作製されたタンパク質）を含む、新脈管形成インヒビタータンパク質をコードする核酸、または新脈管形成インヒビタータンパク質を規定するアミノ酸配列で哺乳動物を処置するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、新脈管形成インヒビタータンパク質を含む融合タンパク質を作製および使用する際に有用な、方法および組成物を特徴とする。この融合タンパク質は、生物学的に活性な新脈管形成インヒビタータンパク質の高レベルの発現を促進し得る。次いで、この新脈管形成インヒビタータンパク質は、この融合タンパク質から切断され得、そして哺乳動物（例えば、ヒト）への投与の前に薬学的に受容可能なキャリアと合わされ得る。あるいは、新脈管形成インヒビター含有融合タンパク質をコードする核酸配列または新脈管形成インヒビター含有融合タンパク質を規定するアミノ酸配列は、薬学的に受容可能なキャリアと合わされ得、そして哺乳動物に投与され得る。
【００１０】
１つの局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）を提供する。この核酸分子は、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびに本明細書中では、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本明細書中で新脈管形成インヒビタータンパク質とも呼ばれる、少なくとも１つの標的タンパク質をコードする。好ましい実施態様では、この核酸分子は、５’から３’の方向で連続して、このシグナル配列、この免疫グロブリンＦｃ領域およびこの標的タンパク質配列をコードする。別の好ましい実施態様では、この核酸分子は、５’から３’の方向で連続して、このシグナル配列、この標的配列および免疫グロブリンＦｃ領域をコードする。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、この免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域を含み、そして好ましくは少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、免疫グロブリン重鎖定常２（ＣＨ2）ドメイン、免疫グロブリン重鎖定常３（ＣＨ3）ドメイン）、およびＦｃ領域を生成するために用いられる免疫グロブリンの型に依存して、必要に応じて免疫グロブリン重鎖定常領域４（ＣＨ4）ドメインを含む。より好ましい実施態様では、この免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む。特定の状況下では、この免疫グロブリンＦｃ領域は好ましくは、少なくともこのＣＨ1ドメインを欠く。この免疫グロブリンＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に基づき得るが、ＩｇＧに基づく免疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。
【００１２】
別の実施態様では、本発明の核酸は、複製可能な発現ベクター中に作動性に連結して組み込まれ得、次いでこれは、哺乳動物宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。別の好ましい実施態様では、本発明は、本発明のこのような核酸配列を保有する宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の局面では、本発明は、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質に、ポリペプチド結合を介して直接、またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで連結された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供する。この標的タンパク質は、そのＣ末端を介してこの免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端へと融合され得る。しかし、さらに好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、そのＮ末端を介して免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端へと融合される。
【００１４】
別の実施態様では、この融合タンパク質は、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメントおよびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される第２の標的タンパク質を含み得る。この型の構築物では、第１および第２の標的タンパク質は、同一のタンパク質または異なるタンパク質であり得る。例えば、好ましい実施態様では、この融合タンパク質は、アンギオスタチンという第１の標的タンパク質、免疫グロブリンＦｃ領域およびエンドスタチンという第２の標的タンパク質を含む。第１および第２の標的タンパク質は、直接またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで一緒に連結され得る。あるいは、両方の標的タンパク質は、直接またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで、この免疫グロブリンＦｃ領域に連結され得る。後者の場合、この第１の標的タンパク質は、この免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結され、そしてこの第２の標的タンパク質は、この免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される。
【００１５】
別の実施態様では、２つの融合タンパク質は、共有結合的に（例えば、ジスルフィド結合もしくはペプチド結合によって）または非共有結合的にのいずれかで会合して、多量体タンパク質を生成し得る。好ましい実施態様では、２つの融合タンパク質は、（好ましくは、両鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に配置された免疫グロブリンヒンジ領域内に位置する）システイン残基を介する１以上のジスルフィド結合によって共有結合される。
【００１６】
好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、約４０ｋＤの分子量を有し、そして必要に応じて配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、プラスミノーゲンフラグメントを含む。別の好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントを含む。
【００１７】
さらに、この標的タンパク質は、全長アンギオスタチンもしくは全長エンドスタチン、またはそれらの生物活性のあるフラグメントであり得る。特定の融合タンパク質を作製する際のこの標的タンパク質の供給源は、この標的タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、この標的タンパク質がヒトに投与されるべきである場合、この標的タンパク質は好ましくは、ヒト起源のものである。
【００１８】
別の局面では、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびにアンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、およびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される標的タンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）シグナル配列を有するかまたは有さないかのいずれかのこのような融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する工程、および（ｂ）この哺乳動物細胞を培養して、この融合タンパク質を生成する工程。次いで、得られる融合タンパク質は、収集され得、再折り畳みされ得、そして必要な場合、当該分野で周知であり、そして当該分野で用いられる従来の精製技術を用いて精製され得る。この融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ領域とこの標的タンパク質との間に配置されたタンパク質分解性切断部位を含むと仮定して、この標的は、従来のタンパク質分解性酵素を用いて融合タンパク質から切断され得、そして必要な場合使用の前に精製され得る。
【００１９】
別の局面では、本発明は、新脈管形成インヒビターに基づく治療を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）を処置するための方法を提供する。例えば、本発明の新脈管形成インヒビターが、腫瘍に罹患したヒトに投与され得ることが意図される。新脈管形成インヒビターでの処置は、腫瘍増殖を減速または停止させ得、そして特定の状況下では、腫瘍後退を引き起こし得る。処置は、この哺乳動物に、腫瘍増殖を減速または停止させるのに充分な量の新脈管形成インヒビターを投与する工程を含み得る。この新脈管形成インヒビターは、融合タンパク質の形態で、または（好ましくは発現ベクターと作動可能に連結された）核酸として、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて提供され得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） 融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、以下：
（ａ）シグナル配列；
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域；ならびに
（ｃ）アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質配列、
を含む、ＤＮＡ分子。
（項目２） 前記シグナル配列、前記免疫グロブリンＦｃ領域および前記標的タンパク質配列が、５’から３’の方向で連続してコードされる、請求項１に記載のＤＮＡ。
（項目３） 前記シグナル配列、前記標的配列および前記免疫グロブリンＦｃ領域が、５’から３’の方向で連続してコードされる、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目４） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目５） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域および免疫グロブリン定常重鎖ドメインを含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目６） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメインを含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目７） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも前記ＣＨ1ドメインを欠く、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目８） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも免疫グロブリンγの一部をコードする、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目９） 哺乳動物細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターであって、該ベクターが、項目１に記載のＤＮＡを含む、ベクター。
（項目１０） 項目１に記載のＤＮＡを保有する、哺乳動物細胞。
（項目１１） 融合タンパク質であって、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびにアンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質を含む、融合タンパク質。
（項目１２） 前記プラスミノーゲンフラグメントが、約４０ｋＤの分子量を有し、そして配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３） 前記標的タンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１４） 前記コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１５） 前記標的タンパク質が、アンギオスタチン、エンドスタチン、プラスミノーゲンフラグメントおよびコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される少なくとも２つの分子を含み、該２つの分子が、ポリペプチドリンカーによって連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１６） 前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１７） 前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１８） 多量体タンパク質であって、ジスルフィド結合を介して連結される、項目１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含む、多量体タンパク質。
（項目１９） 少なくとも１つの前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がアンギオスタチンであり、そして少なくとも１つの前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がエンドスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２０） 両方の前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がアンギオスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２１） 両方の前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がエンドスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２２） アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメントおよびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される第２の標的タンパク質をさらに含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目２３） 前記第２の標的タンパク質が、ポリペプチドリンカーによって第１の標的タンパク質に連結されている、項目２２に記載の融合タンパク質。
（項目２４） 前記第１の標的タンパク質が前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結されており、そして前記第２の標的タンパク質が該免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結されている、項目２２に記載の融合タンパク質。
（項目２５） 項目１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含む多量体融合タンパク質であって、該融合タンパク質が、ポリペプチド結合によって連結されている、多量体融合タンパク質。
（項目２６） 融合タンパク質を生成する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）項目１０に記載の哺乳動物細胞を提供する工程；および
ｂ）該哺乳動物細胞を培養して該融合タンパク質を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目２７） 前記融合タンパク質を収集するさらなる工程を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記免疫グロブリンＦｃ領域を前記標的タンパク質から切断するさらなる工程を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 新脈管形成によって媒介される状態を処置する方法であって、項目１に記載のＤＮＡを、新脈管形成インヒビターを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３０） 新脈管形成によって媒介される状態を処置する方法であって、項目９に記載のベクターを、新脈管形成インヒビターを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３１） アンギオスタチンまたはエンドスタチンの投与によって緩和される状態を処置する方法であって、項目１１に記載の融合タンパク質の有効量を、該状態を有する哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【００２０】
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲からさらに明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、本発明に従って構築された例示的な新脈管形成インヒビター融合タンパク質の模式図である（実施例１０〜１５を参照のこと）。これらの図はそれぞれ、以下を描く：図１Ａ、Ｆｃ−アンギオスタチンＫｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｂ、Ｆｃ−アンギオスタチン内側Ｋｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｃ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチン内側Ｋｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｄ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチンＫｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｅ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチン；図１Ｆ、アンギオスタチン−Ｆｃ−エンドスタチン。垂直の線は、このＦｃ分子のヒンジ領域内に配置されたシステイン残基（Ｃ）を連結する任意のジスルフィド結合を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、商業的量の臨床グレードの新脈管形成インヒビターの生成に有用であった、本明細書中でイムノフュージンと呼ばれる、融合タンパク質を提供する。この新脈管形成インヒビターは、イムノフュージンタンパク質構築物から使用前に切断され得る。しかし、イムノフュージンまたはこのイムノフュージンをコードする核酸が、新脈管形成インヒビターで処置する必要がある哺乳動物に直接投与され得ることが意図される。
【００２３】
従って、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域、および本明細書中で新脈管形成インヒビターと呼ばれる、少なくとも１つの標的タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。この新脈管形成インヒビターは好ましくは、アンギオスタチン、エンドスタチン、プラスミノーゲンフラグメントアンギオスタチン活性、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される。しかし、現在公知かまたは後で発見される新脈管形成インヒビター活性を有する他のポリペプチドが、本明細書中に記載される型の融合タンパク質として発現され得ることが意図される。
【００２４】
本発明を具体化したタンパク質構築物の６つの例示的な実施態様を、図１Ａ〜図１Ｆとして図面に例示する。二量体構築物が好ましいので、全てを、隣接するサブユニット上のシステイン間での一対のジスルフィド結合によって架橋される二量体として例示する。この図面では、ジスルフィド架橋は、２つの免疫グロブリンＦｃ領域の一部を、免疫グロブリンヒンジ領域を介して一緒に連結するとして表され、従って、これらの分子のネイティブな形態に特有である。Ｆｃのヒンジ領域を含む構築物が好ましく、そして治療剤として有望であると示されているが、本発明は、他の位置での架橋が、所望により選択され得ることを意図する。さらに、いくつかの状況下では、本発明を実施する際に有用な二量体または三量体は、非共有結合によって、例えば、疎水性相互作用によって生成され得る。
【００２５】
ホモ二量体構築物は本発明の重要な実施態様であるので、図１は、このような構築物を例示する。ヘテロ二量体構造もまた有用であるが、当業者に公知であるように、しばしば精製することが困難であり得ることが理解されるべきである。しかし、ホモ二量体とヘテロ二量体との混合物を含む、ヒトを含む種々の哺乳動物種において新脈管形成を阻害するために有用な存続可能な構築物が構築され得る。例えば、ヘテロ二量体構造の一方の鎖はエンドスタチンを含み得、そして他方の鎖はアンギオスタチンを含み得る。
【００２６】
図１Ａは、実施例１０に示される手順に従って生成される二量体構築物を例示する。この二量体の各単量体は、ヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域１を含む。Ｆｃ領域１のＣ末端には、内側環および外側環の両方に、アンギオスタチン２の第１のＫｒｉｎｇｌｅ領域が直接結合される。図１Ｂは、図１ＡのＦｃ領域と同じＦｃ領域を含み、この場合は、Ｆｃ領域１のＣ末端に結合されたアンギオスタチン３のＫｒｉｎｇｌｅ１の内側環のみを有する、本発明の第２の実施態様を示す（実施例１１を参照のこと）。図１Ｃ〜図１Ｅは、標的タンパク質として、タンデムに配置され、そしてリンカーによって連結された複数の新脈管形成インヒビターを含む、本発明のタンパク質構築物の種々の実施態様を示す。図１Ｃでは、この標的タンパク質は、全長エンドスタチン４、ポリペプチドリンカー５、およびアンギオスタチン３のＫｒｉｎｇｌｅ１の内側環を含む。図１Ｄは、図１ＡのＦｃ領域と同じＦｃ領域、ならびに全長エンドスタチン４、ポリペプチドリンカー５、およびアンギオスタチン２の全長Ｋｒｉｎｇｌｅ１領域（内側環および外側環の両方）を含む標的タンパク質を含むタンパク質を表す。図１Ｅは、最もＣ末端側のタンパク質ドメインが、アンギオスタチン７の全長コピーをを含むという点で図１Ｄの構築物とは異なる。
【００２７】
図１Ａ〜図１Ｅは、Ｆｃ−Ｘ型構築物を表し、ここでＸが標的タンパク質であるが、Ｘ−Ｆｃ型構築物もまた本発明の実施の際に有用であり得ることが意図される。さらに、本発明の有用なタンパク質もまた、式Ｘ−Ｆｃ−Ｘによって表され得、ここでＸは、同じ標的タンパク質または異なる標的タンパク質を表し得ることが意図される。図１Ｆは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、全長ヒトアンギオスタチン７、ヒンジ領域領域を含むヒト免疫グロブリンＦｃ領域６、および全長ヒトエンドスタチンドメイン４を含む、このような構築物を表す。
【００２８】
用語「新脈管形成インヒビター」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物における新規の血管の形成を低減または阻害する、任意のポリペプチド鎖をいう。癌治療に関して、この新脈管形成インヒビターは、腫瘍内または腫瘍上の、好ましくは固形腫瘍内または固形腫瘍上の新規の血管の形成を低減または阻害する。有用な新脈管形成インヒビターが、当該分野で周知であり、そして当該分野で用いられる種々のアッセイを用いて同定され得ることが意図される。このようなアッセイとしては、例えば、ウシ毛細管内皮細胞増殖アッセイ、ヒナ絨毛尿膜（ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＣＡＭ）アッセイまたはマウスの角膜アッセイが挙げられる。しかし、このＣＡＭアッセイが好ましい（例えば、その開示が本明細書中に参考として援用される、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５を参照のこと）。手短には、インタクトな卵黄を有する胚を、受精した３日齢の白色卵から取り出し、そしてペトリ皿に入れる。３７℃にて、３％ ＣＯ2で３日間インキュベーションした後、推定の新脈管形成インヒビターを含むメチルセルロースディスクを、個々の胚の絨毛尿膜に適用する。約４８時間インキュベーションした後、この絨毛尿膜を、阻害帯の証拠について顕微鏡下で観察した。
【００２９】
本発明の実施において有用な好ましい新脈管形成インヒビターとしては、例えば、アンギオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８、および米国特許第５，７３３，８７６号；同第５，８３７，６８２号；および同第５，８８５，７９５号）、ならびにエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５および米国特許第５，８５４，２０５号）が挙げられる。以前に述べたように、アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、内皮細胞増殖の特異的インヒビターであり、そして腫瘍に栄養を与える新規の血管の形成である新脈管形成をブロックすることにより腫瘍増殖を阻害し得る。
【００３０】
アンギオスタチンは、プラスミノーゲンのタンパク質分解性フラグメントとして同定された（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８、および米国特許第５，７３３，８７６号；同第５，８３７，６８２号；および同第５，８８５，７９５号、そしてこの開示は、本明細書中に参考として援用される）。詳細には、アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの少なくとも３つのＫｒｉｎｇｌｅ領域を含む、プラスミノーゲンの３８ｋＤａの内側フラグメントである。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのタンパク質分解性フラグメントとして同定されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５（その開示は、本明細書中に参考として援用される））。詳細には、エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａのＣ末端フラグメントである。用語「アンギオスタチン」および「エンドスタチン」は、本明細書中で使用される場合、全長タンパク質だけでなく、それらの改変体および生物活性フラグメント、ならびにそれぞれ、プラスミノーゲンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩの生物活性フラグメントもまたいう。アンギオスタチンに関して用語「生物活性フラグメント」は、ＣＡＭアッセイによって決定した場合に、全長アンギオスタチンの少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有する、プラスミノーゲンまたはアンギオスタチンの任意のタンパク質フラグメントをいう。エンドスタチンに関して用語「生物活性フラグメント」は、ＣＡＭアッセイによって決定した場合に、全長エンドスタチンの少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有する、コラーゲンＸＶＩＩＩまたはエンドスタチンの任意のタンパク質フラグメントをいう。
【００３１】
用語改変体は、本明細書中に開示されるエンドスタチンまたはアンギオスタチンのいずれかの天然に存在する配列に少なくとも７０％類似または６０％同一であり、より好ましくは少なくとも７５％類似または６５％同一であり、そして最も好ましくは８０％類似または７０％同一である、種（ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）改変体および対立遺伝子改変体、ならびに他の天然に存在するかまたは天然に存在しない改変体（例えば、従来の遺伝子操作プロトコルによって生成される）を含む。
【００３２】
参照ポリペプチドに対して候補ポリペプチドが必要な類似性百分率または同一性百分率を有するか否かを決定するために、この候補アミノ酸配列およびこの参照アミノ酸配列は、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されるＢＬＯＳＵＭ６２置換行列と組み合わせた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載されるダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて最初に整列される。本発明については、ギャップ挿入ペナルティについて適切な値は−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティについて適切な値は−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎおよびＢＬＯＳＵＭ６２行列のアルゴリズムを用いる整列を行うコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムソフト（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）は、市販され、そして当業者に広範に使用される。
【００３３】
一旦、候補配列と参照配列との間の整列がなされると、類似性パーセントスコアが算出され得る。各配列の個々のアミノ酸は、互いにそれらの類似性に従って順次比較される。２つの整列されるアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２行列における値が０または負の数字である場合、対の様式の（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）類似性スコアは０である；さもなければ、この対の様式の類似性スコアは１．０である。生の類似性スコアは、整列されたアミノ酸の対の様式の類似性スコアの合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のうちのより小さいアミノ酸数によって除算することにより、生のスコアが正規化される。正規化された生のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを算出するために、各配列の整列されたアミノ酸が再度順次比較される。アミノ酸が同一でない場合、対の様式の同一性スコアは０である；さもなければ、この対の様式の同一性スコアは、１．０である。生の同一性スコアは、同一の整列されたアミノ酸の合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のうちのより小さいアミノ酸数によって除算することにより、生のスコアが正規化される。正規化された生のスコアは、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性および同一性のパーセントを算出する目的で無視される。従って、ギャップペナルティは、この算出では用いられないが、これらは最初の整列においては用いられる。
【００３４】
本明細書中に開示される標的タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する融合タンパク質として発現される。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４個または５個のドメインから構成される。これらのドメインは、順番に以下の通りに命名される：ＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3（−ＣＨ4）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラスの間で、交差相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ2ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ2ドメインに、ならびにＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ3ドメインに類似である。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域（好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域）のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメイン、２）ＣＨ1ドメインおよびＣＨ2ドメイン、３）ＣＨ1ドメインおよびＣＨ3ドメイン、４）ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメイン、または５）２以上のドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含み得る。好ましい実施態様では、ＤＮＡ構築物において用いられるＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含み、そして好ましくは少なくともこのＣＨ1ドメインを欠く。
【００３６】
重鎖定常領域を誘導する、現在好ましいクラスの免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。他のクラスの免疫グロブリン（ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ））が用いられ得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に詳細に考察される。特定の結果を達成するための、特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業分野の技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部を含み、そして好ましくはＦｃγのＣＨ3ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含む。
【００３７】
適用に依存して、ヒト以外の種（例えば、マウスまたはラット）由来の定常領域遺伝子が用いられ得る。イムノフュージンＤＮＡ構築物における融合パートナーとして用いられるＦｃ領域は、一般に、任意の哺乳動物種由来であり得る。宿主の細胞または動物においてこのＦｃ領域に対する免疫応答を誘発することが望ましくない場合、このＦｃ領域は、宿主の細胞または動物と同じ種に由来し得る。例えば、ヒトＦｃは、宿主の動物または細胞がヒトである場合に用いられ得；同様に、マウスＦｃは、宿主の動物または細胞がマウスである場合に用いられ得る。さらに、定常領域ドメインの１以上のアミノ酸残基が置換または欠失される、これらの定常領域の構築物の置換または欠失もまた有用である。一例は、アミノ酸置換を上流ＣＨ2領域に導入して、Ｆｃレセプターについての親和性が低減したＦｃ改変体を作製することである（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学技術を用いてこのような構築物を調製し得る。
【００３８】
Ｆｃ領域配列としてのヒトＦｃγ１の使用は、いくつかの利点を有する。例えば、この新脈管形成インヒビターＦｃ融合タンパク質が生物薬剤として用いられる場合、このＦｃγ１ドメインは、この融合タンパク質に対してエフェクター機能活性を付与し得る。このエフェクター機能活性としては、補体結合、抗体指向性細胞傷害性、胎盤移入および血清半減期の増加のような生物学的活性が挙げられる。このＦｃドメインはまた、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによる検出およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（「プロテインＡ」）への結合を介した精製を提供する。しかし、特定の適用では、Ｆｃ領域から特異的エフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター結合または補体結合）を欠失させることが所望され得る。
【００３９】
新脈管形成インヒビターイムノフュージンの場合、免疫グロブリンＦｃ融合パートナーの１つの機能は、新脈管形成インヒビタータンパク質の適切な折り畳みを促進して、活性な新脈管形成インヒビタータンパク質を生じること、および少なくとも細胞外培地中での、活性部分に対する溶解度に影響を与えることである。Ｆｃ融合パートナーは親水性であるので、この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成される組換えエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）とは異なり、容易に可溶性である。本明細書中に開示される実施例の全てにおいて、イムノフュージンの高レベルの生成が得られた。この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、代表的には約３０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度で培地中に分泌された。そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって均質になるまで容易に精製され得る。さらに、この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは切断され得、そして例えば、ヘパリンセファロース、リジンセファロースまたはアフィニティー精製を用いる従来の精製プロトコルを用いてさらに精製され得る。
【００４０】
高レベルの発現に加えて、本発明の融合タンパク質はまた、おそらく、それらのより大きな分子サイズに起因して、より長い血清半減期を示す。例えば、ヒトＦｃ−ヒトアンギオスタチンは、ヒトアンギオスタチンについての４〜６時間の血清半減期と比較して、マウスにおいて３３時間の血清半減期を有する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：６８９）。４０ｋＤの分子量を有するアンギオスタチンおよび２０ｋＤの分子量を有するエンドスタチンは、腎臓濾過によって効率的にクリアランスされるのに充分に小さいと考えられる。対照的に、二量体形態のＦｃアンギオスタチンおよび二量体Ｆｃ−エンドスタチンは、それぞれ、１４５ｋＤおよび１００ｋＤである。これは、２つのアンギオスタチン分子または２つのエンドスタチン分子のいずれかに結合した２つの免疫グロブリンＦｃ領域が存在するからである。このような二価構造は、アンギオスタチンレセプターまたはエンドスタチンレセプターに対して、より高い結合親和性を示し得る。この新脈管形成阻害活性がレセプターによって媒介される場合、このＦｃ融合タンパク質は、一価のアンギオスタチンまたは一価のエンドスタチン単独よりも、腫瘍を抑制するために潜在的により効果的である。さらに、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチンが、二量体タンパク質リガンドのクラスに属する場合、このＦｃによってアンギオスタチンまたはエンドスタチンに与えられる物理的制約は、二量体化を分子内プロセスにし、従って、平衡をこの二量体に有利にシフトさせ、そしてそのレセプターに対する結合を増強する。システイン残基はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術によって単量体へと適切な位置で導入されて、共有結合的なジスルフィド結合形成を介して二量体を安定化し得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「多価」は、２以上の生物学的に活性なセグメントを組み込む組換え分子をいう。この多価分子を形成するタンパク質フラグメントは、フレームシフトを引き起こすことなく構成要素部分を結合させ、かつ各々が独立に機能するのを可能にする、ポリペプチドペプチドリンカーによって連結され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「二価」は、本発明の融合構築物において２つの標的タンパク質を有する、多価組換え分子（例えば、Ｆｃ−Ｘ分子、ここで、Ｘは独立して、アンギオスタチン、エンドスタチン、またはそれらの改変体から選択される）をいう。免疫グロブリンＦｃ領域（代表的には、それ自体が、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメイン（および必要に応じてＣＨ2ドメイン）の少なくとも一部を含む重鎖フラグメントの二量体である）に融合された２つのＸ部分が存在するので、この分子は二価である（例えば、図１Ａを参照のこと）。本発明の融合構築物がＦｃ−Ｘ−Ｘ形態を有する場合、得られるＦｃ二量体分子は四価である。このＦｃ−Ｘ−Ｘ分子を形成する２つのタンパク質は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。二価分子は、分子とそのレセプターとの間の見かけの結合親和性を増加させ得る。例えば、Ｆｃ−エンドスタチンの第１のエンドスタチン部分が特定の親和性で細胞上のレセプターに結合し得る場合、同じＦｃ−エンドスタチンの第２のエンドスタチン部分は、ずっと高いアビディティ（見かけの親和性）で同じ細胞上の第２のレセプターに結合し得る。これは、第１のエンドスタチン部分が既に結合した後では、第２のエンドスタチン部分がこのレセプターに対して物理的に近いことによる。抗原に対する抗体結合の場合、見かけの親和性は、少なくとも１０4増加する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「多量体」および「多量体性」は、例えば、共有結合的相互作用による（例えば、ジスルフィド結合による）共有結合的、または例えば、疎水性相互作用による非共有結合的のいずれかの、２以上のポリペプチド鎖の安定な会合をいう。用語多量体は、ポリペプチドが同じであるホモ多量体、およびポリペプチドが異なるヘテロ多量体の両方を含むことが意図される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「二量体」は、共有結合的または非共有結合的な相互作用によって２つのタンパク質ポリペプチド鎖が安定に会合している特異的多量体分子をいう。免疫グロブリンＦｃ領域のＦｃフラグメント自体は代表的には、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメイン（および必要に応じてＣＨ2ドメイン）の少なくとも一部を含む、重鎖フラグメントの二量体であることが理解されるべきである。多くのタンパク質リガンドは、それらのレセプターに二量体として結合することが公知である。タンパク質リガンドＸが天然で二量体化する場合、Ｆｃ−Ｘ分子内のこのＸ部分は、ずっと大きな程度で二量体化する。なぜなら、二量体化プロセスは、濃度依存性であるからである。会合した免疫グロブリンＦｃ領域連結された２つのＸ部分が物理的に近位にあることによって、二量体化を分子内プロセスとし、平衡をこの二量体に有利になるように大いにシフトさせ、そしてそのレセプターに対するその結合を増強する。
【００４５】
本発明が、本発明の実施において有用なＦｃ融合タンパク質を作製するために従来の組換えＤＮＡ方法論を利用することが理解される。このＦｃ融合構築物は好ましくは、ＤＮＡレベルで作製され、そして得られるＤＮＡは、発現ベクター中に組み込まれ、そしてイムノフュージンを生成するために発現される。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞に取り込まれ、そして宿主細胞のゲノムと組換わり、そして宿主細胞のゲノム中に組み込まれる能力、またはエピソームとして自律複製する能力があるヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味することが理解される。このようなベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語、標的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳およびＦｃ融合タンパク質産物の分泌を意味することが理解される。
【００４６】
有用な発現ベクターは、Ｆｃ−Ｘ遺伝子の転写に、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを利用する、ｐｄＣｓ（Ｌｏら（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５（この開示は、本明細書中に参考として援用される））である。使用されるヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーター配列は、Ｂｏｓｈａｒｔら，１９８５，Ｃｅｌｌ ４１：５２１（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に提供される配列のヌクレオチド−６０１から＋７に由来した。このベクターはまた、変異体ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を選択マーカーとして含む（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２４９５（この開示は、本明細書中に参考として援用される））。
【００４７】
適切な宿主細胞を、本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトし得、そして標的タンパク質の発現および分泌のために利用し得る。現在、本発明における使用のために好ましい宿主細胞としては、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００４８】
本発明の融合タンパク質を、好ましくは、従来の組換えＤＮＡ方法論によって生成する。融合タンパク質を、好ましくは、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および標的タンパク質（本明細書中で、新脈管形成インヒビターともいう）をコードするＤＮＡ分子の、宿主細胞における発現により生成する。好ましい構築物は、５’から３’方向で、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および標的タンパク質をコードし得る。あるいは、構築物は、５’から３’方向で、シグナル配列、標的タンパク質、および免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「シグナル配列」は、新脈管形成インヒビターイムノフュージン（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）タンパク質の分泌を指向し、その後で翻訳後に宿主細胞において切断される、ペプチドセグメントを意味すると理解される。本発明のシグナル配列はポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、小胞体の膜を横切るタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードする。本発明において有用なシグナル配列としては、以下が挙げられる：抗体軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９、Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２））、抗体重鎖シグナル配列（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６：５７７４））、および当該分野において公知の任意の他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：５１４５を参照のこと）。これらの各参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【００５０】
シグナル配列は当該分野において十分に特徴付けられている。そして代表的に、１６〜３０アミノ酸残基を含むことが公知であり、そしてそれより多いかまたはそれより少ないアミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、以下の３つの領域から構成される：塩基性Ｎ末端領域、中央疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域。中央疎水性領域は、新生ポリペプチドの輸送の間に膜脂質二重層を横切ってシグナルペプチドを固定する４〜１２個の疎水性残基を含む。開始後、シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によって、小胞体の内腔内で切断される。シグナルペプチドの潜在的切断部位は、一般的に、「（−３，−１）ルール」に従う。従って、代表的なシグナルペプチドは、−１位および−３位に小さな中性アミノ酸残基を有し、そしてこの領域においてプロリン残基を欠く。シグナルペプダーゼは、−１アミノ酸と＋１アミノ酸との間のそのようなシグナルペプチドを切断する。従って、シグナル配列をコードするＤＮＡの部分は、分泌の間に、イムノフュージンタンパク質のアミノ末端から切断され得る。これは、Ｆｃ領域および標的タンパク質から構成されるイムノフュージンタンパク質の分泌を生じる。シグナルペプチド配列の詳細な考察は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：４６８３（この開示は、本明細書中で参考として援用される）により提供される。
【００５１】
当業者に明らかなように、本発明における使用のための特定シグナル配列の適合性は、いくつかの慣用的な実験を必要とし得る。このような実験としては、シグナル配列がイムノフュージンの分泌を指向する能力を決定すること、およびまた、イムノフュージンの効率的な分泌を達成するために使用されるべき配列の最適な立体配置（ゲノムまたはｃＤＮＡ）の決定が挙げられる。さらに、当業者は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（上記に言及）により提示されたルールに従って合成シグナルペプチドを作製し得、そして慣用的な実験によってそのような合成シグナル配列の有効性を試験し得る。シグナル配列を、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」、または「リーダーペプチド」としてもまた言及し得る。
【００５２】
シグナル配列と免疫グロブリンＦｃ領域との融合物は、時折、本明細書中で分泌カセットとして言及される。本発明の実施において有用な例示的な分泌カセットは、５’から３’方向で、免疫グロブリン軽鎖遺伝子のシグナル配列、およびヒト免疫グロブリンγ１遺伝子のＦｃγ１領域をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分およびＣＨ3ドメインの少なくとも一部分を含むか、あるいはヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインの少なくとも部分を含む。分泌カセットをコードするＤＮＡは、そのゲノム立体配置内またはそのｃＤＮＡ立体配置内にあり得る。
【００５３】
別の実施態様では、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと新脈管形成インヒビタータンパク質との間に挿入されたタンパク質分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解性切断を提供し、このようにして新脈管形成インヒビタータンパク質からＦｃドメインを分離させる。本明細書中で使用される場合、「タンパク質分解性切断部位」は、タンパク質分解性酵素または他のタンパク質分解性切断剤によって優先的に切断される、アミノ酸配列を意味すると理解される。有用なタンパク質分解性切断部位としては、トリプシン、プラスミン、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解性酵素によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。多くの切断部位／切断剤の対が公知である。例えば、米国特許第５，７２６，０４４号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。標的タンパク質配列がアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、またはそれらの活性な改変体に対する前駆体分子である場合、所望されるタンパク質産物を、エラスチンまたはプラスミンまたはウロキナーゼのような内因性タンパク質分解性酵素での切断により生成し得る。
【００５４】
本発明はまた、大量に作製され得る組換えアンギオスタチンおよび組換えエンドスタチンまたはそれらのフラグメントの種々の組み合わせを含む融合タンパク質を包含する。腫瘍増殖を抑制する際の、実証された有効性にもかかわらず、どのようにアンギオスタチンおよびエンドスタチンが新脈管形成をブロックするかについての機構は、完全には知られていない。アンギオスタチンは、いくつかのＫｒｉｎｇｌｅ構造を有し、そしてエンドスタチンは、種々の構造モチーフ（これらの各々は、単独で、内皮細胞へのタンパク質の結合および抗新脈管形成効果の発揮を担い得るか、またはこれらを補助し得る）を有する。従って、本発明は、天然に存在する全長アンギオスタチンおよびエンドスタチンに対して生理学的に類似した挙動を示す、アンギオスタチンの生物活性フラグメント（例えば、Ｋｒｉｎｇｌｅ１、Ｋｒｉｎｇｌｅ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ３、およびそれらの組み合わせ）、およびエンドスタチンの生物活性フラグメントである標的タンパク質を含む。
【００５５】
本発明の別の実施態様は、新脈管形成インヒビターの二機能性ハイブリッド構築物を提供する。本明細書中で使用される場合、二機能性ハイブリッド分子または構築物は、２つのタンパク質サブユニット（ここで、この２つのサブユニットは、異なるタンパク質に由来し得る）を組合わせることによって生成されるタンパク質を意味する。各タンパク質サブユニットはそれ自身の独立した機能を有し、その結果、ハイブリッド分子では、この２つのサブユニットの機能は付加的または相乗的であり得る。そのような機能的ハイブリッドタンパク質は、動物モデルにおいて調査されるアンギオスタチンおよびエンドスタチンの相乗効果を可能にする。好ましい二機能性ハイブリッドは、直接的またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで直列に連結された、少なくとも２つの異なる新脈管形成インヒビターを含み得る。例えば、好ましい実施態様では、標的配列は、エンドスタチンの少なくとも一部分とインフレームで連結されたアンギオスタチンの少なくとも一部分をコードし、そしてアンギオスタチンドメインおよびエンドスタチンドメインの両方は、抗新脈管形成活性または新脈管形成阻害を示す。２つのユニットは、ポリペプチドリンカーによって連結され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒に、またはタンパク質とＦｃ領域とを連結し得るペプチド配列を意味すると理解される。ポリペプチドリンカーは、好ましくは、グリシンおよび／またはセリンのような複数のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、約１０〜１５残基長の一連のグリシンおよびセリンのペプチドを含む。例えば、米国特許第５，２５８，６９８号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。しかし、最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成を、慣用的な実験によって決定し得ることが意図される。
【００５７】
アンギオスタチンの種々の部分がＦｃ融合タンパク質分子として発現される場合に、高レベルの発現が得られることが見出されている。これはおそらく、Ｆｃ領域がキャリアとして作用し、ポリペプチドがＣ末端で正確に折りたたまれるのを補助するからである。さらに、Ｆｃ領域は、生理的ｐＨでグリコシル化および高度に荷電化され得、このようにしてＦｃ領域は疎水性タンパク質を可溶化させるのを補助し得る。
【００５８】
本発明はまた、Ｆｃ融合タンパク質としての非ヒト種のアンギオスタチンおよびエンドスタチンの生成のための方法を提供する。非ヒト新脈管形成インヒビター融合タンパク質は、新脈管形成インヒビターの前臨床的研究のために有用である。なぜなら、タンパク質薬物の有効性および毒性の試験が、ヒトにおいて試験する前に動物モデル系で実施されなければならないからである。ヒトタンパク質は、マウスモデルでは作用しないかもしれない。なぜなら、このタンパク質は免疫応答を誘発し得、そして／または試験結果を歪める異なった薬物動態を示し得るからである。従って、等価なマウスタンパク質が、マウスモデルにおいて試験するためのヒトタンパク質の最良な代用物である。
【００５９】
マウスにおける標準的なルイス肺がん腫モデル（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）を使用して、可溶性ｈｕＦｃ−ｈｕアンジオスタチン、ｈｕＦｃ−ｈｕエンドスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕアンジオスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチンを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において生成されたその不溶性タンパク質と比較した。可溶性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成された対応タンパク質よりも、ルイス肺モデルにおいて腫瘍増殖を抑制する際により有効であった。さらに、実験室マウスを同系交配し、そしてそれらの腫瘍を自然発生的ではなく誘導した。従って、マウスモデルにおける有効性は、ヒト腫瘍に対する、ありそうな有効性に相関しないかもしれない。イヌにおける前臨床的研究は、自然発生的腫瘍に対するこれらの新脈管形成インヒビターの有効性に関するより正確な情報を提供する。なぜなら、多くの自然に起こる自然発生的なイヌの腫瘍が存在するからである。本発明のマウス（ｍｕ）Ｆｃ−ｍｕアンギオスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチン、およびイヌ（ｃａ）Ｆｃ−ｃａアンギオスタチン、ｃａＦｃ−ｃａエンドスタチンを生成する方法は、マウス系およびイヌ系の両方における新脈管形成インヒビターの前臨床的研究を容易にする。
【００６０】
本発明は、本発明のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を投与することによって、新脈管形成により媒介される状態を処置する方法を提供する。新脈管形成により媒介される状態としては、例えば、以下が挙げられる：固形腫瘍；血液媒介性腫瘍、腫瘍転移、良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および発熱性肉芽腫を含む）；慢性関節リウマチ；乾癬；眼球の新脈管形成疾患（糖尿病性網膜症、未熟児の網膜障害、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障）、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、オースラー−ウェーバー症候群（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；心筋新脈管形成；斑新生血管形成（ｐｌａｑｕｅ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細管拡張症；血友病関節血管線維腫；および創傷肉芽形成；ならびに、内皮細胞、腸接着、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、強皮症および過形成性瘢痕（すなわち、ケロイド）の過剰刺激または異常刺激。
【００６１】
本明細書中に開示されるＤＮＡ構築物は、遺伝子治療手順において有用であり得る。ここでは、エンドスタチン遺伝子およびアンギオスタチン遺伝子を、種々の手段（例えば、プロモーターと結合されたネイティブなＤＮＡ、またはウイルスベクター内におけるＤＮＡ）のうちの１つによって細胞に送達する。一旦、細胞内になると、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチンの遺伝子または遺伝子フラグメントが発現され、そしてこのタンパク質がインビボで生成されて、その正常な生物学的機能を果たす。本発明のＤＮＡ構築物は、融合タンパク質の高レベルの発現を生じる。本発明の融合タンパク質はまた、新脈管形成により媒介される状態を処置する際に有用であり得、そしてネイティブな新脈管形成インヒビターおよび他の組換え新脈管形成インヒビターよりも高い臨床的有効性を有し得る。なぜなら、本発明の新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、他の組換え新脈管形成インヒビターまたはネイティブな新脈管形成インヒビター単独よりも長い血清半減期を有するからである。本発明の二価形態および二量体形態は、その二価構造および二量体構造に起因して、より高い結合親和性を有するはずである。本発明の二機能性ハイブリッド分子は、融合Ｆｃ領域または可撓性ポリペプチドリンカーによって連結された２つの異なる新脈管形成インヒビターについてのあり得る相乗効果に起因して、より高い臨床的有効性を有し得る。
【００６２】
本発明の組成物を、任意の適切な手段によって、直接的に（例えば、局所的に、組織位置への注射、移植、または局所的投与によるような）か、または全身的に（例えば、非経口的または経口的に）、動物に提供し得る。組成物が非経口的に提供される場合（例えば、静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋内、口内、直腸内、膣内、眼窩内、大脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内、鞘内、槽内、嚢内、鼻腔内、またはエアロゾル投与による）、好ましくは、組成物は、水性の部分か、または生理的に適合性の流体の懸濁物もしくは溶液を含む。従って、キャリアまたはビヒクルは生理的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の患者への送達に加えて、これは他の点で患者の電解質および／または容量均衡に有害に作用しない。従って、この薬剤のための流体の培地は、正常生理食塩水（例えば、９．８５％水性ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含み得る。
【００６３】
投与あたりのイムノフュージンの好ましい投薬量は、５０ｎｇ／ｍ2〜１ｇ／ｍ2、より好ましくは５μｇ／ｍ2〜２００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2〜５０ｍｇ／ｍ2の範囲内である。投与あたりのイムノフュージンをコードする核酸の好ましい投薬量は、１μｇ／ｍ2〜１００ｍｇ／ｍ2、より好ましくは２０μｇ／ｍ2〜１０ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは４００μｇ／ｍ2〜４ｍｇ／ｍ2の範囲内である。しかし、投与の最適な様式および投薬量を、当該分野の技術レベルの十分範囲内にある慣用的実験によって決定し得ることが意図される。
【００６４】
本発明を、以下の限定されない実施例によってさらに例証する。
【実施例】
【００６５】
（実施例）
（実施例１．ｈｕＦｃ−ｈｕエンドスタチンの発現）
ヒトエンドスタチンを、Ｌｏら（１９９８）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５）の教示に従って、ヒトＦｃ−ヒトエンドスタチン（ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏ）融合タンパク質として発現させた。Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンγのＦｃフラグメントをいう（配列番号１に示されるＤＮＡ配列；配列番号２に示されるアミノ酸配列）。（ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ）を使用して、Ｆｃ−Ｅｎｄｏ融合タンパク質における発現に、エンドスタチンｃＤＮＡ（配列番号３；このアミノ酸配列は、配列番号４に開示される）を合わせた。正方向プライマーは、５’−ＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ Ｃ（配列番号５；配列番号６に開示されるアミノ酸をコードした）、または５’−Ｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ Ｃ（配列番号７；コードされるアミノ酸を配列番号８に開示する）のいずれかであって、ここでＸｍａＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位にはエンドスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。ＸｍａＩ部位を有するプライマーは、ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ3ドメインの末端でのＸｍａＩ部位への連結に、エンドスタチンｃＤＮＡを合わせた。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプライマーは、融合タンパク質の連結部にエンテロキナーゼ認識部位であるＡｓｐ4−Ｌｙｓ（Ｌａ Ｖａｌｌｉｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３３１１−２３３１７）を含むｐｄＣｓ−Ｆｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位への連結に、エンドスタチンｃＤＮＡを合わせた。逆方向プライマーは、５’−Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＣＡＴ Ｇ（配列番号９）（これは、エンドスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を置くように設計された）であり、これにはＸｈｏＩ部位が続く。ＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、そして得られたＸｍａＩおよびＸｈｏＩ消化ｐｄＣｓ−ＦｃベクターにＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを連結させた。同様に、エンドスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、適切に消化したｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクター内に連結した。Ｆｃ−ｅｎｄｏまたはＦｃ（Ｄ4Ｋ）−エンドスタチンを発現する安定なクローンを、ＮＳ／０細胞のエレクトロポレーション、次いで、１００ｎＭメトトレキサートを含有する増殖培地における選択によって得た。タンパク質発現レベルを、抗ヒトＦｃＥＬＩＳＡ（実施例３）によってアッセイし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約５２ｋＤのタンパク質産物が示された。最良の産生クローンを、限界希釈によってサブクローニングした。
【００６６】
（実施例２．細胞培養およびトランスフェクション）
一過性トランスフェクションについて、リン酸カルシウムとプラスミドＤＮＡとの沈降によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）か、またはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いたリポフェクションによって、プラスミドをヒト腎臓２９３細胞内に導入した。
【００６７】
安定的にトランスフェクトされたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによってマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞内に導入した。ＮＳ／０細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地内で増殖させた。約５×１０6細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、１０μｇの直鎖化プラスミドＤＮＡを、細胞と共にＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（０．４ｃｍ電極ギャップ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中で氷上にて１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションを、０．２５Ｖおよび５００μＦの設定で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて実施した。細胞を、氷上で１０分間で回復させ、その後この細胞を増殖培地中に再懸濁し、次いで、２つの９６ウェルプレート上にプレーティングした。安定的にトランスフェクトされたクローンを、トランスフェクションの２日後に導入された１００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下での増殖によって選択した。細胞に、３日おきにさらに３回補給し、そして２〜３週間でＭＴＸ耐性クローンが現れた。クローン由来の上清を、高産生株を同定するために、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによってアッセイした。抗産生クローンを単離し、そして１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中で増殖させた。
【００６８】
（実施例３．ＥＬＩＳＡ手順）
３つの異なるＥＬＩＳＡを使用して、ＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの上清におけるタンパク質産物の濃度を決定した。抗ヒトＦｃ（ｈｕＦｃ）ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＦｃ含有タンパク質の量を測定した。抗マウスＦｃ（ｍｕＦｃ）抗体および抗イヌ（ｃａＦｃ）抗体をＥＬＩＳＡで使用して、それぞれ、マウスＦｃ含有タンパク質およびイヌＦｃ含有タンパク質の量を測定した。抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡについての手順は、本明細書中で以下に詳細に記載される。
【００６９】
（Ａ．プレートのコーティング）
ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｐTM、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）において１００μｌ／ウェルにてコーティングした。コーティングされたプレートを被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そしてＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清（２００μｌ／ウェル）でブロックした。３７℃で２時間のブロッキング緩衝液とのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、そしてペーパータオルで軽く叩いて乾かした。
【００７０】
（Ｂ．試験サンプルおよび２次抗体とのインキュベーション）
試験サンプルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するサンプル緩衝液において適切な濃度に希釈した。濃度が既知であったキメラ抗体（ヒトＦｃを有する）を用いて、検量線を作成した。検量線を作成するために、サンプル緩衝液中に連続希釈を作製して、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる検量線を得た。希釈サンプルおよび基準物をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、次いで、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに、サンプル緩衝液中で約１：１２０，０００で希釈された１００μｌの２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を添加した。２次抗体の正確な希釈は、ＨＲＰ結合体化抗ヒトＩｇＧの各ロットについて決定されなければならない。３７℃での２時間のインキュベーションの後、このプレートをＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。
【００７１】
（Ｃ．呈色）
基質溶液を、０．０３％の新たに添加されたＨ2Ｏ2を含有する１５ｍｌの０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ５）中に、３０ｍｇ（１錠）のｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を溶解することによって調製した。この基質溶液を、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。色は、暗黒下にて室温で、３０分間で呈色が可能であった。呈色時間は、コーティングされたプレート、２次抗体などのロット毎の変動性に依存して、変更され得る。この反応を、１００μｌ／ウェルで４ＮのＨ2ＳＯ4を添加することによって停止させた。このプレートを、プレートリーダー（これを、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍの両方に設定し、そして４９０ｎｍでのＯＤから６５０ｎｍでのバックグラウンドＯＤを差し引くようにプログラムした）で読み取った。
【００７２】
抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡについての手順は、ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で、１００μｌ／ウェルにてコーティングすること；そして、２次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ｍｕＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（５０００中で１の希釈率で使用）であったことを除いて、同様であった。同様に、抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡについて、ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で１００μｌ／ウェルにてコーティングし；そして、２次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）であった（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（５０００中で１の希釈率で使用）。
【００７３】
（実施例４．ｈｕＦｃ−ｈｕアンギオスタチンの発現）
ヒトアンギオスタチン（配列番号１０に示されるＤＮＡ配列；配列番号１１に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例１に記載されるように、ヒトＦｃ−ヒトアンギオスタチン（ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏ）融合タンパク質として発現させた。ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターまたはｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現にアンギオスタチンｃＤＮＡ（配列番号３）を合わせるために、ＰＣＲを使用した。それぞれの正方向プライマーは、５’−ＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＣＡ ＧＡＧ（配列番号１２；配列番号１３に開示されるアミノ酸をコードした）、および５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＣＡ ＧＡＧ（配列番号１４；配列番号１５に開示されるアミノ酸をコードした）であり、ここでＸｍａＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位の後には、アンギオスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、アンギオスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された、５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号１６）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてアンギオスタチンをコードする得られたＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、それぞれ、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターおよびｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏおよびｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｈｕＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイした。
【００７４】
（実施例５．ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチンの発現）
マウスエンドスタチン（配列番号１７に示されるＤＮＡ配列；配列番号１８に示されるアミノ酸配列）およびマウスＦｃ（配列番号１９に示されるＤＮＡ配列；配列番号２０に示されるアミノ酸をコードした）を、本質的に実施例１に記載されるように、マウスＦｃ−マウスエンドスタチン（ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ）融合タンパク質として発現させた。ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現めにエンドスタチンｃＤＮＡ（配列番号４）を合わせるために、ＰＣＲを使用した。正方向のプライマーは、５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＴＴＴ Ｃ（配列番号２１；配列番号２２に開示されるアミノ酸をコードした）であり、ここでＨｉｎｄＩＩＩ部位には、エンドスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、エンドスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＧＴ Ｃ（配列番号２３）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてエンドスタチンをコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクター中に連結した。ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｍｕＥｎｄｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイ（抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡ）した。
【００７５】
（実施例６．ｍｕＦｃ−ｍｕアンギオスタチンの発現）
マウスアンギオスタチン（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列；配列番号２５に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例１に記載されるように、マウスＦｃ−マウスアンギオスタチン（ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ）融合タンパク質として発現させた。ＰＣＲを、ｐｄＣｓ−Ｆｓ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現にアンギオスタチンｃＤＮＡ（配列番号６）を合わせるために使用した。正方向プライマーは、５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＴＧＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号２６；配列番号２７に開示されるアミノ酸をコードする）であり、ここでＨｉｎｄＩＩＩ部位には、アンギオスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、アンギオスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号２８）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｍｕＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイ（抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡ）した。
【００７６】
（実施例７．イヌＦｃ（ｃａＦｃ）の発現）
イヌの血液から単離されたイヌ末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、ｍＲＮＡを調製した。逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）を用いる第１鎖ｃＤＮＡの合成後に、正方向プライマー５’−ＣＣ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＧＣ（配列番号２９；配列番号３０に開示されるアミノ酸をコードした）（ここでＡｆＩＩＩ部位を、イヌＦｃのヒンジ領域をコードする配列のすぐ上流に導入した）および逆方向プライマー５’−Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＴ ＣＴＧ（配列番号３１）（ここでＸｈｏＩ部位を、イヌＦｃの翻訳終止コドン（アンチコドン、ＴＣＡ）の後に導入した）を使用して、イヌＦｃ（Ｋａｚｕｈｉｋｏら、（１９９２）ＪＰ １９９２０４０８９４−Ａ１）を増幅するために、ＰＣＲを実行した。逆方向プライマーはまた、ＸｍａＩ制限部位を作製するためにサイレント変異を導入し、これによりリンカー−アダプターを通じたｐｄＣｓ−ｃａＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターの構築およびイヌのエンドスタチンまたはアンギオスタチンをコードするＤＮＡ構築物への連結が容易になった。Ｌｏら（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１：４９５）に詳細に記載されたｐｄＣｓ−ｈｕＦｃの構築と同様に、ｐｄＣｓ−ｃａＦｃについての発現ベクターを、以下の通りに構築した。イヌＦｃをコードするＡｆＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、軽鎖シグナルペプチドをコードするＸｂａＩ−ＡｆＩＩＩフラグメントおよびＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化したｐｄＣｓベクターに連結した。次いで、得られたｐｄＣｓ−ｃａＦｃ発現ベクターを使用して、２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ３日後、この上清を、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。イヌＦｃ（配列番号３２に示されるＤＮＡ配列；配列番号３３に示されるアミノ酸配列）の発現を、ペルオキシダーゼ結合体化ウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウエスタンブロット分析により確認した。
【００７７】
（実施例８．ｃａＦｃ−ｃａエンドスタチンの発現）
イヌエンドスタチンのコード配列（配列番号３４に示されるＤＮＡ配列；配列番号３５に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例５に記載されるように、Ｆｃ融合タンパク質としての発現のために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントに合わせた。３’末端にて、終止コドンを、例えば、ＰＣＲによって、Ｃ末端のリジン残基をコードするコドンのすぐ後に導入し、そしてこれには、ＮｏｔＩ制限酵素部位が続いた。しかし、５’末端では、再構築に都合のよいＤｒａＩＩＩ制限部位が存在した。ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端およびＤｒａＩＩＩ粘着末端からなるオリゴヌクレオチド２重鎖を化学的に合成し、そしてイヌエンドスタチンｃＤＮＡの残りをコードするＤｒａＩＩＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントに連結するために使用した。使用された二重鎖を以下に示す：
【００７８】
【化１】
二重鎖における第１のＣＡＣは、イヌエンドスタチンのＮ末端ヒスチジン残基をコードする。従って、全長のイヌエンドスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントは、発現のためにＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩで消化したｐｄＣｓ−ｃａＦｃベクター（実施例７を参照のこと）に連結され得る。ｃａＦｃ−ｃａＥｎｄｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そして抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡによりアッセイした。このタンパク質産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そしてウエスタンブロット分析により確認した。
【００７９】
（実施例９．ｃａＦｃ−ｃａアンギオスタチンの発現）
全長のイヌアンギオスタチンをコードするｃＤＮＡ（配列番号３９に示されるＤＮＡ配列；配列番号４０に示されるアミノ酸配列）を、本質的に前述の実施例に記載されるように、ｃａＦｃ融合タンパク質として、発現に合わせた。簡潔には、３’末端にて、終止コドンを、例えば、ＰＣＲによって、Ｃ末端のリジン残基をコードするコドンのすぐ後に導入し、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位の代わりのＮｏｔＩ制限部位が続いた。なぜなら、イヌアンギオスタチンのｃＤＮＡにおいて、内側ＸｈｏＩ制限部位が存在したからであった。５’末端にて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、アンギオスタチンのＮ末端のすぐ上流にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で導入した。次いで、全長のイヌアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、発現のために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化したｐｄＣｓ−ｃａＦｃベクターに連結した（ここでＮｏｔＩ部位を、リンカー連結を通してＸｈｏＩ部位に導入した）。ｃａＦｃ−ｃａＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そして抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡによりアッセイした。このタンパク質産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そしてウエスタンブロット分析により確認した。
【００８０】
（実施例１０．ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ Ｋ１の発現）
アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの５つのＫｒｉｎｇｌｅドメインのうちの初めの４つを含む。いずれか１個または数個のＫｒｉｎｇｌｅドメインがアンギオスタチンの観察された抗脈管形成活性を担うか否かを決定するために、試験のために、１個のＫｒｉｎｇｌｅドメインを単独でまたはそれらの組合せで産生することが、可能である。融合タンパク質パートナーとしてのＦｃの有用性を実証するために、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋ１）の発現を、以下の方法で達成した。第１のＫｒｉｎｇｌｅドメインは、マウスアンギオスタチン（配列番号２５）のＧｌｕ−８７で終了する。ｃＤＮＡ中のこの位置には、都合のよいＮｓｉＩ制限部位が存在したので、その結果、ＮｓｉＩによる消化の後に、４塩基の３’突出をＴ４ポリメラーゼにより除去して、平滑末端を作製した。翻訳終止停止コドンを、パリンドロームリンカーＴＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ（配列番号４１）への連結を通して、Ｇｌｕ−８７をコードするＧＡＡのすぐ下流に導入した。ここで終止コドンＴＧＡには、ＸｈｏＩ部位が続いた。次いで、この短縮型アンギオスタチン（すなわち、第１のＫｒｉｎｇｌｅのみ）をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、高レベルの発現が、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８１】
（実施例１１．ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ内側Ｋ１の発現）
Ｋｒｉｎｇｌｅドメインは、複数のループ（外側のループおよび内側のループを含む）からなる。マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅでは、この内側のループはＣｙｓ５５およびＣｙｓ７９によって規定され、これは一緒になって、このループの基部でジスルフィド結合を形成する。内側のループのＣｙｓ−６７は、外側のループのＣｙｓ残基と別のジスルフィド結合を形成し、Ｋｒｉｎｇｌｅ構造を生じる。この内側のループが任意の抗脈管形成活性を有するか否かを試験するために、これを、以下の通りにｍｕＦｃ−内側Ｋ１（Ｋｒｉｎｇｌｅ１）として発現させた。テンプレートとして第１のＫｒｉｎｇｌｅをコードするＤＮＡフラグメントとともに、配列５’ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＡＣＡ（配列番号４２；配列番号４３に開示されるアミノ酸をコードした）を有する変異原性プライマーを使用して、ＰＣＲによって、ＴＧＣ（Ｃｙｓ−６７）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）に変異誘発した。このことは、Ｋｒｉｎｇｌｅ１の内側のループが外側のループなしに発現される場合に、Ｃｙｓ−６７がジスルフィド結合を形成しないことを保証する。配列５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＧＧ（配列番号４４；配列番号４５に開示されるアミノ酸をコードした）を有する上流プライマーを使用して、Ｓｅｒ−４３（ＡＧＴ）に対するコドンのすぐ５’にインフレームでＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＢａｍＨＩ部位もまた、このＨｉｎｄＩＩＩ部位のすぐ上流に導入した。このＢａｍＨＩ部位は、以下の実施例１２に示される可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの末端に、ＢａｍＨＩ部位を連結するために有用である。従って、マウスアンギオスタチンのＳｅｒ−４３からＧｌｕ−８７をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−内側Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８２】
（実施例１２．ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏ 内側Ｋ１の発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−内側Ｋ１は、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅの内側のループに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を以下の通りに構築した。
【００８３】
マウスエンドスタチンｃＤＮＡの３’末端にＢｓｐＨＩ部位が存在する。マウスエンドスタチンのＣ末端にグリシン残基およびセリン残基の可撓性リンカーを導入するために、エンドスタチンをコードする５４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｐＨＩフラグメントを、配列番号４６および配列番号４８に開示されるオリゴヌクレオチドにより形成される重複するオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。配列番号４６によってコードされるアミノ酸リンカーを、配列番号４７に開示する。
【００８４】
マウスエンドスタチンおよびＧｌｙ−ＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、標準的なクローニングベクター中にサブクローニングした。次いで、ＢａｍＨＩ部位を使用して、実施例１１における内側Ｋ１をコードするＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを導入した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−内側Ｋ１をコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−内側Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８５】
（実施例１３．ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏ Ｋ１の発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−Ｋ１は、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を以下の通りに構築した。
【００８６】
ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１２）のＢａｍＨＩ末端を、以下のアダプターを通じて、マウスアンギオスタチンのＫｒｉｎｇｌｅ１をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（実施例１０）に連結した：
【００８７】
【化２】
このアダプターは、ＨｉｎｄＩＩＩ’粘着末端を有し、これは、連結の際にＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生しない。従って、ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−Ｋｒｉｎｇｌｅ１をコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８８】
（実施例１４ ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏの発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏは、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を、本質的に以下の通りに構築した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１２）のＢａｍＨＩ末端を、実施例１３に記載されるアダプターを通して、マウスアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏをコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏの高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８９】
（実施例１５．ｈｕＡｎｇｉｏ−ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏの発現）
ハイブリッド分子ｈｕＡｎｇｉｏ−ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏは、ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏにペプチド結合により連結されたヒトアンギオスタチンを含む。このＤＮＡ構築物を、以下の通りに構築した。終止コドンを有さないヒトアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＰＣＲによって初めに作製し、その結果、アンギオスタチンの最後のアミノ酸残基についてのコドンには、ＸｈｏＩ部位のＣＴＣＧＡＧがすぐ続いた。５’末端のＨｉｎｄＩＩＩを、ＡｆＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ’アダプターを通して、軽鎖シグナルペプチド（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１：４９５）のＸｂａＩ−ＡｆＩＩＩフラグメントに連結した：
【００９０】
【化３】
アダプターのＨｉｎｄＩＩＩ’粘着末端は、連結の際にＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生しなかった。３’末端にて、ＸｈｏＩ部位を、以下のＸｈｏＩ’−ＡｆＩＩＩアダプターを通じて、ｈｕＦｃ−ｈｕ−ＥｎｄｏをコードするＡｆＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントのＡｆＩＩＩ部位に連結した：
【００９１】
【化４】
このアダプターのＸｈｏＩ粘着末端は、連結の際にＸｈｏＩ部位を再生しない。シグナルペプチド−ヒトアンギオスタチン−ｈｕＦｃ−ヒトエンドスタチンをコードする得られたＸｂａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓベクター中にクローニングした。高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したとき一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００９２】
（実施例１６ 薬物動態学）
薬物動態学研究の１つのセットでは、１００〜２００ｍｍ3のＬｅｗｉｓ肺腫瘍を移植されたＣ５７／ＢＬ６マウスに尾静脈において、１匹のマウス当たり７２０μｇのｈｕＦｕ−ｈｕＡｎｇｉｏを注射した。本研究で使用された腫瘍のサイズおよびｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏの用量を選択して、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：６８９）により記載される実際の処置プロトコルをシミュレートした。血液を眼窩後方の採血により、注射後１／２、１、２、４、８、２４、および４８ｈｒに回収した。この血液サンプルを、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ、続いてウエスタン分析によって分析した。ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏは、マウスにおいて約３２時間の循環半減期を有することが見出され、そしてウエスタン分析は、９０％を超えるｈｕ−Ｆｃ−ｈｕＡｎｇｉｏが循環中にインタクトな分子として残っていたことを示した。
【００９３】
薬物動態学研究をまた、腫瘍を有さないＳｗｉｓｓマウスにおいて、２００μｇ／マウスの用量で繰り返した。この場合では、ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏは、約３３時間の循環半減期を有することが見出された。
【００９４】
（均等物）
本発明は、それらの精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に記載される本発明を限定するのでなく、例示的であると全ての点において考慮されるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内となる全ての変化は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、新脈管形成インヒビターを含む融合タンパク質を作製および使用するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および新脈管形成インヒビターを含む、イムノフュージン（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）と呼ばれる融合タンパク質を作製および使用するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
２つの強力な新脈管形成インヒビターであるアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５）およびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）が発見され、そして原発性腫瘍によって本来生成されることが見出された。両方のタンパク質は、内皮細胞増殖の特異的なインヒビターであり、そして腫瘍に栄養を与える新規の血管の形成である新脈管形成をブロックすることによって腫瘍増殖を阻害する。研究により、これらの新脈管形成インヒビターが非常に高い用量でさえも非毒性であり、そしてこれらが転移の増殖を抑制し得、そして原発性腫瘍が休眠した顕微鏡状態まで後退し得ることが示された。両方のインヒビターは、ずっと大きなインタクトな分子のタンパク質分解性フラグメントとして同定された。アンギオスタチンは、プラスミノーゲンのフラグメントであり、そしてエンドスタチンはコラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメントであることが見出された。
【０００３】
これらの２つのタンパク質は、癌の分野において大きな興味を生じてきた。なぜなら、これらは、明らかな副作用も薬物耐性も伴わずに、マウスにおいて多くの異なる型の腫瘍の増殖を抑制することが示されているからである。伝統的な化学療法は一般に、癌細胞の遺伝的不安定性により主に引き起こされる、後天性薬物耐性をもたらす。癌細胞を標的とするよりも、新脈管形成インヒビターを用いる治療は、腫瘍の増殖を支持する正常な内皮細胞を標的とする。内皮細胞は遺伝的に安定であるので、新脈管形成インヒビター治療がより少ない薬物耐性をもたらし得ることは可能である。研究により、エンドスタチンを用いる長期の抗新脈管形成治療に暴露したマウスにおいて薬物耐性が発達しなかったことが示される。さらに、マウスにおける反復サイクルのエンドスタチン処置は、長期の腫瘍休眠および治療中止後に腫瘍の再発がないことをもたらした（Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：４０４）。
【０００４】
マウスにおける有望な結果にもかかわらず、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルス、酵母および哺乳動物発現系を用いて商業的品質の、臨床グレードの可溶性の活性なアンギオスタチンおよびエンドスタチンを生成することは可能ではなかった。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現は、不確定の組成の不溶性のタンパク質凝集物を生じた。このタンパク質凝集物は、ヒト注射できない。他の生成方法（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系）は、非常に低レベルのこの組換えタンパク質を生じた（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）。
【０００５】
今日までのこの発現系の乏しい収量は、アンギオスタチンおよびエンドスタチンの両方が、ずっと大きなタンパク質の内部フラグメントであることにより説明され得る。短縮型タンパク質は、前駆体分子から切断される残基がなければ適切には折り畳まれないのかもしれない。例えば、アンギオスタチンは、多数のジスルフィド結合を形成する、２６個のシステイン残基を有する。アンギオスタチンの発現は、独力では、これらの多数のジスルフィド結合が、分泌経路において正しく形成するのに最適な環境を提供しないかもしれない。また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成されるこの組換えエンドスタチンタンパク質は、おそらく、エンドスタチンの疎水性に起因して、透析の間に沈澱した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）．
それらの現在の形態におけるアンギオスタチンおよびエンドスタチンの使用に関する主要な障害は、所望の臨床結果を達成するためには、比較的多量のタンパク質を、数週間から数ヶ月にわたって毎日注射しなければならないことである。例えば、最近のマウスモデルでは、２０ｍｇ／ｋｇ／日のエンドスタチンの投薬量が、最適な効力を実証するために必要とされる（Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０：４０４）。エンドスタチンおよびアンギオスタチンを臨床的に試験する差し迫った必要性があることを考慮すると、大量の臨床的グレードの物質を生成し得る生成方法が重要である。
【０００６】
哺乳動物細胞における融合タンパク質の高レベルの発現を生じるために用いられている１つの発現系は、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域および標的タンパク質をコードする、ＤＮＡ構築物である。この構築物の融合産物は一般に、「イムノフュージン」と呼ばれる。以下を含むいくつかの標的タンパク質がイムノフュージンとして成功裏に発現されている：ＩＬ２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、βＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥレセプター、ＰＳＭＡおよびｇｐ１２０。これらの発現構築物は、その開示が本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５４１，０８７号および米国特許第５，７２６，０４４号に開示される。
【０００７】
哺乳動物細胞において組換え融合タンパク質を発現する主要な目的は、新規なまたは有用な特性（例えば、適切な折り畳み、溶解度の増加、インビボにおけるサイトカインまたは毒素の標的化、Ｆｃレセプター結合、補体結合、プロテインＡ結合、循環半減期の増加および血液脳関門を通過する能力の増加）をハイブリッド分子に付与しようとすることであった。哺乳動物細胞において生成された組換え融合タンパク質の例としては、サイトカイン免疫結合体（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２３０）、、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）（Ｃａｐｏｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５）、イムノトキシン（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４）、および神経成長因子結合体（Ｆｒｉｄｅｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３７３）が挙げられる。上記の刊行物の各々は、本明細書中に参考として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、種々の哺乳動物宿主細胞における新脈管形成インヒビターの効率的な生成および分泌を促進する新規なＤＮＡを提供することである。本発明の別の目的はまた、非天然の、生合成の、またはそうではない人工のタンパク質（例えば、合理的な設計によって作製されたタンパク質）を含む、新脈管形成インヒビタータンパク質をコードする核酸、または新脈管形成インヒビタータンパク質を規定するアミノ酸配列で哺乳動物を処置するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、新脈管形成インヒビタータンパク質を含む融合タンパク質を作製および使用する際に有用な、方法および組成物を特徴とする。この融合タンパク質は、生物学的に活性な新脈管形成インヒビタータンパク質の高レベルの発現を促進し得る。次いで、この新脈管形成インヒビタータンパク質は、この融合タンパク質から切断され得、そして哺乳動物（例えば、ヒト）への投与の前に薬学的に受容可能なキャリアと合わされ得る。あるいは、新脈管形成インヒビター含有融合タンパク質をコードする核酸配列または新脈管形成インヒビター含有融合タンパク質を規定するアミノ酸配列は、薬学的に受容可能なキャリアと合わされ得、そして哺乳動物に投与され得る。
【００１０】
１つの局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）を提供する。この核酸分子は、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびに本明細書中では、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本明細書中で新脈管形成インヒビタータンパク質とも呼ばれる、少なくとも１つの標的タンパク質をコードする。好ましい実施態様では、この核酸分子は、５’から３’の方向で連続して、このシグナル配列、この免疫グロブリンＦｃ領域およびこの標的タンパク質配列をコードする。別の好ましい実施態様では、この核酸分子は、５’から３’の方向で連続して、このシグナル配列、この標的配列および免疫グロブリンＦｃ領域をコードする。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、この免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域を含み、そして好ましくは少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、免疫グロブリン重鎖定常２（ＣＨ2）ドメイン、免疫グロブリン重鎖定常３（ＣＨ3）ドメイン）、およびＦｃ領域を生成するために用いられる免疫グロブリンの型に依存して、必要に応じて免疫グロブリン重鎖定常領域４（ＣＨ4）ドメインを含む。より好ましい実施態様では、この免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む。特定の状況下では、この免疫グロブリンＦｃ領域は好ましくは、少なくともこのＣＨ1ドメインを欠く。この免疫グロブリンＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に基づき得るが、ＩｇＧに基づく免疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。
【００１２】
別の実施態様では、本発明の核酸は、複製可能な発現ベクター中に作動性に連結して組み込まれ得、次いでこれは、哺乳動物宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。別の好ましい実施態様では、本発明は、本発明のこのような核酸配列を保有する宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の局面では、本発明は、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質に、ポリペプチド結合を介して直接、またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで連結された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供する。この標的タンパク質は、そのＣ末端を介してこの免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端へと融合され得る。しかし、さらに好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、そのＮ末端を介して免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端へと融合される。
【００１４】
別の実施態様では、この融合タンパク質は、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメントおよびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される第２の標的タンパク質を含み得る。この型の構築物では、第１および第２の標的タンパク質は、同一のタンパク質または異なるタンパク質であり得る。例えば、好ましい実施態様では、この融合タンパク質は、アンギオスタチンという第１の標的タンパク質、免疫グロブリンＦｃ領域およびエンドスタチンという第２の標的タンパク質を含む。第１および第２の標的タンパク質は、直接またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで一緒に連結され得る。あるいは、両方の標的タンパク質は、直接またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで、この免疫グロブリンＦｃ領域に連結され得る。後者の場合、この第１の標的タンパク質は、この免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結され、そしてこの第２の標的タンパク質は、この免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される。
【００１５】
別の実施態様では、２つの融合タンパク質は、共有結合的に（例えば、ジスルフィド結合もしくはペプチド結合によって）または非共有結合的にのいずれかで会合して、多量体タンパク質を生成し得る。好ましい実施態様では、２つの融合タンパク質は、（好ましくは、両鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に配置された免疫グロブリンヒンジ領域内に位置する）システイン残基を介する１以上のジスルフィド結合によって共有結合される。
【００１６】
好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、約４０ｋＤの分子量を有し、そして必要に応じて配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、プラスミノーゲンフラグメントを含む。別の好ましい実施態様では、この標的タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントを含む。
【００１７】
さらに、この標的タンパク質は、全長アンギオスタチンもしくは全長エンドスタチン、またはそれらの生物活性のあるフラグメントであり得る。特定の融合タンパク質を作製する際のこの標的タンパク質の供給源は、この標的タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、この標的タンパク質がヒトに投与されるべきである場合、この標的タンパク質は好ましくは、ヒト起源のものである。
【００１８】
別の局面では、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびにアンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、およびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される標的タンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）シグナル配列を有するかまたは有さないかのいずれかのこのような融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する工程、および（ｂ）この哺乳動物細胞を培養して、この融合タンパク質を生成する工程。次いで、得られる融合タンパク質は、収集され得、再折り畳みされ得、そして必要な場合、当該分野で周知であり、そして当該分野で用いられる従来の精製技術を用いて精製され得る。この融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ領域とこの標的タンパク質との間に配置されたタンパク質分解性切断部位を含むと仮定して、この標的は、従来のタンパク質分解性酵素を用いて融合タンパク質から切断され得、そして必要な場合使用の前に精製され得る。
【００１９】
別の局面では、本発明は、新脈管形成インヒビターに基づく治療を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）を処置するための方法を提供する。例えば、本発明の新脈管形成インヒビターが、腫瘍に罹患したヒトに投与され得ることが意図される。新脈管形成インヒビターでの処置は、腫瘍増殖を減速または停止させ得、そして特定の状況下では、腫瘍後退を引き起こし得る。処置は、この哺乳動物に、腫瘍増殖を減速または停止させるのに充分な量の新脈管形成インヒビターを投与する工程を含み得る。この新脈管形成インヒビターは、融合タンパク質の形態で、または（好ましくは発現ベクターと作動可能に連結された）核酸として、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて提供され得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） 融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、以下：
（ａ）シグナル配列；
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域；ならびに
（ｃ）アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質配列、
を含む、ＤＮＡ分子。
（項目２） 前記シグナル配列、前記免疫グロブリンＦｃ領域および前記標的タンパク質配列が、５’から３’の方向で連続してコードされる、請求項１に記載のＤＮＡ。
（項目３） 前記シグナル配列、前記標的配列および前記免疫グロブリンＦｃ領域が、５’から３’の方向で連続してコードされる、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目４） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目５） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域および免疫グロブリン定常重鎖ドメインを含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目６） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメインを含む、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目７） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも前記ＣＨ1ドメインを欠く、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目８） 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも免疫グロブリンγの一部をコードする、項目１に記載のＤＮＡ。
（項目９） 哺乳動物細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターであって、該ベクターが、項目１に記載のＤＮＡを含む、ベクター。
（項目１０） 項目１に記載のＤＮＡを保有する、哺乳動物細胞。
（項目１１） 融合タンパク質であって、免疫グロブリンＦｃ領域、ならびにアンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメント、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的タンパク質を含む、融合タンパク質。
（項目１２） 前記プラスミノーゲンフラグメントが、約４０ｋＤの分子量を有し、そして配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３） 前記標的タンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１４） 前記コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１５） 前記標的タンパク質が、アンギオスタチン、エンドスタチン、プラスミノーゲンフラグメントおよびコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される少なくとも２つの分子を含み、該２つの分子が、ポリペプチドリンカーによって連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１６） 前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１７） 前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１８） 多量体タンパク質であって、ジスルフィド結合を介して連結される、項目１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含む、多量体タンパク質。
（項目１９） 少なくとも１つの前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がアンギオスタチンであり、そして少なくとも１つの前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がエンドスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２０） 両方の前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がアンギオスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２１） 両方の前記融合タンパク質の前記標的タンパク質がエンドスタチンである、項目１８に記載の多量体タンパク質。
（項目２２） アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン活性を有するプラスミノーゲンフラグメントおよびエンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される第２の標的タンパク質をさらに含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目２３） 前記第２の標的タンパク質が、ポリペプチドリンカーによって第１の標的タンパク質に連結されている、項目２２に記載の融合タンパク質。
（項目２４） 前記第１の標的タンパク質が前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結されており、そして前記第２の標的タンパク質が該免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結されている、項目２２に記載の融合タンパク質。
（項目２５） 項目１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含む多量体融合タンパク質であって、該融合タンパク質が、ポリペプチド結合によって連結されている、多量体融合タンパク質。
（項目２６） 融合タンパク質を生成する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）項目１０に記載の哺乳動物細胞を提供する工程；および
ｂ）該哺乳動物細胞を培養して該融合タンパク質を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目２７） 前記融合タンパク質を収集するさらなる工程を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記免疫グロブリンＦｃ領域を前記標的タンパク質から切断するさらなる工程を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 新脈管形成によって媒介される状態を処置する方法であって、項目１に記載のＤＮＡを、新脈管形成インヒビターを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３０） 新脈管形成によって媒介される状態を処置する方法であって、項目９に記載のベクターを、新脈管形成インヒビターを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３１） アンギオスタチンまたはエンドスタチンの投与によって緩和される状態を処置する方法であって、項目１１に記載の融合タンパク質の有効量を、該状態を有する哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【００２０】
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲からさらに明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、本発明に従って構築された例示的な新脈管形成インヒビター融合タンパク質の模式図である（実施例１０〜１５を参照のこと）。これらの図はそれぞれ、以下を描く：図１Ａ、Ｆｃ−アンギオスタチンＫｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｂ、Ｆｃ−アンギオスタチン内側Ｋｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｃ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチン内側Ｋｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｄ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチンＫｒｉｎｇｌｅ１；図１Ｅ、Ｆｃ−エンドスタチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−アンギオスタチン；図１Ｆ、アンギオスタチン−Ｆｃ−エンドスタチン。垂直の線は、このＦｃ分子のヒンジ領域内に配置されたシステイン残基（Ｃ）を連結する任意のジスルフィド結合を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、商業的量の臨床グレードの新脈管形成インヒビターの生成に有用であった、本明細書中でイムノフュージンと呼ばれる、融合タンパク質を提供する。この新脈管形成インヒビターは、イムノフュージンタンパク質構築物から使用前に切断され得る。しかし、イムノフュージンまたはこのイムノフュージンをコードする核酸が、新脈管形成インヒビターで処置する必要がある哺乳動物に直接投与され得ることが意図される。
【００２３】
従って、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域、および本明細書中で新脈管形成インヒビターと呼ばれる、少なくとも１つの標的タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。この新脈管形成インヒビターは好ましくは、アンギオスタチン、エンドスタチン、プラスミノーゲンフラグメントアンギオスタチン活性、エンドスタチン活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩフラグメントからなる群より選択される。しかし、現在公知かまたは後で発見される新脈管形成インヒビター活性を有する他のポリペプチドが、本明細書中に記載される型の融合タンパク質として発現され得ることが意図される。
【００２４】
本発明を具体化したタンパク質構築物の６つの例示的な実施態様を、図１Ａ〜図１Ｆとして図面に例示する。二量体構築物が好ましいので、全てを、隣接するサブユニット上のシステイン間での一対のジスルフィド結合によって架橋される二量体として例示する。この図面では、ジスルフィド架橋は、２つの免疫グロブリンＦｃ領域の一部を、免疫グロブリンヒンジ領域を介して一緒に連結するとして表され、従って、これらの分子のネイティブな形態に特有である。Ｆｃのヒンジ領域を含む構築物が好ましく、そして治療剤として有望であると示されているが、本発明は、他の位置での架橋が、所望により選択され得ることを意図する。さらに、いくつかの状況下では、本発明を実施する際に有用な二量体または三量体は、非共有結合によって、例えば、疎水性相互作用によって生成され得る。
【００２５】
ホモ二量体構築物は本発明の重要な実施態様であるので、図１は、このような構築物を例示する。ヘテロ二量体構造もまた有用であるが、当業者に公知であるように、しばしば精製することが困難であり得ることが理解されるべきである。しかし、ホモ二量体とヘテロ二量体との混合物を含む、ヒトを含む種々の哺乳動物種において新脈管形成を阻害するために有用な存続可能な構築物が構築され得る。例えば、ヘテロ二量体構造の一方の鎖はエンドスタチンを含み得、そして他方の鎖はアンギオスタチンを含み得る。
【００２６】
図１Ａは、実施例１０に示される手順に従って生成される二量体構築物を例示する。この二量体の各単量体は、ヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域１を含む。Ｆｃ領域１のＣ末端には、内側環および外側環の両方に、アンギオスタチン２の第１のＫｒｉｎｇｌｅ領域が直接結合される。図１Ｂは、図１ＡのＦｃ領域と同じＦｃ領域を含み、この場合は、Ｆｃ領域１のＣ末端に結合されたアンギオスタチン３のＫｒｉｎｇｌｅ１の内側環のみを有する、本発明の第２の実施態様を示す（実施例１１を参照のこと）。図１Ｃ〜図１Ｅは、標的タンパク質として、タンデムに配置され、そしてリンカーによって連結された複数の新脈管形成インヒビターを含む、本発明のタンパク質構築物の種々の実施態様を示す。図１Ｃでは、この標的タンパク質は、全長エンドスタチン４、ポリペプチドリンカー５、およびアンギオスタチン３のＫｒｉｎｇｌｅ１の内側環を含む。図１Ｄは、図１ＡのＦｃ領域と同じＦｃ領域、ならびに全長エンドスタチン４、ポリペプチドリンカー５、およびアンギオスタチン２の全長Ｋｒｉｎｇｌｅ１領域（内側環および外側環の両方）を含む標的タンパク質を含むタンパク質を表す。図１Ｅは、最もＣ末端側のタンパク質ドメインが、アンギオスタチン７の全長コピーをを含むという点で図１Ｄの構築物とは異なる。
【００２７】
図１Ａ〜図１Ｅは、Ｆｃ−Ｘ型構築物を表し、ここでＸが標的タンパク質であるが、Ｘ−Ｆｃ型構築物もまた本発明の実施の際に有用であり得ることが意図される。さらに、本発明の有用なタンパク質もまた、式Ｘ−Ｆｃ−Ｘによって表され得、ここでＸは、同じ標的タンパク質または異なる標的タンパク質を表し得ることが意図される。図１Ｆは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、全長ヒトアンギオスタチン７、ヒンジ領域領域を含むヒト免疫グロブリンＦｃ領域６、および全長ヒトエンドスタチンドメイン４を含む、このような構築物を表す。
【００２８】
用語「新脈管形成インヒビター」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物における新規の血管の形成を低減または阻害する、任意のポリペプチド鎖をいう。癌治療に関して、この新脈管形成インヒビターは、腫瘍内または腫瘍上の、好ましくは固形腫瘍内または固形腫瘍上の新規の血管の形成を低減または阻害する。有用な新脈管形成インヒビターが、当該分野で周知であり、そして当該分野で用いられる種々のアッセイを用いて同定され得ることが意図される。このようなアッセイとしては、例えば、ウシ毛細管内皮細胞増殖アッセイ、ヒナ絨毛尿膜（ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＣＡＭ）アッセイまたはマウスの角膜アッセイが挙げられる。しかし、このＣＡＭアッセイが好ましい（例えば、その開示が本明細書中に参考として援用される、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５を参照のこと）。手短には、インタクトな卵黄を有する胚を、受精した３日齢の白色卵から取り出し、そしてペトリ皿に入れる。３７℃にて、３％ ＣＯ2で３日間インキュベーションした後、推定の新脈管形成インヒビターを含むメチルセルロースディスクを、個々の胚の絨毛尿膜に適用する。約４８時間インキュベーションした後、この絨毛尿膜を、阻害帯の証拠について顕微鏡下で観察した。
【００２９】
本発明の実施において有用な好ましい新脈管形成インヒビターとしては、例えば、アンギオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８、および米国特許第５，７３３，８７６号；同第５，８３７，６８２号；および同第５，８８５，７９５号）、ならびにエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５および米国特許第５，８５４，２０５号）が挙げられる。以前に述べたように、アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、内皮細胞増殖の特異的インヒビターであり、そして腫瘍に栄養を与える新規の血管の形成である新脈管形成をブロックすることにより腫瘍増殖を阻害し得る。
【００３０】
アンギオスタチンは、プラスミノーゲンのタンパク質分解性フラグメントとして同定された（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８、および米国特許第５，７３３，８７６号；同第５，８３７，６８２号；および同第５，８８５，７９５号、そしてこの開示は、本明細書中に参考として援用される）。詳細には、アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの少なくとも３つのＫｒｉｎｇｌｅ領域を含む、プラスミノーゲンの３８ｋＤａの内側フラグメントである。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのタンパク質分解性フラグメントとして同定されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５（その開示は、本明細書中に参考として援用される））。詳細には、エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａのＣ末端フラグメントである。用語「アンギオスタチン」および「エンドスタチン」は、本明細書中で使用される場合、全長タンパク質だけでなく、それらの改変体および生物活性フラグメント、ならびにそれぞれ、プラスミノーゲンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩの生物活性フラグメントもまたいう。アンギオスタチンに関して用語「生物活性フラグメント」は、ＣＡＭアッセイによって決定した場合に、全長アンギオスタチンの少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有する、プラスミノーゲンまたはアンギオスタチンの任意のタンパク質フラグメントをいう。エンドスタチンに関して用語「生物活性フラグメント」は、ＣＡＭアッセイによって決定した場合に、全長エンドスタチンの少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有する、コラーゲンＸＶＩＩＩまたはエンドスタチンの任意のタンパク質フラグメントをいう。
【００３１】
用語改変体は、本明細書中に開示されるエンドスタチンまたはアンギオスタチンのいずれかの天然に存在する配列に少なくとも７０％類似または６０％同一であり、より好ましくは少なくとも７５％類似または６５％同一であり、そして最も好ましくは８０％類似または７０％同一である、種（ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）改変体および対立遺伝子改変体、ならびに他の天然に存在するかまたは天然に存在しない改変体（例えば、従来の遺伝子操作プロトコルによって生成される）を含む。
【００３２】
参照ポリペプチドに対して候補ポリペプチドが必要な類似性百分率または同一性百分率を有するか否かを決定するために、この候補アミノ酸配列およびこの参照アミノ酸配列は、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されるＢＬＯＳＵＭ６２置換行列と組み合わせた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載されるダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて最初に整列される。本発明については、ギャップ挿入ペナルティについて適切な値は−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティについて適切な値は−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎおよびＢＬＯＳＵＭ６２行列のアルゴリズムを用いる整列を行うコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムソフト（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）は、市販され、そして当業者に広範に使用される。
【００３３】
一旦、候補配列と参照配列との間の整列がなされると、類似性パーセントスコアが算出され得る。各配列の個々のアミノ酸は、互いにそれらの類似性に従って順次比較される。２つの整列されるアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２行列における値が０または負の数字である場合、対の様式の（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）類似性スコアは０である；さもなければ、この対の様式の類似性スコアは１．０である。生の類似性スコアは、整列されたアミノ酸の対の様式の類似性スコアの合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のうちのより小さいアミノ酸数によって除算することにより、生のスコアが正規化される。正規化された生のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを算出するために、各配列の整列されたアミノ酸が再度順次比較される。アミノ酸が同一でない場合、対の様式の同一性スコアは０である；さもなければ、この対の様式の同一性スコアは、１．０である。生の同一性スコアは、同一の整列されたアミノ酸の合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のうちのより小さいアミノ酸数によって除算することにより、生のスコアが正規化される。正規化された生のスコアは、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性および同一性のパーセントを算出する目的で無視される。従って、ギャップペナルティは、この算出では用いられないが、これらは最初の整列においては用いられる。
【００３４】
本明細書中に開示される標的タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する融合タンパク質として発現される。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４個または５個のドメインから構成される。これらのドメインは、順番に以下の通りに命名される：ＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3（−ＣＨ4）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラスの間で、交差相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ2ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ2ドメインに、ならびにＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ3ドメインに類似である。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域（好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域）のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメイン、２）ＣＨ1ドメインおよびＣＨ2ドメイン、３）ＣＨ1ドメインおよびＣＨ3ドメイン、４）ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメイン、または５）２以上のドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含み得る。好ましい実施態様では、ＤＮＡ構築物において用いられるＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含み、そして好ましくは少なくともこのＣＨ1ドメインを欠く。
【００３６】
重鎖定常領域を誘導する、現在好ましいクラスの免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。他のクラスの免疫グロブリン（ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ））が用いられ得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に詳細に考察される。特定の結果を達成するための、特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業分野の技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部を含み、そして好ましくはＦｃγのＣＨ3ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含む。
【００３７】
適用に依存して、ヒト以外の種（例えば、マウスまたはラット）由来の定常領域遺伝子が用いられ得る。イムノフュージンＤＮＡ構築物における融合パートナーとして用いられるＦｃ領域は、一般に、任意の哺乳動物種由来であり得る。宿主の細胞または動物においてこのＦｃ領域に対する免疫応答を誘発することが望ましくない場合、このＦｃ領域は、宿主の細胞または動物と同じ種に由来し得る。例えば、ヒトＦｃは、宿主の動物または細胞がヒトである場合に用いられ得；同様に、マウスＦｃは、宿主の動物または細胞がマウスである場合に用いられ得る。さらに、定常領域ドメインの１以上のアミノ酸残基が置換または欠失される、これらの定常領域の構築物の置換または欠失もまた有用である。一例は、アミノ酸置換を上流ＣＨ2領域に導入して、Ｆｃレセプターについての親和性が低減したＦｃ改変体を作製することである（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学技術を用いてこのような構築物を調製し得る。
【００３８】
Ｆｃ領域配列としてのヒトＦｃγ１の使用は、いくつかの利点を有する。例えば、この新脈管形成インヒビターＦｃ融合タンパク質が生物薬剤として用いられる場合、このＦｃγ１ドメインは、この融合タンパク質に対してエフェクター機能活性を付与し得る。このエフェクター機能活性としては、補体結合、抗体指向性細胞傷害性、胎盤移入および血清半減期の増加のような生物学的活性が挙げられる。このＦｃドメインはまた、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによる検出およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（「プロテインＡ」）への結合を介した精製を提供する。しかし、特定の適用では、Ｆｃ領域から特異的エフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター結合または補体結合）を欠失させることが所望され得る。
【００３９】
新脈管形成インヒビターイムノフュージンの場合、免疫グロブリンＦｃ融合パートナーの１つの機能は、新脈管形成インヒビタータンパク質の適切な折り畳みを促進して、活性な新脈管形成インヒビタータンパク質を生じること、および少なくとも細胞外培地中での、活性部分に対する溶解度に影響を与えることである。Ｆｃ融合パートナーは親水性であるので、この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成される組換えエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）とは異なり、容易に可溶性である。本明細書中に開示される実施例の全てにおいて、イムノフュージンの高レベルの生成が得られた。この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、代表的には約３０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度で培地中に分泌された。そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって均質になるまで容易に精製され得る。さらに、この新脈管形成インヒビターイムノフュージンは切断され得、そして例えば、ヘパリンセファロース、リジンセファロースまたはアフィニティー精製を用いる従来の精製プロトコルを用いてさらに精製され得る。
【００４０】
高レベルの発現に加えて、本発明の融合タンパク質はまた、おそらく、それらのより大きな分子サイズに起因して、より長い血清半減期を示す。例えば、ヒトＦｃ−ヒトアンギオスタチンは、ヒトアンギオスタチンについての４〜６時間の血清半減期と比較して、マウスにおいて３３時間の血清半減期を有する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：６８９）。４０ｋＤの分子量を有するアンギオスタチンおよび２０ｋＤの分子量を有するエンドスタチンは、腎臓濾過によって効率的にクリアランスされるのに充分に小さいと考えられる。対照的に、二量体形態のＦｃアンギオスタチンおよび二量体Ｆｃ−エンドスタチンは、それぞれ、１４５ｋＤおよび１００ｋＤである。これは、２つのアンギオスタチン分子または２つのエンドスタチン分子のいずれかに結合した２つの免疫グロブリンＦｃ領域が存在するからである。このような二価構造は、アンギオスタチンレセプターまたはエンドスタチンレセプターに対して、より高い結合親和性を示し得る。この新脈管形成阻害活性がレセプターによって媒介される場合、このＦｃ融合タンパク質は、一価のアンギオスタチンまたは一価のエンドスタチン単独よりも、腫瘍を抑制するために潜在的により効果的である。さらに、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチンが、二量体タンパク質リガンドのクラスに属する場合、このＦｃによってアンギオスタチンまたはエンドスタチンに与えられる物理的制約は、二量体化を分子内プロセスにし、従って、平衡をこの二量体に有利にシフトさせ、そしてそのレセプターに対する結合を増強する。システイン残基はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術によって単量体へと適切な位置で導入されて、共有結合的なジスルフィド結合形成を介して二量体を安定化し得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「多価」は、２以上の生物学的に活性なセグメントを組み込む組換え分子をいう。この多価分子を形成するタンパク質フラグメントは、フレームシフトを引き起こすことなく構成要素部分を結合させ、かつ各々が独立に機能するのを可能にする、ポリペプチドペプチドリンカーによって連結され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「二価」は、本発明の融合構築物において２つの標的タンパク質を有する、多価組換え分子（例えば、Ｆｃ−Ｘ分子、ここで、Ｘは独立して、アンギオスタチン、エンドスタチン、またはそれらの改変体から選択される）をいう。免疫グロブリンＦｃ領域（代表的には、それ自体が、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメイン（および必要に応じてＣＨ2ドメイン）の少なくとも一部を含む重鎖フラグメントの二量体である）に融合された２つのＸ部分が存在するので、この分子は二価である（例えば、図１Ａを参照のこと）。本発明の融合構築物がＦｃ−Ｘ−Ｘ形態を有する場合、得られるＦｃ二量体分子は四価である。このＦｃ−Ｘ−Ｘ分子を形成する２つのタンパク質は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。二価分子は、分子とそのレセプターとの間の見かけの結合親和性を増加させ得る。例えば、Ｆｃ−エンドスタチンの第１のエンドスタチン部分が特定の親和性で細胞上のレセプターに結合し得る場合、同じＦｃ−エンドスタチンの第２のエンドスタチン部分は、ずっと高いアビディティ（見かけの親和性）で同じ細胞上の第２のレセプターに結合し得る。これは、第１のエンドスタチン部分が既に結合した後では、第２のエンドスタチン部分がこのレセプターに対して物理的に近いことによる。抗原に対する抗体結合の場合、見かけの親和性は、少なくとも１０4増加する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「多量体」および「多量体性」は、例えば、共有結合的相互作用による（例えば、ジスルフィド結合による）共有結合的、または例えば、疎水性相互作用による非共有結合的のいずれかの、２以上のポリペプチド鎖の安定な会合をいう。用語多量体は、ポリペプチドが同じであるホモ多量体、およびポリペプチドが異なるヘテロ多量体の両方を含むことが意図される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「二量体」は、共有結合的または非共有結合的な相互作用によって２つのタンパク質ポリペプチド鎖が安定に会合している特異的多量体分子をいう。免疫グロブリンＦｃ領域のＦｃフラグメント自体は代表的には、ヒンジ領域およびＣＨ3ドメイン（および必要に応じてＣＨ2ドメイン）の少なくとも一部を含む、重鎖フラグメントの二量体であることが理解されるべきである。多くのタンパク質リガンドは、それらのレセプターに二量体として結合することが公知である。タンパク質リガンドＸが天然で二量体化する場合、Ｆｃ−Ｘ分子内のこのＸ部分は、ずっと大きな程度で二量体化する。なぜなら、二量体化プロセスは、濃度依存性であるからである。会合した免疫グロブリンＦｃ領域連結された２つのＸ部分が物理的に近位にあることによって、二量体化を分子内プロセスとし、平衡をこの二量体に有利になるように大いにシフトさせ、そしてそのレセプターに対するその結合を増強する。
【００４５】
本発明が、本発明の実施において有用なＦｃ融合タンパク質を作製するために従来の組換えＤＮＡ方法論を利用することが理解される。このＦｃ融合構築物は好ましくは、ＤＮＡレベルで作製され、そして得られるＤＮＡは、発現ベクター中に組み込まれ、そしてイムノフュージンを生成するために発現される。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞に取り込まれ、そして宿主細胞のゲノムと組換わり、そして宿主細胞のゲノム中に組み込まれる能力、またはエピソームとして自律複製する能力があるヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味することが理解される。このようなベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語、標的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳およびＦｃ融合タンパク質産物の分泌を意味することが理解される。
【００４６】
有用な発現ベクターは、Ｆｃ−Ｘ遺伝子の転写に、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを利用する、ｐｄＣｓ（Ｌｏら（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５（この開示は、本明細書中に参考として援用される））である。使用されるヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーター配列は、Ｂｏｓｈａｒｔら，１９８５，Ｃｅｌｌ ４１：５２１（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に提供される配列のヌクレオチド−６０１から＋７に由来した。このベクターはまた、変異体ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を選択マーカーとして含む（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２４９５（この開示は、本明細書中に参考として援用される））。
【００４７】
適切な宿主細胞を、本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトし得、そして標的タンパク質の発現および分泌のために利用し得る。現在、本発明における使用のために好ましい宿主細胞としては、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００４８】
本発明の融合タンパク質を、好ましくは、従来の組換えＤＮＡ方法論によって生成する。融合タンパク質を、好ましくは、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および標的タンパク質（本明細書中で、新脈管形成インヒビターともいう）をコードするＤＮＡ分子の、宿主細胞における発現により生成する。好ましい構築物は、５’から３’方向で、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および標的タンパク質をコードし得る。あるいは、構築物は、５’から３’方向で、シグナル配列、標的タンパク質、および免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「シグナル配列」は、新脈管形成インヒビターイムノフュージン（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）タンパク質の分泌を指向し、その後で翻訳後に宿主細胞において切断される、ペプチドセグメントを意味すると理解される。本発明のシグナル配列はポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、小胞体の膜を横切るタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードする。本発明において有用なシグナル配列としては、以下が挙げられる：抗体軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９、Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２））、抗体重鎖シグナル配列（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６：５７７４））、および当該分野において公知の任意の他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：５１４５を参照のこと）。これらの各参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【００５０】
シグナル配列は当該分野において十分に特徴付けられている。そして代表的に、１６〜３０アミノ酸残基を含むことが公知であり、そしてそれより多いかまたはそれより少ないアミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、以下の３つの領域から構成される：塩基性Ｎ末端領域、中央疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域。中央疎水性領域は、新生ポリペプチドの輸送の間に膜脂質二重層を横切ってシグナルペプチドを固定する４〜１２個の疎水性残基を含む。開始後、シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によって、小胞体の内腔内で切断される。シグナルペプチドの潜在的切断部位は、一般的に、「（−３，−１）ルール」に従う。従って、代表的なシグナルペプチドは、−１位および−３位に小さな中性アミノ酸残基を有し、そしてこの領域においてプロリン残基を欠く。シグナルペプダーゼは、−１アミノ酸と＋１アミノ酸との間のそのようなシグナルペプチドを切断する。従って、シグナル配列をコードするＤＮＡの部分は、分泌の間に、イムノフュージンタンパク質のアミノ末端から切断され得る。これは、Ｆｃ領域および標的タンパク質から構成されるイムノフュージンタンパク質の分泌を生じる。シグナルペプチド配列の詳細な考察は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：４６８３（この開示は、本明細書中で参考として援用される）により提供される。
【００５１】
当業者に明らかなように、本発明における使用のための特定シグナル配列の適合性は、いくつかの慣用的な実験を必要とし得る。このような実験としては、シグナル配列がイムノフュージンの分泌を指向する能力を決定すること、およびまた、イムノフュージンの効率的な分泌を達成するために使用されるべき配列の最適な立体配置（ゲノムまたはｃＤＮＡ）の決定が挙げられる。さらに、当業者は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（上記に言及）により提示されたルールに従って合成シグナルペプチドを作製し得、そして慣用的な実験によってそのような合成シグナル配列の有効性を試験し得る。シグナル配列を、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」、または「リーダーペプチド」としてもまた言及し得る。
【００５２】
シグナル配列と免疫グロブリンＦｃ領域との融合物は、時折、本明細書中で分泌カセットとして言及される。本発明の実施において有用な例示的な分泌カセットは、５’から３’方向で、免疫グロブリン軽鎖遺伝子のシグナル配列、およびヒト免疫グロブリンγ１遺伝子のＦｃγ１領域をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分およびＣＨ3ドメインの少なくとも一部分を含むか、あるいはヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインの少なくとも部分を含む。分泌カセットをコードするＤＮＡは、そのゲノム立体配置内またはそのｃＤＮＡ立体配置内にあり得る。
【００５３】
別の実施態様では、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと新脈管形成インヒビタータンパク質との間に挿入されたタンパク質分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解性切断を提供し、このようにして新脈管形成インヒビタータンパク質からＦｃドメインを分離させる。本明細書中で使用される場合、「タンパク質分解性切断部位」は、タンパク質分解性酵素または他のタンパク質分解性切断剤によって優先的に切断される、アミノ酸配列を意味すると理解される。有用なタンパク質分解性切断部位としては、トリプシン、プラスミン、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解性酵素によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。多くの切断部位／切断剤の対が公知である。例えば、米国特許第５，７２６，０４４号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。標的タンパク質配列がアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、またはそれらの活性な改変体に対する前駆体分子である場合、所望されるタンパク質産物を、エラスチンまたはプラスミンまたはウロキナーゼのような内因性タンパク質分解性酵素での切断により生成し得る。
【００５４】
本発明はまた、大量に作製され得る組換えアンギオスタチンおよび組換えエンドスタチンまたはそれらのフラグメントの種々の組み合わせを含む融合タンパク質を包含する。腫瘍増殖を抑制する際の、実証された有効性にもかかわらず、どのようにアンギオスタチンおよびエンドスタチンが新脈管形成をブロックするかについての機構は、完全には知られていない。アンギオスタチンは、いくつかのＫｒｉｎｇｌｅ構造を有し、そしてエンドスタチンは、種々の構造モチーフ（これらの各々は、単独で、内皮細胞へのタンパク質の結合および抗新脈管形成効果の発揮を担い得るか、またはこれらを補助し得る）を有する。従って、本発明は、天然に存在する全長アンギオスタチンおよびエンドスタチンに対して生理学的に類似した挙動を示す、アンギオスタチンの生物活性フラグメント（例えば、Ｋｒｉｎｇｌｅ１、Ｋｒｉｎｇｌｅ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ３、およびそれらの組み合わせ）、およびエンドスタチンの生物活性フラグメントである標的タンパク質を含む。
【００５５】
本発明の別の実施態様は、新脈管形成インヒビターの二機能性ハイブリッド構築物を提供する。本明細書中で使用される場合、二機能性ハイブリッド分子または構築物は、２つのタンパク質サブユニット（ここで、この２つのサブユニットは、異なるタンパク質に由来し得る）を組合わせることによって生成されるタンパク質を意味する。各タンパク質サブユニットはそれ自身の独立した機能を有し、その結果、ハイブリッド分子では、この２つのサブユニットの機能は付加的または相乗的であり得る。そのような機能的ハイブリッドタンパク質は、動物モデルにおいて調査されるアンギオスタチンおよびエンドスタチンの相乗効果を可能にする。好ましい二機能性ハイブリッドは、直接的またはポリペプチドリンカーによってのいずれかで直列に連結された、少なくとも２つの異なる新脈管形成インヒビターを含み得る。例えば、好ましい実施態様では、標的配列は、エンドスタチンの少なくとも一部分とインフレームで連結されたアンギオスタチンの少なくとも一部分をコードし、そしてアンギオスタチンドメインおよびエンドスタチンドメインの両方は、抗新脈管形成活性または新脈管形成阻害を示す。２つのユニットは、ポリペプチドリンカーによって連結され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒に、またはタンパク質とＦｃ領域とを連結し得るペプチド配列を意味すると理解される。ポリペプチドリンカーは、好ましくは、グリシンおよび／またはセリンのような複数のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、約１０〜１５残基長の一連のグリシンおよびセリンのペプチドを含む。例えば、米国特許第５，２５８，６９８号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。しかし、最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成を、慣用的な実験によって決定し得ることが意図される。
【００５７】
アンギオスタチンの種々の部分がＦｃ融合タンパク質分子として発現される場合に、高レベルの発現が得られることが見出されている。これはおそらく、Ｆｃ領域がキャリアとして作用し、ポリペプチドがＣ末端で正確に折りたたまれるのを補助するからである。さらに、Ｆｃ領域は、生理的ｐＨでグリコシル化および高度に荷電化され得、このようにしてＦｃ領域は疎水性タンパク質を可溶化させるのを補助し得る。
【００５８】
本発明はまた、Ｆｃ融合タンパク質としての非ヒト種のアンギオスタチンおよびエンドスタチンの生成のための方法を提供する。非ヒト新脈管形成インヒビター融合タンパク質は、新脈管形成インヒビターの前臨床的研究のために有用である。なぜなら、タンパク質薬物の有効性および毒性の試験が、ヒトにおいて試験する前に動物モデル系で実施されなければならないからである。ヒトタンパク質は、マウスモデルでは作用しないかもしれない。なぜなら、このタンパク質は免疫応答を誘発し得、そして／または試験結果を歪める異なった薬物動態を示し得るからである。従って、等価なマウスタンパク質が、マウスモデルにおいて試験するためのヒトタンパク質の最良な代用物である。
【００５９】
マウスにおける標準的なルイス肺がん腫モデル（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２７７）を使用して、可溶性ｈｕＦｃ−ｈｕアンジオスタチン、ｈｕＦｃ−ｈｕエンドスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕアンジオスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチンを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において生成されたその不溶性タンパク質と比較した。可溶性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成された対応タンパク質よりも、ルイス肺モデルにおいて腫瘍増殖を抑制する際により有効であった。さらに、実験室マウスを同系交配し、そしてそれらの腫瘍を自然発生的ではなく誘導した。従って、マウスモデルにおける有効性は、ヒト腫瘍に対する、ありそうな有効性に相関しないかもしれない。イヌにおける前臨床的研究は、自然発生的腫瘍に対するこれらの新脈管形成インヒビターの有効性に関するより正確な情報を提供する。なぜなら、多くの自然に起こる自然発生的なイヌの腫瘍が存在するからである。本発明のマウス（ｍｕ）Ｆｃ−ｍｕアンギオスタチン、ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチン、およびイヌ（ｃａ）Ｆｃ−ｃａアンギオスタチン、ｃａＦｃ−ｃａエンドスタチンを生成する方法は、マウス系およびイヌ系の両方における新脈管形成インヒビターの前臨床的研究を容易にする。
【００６０】
本発明は、本発明のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を投与することによって、新脈管形成により媒介される状態を処置する方法を提供する。新脈管形成により媒介される状態としては、例えば、以下が挙げられる：固形腫瘍；血液媒介性腫瘍、腫瘍転移、良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および発熱性肉芽腫を含む）；慢性関節リウマチ；乾癬；眼球の新脈管形成疾患（糖尿病性網膜症、未熟児の網膜障害、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障）、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、オースラー−ウェーバー症候群（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；心筋新脈管形成；斑新生血管形成（ｐｌａｑｕｅ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細管拡張症；血友病関節血管線維腫；および創傷肉芽形成；ならびに、内皮細胞、腸接着、動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、強皮症および過形成性瘢痕（すなわち、ケロイド）の過剰刺激または異常刺激。
【００６１】
本明細書中に開示されるＤＮＡ構築物は、遺伝子治療手順において有用であり得る。ここでは、エンドスタチン遺伝子およびアンギオスタチン遺伝子を、種々の手段（例えば、プロモーターと結合されたネイティブなＤＮＡ、またはウイルスベクター内におけるＤＮＡ）のうちの１つによって細胞に送達する。一旦、細胞内になると、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチンの遺伝子または遺伝子フラグメントが発現され、そしてこのタンパク質がインビボで生成されて、その正常な生物学的機能を果たす。本発明のＤＮＡ構築物は、融合タンパク質の高レベルの発現を生じる。本発明の融合タンパク質はまた、新脈管形成により媒介される状態を処置する際に有用であり得、そしてネイティブな新脈管形成インヒビターおよび他の組換え新脈管形成インヒビターよりも高い臨床的有効性を有し得る。なぜなら、本発明の新脈管形成インヒビターイムノフュージンは、他の組換え新脈管形成インヒビターまたはネイティブな新脈管形成インヒビター単独よりも長い血清半減期を有するからである。本発明の二価形態および二量体形態は、その二価構造および二量体構造に起因して、より高い結合親和性を有するはずである。本発明の二機能性ハイブリッド分子は、融合Ｆｃ領域または可撓性ポリペプチドリンカーによって連結された２つの異なる新脈管形成インヒビターについてのあり得る相乗効果に起因して、より高い臨床的有効性を有し得る。
【００６２】
本発明の組成物を、任意の適切な手段によって、直接的に（例えば、局所的に、組織位置への注射、移植、または局所的投与によるような）か、または全身的に（例えば、非経口的または経口的に）、動物に提供し得る。組成物が非経口的に提供される場合（例えば、静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋内、口内、直腸内、膣内、眼窩内、大脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内、鞘内、槽内、嚢内、鼻腔内、またはエアロゾル投与による）、好ましくは、組成物は、水性の部分か、または生理的に適合性の流体の懸濁物もしくは溶液を含む。従って、キャリアまたはビヒクルは生理的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の患者への送達に加えて、これは他の点で患者の電解質および／または容量均衡に有害に作用しない。従って、この薬剤のための流体の培地は、正常生理食塩水（例えば、９．８５％水性ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含み得る。
【００６３】
投与あたりのイムノフュージンの好ましい投薬量は、５０ｎｇ／ｍ2〜１ｇ／ｍ2、より好ましくは５μｇ／ｍ2〜２００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2〜５０ｍｇ／ｍ2の範囲内である。投与あたりのイムノフュージンをコードする核酸の好ましい投薬量は、１μｇ／ｍ2〜１００ｍｇ／ｍ2、より好ましくは２０μｇ／ｍ2〜１０ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは４００μｇ／ｍ2〜４ｍｇ／ｍ2の範囲内である。しかし、投与の最適な様式および投薬量を、当該分野の技術レベルの十分範囲内にある慣用的実験によって決定し得ることが意図される。
【００６４】
本発明を、以下の限定されない実施例によってさらに例証する。
【実施例】
【００６５】
（実施例）
（実施例１．ｈｕＦｃ−ｈｕエンドスタチンの発現）
ヒトエンドスタチンを、Ｌｏら（１９９８）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５）の教示に従って、ヒトＦｃ−ヒトエンドスタチン（ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏ）融合タンパク質として発現させた。Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンγのＦｃフラグメントをいう（配列番号１に示されるＤＮＡ配列；配列番号２に示されるアミノ酸配列）。（ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ）を使用して、Ｆｃ−Ｅｎｄｏ融合タンパク質における発現に、エンドスタチンｃＤＮＡ（配列番号３；このアミノ酸配列は、配列番号４に開示される）を合わせた。正方向プライマーは、５’−ＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ Ｃ（配列番号５；配列番号６に開示されるアミノ酸をコードした）、または５’−Ｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ Ｃ（配列番号７；コードされるアミノ酸を配列番号８に開示する）のいずれかであって、ここでＸｍａＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位にはエンドスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。ＸｍａＩ部位を有するプライマーは、ＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ3ドメインの末端でのＸｍａＩ部位への連結に、エンドスタチンｃＤＮＡを合わせた。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプライマーは、融合タンパク質の連結部にエンテロキナーゼ認識部位であるＡｓｐ4−Ｌｙｓ（Ｌａ Ｖａｌｌｉｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３３１１−２３３１７）を含むｐｄＣｓ−Ｆｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位への連結に、エンドスタチンｃＤＮＡを合わせた。逆方向プライマーは、５’−Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＣＡＴ Ｇ（配列番号９）（これは、エンドスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を置くように設計された）であり、これにはＸｈｏＩ部位が続く。ＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、そして得られたＸｍａＩおよびＸｈｏＩ消化ｐｄＣｓ−ＦｃベクターにＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを連結させた。同様に、エンドスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、適切に消化したｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクター内に連結した。Ｆｃ−ｅｎｄｏまたはＦｃ（Ｄ4Ｋ）−エンドスタチンを発現する安定なクローンを、ＮＳ／０細胞のエレクトロポレーション、次いで、１００ｎＭメトトレキサートを含有する増殖培地における選択によって得た。タンパク質発現レベルを、抗ヒトＦｃＥＬＩＳＡ（実施例３）によってアッセイし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約５２ｋＤのタンパク質産物が示された。最良の産生クローンを、限界希釈によってサブクローニングした。
【００６６】
（実施例２．細胞培養およびトランスフェクション）
一過性トランスフェクションについて、リン酸カルシウムとプラスミドＤＮＡとの沈降によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）か、またはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いたリポフェクションによって、プラスミドをヒト腎臓２９３細胞内に導入した。
【００６７】
安定的にトランスフェクトされたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによってマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞内に導入した。ＮＳ／０細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地内で増殖させた。約５×１０6細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、１０μｇの直鎖化プラスミドＤＮＡを、細胞と共にＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（０．４ｃｍ電極ギャップ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中で氷上にて１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションを、０．２５Ｖおよび５００μＦの設定で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて実施した。細胞を、氷上で１０分間で回復させ、その後この細胞を増殖培地中に再懸濁し、次いで、２つの９６ウェルプレート上にプレーティングした。安定的にトランスフェクトされたクローンを、トランスフェクションの２日後に導入された１００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下での増殖によって選択した。細胞に、３日おきにさらに３回補給し、そして２〜３週間でＭＴＸ耐性クローンが現れた。クローン由来の上清を、高産生株を同定するために、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによってアッセイした。抗産生クローンを単離し、そして１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中で増殖させた。
【００６８】
（実施例３．ＥＬＩＳＡ手順）
３つの異なるＥＬＩＳＡを使用して、ＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの上清におけるタンパク質産物の濃度を決定した。抗ヒトＦｃ（ｈｕＦｃ）ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＦｃ含有タンパク質の量を測定した。抗マウスＦｃ（ｍｕＦｃ）抗体および抗イヌ（ｃａＦｃ）抗体をＥＬＩＳＡで使用して、それぞれ、マウスＦｃ含有タンパク質およびイヌＦｃ含有タンパク質の量を測定した。抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡについての手順は、本明細書中で以下に詳細に記載される。
【００６９】
（Ａ．プレートのコーティング）
ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｐTM、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）において１００μｌ／ウェルにてコーティングした。コーティングされたプレートを被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そしてＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清（２００μｌ／ウェル）でブロックした。３７℃で２時間のブロッキング緩衝液とのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、そしてペーパータオルで軽く叩いて乾かした。
【００７０】
（Ｂ．試験サンプルおよび２次抗体とのインキュベーション）
試験サンプルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するサンプル緩衝液において適切な濃度に希釈した。濃度が既知であったキメラ抗体（ヒトＦｃを有する）を用いて、検量線を作成した。検量線を作成するために、サンプル緩衝液中に連続希釈を作製して、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる検量線を得た。希釈サンプルおよび基準物をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、次いで、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに、サンプル緩衝液中で約１：１２０，０００で希釈された１００μｌの２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を添加した。２次抗体の正確な希釈は、ＨＲＰ結合体化抗ヒトＩｇＧの各ロットについて決定されなければならない。３７℃での２時間のインキュベーションの後、このプレートをＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。
【００７１】
（Ｃ．呈色）
基質溶液を、０．０３％の新たに添加されたＨ2Ｏ2を含有する１５ｍｌの０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ５）中に、３０ｍｇ（１錠）のｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を溶解することによって調製した。この基質溶液を、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。色は、暗黒下にて室温で、３０分間で呈色が可能であった。呈色時間は、コーティングされたプレート、２次抗体などのロット毎の変動性に依存して、変更され得る。この反応を、１００μｌ／ウェルで４ＮのＨ2ＳＯ4を添加することによって停止させた。このプレートを、プレートリーダー（これを、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍの両方に設定し、そして４９０ｎｍでのＯＤから６５０ｎｍでのバックグラウンドＯＤを差し引くようにプログラムした）で読み取った。
【００７２】
抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡについての手順は、ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で、１００μｌ／ウェルにてコーティングすること；そして、２次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ｍｕＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（５０００中で１の希釈率で使用）であったことを除いて、同様であった。同様に、抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡについて、ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）で１００μｌ／ウェルにてコーティングし；そして、２次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）であった（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（５０００中で１の希釈率で使用）。
【００７３】
（実施例４．ｈｕＦｃ−ｈｕアンギオスタチンの発現）
ヒトアンギオスタチン（配列番号１０に示されるＤＮＡ配列；配列番号１１に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例１に記載されるように、ヒトＦｃ−ヒトアンギオスタチン（ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏ）融合タンパク質として発現させた。ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターまたはｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現にアンギオスタチンｃＤＮＡ（配列番号３）を合わせるために、ＰＣＲを使用した。それぞれの正方向プライマーは、５’−ＣＣ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＣＡ ＧＡＧ（配列番号１２；配列番号１３に開示されるアミノ酸をコードした）、および５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＣＡ ＧＡＧ（配列番号１４；配列番号１５に開示されるアミノ酸をコードした）であり、ここでＸｍａＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ部位の後には、アンギオスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、アンギオスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された、５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号１６）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてアンギオスタチンをコードする得られたＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、それぞれ、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターおよびｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏおよびｈｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｈｕＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイした。
【００７４】
（実施例５．ｍｕＦｃ−ｍｕエンドスタチンの発現）
マウスエンドスタチン（配列番号１７に示されるＤＮＡ配列；配列番号１８に示されるアミノ酸配列）およびマウスＦｃ（配列番号１９に示されるＤＮＡ配列；配列番号２０に示されるアミノ酸をコードした）を、本質的に実施例１に記載されるように、マウスＦｃ−マウスエンドスタチン（ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ）融合タンパク質として発現させた。ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現めにエンドスタチンｃＤＮＡ（配列番号４）を合わせるために、ＰＣＲを使用した。正方向のプライマーは、５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＴＴＴ Ｃ（配列番号２１；配列番号２２に開示されるアミノ酸をコードした）であり、ここでＨｉｎｄＩＩＩ部位には、エンドスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、エンドスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＧＴ Ｃ（配列番号２３）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてエンドスタチンをコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクター中に連結した。ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｍｕＥｎｄｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイ（抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡ）した。
【００７５】
（実施例６．ｍｕＦｃ−ｍｕアンギオスタチンの発現）
マウスアンギオスタチン（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列；配列番号２５に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例１に記載されるように、マウスＦｃ−マウスアンギオスタチン（ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ）融合タンパク質として発現させた。ＰＣＲを、ｐｄＣｓ−Ｆｓ（Ｄ4Ｋ）ベクターにおける発現にアンギオスタチンｃＤＮＡ（配列番号６）を合わせるために使用した。正方向プライマーは、５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＴＧＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号２６；配列番号２７に開示されるアミノ酸をコードする）であり、ここでＨｉｎｄＩＩＩ部位には、アンギオスタチンのＮ末端をコードする配列が続いた。逆方向プライマーは、アンギオスタチンのＣ末端の直後に翻訳終止コドン（アンチコドン、ＣＴＡ）を配置するように設計された５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＡ（配列番号２８）であり、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が続いた。このＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定し、そしてアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）−ｍｕＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そしてアッセイ（抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡ）した。
【００７６】
（実施例７．イヌＦｃ（ｃａＦｃ）の発現）
イヌの血液から単離されたイヌ末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、ｍＲＮＡを調製した。逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）を用いる第１鎖ｃＤＮＡの合成後に、正方向プライマー５’−ＣＣ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＧＣ（配列番号２９；配列番号３０に開示されるアミノ酸をコードした）（ここでＡｆＩＩＩ部位を、イヌＦｃのヒンジ領域をコードする配列のすぐ上流に導入した）および逆方向プライマー５’−Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＴ ＣＴＧ（配列番号３１）（ここでＸｈｏＩ部位を、イヌＦｃの翻訳終止コドン（アンチコドン、ＴＣＡ）の後に導入した）を使用して、イヌＦｃ（Ｋａｚｕｈｉｋｏら、（１９９２）ＪＰ １９９２０４０８９４−Ａ１）を増幅するために、ＰＣＲを実行した。逆方向プライマーはまた、ＸｍａＩ制限部位を作製するためにサイレント変異を導入し、これによりリンカー−アダプターを通じたｐｄＣｓ−ｃａＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターの構築およびイヌのエンドスタチンまたはアンギオスタチンをコードするＤＮＡ構築物への連結が容易になった。Ｌｏら（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１：４９５）に詳細に記載されたｐｄＣｓ−ｈｕＦｃの構築と同様に、ｐｄＣｓ−ｃａＦｃについての発現ベクターを、以下の通りに構築した。イヌＦｃをコードするＡｆＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、軽鎖シグナルペプチドをコードするＸｂａＩ−ＡｆＩＩＩフラグメントおよびＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化したｐｄＣｓベクターに連結した。次いで、得られたｐｄＣｓ−ｃａＦｃ発現ベクターを使用して、２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ３日後、この上清を、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。イヌＦｃ（配列番号３２に示されるＤＮＡ配列；配列番号３３に示されるアミノ酸配列）の発現を、ペルオキシダーゼ結合体化ウサギ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウエスタンブロット分析により確認した。
【００７７】
（実施例８．ｃａＦｃ−ｃａエンドスタチンの発現）
イヌエンドスタチンのコード配列（配列番号３４に示されるＤＮＡ配列；配列番号３５に示されるアミノ酸配列）を、本質的に実施例５に記載されるように、Ｆｃ融合タンパク質としての発現のために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントに合わせた。３’末端にて、終止コドンを、例えば、ＰＣＲによって、Ｃ末端のリジン残基をコードするコドンのすぐ後に導入し、そしてこれには、ＮｏｔＩ制限酵素部位が続いた。しかし、５’末端では、再構築に都合のよいＤｒａＩＩＩ制限部位が存在した。ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端およびＤｒａＩＩＩ粘着末端からなるオリゴヌクレオチド２重鎖を化学的に合成し、そしてイヌエンドスタチンｃＤＮＡの残りをコードするＤｒａＩＩＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントに連結するために使用した。使用された二重鎖を以下に示す：
【００７８】
【化１】
二重鎖における第１のＣＡＣは、イヌエンドスタチンのＮ末端ヒスチジン残基をコードする。従って、全長のイヌエンドスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントは、発現のためにＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩで消化したｐｄＣｓ−ｃａＦｃベクター（実施例７を参照のこと）に連結され得る。ｃａＦｃ−ｃａＥｎｄｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そして抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡによりアッセイした。このタンパク質産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そしてウエスタンブロット分析により確認した。
【００７９】
（実施例９．ｃａＦｃ−ｃａアンギオスタチンの発現）
全長のイヌアンギオスタチンをコードするｃＤＮＡ（配列番号３９に示されるＤＮＡ配列；配列番号４０に示されるアミノ酸配列）を、本質的に前述の実施例に記載されるように、ｃａＦｃ融合タンパク質として、発現に合わせた。簡潔には、３’末端にて、終止コドンを、例えば、ＰＣＲによって、Ｃ末端のリジン残基をコードするコドンのすぐ後に導入し、そしてこれには、ＸｈｏＩ部位の代わりのＮｏｔＩ制限部位が続いた。なぜなら、イヌアンギオスタチンのｃＤＮＡにおいて、内側ＸｈｏＩ制限部位が存在したからであった。５’末端にて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、アンギオスタチンのＮ末端のすぐ上流にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で導入した。次いで、全長のイヌアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、発現のために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化したｐｄＣｓ−ｃａＦｃベクターに連結した（ここでＮｏｔＩ部位を、リンカー連結を通してＸｈｏＩ部位に導入した）。ｃａＦｃ−ｃａＡｎｇｉｏを発現している安定なＮＳ／０クローンを、実施例２および３に記載されるように選択し、そして抗ｃａＦｃ ＥＬＩＳＡによりアッセイした。このタンパク質産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そしてウエスタンブロット分析により確認した。
【００８０】
（実施例１０．ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ Ｋ１の発現）
アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの５つのＫｒｉｎｇｌｅドメインのうちの初めの４つを含む。いずれか１個または数個のＫｒｉｎｇｌｅドメインがアンギオスタチンの観察された抗脈管形成活性を担うか否かを決定するために、試験のために、１個のＫｒｉｎｇｌｅドメインを単独でまたはそれらの組合せで産生することが、可能である。融合タンパク質パートナーとしてのＦｃの有用性を実証するために、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋ１）の発現を、以下の方法で達成した。第１のＫｒｉｎｇｌｅドメインは、マウスアンギオスタチン（配列番号２５）のＧｌｕ−８７で終了する。ｃＤＮＡ中のこの位置には、都合のよいＮｓｉＩ制限部位が存在したので、その結果、ＮｓｉＩによる消化の後に、４塩基の３’突出をＴ４ポリメラーゼにより除去して、平滑末端を作製した。翻訳終止停止コドンを、パリンドロームリンカーＴＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ（配列番号４１）への連結を通して、Ｇｌｕ−８７をコードするＧＡＡのすぐ下流に導入した。ここで終止コドンＴＧＡには、ＸｈｏＩ部位が続いた。次いで、この短縮型アンギオスタチン（すなわち、第１のＫｒｉｎｇｌｅのみ）をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、高レベルの発現が、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８１】
（実施例１１．ｍｕＦｃ−ｍｕＡｎｇｉｏ内側Ｋ１の発現）
Ｋｒｉｎｇｌｅドメインは、複数のループ（外側のループおよび内側のループを含む）からなる。マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅでは、この内側のループはＣｙｓ５５およびＣｙｓ７９によって規定され、これは一緒になって、このループの基部でジスルフィド結合を形成する。内側のループのＣｙｓ−６７は、外側のループのＣｙｓ残基と別のジスルフィド結合を形成し、Ｋｒｉｎｇｌｅ構造を生じる。この内側のループが任意の抗脈管形成活性を有するか否かを試験するために、これを、以下の通りにｍｕＦｃ−内側Ｋ１（Ｋｒｉｎｇｌｅ１）として発現させた。テンプレートとして第１のＫｒｉｎｇｌｅをコードするＤＮＡフラグメントとともに、配列５’ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＡＣＡ（配列番号４２；配列番号４３に開示されるアミノ酸をコードした）を有する変異原性プライマーを使用して、ＰＣＲによって、ＴＧＣ（Ｃｙｓ−６７）からＡＧＣ（Ｓｅｒ）に変異誘発した。このことは、Ｋｒｉｎｇｌｅ１の内側のループが外側のループなしに発現される場合に、Ｃｙｓ−６７がジスルフィド結合を形成しないことを保証する。配列５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＧＧ（配列番号４４；配列番号４５に開示されるアミノ酸をコードした）を有する上流プライマーを使用して、Ｓｅｒ−４３（ＡＧＴ）に対するコドンのすぐ５’にインフレームでＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＢａｍＨＩ部位もまた、このＨｉｎｄＩＩＩ部位のすぐ上流に導入した。このＢａｍＨＩ部位は、以下の実施例１２に示される可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの末端に、ＢａｍＨＩ部位を連結するために有用である。従って、マウスアンギオスタチンのＳｅｒ−４３からＧｌｕ−８７をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−内側Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８２】
（実施例１２．ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏ 内側Ｋ１の発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−内側Ｋ１は、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅの内側のループに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を以下の通りに構築した。
【００８３】
マウスエンドスタチンｃＤＮＡの３’末端にＢｓｐＨＩ部位が存在する。マウスエンドスタチンのＣ末端にグリシン残基およびセリン残基の可撓性リンカーを導入するために、エンドスタチンをコードする５４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｐＨＩフラグメントを、配列番号４６および配列番号４８に開示されるオリゴヌクレオチドにより形成される重複するオリゴヌクレオチド二重鎖に連結した。配列番号４６によってコードされるアミノ酸リンカーを、配列番号４７に開示する。
【００８４】
マウスエンドスタチンおよびＧｌｙ−ＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、標準的なクローニングベクター中にサブクローニングした。次いで、ＢａｍＨＩ部位を使用して、実施例１１における内側Ｋ１をコードするＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを導入した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−内側Ｋ１をコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−内側Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８５】
（実施例１３．ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏ Ｋ１の発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−Ｋ１は、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンの第１のＫｒｉｎｇｌｅに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を以下の通りに構築した。
【００８６】
ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１２）のＢａｍＨＩ末端を、以下のアダプターを通じて、マウスアンギオスタチンのＫｒｉｎｇｌｅ１をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（実施例１０）に連結した：
【００８７】
【化２】
このアダプターは、ＨｉｎｄＩＩＩ’粘着末端を有し、これは、連結の際にＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生しない。従って、ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−Ｋｒｉｎｇｌｅ１をコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−Ｋ１の高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８８】
（実施例１４ ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏの発現）
ハイブリッド分子ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏは、グリシン残基およびセリン残基を含むポリペプチドリンカーにより、マウスアンギオスタチンに対して連結されたｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏを含む。このＤＮＡ構築物を、本質的に以下の通りに構築した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカーをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１２）のＢａｍＨＩ末端を、実施例１３に記載されるアダプターを通して、マウスアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結した。ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏをコードする得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ（Ｄ4Ｋ）ベクターに連結した。ｍｕＦｃ−ｍｕＥｎｄｏ−ＧｌｙＳｅｒリンカー−ｍｕＡｎｇｉｏの高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したとき、一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００８９】
（実施例１５．ｈｕＡｎｇｉｏ−ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏの発現）
ハイブリッド分子ｈｕＡｎｇｉｏ−ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏは、ｈｕＦｃ−ｈｕＥｎｄｏにペプチド結合により連結されたヒトアンギオスタチンを含む。このＤＮＡ構築物を、以下の通りに構築した。終止コドンを有さないヒトアンギオスタチンをコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＰＣＲによって初めに作製し、その結果、アンギオスタチンの最後のアミノ酸残基についてのコドンには、ＸｈｏＩ部位のＣＴＣＧＡＧがすぐ続いた。５’末端のＨｉｎｄＩＩＩを、ＡｆＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ’アダプターを通して、軽鎖シグナルペプチド（Ｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１：４９５）のＸｂａＩ−ＡｆＩＩＩフラグメントに連結した：
【００９０】
【化３】
アダプターのＨｉｎｄＩＩＩ’粘着末端は、連結の際にＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生しなかった。３’末端にて、ＸｈｏＩ部位を、以下のＸｈｏＩ’−ＡｆＩＩＩアダプターを通じて、ｈｕＦｃ−ｈｕ−ＥｎｄｏをコードするＡｆＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントのＡｆＩＩＩ部位に連結した：
【００９１】
【化４】
このアダプターのＸｈｏＩ粘着末端は、連結の際にＸｈｏＩ部位を再生しない。シグナルペプチド−ヒトアンギオスタチン−ｈｕＦｃ−ヒトエンドスタチンをコードする得られたＸｂａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、発現のためにｐｄＣｓベクター中にクローニングした。高レベルの発現は、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したとき一過性発現および安定な発現の両方において得られた。
【００９２】
（実施例１６ 薬物動態学）
薬物動態学研究の１つのセットでは、１００〜２００ｍｍ3のＬｅｗｉｓ肺腫瘍を移植されたＣ５７／ＢＬ６マウスに尾静脈において、１匹のマウス当たり７２０μｇのｈｕＦｕ−ｈｕＡｎｇｉｏを注射した。本研究で使用された腫瘍のサイズおよびｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏの用量を選択して、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：６８９）により記載される実際の処置プロトコルをシミュレートした。血液を眼窩後方の採血により、注射後１／２、１、２、４、８、２４、および４８ｈｒに回収した。この血液サンプルを、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡ、続いてウエスタン分析によって分析した。ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏは、マウスにおいて約３２時間の循環半減期を有することが見出され、そしてウエスタン分析は、９０％を超えるｈｕ−Ｆｃ−ｈｕＡｎｇｉｏが循環中にインタクトな分子として残っていたことを示した。
【００９３】
薬物動態学研究をまた、腫瘍を有さないＳｗｉｓｓマウスにおいて、２００μｇ／マウスの用量で繰り返した。この場合では、ｈｕＦｃ−ｈｕＡｎｇｉｏは、約３３時間の循環半減期を有することが見出された。
【００９４】
（均等物）
本発明は、それらの精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に記載される本発明を限定するのでなく、例示的であると全ての点において考慮されるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内となる全ての変化は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２７３４７８（Ｐ２００９−２７３４７８Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９６０９１（Ｐ２００９−１９６０９１）
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【分割の表示】特願２０００−５６６３０５（Ｐ２０００−５６６３０５）の分割
【原出願日】平成１１年８月２５日（１９９９．８．２５）
【出願人】（３０８０１４８４６）メルク パテント ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【分割の表示】特願２０００−５６６３０５（Ｐ２０００−５６６３０５）の分割
【原出願日】平成１１年８月２５日（１９９９．８．２５）
【出願人】（３０８０１４８４６）メルク パテント ゲーエムベーハー (12)
【Ｆターム（参考）】
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