インテグリンα−１１サブユニットに対する結合剤およびその使用
本発明は、医薬に用いるための抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体に関し、ここで、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体はインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対して結合特異性を有する。特に、本発明は、関節炎疾患（例えば、ＲＡおよびＯＡ）などの炎症性症状の処置における、このような抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘発体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンα１１サブユニットまたはそれを含んでなるヘテロ二量体（例えば、α１１β１ヘテロ二量体）に対して結合特異性を有する結合剤、および炎症性症状の処置におけるその使用に関する。具体的には、本発明は、関節炎疾患などの炎症性症状の処置に用いるための抗体および抗原結合フラグメント、その変異体、融合体および誘導体、ならびにそれを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用による多様な事象を調節する
インテグリンは、元々、内部の細胞骨格と隣接環境または細胞外細胞マトリックスとを結びつける介在細胞表面構造として定義されており、機能上「死んだ」分子と見なされていた。この理由は、１つには、ほとんどのインテグリンはシグナル伝達モチーフを欠いた極めて小さな細胞質テールだけを含むという知見に基づいていた。今日、インテグリンは、他の細胞表面受容体との相互作用および細胞内アダプタータンパク質の動員を介して、インサイドアウト(Phillips et ah, 1988, Blood 71:831-43.)、アウトサイドイン(Law et al, 1999, Nature 401:808-811.)の細胞シグナル伝達に関与する極めて複雑な構造であることが知られ、シグナルを細胞膜を横断して伝達することが示されている(Hynes, 2002, Cell 110:673-87;総説としては、Miranti & Brugge, 2002, Nat Cell Biol 4:E83-90.を参照)。
【０００３】
最もよく研究されている数種のインテグリンを、モノクローナル抗体または小分子阻害剤を用いて遮断すると、細胞−細胞および細胞−マトリックスの接触が排除されて、発達、組織修復、脈管形成、炎症および止血を含む多様な生体プロセスの干渉が起こることが示されている。これらの抗体のいくつかは臨床段階治験の対象となっている(Shimaoka & Springer, 2003, Nat Rev Drug Discov 2:703-16)。
【０００４】
このように、インテグリンが介在する免疫調節作用および細胞外マトリックス調節作用は、それらの天然ＥＣＭリガンドまたは抗β１インテグリン抗体を介したインテグリンの刺激にいっそう大きく限定されてきた(Loeser, 2002, Biorheology 39:119-24)。このような研究は、他のインテグリン受容体と同様に、軟骨細胞インテグリンのインサイドアウト、アウトサイドイン、側方シグナル伝達関与を実証した。
【０００５】
関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜性関節を侵し、疼痛、腫脹を生じ、患者の運動を低下させる炎症性の自己免疫疾患である。総ての末梢関節がＲＡに侵される可能性があるが、罹患が最も多いのは手、足および膝の関節である。ＲＡでは、未知の理由で免疫系が滑膜（関節包を裏打ちしている組織）を攻撃し、局部的炎症を起こす。炎症はやがてその関節内の軟骨および骨の破壊、ならびにその関節を支えている靱帯、腱および筋肉の破壊を引き起こす。リウマチ様の滑膜では、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞および血漿細胞が確認できる。管系における処置の多くは、これらの特定の細胞のより標的化された阻害をねらいとしている。ＲＡの実際の原因はまだ知られていないが、強い遺伝的要素がある。
【０００６】
ＲＡは世界の成人人口の０．５〜２．０％に見られ、患者の３人に１人が２０年以内に重度の不能状態となっている。ＲＡの罹患率は男性よりも女性で３倍高く、発症のピーク年齢は通常２０〜４５歳の間である。死亡率は、年齢および性別の合致した対照よりもＲＡ罹患者で２７％高く、女性のサブセットではいっそう高い。これは、研究によっておよそ５〜１８年の余命の低下を表す。ラジオグラフィー的に明らかな関節疾患は、最初の２年では患者の＞６７％、最初の５年では患者の＞７２％に見られる。
【０００７】
ＲＡは、滑膜性関節を標的とする慢性の全身性炎症性疾患であり、一連の関節外徴候を伴うことが多い。この関節炎は、関節軟骨へのリンパ球および顆粒球の浸潤、滑膜繊維芽細胞およびマクロファージの増殖、ならびに関節を取り巻いている滑膜性内面の新血管新生という複数細胞の炎症プロセスを特徴とする。この増殖プロセスには、関節の腫脹、紅斑および疼痛が含まれるが、関節の破壊ならびに骨密度および構造の低下への進行も起こる。
【０００８】
ＲＡの病理学的メカニズムは十分理解されていない。しかしながら、マクロファージ、樹状細胞、繊維芽細胞様滑膜細胞、肥満細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞などの多くの細胞種が関与していると考えられる。ＲＡ滑膜では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５などのサイトカインおよび種々のケモカインの放出が実在する。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１のレベルは疾病の症状および関節の損傷と強く相関している。血中のリウマチ様因子（ＲＦ）および抗シトルリン抗体などの自己抗体のレベルはＲＡに特徴的であり、この疾病の診断および予後マーカーとなる。
【０００９】
関節リウマチはまず、いくつかの異なる細胞種の流入によって示唆される滑膜の炎症性応答を特徴とする。この内面は肥厚し、腫脹する。さらに、骨の破壊が見られる。
【００１０】
ＲＡでは疾病改善薬が利用できるが、それらは副作用のために使用が制限され、多くの患者は既存の治療に応答しない。過去２０年の間、ＲＡ処置のもっと積極的なアプローチは、疾病の進行を休止させることを試みる疾病改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）の開発に至った。最も処方されているＤＭＡＲＤは、元々は癌の処置に用いられていたメトトレキサートである。他のものとしては、金塩、抗マラリア薬、スルファサラジン、テトラサイクリンおよびシクロスポリンが含まれる。医師は通常、疾病の発症時にＤＭＡＲＤを処方するが、中度〜重度のＲＡ罹患者にはＮＳＡＩＤ、コルチコステロイドおよびＤＭＡＲＤが同時に与えられる。
【００１１】
メトトレキサートは大多数のＲＡ患者で効果的であるが、多くの人がこの薬剤の副作用に耐えられず、およそ５０％の患者がついには処置が上手く行かず、その後は生物応答改質剤など、より最近の治療革新が望ましくなる。１９９８年に市場に出たレフルノミド(Arava; Aventis)はメトトレキサートとメカニズムおよび副作用が類似しており、メトトレキサート療法に失敗した患者の第二選択薬として用いられている。最も好結果の新規ＲＡ療法は、エタネルセプト(Eribrel; Amgen)、インフリキシマブ(Remicade; J&J/Centocor)およびアダリムマブ(Humira; Abbott)などの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）阻害剤である。しかしながら、ＴＮＦα阻害剤は、長期間の使用では、感染症および癌の増加などの副作用の可能性がある。
【００１２】
骨関節炎
骨関節炎（ＯＡ）は、進行性の変性性関節疾患であり、最も多い形態の関節炎である。骨関節炎は加齢と強い関係があり、高齢者における疼痛および能力障害の主要な原因である。種々の機械的、代謝的または構成的傷害がＯＡを誘発し得る。これらの傷害は明らかにならないままである場合（「原発性」ＯＡ）が多いが、外傷などの明白な原因が明らかになる場合もある（「二次的」ＯＡ）。関節組織（軟骨、骨、滑膜、関節包、靱帯、筋肉）は総て、健康および機能に関して互いに依存し合っている。あるものに対する傷害は他に影響を及ぼし、関節全体に影響を及ぼす一般的なＯＡ現象を招く。ＯＡプロセスには、新しい組織、最も著しくは骨（「骨棘」の産生および関節形状のリモデリングが含まれる。多くの場合、ＯＡはこれらの傷害を代償し、無痛であるが解剖学的に変化した機能性関節をもたらす（「代償性」ＯＡ）。しかしながら、これが上手く行かない場合もあり、進行性の損傷、関連の症状および「関節不全」を有するＯＡ患者としての顕現に至る。このような見方は、ＯＡの臨床的不均質性および変動のある臨床転帰を説明する。
【００１３】
骨関節炎は、６５歳を超える身体障害の主因であり、人口の推計１０％に影響を及ぼしている。ＯＡ関連の身体障害の罹患率は男性よりも女性で高く、８５歳を超える女性では常に２５％にのぼる。予測では、２０２０年までにＯＡ関連障害を有する人の数は６６％増加することが示唆されている。もしＯＡの医学的治療および予防のための疾病改善戦略を見つけることができなければ、次の３０年で、関節置換術を必要とする股関節部および膝の重度症候性ＯＡを有する人の数にも同様の増加が予測される。
【００１４】
骨関節炎（ＯＡ）は、単一の疾病またはプロセスではなく、１以上の滑膜性関節の構造的不全、そしてやがては症候的不全をもたらすある範囲のプロセスおよび障害の臨床的および病理学的転帰である。ＯＡは、肋軟骨下の骨、靱帯、関節包、滑膜および関節周囲の筋肉ならびに関節軟骨を含む関節全体を含む。結局、関節軟骨は、繊維形成、亀裂、潰瘍形成および関節表面の全厚の減少を伴って退化する。
【００１５】
骨関節炎の処置には広範囲のアプローチが含まれるが、手術を除いてほとんどの処置は待期的である。これは、ほとんどの処置が痛みを緩和し、それにより、患者の関節機能を高めるものであることを意味するが、これらの処置は疾病の経過を変化させない。外科的介入には、関節置換および骨切り術が含まれるが、これらは骨関節炎の進行を逆転させ、特定の関節に対して長期の機能改善および疼痛緩和をもたらし得る。
【００１６】
従って、また、ＯＡを処置するための選択肢を改善する差し迫った必要がある。ＯＡに対する既存の薬物療法は症状（主として疼痛）を軽減し、ある程度の効果しかなく、患者は実質的な疼痛負荷があるままである場合も多い。このように、これまでにＯＡにおいて疾病改善効果が実証された薬剤はない。
【００１７】
従って、本発明は、ＲＡおよびＯＡなどの炎症性症状に対する新規な処置およびそれに用いるための新規な結合剤を提供しようとするものである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の第一の態様は、炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用を提供し、ここで、該抗体もしくはフラグメントは以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHW［配列番号６］
を含んでなる。
【００１９】
当業者であれば、上記配列番号１〜６のアミノ酸配列は相補性決定領域（ＣＤＲ）を表すことが分かるであろう。
【００２０】
本発明の第二の態様は、炎症性症状の診断薬または予後薬の製造における、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用を提供する。
【００２１】
本発明の第三の態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用を提供する。
【００２２】
本発明の関連の態様は、
（ａ）炎症性症状を処置するための、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用；
（ｂ）炎症性症状を診断または予後するための、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用；
（ｃ）インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用
を提供する。
【００２３】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する「結合特異性」とは、インテグリンα１１サブユニット、またはα１１β１ヘテロ二量体などのそのヘテロ二量体と結合することができる、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を意味する。
【００２４】
一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体は、軟骨細胞、繊維芽細胞、間葉細胞（例えば、間葉幹細胞）または樹状細胞などの細胞の表面に存在する。
【００２５】
さらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vivoにおいて、すなわち、インテグリンα１１サブユニットが体内に存在する生理学的条件下で、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と結合することができる。このような結合特異性は、α１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現するトランスフェクト細胞を用い、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウエスタンブロット、クロマトグラフィーおよびフローサイトメトリーなどの当技術分野で周知の方法によって決定することができる（実施例参照）。抗体の特異性をどのように評価するかの例は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるHarlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory", Cold Spring Habor Laboratory Press, New Yorkに示されている。
【００２６】
当業者であれば、インテグリンα１１サブユニットはヒトまたは動物インテグリンα１１サブユニットであり得ることが分かるであろう。一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットはヒトである。既知のインテグリンα１１サブユニットの例は、引用することにより本明細書の一部とされる国際特許出願（公報）ＷＯ００／７５１８７(Cartela AB)に開示されている。
【００２７】
もう１つの実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と選択的に結合することができる。「選択的に結合することができる」とは、別のタンパク質（特に、α１１と最も高い同一性を有するα１０、α１およびα２などの他のインテグリン）に対するよりもインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量と少なくとも１０倍強く、例えば、少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強く結合するこのような抗体由来結合部分を含むものとする。この結合部分は生理学的条件下、例えば、in vivoでインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と選択的に結合し得る。相対的結合強度を評価するのに好適な方法としてイムノアッセイが含まれ、例えばこの場合、結合部分は抗体である（引用することにより本明細書の一部とされるHarlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory", Cold Spring Habor Laboratory Press, New York参照）。あるいは、結合は競合アッセイを用いるか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析(Biacore International AB, Sweden)を用いて評価することもできる。
【００２８】
さらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と排他的に結合する。
【００２９】
当業者であれば、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合特異性は、成分である重鎖と軽鎖の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）の存在により付与されることが分かるであろう。本発明の使用では、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性は、上記の配列番号１〜６として定義されるＣＤＲまたは同じ結合特異性を保持するその変異体配列の存在により付与される。
【００３０】
「結合特異性を保持する」とは、該抗体またはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、インテグリンα１１サブユニットとの結合に関して抗体「Ａ０３」と競合することができる（配列番号１１および下記実施例を参照）。
【００３１】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６として特定されるＣＤＲを含んでなる抗体と同じインテグリンα１１サブユニット上のエピトープと結合し得る。
【００３２】
「エピトープ」とは、本明細書において、抗体が結合する分子の部位、すなわち、抗原のある分子領域を意味するものとする。エピトープは、例えばアミノ酸配列によって決定される直鎖エピトープ、すなわち一次構造、または二次構造、例えば、ペプチド鎖のβシートもしくはαヘリックスへの折りたたみにより、または三次構造、例えば、ヘリックスもしくはシートが折りたたまれるか、または配列された抗原の三次元構造を与える方法により定義される三次元エピトープであり得る。
【００３３】
インテグリンα１１サブユニットの好適なエピトープ（またはその一部）の例は以下の通りである。
WNGCNEDEHCVPDLVLDARSDLPTAMEYCQRVLRKPAQDCSAYTLSF
DTTVFIIESTRQRVAVEATLENRGENAYSTVLNISQSANLQFASLIQKED
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号７］
【００３４】
インテグリンα１１のさらなる好適なエピトープとしては、配列番号７のフラグメント、融合体または天然変異体が含まれ得る。
【００３５】
例えば、好適なフラグメントは、配列番号７で示されるヒトα１１インテグリン配列のほぼアミノ酸７７８番〜アミノ酸１１４２番、またはヒトα１１インテグリン配列のほぼアミノ酸８０４番〜ほぼアミノ酸８２６番のアミノ酸配列を本質的に含んでなるペプチドなどの細胞外延長領域、特に、アミノ酸配列ＥＹＣＱＲＶＬＲＫＰＡＱＤＣＳＡＹＴＬＳＦＤＴ［配列番号８］を本質的に含んでなるペプチド、またはヒトα１１配列のほぼアミノ酸（ａａ）番号：ａａ７７８〜ａａ８００、ほぼａａ８００〜８２０番、ほぼａａ８２０〜８４０番、ほぼａａ８４０〜８６０番、ほぼａａ８６０〜８８０番、ほぼａａ８８０〜９００番、ほぼａａ９００〜９２０番、ほぼａａ９２０〜９４０番、ほぼａａ９４０〜９６０番、ほぼａａ９６０〜９８０番、ほぼａａ９８０〜１０００番、ほぼａａ１０２０〜１０４０番、ほぼａａ１０４０〜１０６０番、ほぼａａ１０８０〜１１００番、ほぼａａ１１００〜１１２０番、ほぼａａ１１２０〜１１４２番を含んでなるか、またはそれからなるいずれかのポリペプチドフラグメントを含んでなるか、またはそれからなる。
【００３６】
上記の総てのアミノ酸番号は、ヒトα１１配列アミノ酸番号から算出され、ＷＯ００／７５１８７（引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているヒトインテグリンα１１のアミノ酸１番はＭであり、ａａ２番はＤであり、ａａ３番はＬであり、ａａ４番はＰであり、ａａ５番はＲであり、ａａ６番はＧであり、ａａ７番はＬであるなどである。
【００３７】
好適なエピトープ融合体としては、上記のペプチドとＳｔｒｅｐＴａｇテールの融合体が含まれる。
【００３８】
上記のエピトープポリペプチド配列の、天然変異体などのエピトープ変異体としては、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは、前記配列と少なくとも７０％または８０％または８５％または９０％の同一性、より好ましくは、前記アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含んでなるポリペプチドを含む。
【００３９】
同一性％は、例えば、Expasy facilityサイト：
(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)
のＬＡＬＩＧＮプログラム(Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)を用い、パラメーターとしてグローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティー−１４、エクステンディングギャップペナルティー−４を用いるなど、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。
【００４０】
あるいは、２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウイスコンシン大学ジェネティックコンピューティンググループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて決定することもでき、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して計算されると考えられる。
【００４１】
抗体「Ａ０３」の結合特異性を保持する抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体はまた、抗体「Ａ０３」と同じ１以上の生物特性を保持していてもよい（下記参照）。
【００４２】
試験抗体が結合に関して第二の抗体と競合することができるかどうかを判定するための方法は当技術分野で周知である。
【００４３】
１つの好適な方法が、α１１結合抗体Ａ０３の評価のためのサンドイッチＥＬＩＳＡである。例えばポリクローナル抗体の好適な量は、ヒトα１１の細胞質テールに対するポリクローナルウサギ抗体１０μｇ／ｍｌなどである。次に、この抗体は、例えばＭａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ（商標）などの９６ウェルプレートにコーティングされた場合、捕捉抗体として用いられる。コーティングは、例えばプレートを４℃で一晩インキュベートした後、例えばＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄することによるなど、当技術分野で公知の標準法に従って行う。ウェルを、例えば室温にて、ＴＢＳ−Ｔ中３％のＢＳＡで１時間ブロッキングすることができる。次に、ヒトα１１発現ベクターで安定トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの細胞抽出液をアッセイバッファー（例えば、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を添加したＴＢＳ−Ｔ）で希釈する。次に、例えばウェル当たり５０μｌなどの好適な量の希釈細胞抽出液を加え、例えば室温で１時間、インキュベートして、コーティングされた抗体と結合させる。その後、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、ビオチンとコンジュゲートさせた一次抗体（Ａ０３または対照抗体）を、例えばアッセイバッファー中２μｇ／ｍｌなどの好適な量で加える。次に、プレートを、例えば室温で１時間など、可能であれば、Ａ０３および対照抗体の結合を可能とするに十分な時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ビオチニル化一次抗体を用いる場合には、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体（ＤＡＫＯ）を用い、アッセイバッファーで相応に希釈し（１：５０００）、ウェルに加えればよい。その後、プレートを、例えば室温で１時間など、ストレプトアビジン−ビオチン複合体が形成するに十分にインキュベートする。例えばＴＢＳ−Ｔで３回などの洗浄の後、プレートをペルオキシダーゼ基質（例えば、OPD SigmaFast, Sigma）で現像する。比色定量変化の吸光度を好適な波長（この場合４９０ｎｍ）で測定する。
【００４４】
一次抗体がコンジュゲートされない場合には、同じＥＬＩＳＡを代わりに、例えばSerotecからの、例えばマウス抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰなどの、ＨＲＰと直接コンジュゲートされたヒトＩｇＧ４に対する二次抗体とともに、あるいはコンジュゲートされない場合には、次いで例えばＤＡＫＯからのＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体とインキュベートすることができる。その後、プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４５】
さらなる方法としては、上記で概略を示したサンドイッチＥＬＩＳＡを逆転させることを含み、代わりに、捕捉抗体としてα１１抗体Ａ０３を用いる。この場合、α１１を含む細胞抽出液を加え、以下の改変を施して上記で概略を示したようにＥＬＩＳＡを行う。
【００４６】
一次抗体として、ヒトα１１の細胞質テールに対するポリクローナルウサギ抗体をアッセイバッファーで希釈する（１μｇ／ｍｌ）。二次抗体として、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を用いることができる（例えば、ＤＡＫＯ、１：５０００希釈）。その後、プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４７】
さらなるＥＬＩＳＡアッセイでは、エピトープ修飾または遮断抗体を評価することができる。これは、例えば以下の改変を施して上記で詳細に示したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いるなど、いくつかの方法で行うことができる。
【００４８】
捕捉抗体ならびにα１１を上記で詳細に示したように９６ウェルプレートに加える。一次抗体を適用する前に、プレートをアッセイバッファー中１０μｇ／ｍｌの試験抗体、例えば、エピトープ修飾または遮断抗体とともにインキュベートする。プレートを室温で１５分間インキュベートし、その後、ビオチンとコンジュゲートさせた一次抗体（Ａ０３または対照抗体）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４９】
試験抗体、例えば、エピトープ修飾または遮断抗体を評価するために逆サンドイッチＥＬＩＳＡも使用可能である。このＥＬＩＳＡでは、α１１抗体Ａ０３を捕捉抗体として使用することができる。次に、α１１を含有する細胞抽出液を上記で概略を示したように加え、種々のコンジュゲート、可能性のある修飾抗体を一次抗体として用いることができる。
【００５０】
試験抗体が結合に関して二次抗体と競合することができるかどうかを評価するためのさらなる方法は、下記の実施例ＩＶに記載されているような蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ（登録商標））などのフローサイトメトリーによる。
【００５１】
競合抗体を同定するのに好適なさらなる方法は、引用することにより本明細書の一部とされるAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York, ISBN 0-87969-314-2（例えば、５６７〜５６９頁、５７４〜５７６頁、５８３頁および５９０〜６１２頁を参照）に開示されている。
【００５２】
「抗体」とは、実質的に完全な抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここでは、天然ヒト抗体に対して、少なくとも１つのアミノ酸が突然変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにその抗原結合フラグメントおよび誘導体を含むものとする。例えば、この抗体はモノクローナル抗体であり得る。
【００５３】
よって、一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる。
【００５４】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は本質的に完全な抗体からなってよい。「本質的に〜からなる」とは、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、インテグリンα１１サブユニットに対する結合特異性を保持するに十分な完全抗体の一部からなることを意味する。
【００５５】
「抗体」とはまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥをはじめ、あらゆる抗体種を含む。しかしながら、一実施形態において、該抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子などのＩｇＧ分子である。
【００５６】
一実施形態において、該抗体はＩｇＧ４分子である。
【００５７】
さらなる実施形態において、該抗体は非天然抗体である。もちろん、抗体が天然抗体である場合、それは単離された形態（すなわち、天然に見られるものとは異なる）で提供される。
【００５８】
抗体の重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与し、これは初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。さらなる確証は齧歯類抗体の「ヒト化」により見出された。齧歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合し、結果として得られる抗体が齧歯類により産み出された抗体の抗原特異性を保持するようにすることができる(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855)。
【００５９】
総て１以上の可変ドメインを含む、抗体フラグメントの細菌発現を含む実験から知られているように、抗原特異性は可変ドメインにより付与され、定常ドメインとは独立である。これらの分子にはＦａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041)；Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038)；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)および単離されたＶドメインを含んでなるシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）(Ward et al (1989) Nature 341, 544)。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説はWinter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299に見出される。
【００６０】
よって、「抗原結合フラグメント」とは、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と結合することができる抗体の機能的フラグメントを意味する。
【００６１】
抗原結合フラグメントの例は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択することができる。
【００６２】
一実施形態において、抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。
【００６３】
完全抗体ではなく抗体フラグメントを用いる利点は数倍である。フラグメントが小さいほど、固体組織の浸透性が良好となるなど、薬理特性の向上をもたらすことができる。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントを大腸菌(E. coli)内で発現させ、そこから分泌させることができ、よって、大量の該フラグメントを容易に生産することができる。
【００６４】
また、修飾型の、例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の好適なポリマーの共有結合によって修飾された、抗体およびその抗原結合フラグメントならびにその使用も本発明の範囲内に含まれる。
【００６５】
抗体および抗体フラグメントを作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のin vivo産生の誘発、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング(引用することにより本明細書の一部とされるOrlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al, 1991, Nature 349:293-299)または培養細胞系統によるモノクローナル抗体分子の作製を用いるいくつかの方法のいずれか１つによって作製することができる。これらには、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれる（引用することにより本明細書の一部とされるKohler et al, 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al, 1985. J Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al, 1984. Mol Cell. Biol. 62:109-120参照）。
【００６６】
該抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体は組換え手段によって生産することができる。
【００６７】
選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、"Monoclonal Amtibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)および"Monoclonal Hybridoma Amtibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されているものなどの既知の技術によって製造することができる。
抗体フラグメントはまた、当技術分野で周知の方法を用いて得ることもできる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York参照）。例えば、本発明の抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解またはそのフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物またはその他のタンパク質発現系）での発現によって製造することができる。あるいは、抗体フラグメントは、常法により、完全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることもできる。
【００６８】
当業者であれば、ヒト療法または診断法にはヒト化抗体を使用可能であることが分かるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する、好ましくは最小部分を有する、遺伝的に操作されたキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、望ましい官能基を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域に由来する残基で置換されている抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒトヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも導入された相補性決定領域またはフレームワーク配列にも見られる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に総てを含み、ここでは、相補性決定領域の総てまたは実質的に総てが非ヒト抗体のそれに相当し、フレームワーク領域の総てまたは実質的に総てが関連のあるヒトコンセンサス配列のそれに相当する。ヒト化抗体は最適には、一般にヒト抗体に由来する、Ｆｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部も含む（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Jones et al, 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al, 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596参照）。
【００６９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（導入残基と呼ばれることが多い）は一般に導入可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類相補性決定領域で置換することにより、本質的に記載の通りに行うことができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al, 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science 239:1534-15361；米国特許第４，８１６，５６７号参照）。よって、このようなヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、いくつかの相補性決定領域残基および可能性としてはいくつかのフレームワーク残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体であってよい。
【００７０】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む当技術分野で公知の種々の技術を用いて同定することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al, 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al, 1991. J. Immunol. 147:86-95, Soderlind et al., 2000, Nat Biotechnol 18:852-6およびＷＯ９８／３２８４５参照）。
【００７１】
一度、好適な抗体が得られれば、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロットなどにより、抗体の結合特異性または生物活性などの活性に関してそれらを試験することができる。生物活性は特定の特徴に関する読み取りを用いる種々のアッセイで試験することができる。本発明の抗体の１以上の生物活性の例としては次のものがある。
ａ）軟骨の退化からの保護（例えば、プロテオグリカン含量の減少）
ｂ）関節の炎症（例えば、腫脹）の軽減；および／または
ｃ）炎症性細胞の浸潤の軽減
【００７２】
前記生物活性を試験するのに好適なアッセイの例は当技術分野で公知であり、本明細書の実施例でも示されている。
【００７３】
本発明の第一の態様の一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜３で示されるＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。例えば、該重鎖可変領域は、配列番号９：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSS［配列番号９］
のアミノ酸配列を含んでなり得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。
【００７４】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号４〜６で示されるＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。例えば、該軽鎖可変領域は、配列番号１０：
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLG
［配列番号１０］
のアミノ酸配列を含んでなり得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。
【００７５】
よって、一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００７６】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖を含んでなり得る。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
［配列番号１１］
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPG
AVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS
YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
［配列番号１２］
【００７７】
さらなる例示的実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQWGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQP
PSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGYNER
PSGWDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGHWFGG
GTKLTVLG
［配列番号１３］
【００７８】
この配列は本発明の方法に用いるための例示的「Ａ０３」ｓｃＦｖ分子に相当する（リンカー配列は下線で示される）。所望により、この配列はまた、例えばＣ末端にｃ−ｍｙｃおよび／またはヒスチジンタグを含んでもよい。
EQKLISEEDLSGSAAAHHHHHH［配列番号１４］
【００７９】
本明細書において「アミノ酸」とは、標準的な２０の遺伝的にコードされているアミノ酸およびそれらの対応する「Ｄ」型立体異性体（天然の「Ｌ」型に対して）ωアミノ酸他の天然アミノ酸、非通常アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）および化学的に誘導体化されたアミノ酸（下記参照）を含む。
【００８０】
「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など、アミノ酸が具体的に挙げられている場合、この用語は、特に断りのない限り、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンの双方を指す。他の非通常アミノ酸も、そのポリペプチドに所望の機能特性が保持されている限り、本発明のポリペプチドに好適な成分であり得る。示されているペプチドに関し、それぞれコードされているアミノ酸残基は、適当であれば、通常アミノ酸の通称に相当する一文字表記により表される。
【００８１】
一実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド結合剤はＬ−アミノ酸を含んでなるか、またはそれからなる。
【００８２】
当業者であれば、本発明は、定義されたポリペプチドの変異体、融合体および誘導体、ならびに該変異体または誘導体の融合体、ならびにその使用を、このような変異体、融合体および誘導体がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する限り、包含することが分かるであろう。
【００８３】
変異体は、組換えポリヌクレオチドを用い、当技術分野で周知のタンパク質工学および部位指定突然変異誘発の方法を用いて作製することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
【００８４】
該ポリペプチドの「融合体」とは、他のいずれかのポリペプチドと融合されたポリペプチドを含むものとする。例えば、該ポリペプチドは、該ポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＡタンパク質などのポリペプチドと融合させることができる。このような融合体の例は当業者に周知である。同様に、該ポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴ−ヒスチジンタグまたは周知のＭｙｃタグエピトープなどの、抗体により認識されるエピトープと融合させることができる。該ポリペプチドの任意の変異体または誘導体との融合体もまた、本発明の範囲に含まれる。インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持するなど、望ましい特性を保持する融合物が好ましいと考えられる。
【００８５】
該融合体は本発明のポリペプチドに望ましい特徴を付与するさらなる部分を含んでなることができ、例えば、該部分はポリペプチドの検出もしくは単離、またはポリペプチドの細胞取り込みの促進に有用であり得る。該部分は例えば、当業者に周知のような、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小蛍光団もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光団であり得る。該部分は、当業者に公知のような免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであってもよいし、あるいは当業者に公知のように、ポリペプチドの細胞取り込みを促進することができる親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
【００８６】
「ポリペプチドの変異体」とは、保存性または非保存性のいずれかの、挿入、欠失および置換を含むものとする。特に、このような変化が該ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドの変異体を含むものとする。例えば、このような変化がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を実質的に変化させないポリペプチドの変異体を含むものとする。
【００８７】
ポリペプチド変異体は、上記で示された１以上のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性、例えば、上記で明示された１以上のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００８８】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウイスコンシン大学ジェネティックコンピューティンググループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて決定することができ、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して計算されると考えられる。
【００８９】
このアライメントはあるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Thompson et al, 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載の通り）を用いて行うこともできる。
【００９０】
使用するパラメーターは次の通りであり得る：
ファースト・ペアワイズ・アライメント・パラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナルの数；５。スコアリング法：ｘ％。
マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップエクステンションペナルティー；０．０５。
スコアリング法：ＢＬＯＳＵＭ。
【００９１】
あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて、ローカル配列アラインメントを決定することもできる。
【００９２】
本発明のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、修飾または誘導体化された１以上のアミノ酸を含み得る。
【００９３】
１以上のアミノ酸の化学誘導体は機能的側基との反応により達成することができる。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他の種のエステルおよびヒドラジド基を形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学誘導体として、２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに取って代わることができ、５−ヒドロキシリシンはリシンに取って代わることができ、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに取って代わることができ、ホモセリンはセリンに、また、オルニチンはリシンに取って代わることができる。誘導体としてはまた、必要な活性が維持される限り、１以上のさらなる付加または欠失を含むペプチドも含む。含まれる他の修飾としては、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）などの末端修飾がある。
【００９４】
当業者であれば、ペプチドミメティック化合物も有用であり得ることが分かるであろう。よって、「ポリペプチド」には、インテグリンα１１サブユニットと結合することができるペプチドミメティック化合物を含むものとする。「ペプチドミメティック」とは、治療薬としての特定のペプチドのコンフォメーションおよび望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【００９５】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結されている分子だけでなく、このペプチド結合が逆転している分子も含む。このような逆ペプチドミメティックは、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるMeziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載されているものなど、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。このアプローチには、主鎖に関わるが、側鎖の配向には関わらない変化を含むシュードペプチドの作製が含まれる。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含む逆ペプチドは、タンパク質分解に対して遙かに高い耐性を有する。あるいは、本発明のポリペプチドは、１以上のアミノ酸残基が通常のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって連結されているペプチドミメティック化合物であってもよい。
【００９６】
さらに別法では、このペプチド結合は、これらのアミノ酸残基の炭素原子間にスペースを保持する適当な適当なリンカー部分が用いられる限り、一緒に分配することができ、このリンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ二次元配置を有していれば特に好ましい。
【００９７】
このポリペプチドは、エキソ型タンパク質分解消化に対する感受性を低下させる助けとなるように、そのＮ末端またはＣ末端において便宜にブロッキングすることができると考えられる。
【００９８】
Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの種々の非コードまたは修飾アミノ酸もまた、哺乳類ペプチドを修飾するために使用されてきた。さらに、推定される生活性コンフォメーションが、環化などの共有結合的修飾により、またはラクタムの組み込みにより、または他の種類の架橋により安定化され得る（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. ScLi. USA 75:2636およびThursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166参照）。
【００９９】
多くの合成戦略の中でも一般的な主題は、ペプチドに基づくフレームワークにいくつかの環状部分を導入することであった。この環状部分はペプチド構造のコンフォメーションスペースを制限し、多くの場合、そのペプチドの、特定の生物学的受容体に対する特異性の増強をもたらす。この戦略の付加的利点は、ペプチドに環状部分を導入すると、細胞ペプチダーゼに対する感受性が消失されたペプチドも得られるということである。
【０１００】
よって、例示的ポリペプチドは末端システインアミノ酸を含んでなる。このようなポリペプチドは、末端システインアミノ酸におけるメルカプチド基のジスルフィド結合の形成によりヘテロデティック(heterodetic)形態で、または末端アミノ酸間のアミドペプチド結合の形成によりホモデティック(homodetic)形態で存在し得る。上記で示したように、Ｎ、末端システインとＣ末端システインの間のジスルフィド結合またはアミド結合によって小ペプチドを環化すると、タンパク質分解が低下し、また、構造の堅牢性が高まることで、直鎖ペプチドで見られることがある特異性および半減期の問題が回避され、より特異性の高い化合物が生じ得る。ジスルフィド結合によって環化されたポリペプチドは、タンパク質分解をなお受けやすい遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端を有するが、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシルの間でのアミド結合の形成により環化されたペプチドは、それゆえに、もはや遊離のアミノ末端またはカルボキシ末端を含まない。例えば、本発明のペプチドは、Ｃ−Ｎ結合またはジスルフィド結合のいずれかによって連結可能である。
【０１０１】
本発明は、ペプチドの環化の方法により何ら限定されるものではないが、その環状構造がいずれかの好適な合成方法によって達成され得るペプチドを包含する。よって、ヘテロデティック結合としては、限定されるものではないが、ジスルフィド橋、アルキレン橋またはスルフィド橋による形成を含み得る。ジスルフィド橋、アルキレン橋またはスルフィド橋を含む環状ホモデティックペプチドおよび環状ヘテロデティックペプチドの合成方法は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，６４３，８７２号に開示されている。環化法の他の例は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，００８，０５８号に記載および開示されている。
【０１０２】
環状安定ペプチドミメティック化合物の合成のためのさらなるアプローチとして閉環メタセシス（ＲＣＭ）がある。この方法はペプチド前駆体を合成する工程と、それをＲＣＭ触媒と接触させてコンフォメーション的に制限されたペプチドを得ることを含む。好適なペプチド前駆体は２以上の不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み得る。この方法は固相ペプチド合成技術を用いて行うことができる。この実施形態では、固相支持体に固定されている前駆体をＲＣＭ触媒と接触させた後、生成物を固相支持体から切断し、コンフォメーション的に制限されたペプチドを得る。
【０１０３】
引用することにより本明細書の一部とされるD. H. RichによりProtease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986)に開示されているもう１つのアプローチ，は、酵素阻害剤の設計において遷移状態類似体の概念の適用によりペプチドミミックスを設計したものである。例えば、スタリンの第二級アルコールは、ペプシン基質の切れやすいアミド結合の四面体遷移状態を模倣することが知られている。
【０１０４】
要するに、末端修飾は周知のように、プロテイナーゼ消化のよる感受性を低下させるのに、従って、溶液中、特に、プロテアーゼが存在する可能性のある体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチドの環化もまた有用な修飾であり、環化により形成される安定構造のために、また、環状ペプチドで見られる生物活性の点で好ましい。
【０１０５】
よって、一実施形態において、ポリペプチド結合部分は環状である。しかしながら、別の実施形態では、ポリペプチドは直鎖である。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合部分の薬学上許容される酸または塩基付加塩を含んでなる組成物も含む。本発明において有用な上述の塩基化合物の薬学上許容される酸付加塩を作製するために使用される酸は、無毒な酸付加塩、すなわち、とりわけ塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、二酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩などの薬理学上許容される陰イオンを含む塩を形成するものである。
【０１０７】
薬学上許容される塩基付加塩もまた、本発明の化合物の薬学上許容される塩形態を作製するために使用可能である。
【０１０８】
本来酸性である本発明の化合物の薬学上許容される塩基塩を作製するために試薬として使用可能な化学塩基は、このような化合物と無毒な塩基塩を形成するものである。このような無毒な塩基塩としては、限定されるものではないが、とりわけ、アルカリ金属陽イオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）ならびにアルカリ土類金属陽イオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えば、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）、および低級アルカノールアンモニウムおよび薬学上許容される有機アミンの他の塩基塩などのような薬理学上許容される陽イオンに由来するものが挙げられる。
【０１０９】
本明細書に記載のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成することができる。好適ないずれの凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーク乾燥）および／または再構成技術を使用してもよい。当業者であれば、凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性損失をもたらし得ること（例えば、通常の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大きな活性損失を有する傾向がある）、および補償するために使用レベルは上方調整しなければならない場合があることが分かるであろう。一実施形態では、凍結乾燥（フリーズドライ）したポリペプチドは、再水和した際にその活性（凍結乾燥前）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を失活する。
【０１１０】
当業者であれば、本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメント、その変異体、融合体および誘導体がその単量体形態、またはホモもしくはヘテロ多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体など）形態で存在し得ることが分かるであろう。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、治療部分および／または検出可能部分を含んでなる。
【０１１２】
「検出可能部分」とは、その部分が、本発明の化合物を患者に投与した後に標的部位に局在した際に、一般には非侵襲的に身体および局在した標的の部位の外側から検出可能なものである。検出可能部分は、検出可能な種の産生に直接または間接的のいずれかで関与する単一の原子または分子であり得る。よって、本発明のこの実施形態の結合剤は画像化および診断に有用である。
【０１１３】
好適な検出可能部分は医化学では周知であり、これらの部分とポリペプチドおよびタンパク質との連結は当技術分野で周知である。検出可能部分の例としては、限定されるものではないが、次のものが挙げられる：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ）、放射性核種（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光剤、ビオチニル基および二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的立体障害を軽減するための、様々な長さのスペーサーアームによって結合させる。
【０１１４】
放射性標識またはその他の標識は、既知の方法で本発明のポリペプチドに組み込むことができる。例えば、結合部分がポリペプチドであれば、生合成可能であるか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いる化学アミノ酸合成によって合成することができる。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、結合部分内のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０はリシン残基を介して結合させることができる。１２３Ｉを組み込むためにはヨードゲン法（引用することにより本明細書の一部とされるFraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57）を使用することができる。参照文献（引用することにより本明細書の一部とされる"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989）は、他の方法を詳細に記載している。
【０１１５】
上記のような抗体および抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、炎症性症状の処置に有効性を有する。
【０１１６】
「処置」とは、対象／患者の治療的処置および予防的処置の双方を含むものとする。「予防的」とは、患者または対象における炎症性症状の見込みを予防または軽減する、本明細書に記載のポリペプチドまたは処方物の使用を包含するために用いる。
【０１１７】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される炎症性症状の処置に有効性を有し得る。
【０１１８】
一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、関節リウマチまたは骨関節炎などの関節疾患の処置において有効性を有する。このような有効性は、マウスにおける関節炎モデル（実施例参照）などの好適な動物モデルで決定することができる。
【０１１９】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vitroおよび／またはin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）する能力を持ち得る。
【０１２０】
「調整する」とは、コラーゲンの分解速度を高める、または低下させることを含むものとする。コラーゲンの分解の阻害は完全なものであっても部分的なものであってもよい。例えば、コラーゲンの分解は、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の不在下でのコラーゲン分解に比べて１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害され得る。
【０１２１】
該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、次の医学的に有用な特性の１以上を示し得る。
ａ）軟骨の退化からの保護（例えば、プロテオグリカン含量の減少）
ｂ）関節の炎症（例えば、腫脹）の軽減；および／または
ｃ）炎症性細胞の浸潤の軽減
【０１２２】
上記の特性の試験方法は下記の実施例に記載されている。
【０１２３】
ゆえに、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、同じ動物モデルで腫脹を軽減する（ＮＳＡＩＤ）または腫脹および細胞浸潤（抗ＴＮＦ抗体）を軽減する関節疾患に対する確立された療法を超える有利な特性を有し得るが、３つのパラメーター総てには影響を及ぼすことはできない。
【０１２４】
よって、本発明は次の方法：
ａ）軟骨部位に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、軟骨を分解から保護するための方法；
ｂ）関節に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、関節炎症を軽減するための方法；および
ｃ）関節に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、炎症性細胞の関節への浸潤を軽減するための方法
を提供する。
【０１２５】
特に、本発明の第四の態様は、炎症性症状を有する個体を処置するための方法を提供し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２６】
本発明の第五の態様は、個体において炎症性症状を診断または予後するための方法を提供し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２７】
第六の態様は、個体の身体において、炎症性症状に関連するインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を画像化するための方法を記載し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２８】
本発明の上記態様の一実施形態では、該方法は、個体において該化合物の位置を検出する工程をさらに含む。
【０１２９】
本発明の第七の態様は、個体において炎症性症状の進行を監視するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）第一の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；
（ｂ）第二の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、インテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；および
（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を比較すること
を含み、工程（ａ）と比べた場合の工程（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量の増加が炎症性症状の進行の指標となる。
【０１３０】
本発明の第八の態様は、炎症性症状と関連する細胞を同定する方法を提供し、該方法は供試細胞のサンプル中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること、およびそれを陽性対照および／または陰性対照に対するインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量と比較することを含む。
【０１３１】
該陽性対照は炎症性症状に罹患している対象由来の細胞を含んでよく、該陰性対照は炎症性症状に罹患していない健康な対象に由来する細胞を含んでよい。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、該細胞は軟骨細胞、繊維芽細胞および間葉細胞（例えば、間葉幹細胞）からなる群から選択される。
【０１３３】
サンプル中のインテグリンα１１サブユニットの量は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。生体サンプル中のインテグリンα１１タンパク質レベルをアッセイするのに好適な方法には、抗体に基づく技術が含まれる。例えば、組織中のインテグリンα１１タンパク質発現は、従来の免疫組織学的方法を用いて検討することができる。これらの場合、一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって特異的認識が提供されるが、二次検出系は蛍光、酵素またはその他のコンジュゲートされた二次抗体が利用可能である。結果として、病理学的検査用の組織切片の免疫組織学的染色が得られる。また、ウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためにインテグリンα１１タンパク質を遊離させるために、例えば尿素および中性洗剤を用いて組織を抽出することもできる（引用することにより本明細書の一部とされるJalkanen et al, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al, 1987, J. Cell. Biol 105:3087-3096）。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術では、インテグリンα１１タンパク質の定量は、標品として単離されたインテグリンα１１タンパク質を用いて果たすことができる。この技術は体液にも適用することができる。
【０１３４】
一実施形態において、供試細胞は、対応する正常な健康細胞に比べての、インテグリンα１１サブユニットタンパク質レベルのアップレギュレーションにより、炎症性症状と関連する細胞として同定される。「アップレギュレーションされる」とは、インテグリンα１１サブユニットタンパク質が、正常（健康）細胞におけるインテグリンの発現に比べて少なくとも１０％上昇していることを意味する。例えば、インテグリンα１１サブユニットタンパク質のレベルは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはさらには１００％もしくはそれを超えて上昇され得る。
【０１３５】
さらなる実施形態において、上記の方法は、個体において該化合物の位置を検出する工程をさらに含む。
【０１３６】
化合物または抗体の検出は、臨床的画像化および診断の技術分野で周知の方法を用いて果たすことができる。必要とされる特定の方法は、該化合物または抗体に結合される検出可能な標識の種類によって異なる。例えば、放射性原子はオートラジオグラフィーまたはあるいは場合によっては上記のような磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて検出可能である。
【０１３７】
本発明の上記方法のさらなる実施形態において、炎症性症状は、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される。
【０１３８】
例えば、炎症性症状は関節リウマチまたは骨関節炎などの関節疾患であり得る。
【０１３９】
本発明の第九の態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、前記抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該その変異体もしくはその誘導体の融合体と競合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する（ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【０１４０】
好適な抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、本発明の使用および方法に関して上記されている。
【０１４１】
インテグリンα１１サブユニットとの結合に関して、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができるこのような抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、当技術分野で周知の技術を用いて同定することができる。例えば、まずファージディスプレー抗体ライブラリーをスクリーニングしてインテグリンα１１サブユニットと結合する抗体を同定し、その後、これらの抗体を、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合するものを同定するためにさらに試験することができる。
【０１４２】
本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体の一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体は細胞（軟骨細胞または繊維芽細胞など）の表面に局在する。
【０１４３】
当業者ならば、本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は本発明の上記使用および方法において有用性を有することが分かるであろう。
【０１４４】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子「と競合することができる」とは、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体は、配列番号１１のｓｃＦｖ分子とインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合を少なくとも部分的に阻害する、または干渉することができることを意味する。競合結合は、ＥＬＩＳＡ（上記の通り）などの当業者に周知の方法によって決定することができる。
【０１４５】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該その変異体もしくは誘導体の融合体は、配列番号１１のｓｃＦｖ分子とインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、３５％、またはさらには１００％阻害することができる。
【０１４６】
一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる。
【０１４７】
もう１つの実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる。
【０１４８】
本明細書において「エピトープ」とは、抗体が結合する分子の部位、すなわち、抗原のある分子領域を意味するものとする。エピトープは、例えばアミノ酸配列、すなわち一次構造により決定される直鎖エピトープ、または二次構造、例えば、ペプチド鎖の、βシートまたはαヘリカルへの折りたたみにより、またははヘリックスもしくはシートが折りたたまれ、または配列されて抗原の三次元構造を与える方法である三次構造により定義される三次元エピトープであってよい。
【０１４９】
本発明の第九の態様の一実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる。
【０１５０】
本発明の第九の態様のもう１つの実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、およびＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）からなる群から選択される）抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる。
【０１５１】
該抗体はモノクローナル抗体などの組換え抗体であり得ると考えられる。例えば、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントはヒトまたはヒト化されていてもよい。
【０１５２】
本発明の第九の態様のさらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vitroおよび／またはin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）することができる。
【０１５３】
本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、例えば、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される炎症性症状の処置において有用性を有し得る。
【０１５４】
本発明の第九の態様のさらなる実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、治療部分および／または検出可能部分（上記の通り）をさらに含んでなる。
【０１５５】
本発明の第十の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードする核酸分子、またはその成分ポリペプチド鎖を提供する。
【０１５６】
単離された核酸分子は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を発現するのに好適である。「発現するのに好適とは、その核酸分子が、翻訳されてポリペプチド、例えばＲＮＡを形成し得るポリヌクレオチドであること、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）がプラスミドなどの発現ベクターに、発現に適切な配向および適正なリーディングフレームで挿入されることを意味する。このポリヌクレオチドは、任意の所望の宿主によって認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列と連結することができ、このような制御を発現ベクターに組み込むことができる。
【０１５７】
よって、該核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１５８】
該核酸分子（またはポリヌクレオチド）は、本発明のポリペプチド産物を産生するのに好適な宿主で発現させることができる。よって、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる教示に照らして適宜改変された、発現ベクターを構築するための既知の技術に従って使用することができ、次にこれを用いて、本発明のポリペプチドの発現および産生に適当な宿主細胞を形質転換する（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるSambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York参照）。
【０１５９】
ポリペプチドをコードする核酸分子は、適当な宿主へ導入するための広範な他のポリヌクレオチド配列と連結させることができる。この付随ポリヌクレオチドは、宿主の性質、宿主へのポリヌクレオチドの導入様式、およびエピソーム維持が望ましいか組み込みが望ましいかによって異なる。
【０１６０】
要するに、適当な宿主内で、その核酸分子によりコードされているポリペプチド結合部分または化合物を発現することができる核酸分子を含んでなる発現ベクターを構築すればよい。
【０１６１】
例えば相補性付着末端を介して核酸分子、特にＤＮＡを作動可能なようにベクターに連結するための種々の方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡ中に挿入されるＤＮＡセグメントに相補的ホモポリマートラクトを付加することができる。次に、このベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって連結し、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１６２】
１以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する別法を提供する。例えばエンドヌクレアーゼ制限消化によって作製されたＤＮＡセグメントをバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌(E. coli)ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する（この酵素はそれらの３’−５’−エキソヌクレオ分解活性を有する、突出した３’一本鎖末端を除去し、それらの重合活性を有する陥凹した３’末端を埋める）。
【０１６３】
従って、これらの活性の組合せで平滑末端ＤＮＡセグメントが生じる。次に、この平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素の存在下、よりモル過剰のリンカー分子とともにインキュベートする。よって、この反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。その後、これらのＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で切断し、そのＤＮＡセグメントのものに適合する末端を作り出す酵素で切断した発現ベクターに連結する。
【０１６４】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USAをはじめとするいくつかの供給者から市販されている。
【０１６５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾するための望ましい方法がＰＣＲの使用である。この方法は、例えば、好適な制限部位における操作によって好適なベクターにＤＮＡを導入するために使用可能であるか、または当技術分野で知られているように、他の有用な方法でＤＮＡを修飾するために使用可能である。
【０１６６】
この方法において、酵素的に増幅させるＤＮＡを、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的プライマーに隣接させる。該特異的プライマーは、当技術分野で公知の方法を用い、発現ベクターにクローニングするために使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
【０１６７】
次に、このＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）を好適な宿主内で発現させて、本発明の化合物またはその結合部分を含んでなるポリペプチドを産生させる。よって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、本明細書に含まれる教示に照らして適宜改変された既知の技術に従って用いて発現ベクターを構築することができ、次に、これを用いて本発明の化合物またはその結合部分の発現および産生に適当な宿主細胞を形質転換させる。このような技術としては、１９８４年４月３日にRutter et alに対して発行された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日にWeissmanに対して発行された米国特許第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日にCrowlに対して発行された米国特許第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日にMark et alに対して発行された米国特許第４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日にGoeddel対して発行された米国特許第４，６７８，７５１号、１９８７年１１月３日にItakura et alに対して発行された米国特許第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日にMurrayに対して発行された米国特許第４，７１０，４６３号、１９８８年７月１２日にToole, Jr. et alに対して発行された米国特許第４，７５７，００６号、１９８８年８月２３日にGoeddel et alに対して発行された米国特許第４，７６６，０７５号および１９８９年３月７日にStalkerに対して発行された米国特許第４，８１０，６４８号に開示されているものが含まれる（これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０１６８】
本発明の方法に用いるためのポリペプチド結合部分をコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は、適当な宿主に導入するための広範な他のＤＮＡ配列と連結させることができる。この付随ＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのポリヌクレオチドの導入様式、およびエピソーム維持が望ましいか組み込みが望ましいかによって異なる。
【０１６９】
一般に、該ＤＮＡは、プラスミドなどの発現ベクターに、発現に適切な配向および適正なリーディングフレームで挿入される。必要に応じて、該ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列と連結することができ、このような制御は発現ベクター内で一般に利用可能である。次に、このベクターを、標準的な技術によって宿主へ導入する。一般に、総てではないが、種祝はこのベクターによって形質転換される。よって、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。ある選択技術には、発現ベクターに、抗生物質耐性など、形質転換細胞において選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列を、必要な制御配列とともに組み込むことを含む。あるいは、このような選択可能な形質の遺伝子は別のベクター上にあってもよく、これを用いて所望の宿主細胞同時形質転換する。
【０１７０】
次に、本発明の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を可能とする十分な時間、本明細書に開示されている教示に照らして当業者に公知の適当な条件下で培養し、その後それを回収することができる。
【０１７１】
多くの発現系が知られており、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、糸状真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が含まれる。
【０１７２】
これらのベクターは一般に、そのベクターが他の非原核細胞種での発現に用いられるとしても、原核生物での増殖のためのＣｏｌＥ１ ｏｒｉなどの原核生物レプリコンを含む。これらのベクターはまた、それで形質転換された大腸菌などの細菌宿主細胞内でそれらの遺伝子の発現（転写および翻訳）を命令し得る原核生物プロモーターなどの適当なプロモーターも含み得る。
【０１７３】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こさせるＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。例示的細菌宿主に適合するプロモーター配列は一般に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便宜な制限部位を含むプラスミドベクターで提供される。
【０１７４】
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA)から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにPharmacia, Piscataway, NJ, USAから入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【０１７５】
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway, NJ, USAから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現を駆動するためにＳＶ４０後期プロモーターを使用し、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞で最大発現レベルが見られる。
【０１７６】
誘導型の哺乳類発現ベクターの例は、これもまたPharmaciaから入手可能なｐＭＳＧである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現を駆動するためにマウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導型プロモーターを用いる。
【０１７７】
有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０１７８】
多様な宿主細胞とともに用いるための他のベクターおよび発現系も当技術分野で周知である。
【０１７９】
宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよい。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、一般に、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USAから入手可能な大腸菌株ＤＨ５およびRockville, MD, USAのthe American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能なＲＲ１（Ｎｏ． ＡＴＣＣ ３１３４３）などの大腸菌株である。例示的真核生物の宿主細胞としては、酵母、昆虫および哺乳類細胞が挙げられ、マウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞系統および腎臓細胞系統などの脊椎動物細胞が好ましい。酵母宿主細胞としては、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから一般に入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１がある。例示的哺乳類宿主細胞としてが、ＡＴＣＣからＣＲＬ １６５８として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。例示的昆虫細胞としては、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクト可能なＳｆ９細胞がある。
【０１８０】
本発明のＤＮＡ構築物による適当な細胞宿主の形質転換は周知の方法によって達成され、その方法は用いるベクターの種類によって異なる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110およびSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY（これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。引用することにより本明細書の一部とされるBeggs (1978) Nature 275, 104-109の方法も有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤は、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手可能である。
【０１８１】
エレクトロポレーションも細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０１８２】
例えば、多くの細菌種が、引用することにより本明細書の一部とされるLuchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載されている方法により形質転換可能である。２５μＦＤにて６２５０Ｖ／ｃｍを用いる２．５ＰＥＢに懸濁させたＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーション後に、一貫して最大数の形質転換体が回収される。
【０１８３】
エレクトロポレーションにより酵母を形質転換するための方法は、引用することにより本明細書の一部とされるBecker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182に開示されている。
【０１８４】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入から得られた細胞を増殖させて、本発明のポリペプチドを産生することができる。細胞を採取し、溶解させ、それらのＤＮＡ内容物を、引用することにより本明細書の一部とされるSouthern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208によって記載されているものなどの方法を用い、ＤＮＡの存在に関して調べることができる。あるいは、上清におけるタンパク質の存在を下記のような抗体を用いて検出することもできる。
【０１８５】
組換えＤＮＡの存在に関して直接アッセイする他、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現を命令することができる場合には、周知の免疫学的方法によって形質転換の成功を確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。
【０１８６】
形質転換されたと思われる細胞のサンプルを採取し、好適な抗体を用い、タンパク質に関してアッセイする。
【０１８７】
宿主細胞は非ヒト動物体内の宿主細胞であってもよい。よって、導入遺伝子の存在のために本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。一実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、マウスなどの齧歯類である。トランスジェニック非ヒト動物は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。
【０１８８】
宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は当技術分野で周知である。産生される本発明の化合物（またはその結合部分）は宿主細胞によって異なると考えられる。例えば、酵母または細菌細胞などのある種の宿主細胞は、違ったように翻訳後修飾され得る本発明の化合物（またはその結合部分）の形態の産生をもたらし得る異なった翻訳後修飾系を持っていても持っていなくてもよい。
【０１８９】
一実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。あるいは、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばヒト細胞または類人猿細胞などの霊長類目由来の細胞、またはラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、リス細胞、モルモット細胞、マーモット細胞もしくはビーバー細胞などの齧歯目由来の細胞であり得る。
【０１９０】
さらなる実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞またはＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞である。
【０１９１】
よって、本発明の第１１の態様は、本発明の第十の態様の核酸分子を含んでなるベクターを提供する。
【０１９２】
同様に、本発明の第１２の態様は、本発明の第十の態様の核酸分子または本発明の第１１の態様のベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
【０１９３】
本発明の第１３の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を作製する方法を提供し、該方法は、コードされている抗体もしくはその抗原結合フラグメントの発現を可能とする条件下で本発明の第１２の態様の宿主細胞を培養することを含む。このような方法はまた、本発明の方法で用いるための抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を産生するために使用することもできる。
【０１９４】
このようなポリペプチドは、ウサギ網状赤血球ライゼートまたは麦芽ライゼート（Promegaから入手可能）などの市販のin vitro翻訳系を用いてin vitroで産生することができる。例えば、この翻訳系はウサギ網状赤血球ライゼートであり得る。便宜には、ＴＮＴ転写−翻訳系(Promega)のように、この翻訳系を転写系と組み合わせることができる。この系により、コードＤＮＡポリヌクレオチドから好適なｍＲＮＡ転写物を翻訳と同じ反応で生産することができる。
【０１９５】
当業者であれば、上記の医薬および薬剤が医学および獣医学双方の分野で有用性を有することがさらに分かるであろう。よって、これらの医薬および薬剤はヒトおよび非ヒト動物（ウマ、イヌ、マウス、ラット、霊長類、サル、ブタおよびネコなど）の双方の処置に使用可能である。しかしながら、好ましくは、患者はヒトである。
【０１９６】
本発明の第１４の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体と薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１９７】
本明細書において「医薬組成物」とは、治療上有効な処方物を意味する。
【０１９８】
本明細書において「治療上有効な量」または「有効量」または「治療上有効」とは、与えられた条件および投与計画に対して治療作用をもたらす量（例えば、コラーゲンの分解を阻害するのに十分な量）を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち、担体または投与ビヒクルをともに所望の治療作用をもたらすように計算された有効物質の所定の量である。さらに、それは宿主の活動、機能および応答において臨床上有意な欠損を軽減または回避するのに十分な量を意味するものとする。あるいは、治療上有効な量は、宿主において臨床上有意な症状における改善をもたらすに十分なものである。当業者であれば分かるように、化合物の量はその具体的活性によって異なり得る。好適な用量は、必要とされる希釈剤とともに所望の治療作用をもたらすように計算された有効組成物の所定量を含み得る。本発明の組成物の製造のための方法および使用では、治療上有効な量の有効成分が提供される。治療上有効な量は、当技術分野で周知のように、齢、体重、性、症状、合併症、他の疾病などの患者の特徴に基づき、熟練の医師または獣医師によって決定することができる。
【０１９９】
当業者であれば、このような有効量の該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、その処方物は、単回のボーラス投与（すなわち、急性投与）として送達することもでききるし、あるいはより好ましくは、経時的な一連の投与（すなわち、慢性投与）としても送達することもできることが分かるであろう。
【０２００】
当業者であれば、本発明の方法で用いるための抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、炎症性症状の処置のための１以上の他の慣例薬と組み合わせて投与できることがさらに分かるであろう。
【０２０１】
例えば、関節リウマチの場合、好適な慣例薬としては、限定されるものではないが、疾病改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ、例えば、メトトレキサート）、金塩、抗マラリア薬、スルファサラジン、テトラサイクリン、シクロスポリン、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、レフルノミド(Arava; Aventis)、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）阻害剤、例えば、エタネルセプト(エンブレル;Amgen)、インフリキシマブ(Remicade; J&J/Centocor)およびアダリムマブ(Humira; Abbott)が挙げられる。
【０２０２】
ＯＡの場合、好適な慣例薬としては、限定されるものではないが、アセトアミノフェン（パラセタモールとしても知られる）などの鎮痛薬または抗炎症薬、またはＣＯＸ２阻害剤などのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を阻害する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＭＭＰ阻害剤などの疾病改善骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、またはインターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤が挙げられる。
【０２０３】
本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、用いる化合物の有効性／毒性に応じて種々の濃度で処方することができる。一実施形態では、この処方物は本発明の薬剤を０．１μＭ〜１ｍＭの間、例えば１μＭ〜１００μＭの間、５μＭ〜５０μＭの間、１０μＭ〜５０μＭの間、２０μＭ〜４０μＭの間、または約３０μＭ濃度で含んでなる。in vitro適用では、処方物はより低濃度の、例えば０．００２５μＭ〜１μＭの間の本発明の化合物を含み得る。
【０２０４】
よって、炎症性症状の処置に有効な量（上記の通り）の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を含んでなる医薬処方物が提供される。
【０２０５】
当業者であれば、これらの医薬および薬剤は一般に、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択された好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与されることが分かるであろう（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA参照）。
【０２０６】
例えば、これらの医薬および薬剤は、即放出、遅延放出または徐放性適用のための、香味剤または着色剤を含み得る錠剤、カプセル剤、小卵剤(ovule)、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で経口投与、頬側投与または舌下投与することができる。これらの医薬および薬剤はまた陰茎海綿体注射によって投与することもできる。
【０２０７】
このような錠剤は、微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（例えば、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合体シリケートなどの崩壊剤、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアラビアガムなどの造粒結合剤を含み得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの滑沢剤も含み得る。
【０２０８】
ゼラチンカプセル剤中の増量剤と類似の種の固体組成物も使用可能である。これに関する例示的賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤では、本発明の化合物は種々の甘味剤または香味剤、着色物質または色素と、また乳化剤および／または沈殿防止剤と、また水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにその組合せと組み合わせることができる。
【０２０９】
これらの医薬および薬剤はまた、非経口投与、例えば、静脈内投与、関節内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、脳室内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与または皮下投与することもできるし、あるいは注入技術により投与することもできる。それらは、例えば血液と等張な溶液を作製するために十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでもよい無菌水溶液の形態で最良に用いられる。これらの水溶液は必要であれば適宜緩衝させなければならない（例えば、ｐＨ３〜９）。無菌条件下での好適な非経口処方物の作製は、当業者に周知の標準的な製薬技術により容易に達成される。
【０２１０】
非経口投与に好適な処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と等張の処方物とする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。これらの処方物は、例えば密閉アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多回用量容器で提供することができ、注射直前に例えば注射水などの無菌液体担体を加えるだけのフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することもできる。即時調合注射溶液および懸濁液は、これまでに記載されている種の無菌粉末、顆粒および錠剤から作製し得る。
【０２１１】
ヒト患者への経口および非経口投与では、これらの医薬および薬剤の一日用量レベルは通常、成人１人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回用量または分割用量で投与される。
【０２１２】
疾病の予防または治療のための、抗体の適当用量は処置される疾病の種類、その疾病の重篤度および経過、抗体またはそのフラグメントが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、従前の療法の経過、および患者の臨床歴および抗体またはそのフラグメントに対する応答によって異なる。本発明の抗体、抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体は、１回で、または一連の処置にわたって患者に適宜投与される。疾病の種類および重篤度によって、抗体またはそのフラグメント約０．０１５〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇが患者への投与のための初期用量である。投与は例えば１回以上の独立した投与によってもよいし、あるいは持続的注入によってもよい。症状によって数日またはそれ以上にわたる反復投与では、病徴の望ましい抑制または緩和が起こるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与計画が有用である場合もあり、それらを排除するものではない。
【０２１３】
症状の緩和、疾病の予防または治療における抗体、抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体の有効性は、本発明の抗体のものとは異なるエピトープに対する別の抗体またはそのフラグメント、または意図する治療適応に関して知られている１以上の慣例治療薬など、同じ臨床適応に有効な別の薬剤との連続投与または組合せ投与により改善し得る。
【０２１４】
このような適応に影響を及ぼす好適な薬学上許容される薬剤は、例えば骨関節炎、関節リウマチなどの関節疾患のような炎症性疾患の処置のための、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症薬；例えば抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの抗シトルチン薬；疼痛管理処置のための整形外科術後の術後使用のための局部麻酔薬またはアテローム斑の処置のための抗高脂血症薬、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）といった抗炎症薬であり得る。
【０２１５】
これらの医薬および薬剤はまた鼻内投与または吸入による投与が可能であり、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の好適なガスなどの好適な噴射剤を用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、ドライパウダー吸入器またはエアゾールスプレー剤形の形態で便宜に送達される。加圧エアゾールの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、エタノールと噴射剤の混合物を溶媒として用い（さらに、例えばトリオレイン酸ソルビタンなどの滑沢剤を含んでもよい）、有効化合物の溶液または懸濁液を含み得る。吸入器または通気器に用いるためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含むように処方することができる。
【０２１６】
エアゾールまたはドライパウダー処方物は、各計量量または「ひと吹き」が患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように調整することができる。エアゾールによる一日総量は患者ごとに異なり、１回またはそれを超える回数、通常には、１日にさたる分割量で投与することができると考えられる。
【０２１７】
あるいは、これらの医薬および薬剤は、坐剤または膣坐剤の形態で投与することもできるし、あるいはローション、溶液、クリーム、軟膏またはダスティングパウダーの形態で局所適用することもできる。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用により経皮投与することもできる。それらはまた、眼内経路によって投与することもできる。
【０２１８】
皮膚への局所適用では、これらの医薬および薬剤は、例えば以下：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水の１以上の混合物に懸濁または溶解させた有効化合物を含有する好適な軟膏として処方することができる。あるいは、それらは、例えば以下：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１以上の混合物に懸濁または溶解させた好適なローションまたはクリームとして処方することもできる。
【０２１９】
口内局所投与に好適な処方物としては、香味基剤、通常はスクロースおよびアラビアガムまたはトラガカントガム中に有効成分を含んでなるトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に有効成分を含んでなる香錠；ならびに好適な液体担体中に有効成分を含んでなるマウスウォッシュがある。
【０２２０】
これらの医薬または薬剤がポリペプチドである場合には、マイクロスフェアなどの徐放性薬物送達系を用いるのが好ましい場合がある。これらは特に注射頻度を減らすために設計される。このような系の一例として、生分解性マイクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を封入するNutropin Depotがあり、一度注射すると、長時間かけてゆっくりｒｈＧＨを放出する。
【０２２１】
徐放性免疫グロブリン組成物はまた、リポソームに捕捉された免疫グロブリンも含む。免疫グロブリンを含有するリポソームは、それ自体公知の方法によって作製される。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-92 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号；同第４，５４４，５４５号；同第６，１３９，８６９号および同第６，０２７，７２６号参照。通常には、これらのリポソームは、液体含量が約３０モル％（ｍｏｌ％）コレステロールよりも高い小型（約２００〜約８００オングストローム）の単層種であり、選択された割合は最適な免疫グロブリン療法向けに調整される。
【０２２２】
あるいは、ポリペプチド医薬および薬剤は、必要な部位に直接薬剤を放出する外科的に埋め込んだデバイスにより投与することもできる。
【０２２３】
また、タンパク質およびポリペプチドの投与のためにエレクトロポレーション療法（ＥＰＴ）系も使用可能である。細胞にパルス電場を送達するデバイスは薬剤に対する細胞膜の浸透性を高め、細胞内薬物送達の著しい増強をもたらす。
【０２２４】
また、タンパク質およびポリペプチドは、エレクトロインコーポレーション（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚の表面で直径３０ミクロンまでの小粒子がエレクトロポレーションで用いられるものと同一または類似の電気パルスを受ける場合に生じる。ＥＩでは、これらの粒子は角質層を経て皮膚のより深部に送られる。これらの粒子には薬剤または遺伝子を付加またはコーティングすることができ、あるいは単に皮膚に化合物が侵入可能な孔を開ける「弾丸」としても働き得る。
【０２２５】
タンパク質およびポリペプチド送達の別法は、温度感受性ＲｅＧｅｌ注入である。体温より低いとＲｅＧｅｌは注入可能な液体であるが、体温ではすぐにゲルリザーバーを形成し、これはゆっくり浸食し、既知の安全な生分解性ポリマーへと溶解する。このバイオポリマーが溶解するにつれ、有効薬剤が経時的に送達される。
【０２２６】
タンパク質およびポリペプチド医薬はまた経口送達することもできる。このような１つの系では、タンパク質およびポリペプチドを同時送達するために、身体のビタミンＢ１２の経口取り込みの天然プロセスを用いる。ビタミンＢ１２取り込み系を付加することで、これらのタンパク質またはポリペプチドは腸管壁を経て移動可能である。ビタミンＢ１２類似体と薬剤の間で複合体が形成され、この複合体のビタミンＢ１２部分における内性因子（ＩＦ）に対する有意な特異性と複合体の薬剤部分の有意な生活性が保持される。
【０２２７】
本発明の第九の態様の抗体および抗体由来結合剤は、上記のような医薬組成物を含んでなるキットの形態で提供され得る。よって、炎症性症状の処置に用いるためのキットが提供され得る。
【０２２８】
あるいは、キットは、診断において用いるのに好適な、本発明の検出可能な抗体または抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含み得る。このような診断キットは、個包装試薬としての診断薬を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含み得る。包装試薬の使用説明書も一般に含まれる。このような説明書は一般に、試薬濃度および／または混合する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の持続時間、温度、バッファー条件などの少なくとも１つのアッセイ法パラメーターを記載した有形表示物を含む。
【０２２９】
本発明のさらなる態様は、炎症性症状を処置するための候補化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、
ａ）供試化合物を準備する工程；
ｂ）該化合物の、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、以下のＣＤＲ配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくは誘導体の融合体と競合する能力を試験する工程
を含み、
【０２３０】
該試験化合物がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して競合することができれば、それは炎症性症状を処置するための候補化合物として同定される。
【０２３１】
競合結合はＥＬＩＳＡなど、当技術分野で周知の方法を用いてアッセイすることができる（上記参照）。
【０２３２】
一実施形態において、本方法は、コラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）する化合物の能力を試験する工程をさらに含む。
【０２３３】
「調整する」とは、コラーゲンの分解速度を高める、または低下させることを含む。コラーゲンの分解の阻害は完全であっても部分的であってもよいと考えられる。例えば、コラーゲン分解は、試験化合物の不在下でのコラーゲンの分解と比べて、１０％またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害され得る。
【０２３４】
便宜には、試験工程のいくつかまたは総てがin vivoで行われる。
【０２３５】
あるいは、試験工程のいくつかまたは総てが、例えば、免疫組織化学法（例えば、サフラニンでの染色）を用いてin vitroで行ってもよい（下記の実施例参照）。
【０２３６】
例示的試験化合物としては、ポリペプチド、またはその融合体もしくは誘導体、または該誘導体の融合体が含まれる。例えば、試験化合物は抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、またが該変異体もしくはその誘導体の融合体であり得る。
【０２３７】
一実施形態において、試験化合物は完全な抗体である。
【０２３８】
あるいは、試験化合物は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントであり得る。
【０２３９】
本発明のさらなる態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体により定義されるエピトープを提供し、ここで、該抗体またはフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる。
【０２４０】
一実施形態において、該エピトープは以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEEKRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEΓNFHLLGNLWLRSLICALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体を含んでなるか、またはそれからなる。
【０２４１】
その例示的変異体、融合体およびフラグメントは上記に開示されている。
【０２４２】
よって、さらなる態様として、本発明はまた、以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDWSINCNIRLV
PNQEΓNFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体を含んでなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。
【０２４３】
該ポリペプチドは免疫応答を刺激し得るので、免疫原性エピトープとして働く。
【０２４４】
一実施形態において、該ポリペプチド、フラグメント、その融合体または変異体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体と結合することができ、
【０２４５】
ここで、該抗体またはフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号Ｉ］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる。
【０２４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または産生するための、上記のエピトープおよび単離されたポリペプチドの使用を提供する。
【０２４７】
本発明はまた、上記のエピトープおよび単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子ならびにベクター、宿主細胞およびそれを作製する方法を包含する。
【０２４８】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り、複数形を含む。よって、例えば、「ある抗体」という場合には、複数のこのような抗体を含み、「その用量」という場合には、１以上の用量および当業者に公知のその等価物を含むなどである。
【０２４９】
以下、本発明のある特定の態様を用いる限定されない例を、次の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】抗α１１インテグリン結合剤に関するｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体ライブラリーのスクリーニング。スクリーニングされた１９２のα１１インテグリン活性ｓｃＦｖクローンをα１１インテグリンでトランスフェクトされた２９３細胞と結合するかどうかを確認したが、大腸菌により発現されるＨｉｓタグｓｃＦｖクローンを、インテグリントランスフェクト細胞（図面に示されている通り）、マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ、Ｃｙ５コンジュゲート抗マウスｍＡｂ試薬と同時インキュベーションした後、ＦＭＡＴマクロコンフォーカルによるスクリーニング装置でスクリーニングすることによっては、α１０インテグリントランスフェクト２９３細胞との結合は見られなかった。スクリーニングされたｓｃＦｖを、α１１インテグリン特異的結合剤に関してｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体ライブラリーをパンニングした後に賦活させる。このアプローチを用い、１７２のｓｃＦｖクローンを選択的α１１インテグリン結合剤として確認した。
【図２】抗インテグリンｓｃＦｖの標的インテグリン特異性。ヒトα１０インテグリン（左のグラフ）またはヒトα１１インテグリン（右のグラフ）でトランスフェクトされたＨｅｋ２９３細胞を抗α１０インテグリンｓｃＦｖ（対照、標識付きのグレーのピーク）、抗α１１インテグリンｓｃＦｖ（標識付きのグレーのピーク）または無関係の対照ｓｃＦｖ（黒塗りのピーク）とともにインキュベートした。ｓｃＦｖと細胞の結合を、二次フィコエリトリンコンジュゲート抗Ｈｉｓ ｍＡｂで検出した後、フローサイトメトリーにより分析した。
【図３】抗α１１インテグリンｓｃＦｖの、α１１β１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞の、コラーゲンＩＩコーティングプレートへの接着を選択的に阻害する能力。α１０インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２マウス繊維芽細胞（Ａ）またはα１１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２マウス繊維芽細胞（Ｂ）を、１０μｇ／ｍｌの抗α１１インテグリンｓｃＦｖ、ＦＩＴＣ−８対照ｓｃＦＶ、抗α１０インテグリンモノクローナル抗体またはＩｇＧ２ａイソ型対照抗体とともにプレインキュベートした。次に、細胞を、コラーゲンＩＩをコーティングしたマイクロタイタープレートに加え、接着させた。結合しなかった細胞を洗い流し、結合細胞の数を酵素アッセイにより決定した。グラフは３回の独立した実験からのデータを合わせたものを表し、各実験からのデータは抗体を含まない対照に対してノーマライズした。（上）α１０トランスフェクト細胞の細胞接着に対するＳｃＦｖの効果。（下）α１１トランスフェクト細胞の細胞接着に対するＳｃＦｖの効果。平均値と標準誤差(s.e.m.)。有意性は一元配置Ａｎｏｖａおよびダネットの多重比較検定を用いて算出した。白いバー：α１１−ｓｃＦｖ。縞のバー；対照。
【図４】ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗α１１インテグリンｓｃＦｖと末梢血白血球部分集団との結合の欠如。精製ヒトＰＢＬを、異なる蛍光団とコンジュゲートさせた細胞部分集団特異的モノクローナル抗体の存在下で、抗α１１インテグリンｓｃＦｖ α１１＿Ａ＿００１−Ａ０３−ＭＨ（グレーの線）、陽性対照ｓｃＦｖ Ｃ１１（黒い点線）または陰性対照ｓｃＦｖ ＦＩＴＣ−８（黒塗りのピーク）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、１／２０ ＰＥコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(R&D Systems)とともにインキュベートした。抗α１１β１インテグリン特異的ｓｃＦｖの陽性結合を、陰性対照ＣＴ１７ ｓｃＦｖで染色した細胞の９７〜９９％で見られるものよりも大きなＦＬ２蛍光強度として記録した。マウス抗Ｈｉｓ抗体とのインキュベーションの前に、細胞を予めブロッキングし、２００μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ／２×１０６全白血球の存在下で維持し、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞（左のグラフのそれぞれゲート５、４および３）として同定した。単球（Ｒ２）および顆粒球（Ｒ１）は、独特な前方分散および側方分散特性によって定義され、さらにはＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＤ５６−として定義された。
【図５】ｍＢＳＡの関節内注射後３日目の誘発および非誘発膝におけるＴｃ−９９ｍ取り込みにより測定される関節腫脹の比。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ（コレラ毒素に対する）、「Ａ０３」＝例示的抗α１１全ＩｇＧ抗体。
【図６】膝関節全体の切片における滑膜空間の浸潤細胞としての炎症の組織学的スコア。０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図７】膝関節全体の切片における関節空間への細胞の滲出、浸潤の組織学的スコア。０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図８】画像解析によって測定された膝蓋軟骨における関節炎誘発後１５日目のプロテオグリカン（ＰＧ）の枯渇。凡例「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図９】ＰＧ枯渇−Ａ０３は最初の実験において関節炎誘発後１５日目のＰＧ枯渇を軽減する。図１１Ａは膝蓋からの組織学的スコアリングを示し（図１０に０おける画像解析によりスコアリングとして示される）、図１１Ｂは外側脛骨の組織学的スコアリングを示し、図１１Ｃは膝の全体像を示す。
【図１０】ＰＧ枯渇−Ａ０３は第２の実験における関節炎誘発後１５日目のＰＧ枯渇を軽減する。図１２Ａは膝蓋骨からの組織学的スコアリングを示し、図１２Ｂは外側脛骨の組織学的スコアリングを示す（外側脛骨に関してｐ＝０．０２）。
【図１１】Ａ０３は関節炎誘発後１５日目に測定される骨棘の大きさを減少させる。
【図１２】Ｇ６ＰＩにより誘発された関節炎における関節炎の罹患率（頻度）。処置はＧ６ＰＩ感作後７、１０、１３および１６日目に行った。
【図１３】Ｇ６ＰＩにより誘発された関節炎における関節炎に平均臨床スコア。処置はＧ６ＰＩ感作後７、１０、１３および１６日目に行った。
【図１４】Ｇ６ＰＩ感作後１３日目の体重変化（％）。対照抗体で処置したマウスは平均１０％体重が低下した。Ａ０３処置マウスは平均５％体重が低下し、対照群と比べて体重低下は明らかに減少した（ｐ＝０．０８）。
【実施例】
【０２５１】
実施例１−本発明の例示的抗体（「Ａ０３と呼ぶ」）の生産
α１１β１インテグリンに特異的なｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）由来ヒト抗体の同定
全ヒト抗体ライブラリーｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）（引用することにより本明細書の一部とされるSoderlind et al, 2000, Nat Biotechnol 18:852-6およびＷＯ９８／３２８４５参照）を、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンに対して特異性を有する抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）に関してスクリーニングした。標的インテグリン特異性の高い抗体の賦活を最大にするため、一連の陽性およびサブトラクティブパンニング法を合わせたものを考案した（下記付録参照）。ｓｃＦｖ形式へ変換した後、抗体フラグメントを大腸菌で発現させ、適当であれば、ＦＭＡＴ技術（図１、ＦＭＡＴ分散プロット）を用い、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンを発現するＨｅｋ−２９３細胞との結合に関して陽性および陰性スクリーニングを行った。このようにして、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンに特異的な遺伝子型が独特な数百の抗体フラグメントが同定された（表１）。
【０２５２】
抗体パンニング手順
ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＮＰ４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０１ｍＭ ＣａＣｌ２のバッファー中、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリーのファージ原株を、Dynalsの説明書に従い、ウサギ−抗α１０インテグリンおよびウサギ−抗α１１インテグリンポリクローナル抗体を結合させた免疫チューブおよびトシル活性化ダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌカタログ番号１４２．０４）でのＢＳＡコーティングを用い、４℃で一晩予備選択した。最初のパンニングは４℃で一晩、ウサギ−抗α１１ポリクローナル抗体を結合させた（上記の通り）磁気ビーズに付加した、α１１β１を発現する１５×１０６のＨＥＫ２９３細胞のライゼートに対して行った。ビーズを９×１ｍｌのバッファーで洗浄し、結合しているファージをトリプシンで溶出させ、他所に記載されているように増幅させた(Hallborn & Carlsson, 2002, Biotechniques Dec;Suppl:30-37)。
【０２５３】
１回目のパンニングから増幅したファージを上記のように緩衝させ、１回目のパンニングの場合と同様にポリクローナル結合ダイナビーズに対して予備選択を行った後、ウサギ−抗α１１ポリクローナル抗体を有するダイナビーズに付加された１０×１０６ ＨＥＫ２９３ α１１β１細胞のライゼートを用いて１回目のパンニングと同様に選択を行った。洗浄後（９×１ｍｌバッファー）、結合しているファージをトリプシンで溶出させ、増幅させた。
【０２５４】
２回目のパンニングから増幅させたファージを、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を含有するＤＭＥＭ細胞培地で希釈し、α１０β１を発現する４５×１０６ Ｃ２Ｃ１２細胞およびα１０β１を発現する１３×１０５ ＨＥＫ細胞に対して４℃で一晩、予備選択を行った。次に、ファージを４℃で４時間α１１β１とともにインキュベートし、組換えＣ２Ｃ１２細胞（５×１０６細胞を使用）上に展示させた。結合していないファージを除去するために４０％フィコール（２％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を含有）による密度勾配遠心分離を行った後、残った結合剤を７６ｍＭクエン酸ｐＨ２．５および２００ｍＭトリエタノールアミンの双方で溶出させた。溶出したファージのプールをｓｃＦｖ形式へ変換させるため、大腸菌ＨＢ１０１Ｆで増幅させた。
【０２５５】
ｓｃＦｖ形式への変換
ｃ−ｍｙｃ／６ｘｈｉｓ ｓｃＦｖ形式への変換（ＥａｇＩ変換）
タンパク質ＩＩＩは、ｓｃＦｖとファージ粒子の間の機能的連結であり、遺伝子ＩＩＩを除去すると、可溶性ｓｃＦｖが産生される。ｎ−ＣｏＤｅＲ Ｌｉｂ２０００選択からのファージミドＤＮＡをＥａｇＩｄｅ消化して遺伝子ＩＩＩを除去し、６×ｈｉｓタグをｓｃＦｖフラグメントおよびｃ−ｍｙｃタグに隣接させた。このプラスミドを連結し、遺伝子ＩＩＩ内に制限部位を有するＥｃｏＲＩで「キラーカット(killer-cut)」を行い、再連結したファージミドを排除した。このプラスミドＤＮＡを化学コンピテント大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換させた。
【０２５６】
ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ライブラリーから単離されたユニークな遺伝子型を有するα１１インテグリン特異的抗体フラグメントの数
【表１】
【０２５７】
標的化されたインテグリンα鎖に対する抗原の特異性
これまでにインテグリンヘテロ二量体と結合する４つの異なるコラーゲン、すなわち、α１β１、α２β１、α１０β１およびα１１β１が同定されている。異なる種類のコラーゲンに対する結合に関するそれらの個体間選択性は完全には特徴付けられてない。コラーゲン結合インテグリンの中でも、α１０β１ α１１βｌインテグリンおよびα１１β１インテグリンは高い相同性を示す（リガンド結合Ｉ−ドメインのアミノ酸レベルで６０％の同一性）（Gullberg et al, 2003, Structure and function of alphalpha11beta1 integrin. In: D. Gullberg (Ed) I Domains in Integrins.参照）。結論として、これらのインテグリンヘテロ二量体のいずれかに対するいくつかの抗体は他のものと交差反応性がある可能性がある。
【０２５８】
細胞外マトリックスのターンオーバーに対する単離された抗α１１β１インテグリン抗体の、見られた推定効果が、α１１β１インテグリンヘテロ二量体との排他的相互作用によるものであるとすることができるように、この複合体に対する抗体の詳細な特異性を調べた。このように、抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖを、フローサイトメトリーを用い、α１０β１インテグリンでトランスフェクトされた、またはα１１β１インテグリンでトランスフェクトされたＨｅｋ−２９３細胞との結合に関して調べた。このアプローチにより、２９の抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖ（検討した３８のうち）がα１１β１インテグリントランスフェクト細胞と強く結合したが、α１０β１インテグリントランスフェクト細胞とは結合しないことが確認された（図２）。
【０２５９】
抗インテグリン抗体の詳細な特異性を、抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖの、α１１β１インテグリンでトランスフェクトされた（α１０β１インテグリンでトランスフェクトされたものではない）Ｃ２Ｃ１２細胞のコラーゲンＩＩコーティングプレートへの接着を選択的に阻害する能力によりさらに示す（図３）。インテグリンの構造とインテグリンの活性化および結合の際に起こる構造変化を考えれば、細胞接着（すなわち、インテグリンの結合）を妨げる薬剤が潜在的に興味深い。リガンド結合部位（すなわち、ＭＩＤＡＳ）において、またはその付近で結合する抗体またはｓｃＦｖはリガンドの相互作用を物理的に妨げることができる。ＭＩＤＡＳ付近で結合しないが（例えば、非Ｉ−ドメイン結合剤）、細胞接着に対してなお作用を有する抗体またはｓｃＦｖは、インテグリンα鎖構造、インテグリンの活性化またはα／β鎖の相互作用を妨げる可能性がある。
【０２６０】
最後に、in vitroおよびin vivo試験系において機能を検討する前に、抗α１１β１インテグリン抗体クローンは、顆粒球、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー細胞を含む定義された末梢血白血球部分集団と交差反応しないことが示された（図４）。
【０２６１】
例示的抗α１１抗体に関する配列情報
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の重鎖−アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
［配列番号１１］
【０２６２】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の軽鎖−アミノ酸配列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPG
AVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS
YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
［配列番号１２］
【０２６３】
ＳｃＦｖ形式の抗α抗体（Ａ０３）−アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQP
PSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGYNER
PSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGHWFGG
GTKLTVLG
［配列番号１３］
【０２６４】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の重鎖−ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGTT
ACTACATGCACTGGGTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
GGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGACGCACTATGCAGAC
TCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC
GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTG
TATTACTGTGCGAGAGTAAGTGGAGATGGCTACAATTTTGGCGCCTG
GGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGCTTCCACCAAGGGC
CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG
CACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG
TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC
CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG
TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGC
AACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTG
AGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTC
CTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC
TCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACG
TGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTC
AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC
CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC
CCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGAT
GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC
CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA
CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT
TCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGG
GAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
［配列番号１６］
【０２６５】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の軽鎖−ヌクレオチド配列
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCA
GAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCA
GGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAA
ACTCCTCATCTATGGTTATAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACC
GATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGT
GGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGG
ATGACAGCCTGAGTGGTCATGTGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCC
CGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGT
CTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGG
CAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTC
CAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTG
ACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCA
CGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATG
TTCA
［配列番号１７］
【０２６６】
ＳｃＦｖ形式の抗α１１抗体（Ａ０３）−ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGTT
ACTACATGCACTGGGTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
GGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGACGCACTATGCAGAC
TCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC
GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTG
TATTACTGTGCAAGAGTAAGTGGAGATGGCTACAATTTTGGCGCCTG
GGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCA
GGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTC
AGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCC
TGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACT
GGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGT
TATAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAA
GTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGG
ATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGT
CATGTGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
［配列番号１８］
【０２６７】
最初のスクリーニング実験は、ｓｃＦｖ形式の例示的抗体「Ａ０３」を用いて行った。
【０２６８】
in vivo試験は、完全ＩｇＧ形式の例示的抗体「Ａ０３」を用いて行った。
付録Ｉ．−抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖを単離するために用いた選択戦略
【０２６９】
選択戦略Ｅ〜Ｇ（下のグラフ）を、α１１β１インテグリン特異的抗体を賦活する目的で行う選択により例示する。
【０２７０】
【表２】
【０２７１】
実施例ＩＩ−抗原誘発性関節炎に対する本発明の例示的抗体の効果
この研究の目的は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいてｍＢＳＡ抗原による誘発された関節炎（ＡＩＡ）における、本発明の例示的完全ＩｇＧ抗体（「Ａ０３」と呼ぶ）の効果を調べることであった。
【０２７２】
材料および方法
試験施設
Experimental Rheumatology & Advanced Therapeutics, University Medical Center Nijmegen, Geert Grooteplain 26-28, 6525 GA Nijmegen, The Netherlands
【０２７３】
実験計画
実験プロトコールを下記の表２および３に示す。
【０２７４】
表２
【表３】
【０２７５】
表３
【表４】
動物
【０２７６】
１０週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６マウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) （２３〜２５ｇ）を研究に用いた。マウスは到着後少なくとも１週間馴化させた。食物および酸性水は自由に摂らせた。マウスは毎週秤量した。
抗原誘発性関節炎の誘発
【０２７７】
抗原誘発性関節炎は、記載のもの（１）と同様のプロトコールを用いて誘発した。要するに、−２１日目に、フロイントノ完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化させた１００μｇのメチル化ＢＳＡ(mBSA, Sigma)（１００μｌ ｍｇ／ｍｌ）をマウスに感作させた。注射は側腹部と後脚の足蹠の双方に分割した。熱失活させた百日咳菌(Bordetella pertussis)(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)１ｍｌを付加的アジュバントとして腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。最初の感作から７日後に動物の頚部にＣＦＡ中、１００μｇ（１００μｌ ｍｇ／ｍｌ）のｍＢＳＡおよび１ｍｌの百日咳菌（ｉ．ｐ．）を追加投与した。追加注射から２週間後に、マウスの右膝関節に６０μｇ ｍＢＳＡ（ｍＢＳＡ）を関節内注射することで関節炎を誘発させた。
抗体
【０２７８】
抗体はBiolnvent International AB (Lund, Sweden)のよって生産されたものである。
試験抗体の投与
【０２７９】
抗体は、Cartela AB (Lund, Sweden)から試験施設に到着した後、４℃で保存した。適正な濃度を得るために抗体を無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させ、無菌条件下、４℃で保存した。１日目に抗体薬剤の投与を開始し、１３日目に終了した。抗体投与は１、５、９および１３日目に行った。抗体は２００μｌ／マウスをｉ．ｐ．投与した。抗体の投与は常に１日の同じ時間−／＋１時間に行った。以下のスキームで各マウスに合計９００μｇの抗体を投与した。
【０２８０】
表４
【表５】
同位元素取り込みの指標としての炎症スコアリング
【０２８１】
関節の腫脹は３日目と１０日目に膝関節における９９Ｔｃペルテケート(pertechate)取り込みを用いて測定した。要するに、マウスに１２μＣｉの９９Ｔｃをｉ．ｐ．注射した後、クロルアルドヒドレートで鎮静させた。３０分後、膝を固定位に保ちつつ、視準されたＮａ−Ｉ−シンチレーションクリスタルを用いて、γ線照射を評価した。関節炎は右膝（注射）と左膝（注射無し）における９９Ｔｃ取り込みの比率としてスコアリングした。比率が１．１より大きい場合に、右膝関節の炎症を示すものとした。この方法はこれまでに、組織学的所見とよく相関することが示されている（２）。
組織学
【０２８２】
右および左双方の膝関節全体を、従前に記載されたように（１）、組織学向けに切開および処理した。要するに、膝をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３日間固定し、５％緩衝ギ酸中で脱石灰した後、パラフィンワックス中に包埋した。ミクロトームで半連続の冠状７μｍ切片を作製した。これらの切片をヘマトキシリンでおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で、またはサフラニン−Ｏ(Safranin O: Merck #1.15948)およびFastgreen(Fast Green FCF: Merck # 1.04022)で染色した。組織学的パラメーター（関節炎症、プロテオグリカン枯渇、骨棘形成）を光学顕微鏡によりスコアリングした。また、膝蓋におけるプロテオグリカン枯渇はデジタル画像解析を用いてスコアリングした。
炎症のスコアリング
【０２８３】
膝全体の前面切片をＨ＆Ｅで染色した。炎症の組織学的スコアリングは光学顕微鏡によった。炎症の程度を滑膜空間中の浸潤細胞の量として、また、関節空間中の細胞の滲出量としてスコアリングした。滲出および浸潤は双方とも、０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症を用いてスコアリングした（１）。
【０２８４】
軟骨損傷のスコアリング
プロテオグリカンの欠如の指標として、膝関節全体の切片をサフラニン−ＯおよびＦａｓｔｇｒｅｅｎで染色した。種々の軟骨層（膝蓋骨、膝蓋大腿骨、外側脛骨、外側大腿、内側脛骨、内側大腿）の６部位からの赤色染色の欠如を、０〜３の任意の尺度：０−プロテオグリカン枯渇無し、１−軽度のプロテオグリカン枯渇、２−中度のプロテオグリカン枯渇、３−重度のプロテオグリカン枯渇を用いて評価した（１）。また、膝蓋におけるプロテオグリカン枯渇はデジタル画像解析を用いてスコアリングした。
骨棘のスコアリング
【０２８５】
骨棘の大きさは、Ｈ＆Ｅ染色した内側大腿からの切片に対して、０〜３の任意の尺度：０−骨棘無し、１−軟骨形成の徴候、２−小さな骨棘、３−大きな骨棘を用いてスコアリングした。
統計学
【０２８６】
軟骨のプロテオグリカン枯渇損傷は、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびダンの事後検定を用いて分析した。群間差異はマン・ホイットニー検定を用いて検定した。総ての部位を個別に検定した。テクネチウムの取り込みは、スチューデントのｔ検定を用いて検定した。統計学的計算を行うため、グラフパッドプリズム４ソフトウエアを用いた。
【０２８７】
結果
関節炎マウスにおいてα１１インテグリンに対する抗体による処置は炎症を軽減した
【０２８８】
膝関節へのｍＢＳＡのｉ．ａ．注射により１つの関節炎を誘発した。この疾病は発症が早く、ｉ．ａ．注射後１日目に関節の腫脹が最大に達し、７日まで徐々に低下した。さらに８日後（ｉ．ａ．注射から１５日後）、疾病がより慢性化した際にマウスを屠殺した。関節炎マウスを抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）で処置すると、マウスの膝関節の腫脹程度ならびに関節中への炎症性細胞の浸潤程度として評価される炎症に有意な軽減がもたらされた。抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）で処置したマウスでは、ｍＢＳＡのｉ．ａ．注射３日後に、誘発された膝関節の腫脹に対照抗体（ＣＴ１７）で処置したマウスに比べて有意な軽減が見られた（Ｐ＝０．０３５、Ｔ検定）（図５）。その後の２回の実験でも同様の結果が示された。
【０２８９】
抗α１１インテグリンで処置したマウスは、実験の終了時（ｉ．ａ．注射１５日後）における滑膜空間（図６）および関節空間（滲出）（図８）中の浸潤細胞の量が、対照抗体で処置したマウスに比べて少なかったが、この違いは統計学的に有意な差ではなかった。
関節炎マウスにおいてα１１に対する抗体による処置は軟骨を破壊から保護する
【０２９０】
抗α１１インテグリン抗体で処置されたマウスでは、対照抗体で処置されたマウスに比べ軟骨の破壊が少なかった（Ｐ＝０．０１５）（図８）。軟骨破壊の量は、０〜３の任意の尺度を用いて、ならびに画像解析を用いて、組織切片におけるプロテオグリカンの欠如としてスコアリングした。プロテオグリカン枯渇に対する抗α１１インテグリン抗体による処置の保護効果は膝においてスコアリングされた６箇所総てで見られた。
【０２９１】
図９および１０は、任意の尺度評価を用いてプロテオグリカン（ＰＧ枯渇）およびその低下として評価される膝蓋および外側脛骨に対する抗α１１インテグリン抗体による処置の効果をさらに示す。２つの異なる実験を表しているこれら２つの図面で分かるように、Ａ０３による処置は膝蓋および外側脛骨の双方においてＰＧ枯渇を軽減する。実験２にいける外側脛骨のＡ０３でのＰＧ枯渇の軽減は有意である（ｐ＝０．０２）。これら２つの図９および１０は、膝蓋の画像解析（図９に相当、任意の尺度で分析された膝蓋）と比較しなければならず、その結果が図８に示されている（Ｐ＝０．０１５）。
【０２９２】
図１１は、骨棘の大きさに対する抗α１１インテグリン抗体により処置の効果を示している。この図面で分かるように、対照抗体（ＣＴ１７）による処置に比べ、Ａ０３抗体で処置した後に骨棘の大きさの低下が見られる。
【０２９３】
結論
本発明の例示的抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）による処置は、関節の腫脹および炎症性細胞の浸潤として評価される、抗原誘発性関節炎（ＡＩＡ）で誘発された関節炎マウスの関節の炎症を軽減する。さらに、抗α１１インテグリン処置はＡＩＡマウスにおいて軟骨を退化から保護し、これはプロテオグリカン分解の低下として示される。本発明者らの結果は、３日目の炎症（ＴＣ取り込み）と１５日目の軟骨退化（ＰＧ枯渇）の間に明白な相関を示す。
【０２９４】
現在確立されているＲＡに対する処置は、同じＡＩＡモデルで腫脹を軽減する（ＮＳＡＩＤＳ）か、または腫脹と浸潤細胞の量を軽減する（抗ＴＮＦα）が、軟骨に対して保護効果を有するものはない（６〜９）。これは、抗α１１インテグリン処置が単独療法としての、または他の療法との併用としてのＲＡ療法に大きな可能性を有することを示唆する。
【０２９５】
参照文献
【０２９６】
実施例ＩＩＩ−グルコース−６−リン酸誘発性関節炎に対する本発明の例示的抗体の効果
この研究の目的は、ＤＢＡ／１マウスにおいて例示的完全ＩｇＧ抗体（「Ａ０３と呼ぶ」）の作用を試験することであった。
【０２９７】
材料および方法
試験施設
Cartela AB, Scheelvagen 22, 223 63 Lund, Sweden
【０２９８】
実験計画
実験プロトコールを下記表５および６に示す。
【０２９９】
表５
【表６】
【０３００】
表６
【表７】
【０３０１】
動物
雌ＤＢＡ１マウスをTaconic M&B, Denmarkから入手した。マウスにEMI Expanded(special Diet Services Ltd, UK)および水を自由に摂らせた。マウスには少なくとも１週間、新しい環境に対する馴化期間を設けた。水およびケージは１週間に２回交換した。必要に応じて餌を満たした。マウスは蓋を強化したＭａｃ３ケージ当たり７匹を飼育した。
抗原
【０３０２】
組換えヒトグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）は、Kamradt (Deutches Rheumaforschungszentrum Berlin, Berlin, Germany)から、従前に記載されているように（３）製造されたものを購入した。
グルコース−６−リン酸イソメラーゼ誘発性関節炎の誘発
【０３０３】
マウスにＣＦＡ(Difco, Detroit, MI, USA)中に１：１比で乳化させた２００μｇの組換えヒトＧ６ＰＩを感作させた。１００μｌ量を尾の基部に皮下注射した（３）。
試験薬の投与
【０３０４】
抗体は４℃で保存した。抗体を無菌ＰＢＳに溶解させ、無菌条件下４℃で保存した。抗体の投与はｈＧ６ＰＩ注射後、７、１０、１３、１６日目に行った。抗体は２００μｌ／マウスをｉ．ｐ．投与した。抗体の投与は常に１日の同じ時間−／＋１時間に行った。以下のスキームで各マウスに合計８８０μｇの抗体を投与した。
【０３０５】
表７
【表８】
炎症のスコアリング
【０３０６】
各脚について１〜１５の範囲の拡張スコアリングプロトコールを用い、これまでに記載されているような（４）関節炎のマウス１匹につき最大スコア６０とした。各関節炎（発赤および腫脹）の足指および指を１とし、影響を受けた足首を５とした。
組織学
【０３０７】
後足および足首をリン酸緩衝ホルマリン（ｐＨ７．４）中で３日間固定し、ＥＤＴＡ中で脱石灰した後、パラフィンワックスに包埋した。ミクロトームで半連続の５μｍ切片を作製した。前足をＥＤＴＡ中で脱石灰した後、ＯＣＴに包埋し、凍結させた。クリオスタットで半連続の５μｍ切片を作製した。
軟骨損傷および骨破壊のスコアリング
【０３０８】
後足および足首のパラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）またはサフラニン−Ｏで染色した。切片を、勾配作製系（５）を用いたプロテオグリカン枯渇に関して、さらにはまた光学顕微鏡による骨棘形成および骨破壊に関して等級付けした。プロテオグリカン枯渇はまた、デジタル画像解析を用い、赤色染色の欠損としてスコアリングした。
免疫染色
【０３０９】
凍結切片を室温まで温めた後、アセトン中、−２０℃で１０分間固定した。スライドをＰＢＳで５分３回洗浄した後、３７℃で３０分間、ヒアルロニダーゼ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ；Sigma）とともにインキュベートした。もう一度、ＰＢＳ中で５分３回洗浄した後、切片をＰＢＳ中に希釈した４％ヤギ血清(Sigma, G-9023)ととともに３０分間インキュベートして遮断した。切片を室温で６０分間、ＰＢＳ中４％ヤギ血清中に１：１００希釈したビオチニル化ＩｇＧ４−抗α１１インテグリンＡｂ（＝２０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、ＰＢＳ中で５分３回洗浄した。その後、切片を蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４４８またはＣｙ３）コンジュゲートストレプトアビジンとともにさらに６０分間インキュベートした。ＰＢＳ中でさらに５分３回洗浄した後、スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを取り付け、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果
【０３１０】
マウスにおいてα１１インテグリンに対する抗体による処置はＧ６ＰＩ誘発性関節炎の罹患率および重篤度を軽減した
【０３１１】
組換えヒトグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ｒｈＧ６ＰＩ）を感作させると、前足と後足の双方に重度の腫脹を有する多発性関節炎が誘発される。関節炎の臨床徴候はまず感作後７日目に表れ、急速に進行し、９日目に最大に達した（図１２）。感作後１８日目にマウスを塗擦した。
【０３１２】
７日目に処置を開始した後、注射１０、１３、１６日後にマウス当たり合計８８０μｇの試験抗体を投与した。ＴＮＦＲ−ｐ７５−ＩｇＦｃ（エンブレル）を陽性対照として用いた。エンブレルによる処置は、対照抗体（ＣＴ１７）で処置した群における１００％に対して、関節炎の罹患率を５０％低下させた。Ａ０３処置は、関節炎の罹患率および重篤度に明らかな低下をもたらした（図１２および１３）。Ａ０３で処置したマウスは総て関節炎を発症し（９日目で罹患率１００％）、その後、５０％のマウスが回復し（ｐ＜０．０５）（図１３）、罹患率はエンブレル処置群と同レベルまで低下した（ｐ＝０．０５１）（図１２）。図１３は、各群の個体の関節炎スコアの平均として評価される関節炎の重篤度を示す。
【０３１３】
関節炎の試験中、全般的な疾病状態の指標としてマウスを秤量した。Ａ０３処置マウスは対照処置マウスに比べ、有意ではないが明らかな体重低下の減少を示した（ｐ＝０．０８）（図１４）。
【０３１４】
以下の表８は、これらの試験で調べた各群において発症した関節炎の罹患率（頻度）を示す。
【０３１５】
表８
【表９】
結論
【０３１６】
抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）による処置は、多発性関節炎モデルであるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ｒｈＧ６ＰＩ）誘発性関節炎において、関節炎マウスの関節の炎症を軽減する。発症日に試験抗体を投与し、その後、試験の終了時まで３日おきに投与する処置スキームを用いると、Ａ０３処置が５０％の関節炎マウスに回復をもたらしたことが実証できる。関節炎の罹患率は試験群においては１００から５０％に低下し、エンブレル処置の場合の罹患率レベルを下回った。
【０３１７】
参照文献
実施例ＩＶ−例示的「Ａ０３」抗体と競合するモノクローナル抗体の作製
【０３１８】
本実施例の目的は、ハイブリドーマ技術を用い、例示的「Ａ０３」抗体と競合するマウスモノクローナル抗体を作製することである。
材料および方法
感作プロトコール
【０３１９】
ＨＥＫ細胞により産生された組換えタンパク質を感作に用いる。このタンパク質は、α１１インテグリンのスターク領域に対する抗体応答を命令するために、ヒトα１１の上方−下方ウシドメイン（Ｅ−ＵＬＣＤ）を含む。
Ｅ−ＵＬＣＤの配列は、
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号１９］
である。
【０３２０】
Ｃ５７ｂ１／６−α１１ノックアウトマウス（詳細は、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ０３／１０１４９７に記載の通り）に感作させた。
【０３２１】
ＦＡＣＳ分析によって免疫応答を追跡できるように、示された時点で採血を行った。次の感作スキームを適用した。
【０３２２】
０日目
０日目にＦＡＣＳ分析用の採血を行い、α１１スタークタンパク質（このα１１配列の種はヒトであり、Veiling et al. J. Biol. Chem. 1999, 274:25735-25742に記載されている) (Cartela AB, バッチ番号53; 070509; ピーク1+2をプール, E-ULCD)(80μｇ／マウス) を音波処理によりＣＦＡ（フロイントの完全アジュバント，Sigma）に乳化させ、４匹のＣ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスの尾の基部に注射した。
【０３２３】
１４日目
ＦＡＣＳ分析用に採血し、ＩＦＡ（フロイントの不完全アジュバント，Sigma）中、α１１スターク（Ｅ−ＵＬＣＤ）（５０μｇ／マウス）で追加免疫した。
【０３２４】
２２日目
ＦＡＣＳ分析用に採血
【０３２５】
２４日目
融合用にＮＳ０融合相手を増殖
【０３２６】
３１日目
予備融合 ＰＢＳ中、α１１スターク（バッチ番号５３ Ｅ−ＵＬＣＤ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｃａ２＋、バッチＩ）（５０μｇ／マウス）で追加免疫。
【０３２７】
３４日目
Ｂ細胞と骨髄腫細胞系統ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ）の融合
【０３２８】
３４日目のＮＳ０細胞（０７０６２５）との融合
３匹のＣ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスの脾臓を用いた。単細胞懸濁液を作製し、９ｍｌの無菌ｄｄＨ２Ｏを用い（１０秒）溶解させた後、１ｍｌの１０倍ＰＢＳを加えて溶解を停止させた。細胞を血清不含Ｄ−ＭＥＭで洗浄し（２回）、５０ｍｌファルコン試験管内で、洗浄したＮＳ０細胞のアリコートと混合した（ＰＥＧとの融合の際に有害となり得る遊離タンパク質を除去するため）。これらのペレットを水浴中で３７℃に維持した。３７℃にて攪拌しながら、ガラスピペットを用い、１分間かけてＤ−ＭＥＭ中５０％ＰＥＧ（１５００ＭＷ）１ｍｌを滴下した。予温した２ｍｌの血清不含Ｄ−ＭＥＭ２分かけて加えた。予温した７ｍｌの血清不含Ｄ−ＭＥＭを３分かけて滴下した。細胞を５分間５００ｘｇで遠心分離した。上清を廃棄し、予温した完全Ｄ−ＭＥＭ（ピルビン酸塩、１０％ＦＣＳ、ＰＥＳＴ）、３プレートにＮｒ１ ４０ｍｌ）、４プレートにＮｒ３ ５０ｍｌ）、４プレートにＮｒ１０ ５０ｍｌを加えた。細胞を室温で１０分間休止させた後、およそ１００μｌの細胞を１０ｍｌピペットで９６ウェル細胞培養プレートに加えた（１ウェル当たり１滴）。
【０３２９】
融合は、引用することにより本明細書の一部とされる'Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, "Production of Monoclonal antibodies" (ISBN ISSBN: 1934-3671, Wileyのプロトコールに従って行った。
【０３３０】
３５日目
１００μｌの２倍ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン、
Apoteket, Sweden)培地を選択用ウェルに加えた。
【０３３１】
３８日目
死細胞からの有害な上清を除去し、新鮮なＨＴ培地（ヒポキサンチン−チミジン， Apoteket, Sweden)を加えた。
【０３３２】
４４日目
ＦＡＣＳスクリーニング用の１００μｌ培地を除去し、ウェルにＨＴ培地を加えた。
【０３３３】
ＦＡＣＳスクリーニングによるスターク特異的ハイブリドーマの同定
候補ハイブリドーマを含むウェルの上清を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用い、スターク領域に対する反応性に関して調べる。これらのクローンをそれらのスターク反応性および抗α１１インテグリンスターク候補ハイブリドーマの望ましくない潜在的交差反応性に関してさらに特性決定した。
スターク特異的ハイブリドーマの同定：
【０３３４】
抗α１１インテグリンスターク候補ハイブリドーマの、関連のα１０−インテグリンとの望ましくない交差反応性を、α１０−インテグリンでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞およびα１０−インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を用いて調べる。他種、すなわちマウス由来の相当するスタークに対する交差反応性は、マウスα１１−インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を用いて調べる。
【０３３５】
α１１スタークハイブリドーマのサブクローニング
ＦＡＣＳ陽性細胞を、制限希釈法（およそ０．３細胞／ウェル）を用いてサブクローニングする。ハイブリドーマの生存を確保するためのフィーダー細胞としてラット胸腺細胞を用いる。種々のサブクローニング段階でハイブリドーマ細胞を凍結させる。
【０３３６】
全長ヒトα１１インテグリンに対する抗体の作製
全長ヒトα１１インテグリンに対する抗体の作製。該全長α１１インテグリンタンパク質は、細胞質テールに特異的なポリクローナル抗血清を用い、ヒトα１１でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞ライゼートからアフィニティー精製する（ＷＯ００／７５１８７に記載の通り）。
【０３３７】
感作プロトコール：全長α１１−インテグリンプロジェクト
０日目
４匹の雌Ｃ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスを用い、尾の基部にＣＦＡ中、４０μｇ／マウスの全長α１１タンパク質（バッチ番号０７０７１７）を感作させた。ＦＡＣＳ分析用に採血した。
１３日目
１３日目にＦＡＣＳ分析用に採血した。
１６日目
ＩＦＡ中、１０μｇ／マウスの全長α１１タンパク質（バッチ番号０７０７１７）を追加投与した。
２６日目
ＰＢＳ中、１０μｇ／マウスの全長α１１インテグリンおよび４０μｇのスタークα１１タンパク質（バッチ番号５３ Ｅ−ＵＬＣＤ）／マウスをｉ．ｐ．追加投与した。
２９日目
脾臓およびリンパ節細胞とＮＳ０細胞との融合。ＤＮＡ用の尾の切片および血清を保存。
【０３３８】
２９日目のＮＳ０細胞との融合
３匹の感作α１１ｋｏマウスの脾臓および排出リンパ節（ＬＮ）からの細胞を融合に用いた。単細胞懸濁液を作製し、脾細胞の赤血球を、０．８４％塩化アンモニウムを用いて溶解させた。細胞を血清不含Ｄ−ＭＥＭで洗浄し（２回）、５０ｍｌファルコン試験管内で、洗浄したＮＳ０細胞のアリコートと混合した。これらのペレットを水浴中で３７℃に維持した。３７℃にて攪拌しながら、ＤＭＥＭ中、５０％ＰＥＧ１５００ＭＷ１ｍｌを１分間かけて滴下した。予温した２ｍｌの血清不含ＤＭＥＭ２分かけて滴下した。予温した７ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを３分かけて滴下した。細胞を５分間５００ｘｇで遠心分離した。上清を廃棄した後、予温した完全ＤＭＥＭ（ピルビン酸塩、１０％ＦＣＳ、ＰＳ）をＬＮおよび脾臓調製物に加えた（Ｎｒ１では５０ｍｌ、Ｎｒ３では５０ｍｌ、Ｎｒ１０では５０ｍｌ）。１融合当たり４．５個のプレートに各ウェルに１滴（およそ１００μｌ）ずつ加えた。４時間後に、１００μｌの２倍ＨＡＴ培地を加えた。
融合は、引用することにより本明細書の一部とされる'Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, "Production of Monoclonal antibodies" (ISBN ISSBN: 1934-3671, Wileyのプロトコールに従って行った。
【０３３９】
日
１００μｌの培地を除去し、ウェルにＨＴ培地を加えた。
【０３４０】
融合後１１日目に、上記のように陽性ウェルのＦＡＣＳスクリーニングのために上清を採取する。陽性ウェルを同定した後、上清をヒトおよびマウスα１１インテグリン間の交差反応性に関して調べた（Ｃ２Ｃ１２野生型細胞ならびにヒトα１１およびα１０−インテグリンでトランスフェクトされた細胞を用いるハイブリドーマスクリーニング）。
【０３４１】
ＢＭコンダイムＨ１添加培地(Roche, DE)中でハイブリドーマ細胞をサブクローニングした（０，３細胞／ウェル）。１コロニーのみが増殖しているウェルを特異性スクリーニングのために選択した。
【０３４２】
例示的抗体「Ａ０３」との競合に関するスクリーニング
さらに、新たに作製されたクローンを、例示的抗体「Ａ０３」の結合を遮断するその能力に関して調べる。ＦＡＣＳに基づく方法を用いる。ヒトα１１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を、新たに作製された精製抗体とともに、細胞表面で発現されるα１１−インテグリンに対するそれらのエピトープを占有するよう、１０００ｎｇ／ｍｌまでの約１．６の希釈系でインキュベートする。第二段階では、ビオチニル化された例示的抗体Ａ０３を加える。これらの抗体があるエピトープ領域を共有していれば、ヒトＩｇＧの結合が減少する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンα１１サブユニットまたはそれを含んでなるヘテロ二量体（例えば、α１１β１ヘテロ二量体）に対して結合特異性を有する結合剤、および炎症性症状の処置におけるその使用に関する。具体的には、本発明は、関節炎疾患などの炎症性症状の処置に用いるための抗体および抗原結合フラグメント、その変異体、融合体および誘導体、ならびにそれを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用による多様な事象を調節する
インテグリンは、元々、内部の細胞骨格と隣接環境または細胞外細胞マトリックスとを結びつける介在細胞表面構造として定義されており、機能上「死んだ」分子と見なされていた。この理由は、１つには、ほとんどのインテグリンはシグナル伝達モチーフを欠いた極めて小さな細胞質テールだけを含むという知見に基づいていた。今日、インテグリンは、他の細胞表面受容体との相互作用および細胞内アダプタータンパク質の動員を介して、インサイドアウト(Phillips et ah, 1988, Blood 71:831-43.)、アウトサイドイン(Law et al, 1999, Nature 401:808-811.)の細胞シグナル伝達に関与する極めて複雑な構造であることが知られ、シグナルを細胞膜を横断して伝達することが示されている(Hynes, 2002, Cell 110:673-87;総説としては、Miranti & Brugge, 2002, Nat Cell Biol 4:E83-90.を参照)。
【０００３】
最もよく研究されている数種のインテグリンを、モノクローナル抗体または小分子阻害剤を用いて遮断すると、細胞−細胞および細胞−マトリックスの接触が排除されて、発達、組織修復、脈管形成、炎症および止血を含む多様な生体プロセスの干渉が起こることが示されている。これらの抗体のいくつかは臨床段階治験の対象となっている(Shimaoka & Springer, 2003, Nat Rev Drug Discov 2:703-16)。
【０００４】
このように、インテグリンが介在する免疫調節作用および細胞外マトリックス調節作用は、それらの天然ＥＣＭリガンドまたは抗β１インテグリン抗体を介したインテグリンの刺激にいっそう大きく限定されてきた(Loeser, 2002, Biorheology 39:119-24)。このような研究は、他のインテグリン受容体と同様に、軟骨細胞インテグリンのインサイドアウト、アウトサイドイン、側方シグナル伝達関与を実証した。
【０００５】
関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜性関節を侵し、疼痛、腫脹を生じ、患者の運動を低下させる炎症性の自己免疫疾患である。総ての末梢関節がＲＡに侵される可能性があるが、罹患が最も多いのは手、足および膝の関節である。ＲＡでは、未知の理由で免疫系が滑膜（関節包を裏打ちしている組織）を攻撃し、局部的炎症を起こす。炎症はやがてその関節内の軟骨および骨の破壊、ならびにその関節を支えている靱帯、腱および筋肉の破壊を引き起こす。リウマチ様の滑膜では、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞および血漿細胞が確認できる。管系における処置の多くは、これらの特定の細胞のより標的化された阻害をねらいとしている。ＲＡの実際の原因はまだ知られていないが、強い遺伝的要素がある。
【０００６】
ＲＡは世界の成人人口の０．５〜２．０％に見られ、患者の３人に１人が２０年以内に重度の不能状態となっている。ＲＡの罹患率は男性よりも女性で３倍高く、発症のピーク年齢は通常２０〜４５歳の間である。死亡率は、年齢および性別の合致した対照よりもＲＡ罹患者で２７％高く、女性のサブセットではいっそう高い。これは、研究によっておよそ５〜１８年の余命の低下を表す。ラジオグラフィー的に明らかな関節疾患は、最初の２年では患者の＞６７％、最初の５年では患者の＞７２％に見られる。
【０００７】
ＲＡは、滑膜性関節を標的とする慢性の全身性炎症性疾患であり、一連の関節外徴候を伴うことが多い。この関節炎は、関節軟骨へのリンパ球および顆粒球の浸潤、滑膜繊維芽細胞およびマクロファージの増殖、ならびに関節を取り巻いている滑膜性内面の新血管新生という複数細胞の炎症プロセスを特徴とする。この増殖プロセスには、関節の腫脹、紅斑および疼痛が含まれるが、関節の破壊ならびに骨密度および構造の低下への進行も起こる。
【０００８】
ＲＡの病理学的メカニズムは十分理解されていない。しかしながら、マクロファージ、樹状細胞、繊維芽細胞様滑膜細胞、肥満細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞などの多くの細胞種が関与していると考えられる。ＲＡ滑膜では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５などのサイトカインおよび種々のケモカインの放出が実在する。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１のレベルは疾病の症状および関節の損傷と強く相関している。血中のリウマチ様因子（ＲＦ）および抗シトルリン抗体などの自己抗体のレベルはＲＡに特徴的であり、この疾病の診断および予後マーカーとなる。
【０００９】
関節リウマチはまず、いくつかの異なる細胞種の流入によって示唆される滑膜の炎症性応答を特徴とする。この内面は肥厚し、腫脹する。さらに、骨の破壊が見られる。
【００１０】
ＲＡでは疾病改善薬が利用できるが、それらは副作用のために使用が制限され、多くの患者は既存の治療に応答しない。過去２０年の間、ＲＡ処置のもっと積極的なアプローチは、疾病の進行を休止させることを試みる疾病改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）の開発に至った。最も処方されているＤＭＡＲＤは、元々は癌の処置に用いられていたメトトレキサートである。他のものとしては、金塩、抗マラリア薬、スルファサラジン、テトラサイクリンおよびシクロスポリンが含まれる。医師は通常、疾病の発症時にＤＭＡＲＤを処方するが、中度〜重度のＲＡ罹患者にはＮＳＡＩＤ、コルチコステロイドおよびＤＭＡＲＤが同時に与えられる。
【００１１】
メトトレキサートは大多数のＲＡ患者で効果的であるが、多くの人がこの薬剤の副作用に耐えられず、およそ５０％の患者がついには処置が上手く行かず、その後は生物応答改質剤など、より最近の治療革新が望ましくなる。１９９８年に市場に出たレフルノミド(Arava; Aventis)はメトトレキサートとメカニズムおよび副作用が類似しており、メトトレキサート療法に失敗した患者の第二選択薬として用いられている。最も好結果の新規ＲＡ療法は、エタネルセプト(Eribrel; Amgen)、インフリキシマブ(Remicade; J&J/Centocor)およびアダリムマブ(Humira; Abbott)などの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）阻害剤である。しかしながら、ＴＮＦα阻害剤は、長期間の使用では、感染症および癌の増加などの副作用の可能性がある。
【００１２】
骨関節炎
骨関節炎（ＯＡ）は、進行性の変性性関節疾患であり、最も多い形態の関節炎である。骨関節炎は加齢と強い関係があり、高齢者における疼痛および能力障害の主要な原因である。種々の機械的、代謝的または構成的傷害がＯＡを誘発し得る。これらの傷害は明らかにならないままである場合（「原発性」ＯＡ）が多いが、外傷などの明白な原因が明らかになる場合もある（「二次的」ＯＡ）。関節組織（軟骨、骨、滑膜、関節包、靱帯、筋肉）は総て、健康および機能に関して互いに依存し合っている。あるものに対する傷害は他に影響を及ぼし、関節全体に影響を及ぼす一般的なＯＡ現象を招く。ＯＡプロセスには、新しい組織、最も著しくは骨（「骨棘」の産生および関節形状のリモデリングが含まれる。多くの場合、ＯＡはこれらの傷害を代償し、無痛であるが解剖学的に変化した機能性関節をもたらす（「代償性」ＯＡ）。しかしながら、これが上手く行かない場合もあり、進行性の損傷、関連の症状および「関節不全」を有するＯＡ患者としての顕現に至る。このような見方は、ＯＡの臨床的不均質性および変動のある臨床転帰を説明する。
【００１３】
骨関節炎は、６５歳を超える身体障害の主因であり、人口の推計１０％に影響を及ぼしている。ＯＡ関連の身体障害の罹患率は男性よりも女性で高く、８５歳を超える女性では常に２５％にのぼる。予測では、２０２０年までにＯＡ関連障害を有する人の数は６６％増加することが示唆されている。もしＯＡの医学的治療および予防のための疾病改善戦略を見つけることができなければ、次の３０年で、関節置換術を必要とする股関節部および膝の重度症候性ＯＡを有する人の数にも同様の増加が予測される。
【００１４】
骨関節炎（ＯＡ）は、単一の疾病またはプロセスではなく、１以上の滑膜性関節の構造的不全、そしてやがては症候的不全をもたらすある範囲のプロセスおよび障害の臨床的および病理学的転帰である。ＯＡは、肋軟骨下の骨、靱帯、関節包、滑膜および関節周囲の筋肉ならびに関節軟骨を含む関節全体を含む。結局、関節軟骨は、繊維形成、亀裂、潰瘍形成および関節表面の全厚の減少を伴って退化する。
【００１５】
骨関節炎の処置には広範囲のアプローチが含まれるが、手術を除いてほとんどの処置は待期的である。これは、ほとんどの処置が痛みを緩和し、それにより、患者の関節機能を高めるものであることを意味するが、これらの処置は疾病の経過を変化させない。外科的介入には、関節置換および骨切り術が含まれるが、これらは骨関節炎の進行を逆転させ、特定の関節に対して長期の機能改善および疼痛緩和をもたらし得る。
【００１６】
従って、また、ＯＡを処置するための選択肢を改善する差し迫った必要がある。ＯＡに対する既存の薬物療法は症状（主として疼痛）を軽減し、ある程度の効果しかなく、患者は実質的な疼痛負荷があるままである場合も多い。このように、これまでにＯＡにおいて疾病改善効果が実証された薬剤はない。
【００１７】
従って、本発明は、ＲＡおよびＯＡなどの炎症性症状に対する新規な処置およびそれに用いるための新規な結合剤を提供しようとするものである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の第一の態様は、炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用を提供し、ここで、該抗体もしくはフラグメントは以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHW［配列番号６］
を含んでなる。
【００１９】
当業者であれば、上記配列番号１〜６のアミノ酸配列は相補性決定領域（ＣＤＲ）を表すことが分かるであろう。
【００２０】
本発明の第二の態様は、炎症性症状の診断薬または予後薬の製造における、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用を提供する。
【００２１】
本発明の第三の態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用を提供する。
【００２２】
本発明の関連の態様は、
（ａ）炎症性症状を処置するための、上記の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用；
（ｂ）炎症性症状を診断または予後するための、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用；
（ｃ）インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用
を提供する。
【００２３】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する「結合特異性」とは、インテグリンα１１サブユニット、またはα１１β１ヘテロ二量体などのそのヘテロ二量体と結合することができる、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を意味する。
【００２４】
一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体は、軟骨細胞、繊維芽細胞、間葉細胞（例えば、間葉幹細胞）または樹状細胞などの細胞の表面に存在する。
【００２５】
さらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vivoにおいて、すなわち、インテグリンα１１サブユニットが体内に存在する生理学的条件下で、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と結合することができる。このような結合特異性は、α１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現するトランスフェクト細胞を用い、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウエスタンブロット、クロマトグラフィーおよびフローサイトメトリーなどの当技術分野で周知の方法によって決定することができる（実施例参照）。抗体の特異性をどのように評価するかの例は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるHarlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory", Cold Spring Habor Laboratory Press, New Yorkに示されている。
【００２６】
当業者であれば、インテグリンα１１サブユニットはヒトまたは動物インテグリンα１１サブユニットであり得ることが分かるであろう。一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットはヒトである。既知のインテグリンα１１サブユニットの例は、引用することにより本明細書の一部とされる国際特許出願（公報）ＷＯ００／７５１８７(Cartela AB)に開示されている。
【００２７】
もう１つの実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と選択的に結合することができる。「選択的に結合することができる」とは、別のタンパク質（特に、α１１と最も高い同一性を有するα１０、α１およびα２などの他のインテグリン）に対するよりもインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量と少なくとも１０倍強く、例えば、少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強く結合するこのような抗体由来結合部分を含むものとする。この結合部分は生理学的条件下、例えば、in vivoでインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と選択的に結合し得る。相対的結合強度を評価するのに好適な方法としてイムノアッセイが含まれ、例えばこの場合、結合部分は抗体である（引用することにより本明細書の一部とされるHarlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory", Cold Spring Habor Laboratory Press, New York参照）。あるいは、結合は競合アッセイを用いるか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析(Biacore International AB, Sweden)を用いて評価することもできる。
【００２８】
さらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と排他的に結合する。
【００２９】
当業者であれば、抗体またはその抗原結合フラグメントの結合特異性は、成分である重鎖と軽鎖の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）の存在により付与されることが分かるであろう。本発明の使用では、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性は、上記の配列番号１〜６として定義されるＣＤＲまたは同じ結合特異性を保持するその変異体配列の存在により付与される。
【００３０】
「結合特異性を保持する」とは、該抗体またはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、インテグリンα１１サブユニットとの結合に関して抗体「Ａ０３」と競合することができる（配列番号１１および下記実施例を参照）。
【００３１】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６として特定されるＣＤＲを含んでなる抗体と同じインテグリンα１１サブユニット上のエピトープと結合し得る。
【００３２】
「エピトープ」とは、本明細書において、抗体が結合する分子の部位、すなわち、抗原のある分子領域を意味するものとする。エピトープは、例えばアミノ酸配列によって決定される直鎖エピトープ、すなわち一次構造、または二次構造、例えば、ペプチド鎖のβシートもしくはαヘリックスへの折りたたみにより、または三次構造、例えば、ヘリックスもしくはシートが折りたたまれるか、または配列された抗原の三次元構造を与える方法により定義される三次元エピトープであり得る。
【００３３】
インテグリンα１１サブユニットの好適なエピトープ（またはその一部）の例は以下の通りである。
WNGCNEDEHCVPDLVLDARSDLPTAMEYCQRVLRKPAQDCSAYTLSF
DTTVFIIESTRQRVAVEATLENRGENAYSTVLNISQSANLQFASLIQKED
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号７］
【００３４】
インテグリンα１１のさらなる好適なエピトープとしては、配列番号７のフラグメント、融合体または天然変異体が含まれ得る。
【００３５】
例えば、好適なフラグメントは、配列番号７で示されるヒトα１１インテグリン配列のほぼアミノ酸７７８番〜アミノ酸１１４２番、またはヒトα１１インテグリン配列のほぼアミノ酸８０４番〜ほぼアミノ酸８２６番のアミノ酸配列を本質的に含んでなるペプチドなどの細胞外延長領域、特に、アミノ酸配列ＥＹＣＱＲＶＬＲＫＰＡＱＤＣＳＡＹＴＬＳＦＤＴ［配列番号８］を本質的に含んでなるペプチド、またはヒトα１１配列のほぼアミノ酸（ａａ）番号：ａａ７７８〜ａａ８００、ほぼａａ８００〜８２０番、ほぼａａ８２０〜８４０番、ほぼａａ８４０〜８６０番、ほぼａａ８６０〜８８０番、ほぼａａ８８０〜９００番、ほぼａａ９００〜９２０番、ほぼａａ９２０〜９４０番、ほぼａａ９４０〜９６０番、ほぼａａ９６０〜９８０番、ほぼａａ９８０〜１０００番、ほぼａａ１０２０〜１０４０番、ほぼａａ１０４０〜１０６０番、ほぼａａ１０８０〜１１００番、ほぼａａ１１００〜１１２０番、ほぼａａ１１２０〜１１４２番を含んでなるか、またはそれからなるいずれかのポリペプチドフラグメントを含んでなるか、またはそれからなる。
【００３６】
上記の総てのアミノ酸番号は、ヒトα１１配列アミノ酸番号から算出され、ＷＯ００／７５１８７（引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているヒトインテグリンα１１のアミノ酸１番はＭであり、ａａ２番はＤであり、ａａ３番はＬであり、ａａ４番はＰであり、ａａ５番はＲであり、ａａ６番はＧであり、ａａ７番はＬであるなどである。
【００３７】
好適なエピトープ融合体としては、上記のペプチドとＳｔｒｅｐＴａｇテールの融合体が含まれる。
【００３８】
上記のエピトープポリペプチド配列の、天然変異体などのエピトープ変異体としては、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは、前記配列と少なくとも７０％または８０％または８５％または９０％の同一性、より好ましくは、前記アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含んでなるポリペプチドを含む。
【００３９】
同一性％は、例えば、Expasy facilityサイト：
(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)
のＬＡＬＩＧＮプログラム(Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)を用い、パラメーターとしてグローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティー−１４、エクステンディングギャップペナルティー−４を用いるなど、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。
【００４０】
あるいは、２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウイスコンシン大学ジェネティックコンピューティンググループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて決定することもでき、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して計算されると考えられる。
【００４１】
抗体「Ａ０３」の結合特異性を保持する抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体はまた、抗体「Ａ０３」と同じ１以上の生物特性を保持していてもよい（下記参照）。
【００４２】
試験抗体が結合に関して第二の抗体と競合することができるかどうかを判定するための方法は当技術分野で周知である。
【００４３】
１つの好適な方法が、α１１結合抗体Ａ０３の評価のためのサンドイッチＥＬＩＳＡである。例えばポリクローナル抗体の好適な量は、ヒトα１１の細胞質テールに対するポリクローナルウサギ抗体１０μｇ／ｍｌなどである。次に、この抗体は、例えばＭａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ（商標）などの９６ウェルプレートにコーティングされた場合、捕捉抗体として用いられる。コーティングは、例えばプレートを４℃で一晩インキュベートした後、例えばＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄することによるなど、当技術分野で公知の標準法に従って行う。ウェルを、例えば室温にて、ＴＢＳ−Ｔ中３％のＢＳＡで１時間ブロッキングすることができる。次に、ヒトα１１発現ベクターで安定トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの細胞抽出液をアッセイバッファー（例えば、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を添加したＴＢＳ−Ｔ）で希釈する。次に、例えばウェル当たり５０μｌなどの好適な量の希釈細胞抽出液を加え、例えば室温で１時間、インキュベートして、コーティングされた抗体と結合させる。その後、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、ビオチンとコンジュゲートさせた一次抗体（Ａ０３または対照抗体）を、例えばアッセイバッファー中２μｇ／ｍｌなどの好適な量で加える。次に、プレートを、例えば室温で１時間など、可能であれば、Ａ０３および対照抗体の結合を可能とするに十分な時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ビオチニル化一次抗体を用いる場合には、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体（ＤＡＫＯ）を用い、アッセイバッファーで相応に希釈し（１：５０００）、ウェルに加えればよい。その後、プレートを、例えば室温で１時間など、ストレプトアビジン−ビオチン複合体が形成するに十分にインキュベートする。例えばＴＢＳ−Ｔで３回などの洗浄の後、プレートをペルオキシダーゼ基質（例えば、OPD SigmaFast, Sigma）で現像する。比色定量変化の吸光度を好適な波長（この場合４９０ｎｍ）で測定する。
【００４４】
一次抗体がコンジュゲートされない場合には、同じＥＬＩＳＡを代わりに、例えばSerotecからの、例えばマウス抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰなどの、ＨＲＰと直接コンジュゲートされたヒトＩｇＧ４に対する二次抗体とともに、あるいはコンジュゲートされない場合には、次いで例えばＤＡＫＯからのＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体とインキュベートすることができる。その後、プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４５】
さらなる方法としては、上記で概略を示したサンドイッチＥＬＩＳＡを逆転させることを含み、代わりに、捕捉抗体としてα１１抗体Ａ０３を用いる。この場合、α１１を含む細胞抽出液を加え、以下の改変を施して上記で概略を示したようにＥＬＩＳＡを行う。
【００４６】
一次抗体として、ヒトα１１の細胞質テールに対するポリクローナルウサギ抗体をアッセイバッファーで希釈する（１μｇ／ｍｌ）。二次抗体として、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を用いることができる（例えば、ＤＡＫＯ、１：５０００希釈）。その後、プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４７】
さらなるＥＬＩＳＡアッセイでは、エピトープ修飾または遮断抗体を評価することができる。これは、例えば以下の改変を施して上記で詳細に示したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いるなど、いくつかの方法で行うことができる。
【００４８】
捕捉抗体ならびにα１１を上記で詳細に示したように９６ウェルプレートに加える。一次抗体を適用する前に、プレートをアッセイバッファー中１０μｇ／ｍｌの試験抗体、例えば、エピトープ修飾または遮断抗体とともにインキュベートする。プレートを室温で１５分間インキュベートし、その後、ビオチンとコンジュゲートさせた一次抗体（Ａ０３または対照抗体）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、上記で概略を示したように現像する。
【００４９】
試験抗体、例えば、エピトープ修飾または遮断抗体を評価するために逆サンドイッチＥＬＩＳＡも使用可能である。このＥＬＩＳＡでは、α１１抗体Ａ０３を捕捉抗体として使用することができる。次に、α１１を含有する細胞抽出液を上記で概略を示したように加え、種々のコンジュゲート、可能性のある修飾抗体を一次抗体として用いることができる。
【００５０】
試験抗体が結合に関して二次抗体と競合することができるかどうかを評価するためのさらなる方法は、下記の実施例ＩＶに記載されているような蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ（登録商標））などのフローサイトメトリーによる。
【００５１】
競合抗体を同定するのに好適なさらなる方法は、引用することにより本明細書の一部とされるAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York, ISBN 0-87969-314-2（例えば、５６７〜５６９頁、５７４〜５７６頁、５８３頁および５９０〜６１２頁を参照）に開示されている。
【００５２】
「抗体」とは、実質的に完全な抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここでは、天然ヒト抗体に対して、少なくとも１つのアミノ酸が突然変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにその抗原結合フラグメントおよび誘導体を含むものとする。例えば、この抗体はモノクローナル抗体であり得る。
【００５３】
よって、一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる。
【００５４】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は本質的に完全な抗体からなってよい。「本質的に〜からなる」とは、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、インテグリンα１１サブユニットに対する結合特異性を保持するに十分な完全抗体の一部からなることを意味する。
【００５５】
「抗体」とはまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥをはじめ、あらゆる抗体種を含む。しかしながら、一実施形態において、該抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子などのＩｇＧ分子である。
【００５６】
一実施形態において、該抗体はＩｇＧ４分子である。
【００５７】
さらなる実施形態において、該抗体は非天然抗体である。もちろん、抗体が天然抗体である場合、それは単離された形態（すなわち、天然に見られるものとは異なる）で提供される。
【００５８】
抗体の重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与し、これは初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された事実である。さらなる確証は齧歯類抗体の「ヒト化」により見出された。齧歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合し、結果として得られる抗体が齧歯類により産み出された抗体の抗原特異性を保持するようにすることができる(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855)。
【００５９】
総て１以上の可変ドメインを含む、抗体フラグメントの細菌発現を含む実験から知られているように、抗原特異性は可変ドメインにより付与され、定常ドメインとは独立である。これらの分子にはＦａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041)；Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038)；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)および単離されたＶドメインを含んでなるシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）(Ward et al (1989) Nature 341, 544)。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説はWinter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299に見出される。
【００６０】
よって、「抗原結合フラグメント」とは、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体と結合することができる抗体の機能的フラグメントを意味する。
【００６１】
抗原結合フラグメントの例は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択することができる。
【００６２】
一実施形態において、抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。
【００６３】
完全抗体ではなく抗体フラグメントを用いる利点は数倍である。フラグメントが小さいほど、固体組織の浸透性が良好となるなど、薬理特性の向上をもたらすことができる。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントを大腸菌(E. coli)内で発現させ、そこから分泌させることができ、よって、大量の該フラグメントを容易に生産することができる。
【００６４】
また、修飾型の、例えば、ポリエチレングリコールまたはその他の好適なポリマーの共有結合によって修飾された、抗体およびその抗原結合フラグメントならびにその使用も本発明の範囲内に含まれる。
【００６５】
抗体および抗体フラグメントを作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のin vivo産生の誘発、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング(引用することにより本明細書の一部とされるOrlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al, 1991, Nature 349:293-299)または培養細胞系統によるモノクローナル抗体分子の作製を用いるいくつかの方法のいずれか１つによって作製することができる。これらには、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれる（引用することにより本明細書の一部とされるKohler et al, 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al, 1985. J Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al, 1984. Mol Cell. Biol. 62:109-120参照）。
【００６６】
該抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体は組換え手段によって生産することができる。
【００６７】
選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、"Monoclonal Amtibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)および"Monoclonal Hybridoma Amtibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されているものなどの既知の技術によって製造することができる。
抗体フラグメントはまた、当技術分野で周知の方法を用いて得ることもできる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York参照）。例えば、本発明の抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解またはそのフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物またはその他のタンパク質発現系）での発現によって製造することができる。あるいは、抗体フラグメントは、常法により、完全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることもできる。
【００６８】
当業者であれば、ヒト療法または診断法にはヒト化抗体を使用可能であることが分かるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する、好ましくは最小部分を有する、遺伝的に操作されたキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、望ましい官能基を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域に由来する残基で置換されている抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒトヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも導入された相補性決定領域またはフレームワーク配列にも見られる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に総てを含み、ここでは、相補性決定領域の総てまたは実質的に総てが非ヒト抗体のそれに相当し、フレームワーク領域の総てまたは実質的に総てが関連のあるヒトコンセンサス配列のそれに相当する。ヒト化抗体は最適には、一般にヒト抗体に由来する、Ｆｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部も含む（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Jones et al, 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al, 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596参照）。
【００６９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（導入残基と呼ばれることが多い）は一般に導入可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類相補性決定領域で置換することにより、本質的に記載の通りに行うことができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al, 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science 239:1534-15361；米国特許第４，８１６，５６７号参照）。よって、このようなヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、いくつかの相補性決定領域残基および可能性としてはいくつかのフレームワーク残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体であってよい。
【００７０】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む当技術分野で公知の種々の技術を用いて同定することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al, 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al, 1991. J. Immunol. 147:86-95, Soderlind et al., 2000, Nat Biotechnol 18:852-6およびＷＯ９８／３２８４５参照）。
【００７１】
一度、好適な抗体が得られれば、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロットなどにより、抗体の結合特異性または生物活性などの活性に関してそれらを試験することができる。生物活性は特定の特徴に関する読み取りを用いる種々のアッセイで試験することができる。本発明の抗体の１以上の生物活性の例としては次のものがある。
ａ）軟骨の退化からの保護（例えば、プロテオグリカン含量の減少）
ｂ）関節の炎症（例えば、腫脹）の軽減；および／または
ｃ）炎症性細胞の浸潤の軽減
【００７２】
前記生物活性を試験するのに好適なアッセイの例は当技術分野で公知であり、本明細書の実施例でも示されている。
【００７３】
本発明の第一の態様の一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜３で示されるＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。例えば、該重鎖可変領域は、配列番号９：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSS［配列番号９］
のアミノ酸配列を含んでなり得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。
【００７４】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号４〜６で示されるＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。例えば、該軽鎖可変領域は、配列番号１０：
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLG
［配列番号１０］
のアミノ酸配列を含んでなり得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。
【００７５】
よって、一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００７６】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖を含んでなり得る。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
［配列番号１１］
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPG
AVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS
YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
［配列番号１２］
【００７７】
さらなる例示的実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQWGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQP
PSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGYNER
PSGWDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGHWFGG
GTKLTVLG
［配列番号１３］
【００７８】
この配列は本発明の方法に用いるための例示的「Ａ０３」ｓｃＦｖ分子に相当する（リンカー配列は下線で示される）。所望により、この配列はまた、例えばＣ末端にｃ−ｍｙｃおよび／またはヒスチジンタグを含んでもよい。
EQKLISEEDLSGSAAAHHHHHH［配列番号１４］
【００７９】
本明細書において「アミノ酸」とは、標準的な２０の遺伝的にコードされているアミノ酸およびそれらの対応する「Ｄ」型立体異性体（天然の「Ｌ」型に対して）ωアミノ酸他の天然アミノ酸、非通常アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）および化学的に誘導体化されたアミノ酸（下記参照）を含む。
【００８０】
「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など、アミノ酸が具体的に挙げられている場合、この用語は、特に断りのない限り、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンの双方を指す。他の非通常アミノ酸も、そのポリペプチドに所望の機能特性が保持されている限り、本発明のポリペプチドに好適な成分であり得る。示されているペプチドに関し、それぞれコードされているアミノ酸残基は、適当であれば、通常アミノ酸の通称に相当する一文字表記により表される。
【００８１】
一実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド結合剤はＬ−アミノ酸を含んでなるか、またはそれからなる。
【００８２】
当業者であれば、本発明は、定義されたポリペプチドの変異体、融合体および誘導体、ならびに該変異体または誘導体の融合体、ならびにその使用を、このような変異体、融合体および誘導体がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する限り、包含することが分かるであろう。
【００８３】
変異体は、組換えポリヌクレオチドを用い、当技術分野で周知のタンパク質工学および部位指定突然変異誘発の方法を用いて作製することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
【００８４】
該ポリペプチドの「融合体」とは、他のいずれかのポリペプチドと融合されたポリペプチドを含むものとする。例えば、該ポリペプチドは、該ポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＡタンパク質などのポリペプチドと融合させることができる。このような融合体の例は当業者に周知である。同様に、該ポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴ−ヒスチジンタグまたは周知のＭｙｃタグエピトープなどの、抗体により認識されるエピトープと融合させることができる。該ポリペプチドの任意の変異体または誘導体との融合体もまた、本発明の範囲に含まれる。インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持するなど、望ましい特性を保持する融合物が好ましいと考えられる。
【００８５】
該融合体は本発明のポリペプチドに望ましい特徴を付与するさらなる部分を含んでなることができ、例えば、該部分はポリペプチドの検出もしくは単離、またはポリペプチドの細胞取り込みの促進に有用であり得る。該部分は例えば、当業者に周知のような、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小蛍光団もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光団であり得る。該部分は、当業者に公知のような免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであってもよいし、あるいは当業者に公知のように、ポリペプチドの細胞取り込みを促進することができる親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
【００８６】
「ポリペプチドの変異体」とは、保存性または非保存性のいずれかの、挿入、欠失および置換を含むものとする。特に、このような変化が該ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドの変異体を含むものとする。例えば、このような変化がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を実質的に変化させないポリペプチドの変異体を含むものとする。
【００８７】
ポリペプチド変異体は、上記で示された１以上のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性、例えば、上記で明示された１以上のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００８８】
２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウイスコンシン大学ジェネティックコンピューティンググループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて決定することができ、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して計算されると考えられる。
【００８９】
このアライメントはあるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Thompson et al, 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載の通り）を用いて行うこともできる。
【００９０】
使用するパラメーターは次の通りであり得る：
ファースト・ペアワイズ・アライメント・パラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナルの数；５。スコアリング法：ｘ％。
マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップエクステンションペナルティー；０．０５。
スコアリング法：ＢＬＯＳＵＭ。
【００９１】
あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて、ローカル配列アラインメントを決定することもできる。
【００９２】
本発明のポリペプチド、変異体、融合体または誘導体は、修飾または誘導体化された１以上のアミノ酸を含み得る。
【００９３】
１以上のアミノ酸の化学誘導体は機能的側基との反応により達成することができる。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他の種のエステルおよびヒドラジド基を形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学誘導体として、２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに取って代わることができ、５−ヒドロキシリシンはリシンに取って代わることができ、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに取って代わることができ、ホモセリンはセリンに、また、オルニチンはリシンに取って代わることができる。誘導体としてはまた、必要な活性が維持される限り、１以上のさらなる付加または欠失を含むペプチドも含む。含まれる他の修飾としては、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）などの末端修飾がある。
【００９４】
当業者であれば、ペプチドミメティック化合物も有用であり得ることが分かるであろう。よって、「ポリペプチド」には、インテグリンα１１サブユニットと結合することができるペプチドミメティック化合物を含むものとする。「ペプチドミメティック」とは、治療薬としての特定のペプチドのコンフォメーションおよび望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【００９５】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結されている分子だけでなく、このペプチド結合が逆転している分子も含む。このような逆ペプチドミメティックは、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるMeziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載されているものなど、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。このアプローチには、主鎖に関わるが、側鎖の配向には関わらない変化を含むシュードペプチドの作製が含まれる。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含む逆ペプチドは、タンパク質分解に対して遙かに高い耐性を有する。あるいは、本発明のポリペプチドは、１以上のアミノ酸残基が通常のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって連結されているペプチドミメティック化合物であってもよい。
【００９６】
さらに別法では、このペプチド結合は、これらのアミノ酸残基の炭素原子間にスペースを保持する適当な適当なリンカー部分が用いられる限り、一緒に分配することができ、このリンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ二次元配置を有していれば特に好ましい。
【００９７】
このポリペプチドは、エキソ型タンパク質分解消化に対する感受性を低下させる助けとなるように、そのＮ末端またはＣ末端において便宜にブロッキングすることができると考えられる。
【００９８】
Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの種々の非コードまたは修飾アミノ酸もまた、哺乳類ペプチドを修飾するために使用されてきた。さらに、推定される生活性コンフォメーションが、環化などの共有結合的修飾により、またはラクタムの組み込みにより、または他の種類の架橋により安定化され得る（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. ScLi. USA 75:2636およびThursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166参照）。
【００９９】
多くの合成戦略の中でも一般的な主題は、ペプチドに基づくフレームワークにいくつかの環状部分を導入することであった。この環状部分はペプチド構造のコンフォメーションスペースを制限し、多くの場合、そのペプチドの、特定の生物学的受容体に対する特異性の増強をもたらす。この戦略の付加的利点は、ペプチドに環状部分を導入すると、細胞ペプチダーゼに対する感受性が消失されたペプチドも得られるということである。
【０１００】
よって、例示的ポリペプチドは末端システインアミノ酸を含んでなる。このようなポリペプチドは、末端システインアミノ酸におけるメルカプチド基のジスルフィド結合の形成によりヘテロデティック(heterodetic)形態で、または末端アミノ酸間のアミドペプチド結合の形成によりホモデティック(homodetic)形態で存在し得る。上記で示したように、Ｎ、末端システインとＣ末端システインの間のジスルフィド結合またはアミド結合によって小ペプチドを環化すると、タンパク質分解が低下し、また、構造の堅牢性が高まることで、直鎖ペプチドで見られることがある特異性および半減期の問題が回避され、より特異性の高い化合物が生じ得る。ジスルフィド結合によって環化されたポリペプチドは、タンパク質分解をなお受けやすい遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端を有するが、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシルの間でのアミド結合の形成により環化されたペプチドは、それゆえに、もはや遊離のアミノ末端またはカルボキシ末端を含まない。例えば、本発明のペプチドは、Ｃ−Ｎ結合またはジスルフィド結合のいずれかによって連結可能である。
【０１０１】
本発明は、ペプチドの環化の方法により何ら限定されるものではないが、その環状構造がいずれかの好適な合成方法によって達成され得るペプチドを包含する。よって、ヘテロデティック結合としては、限定されるものではないが、ジスルフィド橋、アルキレン橋またはスルフィド橋による形成を含み得る。ジスルフィド橋、アルキレン橋またはスルフィド橋を含む環状ホモデティックペプチドおよび環状ヘテロデティックペプチドの合成方法は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，６４３，８７２号に開示されている。環化法の他の例は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，００８，０５８号に記載および開示されている。
【０１０２】
環状安定ペプチドミメティック化合物の合成のためのさらなるアプローチとして閉環メタセシス（ＲＣＭ）がある。この方法はペプチド前駆体を合成する工程と、それをＲＣＭ触媒と接触させてコンフォメーション的に制限されたペプチドを得ることを含む。好適なペプチド前駆体は２以上の不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み得る。この方法は固相ペプチド合成技術を用いて行うことができる。この実施形態では、固相支持体に固定されている前駆体をＲＣＭ触媒と接触させた後、生成物を固相支持体から切断し、コンフォメーション的に制限されたペプチドを得る。
【０１０３】
引用することにより本明細書の一部とされるD. H. RichによりProtease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986)に開示されているもう１つのアプローチ，は、酵素阻害剤の設計において遷移状態類似体の概念の適用によりペプチドミミックスを設計したものである。例えば、スタリンの第二級アルコールは、ペプシン基質の切れやすいアミド結合の四面体遷移状態を模倣することが知られている。
【０１０４】
要するに、末端修飾は周知のように、プロテイナーゼ消化のよる感受性を低下させるのに、従って、溶液中、特に、プロテアーゼが存在する可能性のある体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチドの環化もまた有用な修飾であり、環化により形成される安定構造のために、また、環状ペプチドで見られる生物活性の点で好ましい。
【０１０５】
よって、一実施形態において、ポリペプチド結合部分は環状である。しかしながら、別の実施形態では、ポリペプチドは直鎖である。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合部分の薬学上許容される酸または塩基付加塩を含んでなる組成物も含む。本発明において有用な上述の塩基化合物の薬学上許容される酸付加塩を作製するために使用される酸は、無毒な酸付加塩、すなわち、とりわけ塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、二酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩などの薬理学上許容される陰イオンを含む塩を形成するものである。
【０１０７】
薬学上許容される塩基付加塩もまた、本発明の化合物の薬学上許容される塩形態を作製するために使用可能である。
【０１０８】
本来酸性である本発明の化合物の薬学上許容される塩基塩を作製するために試薬として使用可能な化学塩基は、このような化合物と無毒な塩基塩を形成するものである。このような無毒な塩基塩としては、限定されるものではないが、とりわけ、アルカリ金属陽イオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）ならびにアルカリ土類金属陽イオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えば、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）、および低級アルカノールアンモニウムおよび薬学上許容される有機アミンの他の塩基塩などのような薬理学上許容される陽イオンに由来するものが挙げられる。
【０１０９】
本明細書に記載のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成することができる。好適ないずれの凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーク乾燥）および／または再構成技術を使用してもよい。当業者であれば、凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性損失をもたらし得ること（例えば、通常の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大きな活性損失を有する傾向がある）、および補償するために使用レベルは上方調整しなければならない場合があることが分かるであろう。一実施形態では、凍結乾燥（フリーズドライ）したポリペプチドは、再水和した際にその活性（凍結乾燥前）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を失活する。
【０１１０】
当業者であれば、本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメント、その変異体、融合体および誘導体がその単量体形態、またはホモもしくはヘテロ多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体など）形態で存在し得ることが分かるであろう。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、治療部分および／または検出可能部分を含んでなる。
【０１１２】
「検出可能部分」とは、その部分が、本発明の化合物を患者に投与した後に標的部位に局在した際に、一般には非侵襲的に身体および局在した標的の部位の外側から検出可能なものである。検出可能部分は、検出可能な種の産生に直接または間接的のいずれかで関与する単一の原子または分子であり得る。よって、本発明のこの実施形態の結合剤は画像化および診断に有用である。
【０１１３】
好適な検出可能部分は医化学では周知であり、これらの部分とポリペプチドおよびタンパク質との連結は当技術分野で周知である。検出可能部分の例としては、限定されるものではないが、次のものが挙げられる：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ）、放射性核種（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光剤、ビオチニル基および二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的立体障害を軽減するための、様々な長さのスペーサーアームによって結合させる。
【０１１４】
放射性標識またはその他の標識は、既知の方法で本発明のポリペプチドに組み込むことができる。例えば、結合部分がポリペプチドであれば、生合成可能であるか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いる化学アミノ酸合成によって合成することができる。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、結合部分内のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０はリシン残基を介して結合させることができる。１２３Ｉを組み込むためにはヨードゲン法（引用することにより本明細書の一部とされるFraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57）を使用することができる。参照文献（引用することにより本明細書の一部とされる"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989）は、他の方法を詳細に記載している。
【０１１５】
上記のような抗体および抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、炎症性症状の処置に有効性を有する。
【０１１６】
「処置」とは、対象／患者の治療的処置および予防的処置の双方を含むものとする。「予防的」とは、患者または対象における炎症性症状の見込みを予防または軽減する、本明細書に記載のポリペプチドまたは処方物の使用を包含するために用いる。
【０１１７】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される炎症性症状の処置に有効性を有し得る。
【０１１８】
一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、関節リウマチまたは骨関節炎などの関節疾患の処置において有効性を有する。このような有効性は、マウスにおける関節炎モデル（実施例参照）などの好適な動物モデルで決定することができる。
【０１１９】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vitroおよび／またはin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）する能力を持ち得る。
【０１２０】
「調整する」とは、コラーゲンの分解速度を高める、または低下させることを含むものとする。コラーゲンの分解の阻害は完全なものであっても部分的なものであってもよい。例えば、コラーゲンの分解は、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の不在下でのコラーゲン分解に比べて１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害され得る。
【０１２１】
該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、次の医学的に有用な特性の１以上を示し得る。
ａ）軟骨の退化からの保護（例えば、プロテオグリカン含量の減少）
ｂ）関節の炎症（例えば、腫脹）の軽減；および／または
ｃ）炎症性細胞の浸潤の軽減
【０１２２】
上記の特性の試験方法は下記の実施例に記載されている。
【０１２３】
ゆえに、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、同じ動物モデルで腫脹を軽減する（ＮＳＡＩＤ）または腫脹および細胞浸潤（抗ＴＮＦ抗体）を軽減する関節疾患に対する確立された療法を超える有利な特性を有し得るが、３つのパラメーター総てには影響を及ぼすことはできない。
【０１２４】
よって、本発明は次の方法：
ａ）軟骨部位に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、軟骨を分解から保護するための方法；
ｂ）関節に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、関節炎症を軽減するための方法；および
ｃ）関節に上記のような抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、炎症性細胞の関節への浸潤を軽減するための方法
を提供する。
【０１２５】
特に、本発明の第四の態様は、炎症性症状を有する個体を処置するための方法を提供し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２６】
本発明の第五の態様は、個体において炎症性症状を診断または予後するための方法を提供し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２７】
第六の態様は、個体の身体において、炎症性症状に関連するインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を画像化するための方法を記載し、該方法は個体に有効量の上記で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む。
【０１２８】
本発明の上記態様の一実施形態では、該方法は、個体において該化合物の位置を検出する工程をさらに含む。
【０１２９】
本発明の第七の態様は、個体において炎症性症状の進行を監視するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）第一の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；
（ｂ）第二の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、インテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；および
（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を比較すること
を含み、工程（ａ）と比べた場合の工程（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量の増加が炎症性症状の進行の指標となる。
【０１３０】
本発明の第八の態様は、炎症性症状と関連する細胞を同定する方法を提供し、該方法は供試細胞のサンプル中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること、およびそれを陽性対照および／または陰性対照に対するインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量と比較することを含む。
【０１３１】
該陽性対照は炎症性症状に罹患している対象由来の細胞を含んでよく、該陰性対照は炎症性症状に罹患していない健康な対象に由来する細胞を含んでよい。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、該細胞は軟骨細胞、繊維芽細胞および間葉細胞（例えば、間葉幹細胞）からなる群から選択される。
【０１３３】
サンプル中のインテグリンα１１サブユニットの量は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。生体サンプル中のインテグリンα１１タンパク質レベルをアッセイするのに好適な方法には、抗体に基づく技術が含まれる。例えば、組織中のインテグリンα１１タンパク質発現は、従来の免疫組織学的方法を用いて検討することができる。これらの場合、一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって特異的認識が提供されるが、二次検出系は蛍光、酵素またはその他のコンジュゲートされた二次抗体が利用可能である。結果として、病理学的検査用の組織切片の免疫組織学的染色が得られる。また、ウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためにインテグリンα１１タンパク質を遊離させるために、例えば尿素および中性洗剤を用いて組織を抽出することもできる（引用することにより本明細書の一部とされるJalkanen et al, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al, 1987, J. Cell. Biol 105:3087-3096）。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術では、インテグリンα１１タンパク質の定量は、標品として単離されたインテグリンα１１タンパク質を用いて果たすことができる。この技術は体液にも適用することができる。
【０１３４】
一実施形態において、供試細胞は、対応する正常な健康細胞に比べての、インテグリンα１１サブユニットタンパク質レベルのアップレギュレーションにより、炎症性症状と関連する細胞として同定される。「アップレギュレーションされる」とは、インテグリンα１１サブユニットタンパク質が、正常（健康）細胞におけるインテグリンの発現に比べて少なくとも１０％上昇していることを意味する。例えば、インテグリンα１１サブユニットタンパク質のレベルは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはさらには１００％もしくはそれを超えて上昇され得る。
【０１３５】
さらなる実施形態において、上記の方法は、個体において該化合物の位置を検出する工程をさらに含む。
【０１３６】
化合物または抗体の検出は、臨床的画像化および診断の技術分野で周知の方法を用いて果たすことができる。必要とされる特定の方法は、該化合物または抗体に結合される検出可能な標識の種類によって異なる。例えば、放射性原子はオートラジオグラフィーまたはあるいは場合によっては上記のような磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて検出可能である。
【０１３７】
本発明の上記方法のさらなる実施形態において、炎症性症状は、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される。
【０１３８】
例えば、炎症性症状は関節リウマチまたは骨関節炎などの関節疾患であり得る。
【０１３９】
本発明の第九の態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、前記抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該その変異体もしくはその誘導体の融合体と競合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する（ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【０１４０】
好適な抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、本発明の使用および方法に関して上記されている。
【０１４１】
インテグリンα１１サブユニットとの結合に関して、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができるこのような抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、当技術分野で周知の技術を用いて同定することができる。例えば、まずファージディスプレー抗体ライブラリーをスクリーニングしてインテグリンα１１サブユニットと結合する抗体を同定し、その後、これらの抗体を、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合するものを同定するためにさらに試験することができる。
【０１４２】
本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体の一実施形態において、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体は細胞（軟骨細胞または繊維芽細胞など）の表面に局在する。
【０１４３】
当業者ならば、本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は本発明の上記使用および方法において有用性を有することが分かるであろう。
【０１４４】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子「と競合することができる」とは、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体は、配列番号１１のｓｃＦｖ分子とインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合を少なくとも部分的に阻害する、または干渉することができることを意味する。競合結合は、ＥＬＩＳＡ（上記の通り）などの当業者に周知の方法によって決定することができる。
【０１４５】
例えば、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該その変異体もしくは誘導体の融合体は、配列番号１１のｓｃＦｖ分子とインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、３５％、またはさらには１００％阻害することができる。
【０１４６】
一実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる。
【０１４７】
もう１つの実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる。
【０１４８】
本明細書において「エピトープ」とは、抗体が結合する分子の部位、すなわち、抗原のある分子領域を意味するものとする。エピトープは、例えばアミノ酸配列、すなわち一次構造により決定される直鎖エピトープ、または二次構造、例えば、ペプチド鎖の、βシートまたはαヘリカルへの折りたたみにより、またははヘリックスもしくはシートが折りたたまれ、または配列されて抗原の三次元構造を与える方法である三次構造により定義される三次元エピトープであってよい。
【０１４９】
本発明の第九の態様の一実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる。
【０１５０】
本発明の第九の態様のもう１つの実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、およびＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）からなる群から選択される）抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる。
【０１５１】
該抗体はモノクローナル抗体などの組換え抗体であり得ると考えられる。例えば、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントはヒトまたはヒト化されていてもよい。
【０１５２】
本発明の第九の態様のさらなる実施形態において、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、in vitroおよび／またはin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）することができる。
【０１５３】
本発明の第九の態様の抗体、抗原結合フラグメント、変異体、融合体および誘導体は、例えば、関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される炎症性症状の処置において有用性を有し得る。
【０１５４】
本発明の第九の態様のさらなる実施形態では、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、治療部分および／または検出可能部分（上記の通り）をさらに含んでなる。
【０１５５】
本発明の第十の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードする核酸分子、またはその成分ポリペプチド鎖を提供する。
【０１５６】
単離された核酸分子は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を発現するのに好適である。「発現するのに好適とは、その核酸分子が、翻訳されてポリペプチド、例えばＲＮＡを形成し得るポリヌクレオチドであること、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）がプラスミドなどの発現ベクターに、発現に適切な配向および適正なリーディングフレームで挿入されることを意味する。このポリヌクレオチドは、任意の所望の宿主によって認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列と連結することができ、このような制御を発現ベクターに組み込むことができる。
【０１５７】
よって、該核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１５８】
該核酸分子（またはポリヌクレオチド）は、本発明のポリペプチド産物を産生するのに好適な宿主で発現させることができる。よって、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる教示に照らして適宜改変された、発現ベクターを構築するための既知の技術に従って使用することができ、次にこれを用いて、本発明のポリペプチドの発現および産生に適当な宿主細胞を形質転換する（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるSambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York参照）。
【０１５９】
ポリペプチドをコードする核酸分子は、適当な宿主へ導入するための広範な他のポリヌクレオチド配列と連結させることができる。この付随ポリヌクレオチドは、宿主の性質、宿主へのポリヌクレオチドの導入様式、およびエピソーム維持が望ましいか組み込みが望ましいかによって異なる。
【０１６０】
要するに、適当な宿主内で、その核酸分子によりコードされているポリペプチド結合部分または化合物を発現することができる核酸分子を含んでなる発現ベクターを構築すればよい。
【０１６１】
例えば相補性付着末端を介して核酸分子、特にＤＮＡを作動可能なようにベクターに連結するための種々の方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡ中に挿入されるＤＮＡセグメントに相補的ホモポリマートラクトを付加することができる。次に、このベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって連結し、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１６２】
１以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する別法を提供する。例えばエンドヌクレアーゼ制限消化によって作製されたＤＮＡセグメントをバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌(E. coli)ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する（この酵素はそれらの３’−５’−エキソヌクレオ分解活性を有する、突出した３’一本鎖末端を除去し、それらの重合活性を有する陥凹した３’末端を埋める）。
【０１６３】
従って、これらの活性の組合せで平滑末端ＤＮＡセグメントが生じる。次に、この平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素の存在下、よりモル過剰のリンカー分子とともにインキュベートする。よって、この反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。その後、これらのＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で切断し、そのＤＮＡセグメントのものに適合する末端を作り出す酵素で切断した発現ベクターに連結する。
【０１６４】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USAをはじめとするいくつかの供給者から市販されている。
【０１６５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾するための望ましい方法がＰＣＲの使用である。この方法は、例えば、好適な制限部位における操作によって好適なベクターにＤＮＡを導入するために使用可能であるか、または当技術分野で知られているように、他の有用な方法でＤＮＡを修飾するために使用可能である。
【０１６６】
この方法において、酵素的に増幅させるＤＮＡを、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的プライマーに隣接させる。該特異的プライマーは、当技術分野で公知の方法を用い、発現ベクターにクローニングするために使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
【０１６７】
次に、このＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）を好適な宿主内で発現させて、本発明の化合物またはその結合部分を含んでなるポリペプチドを産生させる。よって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、本明細書に含まれる教示に照らして適宜改変された既知の技術に従って用いて発現ベクターを構築することができ、次に、これを用いて本発明の化合物またはその結合部分の発現および産生に適当な宿主細胞を形質転換させる。このような技術としては、１９８４年４月３日にRutter et alに対して発行された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日にWeissmanに対して発行された米国特許第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日にCrowlに対して発行された米国特許第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日にMark et alに対して発行された米国特許第４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日にGoeddel対して発行された米国特許第４，６７８，７５１号、１９８７年１１月３日にItakura et alに対して発行された米国特許第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日にMurrayに対して発行された米国特許第４，７１０，４６３号、１９８８年７月１２日にToole, Jr. et alに対して発行された米国特許第４，７５７，００６号、１９８８年８月２３日にGoeddel et alに対して発行された米国特許第４，７６６，０７５号および１９８９年３月７日にStalkerに対して発行された米国特許第４，８１０，６４８号に開示されているものが含まれる（これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０１６８】
本発明の方法に用いるためのポリペプチド結合部分をコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は、適当な宿主に導入するための広範な他のＤＮＡ配列と連結させることができる。この付随ＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのポリヌクレオチドの導入様式、およびエピソーム維持が望ましいか組み込みが望ましいかによって異なる。
【０１６９】
一般に、該ＤＮＡは、プラスミドなどの発現ベクターに、発現に適切な配向および適正なリーディングフレームで挿入される。必要に応じて、該ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列と連結することができ、このような制御は発現ベクター内で一般に利用可能である。次に、このベクターを、標準的な技術によって宿主へ導入する。一般に、総てではないが、種祝はこのベクターによって形質転換される。よって、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。ある選択技術には、発現ベクターに、抗生物質耐性など、形質転換細胞において選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列を、必要な制御配列とともに組み込むことを含む。あるいは、このような選択可能な形質の遺伝子は別のベクター上にあってもよく、これを用いて所望の宿主細胞同時形質転換する。
【０１７０】
次に、本発明の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を可能とする十分な時間、本明細書に開示されている教示に照らして当業者に公知の適当な条件下で培養し、その後それを回収することができる。
【０１７１】
多くの発現系が知られており、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、糸状真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が含まれる。
【０１７２】
これらのベクターは一般に、そのベクターが他の非原核細胞種での発現に用いられるとしても、原核生物での増殖のためのＣｏｌＥ１ ｏｒｉなどの原核生物レプリコンを含む。これらのベクターはまた、それで形質転換された大腸菌などの細菌宿主細胞内でそれらの遺伝子の発現（転写および翻訳）を命令し得る原核生物プロモーターなどの適当なプロモーターも含み得る。
【０１７３】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こさせるＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。例示的細菌宿主に適合するプロモーター配列は一般に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便宜な制限部位を含むプラスミドベクターで提供される。
【０１７４】
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA)から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにPharmacia, Piscataway, NJ, USAから入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【０１７５】
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway, NJ, USAから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現を駆動するためにＳＶ４０後期プロモーターを使用し、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞で最大発現レベルが見られる。
【０１７６】
誘導型の哺乳類発現ベクターの例は、これもまたPharmaciaから入手可能なｐＭＳＧである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現を駆動するためにマウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導型プロモーターを用いる。
【０１７７】
有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０１７８】
多様な宿主細胞とともに用いるための他のベクターおよび発現系も当技術分野で周知である。
【０１７９】
宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよい。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、一般に、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USAから入手可能な大腸菌株ＤＨ５およびRockville, MD, USAのthe American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能なＲＲ１（Ｎｏ． ＡＴＣＣ ３１３４３）などの大腸菌株である。例示的真核生物の宿主細胞としては、酵母、昆虫および哺乳類細胞が挙げられ、マウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞系統および腎臓細胞系統などの脊椎動物細胞が好ましい。酵母宿主細胞としては、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから一般に入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１がある。例示的哺乳類宿主細胞としてが、ＡＴＣＣからＣＲＬ １６５８として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。例示的昆虫細胞としては、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクト可能なＳｆ９細胞がある。
【０１８０】
本発明のＤＮＡ構築物による適当な細胞宿主の形質転換は周知の方法によって達成され、その方法は用いるベクターの種類によって異なる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110およびSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY（これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。引用することにより本明細書の一部とされるBeggs (1978) Nature 275, 104-109の方法も有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤は、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手可能である。
【０１８１】
エレクトロポレーションも細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０１８２】
例えば、多くの細菌種が、引用することにより本明細書の一部とされるLuchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載されている方法により形質転換可能である。２５μＦＤにて６２５０Ｖ／ｃｍを用いる２．５ＰＥＢに懸濁させたＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーション後に、一貫して最大数の形質転換体が回収される。
【０１８３】
エレクトロポレーションにより酵母を形質転換するための方法は、引用することにより本明細書の一部とされるBecker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182に開示されている。
【０１８４】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の発現構築物の導入から得られた細胞を増殖させて、本発明のポリペプチドを産生することができる。細胞を採取し、溶解させ、それらのＤＮＡ内容物を、引用することにより本明細書の一部とされるSouthern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208によって記載されているものなどの方法を用い、ＤＮＡの存在に関して調べることができる。あるいは、上清におけるタンパク質の存在を下記のような抗体を用いて検出することもできる。
【０１８５】
組換えＤＮＡの存在に関して直接アッセイする他、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現を命令することができる場合には、周知の免疫学的方法によって形質転換の成功を確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。
【０１８６】
形質転換されたと思われる細胞のサンプルを採取し、好適な抗体を用い、タンパク質に関してアッセイする。
【０１８７】
宿主細胞は非ヒト動物体内の宿主細胞であってもよい。よって、導入遺伝子の存在のために本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。一実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、マウスなどの齧歯類である。トランスジェニック非ヒト動物は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。
【０１８８】
宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は当技術分野で周知である。産生される本発明の化合物（またはその結合部分）は宿主細胞によって異なると考えられる。例えば、酵母または細菌細胞などのある種の宿主細胞は、違ったように翻訳後修飾され得る本発明の化合物（またはその結合部分）の形態の産生をもたらし得る異なった翻訳後修飾系を持っていても持っていなくてもよい。
【０１８９】
一実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。あるいは、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばヒト細胞または類人猿細胞などの霊長類目由来の細胞、またはラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、リス細胞、モルモット細胞、マーモット細胞もしくはビーバー細胞などの齧歯目由来の細胞であり得る。
【０１９０】
さらなる実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞またはＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞である。
【０１９１】
よって、本発明の第１１の態様は、本発明の第十の態様の核酸分子を含んでなるベクターを提供する。
【０１９２】
同様に、本発明の第１２の態様は、本発明の第十の態様の核酸分子または本発明の第１１の態様のベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
【０１９３】
本発明の第１３の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を作製する方法を提供し、該方法は、コードされている抗体もしくはその抗原結合フラグメントの発現を可能とする条件下で本発明の第１２の態様の宿主細胞を培養することを含む。このような方法はまた、本発明の方法で用いるための抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を産生するために使用することもできる。
【０１９４】
このようなポリペプチドは、ウサギ網状赤血球ライゼートまたは麦芽ライゼート（Promegaから入手可能）などの市販のin vitro翻訳系を用いてin vitroで産生することができる。例えば、この翻訳系はウサギ網状赤血球ライゼートであり得る。便宜には、ＴＮＴ転写−翻訳系(Promega)のように、この翻訳系を転写系と組み合わせることができる。この系により、コードＤＮＡポリヌクレオチドから好適なｍＲＮＡ転写物を翻訳と同じ反応で生産することができる。
【０１９５】
当業者であれば、上記の医薬および薬剤が医学および獣医学双方の分野で有用性を有することがさらに分かるであろう。よって、これらの医薬および薬剤はヒトおよび非ヒト動物（ウマ、イヌ、マウス、ラット、霊長類、サル、ブタおよびネコなど）の双方の処置に使用可能である。しかしながら、好ましくは、患者はヒトである。
【０１９６】
本発明の第１４の態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体と薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１９７】
本明細書において「医薬組成物」とは、治療上有効な処方物を意味する。
【０１９８】
本明細書において「治療上有効な量」または「有効量」または「治療上有効」とは、与えられた条件および投与計画に対して治療作用をもたらす量（例えば、コラーゲンの分解を阻害するのに十分な量）を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち、担体または投与ビヒクルをともに所望の治療作用をもたらすように計算された有効物質の所定の量である。さらに、それは宿主の活動、機能および応答において臨床上有意な欠損を軽減または回避するのに十分な量を意味するものとする。あるいは、治療上有効な量は、宿主において臨床上有意な症状における改善をもたらすに十分なものである。当業者であれば分かるように、化合物の量はその具体的活性によって異なり得る。好適な用量は、必要とされる希釈剤とともに所望の治療作用をもたらすように計算された有効組成物の所定量を含み得る。本発明の組成物の製造のための方法および使用では、治療上有効な量の有効成分が提供される。治療上有効な量は、当技術分野で周知のように、齢、体重、性、症状、合併症、他の疾病などの患者の特徴に基づき、熟練の医師または獣医師によって決定することができる。
【０１９９】
当業者であれば、このような有効量の該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、その処方物は、単回のボーラス投与（すなわち、急性投与）として送達することもでききるし、あるいはより好ましくは、経時的な一連の投与（すなわち、慢性投与）としても送達することもできることが分かるであろう。
【０２００】
当業者であれば、本発明の方法で用いるための抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、炎症性症状の処置のための１以上の他の慣例薬と組み合わせて投与できることがさらに分かるであろう。
【０２０１】
例えば、関節リウマチの場合、好適な慣例薬としては、限定されるものではないが、疾病改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ、例えば、メトトレキサート）、金塩、抗マラリア薬、スルファサラジン、テトラサイクリン、シクロスポリン、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、レフルノミド(Arava; Aventis)、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）阻害剤、例えば、エタネルセプト(エンブレル;Amgen)、インフリキシマブ(Remicade; J&J/Centocor)およびアダリムマブ(Humira; Abbott)が挙げられる。
【０２０２】
ＯＡの場合、好適な慣例薬としては、限定されるものではないが、アセトアミノフェン（パラセタモールとしても知られる）などの鎮痛薬または抗炎症薬、またはＣＯＸ２阻害剤などのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を阻害する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＭＭＰ阻害剤などの疾病改善骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、またはインターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤が挙げられる。
【０２０３】
本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、用いる化合物の有効性／毒性に応じて種々の濃度で処方することができる。一実施形態では、この処方物は本発明の薬剤を０．１μＭ〜１ｍＭの間、例えば１μＭ〜１００μＭの間、５μＭ〜５０μＭの間、１０μＭ〜５０μＭの間、２０μＭ〜４０μＭの間、または約３０μＭ濃度で含んでなる。in vitro適用では、処方物はより低濃度の、例えば０．００２５μＭ〜１μＭの間の本発明の化合物を含み得る。
【０２０４】
よって、炎症性症状の処置に有効な量（上記の通り）の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を含んでなる医薬処方物が提供される。
【０２０５】
当業者であれば、これらの医薬および薬剤は一般に、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択された好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与されることが分かるであろう（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA参照）。
【０２０６】
例えば、これらの医薬および薬剤は、即放出、遅延放出または徐放性適用のための、香味剤または着色剤を含み得る錠剤、カプセル剤、小卵剤(ovule)、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で経口投与、頬側投与または舌下投与することができる。これらの医薬および薬剤はまた陰茎海綿体注射によって投与することもできる。
【０２０７】
このような錠剤は、微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（例えば、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合体シリケートなどの崩壊剤、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアラビアガムなどの造粒結合剤を含み得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの滑沢剤も含み得る。
【０２０８】
ゼラチンカプセル剤中の増量剤と類似の種の固体組成物も使用可能である。これに関する例示的賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤では、本発明の化合物は種々の甘味剤または香味剤、着色物質または色素と、また乳化剤および／または沈殿防止剤と、また水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにその組合せと組み合わせることができる。
【０２０９】
これらの医薬および薬剤はまた、非経口投与、例えば、静脈内投与、関節内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、脳室内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与または皮下投与することもできるし、あるいは注入技術により投与することもできる。それらは、例えば血液と等張な溶液を作製するために十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでもよい無菌水溶液の形態で最良に用いられる。これらの水溶液は必要であれば適宜緩衝させなければならない（例えば、ｐＨ３〜９）。無菌条件下での好適な非経口処方物の作製は、当業者に周知の標準的な製薬技術により容易に達成される。
【０２１０】
非経口投与に好適な処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と等張の処方物とする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。これらの処方物は、例えば密閉アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多回用量容器で提供することができ、注射直前に例えば注射水などの無菌液体担体を加えるだけのフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することもできる。即時調合注射溶液および懸濁液は、これまでに記載されている種の無菌粉末、顆粒および錠剤から作製し得る。
【０２１１】
ヒト患者への経口および非経口投与では、これらの医薬および薬剤の一日用量レベルは通常、成人１人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回用量または分割用量で投与される。
【０２１２】
疾病の予防または治療のための、抗体の適当用量は処置される疾病の種類、その疾病の重篤度および経過、抗体またはそのフラグメントが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、従前の療法の経過、および患者の臨床歴および抗体またはそのフラグメントに対する応答によって異なる。本発明の抗体、抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体は、１回で、または一連の処置にわたって患者に適宜投与される。疾病の種類および重篤度によって、抗体またはそのフラグメント約０．０１５〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇが患者への投与のための初期用量である。投与は例えば１回以上の独立した投与によってもよいし、あるいは持続的注入によってもよい。症状によって数日またはそれ以上にわたる反復投与では、病徴の望ましい抑制または緩和が起こるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与計画が有用である場合もあり、それらを排除するものではない。
【０２１３】
症状の緩和、疾病の予防または治療における抗体、抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体の有効性は、本発明の抗体のものとは異なるエピトープに対する別の抗体またはそのフラグメント、または意図する治療適応に関して知られている１以上の慣例治療薬など、同じ臨床適応に有効な別の薬剤との連続投与または組合せ投与により改善し得る。
【０２１４】
このような適応に影響を及ぼす好適な薬学上許容される薬剤は、例えば骨関節炎、関節リウマチなどの関節疾患のような炎症性疾患の処置のための、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症薬；例えば抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの抗シトルチン薬；疼痛管理処置のための整形外科術後の術後使用のための局部麻酔薬またはアテローム斑の処置のための抗高脂血症薬、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）といった抗炎症薬であり得る。
【０２１５】
これらの医薬および薬剤はまた鼻内投与または吸入による投与が可能であり、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の好適なガスなどの好適な噴射剤を用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、ドライパウダー吸入器またはエアゾールスプレー剤形の形態で便宜に送達される。加圧エアゾールの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、エタノールと噴射剤の混合物を溶媒として用い（さらに、例えばトリオレイン酸ソルビタンなどの滑沢剤を含んでもよい）、有効化合物の溶液または懸濁液を含み得る。吸入器または通気器に用いるためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含むように処方することができる。
【０２１６】
エアゾールまたはドライパウダー処方物は、各計量量または「ひと吹き」が患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように調整することができる。エアゾールによる一日総量は患者ごとに異なり、１回またはそれを超える回数、通常には、１日にさたる分割量で投与することができると考えられる。
【０２１７】
あるいは、これらの医薬および薬剤は、坐剤または膣坐剤の形態で投与することもできるし、あるいはローション、溶液、クリーム、軟膏またはダスティングパウダーの形態で局所適用することもできる。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用により経皮投与することもできる。それらはまた、眼内経路によって投与することもできる。
【０２１８】
皮膚への局所適用では、これらの医薬および薬剤は、例えば以下：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水の１以上の混合物に懸濁または溶解させた有効化合物を含有する好適な軟膏として処方することができる。あるいは、それらは、例えば以下：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１以上の混合物に懸濁または溶解させた好適なローションまたはクリームとして処方することもできる。
【０２１９】
口内局所投与に好適な処方物としては、香味基剤、通常はスクロースおよびアラビアガムまたはトラガカントガム中に有効成分を含んでなるトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に有効成分を含んでなる香錠；ならびに好適な液体担体中に有効成分を含んでなるマウスウォッシュがある。
【０２２０】
これらの医薬または薬剤がポリペプチドである場合には、マイクロスフェアなどの徐放性薬物送達系を用いるのが好ましい場合がある。これらは特に注射頻度を減らすために設計される。このような系の一例として、生分解性マイクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を封入するNutropin Depotがあり、一度注射すると、長時間かけてゆっくりｒｈＧＨを放出する。
【０２２１】
徐放性免疫グロブリン組成物はまた、リポソームに捕捉された免疫グロブリンも含む。免疫グロブリンを含有するリポソームは、それ自体公知の方法によって作製される。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-92 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号；同第４，５４４，５４５号；同第６，１３９，８６９号および同第６，０２７，７２６号参照。通常には、これらのリポソームは、液体含量が約３０モル％（ｍｏｌ％）コレステロールよりも高い小型（約２００〜約８００オングストローム）の単層種であり、選択された割合は最適な免疫グロブリン療法向けに調整される。
【０２２２】
あるいは、ポリペプチド医薬および薬剤は、必要な部位に直接薬剤を放出する外科的に埋め込んだデバイスにより投与することもできる。
【０２２３】
また、タンパク質およびポリペプチドの投与のためにエレクトロポレーション療法（ＥＰＴ）系も使用可能である。細胞にパルス電場を送達するデバイスは薬剤に対する細胞膜の浸透性を高め、細胞内薬物送達の著しい増強をもたらす。
【０２２４】
また、タンパク質およびポリペプチドは、エレクトロインコーポレーション（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚の表面で直径３０ミクロンまでの小粒子がエレクトロポレーションで用いられるものと同一または類似の電気パルスを受ける場合に生じる。ＥＩでは、これらの粒子は角質層を経て皮膚のより深部に送られる。これらの粒子には薬剤または遺伝子を付加またはコーティングすることができ、あるいは単に皮膚に化合物が侵入可能な孔を開ける「弾丸」としても働き得る。
【０２２５】
タンパク質およびポリペプチド送達の別法は、温度感受性ＲｅＧｅｌ注入である。体温より低いとＲｅＧｅｌは注入可能な液体であるが、体温ではすぐにゲルリザーバーを形成し、これはゆっくり浸食し、既知の安全な生分解性ポリマーへと溶解する。このバイオポリマーが溶解するにつれ、有効薬剤が経時的に送達される。
【０２２６】
タンパク質およびポリペプチド医薬はまた経口送達することもできる。このような１つの系では、タンパク質およびポリペプチドを同時送達するために、身体のビタミンＢ１２の経口取り込みの天然プロセスを用いる。ビタミンＢ１２取り込み系を付加することで、これらのタンパク質またはポリペプチドは腸管壁を経て移動可能である。ビタミンＢ１２類似体と薬剤の間で複合体が形成され、この複合体のビタミンＢ１２部分における内性因子（ＩＦ）に対する有意な特異性と複合体の薬剤部分の有意な生活性が保持される。
【０２２７】
本発明の第九の態様の抗体および抗体由来結合剤は、上記のような医薬組成物を含んでなるキットの形態で提供され得る。よって、炎症性症状の処置に用いるためのキットが提供され得る。
【０２２８】
あるいは、キットは、診断において用いるのに好適な、本発明の検出可能な抗体または抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含み得る。このような診断キットは、個包装試薬としての診断薬を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含み得る。包装試薬の使用説明書も一般に含まれる。このような説明書は一般に、試薬濃度および／または混合する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の持続時間、温度、バッファー条件などの少なくとも１つのアッセイ法パラメーターを記載した有形表示物を含む。
【０２２９】
本発明のさらなる態様は、炎症性症状を処置するための候補化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、
ａ）供試化合物を準備する工程；
ｂ）該化合物の、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、以下のＣＤＲ配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくは誘導体の融合体と競合する能力を試験する工程
を含み、
【０２３０】
該試験化合物がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して競合することができれば、それは炎症性症状を処置するための候補化合物として同定される。
【０２３１】
競合結合はＥＬＩＳＡなど、当技術分野で周知の方法を用いてアッセイすることができる（上記参照）。
【０２３２】
一実施形態において、本方法は、コラーゲンの分解を調整（例えば、阻害）する化合物の能力を試験する工程をさらに含む。
【０２３３】
「調整する」とは、コラーゲンの分解速度を高める、または低下させることを含む。コラーゲンの分解の阻害は完全であっても部分的であってもよいと考えられる。例えば、コラーゲン分解は、試験化合物の不在下でのコラーゲンの分解と比べて、１０％またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害され得る。
【０２３４】
便宜には、試験工程のいくつかまたは総てがin vivoで行われる。
【０２３５】
あるいは、試験工程のいくつかまたは総てが、例えば、免疫組織化学法（例えば、サフラニンでの染色）を用いてin vitroで行ってもよい（下記の実施例参照）。
【０２３６】
例示的試験化合物としては、ポリペプチド、またはその融合体もしくは誘導体、または該誘導体の融合体が含まれる。例えば、試験化合物は抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、またが該変異体もしくはその誘導体の融合体であり得る。
【０２３７】
一実施形態において、試験化合物は完全な抗体である。
【０２３８】
あるいは、試験化合物は、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントであり得る。
【０２３９】
本発明のさらなる態様は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体により定義されるエピトープを提供し、ここで、該抗体またはフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる。
【０２４０】
一実施形態において、該エピトープは以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEEKRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEΓNFHLLGNLWLRSLICALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体を含んでなるか、またはそれからなる。
【０２４１】
その例示的変異体、融合体およびフラグメントは上記に開示されている。
【０２４２】
よって、さらなる態様として、本発明はまた、以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDWSINCNIRLV
PNQEΓNFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体を含んでなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。
【０２４３】
該ポリペプチドは免疫応答を刺激し得るので、免疫原性エピトープとして働く。
【０２４４】
一実施形態において、該ポリペプチド、フラグメント、その融合体または変異体は、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体と結合することができ、
【０２４５】
ここで、該抗体またはフラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号Ｉ］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる。
【０２４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第九の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または産生するための、上記のエピトープおよび単離されたポリペプチドの使用を提供する。
【０２４７】
本発明はまた、上記のエピトープおよび単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子ならびにベクター、宿主細胞およびそれを作製する方法を包含する。
【０２４８】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り、複数形を含む。よって、例えば、「ある抗体」という場合には、複数のこのような抗体を含み、「その用量」という場合には、１以上の用量および当業者に公知のその等価物を含むなどである。
【０２４９】
以下、本発明のある特定の態様を用いる限定されない例を、次の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】抗α１１インテグリン結合剤に関するｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体ライブラリーのスクリーニング。スクリーニングされた１９２のα１１インテグリン活性ｓｃＦｖクローンをα１１インテグリンでトランスフェクトされた２９３細胞と結合するかどうかを確認したが、大腸菌により発現されるＨｉｓタグｓｃＦｖクローンを、インテグリントランスフェクト細胞（図面に示されている通り）、マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ、Ｃｙ５コンジュゲート抗マウスｍＡｂ試薬と同時インキュベーションした後、ＦＭＡＴマクロコンフォーカルによるスクリーニング装置でスクリーニングすることによっては、α１０インテグリントランスフェクト２９３細胞との結合は見られなかった。スクリーニングされたｓｃＦｖを、α１１インテグリン特異的結合剤に関してｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗体ライブラリーをパンニングした後に賦活させる。このアプローチを用い、１７２のｓｃＦｖクローンを選択的α１１インテグリン結合剤として確認した。
【図２】抗インテグリンｓｃＦｖの標的インテグリン特異性。ヒトα１０インテグリン（左のグラフ）またはヒトα１１インテグリン（右のグラフ）でトランスフェクトされたＨｅｋ２９３細胞を抗α１０インテグリンｓｃＦｖ（対照、標識付きのグレーのピーク）、抗α１１インテグリンｓｃＦｖ（標識付きのグレーのピーク）または無関係の対照ｓｃＦｖ（黒塗りのピーク）とともにインキュベートした。ｓｃＦｖと細胞の結合を、二次フィコエリトリンコンジュゲート抗Ｈｉｓ ｍＡｂで検出した後、フローサイトメトリーにより分析した。
【図３】抗α１１インテグリンｓｃＦｖの、α１１β１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞の、コラーゲンＩＩコーティングプレートへの接着を選択的に阻害する能力。α１０インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２マウス繊維芽細胞（Ａ）またはα１１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２マウス繊維芽細胞（Ｂ）を、１０μｇ／ｍｌの抗α１１インテグリンｓｃＦｖ、ＦＩＴＣ−８対照ｓｃＦＶ、抗α１０インテグリンモノクローナル抗体またはＩｇＧ２ａイソ型対照抗体とともにプレインキュベートした。次に、細胞を、コラーゲンＩＩをコーティングしたマイクロタイタープレートに加え、接着させた。結合しなかった細胞を洗い流し、結合細胞の数を酵素アッセイにより決定した。グラフは３回の独立した実験からのデータを合わせたものを表し、各実験からのデータは抗体を含まない対照に対してノーマライズした。（上）α１０トランスフェクト細胞の細胞接着に対するＳｃＦｖの効果。（下）α１１トランスフェクト細胞の細胞接着に対するＳｃＦｖの効果。平均値と標準誤差(s.e.m.)。有意性は一元配置Ａｎｏｖａおよびダネットの多重比較検定を用いて算出した。白いバー：α１１−ｓｃＦｖ。縞のバー；対照。
【図４】ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）抗α１１インテグリンｓｃＦｖと末梢血白血球部分集団との結合の欠如。精製ヒトＰＢＬを、異なる蛍光団とコンジュゲートさせた細胞部分集団特異的モノクローナル抗体の存在下で、抗α１１インテグリンｓｃＦｖ α１１＿Ａ＿００１−Ａ０３−ＭＨ（グレーの線）、陽性対照ｓｃＦｖ Ｃ１１（黒い点線）または陰性対照ｓｃＦｖ ＦＩＴＣ−８（黒塗りのピーク）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、１／２０ ＰＥコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体(R&D Systems)とともにインキュベートした。抗α１１β１インテグリン特異的ｓｃＦｖの陽性結合を、陰性対照ＣＴ１７ ｓｃＦｖで染色した細胞の９７〜９９％で見られるものよりも大きなＦＬ２蛍光強度として記録した。マウス抗Ｈｉｓ抗体とのインキュベーションの前に、細胞を予めブロッキングし、２００μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ／２×１０６全白血球の存在下で維持し、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞（左のグラフのそれぞれゲート５、４および３）として同定した。単球（Ｒ２）および顆粒球（Ｒ１）は、独特な前方分散および側方分散特性によって定義され、さらにはＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＤ５６−として定義された。
【図５】ｍＢＳＡの関節内注射後３日目の誘発および非誘発膝におけるＴｃ−９９ｍ取り込みにより測定される関節腫脹の比。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ（コレラ毒素に対する）、「Ａ０３」＝例示的抗α１１全ＩｇＧ抗体。
【図６】膝関節全体の切片における滑膜空間の浸潤細胞としての炎症の組織学的スコア。０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図７】膝関節全体の切片における関節空間への細胞の滲出、浸潤の組織学的スコア。０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症。凡例：「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図８】画像解析によって測定された膝蓋軟骨における関節炎誘発後１５日目のプロテオグリカン（ＰＧ）の枯渇。凡例「ＣＴ１７」＝対照Ａｂ、「Ａ０３」＝例示的抗α１１抗体。
【図９】ＰＧ枯渇−Ａ０３は最初の実験において関節炎誘発後１５日目のＰＧ枯渇を軽減する。図１１Ａは膝蓋からの組織学的スコアリングを示し（図１０に０おける画像解析によりスコアリングとして示される）、図１１Ｂは外側脛骨の組織学的スコアリングを示し、図１１Ｃは膝の全体像を示す。
【図１０】ＰＧ枯渇−Ａ０３は第２の実験における関節炎誘発後１５日目のＰＧ枯渇を軽減する。図１２Ａは膝蓋骨からの組織学的スコアリングを示し、図１２Ｂは外側脛骨の組織学的スコアリングを示す（外側脛骨に関してｐ＝０．０２）。
【図１１】Ａ０３は関節炎誘発後１５日目に測定される骨棘の大きさを減少させる。
【図１２】Ｇ６ＰＩにより誘発された関節炎における関節炎の罹患率（頻度）。処置はＧ６ＰＩ感作後７、１０、１３および１６日目に行った。
【図１３】Ｇ６ＰＩにより誘発された関節炎における関節炎に平均臨床スコア。処置はＧ６ＰＩ感作後７、１０、１３および１６日目に行った。
【図１４】Ｇ６ＰＩ感作後１３日目の体重変化（％）。対照抗体で処置したマウスは平均１０％体重が低下した。Ａ０３処置マウスは平均５％体重が低下し、対照群と比べて体重低下は明らかに減少した（ｐ＝０．０８）。
【実施例】
【０２５１】
実施例１−本発明の例示的抗体（「Ａ０３と呼ぶ」）の生産
α１１β１インテグリンに特異的なｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）由来ヒト抗体の同定
全ヒト抗体ライブラリーｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）（引用することにより本明細書の一部とされるSoderlind et al, 2000, Nat Biotechnol 18:852-6およびＷＯ９８／３２８４５参照）を、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンに対して特異性を有する抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）に関してスクリーニングした。標的インテグリン特異性の高い抗体の賦活を最大にするため、一連の陽性およびサブトラクティブパンニング法を合わせたものを考案した（下記付録参照）。ｓｃＦｖ形式へ変換した後、抗体フラグメントを大腸菌で発現させ、適当であれば、ＦＭＡＴ技術（図１、ＦＭＡＴ分散プロット）を用い、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンを発現するＨｅｋ−２９３細胞との結合に関して陽性および陰性スクリーニングを行った。このようにして、α１０β１インテグリンまたはα１１β１インテグリンに特異的な遺伝子型が独特な数百の抗体フラグメントが同定された（表１）。
【０２５２】
抗体パンニング手順
ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＮＰ４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０１ｍＭ ＣａＣｌ２のバッファー中、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリーのファージ原株を、Dynalsの説明書に従い、ウサギ−抗α１０インテグリンおよびウサギ−抗α１１インテグリンポリクローナル抗体を結合させた免疫チューブおよびトシル活性化ダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌカタログ番号１４２．０４）でのＢＳＡコーティングを用い、４℃で一晩予備選択した。最初のパンニングは４℃で一晩、ウサギ−抗α１１ポリクローナル抗体を結合させた（上記の通り）磁気ビーズに付加した、α１１β１を発現する１５×１０６のＨＥＫ２９３細胞のライゼートに対して行った。ビーズを９×１ｍｌのバッファーで洗浄し、結合しているファージをトリプシンで溶出させ、他所に記載されているように増幅させた(Hallborn & Carlsson, 2002, Biotechniques Dec;Suppl:30-37)。
【０２５３】
１回目のパンニングから増幅したファージを上記のように緩衝させ、１回目のパンニングの場合と同様にポリクローナル結合ダイナビーズに対して予備選択を行った後、ウサギ−抗α１１ポリクローナル抗体を有するダイナビーズに付加された１０×１０６ ＨＥＫ２９３ α１１β１細胞のライゼートを用いて１回目のパンニングと同様に選択を行った。洗浄後（９×１ｍｌバッファー）、結合しているファージをトリプシンで溶出させ、増幅させた。
【０２５４】
２回目のパンニングから増幅させたファージを、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を含有するＤＭＥＭ細胞培地で希釈し、α１０β１を発現する４５×１０６ Ｃ２Ｃ１２細胞およびα１０β１を発現する１３×１０５ ＨＥＫ細胞に対して４℃で一晩、予備選択を行った。次に、ファージを４℃で４時間α１１β１とともにインキュベートし、組換えＣ２Ｃ１２細胞（５×１０６細胞を使用）上に展示させた。結合していないファージを除去するために４０％フィコール（２％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０μＭ ＣａＣｌ２を含有）による密度勾配遠心分離を行った後、残った結合剤を７６ｍＭクエン酸ｐＨ２．５および２００ｍＭトリエタノールアミンの双方で溶出させた。溶出したファージのプールをｓｃＦｖ形式へ変換させるため、大腸菌ＨＢ１０１Ｆで増幅させた。
【０２５５】
ｓｃＦｖ形式への変換
ｃ−ｍｙｃ／６ｘｈｉｓ ｓｃＦｖ形式への変換（ＥａｇＩ変換）
タンパク質ＩＩＩは、ｓｃＦｖとファージ粒子の間の機能的連結であり、遺伝子ＩＩＩを除去すると、可溶性ｓｃＦｖが産生される。ｎ−ＣｏＤｅＲ Ｌｉｂ２０００選択からのファージミドＤＮＡをＥａｇＩｄｅ消化して遺伝子ＩＩＩを除去し、６×ｈｉｓタグをｓｃＦｖフラグメントおよびｃ−ｍｙｃタグに隣接させた。このプラスミドを連結し、遺伝子ＩＩＩ内に制限部位を有するＥｃｏＲＩで「キラーカット(killer-cut)」を行い、再連結したファージミドを排除した。このプラスミドＤＮＡを化学コンピテント大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換させた。
【０２５６】
ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ライブラリーから単離されたユニークな遺伝子型を有するα１１インテグリン特異的抗体フラグメントの数
【表１】
【０２５７】
標的化されたインテグリンα鎖に対する抗原の特異性
これまでにインテグリンヘテロ二量体と結合する４つの異なるコラーゲン、すなわち、α１β１、α２β１、α１０β１およびα１１β１が同定されている。異なる種類のコラーゲンに対する結合に関するそれらの個体間選択性は完全には特徴付けられてない。コラーゲン結合インテグリンの中でも、α１０β１ α１１βｌインテグリンおよびα１１β１インテグリンは高い相同性を示す（リガンド結合Ｉ−ドメインのアミノ酸レベルで６０％の同一性）（Gullberg et al, 2003, Structure and function of alphalpha11beta1 integrin. In: D. Gullberg (Ed) I Domains in Integrins.参照）。結論として、これらのインテグリンヘテロ二量体のいずれかに対するいくつかの抗体は他のものと交差反応性がある可能性がある。
【０２５８】
細胞外マトリックスのターンオーバーに対する単離された抗α１１β１インテグリン抗体の、見られた推定効果が、α１１β１インテグリンヘテロ二量体との排他的相互作用によるものであるとすることができるように、この複合体に対する抗体の詳細な特異性を調べた。このように、抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖを、フローサイトメトリーを用い、α１０β１インテグリンでトランスフェクトされた、またはα１１β１インテグリンでトランスフェクトされたＨｅｋ−２９３細胞との結合に関して調べた。このアプローチにより、２９の抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖ（検討した３８のうち）がα１１β１インテグリントランスフェクト細胞と強く結合したが、α１０β１インテグリントランスフェクト細胞とは結合しないことが確認された（図２）。
【０２５９】
抗インテグリン抗体の詳細な特異性を、抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖの、α１１β１インテグリンでトランスフェクトされた（α１０β１インテグリンでトランスフェクトされたものではない）Ｃ２Ｃ１２細胞のコラーゲンＩＩコーティングプレートへの接着を選択的に阻害する能力によりさらに示す（図３）。インテグリンの構造とインテグリンの活性化および結合の際に起こる構造変化を考えれば、細胞接着（すなわち、インテグリンの結合）を妨げる薬剤が潜在的に興味深い。リガンド結合部位（すなわち、ＭＩＤＡＳ）において、またはその付近で結合する抗体またはｓｃＦｖはリガンドの相互作用を物理的に妨げることができる。ＭＩＤＡＳ付近で結合しないが（例えば、非Ｉ−ドメイン結合剤）、細胞接着に対してなお作用を有する抗体またはｓｃＦｖは、インテグリンα鎖構造、インテグリンの活性化またはα／β鎖の相互作用を妨げる可能性がある。
【０２６０】
最後に、in vitroおよびin vivo試験系において機能を検討する前に、抗α１１β１インテグリン抗体クローンは、顆粒球、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー細胞を含む定義された末梢血白血球部分集団と交差反応しないことが示された（図４）。
【０２６１】
例示的抗α１１抗体に関する配列情報
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の重鎖−アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
［配列番号１１］
【０２６２】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の軽鎖−アミノ酸配列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLI
YGYNERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSG
HVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPG
AVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS
YSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
［配列番号１２］
【０２６３】
ＳｃＦｖ形式の抗α抗体（Ａ０３）−アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMHWVRQVPGKGLEW
VSGVSWNGSRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
YCARVSGDGYNFGAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQP
PSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGYNER
PSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGHWFGG
GTKLTVLG
［配列番号１３］
【０２６４】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の重鎖−ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGTT
ACTACATGCACTGGGTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
GGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGACGCACTATGCAGAC
TCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC
GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTG
TATTACTGTGCGAGAGTAAGTGGAGATGGCTACAATTTTGGCGCCTG
GGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGCTTCCACCAAGGGC
CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG
CACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG
TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC
CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG
TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGC
AACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTG
AGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTC
CTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC
TCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACG
TGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTC
AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC
CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC
CCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGAT
GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC
CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA
CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT
TCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGG
GAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
［配列番号１６］
【０２６５】
抗α１１完全ＩｇＧ抗体（Ａ０３）の軽鎖−ヌクレオチド配列
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCA
GAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCA
GGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAA
ACTCCTCATCTATGGTTATAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACC
GATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGT
GGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGG
ATGACAGCCTGAGTGGTCATGTGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCC
CGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGT
CTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGG
CAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTC
CAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTG
ACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCA
CGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATG
TTCA
［配列番号１７］
【０２６６】
ＳｃＦｖ形式の抗α１１抗体（Ａ０３）−ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGTT
ACTACATGCACTGGGTCCGCCAAGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
GGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGACGCACTATGCAGAC
TCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC
GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTG
TATTACTGTGCAAGAGTAAGTGGAGATGGCTACAATTTTGGCGCCTG
GGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCA
GGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTC
AGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCC
TGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACT
GGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGT
TATAATGAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAA
GTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGG
ATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGT
CATGTGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT
［配列番号１８］
【０２６７】
最初のスクリーニング実験は、ｓｃＦｖ形式の例示的抗体「Ａ０３」を用いて行った。
【０２６８】
in vivo試験は、完全ＩｇＧ形式の例示的抗体「Ａ０３」を用いて行った。
付録Ｉ．−抗α１１β１インテグリンｓｃＦｖを単離するために用いた選択戦略
【０２６９】
選択戦略Ｅ〜Ｇ（下のグラフ）を、α１１β１インテグリン特異的抗体を賦活する目的で行う選択により例示する。
【０２７０】
【表２】
【０２７１】
実施例ＩＩ−抗原誘発性関節炎に対する本発明の例示的抗体の効果
この研究の目的は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいてｍＢＳＡ抗原による誘発された関節炎（ＡＩＡ）における、本発明の例示的完全ＩｇＧ抗体（「Ａ０３」と呼ぶ）の効果を調べることであった。
【０２７２】
材料および方法
試験施設
Experimental Rheumatology & Advanced Therapeutics, University Medical Center Nijmegen, Geert Grooteplain 26-28, 6525 GA Nijmegen, The Netherlands
【０２７３】
実験計画
実験プロトコールを下記の表２および３に示す。
【０２７４】
表２
【表３】
【０２７５】
表３
【表４】
動物
【０２７６】
１０週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６マウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) （２３〜２５ｇ）を研究に用いた。マウスは到着後少なくとも１週間馴化させた。食物および酸性水は自由に摂らせた。マウスは毎週秤量した。
抗原誘発性関節炎の誘発
【０２７７】
抗原誘発性関節炎は、記載のもの（１）と同様のプロトコールを用いて誘発した。要するに、−２１日目に、フロイントノ完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化させた１００μｇのメチル化ＢＳＡ(mBSA, Sigma)（１００μｌ ｍｇ／ｍｌ）をマウスに感作させた。注射は側腹部と後脚の足蹠の双方に分割した。熱失活させた百日咳菌(Bordetella pertussis)(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)１ｍｌを付加的アジュバントとして腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。最初の感作から７日後に動物の頚部にＣＦＡ中、１００μｇ（１００μｌ ｍｇ／ｍｌ）のｍＢＳＡおよび１ｍｌの百日咳菌（ｉ．ｐ．）を追加投与した。追加注射から２週間後に、マウスの右膝関節に６０μｇ ｍＢＳＡ（ｍＢＳＡ）を関節内注射することで関節炎を誘発させた。
抗体
【０２７８】
抗体はBiolnvent International AB (Lund, Sweden)のよって生産されたものである。
試験抗体の投与
【０２７９】
抗体は、Cartela AB (Lund, Sweden)から試験施設に到着した後、４℃で保存した。適正な濃度を得るために抗体を無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させ、無菌条件下、４℃で保存した。１日目に抗体薬剤の投与を開始し、１３日目に終了した。抗体投与は１、５、９および１３日目に行った。抗体は２００μｌ／マウスをｉ．ｐ．投与した。抗体の投与は常に１日の同じ時間−／＋１時間に行った。以下のスキームで各マウスに合計９００μｇの抗体を投与した。
【０２８０】
表４
【表５】
同位元素取り込みの指標としての炎症スコアリング
【０２８１】
関節の腫脹は３日目と１０日目に膝関節における９９Ｔｃペルテケート(pertechate)取り込みを用いて測定した。要するに、マウスに１２μＣｉの９９Ｔｃをｉ．ｐ．注射した後、クロルアルドヒドレートで鎮静させた。３０分後、膝を固定位に保ちつつ、視準されたＮａ−Ｉ−シンチレーションクリスタルを用いて、γ線照射を評価した。関節炎は右膝（注射）と左膝（注射無し）における９９Ｔｃ取り込みの比率としてスコアリングした。比率が１．１より大きい場合に、右膝関節の炎症を示すものとした。この方法はこれまでに、組織学的所見とよく相関することが示されている（２）。
組織学
【０２８２】
右および左双方の膝関節全体を、従前に記載されたように（１）、組織学向けに切開および処理した。要するに、膝をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３日間固定し、５％緩衝ギ酸中で脱石灰した後、パラフィンワックス中に包埋した。ミクロトームで半連続の冠状７μｍ切片を作製した。これらの切片をヘマトキシリンでおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で、またはサフラニン−Ｏ(Safranin O: Merck #1.15948)およびFastgreen(Fast Green FCF: Merck # 1.04022)で染色した。組織学的パラメーター（関節炎症、プロテオグリカン枯渇、骨棘形成）を光学顕微鏡によりスコアリングした。また、膝蓋におけるプロテオグリカン枯渇はデジタル画像解析を用いてスコアリングした。
炎症のスコアリング
【０２８３】
膝全体の前面切片をＨ＆Ｅで染色した。炎症の組織学的スコアリングは光学顕微鏡によった。炎症の程度を滑膜空間中の浸潤細胞の量として、また、関節空間中の細胞の滲出量としてスコアリングした。滲出および浸潤は双方とも、０〜３の任意の尺度：０−炎症無し、１−軽度の炎症、２−中度の炎症、３−重度の炎症を用いてスコアリングした（１）。
【０２８４】
軟骨損傷のスコアリング
プロテオグリカンの欠如の指標として、膝関節全体の切片をサフラニン−ＯおよびＦａｓｔｇｒｅｅｎで染色した。種々の軟骨層（膝蓋骨、膝蓋大腿骨、外側脛骨、外側大腿、内側脛骨、内側大腿）の６部位からの赤色染色の欠如を、０〜３の任意の尺度：０−プロテオグリカン枯渇無し、１−軽度のプロテオグリカン枯渇、２−中度のプロテオグリカン枯渇、３−重度のプロテオグリカン枯渇を用いて評価した（１）。また、膝蓋におけるプロテオグリカン枯渇はデジタル画像解析を用いてスコアリングした。
骨棘のスコアリング
【０２８５】
骨棘の大きさは、Ｈ＆Ｅ染色した内側大腿からの切片に対して、０〜３の任意の尺度：０−骨棘無し、１−軟骨形成の徴候、２−小さな骨棘、３−大きな骨棘を用いてスコアリングした。
統計学
【０２８６】
軟骨のプロテオグリカン枯渇損傷は、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびダンの事後検定を用いて分析した。群間差異はマン・ホイットニー検定を用いて検定した。総ての部位を個別に検定した。テクネチウムの取り込みは、スチューデントのｔ検定を用いて検定した。統計学的計算を行うため、グラフパッドプリズム４ソフトウエアを用いた。
【０２８７】
結果
関節炎マウスにおいてα１１インテグリンに対する抗体による処置は炎症を軽減した
【０２８８】
膝関節へのｍＢＳＡのｉ．ａ．注射により１つの関節炎を誘発した。この疾病は発症が早く、ｉ．ａ．注射後１日目に関節の腫脹が最大に達し、７日まで徐々に低下した。さらに８日後（ｉ．ａ．注射から１５日後）、疾病がより慢性化した際にマウスを屠殺した。関節炎マウスを抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）で処置すると、マウスの膝関節の腫脹程度ならびに関節中への炎症性細胞の浸潤程度として評価される炎症に有意な軽減がもたらされた。抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）で処置したマウスでは、ｍＢＳＡのｉ．ａ．注射３日後に、誘発された膝関節の腫脹に対照抗体（ＣＴ１７）で処置したマウスに比べて有意な軽減が見られた（Ｐ＝０．０３５、Ｔ検定）（図５）。その後の２回の実験でも同様の結果が示された。
【０２８９】
抗α１１インテグリンで処置したマウスは、実験の終了時（ｉ．ａ．注射１５日後）における滑膜空間（図６）および関節空間（滲出）（図８）中の浸潤細胞の量が、対照抗体で処置したマウスに比べて少なかったが、この違いは統計学的に有意な差ではなかった。
関節炎マウスにおいてα１１に対する抗体による処置は軟骨を破壊から保護する
【０２９０】
抗α１１インテグリン抗体で処置されたマウスでは、対照抗体で処置されたマウスに比べ軟骨の破壊が少なかった（Ｐ＝０．０１５）（図８）。軟骨破壊の量は、０〜３の任意の尺度を用いて、ならびに画像解析を用いて、組織切片におけるプロテオグリカンの欠如としてスコアリングした。プロテオグリカン枯渇に対する抗α１１インテグリン抗体による処置の保護効果は膝においてスコアリングされた６箇所総てで見られた。
【０２９１】
図９および１０は、任意の尺度評価を用いてプロテオグリカン（ＰＧ枯渇）およびその低下として評価される膝蓋および外側脛骨に対する抗α１１インテグリン抗体による処置の効果をさらに示す。２つの異なる実験を表しているこれら２つの図面で分かるように、Ａ０３による処置は膝蓋および外側脛骨の双方においてＰＧ枯渇を軽減する。実験２にいける外側脛骨のＡ０３でのＰＧ枯渇の軽減は有意である（ｐ＝０．０２）。これら２つの図９および１０は、膝蓋の画像解析（図９に相当、任意の尺度で分析された膝蓋）と比較しなければならず、その結果が図８に示されている（Ｐ＝０．０１５）。
【０２９２】
図１１は、骨棘の大きさに対する抗α１１インテグリン抗体により処置の効果を示している。この図面で分かるように、対照抗体（ＣＴ１７）による処置に比べ、Ａ０３抗体で処置した後に骨棘の大きさの低下が見られる。
【０２９３】
結論
本発明の例示的抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）による処置は、関節の腫脹および炎症性細胞の浸潤として評価される、抗原誘発性関節炎（ＡＩＡ）で誘発された関節炎マウスの関節の炎症を軽減する。さらに、抗α１１インテグリン処置はＡＩＡマウスにおいて軟骨を退化から保護し、これはプロテオグリカン分解の低下として示される。本発明者らの結果は、３日目の炎症（ＴＣ取り込み）と１５日目の軟骨退化（ＰＧ枯渇）の間に明白な相関を示す。
【０２９４】
現在確立されているＲＡに対する処置は、同じＡＩＡモデルで腫脹を軽減する（ＮＳＡＩＤＳ）か、または腫脹と浸潤細胞の量を軽減する（抗ＴＮＦα）が、軟骨に対して保護効果を有するものはない（６〜９）。これは、抗α１１インテグリン処置が単独療法としての、または他の療法との併用としてのＲＡ療法に大きな可能性を有することを示唆する。
【０２９５】
参照文献
【０２９６】
実施例ＩＩＩ−グルコース−６−リン酸誘発性関節炎に対する本発明の例示的抗体の効果
この研究の目的は、ＤＢＡ／１マウスにおいて例示的完全ＩｇＧ抗体（「Ａ０３と呼ぶ」）の作用を試験することであった。
【０２９７】
材料および方法
試験施設
Cartela AB, Scheelvagen 22, 223 63 Lund, Sweden
【０２９８】
実験計画
実験プロトコールを下記表５および６に示す。
【０２９９】
表５
【表６】
【０３００】
表６
【表７】
【０３０１】
動物
雌ＤＢＡ１マウスをTaconic M&B, Denmarkから入手した。マウスにEMI Expanded(special Diet Services Ltd, UK)および水を自由に摂らせた。マウスには少なくとも１週間、新しい環境に対する馴化期間を設けた。水およびケージは１週間に２回交換した。必要に応じて餌を満たした。マウスは蓋を強化したＭａｃ３ケージ当たり７匹を飼育した。
抗原
【０３０２】
組換えヒトグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）は、Kamradt (Deutches Rheumaforschungszentrum Berlin, Berlin, Germany)から、従前に記載されているように（３）製造されたものを購入した。
グルコース−６−リン酸イソメラーゼ誘発性関節炎の誘発
【０３０３】
マウスにＣＦＡ(Difco, Detroit, MI, USA)中に１：１比で乳化させた２００μｇの組換えヒトＧ６ＰＩを感作させた。１００μｌ量を尾の基部に皮下注射した（３）。
試験薬の投与
【０３０４】
抗体は４℃で保存した。抗体を無菌ＰＢＳに溶解させ、無菌条件下４℃で保存した。抗体の投与はｈＧ６ＰＩ注射後、７、１０、１３、１６日目に行った。抗体は２００μｌ／マウスをｉ．ｐ．投与した。抗体の投与は常に１日の同じ時間−／＋１時間に行った。以下のスキームで各マウスに合計８８０μｇの抗体を投与した。
【０３０５】
表７
【表８】
炎症のスコアリング
【０３０６】
各脚について１〜１５の範囲の拡張スコアリングプロトコールを用い、これまでに記載されているような（４）関節炎のマウス１匹につき最大スコア６０とした。各関節炎（発赤および腫脹）の足指および指を１とし、影響を受けた足首を５とした。
組織学
【０３０７】
後足および足首をリン酸緩衝ホルマリン（ｐＨ７．４）中で３日間固定し、ＥＤＴＡ中で脱石灰した後、パラフィンワックスに包埋した。ミクロトームで半連続の５μｍ切片を作製した。前足をＥＤＴＡ中で脱石灰した後、ＯＣＴに包埋し、凍結させた。クリオスタットで半連続の５μｍ切片を作製した。
軟骨損傷および骨破壊のスコアリング
【０３０８】
後足および足首のパラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）またはサフラニン−Ｏで染色した。切片を、勾配作製系（５）を用いたプロテオグリカン枯渇に関して、さらにはまた光学顕微鏡による骨棘形成および骨破壊に関して等級付けした。プロテオグリカン枯渇はまた、デジタル画像解析を用い、赤色染色の欠損としてスコアリングした。
免疫染色
【０３０９】
凍結切片を室温まで温めた後、アセトン中、−２０℃で１０分間固定した。スライドをＰＢＳで５分３回洗浄した後、３７℃で３０分間、ヒアルロニダーゼ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ；Sigma）とともにインキュベートした。もう一度、ＰＢＳ中で５分３回洗浄した後、切片をＰＢＳ中に希釈した４％ヤギ血清(Sigma, G-9023)ととともに３０分間インキュベートして遮断した。切片を室温で６０分間、ＰＢＳ中４％ヤギ血清中に１：１００希釈したビオチニル化ＩｇＧ４−抗α１１インテグリンＡｂ（＝２０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、ＰＢＳ中で５分３回洗浄した。その後、切片を蛍光（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４４８またはＣｙ３）コンジュゲートストレプトアビジンとともにさらに６０分間インキュベートした。ＰＢＳ中でさらに５分３回洗浄した後、スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを取り付け、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果
【０３１０】
マウスにおいてα１１インテグリンに対する抗体による処置はＧ６ＰＩ誘発性関節炎の罹患率および重篤度を軽減した
【０３１１】
組換えヒトグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ｒｈＧ６ＰＩ）を感作させると、前足と後足の双方に重度の腫脹を有する多発性関節炎が誘発される。関節炎の臨床徴候はまず感作後７日目に表れ、急速に進行し、９日目に最大に達した（図１２）。感作後１８日目にマウスを塗擦した。
【０３１２】
７日目に処置を開始した後、注射１０、１３、１６日後にマウス当たり合計８８０μｇの試験抗体を投与した。ＴＮＦＲ−ｐ７５−ＩｇＦｃ（エンブレル）を陽性対照として用いた。エンブレルによる処置は、対照抗体（ＣＴ１７）で処置した群における１００％に対して、関節炎の罹患率を５０％低下させた。Ａ０３処置は、関節炎の罹患率および重篤度に明らかな低下をもたらした（図１２および１３）。Ａ０３で処置したマウスは総て関節炎を発症し（９日目で罹患率１００％）、その後、５０％のマウスが回復し（ｐ＜０．０５）（図１３）、罹患率はエンブレル処置群と同レベルまで低下した（ｐ＝０．０５１）（図１２）。図１３は、各群の個体の関節炎スコアの平均として評価される関節炎の重篤度を示す。
【０３１３】
関節炎の試験中、全般的な疾病状態の指標としてマウスを秤量した。Ａ０３処置マウスは対照処置マウスに比べ、有意ではないが明らかな体重低下の減少を示した（ｐ＝０．０８）（図１４）。
【０３１４】
以下の表８は、これらの試験で調べた各群において発症した関節炎の罹患率（頻度）を示す。
【０３１５】
表８
【表９】
結論
【０３１６】
抗α１１インテグリン抗体（Ａ０３）による処置は、多発性関節炎モデルであるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ｒｈＧ６ＰＩ）誘発性関節炎において、関節炎マウスの関節の炎症を軽減する。発症日に試験抗体を投与し、その後、試験の終了時まで３日おきに投与する処置スキームを用いると、Ａ０３処置が５０％の関節炎マウスに回復をもたらしたことが実証できる。関節炎の罹患率は試験群においては１００から５０％に低下し、エンブレル処置の場合の罹患率レベルを下回った。
【０３１７】
参照文献
実施例ＩＶ−例示的「Ａ０３」抗体と競合するモノクローナル抗体の作製
【０３１８】
本実施例の目的は、ハイブリドーマ技術を用い、例示的「Ａ０３」抗体と競合するマウスモノクローナル抗体を作製することである。
材料および方法
感作プロトコール
【０３１９】
ＨＥＫ細胞により産生された組換えタンパク質を感作に用いる。このタンパク質は、α１１インテグリンのスターク領域に対する抗体応答を命令するために、ヒトα１１の上方−下方ウシドメイン（Ｅ−ＵＬＣＤ）を含む。
Ｅ−ＵＬＣＤの配列は、
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIFLHHLE
IELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSSLSHYEVKLN
SSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPIATRSGNRLLKLRDF
LTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRAPQLNHSNSDVVSINCNIRLV
PNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKSMKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDP
SRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号１９］
である。
【０３２０】
Ｃ５７ｂ１／６−α１１ノックアウトマウス（詳細は、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ０３／１０１４９７に記載の通り）に感作させた。
【０３２１】
ＦＡＣＳ分析によって免疫応答を追跡できるように、示された時点で採血を行った。次の感作スキームを適用した。
【０３２２】
０日目
０日目にＦＡＣＳ分析用の採血を行い、α１１スタークタンパク質（このα１１配列の種はヒトであり、Veiling et al. J. Biol. Chem. 1999, 274:25735-25742に記載されている) (Cartela AB, バッチ番号53; 070509; ピーク1+2をプール, E-ULCD)(80μｇ／マウス) を音波処理によりＣＦＡ（フロイントの完全アジュバント，Sigma）に乳化させ、４匹のＣ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスの尾の基部に注射した。
【０３２３】
１４日目
ＦＡＣＳ分析用に採血し、ＩＦＡ（フロイントの不完全アジュバント，Sigma）中、α１１スターク（Ｅ−ＵＬＣＤ）（５０μｇ／マウス）で追加免疫した。
【０３２４】
２２日目
ＦＡＣＳ分析用に採血
【０３２５】
２４日目
融合用にＮＳ０融合相手を増殖
【０３２６】
３１日目
予備融合 ＰＢＳ中、α１１スターク（バッチ番号５３ Ｅ−ＵＬＣＤ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｃａ２＋、バッチＩ）（５０μｇ／マウス）で追加免疫。
【０３２７】
３４日目
Ｂ細胞と骨髄腫細胞系統ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ）の融合
【０３２８】
３４日目のＮＳ０細胞（０７０６２５）との融合
３匹のＣ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスの脾臓を用いた。単細胞懸濁液を作製し、９ｍｌの無菌ｄｄＨ２Ｏを用い（１０秒）溶解させた後、１ｍｌの１０倍ＰＢＳを加えて溶解を停止させた。細胞を血清不含Ｄ−ＭＥＭで洗浄し（２回）、５０ｍｌファルコン試験管内で、洗浄したＮＳ０細胞のアリコートと混合した（ＰＥＧとの融合の際に有害となり得る遊離タンパク質を除去するため）。これらのペレットを水浴中で３７℃に維持した。３７℃にて攪拌しながら、ガラスピペットを用い、１分間かけてＤ−ＭＥＭ中５０％ＰＥＧ（１５００ＭＷ）１ｍｌを滴下した。予温した２ｍｌの血清不含Ｄ−ＭＥＭ２分かけて加えた。予温した７ｍｌの血清不含Ｄ−ＭＥＭを３分かけて滴下した。細胞を５分間５００ｘｇで遠心分離した。上清を廃棄し、予温した完全Ｄ−ＭＥＭ（ピルビン酸塩、１０％ＦＣＳ、ＰＥＳＴ）、３プレートにＮｒ１ ４０ｍｌ）、４プレートにＮｒ３ ５０ｍｌ）、４プレートにＮｒ１０ ５０ｍｌを加えた。細胞を室温で１０分間休止させた後、およそ１００μｌの細胞を１０ｍｌピペットで９６ウェル細胞培養プレートに加えた（１ウェル当たり１滴）。
【０３２９】
融合は、引用することにより本明細書の一部とされる'Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, "Production of Monoclonal antibodies" (ISBN ISSBN: 1934-3671, Wileyのプロトコールに従って行った。
【０３３０】
３５日目
１００μｌの２倍ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン、
Apoteket, Sweden)培地を選択用ウェルに加えた。
【０３３１】
３８日目
死細胞からの有害な上清を除去し、新鮮なＨＴ培地（ヒポキサンチン−チミジン， Apoteket, Sweden)を加えた。
【０３３２】
４４日目
ＦＡＣＳスクリーニング用の１００μｌ培地を除去し、ウェルにＨＴ培地を加えた。
【０３３３】
ＦＡＣＳスクリーニングによるスターク特異的ハイブリドーマの同定
候補ハイブリドーマを含むウェルの上清を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用い、スターク領域に対する反応性に関して調べる。これらのクローンをそれらのスターク反応性および抗α１１インテグリンスターク候補ハイブリドーマの望ましくない潜在的交差反応性に関してさらに特性決定した。
スターク特異的ハイブリドーマの同定：
【０３３４】
抗α１１インテグリンスターク候補ハイブリドーマの、関連のα１０−インテグリンとの望ましくない交差反応性を、α１０−インテグリンでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞およびα１０−インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を用いて調べる。他種、すなわちマウス由来の相当するスタークに対する交差反応性は、マウスα１１−インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を用いて調べる。
【０３３５】
α１１スタークハイブリドーマのサブクローニング
ＦＡＣＳ陽性細胞を、制限希釈法（およそ０．３細胞／ウェル）を用いてサブクローニングする。ハイブリドーマの生存を確保するためのフィーダー細胞としてラット胸腺細胞を用いる。種々のサブクローニング段階でハイブリドーマ細胞を凍結させる。
【０３３６】
全長ヒトα１１インテグリンに対する抗体の作製
全長ヒトα１１インテグリンに対する抗体の作製。該全長α１１インテグリンタンパク質は、細胞質テールに特異的なポリクローナル抗血清を用い、ヒトα１１でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞ライゼートからアフィニティー精製する（ＷＯ００／７５１８７に記載の通り）。
【０３３７】
感作プロトコール：全長α１１−インテグリンプロジェクト
０日目
４匹の雌Ｃ５７ｂ１／６−α１１ｋｏマウスを用い、尾の基部にＣＦＡ中、４０μｇ／マウスの全長α１１タンパク質（バッチ番号０７０７１７）を感作させた。ＦＡＣＳ分析用に採血した。
１３日目
１３日目にＦＡＣＳ分析用に採血した。
１６日目
ＩＦＡ中、１０μｇ／マウスの全長α１１タンパク質（バッチ番号０７０７１７）を追加投与した。
２６日目
ＰＢＳ中、１０μｇ／マウスの全長α１１インテグリンおよび４０μｇのスタークα１１タンパク質（バッチ番号５３ Ｅ−ＵＬＣＤ）／マウスをｉ．ｐ．追加投与した。
２９日目
脾臓およびリンパ節細胞とＮＳ０細胞との融合。ＤＮＡ用の尾の切片および血清を保存。
【０３３８】
２９日目のＮＳ０細胞との融合
３匹の感作α１１ｋｏマウスの脾臓および排出リンパ節（ＬＮ）からの細胞を融合に用いた。単細胞懸濁液を作製し、脾細胞の赤血球を、０．８４％塩化アンモニウムを用いて溶解させた。細胞を血清不含Ｄ−ＭＥＭで洗浄し（２回）、５０ｍｌファルコン試験管内で、洗浄したＮＳ０細胞のアリコートと混合した。これらのペレットを水浴中で３７℃に維持した。３７℃にて攪拌しながら、ＤＭＥＭ中、５０％ＰＥＧ１５００ＭＷ１ｍｌを１分間かけて滴下した。予温した２ｍｌの血清不含ＤＭＥＭ２分かけて滴下した。予温した７ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを３分かけて滴下した。細胞を５分間５００ｘｇで遠心分離した。上清を廃棄した後、予温した完全ＤＭＥＭ（ピルビン酸塩、１０％ＦＣＳ、ＰＳ）をＬＮおよび脾臓調製物に加えた（Ｎｒ１では５０ｍｌ、Ｎｒ３では５０ｍｌ、Ｎｒ１０では５０ｍｌ）。１融合当たり４．５個のプレートに各ウェルに１滴（およそ１００μｌ）ずつ加えた。４時間後に、１００μｌの２倍ＨＡＴ培地を加えた。
融合は、引用することにより本明細書の一部とされる'Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, "Production of Monoclonal antibodies" (ISBN ISSBN: 1934-3671, Wileyのプロトコールに従って行った。
【０３３９】
日
１００μｌの培地を除去し、ウェルにＨＴ培地を加えた。
【０３４０】
融合後１１日目に、上記のように陽性ウェルのＦＡＣＳスクリーニングのために上清を採取する。陽性ウェルを同定した後、上清をヒトおよびマウスα１１インテグリン間の交差反応性に関して調べた（Ｃ２Ｃ１２野生型細胞ならびにヒトα１１およびα１０−インテグリンでトランスフェクトされた細胞を用いるハイブリドーマスクリーニング）。
【０３４１】
ＢＭコンダイムＨ１添加培地(Roche, DE)中でハイブリドーマ細胞をサブクローニングした（０，３細胞／ウェル）。１コロニーのみが増殖しているウェルを特異性スクリーニングのために選択した。
【０３４２】
例示的抗体「Ａ０３」との競合に関するスクリーニング
さらに、新たに作製されたクローンを、例示的抗体「Ａ０３」の結合を遮断するその能力に関して調べる。ＦＡＣＳに基づく方法を用いる。ヒトα１１インテグリンでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を、新たに作製された精製抗体とともに、細胞表面で発現されるα１１−インテグリンに対するそれらのエピトープを占有するよう、１０００ｎｇ／ｍｌまでの約１．６の希釈系でインキュベートする。第二段階では、ビオチニル化された例示的抗体Ａ０３を加える。これらの抗体があるエピトープ領域を共有していれば、ヒトＩｇＧの結合が減少する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項２】
炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができ、
ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【請求項３】
炎症性症状の診断薬または予後薬の製造における、請求項１または２で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項４】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、請求項１または２で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項５】
前記インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体が細胞の表面に局在している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記細胞が軟骨細胞または繊維芽細胞である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトまたはヒト化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が以下のＣＤＲ：
ａ）配列番号１；
ｂ）配列番号２；および
ｃ）配列番号３
を含んでなる重鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が以下のＣＤＲ：
ａ）配列番号４；
ｂ）配列番号５；および
ｃ）配列番号６
を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、請求項１２または１３で定義された重鎖可変領域と請求項１４または１５で定義された軽鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる重鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる軽鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、請求項１７で定義された重鎖と請求項１８で定義された軽鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、治療部分および／または検出可能部分をさらに含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
検出可能部分が放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ）、放射性核種（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光剤、ビオチニル基および二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
炎症性症状の診断または画像化のための診断薬の製造における、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記炎症性症状が関節疾患である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記関節疾患が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がコラーゲンの分解を調整し得る、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がコラーゲンの分解を阻害し得る、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整し得る、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
炎症性症状を有する個体を処置するための方法であって、その個体に有効量の、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
個体において炎症性症状を診断または予後する方法であって、その個体に有効量の請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、含む方法。
【請求項３５】
個体の身体において炎症性症状に関連するインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を画像化するための方法であって、その個体に有効量の請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
個体において前記化合物の位置を検出する工程をさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記炎症性症状が関節炎疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記関節炎疾患が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
個体において炎症性症状の進行を監視するための方法であって、
（ａ）第一の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；
（ｂ）第二の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；および
（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を比較すること
を含み、工程（ａ）と比べた場合の工程（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量の増加が炎症性症状の進行の指標となる、方法。
【請求項４１】
炎症性症状と関連する細胞を同定する方法であって、供試細胞のサンプル中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること、およびそれを陽性対照および／または陰性対照に対するインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量と比較することを含む、方法。
【請求項４２】
前記陽性対照が炎症性症状に罹患している被験体由来の細胞を含んでなる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記陰性対照が炎症性症状に罹患していない健康なヒトに由来する細胞を含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記炎症性症状が関節炎疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炎症性症状が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
炎症性症状を処置するための候補化合物を同定するための方法であって、
ａ）供試化合物を準備すること；
ｂ）該化合物の、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、以下のＣＤＲ配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくは誘導体の融合体と競合する能力を試験すること
を含み、
該試験化合物がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して競合することができれば、それは炎症性症状を処置するための候補化合物として同定される、方法。
【請求項４８】
前記化合物の、コラーゲンの分解を調整する能力を試験する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物の、コラーゲンの分解を阻害する能力を試験する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験工程がin vivoで行われる、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験化合物がポリペプチド、またはその融合体もしくは誘導体、または該その誘導体の融合体である、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記試験化合物が抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体の融合体もしくはその誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記試験化合物が完全な抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試験化合物が、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記試験化合物がｓｃＦｖである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができる抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または
インテグリンα１１サブユニットもしくはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体
（ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【請求項５７】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる、請求項５６に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項５８】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる、請求項５６に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項５９】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体が細胞の表面に局在する、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６０】
前記細胞が軟骨細胞または繊維芽細胞である、請求項６０に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６１】
完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６２】
Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６３】
前記抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項６２に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６４】
前記抗体が組換え抗体である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトまたはヒト化されている、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６７】
コラーゲンの分解を調整することができる、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６８】
コラーゲンの分解を阻害することができる、請求項６７に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６９】
in vivoでコラーゲンの分解を阻害することができる、請求項６７または６８に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７０】
炎症性症状の処置に有効性を有する、請求項５６〜６９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７１】
前記炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項７０に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７２】
前記炎症性症状が関節リウマチである、請求項７１に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７３】
前記炎症性症状が骨関節炎である、請求項７１に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７４】
治療部分および／または検出可能部分をさらに含んでなる、請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７５】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードする核酸分子、またはその成分ポリペプチド鎖。
【請求項７６】
請求項７５に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項７７】
発現ベクターである、請求項７６に記載のベクター。
【請求項７８】
請求項７５に記載の核酸分子または請求項７６もしくは７７に記載のベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項７９】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを製造するための方法であって、請求項７８〜８１のいずれか一項で定義された宿主細胞を、コードされている抗体またはその抗原結合フラグメントの発現を可能とする条件下で培養することを含む、方法。
【請求項８３】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項８４】
非経口投与に好適な請求項８３に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
医薬に用いるための、請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項８６】
請求項８３または８４に記載の医薬組成物を含んでなるキット。
【請求項８７】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体により定義されるエピトープ
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項８８】
以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIF
LHHLEIELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSS
LSHYEVKLNSSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPI
ATRSGNRLLKLRDFLTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRA
PQLNHSNSDVVSINCNIRLVPNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKS
MKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDPSRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号１５］
を含んでなるか、またはそれからなる請求項８７に記載のエピトープ、またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体。
【請求項８９】
以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIF
LHHLEIELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSS
LSHYEVKLNSSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPΓHGMMMKITIPI
ATRSGNRLLKLRDFLTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRA
PQLNHSNSDWSINCNIRLVPNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKS
MKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDPSRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
を含んでなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
免疫応答を刺激することができる、請求項８９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
前記ポリペプチドが、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体と結合することができる、請求項８９または９０に記載の単離されたポリペプチド
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項９２】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または製造するための、請求項８７もしくは８８に記載のエピトープ、または請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【請求項９３】
実質的に本明細書に記載されている薬剤の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９４】
実質的に本明細書に記載されている診断薬または予後薬の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９５】
実質的に本明細書に記載されている細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９６】
実質的に本明細書に記載されている炎症性症状を有する個体を処置する方法。
【請求項９７】
実質的に本明細書に記載されている炎症性症状を診断または予後する方法。
【請求項９８】
実質的に本明細書に記載されているインテグリンα１１サブユニットを発現する細胞を画像化する方法。
【請求項９９】
実質的に本明細書に記載されている候補化合物を同定するための方法。
【請求項１００】
実質的に本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０１】
実質的に本明細書に記載されている医薬組成物。
【請求項１０２】
実質的に本明細書に定義されている核酸分子。
【請求項１０３】
実質的に本明細書に定義されているベクター。
【請求項１０４】
実質的に本明細書に定義されている宿主細胞。
【請求項１０５】
実質的に本明細書に定義されている抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法。
【請求項１０６】
実質的に本明細書に定義されているキット。
【請求項１０７】
本明細書に定義されているエピトープ。
【請求項１０８】
本明細書に記載されている単離されたポリペプチド。
【請求項１０９】
本明細書で定義されている抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または製造するための、エピトープまたは単離されたポリペプチドの使用。
【請求項１】
炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項２】
炎症性症状を処置するための薬剤の製造における、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体の使用
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができ、
ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【請求項３】
炎症性症状の診断薬または予後薬の製造における、請求項１または２で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項４】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、請求項１または２で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項５】
前記インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体が細胞の表面に局在している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記細胞が軟骨細胞または繊維芽細胞である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトまたはヒト化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が以下のＣＤＲ：
ａ）配列番号１；
ｂ）配列番号２；および
ｃ）配列番号３
を含んでなる重鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が以下のＣＤＲ：
ａ）配列番号４；
ｂ）配列番号５；および
ｃ）配列番号６
を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、請求項１２または１３で定義された重鎖可変領域と請求項１４または１５で定義された軽鎖可変領域を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる重鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる軽鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、請求項１７で定義された重鎖と請求項１８で定義された軽鎖を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、請求項１または３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体が、治療部分および／または検出可能部分をさらに含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
検出可能部分が放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ）、放射性核種（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光剤、ビオチニル基および二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
炎症性症状の診断または画像化のための診断薬の製造における、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記炎症性症状が関節疾患である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記関節疾患が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がコラーゲンの分解を調整し得る、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がコラーゲンの分解を阻害し得る、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体がin vivoにおいてコラーゲンの分解を調整し得る、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
炎症性症状を有する個体を処置するための方法であって、その個体に有効量の、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
個体において炎症性症状を診断または予後する方法であって、その個体に有効量の請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、含む方法。
【請求項３５】
個体の身体において炎症性症状に関連するインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体を発現する細胞を画像化するための方法であって、その個体に有効量の請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体、融合体もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
個体において前記化合物の位置を検出する工程をさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記炎症性症状が関節炎疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記関節炎疾患が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
個体において炎症性症状の進行を監視するための方法であって、
（ａ）第一の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；
（ｂ）第二の時点で個体から採取された細胞のサンプルを準備し、その中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること；および
（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を比較すること
を含み、工程（ａ）と比べた場合の工程（ｂ）で測定されたインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量の増加が炎症性症状の進行の指標となる、方法。
【請求項４１】
炎症性症状と関連する細胞を同定する方法であって、供試細胞のサンプル中のインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量を、請求項１〜３２のいずれか一項で定義された抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を用いて測定すること、およびそれを陽性対照および／または陰性対照に対するインテグリンα１１サブユニットタンパク質の量と比較することを含む、方法。
【請求項４２】
前記陽性対照が炎症性症状に罹患している被験体由来の細胞を含んでなる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記陰性対照が炎症性症状に罹患していない健康なヒトに由来する細胞を含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記炎症性症状が関節炎疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炎症性症状が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
炎症性症状を処置するための候補化合物を同定するための方法であって、
ａ）供試化合物を準備すること；
ｂ）該化合物の、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、以下のＣＤＲ配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、その変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくは誘導体の融合体と競合する能力を試験すること
を含み、
該試験化合物がインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して競合することができれば、それは炎症性症状を処置するための候補化合物として同定される、方法。
【請求項４８】
前記化合物の、コラーゲンの分解を調整する能力を試験する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物の、コラーゲンの分解を阻害する能力を試験する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験工程がin vivoで行われる、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験化合物がポリペプチド、またはその融合体もしくは誘導体、または該その誘導体の融合体である、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記試験化合物が抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体の融合体もしくはその誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記試験化合物が完全な抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試験化合物が、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、シングル抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、シングル可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、シングルおよびダブル形式［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記試験化合物がｓｃＦｖである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体との結合に関して、配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と競合することができる抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または
インテグリンα１１サブユニットもしくはそのヘテロ二量体に対する結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体
（ただし、該抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の総ては含まない）。
【請求項５７】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子と同じエピトープと結合することができる、請求項５６に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項５８】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ分子が結合するものとは異なるエピトープと結合することができる、請求項５６に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項５９】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体が細胞の表面に局在する、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６０】
前記細胞が軟骨細胞または繊維芽細胞である、請求項６０に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６１】
完全な抗体を含んでなるか、またはそれからなる、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６２】
Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含んでなるか、またはそれからなる、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６３】
前記抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項６２に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６４】
前記抗体が組換え抗体である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒトまたはヒト化されている、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６７】
コラーゲンの分解を調整することができる、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６８】
コラーゲンの分解を阻害することができる、請求項６７に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項６９】
in vivoでコラーゲンの分解を阻害することができる、請求項６７または６８に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７０】
炎症性症状の処置に有効性を有する、請求項５６〜６９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７１】
前記炎症性症状が関節疾患（関節リウマチおよび骨関節炎など）、関節炎症、炎症により誘発される軟骨破壊、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、歯周炎、乾癬、喘息、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性自己炎症性疾患からなる群から選択される、請求項７０に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７２】
前記炎症性症状が関節リウマチである、請求項７１に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７３】
前記炎症性症状が骨関節炎である、請求項７１に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７４】
治療部分および／または検出可能部分をさらに含んでなる、請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項７５】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体をコードする核酸分子、またはその成分ポリペプチド鎖。
【請求項７６】
請求項７５に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項７７】
発現ベクターである、請求項７６に記載のベクター。
【請求項７８】
請求項７５に記載の核酸分子または請求項７６もしくは７７に記載のベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項７９】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを製造するための方法であって、請求項７８〜８１のいずれか一項で定義された宿主細胞を、コードされている抗体またはその抗原結合フラグメントの発現を可能とする条件下で培養することを含む、方法。
【請求項８３】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項８４】
非経口投与に好適な請求項８３に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
医薬に用いるための、請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体。
【請求項８６】
請求項８３または８４に記載の医薬組成物を含んでなるキット。
【請求項８７】
インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体により定義されるエピトープ
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項８８】
以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIF
LHHLEIELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSS
LSHYEVKLNSSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPIHGMMMKITIPI
ATRSGNRLLKLRDFLTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRA
PQLNHSNSDVVSINCNIRLVPNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKS
MKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDPSRQIVFEISKQEDWQVP
［配列番号１５］
を含んでなるか、またはそれからなる請求項８７に記載のエピトープ、またはそのフラグメント、融合体もしくは変異体。
【請求項８９】
以下のアミノ酸配列：
SDGSIECVNEERRLQKQVCNVSYPFFRAKAKVAFRLDFEFSKSIF
LHHLEIELAAGSDSNERDSTKEDNVAPLRFHLKYEADVLFTRSSS
LSHYEVKLNSSLERYDGIGPPFSCIFRIQNLGLFPΓHGMMMKITIPI
ATRSGNRLLKLRDFLTDEANTSCNIWGNSTEYRPTPVEEDLRRA
PQLNHSNSDWSINCNIRLVPNQEINFHLLGNLWLRSLKALKYKS
MKIMVNAALQRQFHSPFIFREEDPSRQIVFEISKQEDWQVP［配列番号１５］
を含んでなるか、またはそれからなる単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
免疫応答を刺激することができる、請求項８９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
前記ポリペプチドが、インテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量に対して結合特異性を有する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはインテグリンα１１サブユニットまたはそのヘテロ二量体に対する該抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合特異性を保持する、該抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体もしくは誘導体、または該変異体もしくはその誘導体の融合体と結合することができる、請求項８９または９０に記載の単離されたポリペプチド
（ここで、該抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸配列：
FSRYYMHWVRQVPG［配列番号１］；
SGVSWNGSRTHYADSVKGR［配列番号２］；
ARVSGDGYNFGA［配列番号３］；
CTGSSSNIGAGYDVH［配列番号４］；
GYNERPS［配列番号５］；および
CAAWDDSLSGHVV［配列番号６］
を含んでなる）。
【請求項９２】
請求項５６〜７４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または製造するための、請求項８７もしくは８８に記載のエピトープ、または請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【請求項９３】
実質的に本明細書に記載されている薬剤の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９４】
実質的に本明細書に記載されている診断薬または予後薬の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９５】
実質的に本明細書に記載されている細胞を検出および／または画像化するための薬剤の製造における、抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体の使用。
【請求項９６】
実質的に本明細書に記載されている炎症性症状を有する個体を処置する方法。
【請求項９７】
実質的に本明細書に記載されている炎症性症状を診断または予後する方法。
【請求項９８】
実質的に本明細書に記載されているインテグリンα１１サブユニットを発現する細胞を画像化する方法。
【請求項９９】
実質的に本明細書に記載されている候補化合物を同定するための方法。
【請求項１００】
実質的に本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０１】
実質的に本明細書に記載されている医薬組成物。
【請求項１０２】
実質的に本明細書に定義されている核酸分子。
【請求項１０３】
実質的に本明細書に定義されているベクター。
【請求項１０４】
実質的に本明細書に定義されている宿主細胞。
【請求項１０５】
実質的に本明細書に定義されている抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法。
【請求項１０６】
実質的に本明細書に定義されているキット。
【請求項１０７】
本明細書に定義されているエピトープ。
【請求項１０８】
本明細書に記載されている単離されたポリペプチド。
【請求項１０９】
本明細書で定義されている抗体もしくは抗原結合フラグメント、またはその変異体、融合体もしくは誘導体を同定または製造するための、エピトープまたは単離されたポリペプチドの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５１４４１３（Ｐ２０１０−５１４４１３Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２２１１（Ｐ２００９−５４２２１１）
【出願日】平成１９年１２月１８日（２００７．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４８８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７５０４５
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５０８１５７８４２）カルテラ、アールアンドデー、アクチボラグ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＴＥＬＡ Ｒ＆Ｄ ＡＢ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１８日（２００７．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４８８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７５０４５
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５０８１５７８４２）カルテラ、アールアンドデー、アクチボラグ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＴＥＬＡ Ｒ＆Ｄ ＡＢ
【Ｆターム（参考）】
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