インビボでウイルス複製を阻害する方法
本発明は、とりわけポリエチレングリコールで修飾された治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなるインビボでのウイルス複製を調節する方法、ウイルス複製を調節すると同時に癌を処置する方法、および患者における一酸化窒素レベルを調節する方法を対象とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス複製を阻害する方法、癌を処置する方法、転移を処置および／または抑制する方法、およびウイルス複製を阻害すると同時に癌を処置または転移を処置および／または抑制する方法等を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染は、肝炎およびＨＩＶを含む数種のウイルスに直接起因して毎年、数百万人の死亡を導く主な死亡原因である。
【０００３】
肝炎はヒト肝臓の疾患である。これは肝臓の炎症により現れ、そして通常はウイルス感染により引き起こされる。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ型肝炎のような数種のウイルスはウイルス性肝炎を引き起こすことが知られている。それらの中でもＨＢＶおよびＨＣＶが最も深刻である。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は汎発流行病であり、世界中で１億７千万人以上が感染している。ウイルス性疾患の中で、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は５倍以上に広がっており、そして今年、慢性ＨＣＶ感染から生じる肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）から約１０，０００人のアメリカ人が死亡するであろう（非特許文献１。Ｃ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌の発病率および補因子：台湾における１２，００８名の男性の予測実験；非特許文献２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染患者に対する取り組み；非特許文献３。Ｃ型肝炎の経過と結果；非特許文献４。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止）。さらに血液ドナーのスクリーニングプログラムの設定にもかかわらず、ＨＣＶの有病率は米国、西欧およびアジアで増え続けている。慢性疾患への進行はほとんどのＨＣＶ感染患者で起こる。さらに毎年、ＨＣＶはすべての慢性的に感染した個体の１〜４％にＨＣＣを引き起こす。さらにＨＣＣは肝硬変でなくても起こり得る（非特許文献６。腫瘍除去後のインターフェロン治療はＣ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌を持つ患者の予後を改善する；非特許文献７。Ｃ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌における新規腫瘍マーカーの同定；非特許文献８。日本におけるＣ型肝炎ウイルス感染と関連する肝細胞癌：予測可能な将来の他国への投影；非特許文献９。Ｃ型肝炎ウイルスが関連する肝細胞癌の自然経過および病因）。現在３０〜５０歳の人のＨＣＶ感染の有病率を仮定すると、ＨＣＣの発生数および死亡率は米国では次の１０〜２０年で２倍になると推定される（非特許文献１０。米国における肝細胞癌およびＣ型肝炎）。世界中で５億人がＨＣＶに感染していると予想される。現在、効果的な免疫感作法は無く、そしてＣ型肝炎は衛生および環境条件における改善、ならびに伝染経路の中断のような他の予防的方法により防除できるだけである。
【０００５】
今日、外科的切除以外にＨＣＣの効果的治療は無い（非特許文献１１。成人の肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断および処置に関するガイドライン；非特許文献１２。米国における肝細胞癌およびＣ型肝炎；非特許文献１３。肝細胞癌の世界的流行疫学；非特許文献１４。肝細胞癌：全身的処置；非特許文献１５。肝硬変を持つ１１０名の患者を対象とした肝細胞癌の高周波切除。；非特許文献１６。肝臓および胆管）。しかしわずか５％未満のＨＣＣ患者が外科的処置の対象であり、そして〜１％が実際に切除を受けているだけである。これらの切除された患者でさえも、特にＨＣＶに感染している者がＨＣＣを再発することは多い。
【０００６】
アミノ酸除去療法（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）は幾つかの癌の処置には効果的な手段である。正常な細胞はアルギニンを必要としないが、多くの癌細胞株はこのアミノ酸について栄養素要求的である。すなわち限定するわけではないがＨＣＣを含む癌は、アルギニン除去療法により選択的に殺すことができる（非特許文献１７。ペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ）は、インビトロおよびインビボでヒトのメラノーマおよび肝細胞癌を抑制する；非特許文献１８。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素であるアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学的修飾；非特許文献１９。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）から精製したアルギニンデイミナーゼのインビボ抗腫瘍活性；非特許文献２０。インビトロにおけるマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）のデイミナーゼの増殖阻害活性に対するヒトメラノーマ細胞株の高い感受性。インビトロにおけるマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）のデイミナーゼの増殖阻害活性に対するヒトメラノーマ細胞株の高い感受性）。この療法は、アルギニンがシトルリンから合成できるのでヒトではアルギニンが必須アミノ酸ではないために十分に耐容される（非特許文献２１。ヒトのアミノ酸要求；非特許文献２２。小児のアルギニン要求。および総説については非特許文献２３を参照にされたい。アルギニン要求における種の変動。Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋの栄誉をたたえるシンポジウムの講演収録−アンモニアから癌および遺伝子発現までにおいて（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｈｏｎｏｒｉｎｇ Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ Ａｍｍｏｎｉａ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。ＡＤＩは細胞外アルギニンをシトルリンに転換し、これは正常な細胞に取り込まれ、そして細胞内でアルギニンに転換され得るが、癌細胞、特にＨＣＣ細胞はそれらが律速酵素であるアルギニノコハク酸シンターゼを欠くので転換できない（非特許文献１７。ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ）はインビトロおよびインビボでヒトのメラノーマおよび肝細胞癌を抑制する）。このアルギニノコハク酸シンターゼを発現できないことは、最近、他者によって確認された（非特許文献２４。細胞培養中の組換えアルギニンデイミナーゼの抗増殖活性に対する耐性は、内因性酵素アルギニノコハク酸シンターゼと相関する）。我々はこのアルギニノコハク酸シンターゼ欠失の実験を他の腫瘍に拡大した（非特許文献２５。ヒトの癌におけるアルギニノコハク酸シンターゼ欠失の方法発病率および分布：アルギニン除去に対して感受性の癌を同定する方法）。ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗのヒト臨床試験からの予備結果は、この治療が抗癌療法として安全かつ効果的であることを示す。
【０００７】
Ｂ型肝炎ウイルス感染は、広スペクトルの肝臓傷害を導く可能性がある。さらに慢性のＢ型肝炎感染は、死亡の主な原因である後の肝細胞癌の発症に関連した。現在のＨＢＶ感染の防止は、安全かつ効果的なＢ型肝炎のワクチン接種である。しかしワクチン接種はすでに感染した人（すなわち保菌者および患者）の処置には効果的ではない。
【０００８】
後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、症例が過去数年間に劇的に増加したと報告された致命的な疾患である。ＡＩＤＳウイルスは１９８３年に最初に同定された。幾つかの名前および頭字語が知られて来た。これは３番目に知られたＴ−向リンパ性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）であり、そして免疫系の細胞内で複製する能力を持ち、顕著な細胞破壊を引き起こす。ＡＩＤＳウイルスはレトロウイルスであり、このウイルスは複製中に逆転写酵素を使用する。この特定のレトロウイルスはリンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）、そして最も最近ではヒト免疫不全症ウイルス（ＬＩＶ）として知られている。ＨＩＶの２つの異なるファミリー、すなわちＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が今日までに記載された。本明細書では頭字語“ＨＩＶ”は、総称的にヒト免疫不全症ウイルスを指すために使用する。
【０００９】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型は、ヒトに通常感染している持続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）ウイルスである；それらはヒトの疾患に種々の問題を引き起こす。ＨＳＶ１型は、口腔の“熱性疱疹”（再発性口唇疱疹）を引き起こし、そしてＨＳＶ２型は世界の多くの場所で主な性病となった陰部疱疹を引き起こす。完全に満足のいく陰部疱疹の処置は現在存在しない。さらに稀ではあるが、ＨＳＶは脳炎も引き起こし、これは生命を脅かす脳の感染となる（非特許文献２６；非特許文献２７）。最も重篤なＨＳＶが引き起こす疾患は樹枝状角膜炎、これは角膜に分枝損傷を生じる目の感染であり、後に永久的瘢痕化、そして視野の喪失を導く可能性がある。ＨＳＶの目の感染は失明の主な原因である。ＨＳＶは治療が不可能ではないが難しいウイルスである。
抗ウイルス療法
現行の抗ウイルス療法には幾つかの問題がある。第１に相対的に効果的な抗ウイルス剤がほとんどない。多くの既存の抗ウイルス剤は逆または望ましくない副作用を引き起こす。最も効果的な治療（ワクチン接種のような）は、ただ１種類のウイルス株について高度に特異的である。しばしばウイルスは突然変異を受けるので、薬剤またはワクチンのいずれにも耐性となる。
【００１０】
ウイルス感染に関する多くの現行の処置は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を中心に展開している。ＩＦＮ−αは細胞受容体に結合し、そしてタンパク質合成に関与する酵素を含む細胞内応答を開始する。これは最終的に抗ウイルス活性／応答を導く。しかし種々の臨床試験からのデータは、ＩＦＮ−αで処置した患者の約４０％が最初は治療に応答するが、これらの７０％が処置の終了後には逆戻りすること示した（非特許文献２８）。全体として、長期治療効果および応答は、患者の１０〜３０％で観察されただけである（非特許文献２９）。加えてインフルエンザ、疲労、筋肉および頭痛、さらには鬱、体重減少および下痢のような多くの副作用が観察された（非特許文献２８）。
ＨＣＶ療法
ＨＣＶ感染の現在の標準的療法は、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α（ＩＦＮ）およびリバビリンである。この療法は持続的な抗ウイルス応答を生じることができるが、有意な数の患者がこの療法に応答せず、またはこの処置から排除される（非特許文献３０。Ｃ型肝炎の患者を対象とした抗ウイルス処置の驚くべき小効果；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染にはペグインターフェロンアルファ−２ａにリバビリンを加える；非特許文献２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染の患者に対する取り組み；非特許文献３３。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止；非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。例えばリバビリンを加えたＰＥＧ−ＩＦＮ α−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（商標））、およびリバビリンを加えたＰＥＧ−ＩＦＮ α−２ｂ（Ｐｅｇｉｎｔｒｏｎ（商標））の最近の実験は、試験した患者の〜５６％が持続的なウイルス応答を有することを示す（非特許文献３５。これまでの治療に無応答である患者を対象とした慢性Ｃ型肝炎の処置；非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３７。慢性Ｃ型肝炎の処置：系統的総説；非特許文献３８。Ｃ型肝炎の最適な治療；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３９。Ｃ型肝炎の治療の紹介；非特許文献４０。２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果；非特許文献４１。ポリエチレングリコール−インターフェロン：Ｃ型肝炎ウイルス治療における現状；非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。しかし、米国および西欧で最も多い遺伝子型であるＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂについて、応答はわずか〜４６％であった。ＨＣＶ遺伝子型２および３はより良い応答を有した（７６％〜８２％）。さらにこの〜５０％の応答率は、臨床試験で実験した患者に関するもののみである；これは全患者群を表してはおらず、したがって偏っている（非特許文献３５。これまでの治療に無応答である患者を対象とした慢性Ｃ型肝炎の処置；非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３７。慢性Ｃ型肝炎の処置：系統的総説；非特許文献３８。Ｃ型肝炎の最適な治療；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルスにはペグインターフェロンアルファ−２ａにリバビリンを加える；非特許文献３９。Ｃ型肝炎の治療の紹介；非特許文献４０。２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果；Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ ２００２、非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。例えば米国における大規模実験では、選択基準により潜在的患者１３３７名のうち４０４名が排除された（すなわち〜３０％）（非特許文献４２。慢性Ｃ型肝炎の初期の処置としてインターフェロンアルファ−２ｂ単独またはリバビリンとの併用。肝炎国際治療グループ）。他の大規模な実験はしばしば失敗し、それらのスクリーニング基準または登録した患者の割合を記載できない。大きな教育病院により米国で行われた最近の実験は、全ＨＣＶ患者の７２％が医学的または精神的禁忌、進行中の薬物またはアルコール乱用、評価手順の固守の失敗、正常肝臓酵素、または処置無しを好む患者といったような理由からＩＦＮで処置されなかった（非特許文献３０。Ｃ型肝炎の患者を対象とした抗ウイルス処置の驚くべき小効果）。同様の結果が他でも確認された（非特許文献４３。Ｃ型肝炎患者における抗ウイルス療法の使用）。このようにＨＣＶに感染した群の有意な部分が、様々な医学的または精神的禁忌から現在「最高標準の手当」である処置を受けていない。米国および西欧における「最高」の患者を使用した実験でも、〜５０％が持続的ウイルス応答に達するだけである。
【００１１】
ＩＦＮ−αもＰＥＧおよび非ＰＥＧを配合した形の両方でおよそ同じ頻度で起こる有意な副作用を有する（非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ ２００２、非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染の患者に対する取り組み；非特許文献４。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止）。これらの副作用には実験した８２％までの患者で熱を伴うインフルエンザ様の病気、悪寒、筋痛および不定愁訴を含み、〜２０％の患者には鬱、短気および鬱と不安のような神経精神的合併症を伴う。顆粒球減少症、貧血または血小板減少症を伴う骨髄抑制が、脱毛と同じように〜５％で起こる。これらの副作用は大変重篤であることが多いので、さらなるＩＦＮアルファでの処置は中断され、すなわちＩＦＮ治療をさらに限定する。したがってＨＣＶに関する新たな処置が必要である。
ＨＩＶ療法
幾つかの薬剤は、アジドブジン（ａｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ：ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、ｄ４Ｔ、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（エピビル（ｅｐｉｖｉｒ）、３ＴＣ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）を初めとしてＨＩＶの処置に認可された。非特許文献４４および非特許文献４５を参照にされたい。ＨＣＶに関する別の処置は、リバビリンであった。リバビリンは広範囲の標的ウイルス活性を持つ抗ウイルス剤である。リバビリンは修飾塩基を有するグアノシン類似体であり（１−β−Ｄ−リボ−フラノシル− −１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）、そしてグアノシン三リン酸塩の低下をもたらす細胞酵素であるイノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼを阻害することが提案された。非特許文献２８。しかしリバビリンは副作用を引き起こす。非特許文献４６。特にリバビリンは患者の赤血球に蓄積し、そして溶血性貧血を引き起こす可能性がある。
【００１２】
ＡＩＤＳワクチン（Ｓａｌｋ’ｓワクチン）が試験され、そしてＣＤ８に由来するケモカインである数種のタンパク質がＨＩＶサプレッサーとして作用することが見いだされた。上記の合成ヌクレオチド類似体、タンパク質および抗体に加えて、数種の植物および植物由来物質が、インビトロの抗ＨＩＶ活性を有することが分かった。しかしＨＩＶウイルスは容易に破壊されず、また宿主細胞のウイルス複製を防ぐ良いメカニズムもない。
アルギニン除去のインビトロ使用
過去３０年間にわたり、多くの実験で細胞外アルギニンはインビトロでウイルスの複製に必要であることが証明された。過去にはこれはアルギニンを欠く組織培養基を作成し、そしてアルギニンを含まない培地を達成するために補充物として使用する血清を透析することにより成された。アルギニンの除去を達成するためにこの方法を使用すると、ウイルスの多数の多様なファミリーの複製に阻害を生じ、それらには；アデノウイルス（非特許文献４７。アデノウイルス複製のアルギニン依存性およびウシ肺疫菌様微生物によるプラーク形成の阻害）、ヘルペスウイルス（非特許文献４８。ヒト細胞における単純ヘルペスウイルスのアミノ酸要求）、ＳＶ４０（非特許文献４９。腫瘍およびＳＶ４０ウイルスのウイルス抗原の合成に及ぼすアルギニンおよび他のアミノ酸の離脱効果）、サイトメガロウイルス（非特許文献５０。サイトメガロウイルス感染におけるアルギニン依存的反応）、ＲＳウイルス（非特許文献５１。ＲＳウイルス複製の後期同時性）、ポリオーマウイルス（非特許文献５２。ポリオーマに感染したマウス胚細胞における非機能的アルギニン生合成経路）、ニューカッスル病ウイルス（非特許文献５３；ニューカッスル病ウイルスの集成に関する実験：ウイルス複製におけるアルギニン依存的段階）、麻疹ウイルス（非特許文献５４；ＨｅＬａ細胞における麻疹ウイルスのアミノ酸要求）、インフルエンザ（非特許文献５５；インフルエンザウイルス伝播の改善された方法。Ｉ．細胞培養におけるウイルス再生の強化）、および恐らく、より関連性のあるワクシニアウイルス（非特許文献５６、Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｌ細胞におけるワクシニアウイルスの伝播のためのアミノ酸要求。非特許文献５７、ワクシニアウイルスの増殖に及ぼすマイコプラズマの効果：アルギニンの要求。非特許文献５８、ＫＢ細胞におけるワクシニアウイルスの後期ｍＲＮＡ転写に関するアルギニン要求。非特許文献５９、ワクシニアウイルスの複製に及ぼすアルギニン除去の効果）、家兎痘ウイルス（非特許文献６０。家兎痘ウイルスに感染したマウス肉腫１８０細胞におけるシトルリンの強化された利用）が含まれる。ワクシニアウイルスは天然痘（バリオーラウイルス）を含むオルトポックスウイルス属の原型的なメンバーである。ウイルス複製の阻害は、たとえタンパク質合成および感染細胞の複製が影響を受けなくてもインビトロで観察される。
【００１３】
アルギニンを分解する酵素は知られており、そしてアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）を含む。しかしそのような異種タンパク質を治療的に使用することに伴う問題は、その抗原性である。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニンデイミナーゼの、シアヌル酸クロライド連結基を介するポリエチレングリコールを用いた化学的修飾は、非特許文献１８に記載された（マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素アルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学修飾）。しかし修飾されたタンパク質は、シアヌル酸クロライド連結基に由来するシアン化物の放出により、代謝された時に毒性であった。
【００１４】
従来技術に付随する問題が無いウイルス複製の阻害する方法が必要である。本発明はこれらの、ならびに他の重要な目的を対象とする。
【参考文献】
【００１５】
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【非特許文献３０】Ｆａｌｃｋ−Ｙｔｔｅｒ Ｙ，Ｋａｌｅ Ｈ．Ｍｕｌｌｅｎ ＫＤ，Ｓａｒｂａｈ ＳＡ，Ｓｏｒｅｓｃｕ Ｌ．ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ ＡＪ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３６：２８８−２９２，２００２
【非特許文献３１】Ｆｒｉｅｄ ＭＷ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：Ｓ２３７−Ｓ２４４，２００２
【非特許文献３２】Ｆｒｉｅｄ ＭＷ．，Ｓｈｉｆｆｍａｎ ＭＬ，Ｒｅｄｄｙ ＫＲ，Ｓｍｉｔｈ Ｃ，Ｍａｒｉｎｏｓ Ｇ，Ｇｏｎｃａｌｅｓ ＦＬ Ｊｒ，Ｈａｅｕｓｓｉｎｇｅｒ Ｋ，Ｄｉａｇｏ Ｍ，Ｃａｒｏｓｉ Ｇ，Ｄｈｕｍｅａｕｘ Ｋ，Ｃｒａｘｉ Ａ，Ｌｉｎ Ａ，Ｈｏｆｆｍａｎ Ｊ，Ｙｕ Ｊ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：９７５−９８２，２００２
【非特許文献３３】Ｌａｕｅｒ ＧＭ，Ｗａｌｋｅｒ ＢＤ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４５：４１−５２，２００１
【非特許文献３４】Ｍａｎｎｓ ＭＰ，ＭｃＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＪＧ，Ｇｏｒｄｏｎ ＳＣ，Ｒｕｓｔｇｉ ＶＫ，Ｓｈｉｆｆｍａｎ Ｍ，Ｒｅｉｎｄｏｌｌｅｒ Ｒ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＺＤ，Ｋｏｕｒｙ Ｋ，Ｌｉｎｇ Ｍ−Ｈ，Ａｌｂｒｅｃｈｔ ＪＫ，Ｌａｎｃｅｔ ３５８：９５８−９６５，２００１
【非特許文献３５】Ｄａｎｔｚｌｅｒ ＴＤ，Ｌａｗｉｔｚ ＥＪ，Ｃｕｒｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｐ ５：７８−８５，２００３
【非特許文献３６】Ｍａｓｃｉ Ｐ，Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ＲＭ，Ｐａｔｔｅｎ ＰＡ，Ｏｓｂｏｒｎ ＢＬ，Ｂｏｒｄｅｎ ＥＣ，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ５：１０８−１１３，２００３
【非特許文献３７】Ｃｈａｎｄｌｅｒ Ｇ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ ＭＳ，Ｊｅｎｃｋｅｓ ＭＷ，Ｔｏｒｂｅｎｓｏｎ ＭＳ，Ｈｅｒｌｏｎｇ ＨＦ，Ｂａｓｓ ＥＢ，Ｇｅｂｏ ＫＡ，Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：Ｓ１３５−Ｓ１４４，２００２
【非特許文献３８】ＤｉＢｉｓｃｅｇｌｉｅ ＡＭ，Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ＪＨ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：Ｓ１２１−１２７，２００２
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【非特許文献４２】ＭｃＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＪＧ，Ｇｏｒｄｏｎ ＳＣ，Ｓｈｉｆｆ ＥＲ，Ｓｈｉｆｆｍａｎ ＭＬ，Ｌｅｅ ＷＭ，Ｒｕｓｔｇｉ ＶＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３９：１４８５−１４９２，１９９８
【非特許文献４３】Ｄｉａｍｏｎｄ Ｃ，Ｌｅｅ ＪＨ．，Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３７：１０１２，２００２
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【非特許文献５４】Ｒｏｍａｎｏ Ｎ，Ｓｃａｒｌａｔａ Ｇ，Ａｒｃｈ Ｇｅｓａｍｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４３：３５９−３６６，１９７３
【非特許文献５５】Ｌｉｓｏｋ ＴＰ，Ｓｏｍｉｎｉｎａ ＡＡ，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ ２１：２３４−２４０，１９７７
【非特許文献５６】Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ ＯＡ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４：５８５−５９１，１９６９
【非特許文献５７】Ｓｉｎｇｅｒ ＳＨ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＥＡ，Ｂａｒｉｌｅ ＭＦ，Ｋｉｒｓｃｈｓｔｅｉｎ ＲＬ，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １３３：１４３９−１４４２，１９７０
【非特許文献５８】Ｏｂｅｒｔ Ｇ，Ｔｒｉｐｉｅｒ Ｆ，Ｇｕｉｒ Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ４４：３６２−３６７，１９７１
【非特許文献５９】Ａｒｃｈａｒｄ ＬＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＪＤ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １２：２４９−２５８，１９７１
【非特許文献６０】Ｃｏｏｋｅ ＢＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＪＤ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２１：３３９−３４８，１９７３
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを患者に投与することを含んでなるウイルス複製の調節法を対象とする。また本発明はウイルス複製を調節すると同時に、例えば肉腫、肝癌およびメラノーマを含む癌を処置する方法も対象とする。また本発明はウイルス感染についてアルギニン除去療法に対する個体の感受性を測定する方法、肝機能を改善する方法等を対象とする。本発明のこれらのおよび他の観点は、本発明の以下の詳細な説明により明らかとなる。
発明の詳細な説明
概観
本発明はポリエチレングリコールで修飾されたＡＤＩがウイルス複製を阻害するという予期せぬ知見に基づく。ＡＤＩは連結基を用いて、または無しでポリエチレングリコールに共有結合されるが、幾つかの態様では連結基を利用する。例えばＰＥＧ−２０，０００は有用な酵素活性レベル、抗原性、循環半減期、効力および比較的容易な製造を現す。
【００１７】
細胞外アルギニンの低下がウイルス複製を阻害するメカニズムは知られていない。ヒトおよびマウスのような草食動物（アルギニンに対する絶対要求性を有する肉食動物とは異なる）（総説については、Ｒｏｄｇｅｒｓ ＱＲ．１９９４．アルギニン要求における種の変動。Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋの栄誉をたたえるシンポジウムの講演収録−アンモニアから癌および遺伝子発現までにおいて（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｈｏｎｏｒｉｎｇ Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ Ａｍｍｏｎｉａ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。特別出版物８６−１９９４年４月（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６−Ａｐｒｉｌ １９９４）、６１８０１ イリノイ州 アルバナ、マンフォードホール ２１１、イリノイ大学農業実験ステーション、第９〜２１頁を参照にされたい）、およびほとんどの細胞は、アルギニンが２つの細胞内酵素（アルギニノコハク酸シンターゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼ）を使用してシトルリンから合成され得るので、成長にアルギニンを必要としない。すなわち細胞外アルギニンの排除は、シトルリンが細胞に利用され得る限りアルギニンの細胞内レベルに影響を及ぼさない。ウイルス複製は細胞内プロセスであるので、細胞外アルギニンの減少がウイルス複製を阻害できるとは予想されていない。
【００１８】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、細胞外アルギニンの低下がウイルス複製を阻害できる１つの可能なメカニズムは、一酸化窒素の合成を阻害することによる。一酸化窒素は細胞外アルギニンから合成され、すなわちこのアルギニンプールの排除は、この重要な代謝産物の生産を効果的に阻害する。一酸化窒素は幾つかのウイルス感染に対して保護的であると考えられているが（Ａｋａｉｋｅ Ｔ，Ｍａｅｄａ Ｈ．２０００．一酸化窒素およびウイルス感染。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０１：３００−３０８）、一酸化窒素合成の阻害は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＬ Ｓａｍｉｍｉ Ａ，Ｃｈｉａｎｇ ＣＳ．１９９４．誘導性一酸化窒素合成の発現。リンパ球脈絡髄膜炎のマウスを対象とした神経病理学と臨床的特徴との相関。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：３６２２−３６２９）およびＨＩＶ（Ｂｌｏｎｄ Ｄ，Ｒａｏｕｌ Ｈ，ＬｅＧｒａｎｄ Ｒ，Ｄｏｒｍｏｎｔ Ｄ．２０００．一酸化窒素の合成は初代ヒトマクロファージにおけるヒト免疫不全症ウイルスの複製を強化する。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７４：８９０４−８９１２）の複製を遮断することが示された。また一酸化窒素合成の阻害は、インフルエンザ（Ａｋａｉｋｅ Ｔ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｉｊｉｒｉ Ｓ，Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ Ｋ、Ｓｕｇａ Ｍ，Ｚｈｅｎｇ ＹＭ，Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂ、Ｍａｅｄａ Ｈ．１９９６．インフルエンザウイルスが誘導する肺炎の病原論：一酸化窒素および酸素ラジカルの両方の関与。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２４４８−２４５３；Ｋａｒｕｐｉａｈ Ｇ，Ｃｈｅｎ Ｊ−Ｈ，Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ，Ｎａｔｈａｎ ＣＦ，ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ ＪＤ．１９９８．一酸化窒素シンターゼ２−欠失マウスを対象としたインフルエンザＡウイルスの急速なインターフェロンγ−依存性クリアランスおよび肺炎の合併からの保護。Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：１５４１−１５４６）、ポリオウイルス（Ｌｏｐｅｚ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ＪＡ，Ｃａｒｒａｓｃｏ Ｌ．１９９８．２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２５３８−２５４０）、狂犬病ウイルス（Ｕｂｏｌ Ｓ，Ｓｕｋｗａｔｔａｎａｐａｎ Ｃ，Ｍａｎｅｅｒａｔ Ｙ．２００１．誘導性の一酸化窒素合成は、狂犬病ウイルスに感染したマウスの死亡を遅らせる。Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２３８−４２）およびフラビウイルス（Ｋｒｅｉｌ ＴＲ，Ｅｉｂｌ ＭＭ．１９９６．一酸化窒素およびウイルス感染；インビトロでのフラビウイルスに対する抗ウイルス活性無し、およびインビボでの実験的感染における病原への寄与に関する証拠。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９：３０４−３０６）の致命的な影響から動物を保護することも示された。しかしこれらのこれまでに使用した一酸化窒素合成インヒビターは、動物およびヒトの両方でそれらの毒性（肝不全、発作および死亡）により制限されてきた。すなわち培養基からアルギニンを排除することから生じるウイルス複製の阻害（一酸化窒素生産を明らかに排除するプロセス）が、ウイルス複製の阻害が起こる唯一のメカニズムであるといことは明らかではない。またこの一酸化窒素およびウイルス感染の刺激／阻害の二重性は、他の病理学的出来事でも一酸化窒素を用いて観察される（Ｃｏｌａｓａｎｔｉ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ．２０００．ＮＯの二重特性。Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２１：２４９−２５２）。すなわち一酸化窒素の阻害が、すべての続く感染性の出来事を排除すると期待すべきではない（Ｂｏｇｄａｎ Ｃ．２００１．一酸化窒素および免疫系。Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：９０７−９１６）。しかし過去に使用された一酸化窒素合成インヒビターとは異なり、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は一酸化窒素の生産の阻害に安全で、しかも効果的であると思われ、そしてウイルス感染に対する保護におけるこのバイオメディエーターの役割の解明を助けるために使用することができる。
定義
本開示を通じて、以下の略号を使用することができる：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニンデイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンアミド；ＳＰＡ，スクシンイミジルプロピオネート；およびＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド。
【００１９】
ポリエチレングリコールで共有的に修飾された（連結基を用いて、または用いずに）ＡＤＩは、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”または“ＰＥＧ−ＡＤＩ”と呼ぶ。
【００２０】
「ポリエチレングリコール」または“ＰＥＧ”は、分枝または直鎖の一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは少なくとも４である）で表される、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を称する。「ポリエチレングリコール」または“ＰＥＧ”はそれらのおよその重量平均分子量を示す数の接尾辞と合わせて使用する。例えばＰＥＧ−５，０００（ＰＥＧ５）は、約５，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指し；ＰＥＧ１２，０００（ＰＥＧ１２）は約１２，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指し；そしてＰＥＧ２０，０００（ＰＥＧ２０）は約２０，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指す。
【００２１】
本明細書で使用する用語「個体」は動物、幾つかの態様では哺乳動物、そして幾つか態様ではヒトを指す。用語「個体」にはそのような動物から採取した生物学的サンプルを含む。
【００２２】
本明細書で使用するように、用語「ウイルス性疾患」とはウイルスにより引き起こされる疾患および障害を指す。ウイルス性疾患には限定するわけではないが動物またはヒトを含む哺乳動物に感染するウイルスを含む。ヒトのウイルスには以下のウイルスファミリーに由来するウイルスを含む：ポックス、ヘルペス、アデノ、パポバ、パルボ、ヘパドナ、ピコルナ、カリシ、アストロ、トガ、フラビ、コロナ、パラミクソ、オルトミクソ、ブンヤ、アレナ、ラブド、フィロ、ボルナ、レオ、およびレトロ。
【００２３】
本発明により処置することができるウイルスおよび関連疾患の例には、限定するわけではないが痘瘡ウイルス（天然痘）；単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス（単純疱疹）、水痘−帯状疱疹ウイルス（水痘、帯状疱疹）、エプスタイン−バールウイルス（単核細胞症、バーキットリンパ腫）、ＫＳＨＶ（カボジ肉腫）およびサイトメガロウイルス（失明）；アデノウイルス；肝炎ウイルス（Ａ／Ｂ／Ｃ）；ポリオウイルス、ライノシルセス（ｒｈｉｎｏｃｉｒｕｓｅｓ）、風疹、黄熱、西ナイルウイルス、デング、ウマ脳炎、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、およびタバコモザイクウイルスを含む。
【００２４】
幾つかの態様では、ウイルスは中でもＨＩＶ、インフルエンザ、ポリオウイルス、単純ヘルペス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎および肝炎の他のウイルス株、カポジ肉腫、ライノウイルス、西ナイルウイルス、痘瘡およびワクシニアの１以上である。
【００２５】
本明細書で使用する「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」とは、遺伝子の発現の上昇（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の幾つかの態様では、阻害は遺伝子発現の調節の形態である。
【００２６】
本明細書で使用する用語「阻害する」とは、ベースラインと比較して質または量の低下または減少を指す。例えば本発明の内容において、ウイルス複製の阻害とは、ベースラインと比較してウイルス複製における減少を指す。幾つかの態様では、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の低下が存在する。当業者はウイルス複製が阻害されたか否か、そしてどの程度まで阻害されたかを容易に測定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する用語「約」は値の＋／−２０％、＋／−１５％、＋／−１０％、＋／−５％を指す。
【００２８】
本明細書で使用する用語「生物適合性」とは、一般に生物機能に対して有害ではなく、しかもアレルギーおよび疾患状態を含め、許容できない程度の毒性をもたらさない物質または化合物を指す。
【００２９】
「循環半減期」とは、修飾されたＡＤＩが患者に注入された後、ＡＤＩの量が元のピーク血清レベルの半分のレベルに排除されるまでの期間を指す。循環半減期は、ヒトまたはマウスを含む任意の関連する種で測定することができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「共有結合した」、「結合した」および「カップリングした」は互換的に使用され、そして直接的またはリンカーを介してＡＤＩをＰＥＧ分子に連結する共有結合を指す。
【００３１】
本明細書で使用する用語「治療に有効な量」とは、所望する治療的応答を生じるために効果的な本発明の化合物の量を意味する。具体的な治療に有効な量は、明らかに処置する特定の状態、患者の健康状態、処置する哺乳動物または動物の種類、処置期間、同時療法の性質（もしあるならば）、および使用する具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子により変動する。肝機能を改善する内容では、用語「治療に有効な量」は、肝機能を改善するポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量を指す。幾つかの態様では、治療に有効な量は個体のＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患（Ｍａｙｏ Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＭＥＬＤ）スコアを改善するために効果的である。幾つかの態様では、治療に有効な量は限定するわけではないがビリルビンレベル、クレアチレベルおよび国際的な標準比を含む肝機能マーカーの比較に基づき、肝機能の改善するために効果的である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「ウイルス複製を阻害するために効果的な量」とは、ウイルス複製レベルの低下、すなわち個体中に検出可能なウイルス量の低下（すなわちウイルス力価またはウイルス負荷量（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）の低下）を生じる、個体に投与されるポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合したＡＤＩを含んでなる化合物の量を指す。ウイルス複製を阻害するために効果的な量を測定するために、個体のウイルス負荷量を本発明の化合物で処置する前に測定し、次いで処置後に測定することができる。ウイルス複製のレベルは例えば：化合物の投与前および後にサンプル中の実際のウイルス粒子の数を定量すること、および化合物の投与前および後にサンプル中に存在する１以上のウイルス抗原のレベルを定量することを含め、多数の日常的な方法により定量することができる。幾つかの態様では、「ウイルス複製を阻害するために効果な量」は約５μＭ未満の血漿アルギニン濃度に下げるために必要な量である。血漿アルギニン濃度を測定する方法は、当該技術分野では周知である。
【００３３】
またウイルス複製に関するアッセイもウイルスインヒビターの効力を測定する能力を持つ方法を提供し、そして当該技術分野では周知である。そのようなアッセイはインビボまたはインビトロで行うことができる。ＨＣＶはチンパンジーで生じることが知られており、ここでの感染はヒトで見られる感染に良く似ている。霊長類に近いツパイアス（ｔｕｐａｉａｓ）および免疫不全症マウスでの実験的感染の報告もあった（Ｘｉｅ，Ｚ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４４，５１３（１９９８）；Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍ，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１０，９９（１９９９））。
【００３４】
ウイルス複製の阻害は、ウイルス感染またはウイルス感染の症状の重篤度の低下に貢献する。
【００３５】
本明細書で使用する用語「予防に有効な量」とは、所望する予防的応答を生じるために効果的な本発明の化合物の量を意味する。具体的な予防に有効な量は、明らかに特定のウイルス、患者の健康状態、処置する哺乳動物または動物の種類、処置期間、同時療法の性質（もしあるならば）、および使用する具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子により変動する。
【００３６】
本明細書で使用する「併用療法」とは、処置が必要な患者が疾患に関する他の薬剤をＰＥＧ−ＡＤＩと一緒に与えられることを意味する。この併用療法は、個体を最初に１以上の薬剤で処置し、ついで他のまたは２以上の薬剤を同時に与える順次の治療であることができる。
【００３７】
本明細書で使用する「アルギニン除去療法」という句は、患者のアルギニンレベルを下げる、最小にする、または廃する（ａｂｏｌｉｓｈ）薬剤の使用を含む処置計画を指す。アルギニン除去療法はしばしばＡＤＩを使用して行う。アルギニン除去療法およびアルギニン除去療法に使用する薬剤は、査定された１９９８年２月１３日に出願された米国特許出願第０９／０２３，８０９号明細書、現在では２００１年２月６日に発効された米国特許第６，１８３，７３８号明細書；および２０００年２月１５日に出願された係属している米国特許出願第０９／５０４，２８０号明細書に詳述されている（それぞれ引用により全部、本明細書に編入する）。
【００３８】
本明細書で使用する用語「１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体」とは、１以上のウイルスについて陽性であるとは診断されなかったが、最近の高リスクな活動または彼らをウイルスと接触にさせるような活動から、１以上のウイルスに暴露された可能性がある個体を指す。例えばＨＩＶに暴露されたと疑われる個体は、ＨＩＶを含むサンプルまたはＨＩＶに感染した個体のいずれかと接触した針で刺された個体を指す。そのようなサンプルの例には限定するわけではないが、研究または調査サンプルまたは患者に由来する血液、精液、身体の分泌物等のサンプルを含む。ＨＣＶに暴露されたと疑われる個体には、未知の品質の血液の輸血を受けた個体を含む。輸血される血液は試験されなかったかもしれないし、または血液がＨＣＶを含まないことを示す試験結果は信頼できないか、または疑わしい。幾つかの態様では、ウイルスに感染したことが疑われる個体には、例えば性交、他人の体液との接触、皮下注射針の共有等を介することを含め、他人を介してウイルスへ暴露された個体を含む。ウイルスが最初に生じた個体はウイルスの存在および／または不存在について試験されたかもしれないし、またはされなかったかもしれない。また用語「１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体」には、１種のウイルスについて陽性であるとすでに診断されたが、少なくとも１つのさらなるウイルスにも感染している個体を含む。例えばＨＩＶに感染している個体は、１以上の形態の肝炎にも陽性であることが多い。そのような個体は、１以上のウイルスに関して「高リスク」であると分類することができる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「選択的に阻害する」とはウイルス複製の選択的阻害を指し、そして幾つかの態様では、ウイルスｍＲＮＡレベルのＣＣ５０／ＥＣ５０％の比である。ＳＩ＞１０はウイルス複製の選択的阻害を反映していると考える。
【００４０】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、患者に由来する生物学的物質を指す。本発明によりアッセイされるサンプルは、いかなる特別な種類にも限定されない。サンプルには非限定的例として、単細胞、多数の細胞、組織、腫瘍、生物学的流体、生物学的分子、または前記の上清もしくは抽出物を含む。例には生検用に採取した組織、切除中に採取した組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜および糞便サンプルを含む。使用するサンプルはアッセイ形式、検出法およびアッセイする腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づき変動する。サンプルを調製する方法は当該技術分野では周知であり、そして利用する方法に適合するサンプルを得るために容易に調整することができる。
ＡＤＩ
アルギニンデイミナーゼはアルギニンのシトルリンへの転換を触媒し、そしてアルギニンを排除するために使用することができる。本発明では、アルギニンデイミナーゼ遺伝子を誘導し、クローン化するか、あるいは例えば微生物、組換えバイオテクノロジー、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の起源から生産することができる。アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物からクローン化することができる。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、またはそれらの任意の組み合わせからクローン化することができる。幾つかの態様では、本発明で使用するアルギニンデイミナーゼは、配列番号１〜１０および１３〜２１の１以上のアミノ酸配列を有することができる。
【００４１】
天然のアルギニンデイミナーゼは微生物中に見いだすことができ、そして抗原性であり、そして患者の循環から素早く排出される。これらの問題はアルギニンデイミナーゼにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有的に修飾することにより克服することができる。ポリエチレングリコール（連結基を含むか、または含まない）で共有的に修飾したアルギニンデイミナーゼは、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”と呼ぶ。天然のアルギニンデイミナーゼと比較した時、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性をほとんど保持し、はるかに抗原性が低く、大きく延びた循環半減期を有し、そして腫瘍の処置にはさらに一層効果的である。
【００４２】
ある種の欠点が生物由来のアルギニンデイミナーゼの単離に付随していた。インビトロで腫瘍細胞を殺すには効果的であるが、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から単離されたアルギニンデイミナーゼは、中性ｐＨでは酵素活性がほとんどなく、そして実験動物の循環から素早く排出されたので、インビボで効力を現すことはできなかった。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）由来のアルギニンデイミナーゼ（配列番号５）は、例えばＴａｋａｋｕ，Ｈ，Ｔａｋａｓｅ，Ｍ，Ａｂｅ Ｓ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ．（１９９２）。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）から精製したアルギニンデイミナーゼのインビボ抗腫瘍活性。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：２４４−２４９、および米国特許第５，４７４，９２８号明細書に記載され、その開示は引用により全部、本明細書に編入する。そのような異種タンパク質の治療的使用に付随する問題は、その抗原性である。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニンデイミナーゼのシアヌル酸クロライド連結基を介したポリエチレングリコールでの化学修飾は、Ｔａｋａｋｕ，Ｈ，Ｍｉｓａｗａ，Ｓ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ．（１９９３）。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素であるアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学的修飾。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：１１９５−１２００に記載されている。修飾されたタンパク質は、シアヌル酸クロライド連結基に由来するシアン化物の放出により、代謝された時に毒性であった。
【００４３】
また組換えＤＮＡ技法を介するアルギニンデイミナーゼの生産も、ある種の欠点を提供する。例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で生産されたアルギニンデイミナーゼは酵素的に不活性であり、すなわち酵素的に活性となるためには変性させ、そし正しく再生しなければならない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産されたアルギニンデイミナーゼを再生するための常法は、不活性酵素を単離し、塩酸グアニジンに溶解し、そして低イオン強度のバッファーに迅速に希釈することにより再生することである。この最終工程には大変大容量のバッファーを必要とし、これによりアルギニンデイミナーゼの製造が経費がかかり、しかも時間を要するものとなる。しかし組換え技法はある種の利点を有する。例えば宿主としてより発酵し易い微生物を使用することができる。さらにこれらの発酵宿主は一般に病原性がさらに低く、そして大量のアルギニンデイミナーゼを得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は大量のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）アルギニンデイミナーゼを生産できることが示された。
【００４４】
アルギニンデイミナーゼ酵素の化学的および遺伝的修飾は、その生物学的活性に影響を及ぼすことができる。例えばアルギニンデイミナーゼは多くは抗原性であり、そして患者の循環から素早く排出されることが示された。しかしポリエチレングリコールを含むアルギニンデイミナーゼの製剤は抗原性を下げ、そして酵素の循環半減期を上げることも示された。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６（１９８４）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６（１９７７）。特にアルギニンデイミナーゼはポリエチレングリコールで共有的に修飾することができる。ポリエチレングリコールで共有的に修飾されたアルギニンデイミナーゼ（連結基を含むか、または含まない）は、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”と呼ぶ。米国特許出願第０９／０２３，８０９号明細書でＣｌａｒｋは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（配列番号１）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（配列番号５）およびマイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（配列番号７）に由来するアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールで改善された修飾を記載し、それらの開示は引用により全部、本明細書に編入する。天然のアルギニンデイミナーゼと比較した時、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性をほとんど保持し、はるかに抗原性が低く、大きく延びた循環半減期を有し、そして腫瘍の処置にさらに一層効果的である。本発明の目的のためのポリエチレングリコールを用いたアルギニンデイミナーゼの修飾をペグ化と呼ぶことができる。
【００４５】
他の生物に由来するアルギニンデイミナーゼも、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位に対応するペグ化部位を有するかもしれないと理解される。例えばストレプトコッカス ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、１０４位にリシンを有し、マイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１０６位にリシンを有し、そしてキアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１１４位にリシンを有する。さらに数種の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位と同じ全体的に位置に対応するリシンを有し得る。そのような生物に由来するアルギニンデイミナーゼのリシンの位置を以下に示すことができる：
【００４６】
【表１】
【００４７】
現在、そのようなリシンまたはそれらの組み合わせへのポリエチレングリコールの結合が酵素を不活性化できると考えられている。現在、そのようなリシンでのアミノ酸置換はペグ化でその酵素的活性の損失がより少ないタンパク質をもたらすことができると考えられている。
【００４８】
幾つかの態様では、本発明はアルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、ペグ化で活性の損失が少ない修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供し、すなわちペグ化で、修飾されたアルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少は、非修飾アルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少よりも少ない。酵素の触媒領域での、またはそれに隣接するペグ化部位を排除することにより、最適なペグ化がこれまでの活性の損失無しに達成される。上記で検討したように特定の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖上の様々な位置に配置されるペグ化部位を有する。本発明を限定するわけではないが、現在、アルギニンデイミナーゼは酵素の触媒領域、またはそれに隣接するアミノ酸リシンを有する可能性があり、そしてこれら部位のペグ化が酵素を不活性化し得ると考えられる。これらペグ化部位の少なくとも１つを排除することにより、ペグ化を行い、そしてより多くの酵素活性を保持することができる。本発明に従い、幾つかの態様でリシンはグルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはそれらの組み合わせと置換される。幾つかの態様ではリシンはグルタミン酸に置換される。本発明の幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ１１２、Ｌｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、Ｌｙｓ４０８またはそれらの組み合わせまたは副次的組み合わせでアミノ酸置換を有する。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ１１２からＧｌｕ１１２、Ｌｙｓ３７４からＧｌｕ３７４、Ｌｙｓ４０５からＧｌｕ４０５、Ｌｙｓ４０８からＧｌｕ４０８またはそれらの組み合わせへのアミノ酸置換を有する。幾つかの態様ではマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、グルタミン酸に置換される１１２位のリシンを有する（配列番号２）。
【００４９】
このように本発明は、アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。そのようなアミノ酸置換はアルギニンデイミナーゼのペプチド鎖中で問題の多い特徴的構造を排除することができる。そのようなアミノ酸置換は、修飾されたアルギニンデイミナーゼの改良された復元を提供する。これらのアミノ酸置換は、減少させたバッファー量を使用して修飾されたアルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能とする。これらのアミノ酸置換はまた、復元した修飾アルギニンデイミナーゼの収量の増加も提供する。本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼはＰｒｏ２１０で１つのアミノ酸置換を有する。上記のように、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸プロリンを有する。本発明を限定するわけではないが現在、２１０位のアミノ酸プロリンの存在が、アルギニンデイミナーゼの復元（すなわちリフォールディング）の難しさを増す正常なポリペプチド鎖中に曲がりおよびよじれを生じると考えられている。２１０位でのプロリンの置換は、減少したバッファー量を使用して修飾アルギニンデイミナーゼの迅速な復元性を可能とする。２１０位のプロリンの置換は、復元される修飾アルギニンデイミナーゼの収量の上昇も提供することができる。幾つかの態様では２１０位のプロリンは、セリンに置換される（配列番号３）。本発明の観点に従い、２１０位での他の置換も行うことができると理解される。置換の例には、Ｐｒｏ２１０からＴｈｒ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｒｇ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｓｎ２１０、Ｐｒｏ２１０からＧｌｎ２１０またはＰｒｏ２１０からＭｅｔ２１０を含む。野生型アルギニンデイミナーゼの２１０位のアミノ酸に伴うこれらの構造的特徴を排除することにより、酵素の正しいリフォールディングを達成することができる。
【００５０】
本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼが多数のアミノ酸置換を有する。この修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の触媒領域で、またはそれに隣接したペグ化部位を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換を有することができる。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の復元を妨害するこれら構造的特徴を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換も有することができる。このようにアミノ酸置換は、本発明の修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供することができる。アミノ酸置換は、酵素活性を失う事なく修飾されたアルギニンデイミナーゼのペグ化を提供することができる。アミノ酸置換は、減少したバッファー量を使用して迅速に復元することができる修飾アルギニンデイミナーゼを提供することができる。またアミノ酸置換は、上昇した収量の復元された修飾アルギニンデイミナーゼを提供することもできる。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼはセリンに置換される２１０位でのプロリン、およびグルタミン酸で置換される１１２位のリシンを含む（配列番号４）。しかし上記に検討したように、修飾されたアルギニンデイミナーゼは他の置換を含んでもよいと理解される。幾つかの態様では、保存的置換を野生型アルギニンデイミナーゼの１１２位および／または２１０位に作成してもよい。
【００５１】
修飾されたアルギニンデイミナーゼはＪＭ１０１細胞でＴａｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，同上に記載されたように発現された。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、１１２位のグルタミン酸および２１０位のセリンを含んだ。幾つの態様ではマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４の配列である。
【００５２】
幾つかの態様ではアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、キアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム パーフリンゲス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ）、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）またはキアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来することができる。
【００５３】
幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来する（配列番号１）。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒへの置換を含んでなる。
【００５４】
本発明の幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼが修飾され、そして少なくとも１つのアミノ酸置換もしくは欠失を含んでなり、ここで修飾されたアルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて触媒領域に、またはそれに隣接して減少した数のペグ化部位を有する。幾つかの態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２、３７４、４０５または４０８のリシン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つか態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２、３７４、４０５または４０８のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つか態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕへの置換を含んでなる。幾つか態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼはさらに少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失を含んでなる。
【００５５】
幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。
【００５６】
幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて触媒領域に、またはそれに隣接して少なくとも１つのペグ化部位が自由になるように修飾されたアルギニンデイミナーゼを含んでなり、ここで該修飾されたアルギニンデイミナーゼは配列番号１の残基１１２、３７４、４０５もしくは４０８に、またはそれに対応して少なくとも１つのアミノ酸置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのアミノ酸の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのアミノ酸の置換もしくは欠失は、さらに少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。
【００５７】
幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号２）。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号３）。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換、および配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号４）。幾つか態様では、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号５の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号６）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１および１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号８）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号９）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号１０）。
【００５８】
そのような修飾および／または置換ならびにヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、２００１年２月６日に発効された米国特許第６，１８３，７３８号明細書および２０００年５月４日に出願された同時係属出願第０９／５６４，５５９号明細書に記載され、それぞれ引用により全部、本明細書に編入する。
ポリエチレングリコール
分子量および連結基が異なる多くのポリエチレングリコールを利用することができる。これらのＰＥＧはタンパク質の抗原性、免疫原性および循環半減期に変動する効果を有することができる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｃ．ポリエチレングリコールの化学：生物工学および生物医学的応用。Ｐｐ．３４７−３７０、プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９２；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６，６２−６９，１９９５；Ｄｅｌｇａｄｏ Ｃ；Ｆｒａｎｃｉｓ ＧＥ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｄ．ＰＥＧ−結合タンパク質の使用および性質。Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．，９：２４９−３０４，１９９２）。
【００５９】
本発明の幾つかの態様では、各ポリエチレングリコール分子は約１０，０００〜約５０．０００の平均分子量を有し；約１２，０００〜約４０，０００の、約１５，０００〜３０，０００の；そして約２０，０００の平均分子量を有する。一般に３０，０００以上の分子量を持つポリエチレングリコールは溶解し難く、そして配合生成物の収量は大きく減少する。
【００６０】
ポリエチレングリコールは直鎖もしくは分枝鎖でよい。幾つかの態様ではポリエチレングリコールは直鎖である。ポリエチレングリコールの分子量の増加は、一般にＡＤＩの免疫原性を下げる傾向がある。本発明に記載する分子量を有するポリエチレングリコールはウイルス性疾患を処置するためにＡＤＩと一緒に使用することができ、そして任意に生物適合性の連結基を使用することができる。
ペグ化
ＡＤＩは、例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；およびＺａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，ポリエチレングリコールの化学；生物工学および生物医学的応用。Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編集、プレナム出版、ニューヨーク、第２１章（１９９２）に記載されているような（これらは引用により全部、本明細書に編入する）、技術的に知られている方法を使用して生物適合性の連結基を介してＰＥＧに共有結合することができる。
【００６１】
ＰＥＧをＡＤＩに共有結合するために使用する連結基は、任意の適合性連結基でよい。幾つかの態様では、連結基は生物学的適合性の連結基である。上記で検討したように、「生物学的適合性」は化合物または基が非毒性であり、そしてインビトロまたはインビボで損傷、病気、疾患または死を引き起こさずに利用することができることを示す。ＰＥＧは例えばエーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して連結基に結合することができる。適当な連結基には、例えばエステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、スクシンイミド基（例えばスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えばニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または１級アミンを含む。幾つかの態様では、連結基はエステル基および／またはスクシンイミド基である。幾つかの態様では連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳである。
【００６２】
本発明では特定の連結基がＰＥＧ−ＡＤＩの循環半減期またはその特異的酵素活性に影響は与えないと思われる。しかし連結基が使用される場合、幾つかの態様では、生物適合性の連結基を使用することが重要である。タンパク質に結合するＰＥＧはＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＳＣ−ＰＥＧのような単鎖、またはＰＥＧ２−ＮＨＳのようなＰＥＧの分枝鎖のいずれかで使用され得る。
【００６３】
あるいはＡＤＩは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介してＰＥＧに直接カップリングしてもよい（すなわち連結基無し）。幾つかの態様では、ＰＥＧはＡＤＩ上のリシン残基にカップリングされる。
ＡＤＩ−ＰＥＧ
ＰＥＧのＡＤＩへの結合はＡＤＩの循環半減期を上げる。ＡＤＩ上のＰＥＧ分子の数は酵素の循環半減期に関連するようであり、一方、保持される酵素活性の量は、使用するＰＥＧの平均分子量に関連するようである。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数の上昇は、酵素の酵素活性を減少させる。また幾つかのＰＥＧ製剤は生産することが難しく、比較的低収量の生成物を生じることが知られている。すなわち効力的な生成物を達成するためには、循環半減期、抗原性、生産効率および酵素活性の間でバランスが保たれる必要がある。
【００６４】
一般にＰＥＧはＡＤＩの一級アミンに結合する。アルギニンデイミナーゼ上のポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者に知られているようなタンパク質の活性ドイメイン内の各部位の役割により決定される。ＰＥＧは酵素活性の実質的な損失無しでアルギニンデイミナーゼの一級アミンに結合することができる。例えばマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）からクローン化されたＡＤＩは、この手順により修飾され得る約１７個の残基を有する。換言すると１７個のリシンは、ＡＤＩをＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳのような生物適合性連結基を介してＰＥＧに結合させることができるすべての可能な点である。またＰＥＧは当業者には本開示の観点から明白であるように、ＡＤＩの他の部位に結合することもできる。
【００６５】
１〜約３０個のＰＥＧ分子をＡＤＩに共有結合させることができる。幾つかの態様では、ＡＤＩは約７〜約１５個のＰＥＧ分子、約９〜約１２個のＰＥＧ分子で修飾される。換言すると、アルギニンデイミナーゼの一級アミノ基の約３０％〜約７０％がＰＥＧで修飾され、アルギニンデイミナーゼの一級アミノ基の約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、そして約５０％がＰＥＧで修飾される。幾つかの態様では、ＰＥＧがＡＤＩの末端（ｅｎｄ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に共有結合される時、わずか１個のＰＥＧ分子が利用される。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の循環半減期を上げる。しかしＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の比活性を下げる。このように幾つかの態様では、当業者には本開示の観点から明白であるように、２つの間のバランスを取る必要がある。
【００６６】
本発明では、幾つかの態様で連結基がマレイミド基を介してアルギニンデイミナーゼの一級アミンに結合する。いったんアルギニンデイミナーゼにカップリングされれば、ＳＳ−ＰＥＧはＰＥＧの隣にエステル結合を有し、これはこの部位を身体中でＡＤＩからＰＥＧを放出することができる血清エステラーゼに対して感受性とすることができる。ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル結合を持たないので、それらは血清エステラーゼに対して感受性ではない。
【００６７】
本発明に有用な特定の連結基の構造式を以下に説明する。
【００６８】
【化１】
【００６９】
【化２】
【００７０】
処置法
幾つかの態様では、本発明は個体中のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法は連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含んでなる、治療にまたは予防に有効な量の化合物を該個体に投与することを含んでなり、ここで各ポリエチレングリコール分子は、約１０，０００〜約３０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では、ＡＤＩはポリエチレングリコール分子で修飾され、各分子は約２０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では連結基はスクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの態様では、連結基はスクシンイミジルスクシネートである。幾つか態様では、約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様では、約９〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様ではアルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびそれらの組み合わせに由来する。幾つかの態様ではウイルスＨＣＶである。幾つかの態様では、方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する工程を含んでなる。
【００７１】
本発明の１つの化合物の治療に有効な量は、ウイルス複製を阻害するために効果的な量である。一般に処置は少ない投薬用量から開始し、これをその状況下で最適な効果が達成されるまで少しづつ増やしていく。一般に本発明の化合物の治療用量は、１週間に２回からおよそ２週間に１回の約１〜約２００ｍｇ／ｋｇとなり得る。例えばこの投薬用量は２ｍｌの静脈内注射として１週間に１回の約１ｍｇ／ｋｇから、３日に１回の約２０ｍｇ／ｋｇとなり得る。化合物は処置の過程を通して連続的または断続的に１回用量で投与することができる。ＡＤＩ−ＰＥＧは１日に数回、１日に１回、１週間に１回または２週間に１回投与することができる。
【００７２】
幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧは少なくとも約４０ＩＵ／ｍ２、少なくとも約８０ＩＵ／ｍ２、少なくとも約１６０ＩＵ／ｍ２、または少なくとも約２００ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与される。幾つかの態様では、投与される用量はアルギニンの血清レベルを約１０μＭ、５μＭ、１μＭ、１００ｎＭ未満に下げる。幾つか態様ではＡＤＩ−ＰＥＧ２０は毎週約１６０ＩＵ／ｍ２で投与され、患者の血清レベルを約５μＭ未満とする。
【００７３】
本発明は個体中の１以上のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様ではウイルスはヒトのウイルスである。幾つかの態様ではウイルスはＨＣＶである。幾つか態様では個体は２以上の異なるウイルスに感染している。幾つかの態様では２以上のウイルスはＨＩＶおよびＨＣＶである。幾つかの態様では、感染しているウイルスの存在および／または同一性が投与時に、または投与前には未知である。幾つかの態様では、方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する工程を含んでなる。
【００７４】
また本発明は、１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体を処置する方法を提供し、この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。上で検討したように、１以上のウイルスに感染していると診断されなかった個体の中には、彼らが恐らくウイルスに暴露された可能性がある状況におかれた者もいる。また１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体の処置には、上記のようなさらなる治療薬の投与も含む。予防的処置の過程は、ウイルス感染の兆候について周期的に監視することと一緒に行うことができる。幾つかの態様では、本発明に従う処置の開始後、個体は１以上のウイルスについて陽性であると診断される。
【００７５】
幾つかの態様では、本発明は１以上のウイルスの危険にさらされている患者のウイルス複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を個体に投与することを含んでなる。
【００７６】
幾つかの態様では、本発明はウイルス感染に感染したと同定された個体のウイルス複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を個体に投与することを含んでなる。
幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．１ｍＭ未満の濃度で効果的である。幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．０５ｍＭ未満の濃度で効果的である。幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．０１ｍＭ未満の濃度で効果的である。
【００７７】
幾つかの態様では、本発明は個体中の腫瘍を処置すると同時に１以上のウイルスの複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、腫瘍はメラノーマ、肉腫および肝癌からなる群から選択される。幾つかの態様では、腫瘍は肝癌であり、そしてウイルスはＨＣＶである。幾つかの態様では、腫瘍の存在および／または同一性は処置の時点では未知である。幾つかの態様では、ウイルスの存在および／または同一性は、処置の時点では未知である。幾つかの態様では、この方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与することを含んでなる。
【００７８】
幾つかの態様では、本発明は個体の一酸化窒素レベルを調節する方法を提供し、この方法は、ポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、調節は一酸化窒素レベルの抑制である。幾つかの態様では、この方法はさらに治療にまたは予防に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、個体は１以上のウイルスに感染したことがすでに同定されている。
【００７９】
幾つかの態様では、本発明はアルギニンのレベルを調節するためにウイルス複製の感度を測定する方法を提供し、この方法はサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ産物のレベルを測定することを含んでなる。ウイルスＲＮＡまたはそれらの産物のレベルを測定する方法は、当業者には周知である。
【００８０】
幾つかの態様では、本発明は１以上のウイルスに感染した個体中のウイルス複製を選択的に阻害する方を提供する。この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、ウイルスはＨＣＶである。幾つかの態様ではＳＩは１０より高く、１５より高く、２０より高く、または２５より高い。
【００８１】
幾つかの態様では本発明は、ポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を該個体に投与することを含んでなる、個体の肝機能を改善する方法を提供する。
【００８２】
当業者は肝機能の質を容易に測定することができる。幾つかの態様では、１以上のマーカーの相対的な量が、健康な患者と肝臓疾患または肝臓障害がある患者との間で比較される。
【００８３】
幾つかの態様では肝機能はＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患（ＭＥＬＤ）スコアを使用して評価される。肝機能を等級分けするＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスケールは、肝臓疾患における死亡率を予測するために幾つかの因子を使用する。Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスケールで考慮される因子には、ビリルビンレベル、クレアチンレベル、国際標準比（ＩＮＲ：プロトロンビン時間（凝固するための血液の能力の尺度）としても知られている）、腹部の腹水の存在および脳障害の等級を含む。等級は肝機能異常の上昇レベルに割り当てられる；等級“Ａ”は５〜６点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして最低レベルの肝異常を示す。等級“Ｂ”は７〜９点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして中間レベルの肝異常を示す。等級“Ｃ”は１０〜１５点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして最高レベルの肝異常を示す。肝機能を等級分けするＭＥＬＤスケールは、ビリルビンレベル、クレアチンレベルおよび国際標準比を考慮している。
【００８４】
幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの投与前の個体の肝機能は、Ｃｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＡ、Ｃｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＢまたはＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＣである。
【００８５】
幾つかの態様では本発明は、１以上のウイルス感染を有すると同定された個体がアルギニン除去療法に感受性であると同定する方法を提供する。この方法は個体からウイルスサンプルを得、そしてウイルス複製に適する条件下で、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在および不存在下でのサンプル中のウイルス複製を比較することを含んでなる。幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧに接触したサンプル中の少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも８０％のウイルス複製の阻害は、個体がアルギニン除去療法の候補であることの指標となり、そしてＡＤＩ−ＰＥＧによる４０％未満、３０％未満または２０％未満のウイルス複製の阻害は、個体がアルギニン除去療法の候補ではないことの指標となる。
【００８６】
幾つかの態様では、本発明は個体における１以上のウイルス感染を処置する方法を提供する。この方法は、個体が上記のアルギニン除去療法の候補であるかどうかを測定し、そして個体がアルギニン除去療法の候補であるならば個体をアルギニン除去療法で処置し、そして個体がアルギニン除去療法の候補でないならば個体を通常の抗ウイルス処置で処置することを含んでなる。
【００８７】
最も効果的な手段および投薬用量を決定する方法は、当業者には周知である。幾つかの態様では、少なくとも数週間にわたり１週間に２回の投与が使用される。しばしば抗ウイルス化合物は長期間投与され、そして個体の生涯にわたり投与され得る。最も効果的な手段および投薬用量を決定する方法は、当業者には周知である。単回または多回投与を１回用量のレベルで行うことができ、そしてパターンは管理者により選択される。
【００８８】
投与される用量は、もちろん特定薬剤の薬力学的特徴およびその投与様式および経路；個体の年齢、健康状態および／または体重；症状の性質および程度；同時治療の種類；処置頻度；個体に現れる症状；および望む効果のような既知の因子により変動するだろう。
【００８９】
ほとんどのウイルス感染の場合、抗ウイルス処置に対する応答の症状または基準は、ウイルス複製のレベルに集中する。ウイルスの循環するウイルスＲＮＡレベル、そしてその中の変化に関する試験は標準的であり、そして細胞およびヒトを含む動物に応用することができる。ヒト患者では、肝臓の活性に関する試験を行うことができる。１つの試験の例はＡＬＴ（血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）試験である。ＡＬＴは主に肝臓に見いだされる酵素であるが、程度は低いものの心臓および他の組織にも見いだされ、そして肝機能の診断に有用である。ヒトに関する正常な成人の範囲は０から約４８Ｕ／Ｌであり、最適な成人の値は約２４Ｕ／Ｌである。１以上のこれらの基準における改善は、効果的な投薬用量または処置を表示する。
【００９０】
化合物は、意図する投与形態に関して、そして従来の製薬学的プラクティスに合致するように選択される適当な製薬学的希釈剤、増量剤、賦形剤または担体（本明細書では集合的に製薬学的に許容され得る担体を指す）との混合物で投与することができる。例えば幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧはリン酸緩衝化生理食塩水、または当業者に知られている任意の他の適当な溶液と注入前に混合することができる。ＡＤＩ−ＰＥＧ製剤は所望により固体（凍結乾燥物）として、または液体製剤として投与することができる。
【００９１】
本発明の組成物は使用する投与様式に従い配合される。製薬学的組成物が注入可能な製薬学的組成物である場合、それらは滅菌され、発熱物質を含まず、そして粒子を含まない。幾つかの態様では、組成物は等張性製剤である。幾つかの態様では、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースの１以上を含むことができる。幾つかの態様では、組成物はリン酸緩衝化生理食塩水のような等張性溶液として提供される。幾つかの態様において、組成物の安定化剤にはゼラチンおよびアルブミン含む。
【００９２】
また本発明はポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療に有効な量のＡＤＩを含んでなる化合物を個体に投与することを含んでなる、患者における広スペクトルの遺伝的に多様なウイルスを処置する方法を提供する。
併用療法
本発明の化合物は他の抗ウイルス化合物と組み合わせて併用療法を提供することができる。組み合わせがＡＤＩ−ＰＥＧの化合物の抗ウイルス活性を排除しない限り、任意の既知の抗ウイルス剤を本発明の組成物と組み合わせることができる。ＨＩＶの場合、ＡＤＩ−ＰＥＧとＡＺＴ、ＴＣ−３またはプロテアーゼインヒビターとの併用療法は、いずれの薬剤を個別に使用するよりも効果的となり得る。肝炎の場合、ＡＤＩ−ＰＥＧと１以上のシクロビル（ｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ファムシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）またはバラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、インターフェロンまたはベーターグロブリンとの組み合わせを併用療法として使用することができる。例えば組換えアルファインターフェロンもＡＤＩ−ＰＥＧとの併用両方として使用することができる。
【００９３】
併用療法での使用に適する他の抗ウイルス剤は当業者に知られており、そしてそれらには限定するわけではないが中でも、１以上のＡＺＴ（ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、ｄｄＩ（ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、Ｖｉｄｅｘ）、３ＴＣ（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、Ｅｐｉｖｉｒ）、ｄ４Ｔ（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、Ｚｅｒｉｔ）、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）（Ｚｉａｇｅｎ）、ｄｄＣ（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、Ｈｉｖｉｄ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）、デラビルジン（Ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）／リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｋａｌｅｔｒａ）、アンプレナビル（Ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、アタザナビル（Ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、融合インヒビターＴ−２０、インターロイキン−２、ヒドロキシウレア、ＡＲ１７７（Ｚｉｎｔｅｖｉｒ）、フォミビルセン（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）ナトリウム（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ）、ＧＥＭ１３２、ＧＥＭ９１、ＧＥＭ９２、ＡＭＤ３１００、ｎ−ドコサノール（１−ドコサノール）、ＰＲＯ２０００、Ｔ−１２４９、Ｔ−２０、アルビドール（ａｒｂｉｄｏｌ）、ＳＰ−３０３（Ｖｉｒｅｎｄ）、ハイペリシン（ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ）（ＶＩＭＲｘｙｎ）、ＭＤＬ２８５７４、ＳＣ−４８３３４、ＡＤＡ、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ａｌｄｅｒａ）、ＩＳＩＳ５３２０、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、アデホビルジピボキシル（ａｄｅｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）（Ｐｒｅｖｅｏｎ）、ＤＡＰＤ、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｅｆｆｉｘ、Ｅｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ、Ｈｅｒｔｏｖｉｒ、Ｈｅｐｔｏｄｉｎ）、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）、オセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）（Ｔａｍｉｆｌｕ）、ピロダビル（ｐｉｒｏｄａｖｉｒ）、プレコナリル（ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ）（ＶＰ−６３８４３）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）（Ｖｉｒａｚｉｄ／Ｖｉｒａｚｉｄｅ／Ｖｉｒａｚｏｌｅ）、リマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）（Ｆｌｕｍａｄｉｎｅ）、ＷＩＮ５４９５４、ザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）（Ｒｅｌｅｎｚａ）、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（Ｆｏｓｃａｖｉｒ）、マリバビル（ｍａｒｉｂａｖｉｒ）、ＡＢＴ−３７８、アテビリジン（ａｔｅｖｉｒｉｄｉｎｅ）メシレート、カラノライド（ｃａｌａｎｏｌｉｄｅ）Ａ、カプラビリン（ｃａｐｒａｖｉｒｉｎｅ）、エファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）（Ｓｕｓｔｉｖａ）、エミビリン（ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ）（Ｃｏａｃｔｉｎｏｎ）、ＧＷ４２０ ８６７Ｘ（ａｋａ ＨＢＹ１２９３）、ＨＢＹ ０９７、Ｌ−６９７，６６Ｉ、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ＭＩＶ−１５０、ＰＥＴＴ−５、Ｒ１６５３３５−ＴＭＣ１２５、タルビラリン（ｔａｌｖｉｒａｌｉｎｅ）、チビラピン（ｔｉｖｉｒａｐｉｎｅ）、トロビルジン（ｔｒｏｖｉｒｄｉｎｅ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（Ｚｏｖｉｒａｘ）、ブリブジン（ｂｒｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｈｅｌｐｉｎ、Ｚｏｓｔｒｅｘ）、シドホビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）（Ｖｉｓｔｉｄｅ（ｉ．ｖ．）；Ｆｏｒｖａｄｅ（局所））、サイクリックＨＰＭＰＣ、ファムシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｆａｍｖｉｒ）、フィアシタビン（ｆｉａｃｉｔａｂｉｎｅ）、フィアルリジン（ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｃｙｍｖｅｎｅ／Ｃｙｔｏｖｅｎｅ）、ＧＷ−２７３１７５Ｘ、イドクスウリジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（Ｈｅｒｐｉｄ、Ｋｅｒｅｃｉｄ／Ｈｅｒｐｌｅｘ Ｌｉｑｕｉｆｉｌｍ、Ｉｄｏｘｅｎｅ、Ｖｉｒｕｄｏｘ、Ｉｄｕｒｉｄｉｎ、Ｓｔｏｘｉｌ）、ロブカビル（ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）、ネチブジン（ｎｅｔｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｏｎａｖｉｒ）、ペンシクロビル（ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｖｅｃｔａｖｉｒ／Ｄｅｎａｖｉｒ）、ソリブジン（ｓｏｒｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｕｓｅｖｉｒ）、トリフルリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）（Ｖｉｒｏｐｔｉｃ）、バラシクロビル（ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｖａｌｔｒｅｘ；Ｚｅｌｉｔｒｅｘ）、バロマシクロビル（ｖａｌｏｍａｃｉｃｌｏｖｉｒ）ステアレート（ＭＩＶ−６０６）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）（Ｖｉｒａ−Ａ）、９３５Ｕ８３、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）（Ｚｉａｇｅｎ／Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アデホビルジピボキシル（ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）（Ｐｒｅｖｅｏｎ）、アロブジン（ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）、ＡｚｄＵ、ＣＳ−９２，ＤＡＰＤ、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）（Ｖｉｄｅｘ）、ｄＯＴＣ、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）、ホジブジンチドキシル（ｆｏｚｉｖｕｄｉｎｅ ｔｉｄｏｘｉｌ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｅｐｉｖｉｒ／Ｃｏｍｂｉｖｉｒ／Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、ロブカビル（ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）、ロデノシン（ｌｏｄｅｎｏｓｉｎｅ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｅｒｉｔ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）（Ｖｉｒｅａｄ）、テノホビルジソプロキシル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）フマラート、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｈｉｖｉｄ）、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、Ａ−７７００３、ＡＧ７０８８、アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、ＢＭＳ−２３２６３２、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ＤＭＰ−３２３、ＤＭＰ−４５０、ＧＷ４３３ ９０８、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、ＫＮＩ−２７２，ラシナビル（ｌａｓｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）（Ｋａｌｅｔｒａ）、モゼナビル（ｍｏｚｅｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、ＰＤ１７８３９０、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、ＲＰＩ３１２、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｉｎｖｉｒａｅ／Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ）、ＳＣ−５２１５１、ＳＤＺ ＰＲＩ０５３、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、Ｕ−１０３０１７、Ｕ−９６９８８、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ）、ＡＧＩ５４９、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（Ｆｏｓｃａｖｉｒ）、ＬｉＧＬＡ、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）−バラシクロビル（Ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ファミシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、イドクスウリジン（Ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、フォスカルネット（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、シドホビル（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）およびアデホビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、バルサイト（Ｖａｌｃｙｔｅ）、クレブジン（ｃｌｅｖｕｄｉｎｅ）、チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）、ＩＬ−１２を含む。
【００９４】
併用療法は順次的であることができ、これは最初に１つの薬剤で処置し、次いで２番目の薬剤で処置するか、あるいは併用療法は同時に両方の薬剤で処置することができる。順次的治療は第１治療が完了した後、第２治療が始まる前の妥当な期間内であり得る。同時に両薬剤での処置は、同日の投与で、または別々の投与であることができる。例えば幾つかの態様では、１つの薬剤を用いた処置が１日目にあり、そして２日目にもう１つの薬剤を用いた処置がある。正確な処方は、処置する疾患、感染の重篤度および処置に対する応答に依存する。
【００９５】
本発明の化合物の投与のインビボ手段は、意図する応用に依存して変動する。当業者には認識されているように、本発明のＡＤＩ−ＰＥＧ組成物の投与が、例えば吸入または座薬により、あるいは膣、直腸、子宮、頬および舌組織の洗浄によるような粘膜組織へ、経口的に、局所的に、鼻内に、腹腔内に、非経口的に、静脈内に、リンパ内に、腫瘍内に、筋肉内に、間隙に、動脈内に、皮下に、眼内に、滑液包内に、経上皮的に（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）および経皮的に行うことができる。本発明の化合物は錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップおよび乳液のような経口剤形として投与することができる。化合物は静脈内（ボーラスまたは注入）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態でも投与することができ、すべての使用剤形は製薬分野の当業者には周知である。
［実施例］
本発明はさらに以下の実施例で示し、これらは具体的説明を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９６】
組換えＡＤＩの生産
マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（ＡＴＣＣ２３２４３）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（ＡＴＣＣ２３１１４）およびマイコプラズマ アルソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ２３１９２）のカルチャーは、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。
【００９７】
アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）およびマイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）からクローン化し、そしてＳ．Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により以前に記載されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。特異的な酵素活性、Ｋｍ、Ｖｍａｘおよび最適ｐＨに関して、当業者に知られている方法による各タンパク質の特性決定は、それらが生化学的に互いに区別できることを明らかにした。最適ｐＨはクエン酸バッファー（ｐＨ５〜６．５）、リン酸バッファー（ｐＨ６．５〜７．５）およびホウ酸バッファー（ｐＨ７．５〜８．５）を使用して測定した。ＫｍおよびＶｍａｘは酵素を種々の濃度のアルギニンとインキュベーションし、そしてシトルリン生産を定量することにより測定した。種々の酵素に関するＫｍは約０．０２〜０．０６μＭであり、そしてＶｍａｘは約１５〜２０μｍｏｌ／分／ｍｇであり、これらの値は互いに標準誤差内であった。
【００９８】
アルギニンデイミナーゼ遺伝子は、例えばＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：３７８８−３７９５（１９９０）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により記載されているように、Ｍ．アルギニニ（ａｒｇｉｎｉｎｉ）の公開配列に由来する以下のプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した：
５’−ＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴ−３’（配列番号：１１）
５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＣＧ−３’（配列番号：１２）
ポリメラーゼ連鎖反応産物は、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として発現プラスミドｐＱＥ１６にクローン化した。ＤＮＡ配列分析では、この断片がＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、同上に記載されているアルギニンデイミナーゼ遺伝子に関する配列と同じ配列を有することが示された。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）中のトリプトファンをコードするＡＤＩ遺伝子中の５個のＴＧＡコドンは、例えばＪ．Ｒ．Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５９２−５９６（１９９２）に教示されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での遺伝子発現前にオリゴヌクレオチド−指定（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発法によりＴＧＧコドンに変えた。組換えＡＤＩは全細胞タンパク質の１０％のレベルで封入体中に発現された。
【００９９】
上記３種のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に由来する各タンパク質は約９５％の相同性を有し、そしてカラムクロマトグラフィーにより容易に精製される。約１．２ｇの純粋なタンパク質を１リットルの発酵ブロスから単離することができる。組換えＡＤＩは３７℃で約２週間安定であり、そして４℃で保存した時には少なくとも８カ月間安定である。当業者に知られている方法により測定されるように、このタンパク質はアルギニンに対して高い親和性（０．０４μＭ）、および約７．２〜約７．４の生理学的に最適なｐＨを有した。
【実施例２】
【０１００】
組換えＡＤＩの再生および精製
わずかに修飾されたＡＤＩタンパク質は、Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているように再生した。１００ｇの細胞ペーストを８００ｍｌの１０ｍＭ Ｋ２ＰＯ４ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（バッファー１）に再懸濁し、そして細胞をマイクロ流動機（マイクロフルイデェクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、ニュートン、マサチューセッツ州）に２回通すことにより破壊した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて、４（容量／容量）％の最終濃度とした。ホモジネートを４℃で３０分間撹拌し、次いで１３，０００ｇで３０分間遠心した。ペレットを集め、そして０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１リットルのバッファー１に再懸濁した。溶液は１００ｋＤの保持ランク（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｒａｔｉｎｇ）の中空ファイバーカートリッジ（マイクロゴン（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ）社、ラグナヒル、カリフォルニア州）を使用して、５容量の変性バッファー１（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析した。グアニジンＨＣｌを加えて６Ｍの最終濃度とし、そして溶液を４℃で１５分間撹拌した。溶液をリフォールディングバッファー１、１０ｍｍ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で１００倍に希釈し、そして１５℃で４８時間撹拌し、粒子を１５，０００ｘｇで遠心することにより除去した。
【０１０１】
生成した上清は、リフォールディングバッファーで前平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰａｓｔＦｌｏｗ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで濃縮した。ＡＤＩは０．２Ｍ ＮａＣｌを含有するリフォールディングバッファーを使用して溶出した。この精製手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で予想される＞９５％純度のＡＤＩタンパク質を得た。８ｇの再生したＡＤＩタンパク質は１ｋｇの細胞ペーストから生成され、これは１リットルの発酵あたり２００ｍｇの精製ＡＤＩに相当する。
【０１０２】
ＡＤＩ活性はＯｇｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９５７）３：６３９−６４２に記載されている方法をわずかに変更することにより測定した。０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０（ＢＵＮアッセイバッファー）中の１０μｌのサンプルを９６ウェルのマイクロリッタープレートに置き、４０μｌの０．５ｍＭアルギニン（ＢＵＮアッセイバッファー中）を加え、そしてプレートを覆い、そして３７℃で１５分間インキュベーションした。２０μｌの完全ＢＵＮ試薬（シグマダイアグノスティックス：Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を加え、そしてプレートを１００℃で１０分間インキュベーションした。次いでプレートを２２℃に冷却し、そしてマイクロリッタープレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）により４９０ｎｍで分析した。１ＩＵは１分間に１μｍｏｌｅのＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転換する酵素の量である。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いたピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を使用して測定した。精製したＡＤＩ調製物の酵素活性は、１７〜２５ＩＵ／ｍｇであった。
【実施例３】
【０１０３】
ＰＥＧのＡＤＩへの結合
ＰＥＧはＡＤＩに１００ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４中で共有結合させた。簡単に説明すると、リン酸バッファー中でＡＤＩを１００モル過剰なＰＥＧと混合した。反応物は室温で１時間撹拌し、次いで混合物を徹底的に透析して取り込まれなかったＰＥＧを除去した。
【０１０４】
ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物に使用した連結基の効果を評価する第１実験を行った。ＰＥＧ１０，０００およびＡＤＩは４種の異なる連結基を介して共有結合した：ＳＳ、ＳＳＡ、ＳＰＡおよびＳＳＰＡを含むエステル基またはマレイミド基、ここで各ＰＥＧ分子は５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００および４０，０００の平均分子量を有した；エポキシ基、ＰＥＧ−エポキシ、ここでは各ＰＥＧ分子は５，０００の平均分子量を有した；および分枝ＰＥＧ基、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ここで各ＰＥＧ分子は１０，０００、２０，０００および４０，０００の平均分子量を有した。
【０１０５】
生成した組成物の５ＩＵをマウスに注射した（各群あたり５マウス）。アルギニンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元から供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるシトルリンの限界感度は約２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。血清アルギニンの量は、アミノ酸分析により測定した。ＰＥＧおよびＡＤＩを共有結合する連結基は、インビボで血清アルギニンを減少するＡＤＩの能力に測定できる効果をもたなかった。
【０１０６】
連結基およびＰＥＧの分子量がインビボで血清シトルリンレベルに及ぼす効果を評価する第２実験を行った。マウス（各群５匹）にＡＤＩおよびＰＥＧ−ＡＤＩの種々の組成物を５．０ＩＵの量で与えた。シトルリンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメントからの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるシトルリンの限界感度は約２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。シトルリンの量を測定し、そして曲線下の面積をおよそ求め、そしてμｍｏｌ日で表した。
【０１０７】
結果はＰＥＧの分子量がＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効力を決定することを示す。ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果はＰＥＧのＡＤＩへの結合方法または手段には基づかないようである。
【０１０８】
結果は、ＰＥＧの最適な分子量が約２０，０００であることを示す。薬力学的観点からＰＥＧ３０，０００はＰＥＧ２０，０００よりも優れているようであったが、ＰＥＧ３０，０００は溶解性が低く、これは作業をさらに難しくする。酵素活性の回収に基づく収率はＰＥＧ５，０００およびＰＥＧ１２，０００については約９０％であり；ＰＥＧ２０，０００については約８５％；そしてＰＥＧ３０，０００については約４０％であった。したがって幾つかの態様では、ＰＥＧ２０，０００がシトルリン生産により測定される収率と循環半減期との間の良い妥協点となるようである。
【０１０９】
第３実験では、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を用いた血清アルギニン減少およびシトルリンの生産の用量応答を測定した。マウス（各群５匹）に０．０５ＩＵ、０．５ＩＵまたは５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００ののいずれかの単回注射を与えた。示した時期に上記のように血清を集め、そしてアミノ酸分析を行って血清アルギニンおよび血清シトルリンを定量した。両製剤は血清アルギニンに用量依存的減少を、そして血清シトルリンに用量依存的増加を誘導した。しかしＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００により誘導される効果は、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により誘導される効果よりも顕著で、しかも長期間であった。
【実施例４】
【０１１０】
循環半減期
ＢａｌｂＣマウス（各群５匹）に、５．０ＩＵ用量の天然アルギニンデイミナーゼまたはポリエチレングリコールで修飾したアルギニンデイミナーゼの種々の製剤を静脈内に単回注射した。アルギニンおよびシトルリンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメントからの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるアルギニンの限界感度は約６ｐＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。
【０１１１】
血清アルギニンレベルの用量依存的減少および血清シトルリンの上昇は、天然ＡＤＩまたはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧの単回用量の投与から検出された。しかし血清アルギニンの減少および血清シトルリンの上昇は短期であり、すぐに標準に戻った。アルギニン除去の半減期を以下の表２にまとめる。
【０１１２】
【表２】
【実施例５】
【０１１３】
ＰＥＧ修飾化ＡＤＩの抗原性
天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を測定するために、例えばＰａｒｋ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、同上およびＫａｍｉｓａｋｉ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、同上に記載されている手順に従った。簡単に説明すると、ＢａｌｂＣマウス（各群５匹）に１２週間、毎週、約０．５ＩＵ（１００μｇのタンパク質）の天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を静脈内注射した。動物は実験開始時および４、８および１２週に後眼窩叢から採血された（０．０５ｍｌ）。血清を単離し、そして−７０℃で凍結保存した。抗−ＡＤＩ ＩｇＧの力価は、ＥＬＩＳＡにより測定した。５０μｇのＡＤＩを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、そして室温で４時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳですすぎ、次いでウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）で覆って非特異的なタンパク質結合部位をブロックし、そして４℃で一晩保存した。翌日、マウスの血清を希釈し、そしてウェルに加えた。１時間後、プレートをＰＢＳですすぎ、そしてペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗−マウスＩｇＧをウェルに加えた。プレートを３０分間インキュベーションし、ついで生じたＵＶ吸収をマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。力価はバックグラウンドの吸収（約０．５０ＯＤ）から２倍の上昇を生じる血清の最高希釈として定めた。
【０１１４】
ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００は天然のＡＤＩよりも有意に抗原性が低い。例えばわずか４回の天然ＡＤＩの注射が約１０６の力価を生じる一方、任意のＰＥＧ−ＡＤＩ製剤の４回の注射では測定できる抗体を生成できなかった。しかし８回の注射の後、ＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００は約１０２の力価を有し、一方ＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００は１２回の注射後でもこのような量の免疫応答を誘導しなかった。この結果はＰＥＧをＡＤＩに結合することがタンパク質に対する免疫応答を鈍らせることを示す。
【実施例６】
【０１１５】
ヒトに対する応用
ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩおよびＰＥＧ２０，０００−ＡＤＩは正常ヒト血清と一緒にエクスビボでインキュベーションし、そしてアルギニン濃度に及ぼす効果をアミノ酸分析により測定し、ここで酵素は完全に活性であり、そしてすべての検出可能なアルギニンをマウスが関与する実験と同じキネティックスで分解できることが見いだされた。反応は０．１ｍｌ容量で３７℃で１時間内に行った。
【０１１６】
さらにヒト血清中のアルギニンおよびシトルリンのレベルはマウスで見いだされたレベルと同じである。ＰＥＧ−タンパク質はマウスよりもヒトで長時間循環する。例えばアデノシンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルコセルブロシダーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロブリンおよびスーパーオキサイドジスムターゼに結合したＰＥＧの循環半減期は、すべてマウスにおける同じ製剤よりも５〜１０倍長い循環半減期を有する。過去においてこれが意味したことは、ヒトの用量がマウスで使用される用量の１／５〜１／１０であることが最も多いということである。したがってＰＥＧ−ＡＤＩはマウスよりもヒトでさらに長期に循環するはずである。
【実施例７】
【０１１７】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗ウイルス活性は、ヒト胚芽腫細胞株Ｈｕｈ７のトランスフェクションに由来する安定なＨＣＶ ＲＮＡ複製細胞株ＡＶＡ５で試験した（Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，細胞培養におけるＨＣＶ ＲＮＡ複製の効率的な開始、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００ ２９０：１９７２−１９７４）。
インビトロ複製アッセイ
ヒト胚芽腫細胞株Ｈｕｈ７のトランスフェクションに由来する安定なＨＣＶ ＲＮＡ複製細胞株ＡＶＡ５を使用した。ＡＶＡ５細胞の分裂しているカルチャーを１日１回、３日間（培地は各化合物の添加毎に交換した）、４種の濃度の試験化合物で処理した（１濃度につき３カルチャー）。全部で６種の未処理対照カルチャー、および１０、３および１ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロン（細胞傷害性が無い活性な抗ウイルス剤）で処理した３連のカルチャー、および１００、１０および１μＭのリバビリン（抗ウイルス活性も細胞傷害性もない）を対照として使用した。ＨＣＶ ＲＮＡおよび細胞性β−アクチンＲＮＡレベルは化合物の最終投与から２４時間後にドットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。β−アクチンＲＮＡレベルは各サンプル中の細胞ＲＮＡの量を標準化するために使用した。毒性分析は、抗ウイルスアッセイについて使用したプレートとは別のプレートで行った。毒性分析用の細胞を培養し、そして抗ウイルス評価について使用したものと同じスケジュールおよび同一の培養条件下で試験化合物を用いて処置した。各化合物は４種の濃度で、それぞれ３連のカルチャーで試験した。中性のレッド色素の取り込みを使用して、最終処理から２４時間後の相対的毒性レベルを測定した。インターナライズした（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）色素の５１０ｎｍ（Ａ５１０）の吸収を定量分析に使用した。試験カルチャーにおける値は、試験カルチャーとして同じプレート上に維持した未処理細胞の９種の対照と比較した。５０％および９０％効果的な抗ウイルス濃度（ＥＣ５０ＥＣ９０）および５０％細胞傷害濃度（ＣＣ５０）を算出し、そして選択指数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）（ＣＣ５０／ＥＣ５０）を作成するために使用した。１０以上のＳ．Ｉ．は、選択的な抗ウイルス効果と考える。
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗ウイルス活性
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０（０．０１ＩＵ／ｍｌ）の単回用量を、分裂しているカルチャー細胞が５０％の集密度に達した時、これらのカルチャーに加えた。対照としてアルファインターフェロン（１９ＩＵ／ｍｌ）および陽性対照としてリバビリン（１００μＭ）を使用した。処置から３日後、ＲＮＡは標準的な実験技法を使用してカルチャーから単離し、そしてドットブロットを使用して評価した。ＨＣＶ ｍＲＮＡの量を測定し、そしてアクチン（対照として使用する）に関するｍＲＮＡと比較した。ＨＣＶ ｍＲＮＡの対照レベルの５０％阻害を引き起こすために必要な薬剤（ＡＤＩ、アルファインターフェロンまたはラボビロン）の量を測定する。アクチンｍＲＮＡの５０％阻害を引き起こす薬剤の用量は、非特異的な阻害活性を有すると考えられる。この実験から得た結果を以下に示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
これらのデータは、ＡＤＩ−ＰＥＧがほぼアルファインターフェロンのように、そしてリバビリンよりも大いにインビトロでのＨＣＶウイルス複製を阻害することを示す。
【実施例８】
【０１２０】
ＡＶＡ５細胞の分裂カルチャーを種々の濃度のＰＥＧ−ＡＤＩ（または対照実験では、アルファインターフェロンまたはリバビリン）で３日間処理した。ＨＣＶ ｍＲＮＡレベルを上記のようにアッセイした。細胞の生存能はニュートラルレッドを使用して測定した。ＨＣＶ ｍＲＮＡレベルを５０％（ＩＣ５０）および９０％（ＩＣ９０）阻害する濃度を測定した。細胞の５０％を殺す薬剤濃度（ＣＣ５０）も測定した。ＣＣ５０／ＥＣ５０は選択指数（ＳＩ）を測定するために算出する。ＳＩ＞１０はウイルス複製の選択的阻害と考える。結果を以下に示す。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
これらのデータは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０がＨＣＶ複製を阻害し、そしてこの薬剤が選択的であることを確証する。
【実施例９】
【０１２３】
腫瘍患者を対象とした抗ウイルス活性およびＮＯ合成
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、肝細胞癌を有し、そして慢性的にＨＣＶに感染している患者を対象として抗腫瘍活性について試験した。これら患者の血清中のＨＣＶウイルス力価も、ホフマン ラ ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）により開発された標準的な臨床アッセイを使用して測定した。血清はＡＤＩ−ＰＥＧ２０での処置前に得た。患者に１６０ＩＵ／ｍ２のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を１週間に１回、３週間注射した。３回目のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を注射してから１週間後、患者から血清を単離し、そして再度、同アッセイを使用してＨＣＶ力価についてアッセイした。この実験結果を以下に示す。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
これらのデータは、ＨＣＶに慢性的に感染しているヒトのＡＤＩ−ＰＥＧ処置が患者血清中のＨＣＶ力価の有意な低下をもたらすことを示す。さらにアルファインターフェロンはこれらの患者の〜５０％に効果的であるだけで、ＨＣＶ力価に５０％の低下を達成するためには３〜６カ月の頻度の処置が必要であり、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０がこの点で、より一層効果的であると思われる。
【０１２６】
ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ ２０，０００ｍｗは、迅速な最適２段階フェイズ２試験に関するリチャード サイモン統計案（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｉｍｏｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｅｓｉｇｎ）に従い、手術できないＨＣＣの個体のフェイズ２試験で試験した（Ｓｉｍｏｎ Ｒ．１９８９．フェイズＩＩ臨床試験に関する最適な２段階計画。Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｒｉａｌ １０：１−１０；Ｓｉｍｏｎ ＲＭ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＳＭ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍ，Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，ｋｈｌｅｉｆ Ｓ，Ｋｗａｋ ＬＷ，Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ，２００１．治療用癌ワクチンの早期臨床的開発に関する臨床試験計画．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９：１８４８−１８５４）。この試験はイタリア、ナポリのパスカル国立癌研究所（Ｐａｓｃａｌｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）でイタリア保健省（Ｉｔａｌｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ）による認可の下、および地方の研究再審評議委員会（ｌｏｃａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）の認可を得て行なった。すべての個体にはヘルシンキの宣言に従いインフームドコンセントが提供された。ＨＣＶに慢性的に感染し、手術できないＨＣＣの全部で１８名の個体をこの実験に登録した（Ｉｚｚｏ提出）。この試験中、３名が進行性の疾患から死亡し、そしてすべての３サイクルの処置を受けることができず、すなわち更なる分析から排除された。残りの１５名の個体は、３サイクル（それぞれが１週間に４オンスの注入からなる）のＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗを、最適な生物学的用量（Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｏｓｅ）で受けた。この最適な生物学的用量は、血清アルギニンを〜１３０μＭの静止レベルから検出レベル未満（＜２μＭ）に少なくとも７日間下げるＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００の量と定めた（〜１６０ＩＵ／ｍ２）。
【０１２７】
この治療が腫瘍に有した作用を、４週間毎に１回、ＣＴスキャンにより評価した。応答は標準的な国立癌研究所（ＮＣＩ）の基準に従い進行性疾患（ＰＤ）、安定な疾患（ＳＤ）、部分的応答（ＰＲ）または完全な応答（ＣＲ）のいずれかと定めた。この試験結果は、ＨＣＣおよびＨＣＶを持つ１５個体で以下の応答が見られたことを示した：
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
全身的な抗腫瘍処置（または抗ウイルス処置）を、この試験前または最中に受けた個体は無かった。臨床的な研究室の試験は実験中、少なくとも１週間に２回行い、そして血漿サンプルは１週間に１回集め、そして−７０℃で保存した。これらの凍結保存したサンプルは、後にＨＣＶについて試験した。
ＨＣＶ力価に関するアッセイおよびヒト血清サンプルの血清型の決定
ＨＣＶウイルス力価は、標準的な臨床ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、コバス アンプリコールＨＣＶモニター 試験（Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ）、２．０バージョン；ロッシュ ダイアグノスティク（ドイツ １９９９）を使用して、病院の感染疾患臨床研究室で測定した。遺伝子型は同様に測定した。ウイルス力価はＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ処理の前および治療から１２週間後に集めた血漿サンプルについて測定した。
ＮＯ合成
ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗでの処置により、血漿アルギニンの用量依存的な減少および同時にＮＯ合成の減少が生じる（データは示さず）。この処置はＮＯレベルを有意に下げたが、この処置が血圧または心拍に及ぼす測定可能な効果は無かった。
【０１３０】
以下の表３はＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗがＣ型肝炎力価および肝機能試験に及ぼす効果を列挙する。
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
本明細書に記載する各特許、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号、特許出願および公報は、引用により全部、本明細書に編入する。
【０１３３】
本明細書での記載に加え、本発明の様々な修飾が前述の説明の観点から当業者には明白であろう。そのような修飾も添付する特許請求の範囲内にあることを意図している。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス複製を阻害する方法、癌を処置する方法、転移を処置および／または抑制する方法、およびウイルス複製を阻害すると同時に癌を処置または転移を処置および／または抑制する方法等を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染は、肝炎およびＨＩＶを含む数種のウイルスに直接起因して毎年、数百万人の死亡を導く主な死亡原因である。
【０００３】
肝炎はヒト肝臓の疾患である。これは肝臓の炎症により現れ、そして通常はウイルス感染により引き起こされる。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ型肝炎のような数種のウイルスはウイルス性肝炎を引き起こすことが知られている。それらの中でもＨＢＶおよびＨＣＶが最も深刻である。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は汎発流行病であり、世界中で１億７千万人以上が感染している。ウイルス性疾患の中で、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は５倍以上に広がっており、そして今年、慢性ＨＣＶ感染から生じる肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）から約１０，０００人のアメリカ人が死亡するであろう（非特許文献１。Ｃ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌の発病率および補因子：台湾における１２，００８名の男性の予測実験；非特許文献２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染患者に対する取り組み；非特許文献３。Ｃ型肝炎の経過と結果；非特許文献４。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止）。さらに血液ドナーのスクリーニングプログラムの設定にもかかわらず、ＨＣＶの有病率は米国、西欧およびアジアで増え続けている。慢性疾患への進行はほとんどのＨＣＶ感染患者で起こる。さらに毎年、ＨＣＶはすべての慢性的に感染した個体の１〜４％にＨＣＣを引き起こす。さらにＨＣＣは肝硬変でなくても起こり得る（非特許文献６。腫瘍除去後のインターフェロン治療はＣ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌を持つ患者の予後を改善する；非特許文献７。Ｃ型肝炎ウイルスに関連する肝細胞癌における新規腫瘍マーカーの同定；非特許文献８。日本におけるＣ型肝炎ウイルス感染と関連する肝細胞癌：予測可能な将来の他国への投影；非特許文献９。Ｃ型肝炎ウイルスが関連する肝細胞癌の自然経過および病因）。現在３０〜５０歳の人のＨＣＶ感染の有病率を仮定すると、ＨＣＣの発生数および死亡率は米国では次の１０〜２０年で２倍になると推定される（非特許文献１０。米国における肝細胞癌およびＣ型肝炎）。世界中で５億人がＨＣＶに感染していると予想される。現在、効果的な免疫感作法は無く、そしてＣ型肝炎は衛生および環境条件における改善、ならびに伝染経路の中断のような他の予防的方法により防除できるだけである。
【０００５】
今日、外科的切除以外にＨＣＣの効果的治療は無い（非特許文献１１。成人の肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断および処置に関するガイドライン；非特許文献１２。米国における肝細胞癌およびＣ型肝炎；非特許文献１３。肝細胞癌の世界的流行疫学；非特許文献１４。肝細胞癌：全身的処置；非特許文献１５。肝硬変を持つ１１０名の患者を対象とした肝細胞癌の高周波切除。；非特許文献１６。肝臓および胆管）。しかしわずか５％未満のＨＣＣ患者が外科的処置の対象であり、そして〜１％が実際に切除を受けているだけである。これらの切除された患者でさえも、特にＨＣＶに感染している者がＨＣＣを再発することは多い。
【０００６】
アミノ酸除去療法（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）は幾つかの癌の処置には効果的な手段である。正常な細胞はアルギニンを必要としないが、多くの癌細胞株はこのアミノ酸について栄養素要求的である。すなわち限定するわけではないがＨＣＣを含む癌は、アルギニン除去療法により選択的に殺すことができる（非特許文献１７。ペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ）は、インビトロおよびインビボでヒトのメラノーマおよび肝細胞癌を抑制する；非特許文献１８。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素であるアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学的修飾；非特許文献１９。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）から精製したアルギニンデイミナーゼのインビボ抗腫瘍活性；非特許文献２０。インビトロにおけるマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）のデイミナーゼの増殖阻害活性に対するヒトメラノーマ細胞株の高い感受性。インビトロにおけるマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）のデイミナーゼの増殖阻害活性に対するヒトメラノーマ細胞株の高い感受性）。この療法は、アルギニンがシトルリンから合成できるのでヒトではアルギニンが必須アミノ酸ではないために十分に耐容される（非特許文献２１。ヒトのアミノ酸要求；非特許文献２２。小児のアルギニン要求。および総説については非特許文献２３を参照にされたい。アルギニン要求における種の変動。Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋの栄誉をたたえるシンポジウムの講演収録−アンモニアから癌および遺伝子発現までにおいて（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｈｏｎｏｒｉｎｇ Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ Ａｍｍｏｎｉａ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。ＡＤＩは細胞外アルギニンをシトルリンに転換し、これは正常な細胞に取り込まれ、そして細胞内でアルギニンに転換され得るが、癌細胞、特にＨＣＣ細胞はそれらが律速酵素であるアルギニノコハク酸シンターゼを欠くので転換できない（非特許文献１７。ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ）はインビトロおよびインビボでヒトのメラノーマおよび肝細胞癌を抑制する）。このアルギニノコハク酸シンターゼを発現できないことは、最近、他者によって確認された（非特許文献２４。細胞培養中の組換えアルギニンデイミナーゼの抗増殖活性に対する耐性は、内因性酵素アルギニノコハク酸シンターゼと相関する）。我々はこのアルギニノコハク酸シンターゼ欠失の実験を他の腫瘍に拡大した（非特許文献２５。ヒトの癌におけるアルギニノコハク酸シンターゼ欠失の方法発病率および分布：アルギニン除去に対して感受性の癌を同定する方法）。ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗのヒト臨床試験からの予備結果は、この治療が抗癌療法として安全かつ効果的であることを示す。
【０００７】
Ｂ型肝炎ウイルス感染は、広スペクトルの肝臓傷害を導く可能性がある。さらに慢性のＢ型肝炎感染は、死亡の主な原因である後の肝細胞癌の発症に関連した。現在のＨＢＶ感染の防止は、安全かつ効果的なＢ型肝炎のワクチン接種である。しかしワクチン接種はすでに感染した人（すなわち保菌者および患者）の処置には効果的ではない。
【０００８】
後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、症例が過去数年間に劇的に増加したと報告された致命的な疾患である。ＡＩＤＳウイルスは１９８３年に最初に同定された。幾つかの名前および頭字語が知られて来た。これは３番目に知られたＴ−向リンパ性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）であり、そして免疫系の細胞内で複製する能力を持ち、顕著な細胞破壊を引き起こす。ＡＩＤＳウイルスはレトロウイルスであり、このウイルスは複製中に逆転写酵素を使用する。この特定のレトロウイルスはリンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）、そして最も最近ではヒト免疫不全症ウイルス（ＬＩＶ）として知られている。ＨＩＶの２つの異なるファミリー、すなわちＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が今日までに記載された。本明細書では頭字語“ＨＩＶ”は、総称的にヒト免疫不全症ウイルスを指すために使用する。
【０００９】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型は、ヒトに通常感染している持続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）ウイルスである；それらはヒトの疾患に種々の問題を引き起こす。ＨＳＶ１型は、口腔の“熱性疱疹”（再発性口唇疱疹）を引き起こし、そしてＨＳＶ２型は世界の多くの場所で主な性病となった陰部疱疹を引き起こす。完全に満足のいく陰部疱疹の処置は現在存在しない。さらに稀ではあるが、ＨＳＶは脳炎も引き起こし、これは生命を脅かす脳の感染となる（非特許文献２６；非特許文献２７）。最も重篤なＨＳＶが引き起こす疾患は樹枝状角膜炎、これは角膜に分枝損傷を生じる目の感染であり、後に永久的瘢痕化、そして視野の喪失を導く可能性がある。ＨＳＶの目の感染は失明の主な原因である。ＨＳＶは治療が不可能ではないが難しいウイルスである。
抗ウイルス療法
現行の抗ウイルス療法には幾つかの問題がある。第１に相対的に効果的な抗ウイルス剤がほとんどない。多くの既存の抗ウイルス剤は逆または望ましくない副作用を引き起こす。最も効果的な治療（ワクチン接種のような）は、ただ１種類のウイルス株について高度に特異的である。しばしばウイルスは突然変異を受けるので、薬剤またはワクチンのいずれにも耐性となる。
【００１０】
ウイルス感染に関する多くの現行の処置は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を中心に展開している。ＩＦＮ−αは細胞受容体に結合し、そしてタンパク質合成に関与する酵素を含む細胞内応答を開始する。これは最終的に抗ウイルス活性／応答を導く。しかし種々の臨床試験からのデータは、ＩＦＮ−αで処置した患者の約４０％が最初は治療に応答するが、これらの７０％が処置の終了後には逆戻りすること示した（非特許文献２８）。全体として、長期治療効果および応答は、患者の１０〜３０％で観察されただけである（非特許文献２９）。加えてインフルエンザ、疲労、筋肉および頭痛、さらには鬱、体重減少および下痢のような多くの副作用が観察された（非特許文献２８）。
ＨＣＶ療法
ＨＣＶ感染の現在の標準的療法は、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α（ＩＦＮ）およびリバビリンである。この療法は持続的な抗ウイルス応答を生じることができるが、有意な数の患者がこの療法に応答せず、またはこの処置から排除される（非特許文献３０。Ｃ型肝炎の患者を対象とした抗ウイルス処置の驚くべき小効果；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染にはペグインターフェロンアルファ−２ａにリバビリンを加える；非特許文献２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染の患者に対する取り組み；非特許文献３３。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止；非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。例えばリバビリンを加えたＰＥＧ−ＩＦＮ α−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（商標））、およびリバビリンを加えたＰＥＧ−ＩＦＮ α−２ｂ（Ｐｅｇｉｎｔｒｏｎ（商標））の最近の実験は、試験した患者の〜５６％が持続的なウイルス応答を有することを示す（非特許文献３５。これまでの治療に無応答である患者を対象とした慢性Ｃ型肝炎の処置；非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３７。慢性Ｃ型肝炎の処置：系統的総説；非特許文献３８。Ｃ型肝炎の最適な治療；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３９。Ｃ型肝炎の治療の紹介；非特許文献４０。２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果；非特許文献４１。ポリエチレングリコール−インターフェロン：Ｃ型肝炎ウイルス治療における現状；非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。しかし、米国および西欧で最も多い遺伝子型であるＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂについて、応答はわずか〜４６％であった。ＨＣＶ遺伝子型２および３はより良い応答を有した（７６％〜８２％）。さらにこの〜５０％の応答率は、臨床試験で実験した患者に関するもののみである；これは全患者群を表してはおらず、したがって偏っている（非特許文献３５。これまでの治療に無応答である患者を対象とした慢性Ｃ型肝炎の処置；非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３７。慢性Ｃ型肝炎の処置：系統的総説；非特許文献３８。Ｃ型肝炎の最適な治療；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルスにはペグインターフェロンアルファ−２ａにリバビリンを加える；非特許文献３９。Ｃ型肝炎の治療の紹介；非特許文献４０。２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果；Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ ２００２、非特許文献３４。慢性Ｃ型肝炎の初期処置について、リバビリンを加えたインターフェロンアルファ−２ｂと比較したリバビリンを加えたペグインターフェロンアルファ−２ｂ：無作為化試験）。例えば米国における大規模実験では、選択基準により潜在的患者１３３７名のうち４０４名が排除された（すなわち〜３０％）（非特許文献４２。慢性Ｃ型肝炎の初期の処置としてインターフェロンアルファ−２ｂ単独またはリバビリンとの併用。肝炎国際治療グループ）。他の大規模な実験はしばしば失敗し、それらのスクリーニング基準または登録した患者の割合を記載できない。大きな教育病院により米国で行われた最近の実験は、全ＨＣＶ患者の７２％が医学的または精神的禁忌、進行中の薬物またはアルコール乱用、評価手順の固守の失敗、正常肝臓酵素、または処置無しを好む患者といったような理由からＩＦＮで処置されなかった（非特許文献３０。Ｃ型肝炎の患者を対象とした抗ウイルス処置の驚くべき小効果）。同様の結果が他でも確認された（非特許文献４３。Ｃ型肝炎患者における抗ウイルス療法の使用）。このようにＨＣＶに感染した群の有意な部分が、様々な医学的または精神的禁忌から現在「最高標準の手当」である処置を受けていない。米国および西欧における「最高」の患者を使用した実験でも、〜５０％が持続的ウイルス応答に達するだけである。
【００１１】
ＩＦＮ−αもＰＥＧおよび非ＰＥＧを配合した形の両方でおよそ同じ頻度で起こる有意な副作用を有する（非特許文献３６。新規および修飾インターフェロンアルファ：前臨床および臨床データ；非特許文献３１。Ｃ型肝炎の治療の副作用およびそれらの管理；Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ ２００２、非特許文献３２。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染の患者に対する取り組み；非特許文献４。Ｃ型肝炎ウイルス感染；非特許文献５。Ｃ型肝炎の病因、自然経過、処置および防止）。これらの副作用には実験した８２％までの患者で熱を伴うインフルエンザ様の病気、悪寒、筋痛および不定愁訴を含み、〜２０％の患者には鬱、短気および鬱と不安のような神経精神的合併症を伴う。顆粒球減少症、貧血または血小板減少症を伴う骨髄抑制が、脱毛と同じように〜５％で起こる。これらの副作用は大変重篤であることが多いので、さらなるＩＦＮアルファでの処置は中断され、すなわちＩＦＮ治療をさらに限定する。したがってＨＣＶに関する新たな処置が必要である。
ＨＩＶ療法
幾つかの薬剤は、アジドブジン（ａｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ：ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、ｄ４Ｔ、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（エピビル（ｅｐｉｖｉｒ）、３ＴＣ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）を初めとしてＨＩＶの処置に認可された。非特許文献４４および非特許文献４５を参照にされたい。ＨＣＶに関する別の処置は、リバビリンであった。リバビリンは広範囲の標的ウイルス活性を持つ抗ウイルス剤である。リバビリンは修飾塩基を有するグアノシン類似体であり（１−β−Ｄ−リボ−フラノシル− −１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）、そしてグアノシン三リン酸塩の低下をもたらす細胞酵素であるイノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼを阻害することが提案された。非特許文献２８。しかしリバビリンは副作用を引き起こす。非特許文献４６。特にリバビリンは患者の赤血球に蓄積し、そして溶血性貧血を引き起こす可能性がある。
【００１２】
ＡＩＤＳワクチン（Ｓａｌｋ’ｓワクチン）が試験され、そしてＣＤ８に由来するケモカインである数種のタンパク質がＨＩＶサプレッサーとして作用することが見いだされた。上記の合成ヌクレオチド類似体、タンパク質および抗体に加えて、数種の植物および植物由来物質が、インビトロの抗ＨＩＶ活性を有することが分かった。しかしＨＩＶウイルスは容易に破壊されず、また宿主細胞のウイルス複製を防ぐ良いメカニズムもない。
アルギニン除去のインビトロ使用
過去３０年間にわたり、多くの実験で細胞外アルギニンはインビトロでウイルスの複製に必要であることが証明された。過去にはこれはアルギニンを欠く組織培養基を作成し、そしてアルギニンを含まない培地を達成するために補充物として使用する血清を透析することにより成された。アルギニンの除去を達成するためにこの方法を使用すると、ウイルスの多数の多様なファミリーの複製に阻害を生じ、それらには；アデノウイルス（非特許文献４７。アデノウイルス複製のアルギニン依存性およびウシ肺疫菌様微生物によるプラーク形成の阻害）、ヘルペスウイルス（非特許文献４８。ヒト細胞における単純ヘルペスウイルスのアミノ酸要求）、ＳＶ４０（非特許文献４９。腫瘍およびＳＶ４０ウイルスのウイルス抗原の合成に及ぼすアルギニンおよび他のアミノ酸の離脱効果）、サイトメガロウイルス（非特許文献５０。サイトメガロウイルス感染におけるアルギニン依存的反応）、ＲＳウイルス（非特許文献５１。ＲＳウイルス複製の後期同時性）、ポリオーマウイルス（非特許文献５２。ポリオーマに感染したマウス胚細胞における非機能的アルギニン生合成経路）、ニューカッスル病ウイルス（非特許文献５３；ニューカッスル病ウイルスの集成に関する実験：ウイルス複製におけるアルギニン依存的段階）、麻疹ウイルス（非特許文献５４；ＨｅＬａ細胞における麻疹ウイルスのアミノ酸要求）、インフルエンザ（非特許文献５５；インフルエンザウイルス伝播の改善された方法。Ｉ．細胞培養におけるウイルス再生の強化）、および恐らく、より関連性のあるワクシニアウイルス（非特許文献５６、Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｌ細胞におけるワクシニアウイルスの伝播のためのアミノ酸要求。非特許文献５７、ワクシニアウイルスの増殖に及ぼすマイコプラズマの効果：アルギニンの要求。非特許文献５８、ＫＢ細胞におけるワクシニアウイルスの後期ｍＲＮＡ転写に関するアルギニン要求。非特許文献５９、ワクシニアウイルスの複製に及ぼすアルギニン除去の効果）、家兎痘ウイルス（非特許文献６０。家兎痘ウイルスに感染したマウス肉腫１８０細胞におけるシトルリンの強化された利用）が含まれる。ワクシニアウイルスは天然痘（バリオーラウイルス）を含むオルトポックスウイルス属の原型的なメンバーである。ウイルス複製の阻害は、たとえタンパク質合成および感染細胞の複製が影響を受けなくてもインビトロで観察される。
【００１３】
アルギニンを分解する酵素は知られており、そしてアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）を含む。しかしそのような異種タンパク質を治療的に使用することに伴う問題は、その抗原性である。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニンデイミナーゼの、シアヌル酸クロライド連結基を介するポリエチレングリコールを用いた化学的修飾は、非特許文献１８に記載された（マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素アルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学修飾）。しかし修飾されたタンパク質は、シアヌル酸クロライド連結基に由来するシアン化物の放出により、代謝された時に毒性であった。
【００１４】
従来技術に付随する問題が無いウイルス複製の阻害する方法が必要である。本発明はこれらの、ならびに他の重要な目的を対象とする。
【参考文献】
【００１５】
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【非特許文献３０】Ｆａｌｃｋ−Ｙｔｔｅｒ Ｙ，Ｋａｌｅ Ｈ．Ｍｕｌｌｅｎ ＫＤ，Ｓａｒｂａｈ ＳＡ，Ｓｏｒｅｓｃｕ Ｌ．ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ ＡＪ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３６：２８８−２９２，２００２
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【非特許文献３７】Ｃｈａｎｄｌｅｒ Ｇ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ ＭＳ，Ｊｅｎｃｋｅｓ ＭＷ，Ｔｏｒｂｅｎｓｏｎ ＭＳ，Ｈｅｒｌｏｎｇ ＨＦ，Ｂａｓｓ ＥＢ，Ｇｅｂｏ ＫＡ，Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：Ｓ１３５−Ｓ１４４，２００２
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【非特許文献４３】Ｄｉａｍｏｎｄ Ｃ，Ｌｅｅ ＪＨ．，Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３７：１０１２，２００２
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【非特許文献５０】Ｍｉｎａｍｉｓｈｉｍａ Ｙ，Ｂｅｎｙｅｓｈ−Ｍｅｌｎｉｃｋ Ｍ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｐｒｏｃ １７０：３３４−３３９，１９６９
【非特許文献５１】Ｌｅｖｉｎｅ Ｓ，Ｂｕｔｈａｌａ Ｄ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＤ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３９０−４００，１９７１
【非特許文献５２】Ｗｉｎｔｅｒｓ ＡＬ，Ｃｏｎｓｉｇｌｉ ＲＡ，Ｒｏｇｅｒｓ ＯＲ，Ｂｏｉｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ４７：１０４５−１０５１，１９７２
【非特許文献５３】ＩＩｎｕｍａ Ｍ，Ｍａｅｍｏ Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｔ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５１：２０５−２１５，１９７３
【非特許文献５４】Ｒｏｍａｎｏ Ｎ，Ｓｃａｒｌａｔａ Ｇ，Ａｒｃｈ Ｇｅｓａｍｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４３：３５９−３６６，１９７３
【非特許文献５５】Ｌｉｓｏｋ ＴＰ，Ｓｏｍｉｎｉｎａ ＡＡ，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ ２１：２３４−２４０，１９７７
【非特許文献５６】Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ ＯＡ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ４：５８５−５９１，１９６９
【非特許文献５７】Ｓｉｎｇｅｒ ＳＨ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＥＡ，Ｂａｒｉｌｅ ＭＦ，Ｋｉｒｓｃｈｓｔｅｉｎ ＲＬ，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １３３：１４３９−１４４２，１９７０
【非特許文献５８】Ｏｂｅｒｔ Ｇ，Ｔｒｉｐｉｅｒ Ｆ，Ｇｕｉｒ Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ４４：３６２−３６７，１９７１
【非特許文献５９】Ａｒｃｈａｒｄ ＬＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＪＤ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １２：２４９−２５８，１９７１
【非特許文献６０】Ｃｏｏｋｅ ＢＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＪＤ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２１：３３９−３４８，１９７３
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを患者に投与することを含んでなるウイルス複製の調節法を対象とする。また本発明はウイルス複製を調節すると同時に、例えば肉腫、肝癌およびメラノーマを含む癌を処置する方法も対象とする。また本発明はウイルス感染についてアルギニン除去療法に対する個体の感受性を測定する方法、肝機能を改善する方法等を対象とする。本発明のこれらのおよび他の観点は、本発明の以下の詳細な説明により明らかとなる。
発明の詳細な説明
概観
本発明はポリエチレングリコールで修飾されたＡＤＩがウイルス複製を阻害するという予期せぬ知見に基づく。ＡＤＩは連結基を用いて、または無しでポリエチレングリコールに共有結合されるが、幾つかの態様では連結基を利用する。例えばＰＥＧ−２０，０００は有用な酵素活性レベル、抗原性、循環半減期、効力および比較的容易な製造を現す。
【００１７】
細胞外アルギニンの低下がウイルス複製を阻害するメカニズムは知られていない。ヒトおよびマウスのような草食動物（アルギニンに対する絶対要求性を有する肉食動物とは異なる）（総説については、Ｒｏｄｇｅｒｓ ＱＲ．１９９４．アルギニン要求における種の変動。Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋの栄誉をたたえるシンポジウムの講演収録−アンモニアから癌および遺伝子発現までにおいて（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｈｏｎｏｒｉｎｇ Ｗｉｌｌａｒｄ Ｊ．Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ Ａｍｍｏｎｉａ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。特別出版物８６−１９９４年４月（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６−Ａｐｒｉｌ １９９４）、６１８０１ イリノイ州 アルバナ、マンフォードホール ２１１、イリノイ大学農業実験ステーション、第９〜２１頁を参照にされたい）、およびほとんどの細胞は、アルギニンが２つの細胞内酵素（アルギニノコハク酸シンターゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼ）を使用してシトルリンから合成され得るので、成長にアルギニンを必要としない。すなわち細胞外アルギニンの排除は、シトルリンが細胞に利用され得る限りアルギニンの細胞内レベルに影響を及ぼさない。ウイルス複製は細胞内プロセスであるので、細胞外アルギニンの減少がウイルス複製を阻害できるとは予想されていない。
【００１８】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、細胞外アルギニンの低下がウイルス複製を阻害できる１つの可能なメカニズムは、一酸化窒素の合成を阻害することによる。一酸化窒素は細胞外アルギニンから合成され、すなわちこのアルギニンプールの排除は、この重要な代謝産物の生産を効果的に阻害する。一酸化窒素は幾つかのウイルス感染に対して保護的であると考えられているが（Ａｋａｉｋｅ Ｔ，Ｍａｅｄａ Ｈ．２０００．一酸化窒素およびウイルス感染。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０１：３００−３０８）、一酸化窒素合成の阻害は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＬ Ｓａｍｉｍｉ Ａ，Ｃｈｉａｎｇ ＣＳ．１９９４．誘導性一酸化窒素合成の発現。リンパ球脈絡髄膜炎のマウスを対象とした神経病理学と臨床的特徴との相関。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：３６２２−３６２９）およびＨＩＶ（Ｂｌｏｎｄ Ｄ，Ｒａｏｕｌ Ｈ，ＬｅＧｒａｎｄ Ｒ，Ｄｏｒｍｏｎｔ Ｄ．２０００．一酸化窒素の合成は初代ヒトマクロファージにおけるヒト免疫不全症ウイルスの複製を強化する。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７４：８９０４−８９１２）の複製を遮断することが示された。また一酸化窒素合成の阻害は、インフルエンザ（Ａｋａｉｋｅ Ｔ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｉｊｉｒｉ Ｓ，Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ Ｋ、Ｓｕｇａ Ｍ，Ｚｈｅｎｇ ＹＭ，Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂ、Ｍａｅｄａ Ｈ．１９９６．インフルエンザウイルスが誘導する肺炎の病原論：一酸化窒素および酸素ラジカルの両方の関与。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２４４８−２４５３；Ｋａｒｕｐｉａｈ Ｇ，Ｃｈｅｎ Ｊ−Ｈ，Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ，Ｎａｔｈａｎ ＣＦ，ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ ＪＤ．１９９８．一酸化窒素シンターゼ２−欠失マウスを対象としたインフルエンザＡウイルスの急速なインターフェロンγ−依存性クリアランスおよび肺炎の合併からの保護。Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：１５４１−１５４６）、ポリオウイルス（Ｌｏｐｅｚ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ＪＡ，Ｃａｒｒａｓｃｏ Ｌ．１９９８．２種類のヒト細胞株のポリオウイルス感染に及ぼす一酸化窒素の効果。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２５３８−２５４０）、狂犬病ウイルス（Ｕｂｏｌ Ｓ，Ｓｕｋｗａｔｔａｎａｐａｎ Ｃ，Ｍａｎｅｅｒａｔ Ｙ．２００１．誘導性の一酸化窒素合成は、狂犬病ウイルスに感染したマウスの死亡を遅らせる。Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２３８−４２）およびフラビウイルス（Ｋｒｅｉｌ ＴＲ，Ｅｉｂｌ ＭＭ．１９９６．一酸化窒素およびウイルス感染；インビトロでのフラビウイルスに対する抗ウイルス活性無し、およびインビボでの実験的感染における病原への寄与に関する証拠。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９：３０４−３０６）の致命的な影響から動物を保護することも示された。しかしこれらのこれまでに使用した一酸化窒素合成インヒビターは、動物およびヒトの両方でそれらの毒性（肝不全、発作および死亡）により制限されてきた。すなわち培養基からアルギニンを排除することから生じるウイルス複製の阻害（一酸化窒素生産を明らかに排除するプロセス）が、ウイルス複製の阻害が起こる唯一のメカニズムであるといことは明らかではない。またこの一酸化窒素およびウイルス感染の刺激／阻害の二重性は、他の病理学的出来事でも一酸化窒素を用いて観察される（Ｃｏｌａｓａｎｔｉ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ．２０００．ＮＯの二重特性。Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２１：２４９−２５２）。すなわち一酸化窒素の阻害が、すべての続く感染性の出来事を排除すると期待すべきではない（Ｂｏｇｄａｎ Ｃ．２００１．一酸化窒素および免疫系。Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：９０７−９１６）。しかし過去に使用された一酸化窒素合成インヒビターとは異なり、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は一酸化窒素の生産の阻害に安全で、しかも効果的であると思われ、そしてウイルス感染に対する保護におけるこのバイオメディエーターの役割の解明を助けるために使用することができる。
定義
本開示を通じて、以下の略号を使用することができる：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニンデイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンアミド；ＳＰＡ，スクシンイミジルプロピオネート；およびＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド。
【００１９】
ポリエチレングリコールで共有的に修飾された（連結基を用いて、または用いずに）ＡＤＩは、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”または“ＰＥＧ−ＡＤＩ”と呼ぶ。
【００２０】
「ポリエチレングリコール」または“ＰＥＧ”は、分枝または直鎖の一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは少なくとも４である）で表される、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を称する。「ポリエチレングリコール」または“ＰＥＧ”はそれらのおよその重量平均分子量を示す数の接尾辞と合わせて使用する。例えばＰＥＧ−５，０００（ＰＥＧ５）は、約５，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指し；ＰＥＧ１２，０００（ＰＥＧ１２）は約１２，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指し；そしてＰＥＧ２０，０００（ＰＥＧ２０）は約２０，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール分子を指す。
【００２１】
本明細書で使用する用語「個体」は動物、幾つかの態様では哺乳動物、そして幾つか態様ではヒトを指す。用語「個体」にはそのような動物から採取した生物学的サンプルを含む。
【００２２】
本明細書で使用するように、用語「ウイルス性疾患」とはウイルスにより引き起こされる疾患および障害を指す。ウイルス性疾患には限定するわけではないが動物またはヒトを含む哺乳動物に感染するウイルスを含む。ヒトのウイルスには以下のウイルスファミリーに由来するウイルスを含む：ポックス、ヘルペス、アデノ、パポバ、パルボ、ヘパドナ、ピコルナ、カリシ、アストロ、トガ、フラビ、コロナ、パラミクソ、オルトミクソ、ブンヤ、アレナ、ラブド、フィロ、ボルナ、レオ、およびレトロ。
【００２３】
本発明により処置することができるウイルスおよび関連疾患の例には、限定するわけではないが痘瘡ウイルス（天然痘）；単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス（単純疱疹）、水痘−帯状疱疹ウイルス（水痘、帯状疱疹）、エプスタイン−バールウイルス（単核細胞症、バーキットリンパ腫）、ＫＳＨＶ（カボジ肉腫）およびサイトメガロウイルス（失明）；アデノウイルス；肝炎ウイルス（Ａ／Ｂ／Ｃ）；ポリオウイルス、ライノシルセス（ｒｈｉｎｏｃｉｒｕｓｅｓ）、風疹、黄熱、西ナイルウイルス、デング、ウマ脳炎、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、およびタバコモザイクウイルスを含む。
【００２４】
幾つかの態様では、ウイルスは中でもＨＩＶ、インフルエンザ、ポリオウイルス、単純ヘルペス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎および肝炎の他のウイルス株、カポジ肉腫、ライノウイルス、西ナイルウイルス、痘瘡およびワクシニアの１以上である。
【００２５】
本明細書で使用する「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」とは、遺伝子の発現の上昇（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の幾つかの態様では、阻害は遺伝子発現の調節の形態である。
【００２６】
本明細書で使用する用語「阻害する」とは、ベースラインと比較して質または量の低下または減少を指す。例えば本発明の内容において、ウイルス複製の阻害とは、ベースラインと比較してウイルス複製における減少を指す。幾つかの態様では、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の低下が存在する。当業者はウイルス複製が阻害されたか否か、そしてどの程度まで阻害されたかを容易に測定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する用語「約」は値の＋／−２０％、＋／−１５％、＋／−１０％、＋／−５％を指す。
【００２８】
本明細書で使用する用語「生物適合性」とは、一般に生物機能に対して有害ではなく、しかもアレルギーおよび疾患状態を含め、許容できない程度の毒性をもたらさない物質または化合物を指す。
【００２９】
「循環半減期」とは、修飾されたＡＤＩが患者に注入された後、ＡＤＩの量が元のピーク血清レベルの半分のレベルに排除されるまでの期間を指す。循環半減期は、ヒトまたはマウスを含む任意の関連する種で測定することができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「共有結合した」、「結合した」および「カップリングした」は互換的に使用され、そして直接的またはリンカーを介してＡＤＩをＰＥＧ分子に連結する共有結合を指す。
【００３１】
本明細書で使用する用語「治療に有効な量」とは、所望する治療的応答を生じるために効果的な本発明の化合物の量を意味する。具体的な治療に有効な量は、明らかに処置する特定の状態、患者の健康状態、処置する哺乳動物または動物の種類、処置期間、同時療法の性質（もしあるならば）、および使用する具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子により変動する。肝機能を改善する内容では、用語「治療に有効な量」は、肝機能を改善するポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量を指す。幾つかの態様では、治療に有効な量は個体のＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患（Ｍａｙｏ Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＭＥＬＤ）スコアを改善するために効果的である。幾つかの態様では、治療に有効な量は限定するわけではないがビリルビンレベル、クレアチレベルおよび国際的な標準比を含む肝機能マーカーの比較に基づき、肝機能の改善するために効果的である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「ウイルス複製を阻害するために効果的な量」とは、ウイルス複製レベルの低下、すなわち個体中に検出可能なウイルス量の低下（すなわちウイルス力価またはウイルス負荷量（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）の低下）を生じる、個体に投与されるポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合したＡＤＩを含んでなる化合物の量を指す。ウイルス複製を阻害するために効果的な量を測定するために、個体のウイルス負荷量を本発明の化合物で処置する前に測定し、次いで処置後に測定することができる。ウイルス複製のレベルは例えば：化合物の投与前および後にサンプル中の実際のウイルス粒子の数を定量すること、および化合物の投与前および後にサンプル中に存在する１以上のウイルス抗原のレベルを定量することを含め、多数の日常的な方法により定量することができる。幾つかの態様では、「ウイルス複製を阻害するために効果な量」は約５μＭ未満の血漿アルギニン濃度に下げるために必要な量である。血漿アルギニン濃度を測定する方法は、当該技術分野では周知である。
【００３３】
またウイルス複製に関するアッセイもウイルスインヒビターの効力を測定する能力を持つ方法を提供し、そして当該技術分野では周知である。そのようなアッセイはインビボまたはインビトロで行うことができる。ＨＣＶはチンパンジーで生じることが知られており、ここでの感染はヒトで見られる感染に良く似ている。霊長類に近いツパイアス（ｔｕｐａｉａｓ）および免疫不全症マウスでの実験的感染の報告もあった（Ｘｉｅ，Ｚ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４４，５１３（１９９８）；Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍ，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１０，９９（１９９９））。
【００３４】
ウイルス複製の阻害は、ウイルス感染またはウイルス感染の症状の重篤度の低下に貢献する。
【００３５】
本明細書で使用する用語「予防に有効な量」とは、所望する予防的応答を生じるために効果的な本発明の化合物の量を意味する。具体的な予防に有効な量は、明らかに特定のウイルス、患者の健康状態、処置する哺乳動物または動物の種類、処置期間、同時療法の性質（もしあるならば）、および使用する具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子により変動する。
【００３６】
本明細書で使用する「併用療法」とは、処置が必要な患者が疾患に関する他の薬剤をＰＥＧ−ＡＤＩと一緒に与えられることを意味する。この併用療法は、個体を最初に１以上の薬剤で処置し、ついで他のまたは２以上の薬剤を同時に与える順次の治療であることができる。
【００３７】
本明細書で使用する「アルギニン除去療法」という句は、患者のアルギニンレベルを下げる、最小にする、または廃する（ａｂｏｌｉｓｈ）薬剤の使用を含む処置計画を指す。アルギニン除去療法はしばしばＡＤＩを使用して行う。アルギニン除去療法およびアルギニン除去療法に使用する薬剤は、査定された１９９８年２月１３日に出願された米国特許出願第０９／０２３，８０９号明細書、現在では２００１年２月６日に発効された米国特許第６，１８３，７３８号明細書；および２０００年２月１５日に出願された係属している米国特許出願第０９／５０４，２８０号明細書に詳述されている（それぞれ引用により全部、本明細書に編入する）。
【００３８】
本明細書で使用する用語「１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体」とは、１以上のウイルスについて陽性であるとは診断されなかったが、最近の高リスクな活動または彼らをウイルスと接触にさせるような活動から、１以上のウイルスに暴露された可能性がある個体を指す。例えばＨＩＶに暴露されたと疑われる個体は、ＨＩＶを含むサンプルまたはＨＩＶに感染した個体のいずれかと接触した針で刺された個体を指す。そのようなサンプルの例には限定するわけではないが、研究または調査サンプルまたは患者に由来する血液、精液、身体の分泌物等のサンプルを含む。ＨＣＶに暴露されたと疑われる個体には、未知の品質の血液の輸血を受けた個体を含む。輸血される血液は試験されなかったかもしれないし、または血液がＨＣＶを含まないことを示す試験結果は信頼できないか、または疑わしい。幾つかの態様では、ウイルスに感染したことが疑われる個体には、例えば性交、他人の体液との接触、皮下注射針の共有等を介することを含め、他人を介してウイルスへ暴露された個体を含む。ウイルスが最初に生じた個体はウイルスの存在および／または不存在について試験されたかもしれないし、またはされなかったかもしれない。また用語「１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体」には、１種のウイルスについて陽性であるとすでに診断されたが、少なくとも１つのさらなるウイルスにも感染している個体を含む。例えばＨＩＶに感染している個体は、１以上の形態の肝炎にも陽性であることが多い。そのような個体は、１以上のウイルスに関して「高リスク」であると分類することができる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「選択的に阻害する」とはウイルス複製の選択的阻害を指し、そして幾つかの態様では、ウイルスｍＲＮＡレベルのＣＣ５０／ＥＣ５０％の比である。ＳＩ＞１０はウイルス複製の選択的阻害を反映していると考える。
【００４０】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、患者に由来する生物学的物質を指す。本発明によりアッセイされるサンプルは、いかなる特別な種類にも限定されない。サンプルには非限定的例として、単細胞、多数の細胞、組織、腫瘍、生物学的流体、生物学的分子、または前記の上清もしくは抽出物を含む。例には生検用に採取した組織、切除中に採取した組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜および糞便サンプルを含む。使用するサンプルはアッセイ形式、検出法およびアッセイする腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づき変動する。サンプルを調製する方法は当該技術分野では周知であり、そして利用する方法に適合するサンプルを得るために容易に調整することができる。
ＡＤＩ
アルギニンデイミナーゼはアルギニンのシトルリンへの転換を触媒し、そしてアルギニンを排除するために使用することができる。本発明では、アルギニンデイミナーゼ遺伝子を誘導し、クローン化するか、あるいは例えば微生物、組換えバイオテクノロジー、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の起源から生産することができる。アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物からクローン化することができる。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、またはそれらの任意の組み合わせからクローン化することができる。幾つかの態様では、本発明で使用するアルギニンデイミナーゼは、配列番号１〜１０および１３〜２１の１以上のアミノ酸配列を有することができる。
【００４１】
天然のアルギニンデイミナーゼは微生物中に見いだすことができ、そして抗原性であり、そして患者の循環から素早く排出される。これらの問題はアルギニンデイミナーゼにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有的に修飾することにより克服することができる。ポリエチレングリコール（連結基を含むか、または含まない）で共有的に修飾したアルギニンデイミナーゼは、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”と呼ぶ。天然のアルギニンデイミナーゼと比較した時、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性をほとんど保持し、はるかに抗原性が低く、大きく延びた循環半減期を有し、そして腫瘍の処置にはさらに一層効果的である。
【００４２】
ある種の欠点が生物由来のアルギニンデイミナーゼの単離に付随していた。インビトロで腫瘍細胞を殺すには効果的であるが、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から単離されたアルギニンデイミナーゼは、中性ｐＨでは酵素活性がほとんどなく、そして実験動物の循環から素早く排出されたので、インビボで効力を現すことはできなかった。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）由来のアルギニンデイミナーゼ（配列番号５）は、例えばＴａｋａｋｕ，Ｈ，Ｔａｋａｓｅ，Ｍ，Ａｂｅ Ｓ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ．（１９９２）。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）から精製したアルギニンデイミナーゼのインビボ抗腫瘍活性。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：２４４−２４９、および米国特許第５，４７４，９２８号明細書に記載され、その開示は引用により全部、本明細書に編入する。そのような異種タンパク質の治療的使用に付随する問題は、その抗原性である。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来するアルギニンデイミナーゼのシアヌル酸クロライド連結基を介したポリエチレングリコールでの化学修飾は、Ｔａｋａｋｕ，Ｈ，Ｍｉｓａｗａ，Ｓ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ．（１９９３）。マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）に由来する抗腫瘍酵素であるアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールによる化学的修飾。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：１１９５−１２００に記載されている。修飾されたタンパク質は、シアヌル酸クロライド連結基に由来するシアン化物の放出により、代謝された時に毒性であった。
【００４３】
また組換えＤＮＡ技法を介するアルギニンデイミナーゼの生産も、ある種の欠点を提供する。例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で生産されたアルギニンデイミナーゼは酵素的に不活性であり、すなわち酵素的に活性となるためには変性させ、そし正しく再生しなければならない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産されたアルギニンデイミナーゼを再生するための常法は、不活性酵素を単離し、塩酸グアニジンに溶解し、そして低イオン強度のバッファーに迅速に希釈することにより再生することである。この最終工程には大変大容量のバッファーを必要とし、これによりアルギニンデイミナーゼの製造が経費がかかり、しかも時間を要するものとなる。しかし組換え技法はある種の利点を有する。例えば宿主としてより発酵し易い微生物を使用することができる。さらにこれらの発酵宿主は一般に病原性がさらに低く、そして大量のアルギニンデイミナーゼを得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は大量のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）アルギニンデイミナーゼを生産できることが示された。
【００４４】
アルギニンデイミナーゼ酵素の化学的および遺伝的修飾は、その生物学的活性に影響を及ぼすことができる。例えばアルギニンデイミナーゼは多くは抗原性であり、そして患者の循環から素早く排出されることが示された。しかしポリエチレングリコールを含むアルギニンデイミナーゼの製剤は抗原性を下げ、そして酵素の循環半減期を上げることも示された。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６（１９８４）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６（１９７７）。特にアルギニンデイミナーゼはポリエチレングリコールで共有的に修飾することができる。ポリエチレングリコールで共有的に修飾されたアルギニンデイミナーゼ（連結基を含むか、または含まない）は、今後“ＡＤＩ−ＰＥＧ”と呼ぶ。米国特許出願第０９／０２３，８０９号明細書でＣｌａｒｋは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（配列番号１）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（配列番号５）およびマイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（配列番号７）に由来するアルギニンデイミナーゼのポリエチレングリコールで改善された修飾を記載し、それらの開示は引用により全部、本明細書に編入する。天然のアルギニンデイミナーゼと比較した時、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性をほとんど保持し、はるかに抗原性が低く、大きく延びた循環半減期を有し、そして腫瘍の処置にさらに一層効果的である。本発明の目的のためのポリエチレングリコールを用いたアルギニンデイミナーゼの修飾をペグ化と呼ぶことができる。
【００４５】
他の生物に由来するアルギニンデイミナーゼも、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位に対応するペグ化部位を有するかもしれないと理解される。例えばストレプトコッカス ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、１０４位にリシンを有し、マイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１０６位にリシンを有し、そしてキアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは１１４位にリシンを有する。さらに数種の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼの１１２位と同じ全体的に位置に対応するリシンを有し得る。そのような生物に由来するアルギニンデイミナーゼのリシンの位置を以下に示すことができる：
【００４６】
【表１】
【００４７】
現在、そのようなリシンまたはそれらの組み合わせへのポリエチレングリコールの結合が酵素を不活性化できると考えられている。現在、そのようなリシンでのアミノ酸置換はペグ化でその酵素的活性の損失がより少ないタンパク質をもたらすことができると考えられている。
【００４８】
幾つかの態様では、本発明はアルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、ペグ化で活性の損失が少ない修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供し、すなわちペグ化で、修飾されたアルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少は、非修飾アルギニンデイミナーゼにおけるペグ化後の酵素活性の減少よりも少ない。酵素の触媒領域での、またはそれに隣接するペグ化部位を排除することにより、最適なペグ化がこれまでの活性の損失無しに達成される。上記で検討したように特定の生物に由来するアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖上の様々な位置に配置されるペグ化部位を有する。本発明を限定するわけではないが、現在、アルギニンデイミナーゼは酵素の触媒領域、またはそれに隣接するアミノ酸リシンを有する可能性があり、そしてこれら部位のペグ化が酵素を不活性化し得ると考えられる。これらペグ化部位の少なくとも１つを排除することにより、ペグ化を行い、そしてより多くの酵素活性を保持することができる。本発明に従い、幾つかの態様でリシンはグルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはそれらの組み合わせと置換される。幾つかの態様ではリシンはグルタミン酸に置換される。本発明の幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ１１２、Ｌｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、Ｌｙｓ４０８またはそれらの組み合わせまたは副次的組み合わせでアミノ酸置換を有する。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｌｙｓ１１２からＧｌｕ１１２、Ｌｙｓ３７４からＧｌｕ３７４、Ｌｙｓ４０５からＧｌｕ４０５、Ｌｙｓ４０８からＧｌｕ４０８またはそれらの組み合わせへのアミノ酸置換を有する。幾つかの態様ではマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼは、グルタミン酸に置換される１１２位のリシンを有する（配列番号２）。
【００４９】
このように本発明は、アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖中に特定のアミノ酸置換を提供する。そのようなアミノ酸置換はアルギニンデイミナーゼのペプチド鎖中で問題の多い特徴的構造を排除することができる。そのようなアミノ酸置換は、修飾されたアルギニンデイミナーゼの改良された復元を提供する。これらのアミノ酸置換は、減少させたバッファー量を使用して修飾されたアルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能とする。これらのアミノ酸置換はまた、復元した修飾アルギニンデイミナーゼの収量の増加も提供する。本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼはＰｒｏ２１０で１つのアミノ酸置換を有する。上記のように、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来するアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸プロリンを有する。本発明を限定するわけではないが現在、２１０位のアミノ酸プロリンの存在が、アルギニンデイミナーゼの復元（すなわちリフォールディング）の難しさを増す正常なポリペプチド鎖中に曲がりおよびよじれを生じると考えられている。２１０位でのプロリンの置換は、減少したバッファー量を使用して修飾アルギニンデイミナーゼの迅速な復元性を可能とする。２１０位のプロリンの置換は、復元される修飾アルギニンデイミナーゼの収量の上昇も提供することができる。幾つかの態様では２１０位のプロリンは、セリンに置換される（配列番号３）。本発明の観点に従い、２１０位での他の置換も行うことができると理解される。置換の例には、Ｐｒｏ２１０からＴｈｒ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｒｇ２１０、Ｐｒｏ２１０からＡｓｎ２１０、Ｐｒｏ２１０からＧｌｎ２１０またはＰｒｏ２１０からＭｅｔ２１０を含む。野生型アルギニンデイミナーゼの２１０位のアミノ酸に伴うこれらの構造的特徴を排除することにより、酵素の正しいリフォールディングを達成することができる。
【００５０】
本発明の幾つかの態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼが多数のアミノ酸置換を有する。この修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の触媒領域で、またはそれに隣接したペグ化部位を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換を有することができる。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、酵素の復元を妨害するこれら構造的特徴を排除する少なくとも１つのアミノ酸置換も有することができる。このようにアミノ酸置換は、本発明の修飾されたアルギニンデイミナーゼを提供することができる。アミノ酸置換は、酵素活性を失う事なく修飾されたアルギニンデイミナーゼのペグ化を提供することができる。アミノ酸置換は、減少したバッファー量を使用して迅速に復元することができる修飾アルギニンデイミナーゼを提供することができる。またアミノ酸置換は、上昇した収量の復元された修飾アルギニンデイミナーゼを提供することもできる。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼはセリンに置換される２１０位でのプロリン、およびグルタミン酸で置換される１１２位のリシンを含む（配列番号４）。しかし上記に検討したように、修飾されたアルギニンデイミナーゼは他の置換を含んでもよいと理解される。幾つかの態様では、保存的置換を野生型アルギニンデイミナーゼの１１２位および／または２１０位に作成してもよい。
【００５１】
修飾されたアルギニンデイミナーゼはＪＭ１０１細胞でＴａｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，同上に記載されたように発現された。修飾されたアルギニンデイミナーゼは、１１２位のグルタミン酸および２１０位のセリンを含んだ。幾つの態様ではマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）に由来する修飾されたアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４の配列である。
【００５２】
幾つかの態様ではアルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、キアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム パーフリンゲス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ）、バチルス リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア アフゼリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｌｉｉ）、エンテロコッカス フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトバチルス サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）またはキアルジア インテスチナリス（Ｑｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来することができる。
【００５３】
幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼに由来する（配列番号１）。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒへの置換を含んでなる。
【００５４】
本発明の幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼが修飾され、そして少なくとも１つのアミノ酸置換もしくは欠失を含んでなり、ここで修飾されたアルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて触媒領域に、またはそれに隣接して減少した数のペグ化部位を有する。幾つかの態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２、３７４、４０５または４０８のリシン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つか態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２、３７４、４０５または４０８のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つか態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのリシン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕへの置換を含んでなる。幾つか態様では、修飾されたアルギニンデイミナーゼはさらに少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失を含んでなる。
【００５５】
幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換または欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。
【００５６】
幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼは配列番号１と比べて触媒領域に、またはそれに隣接して少なくとも１つのペグ化部位が自由になるように修飾されたアルギニンデイミナーゼを含んでなり、ここで該修飾されたアルギニンデイミナーゼは配列番号１の残基１１２、３７４、４０５もしくは４０８に、またはそれに対応して少なくとも１つのアミノ酸置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのアミノ酸の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基１１２のリシン残基、またはそれに対応する残基のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのアミノ酸の置換もしくは欠失は、さらに少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基の置換もしくは欠失を含んでなる。幾つかの態様では、少なくとも１つのプロリン残基の置換もしくは欠失は、配列番号１の残基２１０のプロリン残基、またはそれに対応する残基のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＭｅｔへの置換を含んでなる。
【００５７】
幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号２）。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号３）。幾つかの態様では、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号１の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換、および配列番号１の残基２１０のプロリンのセリンへの置換を含んでなる（配列番号４）。幾つか態様では、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号５の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号６）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１および１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号８）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１１のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号９）。幾つか態様では、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）由来のアルギニンデイミナーゼは、配列番号７の残基１１２のリシンのグルタミン酸への置換を含んでなる（配列番号１０）。
【００５８】
そのような修飾および／または置換ならびにヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、２００１年２月６日に発効された米国特許第６，１８３，７３８号明細書および２０００年５月４日に出願された同時係属出願第０９／５６４，５５９号明細書に記載され、それぞれ引用により全部、本明細書に編入する。
ポリエチレングリコール
分子量および連結基が異なる多くのポリエチレングリコールを利用することができる。これらのＰＥＧはタンパク質の抗原性、免疫原性および循環半減期に変動する効果を有することができる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｃ．ポリエチレングリコールの化学：生物工学および生物医学的応用。Ｐｐ．３４７−３７０、プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９２；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６，６２−６９，１９９５；Ｄｅｌｇａｄｏ Ｃ；Ｆｒａｎｃｉｓ ＧＥ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｄ．ＰＥＧ−結合タンパク質の使用および性質。Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．，９：２４９−３０４，１９９２）。
【００５９】
本発明の幾つかの態様では、各ポリエチレングリコール分子は約１０，０００〜約５０．０００の平均分子量を有し；約１２，０００〜約４０，０００の、約１５，０００〜３０，０００の；そして約２０，０００の平均分子量を有する。一般に３０，０００以上の分子量を持つポリエチレングリコールは溶解し難く、そして配合生成物の収量は大きく減少する。
【００６０】
ポリエチレングリコールは直鎖もしくは分枝鎖でよい。幾つかの態様ではポリエチレングリコールは直鎖である。ポリエチレングリコールの分子量の増加は、一般にＡＤＩの免疫原性を下げる傾向がある。本発明に記載する分子量を有するポリエチレングリコールはウイルス性疾患を処置するためにＡＤＩと一緒に使用することができ、そして任意に生物適合性の連結基を使用することができる。
ペグ化
ＡＤＩは、例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；およびＺａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，ポリエチレングリコールの化学；生物工学および生物医学的応用。Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編集、プレナム出版、ニューヨーク、第２１章（１９９２）に記載されているような（これらは引用により全部、本明細書に編入する）、技術的に知られている方法を使用して生物適合性の連結基を介してＰＥＧに共有結合することができる。
【００６１】
ＰＥＧをＡＤＩに共有結合するために使用する連結基は、任意の適合性連結基でよい。幾つかの態様では、連結基は生物学的適合性の連結基である。上記で検討したように、「生物学的適合性」は化合物または基が非毒性であり、そしてインビトロまたはインビボで損傷、病気、疾患または死を引き起こさずに利用することができることを示す。ＰＥＧは例えばエーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して連結基に結合することができる。適当な連結基には、例えばエステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、スクシンイミド基（例えばスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えばニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または１級アミンを含む。幾つかの態様では、連結基はエステル基および／またはスクシンイミド基である。幾つかの態様では連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳである。
【００６２】
本発明では特定の連結基がＰＥＧ−ＡＤＩの循環半減期またはその特異的酵素活性に影響は与えないと思われる。しかし連結基が使用される場合、幾つかの態様では、生物適合性の連結基を使用することが重要である。タンパク質に結合するＰＥＧはＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＳＣ−ＰＥＧのような単鎖、またはＰＥＧ２−ＮＨＳのようなＰＥＧの分枝鎖のいずれかで使用され得る。
【００６３】
あるいはＡＤＩは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介してＰＥＧに直接カップリングしてもよい（すなわち連結基無し）。幾つかの態様では、ＰＥＧはＡＤＩ上のリシン残基にカップリングされる。
ＡＤＩ−ＰＥＧ
ＰＥＧのＡＤＩへの結合はＡＤＩの循環半減期を上げる。ＡＤＩ上のＰＥＧ分子の数は酵素の循環半減期に関連するようであり、一方、保持される酵素活性の量は、使用するＰＥＧの平均分子量に関連するようである。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数の上昇は、酵素の酵素活性を減少させる。また幾つかのＰＥＧ製剤は生産することが難しく、比較的低収量の生成物を生じることが知られている。すなわち効力的な生成物を達成するためには、循環半減期、抗原性、生産効率および酵素活性の間でバランスが保たれる必要がある。
【００６４】
一般にＰＥＧはＡＤＩの一級アミンに結合する。アルギニンデイミナーゼ上のポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者に知られているようなタンパク質の活性ドイメイン内の各部位の役割により決定される。ＰＥＧは酵素活性の実質的な損失無しでアルギニンデイミナーゼの一級アミンに結合することができる。例えばマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびマイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）からクローン化されたＡＤＩは、この手順により修飾され得る約１７個の残基を有する。換言すると１７個のリシンは、ＡＤＩをＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳのような生物適合性連結基を介してＰＥＧに結合させることができるすべての可能な点である。またＰＥＧは当業者には本開示の観点から明白であるように、ＡＤＩの他の部位に結合することもできる。
【００６５】
１〜約３０個のＰＥＧ分子をＡＤＩに共有結合させることができる。幾つかの態様では、ＡＤＩは約７〜約１５個のＰＥＧ分子、約９〜約１２個のＰＥＧ分子で修飾される。換言すると、アルギニンデイミナーゼの一級アミノ基の約３０％〜約７０％がＰＥＧで修飾され、アルギニンデイミナーゼの一級アミノ基の約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、そして約５０％がＰＥＧで修飾される。幾つかの態様では、ＰＥＧがＡＤＩの末端（ｅｎｄ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に共有結合される時、わずか１個のＰＥＧ分子が利用される。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の循環半減期を上げる。しかしＡＤＩ上のＰＥＧ単位数の増加は、酵素の比活性を下げる。このように幾つかの態様では、当業者には本開示の観点から明白であるように、２つの間のバランスを取る必要がある。
【００６６】
本発明では、幾つかの態様で連結基がマレイミド基を介してアルギニンデイミナーゼの一級アミンに結合する。いったんアルギニンデイミナーゼにカップリングされれば、ＳＳ−ＰＥＧはＰＥＧの隣にエステル結合を有し、これはこの部位を身体中でＡＤＩからＰＥＧを放出することができる血清エステラーゼに対して感受性とすることができる。ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル結合を持たないので、それらは血清エステラーゼに対して感受性ではない。
【００６７】
本発明に有用な特定の連結基の構造式を以下に説明する。
【００６８】
【化１】
【００６９】
【化２】
【００７０】
処置法
幾つかの態様では、本発明は個体中のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法は連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合したＡＤＩを含んでなる、治療にまたは予防に有効な量の化合物を該個体に投与することを含んでなり、ここで各ポリエチレングリコール分子は、約１０，０００〜約３０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では、ＡＤＩはポリエチレングリコール分子で修飾され、各分子は約２０，０００の平均分子量を有する。幾つかの態様では連結基はスクスシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの態様では、連結基はスクシンイミジルスクシネートである。幾つか態様では、約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様では、約９〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合する。幾つかの態様ではアルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する。幾つかの態様では、アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびそれらの組み合わせに由来する。幾つかの態様ではウイルスＨＣＶである。幾つかの態様では、方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する工程を含んでなる。
【００７１】
本発明の１つの化合物の治療に有効な量は、ウイルス複製を阻害するために効果的な量である。一般に処置は少ない投薬用量から開始し、これをその状況下で最適な効果が達成されるまで少しづつ増やしていく。一般に本発明の化合物の治療用量は、１週間に２回からおよそ２週間に１回の約１〜約２００ｍｇ／ｋｇとなり得る。例えばこの投薬用量は２ｍｌの静脈内注射として１週間に１回の約１ｍｇ／ｋｇから、３日に１回の約２０ｍｇ／ｋｇとなり得る。化合物は処置の過程を通して連続的または断続的に１回用量で投与することができる。ＡＤＩ−ＰＥＧは１日に数回、１日に１回、１週間に１回または２週間に１回投与することができる。
【００７２】
幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧは少なくとも約４０ＩＵ／ｍ２、少なくとも約８０ＩＵ／ｍ２、少なくとも約１６０ＩＵ／ｍ２、または少なくとも約２００ＩＵ／ｍ２の用量で毎週投与される。幾つかの態様では、投与される用量はアルギニンの血清レベルを約１０μＭ、５μＭ、１μＭ、１００ｎＭ未満に下げる。幾つか態様ではＡＤＩ−ＰＥＧ２０は毎週約１６０ＩＵ／ｍ２で投与され、患者の血清レベルを約５μＭ未満とする。
【００７３】
本発明は個体中の１以上のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様ではウイルスはヒトのウイルスである。幾つかの態様ではウイルスはＨＣＶである。幾つか態様では個体は２以上の異なるウイルスに感染している。幾つかの態様では２以上のウイルスはＨＩＶおよびＨＣＶである。幾つかの態様では、感染しているウイルスの存在および／または同一性が投与時に、または投与前には未知である。幾つかの態様では、方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する工程を含んでなる。
【００７４】
また本発明は、１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体を処置する方法を提供し、この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。上で検討したように、１以上のウイルスに感染していると診断されなかった個体の中には、彼らが恐らくウイルスに暴露された可能性がある状況におかれた者もいる。また１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体の処置には、上記のようなさらなる治療薬の投与も含む。予防的処置の過程は、ウイルス感染の兆候について周期的に監視することと一緒に行うことができる。幾つかの態様では、本発明に従う処置の開始後、個体は１以上のウイルスについて陽性であると診断される。
【００７５】
幾つかの態様では、本発明は１以上のウイルスの危険にさらされている患者のウイルス複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を個体に投与することを含んでなる。
【００７６】
幾つかの態様では、本発明はウイルス感染に感染したと同定された個体のウイルス複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を個体に投与することを含んでなる。
幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．１ｍＭ未満の濃度で効果的である。幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．０５ｍＭ未満の濃度で効果的である。幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物は、ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて、５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するために、０．０１ｍＭ未満の濃度で効果的である。
【００７７】
幾つかの態様では、本発明は個体中の腫瘍を処置すると同時に１以上のウイルスの複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、腫瘍はメラノーマ、肉腫および肝癌からなる群から選択される。幾つかの態様では、腫瘍は肝癌であり、そしてウイルスはＨＣＶである。幾つかの態様では、腫瘍の存在および／または同一性は処置の時点では未知である。幾つかの態様では、ウイルスの存在および／または同一性は、処置の時点では未知である。幾つかの態様では、この方法はさらに治療に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与することを含んでなる。
【００７８】
幾つかの態様では、本発明は個体の一酸化窒素レベルを調節する方法を提供し、この方法は、ポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを該個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、調節は一酸化窒素レベルの抑制である。幾つかの態様では、この方法はさらに治療にまたは予防に有効な量のさらなる抗ウイルス剤を、アルギニンデイミナーゼの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、個体は１以上のウイルスに感染したことがすでに同定されている。
【００７９】
幾つかの態様では、本発明はアルギニンのレベルを調節するためにウイルス複製の感度を測定する方法を提供し、この方法はサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ産物のレベルを測定することを含んでなる。ウイルスＲＮＡまたはそれらの産物のレベルを測定する方法は、当業者には周知である。
【００８０】
幾つかの態様では、本発明は１以上のウイルスに感染した個体中のウイルス複製を選択的に阻害する方を提供する。この方法はポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる。幾つかの態様では、ウイルスはＨＣＶである。幾つかの態様ではＳＩは１０より高く、１５より高く、２０より高く、または２５より高い。
【００８１】
幾つかの態様では本発明は、ポリエチレングリコールに結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を該個体に投与することを含んでなる、個体の肝機能を改善する方法を提供する。
【００８２】
当業者は肝機能の質を容易に測定することができる。幾つかの態様では、１以上のマーカーの相対的な量が、健康な患者と肝臓疾患または肝臓障害がある患者との間で比較される。
【００８３】
幾つかの態様では肝機能はＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患（ＭＥＬＤ）スコアを使用して評価される。肝機能を等級分けするＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスケールは、肝臓疾患における死亡率を予測するために幾つかの因子を使用する。Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスケールで考慮される因子には、ビリルビンレベル、クレアチンレベル、国際標準比（ＩＮＲ：プロトロンビン時間（凝固するための血液の能力の尺度）としても知られている）、腹部の腹水の存在および脳障害の等級を含む。等級は肝機能異常の上昇レベルに割り当てられる；等級“Ａ”は５〜６点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして最低レベルの肝異常を示す。等級“Ｂ”は７〜９点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして中間レベルの肝異常を示す。等級“Ｃ”は１０〜１５点のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアを反映し、そして最高レベルの肝異常を示す。肝機能を等級分けするＭＥＬＤスケールは、ビリルビンレベル、クレアチンレベルおよび国際標準比を考慮している。
【００８４】
幾つかの態様では、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの投与前の個体の肝機能は、Ｃｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＡ、Ｃｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＢまたはＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＣである。
【００８５】
幾つかの態様では本発明は、１以上のウイルス感染を有すると同定された個体がアルギニン除去療法に感受性であると同定する方法を提供する。この方法は個体からウイルスサンプルを得、そしてウイルス複製に適する条件下で、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在および不存在下でのサンプル中のウイルス複製を比較することを含んでなる。幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧに接触したサンプル中の少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも８０％のウイルス複製の阻害は、個体がアルギニン除去療法の候補であることの指標となり、そしてＡＤＩ−ＰＥＧによる４０％未満、３０％未満または２０％未満のウイルス複製の阻害は、個体がアルギニン除去療法の候補ではないことの指標となる。
【００８６】
幾つかの態様では、本発明は個体における１以上のウイルス感染を処置する方法を提供する。この方法は、個体が上記のアルギニン除去療法の候補であるかどうかを測定し、そして個体がアルギニン除去療法の候補であるならば個体をアルギニン除去療法で処置し、そして個体がアルギニン除去療法の候補でないならば個体を通常の抗ウイルス処置で処置することを含んでなる。
【００８７】
最も効果的な手段および投薬用量を決定する方法は、当業者には周知である。幾つかの態様では、少なくとも数週間にわたり１週間に２回の投与が使用される。しばしば抗ウイルス化合物は長期間投与され、そして個体の生涯にわたり投与され得る。最も効果的な手段および投薬用量を決定する方法は、当業者には周知である。単回または多回投与を１回用量のレベルで行うことができ、そしてパターンは管理者により選択される。
【００８８】
投与される用量は、もちろん特定薬剤の薬力学的特徴およびその投与様式および経路；個体の年齢、健康状態および／または体重；症状の性質および程度；同時治療の種類；処置頻度；個体に現れる症状；および望む効果のような既知の因子により変動するだろう。
【００８９】
ほとんどのウイルス感染の場合、抗ウイルス処置に対する応答の症状または基準は、ウイルス複製のレベルに集中する。ウイルスの循環するウイルスＲＮＡレベル、そしてその中の変化に関する試験は標準的であり、そして細胞およびヒトを含む動物に応用することができる。ヒト患者では、肝臓の活性に関する試験を行うことができる。１つの試験の例はＡＬＴ（血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）試験である。ＡＬＴは主に肝臓に見いだされる酵素であるが、程度は低いものの心臓および他の組織にも見いだされ、そして肝機能の診断に有用である。ヒトに関する正常な成人の範囲は０から約４８Ｕ／Ｌであり、最適な成人の値は約２４Ｕ／Ｌである。１以上のこれらの基準における改善は、効果的な投薬用量または処置を表示する。
【００９０】
化合物は、意図する投与形態に関して、そして従来の製薬学的プラクティスに合致するように選択される適当な製薬学的希釈剤、増量剤、賦形剤または担体（本明細書では集合的に製薬学的に許容され得る担体を指す）との混合物で投与することができる。例えば幾つかの態様では、ＡＤＩ−ＰＥＧはリン酸緩衝化生理食塩水、または当業者に知られている任意の他の適当な溶液と注入前に混合することができる。ＡＤＩ−ＰＥＧ製剤は所望により固体（凍結乾燥物）として、または液体製剤として投与することができる。
【００９１】
本発明の組成物は使用する投与様式に従い配合される。製薬学的組成物が注入可能な製薬学的組成物である場合、それらは滅菌され、発熱物質を含まず、そして粒子を含まない。幾つかの態様では、組成物は等張性製剤である。幾つかの態様では、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースの１以上を含むことができる。幾つかの態様では、組成物はリン酸緩衝化生理食塩水のような等張性溶液として提供される。幾つかの態様において、組成物の安定化剤にはゼラチンおよびアルブミン含む。
【００９２】
また本発明はポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療に有効な量のＡＤＩを含んでなる化合物を個体に投与することを含んでなる、患者における広スペクトルの遺伝的に多様なウイルスを処置する方法を提供する。
併用療法
本発明の化合物は他の抗ウイルス化合物と組み合わせて併用療法を提供することができる。組み合わせがＡＤＩ−ＰＥＧの化合物の抗ウイルス活性を排除しない限り、任意の既知の抗ウイルス剤を本発明の組成物と組み合わせることができる。ＨＩＶの場合、ＡＤＩ−ＰＥＧとＡＺＴ、ＴＣ−３またはプロテアーゼインヒビターとの併用療法は、いずれの薬剤を個別に使用するよりも効果的となり得る。肝炎の場合、ＡＤＩ−ＰＥＧと１以上のシクロビル（ｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ファムシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）またはバラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、インターフェロンまたはベーターグロブリンとの組み合わせを併用療法として使用することができる。例えば組換えアルファインターフェロンもＡＤＩ−ＰＥＧとの併用両方として使用することができる。
【００９３】
併用療法での使用に適する他の抗ウイルス剤は当業者に知られており、そしてそれらには限定するわけではないが中でも、１以上のＡＺＴ（ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、ｄｄＩ（ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、Ｖｉｄｅｘ）、３ＴＣ（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、Ｅｐｉｖｉｒ）、ｄ４Ｔ（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、Ｚｅｒｉｔ）、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）（Ｚｉａｇｅｎ）、ｄｄＣ（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、Ｈｉｖｉｄ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）、デラビルジン（Ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）／リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｋａｌｅｔｒａ）、アンプレナビル（Ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、アタザナビル（Ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、融合インヒビターＴ−２０、インターロイキン−２、ヒドロキシウレア、ＡＲ１７７（Ｚｉｎｔｅｖｉｒ）、フォミビルセン（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）ナトリウム（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ）、ＧＥＭ１３２、ＧＥＭ９１、ＧＥＭ９２、ＡＭＤ３１００、ｎ−ドコサノール（１−ドコサノール）、ＰＲＯ２０００、Ｔ−１２４９、Ｔ−２０、アルビドール（ａｒｂｉｄｏｌ）、ＳＰ−３０３（Ｖｉｒｅｎｄ）、ハイペリシン（ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ）（ＶＩＭＲｘｙｎ）、ＭＤＬ２８５７４、ＳＣ−４８３３４、ＡＤＡ、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ａｌｄｅｒａ）、ＩＳＩＳ５３２０、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、アデホビルジピボキシル（ａｄｅｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）（Ｐｒｅｖｅｏｎ）、ＤＡＰＤ、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｅｆｆｉｘ、Ｅｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ、Ｈｅｒｔｏｖｉｒ、Ｈｅｐｔｏｄｉｎ）、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）、オセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）（Ｔａｍｉｆｌｕ）、ピロダビル（ｐｉｒｏｄａｖｉｒ）、プレコナリル（ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ）（ＶＰ−６３８４３）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）（Ｖｉｒａｚｉｄ／Ｖｉｒａｚｉｄｅ／Ｖｉｒａｚｏｌｅ）、リマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）（Ｆｌｕｍａｄｉｎｅ）、ＷＩＮ５４９５４、ザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）（Ｒｅｌｅｎｚａ）、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（Ｆｏｓｃａｖｉｒ）、マリバビル（ｍａｒｉｂａｖｉｒ）、ＡＢＴ−３７８、アテビリジン（ａｔｅｖｉｒｉｄｉｎｅ）メシレート、カラノライド（ｃａｌａｎｏｌｉｄｅ）Ａ、カプラビリン（ｃａｐｒａｖｉｒｉｎｅ）、エファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）（Ｓｕｓｔｉｖａ）、エミビリン（ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ）（Ｃｏａｃｔｉｎｏｎ）、ＧＷ４２０ ８６７Ｘ（ａｋａ ＨＢＹ１２９３）、ＨＢＹ ０９７、Ｌ−６９７，６６Ｉ、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ＭＩＶ−１５０、ＰＥＴＴ−５、Ｒ１６５３３５−ＴＭＣ１２５、タルビラリン（ｔａｌｖｉｒａｌｉｎｅ）、チビラピン（ｔｉｖｉｒａｐｉｎｅ）、トロビルジン（ｔｒｏｖｉｒｄｉｎｅ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（Ｚｏｖｉｒａｘ）、ブリブジン（ｂｒｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｈｅｌｐｉｎ、Ｚｏｓｔｒｅｘ）、シドホビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）（Ｖｉｓｔｉｄｅ（ｉ．ｖ．）；Ｆｏｒｖａｄｅ（局所））、サイクリックＨＰＭＰＣ、ファムシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｆａｍｖｉｒ）、フィアシタビン（ｆｉａｃｉｔａｂｉｎｅ）、フィアルリジン（ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｃｙｍｖｅｎｅ／Ｃｙｔｏｖｅｎｅ）、ＧＷ−２７３１７５Ｘ、イドクスウリジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（Ｈｅｒｐｉｄ、Ｋｅｒｅｃｉｄ／Ｈｅｒｐｌｅｘ Ｌｉｑｕｉｆｉｌｍ、Ｉｄｏｘｅｎｅ、Ｖｉｒｕｄｏｘ、Ｉｄｕｒｉｄｉｎ、Ｓｔｏｘｉｌ）、ロブカビル（ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）、ネチブジン（ｎｅｔｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｏｎａｖｉｒ）、ペンシクロビル（ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｖｅｃｔａｖｉｒ／Ｄｅｎａｖｉｒ）、ソリブジン（ｓｏｒｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｕｓｅｖｉｒ）、トリフルリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）（Ｖｉｒｏｐｔｉｃ）、バラシクロビル（ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｖａｌｔｒｅｘ；Ｚｅｌｉｔｒｅｘ）、バロマシクロビル（ｖａｌｏｍａｃｉｃｌｏｖｉｒ）ステアレート（ＭＩＶ−６０６）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）（Ｖｉｒａ−Ａ）、９３５Ｕ８３、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）（Ｚｉａｇｅｎ／Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アデホビルジピボキシル（ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）（Ｐｒｅｖｅｏｎ）、アロブジン（ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）、ＡｚｄＵ、ＣＳ−９２，ＤＡＰＤ、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）（Ｖｉｄｅｘ）、ｄＯＴＣ、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）、ホジブジンチドキシル（ｆｏｚｉｖｕｄｉｎｅ ｔｉｄｏｘｉｌ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（Ｅｐｉｖｉｒ／Ｃｏｍｂｉｖｉｒ／Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、ロブカビル（ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）、ロデノシン（ｌｏｄｅｎｏｓｉｎｅ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）（Ｚｅｒｉｔ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）（Ｖｉｒｅａｄ）、テノホビルジソプロキシル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）フマラート、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｈｉｖｉｄ）、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、Ａ−７７００３、ＡＧ７０８８、アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、ＢＭＳ−２３２６３２、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ＤＭＰ−３２３、ＤＭＰ−４５０、ＧＷ４３３ ９０８、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、ＫＮＩ−２７２，ラシナビル（ｌａｓｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）（Ｋａｌｅｔｒａ）、モゼナビル（ｍｏｚｅｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、ＰＤ１７８３９０、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ｎｏｒｖｉｒ）、ＲＰＩ３１２、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｉｎｖｉｒａｅ／Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ）、ＳＣ−５２１５１、ＳＤＺ ＰＲＩ０５３、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、Ｕ−１０３０１７、Ｕ−９６９８８、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ）、ＡＧＩ５４９、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（Ｆｏｓｃａｖｉｒ）、ＬｉＧＬＡ、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）−バラシクロビル（Ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ファミシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、イドクスウリジン（Ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、フォスカルネット（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、シドホビル（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）およびアデホビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、バルサイト（Ｖａｌｃｙｔｅ）、クレブジン（ｃｌｅｖｕｄｉｎｅ）、チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）、ＩＬ−１２を含む。
【００９４】
併用療法は順次的であることができ、これは最初に１つの薬剤で処置し、次いで２番目の薬剤で処置するか、あるいは併用療法は同時に両方の薬剤で処置することができる。順次的治療は第１治療が完了した後、第２治療が始まる前の妥当な期間内であり得る。同時に両薬剤での処置は、同日の投与で、または別々の投与であることができる。例えば幾つかの態様では、１つの薬剤を用いた処置が１日目にあり、そして２日目にもう１つの薬剤を用いた処置がある。正確な処方は、処置する疾患、感染の重篤度および処置に対する応答に依存する。
【００９５】
本発明の化合物の投与のインビボ手段は、意図する応用に依存して変動する。当業者には認識されているように、本発明のＡＤＩ−ＰＥＧ組成物の投与が、例えば吸入または座薬により、あるいは膣、直腸、子宮、頬および舌組織の洗浄によるような粘膜組織へ、経口的に、局所的に、鼻内に、腹腔内に、非経口的に、静脈内に、リンパ内に、腫瘍内に、筋肉内に、間隙に、動脈内に、皮下に、眼内に、滑液包内に、経上皮的に（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）および経皮的に行うことができる。本発明の化合物は錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップおよび乳液のような経口剤形として投与することができる。化合物は静脈内（ボーラスまたは注入）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態でも投与することができ、すべての使用剤形は製薬分野の当業者には周知である。
［実施例］
本発明はさらに以下の実施例で示し、これらは具体的説明を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９６】
組換えＡＤＩの生産
マイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）（ＡＴＣＣ２３２４３）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）（ＡＴＣＣ２３１１４）およびマイコプラズマ アルソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ２３１９２）のカルチャーは、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。
【００９７】
アルギニンデイミナーゼはマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）およびマイコプラズマ アーソリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）からクローン化し、そしてＳ．Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により以前に記載されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。特異的な酵素活性、Ｋｍ、Ｖｍａｘおよび最適ｐＨに関して、当業者に知られている方法による各タンパク質の特性決定は、それらが生化学的に互いに区別できることを明らかにした。最適ｐＨはクエン酸バッファー（ｐＨ５〜６．５）、リン酸バッファー（ｐＨ６．５〜７．５）およびホウ酸バッファー（ｐＨ７．５〜８．５）を使用して測定した。ＫｍおよびＶｍａｘは酵素を種々の濃度のアルギニンとインキュベーションし、そしてシトルリン生産を定量することにより測定した。種々の酵素に関するＫｍは約０．０２〜０．０６μＭであり、そしてＶｍａｘは約１５〜２０μｍｏｌ／分／ｍｇであり、これらの値は互いに標準誤差内であった。
【００９８】
アルギニンデイミナーゼ遺伝子は、例えばＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：３７８８−３７９５（１９９０）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）により記載されているように、Ｍ．アルギニニ（ａｒｇｉｎｉｎｉ）の公開配列に由来する以下のプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した：
５’−ＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴ−３’（配列番号：１１）
５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＣＧ−３’（配列番号：１２）
ポリメラーゼ連鎖反応産物は、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として発現プラスミドｐＱＥ１６にクローン化した。ＤＮＡ配列分析では、この断片がＴ．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、同上に記載されているアルギニンデイミナーゼ遺伝子に関する配列と同じ配列を有することが示された。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）中のトリプトファンをコードするＡＤＩ遺伝子中の５個のＴＧＡコドンは、例えばＪ．Ｒ．Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：５９２−５９６（１９９２）に教示されているように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での遺伝子発現前にオリゴヌクレオチド−指定（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発法によりＴＧＧコドンに変えた。組換えＡＤＩは全細胞タンパク質の１０％のレベルで封入体中に発現された。
【００９９】
上記３種のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に由来する各タンパク質は約９５％の相同性を有し、そしてカラムクロマトグラフィーにより容易に精製される。約１．２ｇの純粋なタンパク質を１リットルの発酵ブロスから単離することができる。組換えＡＤＩは３７℃で約２週間安定であり、そして４℃で保存した時には少なくとも８カ月間安定である。当業者に知られている方法により測定されるように、このタンパク質はアルギニンに対して高い親和性（０．０４μＭ）、および約７．２〜約７．４の生理学的に最適なｐＨを有した。
【実施例２】
【０１００】
組換えＡＤＩの再生および精製
わずかに修飾されたＡＤＩタンパク質は、Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６：１４５−１５５（１９９４）（この開示は引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているように再生した。１００ｇの細胞ペーストを８００ｍｌの１０ｍＭ Ｋ２ＰＯ４ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（バッファー１）に再懸濁し、そして細胞をマイクロ流動機（マイクロフルイデェクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、ニュートン、マサチューセッツ州）に２回通すことにより破壊した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて、４（容量／容量）％の最終濃度とした。ホモジネートを４℃で３０分間撹拌し、次いで１３，０００ｇで３０分間遠心した。ペレットを集め、そして０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１リットルのバッファー１に再懸濁した。溶液は１００ｋＤの保持ランク（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｒａｔｉｎｇ）の中空ファイバーカートリッジ（マイクロゴン（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ）社、ラグナヒル、カリフォルニア州）を使用して、５容量の変性バッファー１（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析した。グアニジンＨＣｌを加えて６Ｍの最終濃度とし、そして溶液を４℃で１５分間撹拌した。溶液をリフォールディングバッファー１、１０ｍｍ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で１００倍に希釈し、そして１５℃で４８時間撹拌し、粒子を１５，０００ｘｇで遠心することにより除去した。
【０１０１】
生成した上清は、リフォールディングバッファーで前平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰａｓｔＦｌｏｗ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）カラムで濃縮した。ＡＤＩは０．２Ｍ ＮａＣｌを含有するリフォールディングバッファーを使用して溶出した。この精製手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で予想される＞９５％純度のＡＤＩタンパク質を得た。８ｇの再生したＡＤＩタンパク質は１ｋｇの細胞ペーストから生成され、これは１リットルの発酵あたり２００ｍｇの精製ＡＤＩに相当する。
【０１０２】
ＡＤＩ活性はＯｇｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９５７）３：６３９−６４２に記載されている方法をわずかに変更することにより測定した。０．１Ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．０（ＢＵＮアッセイバッファー）中の１０μｌのサンプルを９６ウェルのマイクロリッタープレートに置き、４０μｌの０．５ｍＭアルギニン（ＢＵＮアッセイバッファー中）を加え、そしてプレートを覆い、そして３７℃で１５分間インキュベーションした。２０μｌの完全ＢＵＮ試薬（シグマダイアグノスティックス：Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を加え、そしてプレートを１００℃で１０分間インキュベーションした。次いでプレートを２２℃に冷却し、そしてマイクロリッタープレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）により４９０ｎｍで分析した。１ＩＵは１分間に１μｍｏｌｅのＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転換する酵素の量である。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いたピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を使用して測定した。精製したＡＤＩ調製物の酵素活性は、１７〜２５ＩＵ／ｍｇであった。
【実施例３】
【０１０３】
ＰＥＧのＡＤＩへの結合
ＰＥＧはＡＤＩに１００ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４中で共有結合させた。簡単に説明すると、リン酸バッファー中でＡＤＩを１００モル過剰なＰＥＧと混合した。反応物は室温で１時間撹拌し、次いで混合物を徹底的に透析して取り込まれなかったＰＥＧを除去した。
【０１０４】
ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物に使用した連結基の効果を評価する第１実験を行った。ＰＥＧ１０，０００およびＡＤＩは４種の異なる連結基を介して共有結合した：ＳＳ、ＳＳＡ、ＳＰＡおよびＳＳＰＡを含むエステル基またはマレイミド基、ここで各ＰＥＧ分子は５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００および４０，０００の平均分子量を有した；エポキシ基、ＰＥＧ−エポキシ、ここでは各ＰＥＧ分子は５，０００の平均分子量を有した；および分枝ＰＥＧ基、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ここで各ＰＥＧ分子は１０，０００、２０，０００および４０，０００の平均分子量を有した。
【０１０５】
生成した組成物の５ＩＵをマウスに注射した（各群あたり５マウス）。アルギニンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元から供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるシトルリンの限界感度は約２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。血清アルギニンの量は、アミノ酸分析により測定した。ＰＥＧおよびＡＤＩを共有結合する連結基は、インビボで血清アルギニンを減少するＡＤＩの能力に測定できる効果をもたなかった。
【０１０６】
連結基およびＰＥＧの分子量がインビボで血清シトルリンレベルに及ぼす効果を評価する第２実験を行った。マウス（各群５匹）にＡＤＩおよびＰＥＧ−ＡＤＩの種々の組成物を５．０ＩＵの量で与えた。シトルリンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメントからの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるシトルリンの限界感度は約２〜６μＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。シトルリンの量を測定し、そして曲線下の面積をおよそ求め、そしてμｍｏｌ日で表した。
【０１０７】
結果はＰＥＧの分子量がＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効力を決定することを示す。ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果はＰＥＧのＡＤＩへの結合方法または手段には基づかないようである。
【０１０８】
結果は、ＰＥＧの最適な分子量が約２０，０００であることを示す。薬力学的観点からＰＥＧ３０，０００はＰＥＧ２０，０００よりも優れているようであったが、ＰＥＧ３０，０００は溶解性が低く、これは作業をさらに難しくする。酵素活性の回収に基づく収率はＰＥＧ５，０００およびＰＥＧ１２，０００については約９０％であり；ＰＥＧ２０，０００については約８５％；そしてＰＥＧ３０，０００については約４０％であった。したがって幾つかの態様では、ＰＥＧ２０，０００がシトルリン生産により測定される収率と循環半減期との間の良い妥協点となるようである。
【０１０９】
第３実験では、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を用いた血清アルギニン減少およびシトルリンの生産の用量応答を測定した。マウス（各群５匹）に０．０５ＩＵ、０．５ＩＵまたは５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００ののいずれかの単回注射を与えた。示した時期に上記のように血清を集め、そしてアミノ酸分析を行って血清アルギニンおよび血清シトルリンを定量した。両製剤は血清アルギニンに用量依存的減少を、そして血清シトルリンに用量依存的増加を誘導した。しかしＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００により誘導される効果は、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により誘導される効果よりも顕著で、しかも長期間であった。
【実施例４】
【０１１０】
循環半減期
ＢａｌｂＣマウス（各群５匹）に、５．０ＩＵ用量の天然アルギニンデイミナーゼまたはポリエチレングリコールで修飾したアルギニンデイミナーゼの種々の製剤を静脈内に単回注射した。アルギニンおよびシトルリンの血清レベルを測定するために、マウスは後眼窩叢から採血された（１００μｌ）。採血直後に、等容量の５０（重量／容量）％トリクロロ酢酸を加えた。沈殿を遠心（１３，０００ｘｇで３０分間）により除去し、そして上清を取り出し、そして−７０℃で凍結保存した。次いでサンプルはベックマンインスツルメントからの自動化アミノ酸分析機および試薬を使用して製造元により供給されたプロトコールを使用して分析した。この方法によるアルギニンの限界感度は約６ｐＭであり、そして測定の再現性は約８％内であった。
【０１１１】
血清アルギニンレベルの用量依存的減少および血清シトルリンの上昇は、天然ＡＤＩまたはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧの単回用量の投与から検出された。しかし血清アルギニンの減少および血清シトルリンの上昇は短期であり、すぐに標準に戻った。アルギニン除去の半減期を以下の表２にまとめる。
【０１１２】
【表２】
【実施例５】
【０１１３】
ＰＥＧ修飾化ＡＤＩの抗原性
天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を測定するために、例えばＰａｒｋ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、同上およびＫａｍｉｓａｋｉ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、同上に記載されている手順に従った。簡単に説明すると、ＢａｌｂＣマウス（各群５匹）に１２週間、毎週、約０．５ＩＵ（１００μｇのタンパク質）の天然ＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を静脈内注射した。動物は実験開始時および４、８および１２週に後眼窩叢から採血された（０．０５ｍｌ）。血清を単離し、そして−７０℃で凍結保存した。抗−ＡＤＩ ＩｇＧの力価は、ＥＬＩＳＡにより測定した。５０μｇのＡＤＩを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、そして室温で４時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳですすぎ、次いでウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）で覆って非特異的なタンパク質結合部位をブロックし、そして４℃で一晩保存した。翌日、マウスの血清を希釈し、そしてウェルに加えた。１時間後、プレートをＰＢＳですすぎ、そしてペルオキシダーゼにカップリングしたウサギ抗−マウスＩｇＧをウェルに加えた。プレートを３０分間インキュベーションし、ついで生じたＵＶ吸収をマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。力価はバックグラウンドの吸収（約０．５０ＯＤ）から２倍の上昇を生じる血清の最高希釈として定めた。
【０１１４】
ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００およびＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００は天然のＡＤＩよりも有意に抗原性が低い。例えばわずか４回の天然ＡＤＩの注射が約１０６の力価を生じる一方、任意のＰＥＧ−ＡＤＩ製剤の４回の注射では測定できる抗体を生成できなかった。しかし８回の注射の後、ＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００は約１０２の力価を有し、一方ＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００は１２回の注射後でもこのような量の免疫応答を誘導しなかった。この結果はＰＥＧをＡＤＩに結合することがタンパク質に対する免疫応答を鈍らせることを示す。
【実施例６】
【０１１５】
ヒトに対する応用
ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩおよびＰＥＧ２０，０００−ＡＤＩは正常ヒト血清と一緒にエクスビボでインキュベーションし、そしてアルギニン濃度に及ぼす効果をアミノ酸分析により測定し、ここで酵素は完全に活性であり、そしてすべての検出可能なアルギニンをマウスが関与する実験と同じキネティックスで分解できることが見いだされた。反応は０．１ｍｌ容量で３７℃で１時間内に行った。
【０１１６】
さらにヒト血清中のアルギニンおよびシトルリンのレベルはマウスで見いだされたレベルと同じである。ＰＥＧ−タンパク質はマウスよりもヒトで長時間循環する。例えばアデノシンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルコセルブロシダーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロブリンおよびスーパーオキサイドジスムターゼに結合したＰＥＧの循環半減期は、すべてマウスにおける同じ製剤よりも５〜１０倍長い循環半減期を有する。過去においてこれが意味したことは、ヒトの用量がマウスで使用される用量の１／５〜１／１０であることが最も多いということである。したがってＰＥＧ−ＡＤＩはマウスよりもヒトでさらに長期に循環するはずである。
【実施例７】
【０１１７】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗ウイルス活性は、ヒト胚芽腫細胞株Ｈｕｈ７のトランスフェクションに由来する安定なＨＣＶ ＲＮＡ複製細胞株ＡＶＡ５で試験した（Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，細胞培養におけるＨＣＶ ＲＮＡ複製の効率的な開始、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００ ２９０：１９７２−１９７４）。
インビトロ複製アッセイ
ヒト胚芽腫細胞株Ｈｕｈ７のトランスフェクションに由来する安定なＨＣＶ ＲＮＡ複製細胞株ＡＶＡ５を使用した。ＡＶＡ５細胞の分裂しているカルチャーを１日１回、３日間（培地は各化合物の添加毎に交換した）、４種の濃度の試験化合物で処理した（１濃度につき３カルチャー）。全部で６種の未処理対照カルチャー、および１０、３および１ＩＵ／ｍｌのα−インターフェロン（細胞傷害性が無い活性な抗ウイルス剤）で処理した３連のカルチャー、および１００、１０および１μＭのリバビリン（抗ウイルス活性も細胞傷害性もない）を対照として使用した。ＨＣＶ ＲＮＡおよび細胞性β−アクチンＲＮＡレベルは化合物の最終投与から２４時間後にドットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。β−アクチンＲＮＡレベルは各サンプル中の細胞ＲＮＡの量を標準化するために使用した。毒性分析は、抗ウイルスアッセイについて使用したプレートとは別のプレートで行った。毒性分析用の細胞を培養し、そして抗ウイルス評価について使用したものと同じスケジュールおよび同一の培養条件下で試験化合物を用いて処置した。各化合物は４種の濃度で、それぞれ３連のカルチャーで試験した。中性のレッド色素の取り込みを使用して、最終処理から２４時間後の相対的毒性レベルを測定した。インターナライズした（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）色素の５１０ｎｍ（Ａ５１０）の吸収を定量分析に使用した。試験カルチャーにおける値は、試験カルチャーとして同じプレート上に維持した未処理細胞の９種の対照と比較した。５０％および９０％効果的な抗ウイルス濃度（ＥＣ５０ＥＣ９０）および５０％細胞傷害濃度（ＣＣ５０）を算出し、そして選択指数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）（ＣＣ５０／ＥＣ５０）を作成するために使用した。１０以上のＳ．Ｉ．は、選択的な抗ウイルス効果と考える。
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の抗ウイルス活性
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０（０．０１ＩＵ／ｍｌ）の単回用量を、分裂しているカルチャー細胞が５０％の集密度に達した時、これらのカルチャーに加えた。対照としてアルファインターフェロン（１９ＩＵ／ｍｌ）および陽性対照としてリバビリン（１００μＭ）を使用した。処置から３日後、ＲＮＡは標準的な実験技法を使用してカルチャーから単離し、そしてドットブロットを使用して評価した。ＨＣＶ ｍＲＮＡの量を測定し、そしてアクチン（対照として使用する）に関するｍＲＮＡと比較した。ＨＣＶ ｍＲＮＡの対照レベルの５０％阻害を引き起こすために必要な薬剤（ＡＤＩ、アルファインターフェロンまたはラボビロン）の量を測定する。アクチンｍＲＮＡの５０％阻害を引き起こす薬剤の用量は、非特異的な阻害活性を有すると考えられる。この実験から得た結果を以下に示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
これらのデータは、ＡＤＩ−ＰＥＧがほぼアルファインターフェロンのように、そしてリバビリンよりも大いにインビトロでのＨＣＶウイルス複製を阻害することを示す。
【実施例８】
【０１２０】
ＡＶＡ５細胞の分裂カルチャーを種々の濃度のＰＥＧ−ＡＤＩ（または対照実験では、アルファインターフェロンまたはリバビリン）で３日間処理した。ＨＣＶ ｍＲＮＡレベルを上記のようにアッセイした。細胞の生存能はニュートラルレッドを使用して測定した。ＨＣＶ ｍＲＮＡレベルを５０％（ＩＣ５０）および９０％（ＩＣ９０）阻害する濃度を測定した。細胞の５０％を殺す薬剤濃度（ＣＣ５０）も測定した。ＣＣ５０／ＥＣ５０は選択指数（ＳＩ）を測定するために算出する。ＳＩ＞１０はウイルス複製の選択的阻害と考える。結果を以下に示す。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
これらのデータは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０がＨＣＶ複製を阻害し、そしてこの薬剤が選択的であることを確証する。
【実施例９】
【０１２３】
腫瘍患者を対象とした抗ウイルス活性およびＮＯ合成
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、肝細胞癌を有し、そして慢性的にＨＣＶに感染している患者を対象として抗腫瘍活性について試験した。これら患者の血清中のＨＣＶウイルス力価も、ホフマン ラ ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）により開発された標準的な臨床アッセイを使用して測定した。血清はＡＤＩ−ＰＥＧ２０での処置前に得た。患者に１６０ＩＵ／ｍ２のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を１週間に１回、３週間注射した。３回目のＡＤＩ−ＰＥＧ２０を注射してから１週間後、患者から血清を単離し、そして再度、同アッセイを使用してＨＣＶ力価についてアッセイした。この実験結果を以下に示す。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
これらのデータは、ＨＣＶに慢性的に感染しているヒトのＡＤＩ−ＰＥＧ処置が患者血清中のＨＣＶ力価の有意な低下をもたらすことを示す。さらにアルファインターフェロンはこれらの患者の〜５０％に効果的であるだけで、ＨＣＶ力価に５０％の低下を達成するためには３〜６カ月の頻度の処置が必要であり、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０がこの点で、より一層効果的であると思われる。
【０１２６】
ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ ２０，０００ｍｗは、迅速な最適２段階フェイズ２試験に関するリチャード サイモン統計案（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｉｍｏｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｅｓｉｇｎ）に従い、手術できないＨＣＣの個体のフェイズ２試験で試験した（Ｓｉｍｏｎ Ｒ．１９８９．フェイズＩＩ臨床試験に関する最適な２段階計画。Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｒｉａｌ １０：１−１０；Ｓｉｍｏｎ ＲＭ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＳＭ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍ，Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，ｋｈｌｅｉｆ Ｓ，Ｋｗａｋ ＬＷ，Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ，２００１．治療用癌ワクチンの早期臨床的開発に関する臨床試験計画．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９：１８４８−１８５４）。この試験はイタリア、ナポリのパスカル国立癌研究所（Ｐａｓｃａｌｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）でイタリア保健省（Ｉｔａｌｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ）による認可の下、および地方の研究再審評議委員会（ｌｏｃａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）の認可を得て行なった。すべての個体にはヘルシンキの宣言に従いインフームドコンセントが提供された。ＨＣＶに慢性的に感染し、手術できないＨＣＣの全部で１８名の個体をこの実験に登録した（Ｉｚｚｏ提出）。この試験中、３名が進行性の疾患から死亡し、そしてすべての３サイクルの処置を受けることができず、すなわち更なる分析から排除された。残りの１５名の個体は、３サイクル（それぞれが１週間に４オンスの注入からなる）のＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗを、最適な生物学的用量（Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｏｓｅ）で受けた。この最適な生物学的用量は、血清アルギニンを〜１３０μＭの静止レベルから検出レベル未満（＜２μＭ）に少なくとも７日間下げるＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００の量と定めた（〜１６０ＩＵ／ｍ２）。
【０１２７】
この治療が腫瘍に有した作用を、４週間毎に１回、ＣＴスキャンにより評価した。応答は標準的な国立癌研究所（ＮＣＩ）の基準に従い進行性疾患（ＰＤ）、安定な疾患（ＳＤ）、部分的応答（ＰＲ）または完全な応答（ＣＲ）のいずれかと定めた。この試験結果は、ＨＣＣおよびＨＣＶを持つ１５個体で以下の応答が見られたことを示した：
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
全身的な抗腫瘍処置（または抗ウイルス処置）を、この試験前または最中に受けた個体は無かった。臨床的な研究室の試験は実験中、少なくとも１週間に２回行い、そして血漿サンプルは１週間に１回集め、そして−７０℃で保存した。これらの凍結保存したサンプルは、後にＨＣＶについて試験した。
ＨＣＶ力価に関するアッセイおよびヒト血清サンプルの血清型の決定
ＨＣＶウイルス力価は、標準的な臨床ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、コバス アンプリコールＨＣＶモニター 試験（Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ）、２．０バージョン；ロッシュ ダイアグノスティク（ドイツ １９９９）を使用して、病院の感染疾患臨床研究室で測定した。遺伝子型は同様に測定した。ウイルス力価はＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗ処理の前および治療から１２週間後に集めた血漿サンプルについて測定した。
ＮＯ合成
ＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗでの処置により、血漿アルギニンの用量依存的な減少および同時にＮＯ合成の減少が生じる（データは示さず）。この処置はＮＯレベルを有意に下げたが、この処置が血圧または心拍に及ぼす測定可能な効果は無かった。
【０１３０】
以下の表３はＡＤＩ−ＳＳ ＰＥＧ２０，０００ｍｗがＣ型肝炎力価および肝機能試験に及ぼす効果を列挙する。
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
本明細書に記載する各特許、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号、特許出願および公報は、引用により全部、本明細書に編入する。
【０１３３】
本明細書での記載に加え、本発明の様々な修飾が前述の説明の観点から当業者には明白であろう。そのような修飾も添付する特許請求の範囲内にあることを意図している。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体中の１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的な量で該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
上記個体に、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗原生動物剤からなる群から選択される１以上の化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記個体に、１以上の他の抗ウイルス化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記抗ウイルス化合物が、１以上のアジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、ｄ４Ｔ、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ）、ネビラピン、ラミブジン（エピビル、３ＴＣ）、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α（ＩＦＮ）またはリバビリンである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記組成物が筋肉内、皮内または腹腔内に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物が、ウイルス複製を測定するためのアッセイにおいて５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するほどに約１ｍＭ未満の濃度で効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、１週間あたり約４０ＩＵ／ｍ２から約１６０ＩＵ／ｍ２の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が１週間あたり約１６０ＩＵ／ｍ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、血漿アルギニンレベルを５μＭ未満に下げる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合し、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基およびヒスチジン基、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
連結基がスクシンイミジルスクシネートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
約９〜約１２個の上記ポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記微生物がマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アルギニンデイミナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アルギニンデイミナーゼが配列番号１または４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスがＨＣＶである請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスがＨＣＶ１ｂである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体を処置する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２４】
１以上のウイルスについて危険がある個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
１以上のウイルスに感染したと同定された個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
個体中の腫瘍を処置すると同時に１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、腫瘍の増殖を抑制し、そしてウイルス複製を阻害するために効果的な該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２７】
個体が組成物の投与前に１以上のウイルス感染に感染したと同定された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍がメラノーマ、肉腫または肝癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
腫瘍が肝細胞癌である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記ウイルスがＨＣＶである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記腫瘍が肝細胞癌であり、そして上記ウイルスがＨＣＶである請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
個体の一酸化窒素レベルを調節する方法であって、一酸化窒素を調節するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３４】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基またはヒスチジン基の１以上である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
約７〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
上記アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
アルギニンのレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少がアルギニンデイミナーゼに対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４０】
一酸化窒素のレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少が一酸化窒素に対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４１】
上記化合物が、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物の投与と同時に該個体に投与される、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
治療にまたは予防に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、ウイルス複製の阻害が必要な個体におけるウイルス複製を選択的に阻害する方法。
【請求項４３】
ウイルスがＨＣＶである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
治療に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、個体の肝機能を改善する方法。
【請求項４５】
肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患スコアを使用して評価される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
肝機能が少なくとも１つの肝機能のマーカーを測定することにより評価され、マーカーがビリルビン、アルブミン、プロトロンビン時間、腹水の存在または脳障害の等級である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＢである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＣである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
１以上のウイルス感染を有すると同定された個体がアルギニン除去療法に感受性であると同定する方法であって：
ａ）個体から１以上のウイルスを含んでなるサンプルを得；そして
ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の不存在下でのサンプル中のウイルス複製に対して、ウイルス複製に適する条件下でポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触したサンプル中のウイルス複製を比較することを含んでなり、該サンプル中の少なくとも４０％のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補であることの指標となり、そして４０％未満のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補ではないことの指標となる上記方法。
【請求項５１】
個体中の１以上のウイルスを処置する方法であって：
ａ）個体が請求項５０に記載のアルギニン除去療法の候補であるかどうかを決定し；
ｂ）個体がアルギニン除去療法の候補であるならば、個体をアルギニン除去療法で処置し；そして
ｃ）個体がアルギニン除去療法の候補でないならば、個体を通常の抗ウイルス処置で処置する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項１】
個体中の１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的な量で該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
上記個体に、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗原生動物剤からなる群から選択される１以上の化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記個体に、１以上の他の抗ウイルス化合物を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記抗ウイルス化合物が、１以上のアジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）、ｄ４Ｔ、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ）、ネビラピン、ラミブジン（エピビル、３ＴＣ）、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α（ＩＦＮ）またはリバビリンである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記組成物が筋肉内、皮内または腹腔内に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物が、ウイルス複製を測定するためのアッセイにおいて５０％より多くの細胞で少なくとも５０％までウイルス複製を阻害するほどに約１ｍＭ未満の濃度で効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、１週間あたり約４０ＩＵ／ｍ２から約１６０ＩＵ／ｍ２の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が１週間あたり約１６０ＩＵ／ｍ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量が、血漿アルギニンレベルを５μＭ未満に下げる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合し、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基およびヒスチジン基、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
連結基がスクシンイミジルスクシネートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
約７〜約１５個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
約９〜約１２個の上記ポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記微生物がマイコプラズマ アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｕｓ）、マイコプラズマ アースリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アルギニンデイミナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アルギニンデイミナーゼが配列番号１または４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスがＨＣＶである請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスがＨＣＶ１ｂである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のウイルスに暴露されたと疑われる個体を処置する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２４】
１以上のウイルスについて危険がある個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
１以上のウイルスに感染したと同定された個体のウイルス複製を阻害する方法であって、該個体中のウイルス複製を阻害するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
個体中の腫瘍を処置すると同時に１以上のウイルスの複製を阻害する方法であって、ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合した治療にまたは予防に有効な量のアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を、腫瘍の増殖を抑制し、そしてウイルス複製を阻害するために効果的な該個体に投与する工程を含んでなる上記方法。
【請求項２７】
個体が組成物の投与前に１以上のウイルス感染に感染したと同定された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍がメラノーマ、肉腫または肝癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
腫瘍が肝細胞癌である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスが肝炎ウイルスである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
上記ウイルスがＨＣＶである請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記腫瘍が肝細胞癌であり、そして上記ウイルスがＨＣＶである請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
個体の一酸化窒素レベルを調節する方法であって、一酸化窒素を調節するために効果的なポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼの量を該個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３４】
アルギニンデイミナーゼが連結基を介してポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエチレングリコール分子のぞれぞれが約１０，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記ポリエチレングリコール分子のそれぞれが約２０，０００の分子量を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基またはヒスチジン基の１以上である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
約７〜約１２個のポリエチレングリコール分子がアルギニンデイミナーゼに結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
上記アルギニン デイミナーゼがマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の微生物に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
アルギニンのレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少がアルギニンデイミナーゼに対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４０】
一酸化窒素のレベルの調節に対するウイルス複製の感受性を測定する方法であって：
（ａ）１以上のウイルスを含んでなるサンプルを、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触させ；そして
（ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の存在下および不存在下でウイルス複製のレベルを比較する、
ことを含んでなり、アルギニンデイミナーゼと接触したサンプル中のウイルス複製の減少が一酸化窒素に対するウイルス感受性の指標となる上記方法。
【請求項４１】
上記化合物が、ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる上記組成物の投与と同時に該個体に投与される、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
治療にまたは予防に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、ウイルス複製の阻害が必要な個体におけるウイルス複製を選択的に阻害する方法。
【請求項４３】
ウイルスがＨＣＶである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
治療に有効な量のポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物を個体に投与することを含んでなる、個体の肝機能を改善する方法。
【請求項４５】
肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスケールまたはＭａｙｏ末期肝疾患スコアを使用して評価される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
肝機能が少なくとも１つの肝機能のマーカーを測定することにより評価され、マーカーがビリルビン、アルブミン、プロトロンビン時間、腹水の存在または脳障害の等級である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＢである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の投与前の上記個体の肝機能がＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈレべルＣである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
１以上のウイルス感染を有すると同定された個体がアルギニン除去療法に感受性であると同定する方法であって：
ａ）個体から１以上のウイルスを含んでなるサンプルを得；そして
ｂ）ポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物の不存在下でのサンプル中のウイルス複製に対して、ウイルス複製に適する条件下でポリエチレングリコールに結合したアルギニンデイミナーゼを含んでなる組成物と接触したサンプル中のウイルス複製を比較することを含んでなり、該サンプル中の少なくとも４０％のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補であることの指標となり、そして４０％未満のウイルス複製の阻害は個体がアルギニン除去療法の候補ではないことの指標となる上記方法。
【請求項５１】
個体中の１以上のウイルスを処置する方法であって：
ａ）個体が請求項５０に記載のアルギニン除去療法の候補であるかどうかを決定し；
ｂ）個体がアルギニン除去療法の候補であるならば、個体をアルギニン除去療法で処置し；そして
ｃ）個体がアルギニン除去療法の候補でないならば、個体を通常の抗ウイルス処置で処置する、ことを含んでなる上記方法。
【公表番号】特表２００６−５１５２８１（Ｐ２００６−５１５２８１Ａ）
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５３４２９（Ｐ２００４−５５３４２９）
【出願日】平成１５年９月２９日（２００３．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３０９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０２３９１８３９）フエニツクス・フアーマコロジクス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２９日（２００３．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３０９
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０２３９１８３９）フエニツクス・フアーマコロジクス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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