ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する薬剤および方法
【課題】ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法を提供する。
【解決手段】本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を使用することを含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法、特に、（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルス、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス、ならびに（３）ブドウ球菌の感染を抑制する方法を提供する。本発明はまた、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法をも提供する。
【解決手段】本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を使用することを含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法、特に、（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルス、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス、ならびに（３）ブドウ球菌の感染を抑制する方法を提供する。本発明はまた、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびそれに関連する方法についてのもので、特に、エンベロープを有する例えばインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、およびエンベロープのない例えばエンテロウィルス７１型、ならびにその他ブドウ球菌などの増殖感染を抑制する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界１００カ国以上に感染が広がり、国際的にも非常に重要視されている新型インフルエンザＨ１Ｎ１亜型は、欧米ではすでに死亡率が１０００分の２から４に達している。これに加え、近年、世界各地で局所的または世界的にしばしばその発生が伝えられる鳥インフルエンザＨ５Ｎ１亜型、または人類の生活環境中に常に存在しかつ世界各地に分布しており、近い将来においては絶滅の可能性はない重症エンテロウィルス７１型などは、いずれも人類の生命を脅かし続けているウィルスである。さらに、すでに耐薬性を獲得した新型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）が全世界にもたらすであろう事態について、すべての専門家達は懸念を抱いている。各国の衛生機関は消極的な防御策しかとれないでおり、如何にしてより有効にこれらウィルスを第１の段階で阻止するかについてはなす術がない状態である。ある状況の下では、インフルエンザウィルスに感染しても症状が出ないまま、他人にうつしてしまうこともある。このため、体外においてウィルス侵入を防止することが、第１段階でのウィルス感染増殖の予防・抑制になると考えられている。よって、有効に広域型のウィルスまたは細菌の感染増殖を体外で防止する方法が提供できれば、台湾、アジアそして世界の公衆衛生に大きく貢献することができる。
【０００３】
ウィルスまたは細菌の感染を体外で防止する方法は、ウィルスまたは細菌を破壊しその感染増殖を抑制するもの（消毒法）で、物理的および化学的に大別できる。物理的消毒法は一般に（１）放射線、（２）ろ過、（３）加熱、（４）冷凍、（５）乾燥などに分けられる。物理的消毒法の使用は空間的な制約を受けるのに対し、化学的消毒法はより広い応用が可能である。通常、化学消毒剤（disinfectant）として使用されるものには主に酸、アルカリ、アルコール、ジメチルエーテル、界面活性剤（surfactant）、ハロゲン（halogen）、酸化物、重金属および色素などがある。基本的にこれらの消毒剤は以下の４種のメカニズムによりウィルス・細菌の感染増殖を抑制する。つまり、（１）ウィルスのカプシド（capsid）もしくはエンベロープ（envelope）または細菌細胞壁／膜の破壊、（２）その輸送の破壊、（３）ウィルス・細菌のタンパク質の変性、（４）酵素活性および／またはレセプターの親和性の抑制、というメカニズムである。
【０００４】
化学消毒剤（disinfectant）が有効および広域型であるか否かに関しては、基本的に有効であればあるほどヒトに対してはより危険である傾向がある。よって消毒剤は、（１）対象とするのはどんな微生物か、（２）消毒剤を使用する部分の特性はどうであるか、（３）疾病予防のニーズ、などいくつかのパラメータを基に選択する。
【０００５】
一般に、理想的な化学消毒剤（disinfectant）は、大部分の種類の伝染性微生物（infectant microbe）に対し有効性（effectiveness）を持つ、有機化合物に対して感度を示さないまたはこれを無視できる、微生物表面への浸透能力が極めて高い、腐食性がない、毒性がない、ヒトに対し刺激性がない、消毒作用が持続し、化学的な安定性を持つ、水溶性が高い、消毒されるべき物体の表面への吸着力が良くかつ増殖感染を持続的に抑制する作用を有する、および量産にかかる費用が妥当である、というような特質を満たすものでなくてはならない。
【０００６】
しかしながら、上に挙げた特質を備えると共に、エンベロープを有する／有しないウィルスおよび細菌を有効かつ広域に破壊でき、感染率を低下させ、人体に無害な、ウィルス／細菌の感染増殖を抑制する方法が、依然として求められている。
【０００７】
特許文献１は、コロナウィルスの病原性を破壊する活性剤を開示しており、その活性成分は８−ヒドロキシオクタン酸（ＨＯ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）とされている。かかる化合物はコロナウィルスの外膜を破壊して、コロナウィルスが宿主細胞に接着できないようにし、病原性を失わせるものである。
【０００８】
特許文献２はウィルスの活性化を喪失させる方法を開示しており、該方法は、有機酸、短鎖アルキルの陰イオン界面活性剤混合物、カルシウムイオンキレート剤および消泡剤の組成物を局部投与する工程を含む。有機酸を利用してウィルスを該陰イオン界面活性剤上に吸着させ、さらに該陰イオン界面活性剤をウィルスのリン脂質エンベロープまたは外殻と作用させることにより、ウィルスを破壊する。
【０００９】
ここ数十年の間、世界各地で局部的もしくは全世界的な発生が頻繁に伝えられている鳥インフルエンザ、または近年流行し始めた新型インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型は、人類の生命を脅かしている。また、インフルエンザウィルスは既知の薬物に対して耐薬性を獲得し始めている。よって、（１）有効性があり、かつ（２）広域型のウィルス／細菌感染増殖を体外で、防止する実用的な方法、特に（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス７１型、ならびに（３）細菌の増殖感染を抑制する方法を提供できれば、世界の公衆衛生に大きく貢献することとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】台湾特許公告第Ｉ３０４３３８号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／００３５３３９Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法に関し、特に、（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス７１型、ならびに（３）黄色ブドウ球菌の増殖感染を抑制する方法に関する。
【００１３】
また本発明は、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法をも提供する。
【００１４】
本発明の具体的な実施形態を以下に詳しく説明するが、その実施例は本発明の技術内容をより詳細に開示するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明（１）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を使用することを含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する方法である。
本発明（２）は、前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（３）は、前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（４）は、エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（５）は、エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（６）は、エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（７）は、エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、本発明（２）の方法である。
本発明（８）は、前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、本発明（１）の方法である。
本発明（９）は、前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１０）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、本発明（１）の方法である。
本発明（１１）は、前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、本発明（１０）の方法である。
本発明（１２）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、本発明（１０）の方法である。
本発明（１３）は、ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、本発明（１）の方法である。
本発明（１４）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１５）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加することをさらに含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１６）は、前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１７）は、前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１８）は、前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１９）は、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法である。
本発明（２０）は、ＮａＯＨ水溶液と反応させた後、その反応溶液のｐＨ値が２に調整される、本発明（１９）の方法である。
本発明（２１）は、前記反応がエタノールの沸点の温度下で行われる、本発明（１９）の方法である。
本発明（２２）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を含むウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制するための薬剤である。
本発明（２３）は、前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（２４）は、前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（２５）は、エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２６）は、エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２７）は、エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２８）は、エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２９）は、前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３０）は、前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３１）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３２）は、前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、本発明（３１）の薬剤である。
本発明（３３）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、本発明（３１）の薬剤である。
本発明（３４）は、ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３５）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させるための、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３６）は、個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加するための、本発明（２２）の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を含む薬剤である。
本発明（３７）は、前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、本発明（３６）の薬剤である。
本発明（３８）は、前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、本発明（３６）の薬剤である。
本発明（３９）は、前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、本発明（３６）の薬剤である。
【発明の効果】
【００１５】
エンベロープを有するウィルス（例えばインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型など）、およびエンベロープのないウィルス（例えばエンテロウィルス７１型など）、ならびに細菌（例えばブドウ球菌など）を破壊し、その増殖感染を抑制する広域型かつ有効な薬剤およびその関連の方法を提供することができる。よって世界の公衆衛生に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法を示している。
【図２】ＡはインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型に感染して細胞変性効果が生じ、細胞に円形化、剥落および壊死の現象が起こったことを示している。ＢはインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１が２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸により抑制され、対照群と比べ細胞に変性が生じていない様子（陰性を示す）を示している。
【図３】Ａは未処理のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【図４】Ａは未処理の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した鳥インフルエンザＨ５Ｎ２ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【図５】Ａは未処理のエンテロウィルス７１型ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したエンテロウィルス７１型ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌の感染増殖を抑制する広域型の方法を提供する。
【００１８】
化合物２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造は、図１に示すように、先ず、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）および９５％エタノールと反応させてから、その反応物をＮａＯＨ水溶液とさらに反応させる。その反応物を、ｐＨ値を約２に調整した後、エチルエーテルで抽出する。抽出物中の溶媒を除去した後、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）が得られる。この製造方法において、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネートとチオウレアのモル比は１：１．２とし、反応温度はエタノールの沸点である約７８〜７９℃とするのが好ましい。
【化１】
【００１９】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の塩類に特に制限はなく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、硝酸塩、塩酸塩または炭酸水素塩などが挙げられる。上述の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸自体またはその塩類は、ウィルス表面のエンベロープ（envelope）またはコート（coat）の一部または全部を分解し、宿主細胞に対する親和性結合の感染能力を失わせることができる。
【００２０】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は溶液の形態で存在することが好ましく、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合溶媒中に溶け得るものである。溶媒はこれらに限定はされない。エタノールと水の混合液に溶解するのがより好ましい。
【００２１】
本発明において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度は、溶液の総重量の濃度が２０ｐｐｍより大きく１０００ｐｐｍ未満（２０ｐｐｍと１０００ｐｐｍは含まない）であることが好ましい。溶液の総重量の４５〜７５０ｐｐｍであればより好ましい。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が２０ｐｐｍよりも低いと、ウィルス感染を抑制する効果を生じ得ず、一方１０００ｐｐｍを超えると、宿主細胞に対して細胞毒性を生じる。
【００２２】
本発明で言う「ウィルス」とは生物学上定義されるウィルスであって、核酸分子とタンパク質の外殼から構成されるものであり、外形および感染の表面組成構造によって基本的に（１）エンベロープ（envelope）のあるウィルスと、（２）エンベロープ（envelope）のないウィルスの２種類に分けられる。本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、エンベロープを有するインフルエンザウィルスを失活させることができるものである。該インフルエンザウィルスには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ７亜型が含まれるが、これらに限定されるものではない。該インフルエンザウィルスにはさらに、通常“スペイン（Spanish）かぜ”、“アジア（Asian）かぜ”、“香港（Hong Kong）かぜ”、“鳥インフルエンザ（avian influenza）”、“豚インフルエンザ（swine influenza）”、“馬インフルエンザ”および“犬インフルエンザ”と呼ばれるインフルエンザの亜型なども含まれる。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、エンベロープ（envelope）を有するヒトインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型および鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）Ｈ５Ｎ１亜型、Ｈ５Ｎ２亜型を有効に失活させることができ、かつ、宿主細胞の変形、溶解（lysis）またはアポトーシス（apotosis）などを起こさせる細胞毒性（cytotoxic）を生じない。
【００２３】
本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、エンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を失活させることもできるという点でも優れている。エンテロウィルスはピコルナウイルス科（Picornaviridae）に属し、ウィルスの群の総称である。かかるエンテロウィルスは遺伝子配列解析の結果によって、ヒトエンテロウィルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（Human enterovirus A、B、C、D）型に分類される。このうち、エンテロウィルス７１型（enterovirus type 71）はヒトエンテロウィルスＡ型に入る。小児麻痺ウィルスを除き、すべてのエンテロウィルスのうち、エンテロウィルス７１型（Enterovirus Type 71）が最も神経系の合併症を引き起こし易い。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類は、エンベロープ（envelope）のない７１型を含むエンテロウィルスを破壊して失活させることができ、かつ、宿主細胞に変形、溶解（lysis）またはアポトーシス（apotosis）などを起こさせる細胞毒性（cytotoxic）を生じない。
【００２４】
本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、ブドウ球菌（Staphylococcus）を失活させて感染能力を失わせることもできるものである。ブドウ球菌属には２６種のブドウ球菌が含まれる。このうち黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腐生ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）が最もよく見られ、かつ病原性を持つブドウ球菌であるが、これらのみには制限されない。黄色ブドウ球菌は、食品製造において生じる汚染の主たる病原菌であるだけでなく、病院内で慢性的な院内感染を引き起こす病原菌でもあり、手術部位の感染またはその他の全身性感染を起こすことが多い。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、有効に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を失活させて病原性を失わせることができる。
【００２５】
本発明で言う「宿主細胞」にはヒト細胞が含まれるが、これには限定されない。該宿主細胞は、非ヒト動物、例えば家禽もしくは野生の渡り鳥などの鳥類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、ブタもしくはウマなどの哺乳類動物、サル（monkey）、類人猿（ape）もしくはチンパンジー（chimpanzee）などの非ヒト霊長類動物、またはその他の動物の細胞であってもよい。
【００２６】
本発明のウィルス・細菌の感染増殖を抑制する方法は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む。
【００２７】
本発明で言う「生体」には人体が含まれるが、これに限定はされない。該生体には、非ヒト動物、例えば家禽もしくは野生の渡り鳥などの鳥類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、ブタもしくはウマなどの哺乳類動物、サル（monkey）、類人猿（ape）もしくはチンパンジー（chimpanzee）などの非ヒト霊長類動物、またはその他の動物の生体も含まれ得る。
【００２８】
本発明で言う「生体外でウィルス・細菌と接触」は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を、ウィルスまたは細菌と、活性を有するヒトまたは非ヒトの動物組織または細胞の入った試験管または培養皿などの動物体外にて接触させることを含む。
【００２９】
本発明のウィルス・細菌の感染増殖を抑制する方法は、さらに、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類を、空気清浄用品、個人衛生用品、または繊維製品中に添加することを含む。
【００３０】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、例えばハンドソープ、ボディソープ、シャンプー、乳液または空気清浄スプレーなどの個人衛生用品または空気清浄用品に添加することができる。個人衛生用品または空気清浄用品に用いる場合は、その用途の属する技術分野において慣用されている調製方法に基づいて、その他の添加剤と適切に混合することができる。
【００３１】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、繊維製品中に添加することもできる。該繊維製品には、ポリマー不織布、天然繊維製品、またはこれらの混織物が含まれるが、これらに限定はされない。該繊維製品は、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターなどの用途への応用が可能である。さらに、該繊維製品は、必要に応じてマスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターの表面や内部に取り入れることができる。
【実施例１】
【００３２】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造工程
エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）（５．５ｍｍｏｌ）、チオウレア（thiourea）（６．６ｍｍｏｌ）および９５％のエタノール（２５ｍＬ）を５０ｍＬ丸底フラスコ中に入れ、５時間加熱還流した。さらに２．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（２５ｍＬ）を加えて引き続き約１５時間加熱還流した。反応が終了したら、２Ｍ ＨＣｌ水溶液を加えて溶液のｐＨ?を約２にした。その溶液をエチルエーテルで３回抽出して有機層を収集し、飽和食塩水で洗浄した。次いで、無水硫酸マグネシウムで有機層中の水分を除去し、濃縮後、真空システムで乾燥させて有機溶媒を取り除き、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）を得た（図１のとおり）。
【実施例２】
【００３３】
インフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞（数は約５×１０５）を６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。
【００３４】
細胞の培養が完了したら、インフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／ＷＳＮ／３３）（米国ATCCより入手）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０５ ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価 （１ｍＬあたり１０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。かかるウィルスを、２倍濃度の細胞培養液（Eagle's minimum essential medium，ＭＥＭ）（牛胎児血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（glutamine）、ペニシリン（penicillin）／ストレプトマイシン（streptomycin）を含む）５００μｌ中に加えた。
【００３５】
実施例１で作製した２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸をそれぞれ０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの濃度でエタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）中に溶かした。その溶液をそれぞれ上述したウィルスを含む細胞培養液と１：１で等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００３６】
一方、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量の２倍濃度の細胞培養液と、上記と同様に作用させたものを対照群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００３７】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液を、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００３８】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；phosphate buffered saline）（Invitrogen）で１回洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００３９】
培養プレートの各穴に、さらに上述の１倍濃度の細胞培養液（牛胎児血清（fetal bovine serum）を含まない）) ２ｍＬをそれぞれ加えた。３７℃の恒温下３６時間培養した後、倒立顕微鏡（Zeiss）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた（図２Ａに示すとおり）。３回繰り返した結果を表１にまとめた。
【００４０】
（表１）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸のウィルス感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。＋は細胞変性が起きたことを示す（陽性）。−は細胞変性がなかったことを示す（陰性）。CTXは細胞毒性があることを表す。
【００４１】
結果に示されるように、インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が３０ｐｐｍを超えたとき、対照群との比較において、細胞に変性は生じなかった（陰性を示す）（図２Ｂに示すとおり）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると説明することができる。このため細胞に変性が起こらなかったのである。
【００４２】
また、上記インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた。
【実施例３】
【００４３】
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞（数は約５×１０５）を６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。
【００４４】
細胞の培養が完了したら、タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／ＴＷ／０６６／０９）（米国ATCCより入手）を選んで用いた。該ウィルス株は７×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり７０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。
【００４５】
上記２種類のウィルスを、２倍濃度の細胞培養液（Eagle's minimum essential medium，ＭＥＭ）（牛胎児血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（glutamine）、ペニシリン（penicillin）／ストレプトマイシン（streptomycin）を含む）５００μｌ中にそれぞれ加えた。
【００４６】
実施例１で作製した２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸をそれぞれ０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの濃度でエタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）中に溶かした。その溶液をそれぞれ上述したウィルスを含む細胞培養液と等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００４７】
一方、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量の２倍濃度の細胞培養液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００４８】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液を、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００４９】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；phosphate buffered saline）（Invitrogen）で１回洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００５０】
培養プレートの各穴に、さらに上述の１倍濃度の細胞培養液（牛胎児血清（fetal bovine serum）を含まない）) ２ｍＬをそれぞれ加えた。３７℃の恒温下３６時間培養した後、倒立顕微鏡（Zeiss）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。３回繰り返した結果を表２にまとめた。
【００５１】
（表２）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。＋は細胞変性が起きたことを示す（陽性）。−は細胞変性がなかったことを示す（陰性）。CTXは細胞毒性があることを表す。
【００５２】
結果に示されるように、上記タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が３０ｐｐｍを超えたとき、細胞に変性が生じなかった（陰性であった）。こうした現象が生じたのは、タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１が２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると説明することができ、このために細胞に変性が起こらなかったのである。
【００５３】
また、上記タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型未添加の対照群においては、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性であった）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた。
【実施例４】
【００５４】
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の破壊試験
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（以下、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１と略称する。）（Ａ／ＴＷ／０６６／０９）（米国ATCCより入手）を用いた。該ウィルス株は７×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり７０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。
【００５５】
次いで、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１試料を静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide)のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ１Ｎ１ウィルスの画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ１Ｎ１ウィルスは、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和性結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００５６】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％ （ｗｔ／ｖｏｌ） ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００５７】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ずタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像について、例えば遅れの現象が生じていないかを確かめる。図３Ａはタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図３Ａ’はその側面断面図である。
【００５８】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させたタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図３Ｂの三次元画像に示すとおりである。図３Ｂ’はその側面断面図である。
【００５９】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図３Ｃに示すとおりであり、図３Ｃは三次元画像、図３Ｃ’は側面断面図である。
【００６０】
図３のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図３の側面断面図Ａ’の分析から、未処理のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスの高さは約５４ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスは平坦化して高さが約７ナノメートルになり、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約５ナノメートルとなったことがわかった。なおかつ、図３の側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、より高濃度（１０００ｐｐｍ）で処理すると（図３Ｃ’）、Ｈ１Ｎ１ウィルスの高さがより低くなり、破壊の程度がより高くなるということが示された。これら２つの現象は、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用したことでウィルス外部のエンベロープが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【実施例５】
【００６１】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞を、９６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。細胞の培養が完了したら、後に使用するまで置いた。
【００６２】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ１亜型（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ１）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。
【００６３】
このウィルス株をＰＢＳ（Sigma）で１：１００に希釈した後、エタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）に溶かした濃度０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とそれぞれ等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００６４】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量のＰＢＳ溶液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００６５】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液中に、ＭＥＭ（minimum essential medium）培養液（GIBCO）１００μＬをそれぞれ加えてから、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００６６】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＭＥＭ培養液で洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００６７】
培養プレートの各穴に、さらにＭＥＭ培養液１００μＬをそれぞれ加え、３７℃の恒温下７日間培養した後、倒立顕微鏡（Nikon）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。同時に、各穴の培養液の血球凝集活性（hemagglutination activity）を測定した。各穴の培養液５０μＬを取り、９６穴Ｖ底マイクロプレート（Nunc）に入れ、１％鶏赤血球浮遊液（鶏赤血球をＰＢＳに浮遊させ作製したもの）２５μＬを加えた。均一に混合した後、室温に３０分置いて血球凝集現象が起きたか否かを判断した。血球が試験プレート底部に均一に分布すれば陽性、血球が試験プレート底部に沈降し日の丸状を呈すれば陰性である。３回繰り返した結果を表３にまとめた。
【００６８】
（表３）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。HAは血球凝集活性を表す。CTは細胞毒性を有することを表す。＋は陽性を示し、ウィルスの感染増殖に対し抑制作用がないことを表す。‐は陰性を示し、ウィルスの感染増殖を抑制したことを表す。
【００６９】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１００ｐｐｍを超えたときに、細胞に変性が生じなかった（陰性であった）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると理解することができる。よって、細胞に変性および血球凝集の現象が生じなかったのである。
【００７０】
また、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた（ＣＰＥが陽性を示す）。
【００７１】
そして、血球凝集力価（ＨＡ）の結果からわかるように、濃度が１００ｐｐｍ以上となったとき、血球凝集が生じなかった（ＨＡが陰性となった）。このことは、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は濃度が１００ｐｐｍ以上であるときに、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型を有効に失活させ、これによりウィルスは増殖せず、血球凝集が陰性を示した、ということも説明できる。
【実施例６】
【００７２】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞を、９６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。細胞の培養が完了したら、後に使用するまで置いた。
【００７３】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型株（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ２）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。
【００７４】
このウィルス株をＰＢＳ（Sigma）で１：１００に希釈した後、エタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）に溶かした濃度０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とそれぞれ等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００７５】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量のＰＢＳ溶液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００７６】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液中に、ＭＥＭ（minimum essential medium）培養液（GIBCO）１００μＬをそれぞれ加えてから、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００７７】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＭＥＭ培養液で洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００７８】
培養プレートの各穴に、さらにＭＥＭ培養液１００μＬをそれぞれ加え、３７℃の恒温下７日間培養した後、倒立顕微鏡（Nikon）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect, ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。同時に、各穴の培養液の血球凝集活性（hemagglutination activity）を測定した。各穴の培養液５０μＬを取り、９６穴Ｖ底マイクロプレート（Nunc）に入れ、１％鶏赤血球浮遊液（鶏赤血球をＰＢＳに浮遊させ作製したもの）２５μＬを加えた。均一に混合した後、室温に３０分置いて血球凝集現象が起きたか否かを判断した。血球が試験プレート底部に均一に分布すれば陽性、血球が試験プレート底部に沈降し日の丸状を呈すれば陰性である。３回繰り返した結果を表４にまとめた。
【００７９】
（表４）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。HAは血球凝集活性を表す。CTは細胞毒性を有することを表す。＋はウィルスの感染増殖に対し抑制作用がないことを表す。‐はウィルスの感染増殖を抑制したことを表す。
【００８０】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１００ｐｐｍを超えたときに、細胞に変性が生じなかった（陰性を示す）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると理解することができる。よって、細胞に変性および血球凝集の現象が生じなかったのである。
【００８１】
また、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた（ＣＰＥが陽性を示す）。
【００８２】
そして、血球凝集力価（ＨＡ）の結果からわかるように、濃度が１００ｐｐｍ以上となったとき、血球凝集が生じなかった（ＨＡは陰性を示す）。このことは、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は濃度が１００ｐｐｍ以上であるときに、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型を有効に失活させ、これによりウィルスは増殖せず、血球凝集が陰性を示した、ということも説明できる。
【実施例７】
【００８３】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型の破壊試験
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ２）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。続いて、鳥インフルエンウィルスＨ５Ｎ２試料を、静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide)のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ５Ｎ２ウィルスの画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ５Ｎ２ウィルスは、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和性結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００８４】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００８５】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ず鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像について、例えば遅れの現象が生じていないかを確かめる。図４Ａは鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図４Ａ’はその側面断面図である。
【００８６】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させた鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１００ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図４Ｂの三次元画像に示すとおりである。図４Ｂ’はその側面断面図である。
【００８７】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図４Ｃに示すとおりであり、図４Ｃは三次元画像、図４Ｃ’は側面断面図である。
【００８８】
図４のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図４の側面断面図Ａ’の分析から、未処理の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスの高さは約３２ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスは平坦化して高さが約１４ナノメートルになり、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約６ナノメートルとなっていたことがわかった。なおかつ、図４ＢおよびＣの側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、より高濃度（１０００ｐｐｍ）で処理すると（図４Ｃ’）、Ｈ５Ｎ２ウィルス粒子の高さがより低くなり、破壊の程度がより高くなるということが示された。この現象は、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用したことでエンベロープが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【００８９】
こうした２つの現象が生じたのは、ウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とが作用してウィルスが破壊され、内容物が流出して平坦化したことによるものと解される。
【実施例８】
【００９０】
エンベロープのないエンテロウィルス７１型破壊試験
ヒトエンテロウィルスウィルス株７１型を選んで用いた。該ウィルス株は、１０６ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり１００万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。次いで、エンテロウィルス７１型試料を静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide）のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のエンテロウィルス７１型の画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のエンテロウィルス７１型は、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００９１】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、エンテロウィルス７１型を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００９２】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上のエンテロウィルス７１型のウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ずエンテロウィルス７１型サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像、例えば遅れの現象が起こっていないかを確かめる。図５Ａはエンテロウィルス７１型ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一のエンテロウィルス７１型ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図５Ａ’はその側面断面図である。
【００９３】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させたエンテロウィルス７１型ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、エンテロウィルス７１型を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図５Ｂの三次元画像に示すとおりである。図５Ｂ’はその側面断面図である。
【００９４】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図５Ｃに示すとおりであり、図５Ｃは三次元画像、図５Ｃ’は側面断面図である。
【００９５】
図５のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したエンテロウィルス７１型ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図５の側面断面図Ａ’の分析から、未処理のエンテロウィルス７１型ウィルスは高さが約７５ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後は平坦化して高さが約１０ナノメートルになり、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約８ナノメートルとなっていたことがわかった。更に、図５の側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍ）で処理後のエンテロウィルス７１型ウィルスは、その破壊の高さにすでにあまり差がなく（両者の高さはいずれも約８〜１０ナノメートル）、破壊の程度が同等であることが示された。これら２つの現象は、ウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とが作用したことでウィルスが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【実施例９】
【００９６】
黄色ブドウ球菌の増殖抑制試験
黄色ブドウ球菌標準菌株（Staphylococcus aureus、ＡＴＣＣ−２５９２３、以下Ｓ．ａｕｒｅｕｓと略称する）を選んで用いた。これをＬＢ培養液に播種し、３７℃の培養器に入れて対数増殖期（約１２〜１８時間）まで培養した。分光光度計を用い固定波長６２０ｎｍでのＳ．ａｕｒｅｕｓ−２５９２３の吸光値が０．１となるように制御した。溶液中の総生菌数を１００００ＣＦＵまで計算し、後続の生体感受性（susceptibility）テストに用いるべく備えた。
【００９７】
このＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌をＬＢ培養液中から５００μＬ取り出し、溶媒としてのエタノール水溶液（１：１０）に溶かした２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と等体積で混合し、これをＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌実験群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。実験群の反応が終了した後、反応後のＳ．ａｕｒｅｕｓ混合液を１００μＬずつ取り、ＬＢ寒天プレート（ＬＢ agar plate）に滴下して塗抹し、その後３７℃の培養器中に入れてＯ／Ｎ培養を行い（約１２〜１８時間）、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸がＳ．ａｕｒｅｕｓに抑制効果を生じたか否かを観察した。３回繰り返した結果を表５にまとめた。
【００９８】
（表５）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖抑制効果
※−は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖を抑制したことを表す。＋は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖に対し抑制作用がないことを表す。
【００９９】
表５からわかるように、上述のＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加した実験群のデータより、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量の最終濃度が２０ｐｐｍを超えたときに、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸はＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌を失活させ、その増殖を抑制し、それに対して病原性を失わせるという結果が得られることがわかった。
【０１００】
本発明を好ましい実施例により以上のように開示したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいていくらかの変更や修飾を加えることができる。よって本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲の記載が基準となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびそれに関連する方法についてのもので、特に、エンベロープを有する例えばインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、およびエンベロープのない例えばエンテロウィルス７１型、ならびにその他ブドウ球菌などの増殖感染を抑制する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界１００カ国以上に感染が広がり、国際的にも非常に重要視されている新型インフルエンザＨ１Ｎ１亜型は、欧米ではすでに死亡率が１０００分の２から４に達している。これに加え、近年、世界各地で局所的または世界的にしばしばその発生が伝えられる鳥インフルエンザＨ５Ｎ１亜型、または人類の生活環境中に常に存在しかつ世界各地に分布しており、近い将来においては絶滅の可能性はない重症エンテロウィルス７１型などは、いずれも人類の生命を脅かし続けているウィルスである。さらに、すでに耐薬性を獲得した新型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）が全世界にもたらすであろう事態について、すべての専門家達は懸念を抱いている。各国の衛生機関は消極的な防御策しかとれないでおり、如何にしてより有効にこれらウィルスを第１の段階で阻止するかについてはなす術がない状態である。ある状況の下では、インフルエンザウィルスに感染しても症状が出ないまま、他人にうつしてしまうこともある。このため、体外においてウィルス侵入を防止することが、第１段階でのウィルス感染増殖の予防・抑制になると考えられている。よって、有効に広域型のウィルスまたは細菌の感染増殖を体外で防止する方法が提供できれば、台湾、アジアそして世界の公衆衛生に大きく貢献することができる。
【０００３】
ウィルスまたは細菌の感染を体外で防止する方法は、ウィルスまたは細菌を破壊しその感染増殖を抑制するもの（消毒法）で、物理的および化学的に大別できる。物理的消毒法は一般に（１）放射線、（２）ろ過、（３）加熱、（４）冷凍、（５）乾燥などに分けられる。物理的消毒法の使用は空間的な制約を受けるのに対し、化学的消毒法はより広い応用が可能である。通常、化学消毒剤（disinfectant）として使用されるものには主に酸、アルカリ、アルコール、ジメチルエーテル、界面活性剤（surfactant）、ハロゲン（halogen）、酸化物、重金属および色素などがある。基本的にこれらの消毒剤は以下の４種のメカニズムによりウィルス・細菌の感染増殖を抑制する。つまり、（１）ウィルスのカプシド（capsid）もしくはエンベロープ（envelope）または細菌細胞壁／膜の破壊、（２）その輸送の破壊、（３）ウィルス・細菌のタンパク質の変性、（４）酵素活性および／またはレセプターの親和性の抑制、というメカニズムである。
【０００４】
化学消毒剤（disinfectant）が有効および広域型であるか否かに関しては、基本的に有効であればあるほどヒトに対してはより危険である傾向がある。よって消毒剤は、（１）対象とするのはどんな微生物か、（２）消毒剤を使用する部分の特性はどうであるか、（３）疾病予防のニーズ、などいくつかのパラメータを基に選択する。
【０００５】
一般に、理想的な化学消毒剤（disinfectant）は、大部分の種類の伝染性微生物（infectant microbe）に対し有効性（effectiveness）を持つ、有機化合物に対して感度を示さないまたはこれを無視できる、微生物表面への浸透能力が極めて高い、腐食性がない、毒性がない、ヒトに対し刺激性がない、消毒作用が持続し、化学的な安定性を持つ、水溶性が高い、消毒されるべき物体の表面への吸着力が良くかつ増殖感染を持続的に抑制する作用を有する、および量産にかかる費用が妥当である、というような特質を満たすものでなくてはならない。
【０００６】
しかしながら、上に挙げた特質を備えると共に、エンベロープを有する／有しないウィルスおよび細菌を有効かつ広域に破壊でき、感染率を低下させ、人体に無害な、ウィルス／細菌の感染増殖を抑制する方法が、依然として求められている。
【０００７】
特許文献１は、コロナウィルスの病原性を破壊する活性剤を開示しており、その活性成分は８−ヒドロキシオクタン酸（ＨＯ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）とされている。かかる化合物はコロナウィルスの外膜を破壊して、コロナウィルスが宿主細胞に接着できないようにし、病原性を失わせるものである。
【０００８】
特許文献２はウィルスの活性化を喪失させる方法を開示しており、該方法は、有機酸、短鎖アルキルの陰イオン界面活性剤混合物、カルシウムイオンキレート剤および消泡剤の組成物を局部投与する工程を含む。有機酸を利用してウィルスを該陰イオン界面活性剤上に吸着させ、さらに該陰イオン界面活性剤をウィルスのリン脂質エンベロープまたは外殻と作用させることにより、ウィルスを破壊する。
【０００９】
ここ数十年の間、世界各地で局部的もしくは全世界的な発生が頻繁に伝えられている鳥インフルエンザ、または近年流行し始めた新型インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型は、人類の生命を脅かしている。また、インフルエンザウィルスは既知の薬物に対して耐薬性を獲得し始めている。よって、（１）有効性があり、かつ（２）広域型のウィルス／細菌感染増殖を体外で、防止する実用的な方法、特に（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス７１型、ならびに（３）細菌の増殖感染を抑制する方法を提供できれば、世界の公衆衛生に大きく貢献することとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】台湾特許公告第Ｉ３０４３３８号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／００３５３３９Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する広域型の薬剤およびその関連の方法に関し、特に、（１）エンベロープを有するインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型、および（２）エンベロープのないエンテロウィルス７１型、ならびに（３）黄色ブドウ球菌の増殖感染を抑制する方法に関する。
【００１３】
また本発明は、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法をも提供する。
【００１４】
本発明の具体的な実施形態を以下に詳しく説明するが、その実施例は本発明の技術内容をより詳細に開示するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明（１）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を使用することを含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する方法である。
本発明（２）は、前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（３）は、前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（４）は、エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（５）は、エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（６）は、エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、本発明（２）の方法である。
本発明（７）は、エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、本発明（２）の方法である。
本発明（８）は、前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、本発明（１）の方法である。
本発明（９）は、前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１０）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、本発明（１）の方法である。
本発明（１１）は、前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、本発明（１０）の方法である。
本発明（１２）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、本発明（１０）の方法である。
本発明（１３）は、ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、本発明（１）の方法である。
本発明（１４）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１５）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加することをさらに含む、本発明（１）の方法である。
本発明（１６）は、前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１７）は、前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１８）は、前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、本発明（１５）の方法である。
本発明（１９）は、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法である。
本発明（２０）は、ＮａＯＨ水溶液と反応させた後、その反応溶液のｐＨ値が２に調整される、本発明（１９）の方法である。
本発明（２１）は、前記反応がエタノールの沸点の温度下で行われる、本発明（１９）の方法である。
本発明（２２）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を含むウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制するための薬剤である。
本発明（２３）は、前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（２４）は、前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（２５）は、エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２６）は、エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２７）は、エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２８）は、エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、本発明（２３）の薬剤である。
本発明（２９）は、前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３０）は、前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３１）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３２）は、前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、本発明（３１）の薬剤である。
本発明（３３）は、前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、本発明（３１）の薬剤である。
本発明（３４）は、ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３５）は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させるための、本発明（２２）の薬剤である。
本発明（３６）は、個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加するための、本発明（２２）の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を含む薬剤である。
本発明（３７）は、前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、本発明（３６）の薬剤である。
本発明（３８）は、前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、本発明（３６）の薬剤である。
本発明（３９）は、前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、本発明（３６）の薬剤である。
【発明の効果】
【００１５】
エンベロープを有するウィルス（例えばインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２亜型など）、およびエンベロープのないウィルス（例えばエンテロウィルス７１型など）、ならびに細菌（例えばブドウ球菌など）を破壊し、その増殖感染を抑制する広域型かつ有効な薬剤およびその関連の方法を提供することができる。よって世界の公衆衛生に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法を示している。
【図２】ＡはインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型に感染して細胞変性効果が生じ、細胞に円形化、剥落および壊死の現象が起こったことを示している。ＢはインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１が２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸により抑制され、対照群と比べ細胞に変性が生じていない様子（陰性を示す）を示している。
【図３】Ａは未処理のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【図４】Ａは未処理の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した鳥インフルエンザＨ５Ｎ２ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【図５】Ａは未処理のエンテロウィルス７１型ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ａ’はその側面断面図を示している。ＢおよびＣはそれぞれ３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したエンテロウィルス７１型ウィルス粒子のナノ構造原子間力顕微像を、Ｂ’およびＣ’はそれぞれその側面断面図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌の感染増殖を抑制する広域型の方法を提供する。
【００１８】
化合物２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造は、図１に示すように、先ず、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）および９５％エタノールと反応させてから、その反応物をＮａＯＨ水溶液とさらに反応させる。その反応物を、ｐＨ値を約２に調整した後、エチルエーテルで抽出する。抽出物中の溶媒を除去した後、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）が得られる。この製造方法において、エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネートとチオウレアのモル比は１：１．２とし、反応温度はエタノールの沸点である約７８〜７９℃とするのが好ましい。
【化１】
【００１９】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の塩類に特に制限はなく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、硝酸塩、塩酸塩または炭酸水素塩などが挙げられる。上述の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸自体またはその塩類は、ウィルス表面のエンベロープ（envelope）またはコート（coat）の一部または全部を分解し、宿主細胞に対する親和性結合の感染能力を失わせることができる。
【００２０】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は溶液の形態で存在することが好ましく、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合溶媒中に溶け得るものである。溶媒はこれらに限定はされない。エタノールと水の混合液に溶解するのがより好ましい。
【００２１】
本発明において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度は、溶液の総重量の濃度が２０ｐｐｍより大きく１０００ｐｐｍ未満（２０ｐｐｍと１０００ｐｐｍは含まない）であることが好ましい。溶液の総重量の４５〜７５０ｐｐｍであればより好ましい。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が２０ｐｐｍよりも低いと、ウィルス感染を抑制する効果を生じ得ず、一方１０００ｐｐｍを超えると、宿主細胞に対して細胞毒性を生じる。
【００２２】
本発明で言う「ウィルス」とは生物学上定義されるウィルスであって、核酸分子とタンパク質の外殼から構成されるものであり、外形および感染の表面組成構造によって基本的に（１）エンベロープ（envelope）のあるウィルスと、（２）エンベロープ（envelope）のないウィルスの２種類に分けられる。本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、エンベロープを有するインフルエンザウィルスを失活させることができるものである。該インフルエンザウィルスには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ７亜型が含まれるが、これらに限定されるものではない。該インフルエンザウィルスにはさらに、通常“スペイン（Spanish）かぜ”、“アジア（Asian）かぜ”、“香港（Hong Kong）かぜ”、“鳥インフルエンザ（avian influenza）”、“豚インフルエンザ（swine influenza）”、“馬インフルエンザ”および“犬インフルエンザ”と呼ばれるインフルエンザの亜型なども含まれる。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、エンベロープ（envelope）を有するヒトインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１亜型および鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）Ｈ５Ｎ１亜型、Ｈ５Ｎ２亜型を有効に失活させることができ、かつ、宿主細胞の変形、溶解（lysis）またはアポトーシス（apotosis）などを起こさせる細胞毒性（cytotoxic）を生じない。
【００２３】
本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、エンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を失活させることもできるという点でも優れている。エンテロウィルスはピコルナウイルス科（Picornaviridae）に属し、ウィルスの群の総称である。かかるエンテロウィルスは遺伝子配列解析の結果によって、ヒトエンテロウィルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（Human enterovirus A、B、C、D）型に分類される。このうち、エンテロウィルス７１型（enterovirus type 71）はヒトエンテロウィルスＡ型に入る。小児麻痺ウィルスを除き、すべてのエンテロウィルスのうち、エンテロウィルス７１型（Enterovirus Type 71）が最も神経系の合併症を引き起こし易い。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類は、エンベロープ（envelope）のない７１型を含むエンテロウィルスを破壊して失活させることができ、かつ、宿主細胞に変形、溶解（lysis）またはアポトーシス（apotosis）などを起こさせる細胞毒性（cytotoxic）を生じない。
【００２４】
本発明におけるウィルス・細菌の感染増殖抑制方法は、ブドウ球菌（Staphylococcus）を失活させて感染能力を失わせることもできるものである。ブドウ球菌属には２６種のブドウ球菌が含まれる。このうち黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腐生ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）が最もよく見られ、かつ病原性を持つブドウ球菌であるが、これらのみには制限されない。黄色ブドウ球菌は、食品製造において生じる汚染の主たる病原菌であるだけでなく、病院内で慢性的な院内感染を引き起こす病原菌でもあり、手術部位の感染またはその他の全身性感染を起こすことが多い。本発明の実施形態において、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、有効に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を失活させて病原性を失わせることができる。
【００２５】
本発明で言う「宿主細胞」にはヒト細胞が含まれるが、これには限定されない。該宿主細胞は、非ヒト動物、例えば家禽もしくは野生の渡り鳥などの鳥類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、ブタもしくはウマなどの哺乳類動物、サル（monkey）、類人猿（ape）もしくはチンパンジー（chimpanzee）などの非ヒト霊長類動物、またはその他の動物の細胞であってもよい。
【００２６】
本発明のウィルス・細菌の感染増殖を抑制する方法は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む。
【００２７】
本発明で言う「生体」には人体が含まれるが、これに限定はされない。該生体には、非ヒト動物、例えば家禽もしくは野生の渡り鳥などの鳥類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、ブタもしくはウマなどの哺乳類動物、サル（monkey）、類人猿（ape）もしくはチンパンジー（chimpanzee）などの非ヒト霊長類動物、またはその他の動物の生体も含まれ得る。
【００２８】
本発明で言う「生体外でウィルス・細菌と接触」は、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を、ウィルスまたは細菌と、活性を有するヒトまたは非ヒトの動物組織または細胞の入った試験管または培養皿などの動物体外にて接触させることを含む。
【００２９】
本発明のウィルス・細菌の感染増殖を抑制する方法は、さらに、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類を、空気清浄用品、個人衛生用品、または繊維製品中に添加することを含む。
【００３０】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、例えばハンドソープ、ボディソープ、シャンプー、乳液または空気清浄スプレーなどの個人衛生用品または空気清浄用品に添加することができる。個人衛生用品または空気清浄用品に用いる場合は、その用途の属する技術分野において慣用されている調製方法に基づいて、その他の添加剤と適切に混合することができる。
【００３１】
本発明の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類は、繊維製品中に添加することもできる。該繊維製品には、ポリマー不織布、天然繊維製品、またはこれらの混織物が含まれるが、これらに限定はされない。該繊維製品は、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターなどの用途への応用が可能である。さらに、該繊維製品は、必要に応じてマスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターの表面や内部に取り入れることができる。
【実施例１】
【００３２】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造工程
エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）（５．５ｍｍｏｌ）、チオウレア（thiourea）（６．６ｍｍｏｌ）および９５％のエタノール（２５ｍＬ）を５０ｍＬ丸底フラスコ中に入れ、５時間加熱還流した。さらに２．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（２５ｍＬ）を加えて引き続き約１５時間加熱還流した。反応が終了したら、２Ｍ ＨＣｌ水溶液を加えて溶液のｐＨ?を約２にした。その溶液をエチルエーテルで３回抽出して有機層を収集し、飽和食塩水で洗浄した。次いで、無水硫酸マグネシウムで有機層中の水分を除去し、濃縮後、真空システムで乾燥させて有機溶媒を取り除き、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）を得た（図１のとおり）。
【実施例２】
【００３３】
インフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞（数は約５×１０５）を６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。
【００３４】
細胞の培養が完了したら、インフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／ＷＳＮ／３３）（米国ATCCより入手）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０５ ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価 （１ｍＬあたり１０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。かかるウィルスを、２倍濃度の細胞培養液（Eagle's minimum essential medium，ＭＥＭ）（牛胎児血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（glutamine）、ペニシリン（penicillin）／ストレプトマイシン（streptomycin）を含む）５００μｌ中に加えた。
【００３５】
実施例１で作製した２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸をそれぞれ０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの濃度でエタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）中に溶かした。その溶液をそれぞれ上述したウィルスを含む細胞培養液と１：１で等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００３６】
一方、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量の２倍濃度の細胞培養液と、上記と同様に作用させたものを対照群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００３７】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液を、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００３８】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；phosphate buffered saline）（Invitrogen）で１回洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００３９】
培養プレートの各穴に、さらに上述の１倍濃度の細胞培養液（牛胎児血清（fetal bovine serum）を含まない）) ２ｍＬをそれぞれ加えた。３７℃の恒温下３６時間培養した後、倒立顕微鏡（Zeiss）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた（図２Ａに示すとおり）。３回繰り返した結果を表１にまとめた。
【００４０】
（表１）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸のウィルス感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。＋は細胞変性が起きたことを示す（陽性）。−は細胞変性がなかったことを示す（陰性）。CTXは細胞毒性があることを表す。
【００４１】
結果に示されるように、インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が３０ｐｐｍを超えたとき、対照群との比較において、細胞に変性は生じなかった（陰性を示す）（図２Ｂに示すとおり）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると説明することができる。このため細胞に変性が起こらなかったのである。
【００４２】
また、上記インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた。
【実施例３】
【００４３】
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞（数は約５×１０５）を６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。
【００４４】
細胞の培養が完了したら、タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／ＴＷ／０６６／０９）（米国ATCCより入手）を選んで用いた。該ウィルス株は７×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり７０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。
【００４５】
上記２種類のウィルスを、２倍濃度の細胞培養液（Eagle's minimum essential medium，ＭＥＭ）（牛胎児血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（glutamine）、ペニシリン（penicillin）／ストレプトマイシン（streptomycin）を含む）５００μｌ中にそれぞれ加えた。
【００４６】
実施例１で作製した２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸をそれぞれ０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの濃度でエタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）中に溶かした。その溶液をそれぞれ上述したウィルスを含む細胞培養液と等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００４７】
一方、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量の２倍濃度の細胞培養液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の細胞培養液と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度はいずれも半減した。
【００４８】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液を、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００４９】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；phosphate buffered saline）（Invitrogen）で１回洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００５０】
培養プレートの各穴に、さらに上述の１倍濃度の細胞培養液（牛胎児血清（fetal bovine serum）を含まない）) ２ｍＬをそれぞれ加えた。３７℃の恒温下３６時間培養した後、倒立顕微鏡（Zeiss）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。３回繰り返した結果を表２にまとめた。
【００５１】
（表２）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。＋は細胞変性が起きたことを示す（陽性）。−は細胞変性がなかったことを示す（陰性）。CTXは細胞毒性があることを表す。
【００５２】
結果に示されるように、上記タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が３０ｐｐｍを超えたとき、細胞に変性が生じなかった（陰性であった）。こうした現象が生じたのは、タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１が２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると説明することができ、このために細胞に変性が起こらなかったのである。
【００５３】
また、上記タミフル耐性株のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１型未添加の対照群においては、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性であった）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた。
【実施例４】
【００５４】
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型の破壊試験
タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ：登録商標）耐性を持つインフルエンザウィルス株Ｈ１Ｎ１亜型（以下、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１と略称する。）（Ａ／ＴＷ／０６６／０９）（米国ATCCより入手）を用いた。該ウィルス株は７×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり７０万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。
【００５５】
次いで、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１試料を静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide)のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ１Ｎ１ウィルスの画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ１Ｎ１ウィルスは、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和性結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００５６】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％ （ｗｔ／ｖｏｌ） ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００５７】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ずタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像について、例えば遅れの現象が生じていないかを確かめる。図３Ａはタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図３Ａ’はその側面断面図である。
【００５８】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させたタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、タミフル耐性株Ｈ１Ｎ１を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図３Ｂの三次元画像に示すとおりである。図３Ｂ’はその側面断面図である。
【００５９】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図３Ｃに示すとおりであり、図３Ｃは三次元画像、図３Ｃ’は側面断面図である。
【００６０】
図３のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図３の側面断面図Ａ’の分析から、未処理のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスの高さは約５４ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後のタミフル耐性株Ｈ１Ｎ１ウィルスは平坦化して高さが約７ナノメートルになり、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約５ナノメートルとなったことがわかった。なおかつ、図３の側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、より高濃度（１０００ｐｐｍ）で処理すると（図３Ｃ’）、Ｈ１Ｎ１ウィルスの高さがより低くなり、破壊の程度がより高くなるということが示された。これら２つの現象は、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用したことでウィルス外部のエンベロープが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【実施例５】
【００６１】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ１亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞を、９６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。細胞の培養が完了したら、後に使用するまで置いた。
【００６２】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ１亜型（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ１）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。
【００６３】
このウィルス株をＰＢＳ（Sigma）で１：１００に希釈した後、エタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）に溶かした濃度０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とそれぞれ等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００６４】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量のＰＢＳ溶液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００６５】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液中に、ＭＥＭ（minimum essential medium）培養液（GIBCO）１００μＬをそれぞれ加えてから、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００６６】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＭＥＭ培養液で洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００６７】
培養プレートの各穴に、さらにＭＥＭ培養液１００μＬをそれぞれ加え、３７℃の恒温下７日間培養した後、倒立顕微鏡（Nikon）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect，ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。同時に、各穴の培養液の血球凝集活性（hemagglutination activity）を測定した。各穴の培養液５０μＬを取り、９６穴Ｖ底マイクロプレート（Nunc）に入れ、１％鶏赤血球浮遊液（鶏赤血球をＰＢＳに浮遊させ作製したもの）２５μＬを加えた。均一に混合した後、室温に３０分置いて血球凝集現象が起きたか否かを判断した。血球が試験プレート底部に均一に分布すれば陽性、血球が試験プレート底部に沈降し日の丸状を呈すれば陰性である。３回繰り返した結果を表３にまとめた。
【００６８】
（表３）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。HAは血球凝集活性を表す。CTは細胞毒性を有することを表す。＋は陽性を示し、ウィルスの感染増殖に対し抑制作用がないことを表す。‐は陰性を示し、ウィルスの感染増殖を抑制したことを表す。
【００６９】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１００ｐｐｍを超えたときに、細胞に変性が生じなかった（陰性であった）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると理解することができる。よって、細胞に変性および血球凝集の現象が生じなかったのである。
【００７０】
また、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた（ＣＰＥが陽性を示す）。
【００７１】
そして、血球凝集力価（ＨＡ）の結果からわかるように、濃度が１００ｐｐｍ以上となったとき、血球凝集が生じなかった（ＨＡが陰性となった）。このことは、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は濃度が１００ｐｐｍ以上であるときに、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１型を有効に失活させ、これによりウィルスは増殖せず、血球凝集が陰性を示した、ということも説明できる。
【実施例６】
【００７２】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型の感染増殖抑制試験
イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney，ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞を、９６穴細胞培養マイクロプレート（Nunc）中で培養した。細胞の培養が完了したら、後に使用するまで置いた。
【００７３】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型株（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ２）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。
【００７４】
このウィルス株をＰＢＳ（Sigma）で１：１００に希釈した後、エタノール水溶液（エタノール：水＝１：１０）に溶かした濃度０ｐｐｍ、６ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍおよび６０００ｐｐｍの２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とそれぞれ等量混合し、室温（約２５℃）下にて３０分間静置した。これをウィルス処理群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００７５】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を上記と同じ濃度で、ウィルスを添加していない等量のＰＢＳ溶液と、上記と同様に作用させたものを対照とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。
【００７６】
上述のウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とを混合した混合液、および対照の混合液中に、ＭＥＭ（minimum essential medium）培養液（GIBCO）１００μＬをそれぞれ加えてから、上述したＭＤＣＫ細胞の入った培養プレートにそれぞれ加えた。３７℃の恒温下２時間感染させて、ウィルスを感染細胞上に吸着させた。
【００７７】
上記培養プレート中の作用液を抜き取り、細胞をＭＥＭ培養液で洗浄した。同時に、細胞に感染、吸着しなかったウィルスを洗い落とした。
【００７８】
培養プレートの各穴に、さらにＭＥＭ培養液１００μＬをそれぞれ加え、３７℃の恒温下７日間培養した後、倒立顕微鏡（Nikon）で各穴の細胞変性効果（cytopathic effect, ＣＰＥ）を観察した。細胞変性効果が起きた細胞には円形化、剥落および壊死の現象が認められた。同時に、各穴の培養液の血球凝集活性（hemagglutination activity）を測定した。各穴の培養液５０μＬを取り、９６穴Ｖ底マイクロプレート（Nunc）に入れ、１％鶏赤血球浮遊液（鶏赤血球をＰＢＳに浮遊させ作製したもの）２５μＬを加えた。均一に混合した後、室温に３０分置いて血球凝集現象が起きたか否かを判断した。血球が試験プレート底部に均一に分布すれば陽性、血球が試験プレート底部に沈降し日の丸状を呈すれば陰性である。３回繰り返した結果を表４にまとめた。
【００７９】
（表４）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２感染抑制効果
※CPEは細胞変性効果を表す。HAは血球凝集活性を表す。CTは細胞毒性を有することを表す。＋はウィルスの感染増殖に対し抑制作用がないことを表す。‐はウィルスの感染増殖を抑制したことを表す。
【００８０】
鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加したウィルス処理群では、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１００ｐｐｍを超えたときに、細胞に変性が生じなかった（陰性を示す）。こうした現象が生じたのは、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用して失活し病原性を失ったためであると理解することができる。よって、細胞に変性および血球凝集の現象が生じなかったのである。
【００８１】
また、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型未添加の対照群において、低濃度の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（≦３００ｐｐｍ）は細胞に変性を生じさせなかった（ＣＰＥは陰性を示す）。このことから、３００ｐｐｍよりも低い濃度では２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は細胞に傷害を与えないということが説明される。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量が１０００ｐｐｍを超えたときに、初めて細胞毒性が現れた（ＣＰＥが陽性を示す）。
【００８２】
そして、血球凝集力価（ＨＡ）の結果からわかるように、濃度が１００ｐｐｍ以上となったとき、血球凝集が生じなかった（ＨＡは陰性を示す）。このことは、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸は濃度が１００ｐｐｍ以上であるときに、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２型を有効に失活させ、これによりウィルスは増殖せず、血球凝集が陰性を示した、ということも説明できる。
【実施例７】
【００８３】
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型の破壊試験
鳥インフルエンザウィルス株Ｈ５Ｎ２亜型（ＴＷ１２０９／０３（Ｈ５Ｎ２）ＡＩＶ）（家畜衛生試験所で分離された台湾野外株）を選んで用いた。該ウィルス株は、１０７ＥＩＤ５０／０．１ｍＬのウィルス力価（０．１ｍＬあたり１０００万個のウィルスを含み、５０％の鶏胚を感染させるものとして定義される力価）、または６４ＨＡＵ／２５μＬの血球凝集単位力価（２５μＬあたり６４個の血球凝集単位を含むものとして定義される力価）を有する。続いて、鳥インフルエンウィルスＨ５Ｎ２試料を、静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide)のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ５Ｎ２ウィルスの画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のＨ５Ｎ２ウィルスは、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和性結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００８４】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００８５】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ず鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像について、例えば遅れの現象が生じていないかを確かめる。図４Ａは鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図４Ａ’はその側面断面図である。
【００８６】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させた鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ２亜型を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１００ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図４Ｂの三次元画像に示すとおりである。図４Ｂ’はその側面断面図である。
【００８７】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図４Ｃに示すとおりであり、図４Ｃは三次元画像、図４Ｃ’は側面断面図である。
【００８８】
図４のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図４の側面断面図Ａ’の分析から、未処理の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスの高さは約３２ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後の鳥インフルエンザＨ５Ｎ２亜型ウィルスは平坦化して高さが約１４ナノメートルになり、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約６ナノメートルとなっていたことがわかった。なおかつ、図４ＢおよびＣの側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、より高濃度（１０００ｐｐｍ）で処理すると（図４Ｃ’）、Ｈ５Ｎ２ウィルス粒子の高さがより低くなり、破壊の程度がより高くなるということが示された。この現象は、ウィルスが２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用したことでエンベロープが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【００８９】
こうした２つの現象が生じたのは、ウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とが作用してウィルスが破壊され、内容物が流出して平坦化したことによるものと解される。
【実施例８】
【００９０】
エンベロープのないエンテロウィルス７１型破壊試験
ヒトエンテロウィルスウィルス株７１型を選んで用いた。該ウィルス株は、１０６ＰＦＵ／ｍＬのウィルス力価（１ｍＬあたり１００万個のウィルスを含み、５０％の細胞を感染させるものとして定義される力価）を有する。次いで、エンテロウィルス７１型試料を静電相互作用により、修飾済みの正に帯電したポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（poly-L-lysine hydrobromide）のマイカ片上に固定し、原子間力顕微法による観察・検討を行った。２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理する前と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のエンテロウィルス７１型の画像の比較により、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理した後のエンテロウィルス７１型は、ウィルス表面に破壊が生じ、宿主に対する親和結合を失って病原性を喪失するという現象が証明された。
【００９１】
メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、エンテロウィルス７１型を室温下マイカ片上に加え５分置いた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。
【００９２】
多種のモードのうち走査型プローブ顕微鏡中の原子間力顕微鏡を用いて観察・検討を行った。用いたのはタッピングモード原子間力顕微鏡（SPI300 HV, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）であり、これに光学顕微鏡（Mitutoyo, Japan)を組み合わせてサンプルを観察した。原子間力顕微鏡に用いたプローブの周波数は１４０ｋＨｚである。標準回折格子（Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan）によりＡＦＭプローブの校正を行った。タッピングモード原子間力顕微法は、カンチレバーの振幅の高低を維持しながら走査を行うものである。走査は、先ず２０μｍ×２０μｍの領域の大きさから開始し、その中に１００以上のエンテロウィルス７１型のウィルス粒子が含まれるように制御した後、走査画像のサイズを次第に縮めていき、単一のウィルスの領域の大きさ（３００ｎｍ×３００ｎｍ）までにした。単一のウィルス粒子画像が走査できなかった場合は、先ずエンテロウィルス７１型サンプルを往復走査して、プローブ走査に加工された画像、例えば遅れの現象が起こっていないかを確かめる。図５Ａはエンテロウィルス７１型ウィルスの原子間力顕微法による三次元画像であり、単一のエンテロウィルス７１型ウィルス粒子がはっきりと見て取れる。図５Ａ’はその側面断面図である。
【００９３】
次に２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と作用させたエンテロウィルス７１型ウィルスを処理した。メタノールおよび脱イオン水でマイカ片を洗浄した後、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸を含む溶液をマイカ片上に滴下し、３０分間反応させてから、脱イオン水でマイカ片表面を数回洗浄した。続いて、エンテロウィルス７１型を室温下で修飾済みのマイカ片上に加えて５分置き、さらに２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）をマイカ基材上のウィルスサンプルに加え５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図５Ｂの三次元画像に示すとおりである。図５Ｂ’はその側面断面図である。
【００９４】
また、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）を用い、同じ方式でマイカ片上のウィルスサンプルに加えて５分間反応させた後、迅速に原子間力顕微法による実験を行った。その走査の結果は図５Ｃに示すとおりであり、図５Ｃは三次元画像、図５Ｃ’は側面断面図である。
【００９５】
図５のＡ、ＢおよびＣから明らかなように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸で処理したエンテロウィルス７１型ウィルスには、すでに破壊の現象が見られる。図５の側面断面図Ａ’の分析から、未処理のエンテロウィルス７１型ウィルスは高さが約７５ナノメートルであったが、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍ）処理後は平坦化して高さが約１０ナノメートルになり、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（１０００ｐｐｍ）処理後では、平坦化して高さが約８ナノメートルとなっていたことがわかった。更に、図５の側面断面図Ｂ’およびＣ’を比較するとわかるように、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍ）で処理後のエンテロウィルス７１型ウィルスは、その破壊の高さにすでにあまり差がなく（両者の高さはいずれも約８〜１０ナノメートル）、破壊の程度が同等であることが示された。これら２つの現象は、ウィルスと２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸とが作用したことでウィルスが破壊され、内容物が流失して平坦化したために生じたものであると理解することができる。
【実施例９】
【００９６】
黄色ブドウ球菌の増殖抑制試験
黄色ブドウ球菌標準菌株（Staphylococcus aureus、ＡＴＣＣ−２５９２３、以下Ｓ．ａｕｒｅｕｓと略称する）を選んで用いた。これをＬＢ培養液に播種し、３７℃の培養器に入れて対数増殖期（約１２〜１８時間）まで培養した。分光光度計を用い固定波長６２０ｎｍでのＳ．ａｕｒｅｕｓ−２５９２３の吸光値が０．１となるように制御した。溶液中の総生菌数を１００００ＣＦＵまで計算し、後続の生体感受性（susceptibility）テストに用いるべく備えた。
【００９７】
このＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌をＬＢ培養液中から５００μＬ取り出し、溶媒としてのエタノール水溶液（１：１０）に溶かした２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸と等体積で混合し、これをＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌実験群とした。全溶液中の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の濃度は半減した。実験群の反応が終了した後、反応後のＳ．ａｕｒｅｕｓ混合液を１００μＬずつ取り、ＬＢ寒天プレート（ＬＢ agar plate）に滴下して塗抹し、その後３７℃の培養器中に入れてＯ／Ｎ培養を行い（約１２〜１８時間）、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸がＳ．ａｕｒｅｕｓに抑制効果を生じたか否かを観察した。３回繰り返した結果を表５にまとめた。
【００９８】
（表５）２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖抑制効果
※−は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖を抑制したことを表す。＋は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖に対し抑制作用がないことを表す。
【００９９】
表５からわかるように、上述のＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌と２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸を添加した実験群のデータより、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の添加量の最終濃度が２０ｐｐｍを超えたときに、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸はＳ．ａｕｒｅｕｓブドウ球菌を失活させ、その増殖を抑制し、それに対して病原性を失わせるという結果が得られることがわかった。
【０１００】
本発明を好ましい実施例により以上のように開示したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいていくらかの変更や修飾を加えることができる。よって本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲の記載が基準となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する方法。
【請求項２】
前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法。
【請求項２０】
ＮａＯＨ水溶液と反応させた後、その反応溶液のｐＨ値が２に調整される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応がエタノールの沸点の温度下で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を含むウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制するための薬剤。
【請求項２３】
前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２５】
エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２６】
エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２７】
エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２８】
エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３４】
ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３５】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させるための、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３６】
個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加するための、請求項２２に記載の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を含む薬剤。
【請求項３７】
前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、請求項３６に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、請求項３６記載の薬剤。
【請求項３９】
前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、請求項３６に記載の薬剤。
【請求項１】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）或いはその塩類の使用を含む、ウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制する方法。
【請求項２】
前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を生体外でウィルスと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸或いはその塩類を個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
エチル２−（１０−ブロモ−デシル）マロネート（ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate）をチオウレア（thiourea）およびエタノールと反応させてから、ＮａＯＨ水溶液とさらに反応させることを含む、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸の製造方法。
【請求項２０】
ＮａＯＨ水溶液と反応させた後、その反応溶液のｐＨ値が２に調整される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応がエタノールの沸点の温度下で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸（2-(10-mercaptodecyl)malonic acid）またはその塩類を含むウィルス・細菌を破壊しその感染増殖を抑制するための薬剤。
【請求項２３】
前記ウィルスがエンベロープを有する（with envelope）ウィルスを含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記ウィルスがエンベロープのない（without envelope）ウィルスを含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２５】
エンベロープを有するウィルスがヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２６】
エンベロープを有するウィルスが鳥インフルエンザウィルス（avian influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２７】
エンベロープを有するウィルスが豚インフルエンザウィルス（swine influenza virus）を含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２８】
エンベロープを有するウィルスがヒト・豚またはヒト・鳥遺伝子組み換えインフルエンザウィルスを含む、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記ウィルスがエンベロープのないエンテロウィルス（enterovirus）を含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)を含む、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類が溶媒に溶かされる、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記溶媒が、水、Ｃ１−Ｃ３アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらを混合したものを含む、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類の濃度が、２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類および溶媒の総重量を基準として、３０ｐｐｍよりも大きく１０００ｐｐｍよりも小さく、ただし３０ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍは含まない、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３４】
ヒトまたは非ヒト動物がウィルスまたは細菌に感染することを抑制する、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３５】
２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を生体外でウィルスと接触させるための、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項３６】
個人衛生用品、空気清浄用品または繊維製品に添加するための、請求項２２に記載の２−（１０−メルカプトデシル）マロン酸またはその塩類を含む薬剤。
【請求項３７】
前記個人衛生用品が、ハンドソープ、ボディソープまたは乳液を含む、請求項３６に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記空気清浄用品が、空気清浄スプレーを含む、請求項３６記載の薬剤。
【請求項３９】
前記繊維製品が、マスク、アイソレーションガウンまたは空気フィルターを含む、請求項３６に記載の薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２０９９４（Ｐ２０１１−２０９９４Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３５３７（Ｐ２０１０−３５３７）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【出願人】（５０２１４０５５８）國立台灣大學 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【出願人】（５０２１４０５５８）國立台灣大學 (5)
【Ｆターム（参考）】
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