ウイルス修飾
本発明は、レオウイルス科に属するウイルス(すなわちレオウイルス)のためのリバースジェネティクスシステム、その様々な使用、遺伝的に修飾したレオウイルス、レオウイルス選択/産生および増殖システム、薬剤およびワクチンを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、レオウイルス科に属するウイルス(すなわちレオウイルス)のためのリバースジェネティクスシステム、その様々な使用、遺伝的に修飾したレオウイルス、レオウイルス選択/産生および増殖システム、薬剤およびワクチンを提供する。
【背景技術】
【0002】
レオウイルス科(Reoviridae(Respiratory Enteritic Orphan viruses))は、分節された二本鎖RNAゲノムを備えた非エンベロープウイルスのファミリーを構成する。レオウイルス科は、胃腸系に影響するウイルス(ロタウイルスなど)を含み、それは呼吸器感染を引き起こす。用語「オーファンウイルス」は、特定のウイルスが任意の公知の疾患に関連しないことを示しており、レオウイルス科は多数の疾患に関連するが、オリジナル名がなお使用されている(Tyler、2001)。ロタウイルスは、ヒトからヒトへ直接伝達されることが可能であり、世界の全体で2歳未満の小児においておよそ1年で500,000人死亡を生じる深刻な下痢性疾病の主要な原因微生物である(Kapikianら、2001)。
【0003】
哺乳類オルトレオウイルスのプロトタイプはヒト呼吸管および腸管から単離されていたが、重篤なヒト疾患と関連しない。これらのうちの1つ、ヒトレオウイルスタイプ3ディアリング(Dearing)(T3D)がしばしば研究され、通常この科のモデルとされる(Nibertら、2001)。さらに、最近十年間の間に、哺乳類オルトレオウイルス(特にT3D)は前臨床および臨床の癌治療実験において癌溶解剤として使用されてきた(Normanら、2000;Shmulevitzら、2005)。本発明は、レオウイルスが、健康な非形質転換細胞ではなく腫瘍細胞の細胞死およびアポトーシスを誘導するという観察に部分的に基づく(Hashiroら、1977;Duncanら、1978)。現在までに、癌治療に対するかかるアプローチの実施可能性を研究するために、複数の臨床試験がカナダ、米国およびイギリスで開始された。
【0004】
野生型レオウイルスは、標的細胞への結合のための受容体として複数の別個のタンパク質を使用することができる。最初に、接合部接着分子(Junction Adhesion Molecule)−A(Jam−A、接合部接着分子1、またはJam−1としても公知)は、オルトレオウイルス属(Orthoreovirus)のタイプ1およびタイプ3のための受容体として働き、ウイルスの付着および感染を仲介できることが実証されている(Chappellら、2002d)。Jam−Aは組込まれた密着結合タンパク質であり、レオウイルスT3Dのσ−1タンパク質の球状頭部中の領域はJam−Aと相互作用する(Chappellら、2002c)。さらに、スパイクタンパク質σ−1のシャフトドメインの配列は、産生性感染のための細胞表面シアル酸分子と相互作用することができる(Chappellら、1997)。σ−1タンパク質はRNA分節S1(σ1としても公知である)によってコードされる。
【0005】
レオウイルス受容体が高い頻度で出現するにもかかわらず、いくつかの腫瘍細胞は細胞表面上に限られた数の受容体を有する。例えば、Smakman(2005)は、結腸直腸転移をともなう患者からの13の腫瘍の断片のどれもレオウイルスT3D感染に感受性がないことを記載した(Smakman、2005)。腫瘍細胞上のレオウイルス受容体の欠乏は、癌溶解剤としてのレオウイルスの効率を妨げる。
【0006】
レオウイルス科の遺伝子修飾は、それらの二本鎖RNAゲノムの分節構造のために困難なことが有名である。それゆえ、本発明はレオウイルス科のメンバーのためのリバースジェネティクス法に関する。Ronerら、2001、およびRonerら、1990は、RNA分節のうちの1つのインビトロ合成、このRNAのインビトロキャッピング、および他の9つの分節の一本鎖(プラス鎖)RNAおよび/または二本鎖RNAとのこのRNAのコトランスフェクションを含む、複雑なレオウイルスリバースジェネティクスシステムを開発した。複製を開始するために、トランスフェクションした細胞を、ヘルパーウイルスとしてゆっくり溶菌するレオウイルスバリアントのレオウイルスT2またはT1により感染させた(Ronerら、2001)。クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を保持する単一の組換えレオウイルスT3Dは生成されたが、方法は非能率的で煩わしいものである。
【0007】
代わりのアプローチはKomotoおよびSasaki(Komotoら、2006)によって記述され、ロタウイルスのためのリバースジェネティクスシステムの確立について記述する。彼らは再集合されたロタウイルスのレスキューに成功したが、方法は非常に非能率的であり、改善する必要がある。Kobayashiおよび共同研究者は、完全にプラスミドに基づいたシステムを使用する組換えレオウイルスT3Dの生成について最近記述した(Kobayashi,T.、A.A.R.Antar、K.W.Boehme、P.Danthi、E.A.Eby、K.M.Guglielmi、G.H.Holm、E.M.Johnson、M.S.Maginnis、S.Naik、W.B.Skelton、J.D.Wetzel、G.J.Wilson、J.D.Chappell,およびT.S.Dermody.2007.A Plasmid−Based Reverse Genetics System for Animal Double−Stranded RNA Viruses.Cell Host & Microbe 1:147−157)。
【0008】
これらの両方の方法は、真の分節末端を備えた一本鎖プラス鎖RNAの産生に依存する。一般にポリアデニル化されていない一本鎖RNAが哺乳類細胞中で非常に短命であることが周知であるので、このことは組換体の形成を妨げる(Zeeviら、1982)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、本発明の目的は、先行技術に関する上述の問題を回避または軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、例えば、遺伝的に修飾されたレオウイルスおよび/またはレオウイルスの宿主域バリアントの開発に特定の適用を有することができるレオウイルス科のための効率的なリバースジェネティクスシステムの開発に基づく。
【0011】
第1の態様において、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
(a)レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(b)細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む方法を提供する。
【0012】
本発明は、細胞中で発現された場合、レオウイルスゲノムの修飾部分が新しく形成されたレオウイルス粒子へと組み入れられうるという意外な観察に基づく。理論に束縛されるものではないが、細胞へといったん導入された修飾レオウイルスゲノム部分は転写されて、真の5'キャップで開始し、3'末端で短縮せず、ポリAトラクトを含むようにさらに伸長されるmRNAの分子をもたらすと考えられている。
【0013】
レオウイルス科は、分節二本鎖RNAゲノムを有する非エンベロープウイルス(他の場合にはレオウイルスとして既知である)の科であり、例えば、オルトレオウイルス(Orthoreovirus)、オルビウイルス(Orbivirus)、ロタウイルス(Rotavirus)およびコルティウイルス(Coltivirus)種を含む。そのようなものとして、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、例えばレオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)などのオルトレオウイルス種のゲノムを遺伝的に修飾する方法を提供する。
【0014】
典型的には、細胞にレオウイルスを感染させる工程(上記の工程(b))は、「野生型レオウイルス」の使用を必要としうる。野生型レオウイルスは、レオウイルス科に属する任意のウイルスの生来の形態または自然発生の形態でありえる。好ましくは、野生型レオウイルスは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスの野生型形態である。一例として、方法がオルトレオウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルトレオウイルス種の野生型形態でありえる。
【0015】
あるいは、細胞にレオウイルスを感染させる工程は、レオウイルス突然変異体(mutant)またはバリアントにより実行することができる。例えば、特定の実施形態において、例えば、高温感受性変異体および/または宿主域変異体を使用することは望ましいだろう。さらに、またはあるいは、工程(b)において上で言及されたレオウイルスは、参照または同じ種の野生型株に比べて、修飾されたゲノムを含むレオウイルスでありえる。かかる事例において、本明細書において記述した方法の工程(b)において使用するレオウイルスのゲノムは、本明細書において記述した方法または既に当業者に公知方法のうちのいずれかに従って修飾することができる。上述のように、工程(b)において使用したバリアント、突然変異体または修飾レオウイルスは、好ましくは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスのバリアント、変異体または修飾バージョンである。一例として、方法がオルビウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルビウイルス種のバリアント、突然変異体および/または修飾形態でありえる。
【0016】
本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスは、細胞の感染に使用するレオウイルスと比較して、「修飾された」こと、および工程(b)において使用されるレオウイルスは、同じウイルスの野生型、バリアント、突然変異体または修飾形態でありえることが理解されるべきである。したがって、語句「修飾ゲノム」は、工程(b)で使用されるウイルスに由来したゲノムに比べた場合に、改変されているか、または何らかの形で異なるゲノムを意味するように意図される。例えば、ゲノムは、付加ヌクレオチドおよび/または置換ヌクレオチドおよび/または反転ヌクレオチドを含むように修飾することができる。さらに、またはあるいは、ゲノムは、細胞の感染に使用されるウイルスのゲノムと比較して、特定のヌクレオチドが欠失されるように修飾することができる。
【0017】
さらに、用語「細胞」は、野生型レオウイルスによる感染が可能な任意のタイプの細胞を包含する。周知の例は、細胞株「911」、PER.C6、「293」、HeLa、A549、およびL929を含む。
【0018】
1つの実施形態において、本明細書において記述した方法を使用して、レオウイルスゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントを修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾することができる。
【0019】
本明細書において記述した方法により導入されたゲノム修飾は、第1の態様に従う方法の工程(b)において感染した細胞によって産生されたウイルスの成分(例えば、1種以上の構造的および/または非構造的タンパク質)における1種以上の修飾として現われうることが理解されるべきである。言いかえれば、本明細書において記述した方法によって産生された修飾ゲノムは、1種以上の修飾ウイルス成分をコードし得る。したがって、本発明は、修飾ゲノムを有するレオウイルスの産生が可能な方法の提供に加えて、ゲノムによってコードされた1種以上のウイルス成分を修飾する方法もまた提供する。この手段で、上記の工程(b)において感染した細胞によって産生されたウイルスは、1種以上の修飾成分(例えば、構造的タンパク質および/または非構造的タンパク質)および/または修飾ゲノムを含むことができる。
【0020】
さらなる実施形態において、本方法を使用して、例えば、コアまたはカプシドの構造を含むものなどの1種以上の構造成分を修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して、1種以上の非構造成分、例えば、感染、複製、集合および/または放出に関与するタンパク質などを修飾し得る。特に、本方法を使用して、ウイルスカプシドを含むタンパク質の1つまたは複数を修飾し得る。
【0021】
さらに、またはあるいは、本明細書において記述した方法を使用して、1種以上の異種核酸配列を含むように、レオウイルスゲノムを修飾することができる。1つの実施形態において、異種核酸配列は異種成分および/またはタンパク質をコードし得る。例えば、ゲノムを修飾して、1種以上の生来または天然のレオウイルス成分を対応する異種成分と置換し得る。さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムによってコードされた生来または天然の成分に加えて、1種以上の異種成分および/またはタンパク質をコードするように、レオウイルスゲノムを修飾し得る。
【0022】
またさらなる実施形態において、異種核酸配列は、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードし得る。
【0023】
用語「異種の」は、本明細書において記述した方法が行なわれている特定のレオウイルス以外のソースに由来する核酸配列および/またはその産物(例えばそれによってコードされたタンパク質)を指すことが理解されるべきである。
【0024】
オルトレオウイルス属(レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D))の事例において、本明細書において記述した方法のうちのいずれかを使用して、ゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAセグメント(またはその一部分もしくは複数部分)を修飾することに加えて、T3Dの1種以上の成分、例えば、構造的成分および/または非構造成分を修飾し得る。特に、本方法を使用して、T3Dの内殻および/または外殻のカプシドを含む1種以上のタンパク質を修飾し得る。タンパク質σ1、σ3、λ2およびμ1cは、外殻カプシドの成分であり、タンパク質λ1、λ3、σ2およびμ2は、内殻カプシドの一部である。
【0025】
当業者は、多数のウイルス成分を修飾するために、細胞へと多数の核酸(ウイルスの修飾成分をそれぞれコードしている)を導入できることを認識するだろう。
【0026】
好ましくは、成分は、構造成分および/または非構造成分である。例えば、構造成分はウイルスカプシドを含むタンパク質でありえる。
【0027】
好ましくは、および1つの実施形態において、細胞に導入される核酸は、ウイルスのゲノムの選択された部分の相補的なDNA(cDNA)コピーを生成する工程を含む方法によって提供し得る。有利には、ウイルスゲノムの選択された部分は、ウイルスの1種以上の成分をコードし得る。
【0028】
1つの実施形態において、細胞(宿主細胞)を使用して、本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスを増殖し得る。宿主細胞としての使用のために適切な細胞は、例えば、911細胞、PER.C6細胞、293の細胞、HeLa細胞、A549細胞、およびL929細胞を含むことができる。
【0029】
典型的には、その中でウイルスを増殖させた細胞はRNA抽出プロトコールにさらされ得る。1つの実施形態において、RNA抽出プロトコールは、溶解を誘導する条件に宿主細胞をさらす工程を含み得る。かかる条件は、ウイルスを含む細胞懸濁液の凍結融解の使用を含み得る。このように、宿主細胞内の任意のウイルス粒子は、例えば遠心分離、好ましくは超遠心分離によって放出および採取し得る。
【0030】
有利には、採取されたウイルス粒子は、溶解を誘導する条件にさらし得る。かかる条件は、例えばウイルス粒子の変性および酵素の不活性化を可能にし、他の場合には核酸を変性および/または破壊し得るカオトロピック化合物の使用を含み得る。かかる化合物は、例えば、塩化グアニジンまたはグアニジウムチオシアネートなどの、尿素および/またはグアニジン化合物を含み得る。典型的には、残存ウイルスおよび/または細胞残屑をさらなる遠心分離ラウンドによって除去して、ウイルスRNAを含む上清を残し得る。
【0031】
好ましくは、RNA抽出は、フェノール−クロロホルム、シリカビーズ、粒子または珪藻などの化合物、および/または溶液からRNAを抽出するようにデザインされたミクロスピンのカラム(キアゲン(QIAGEN)社)の使用を含む核酸沈殿技術によって達成し得る。これらの技術に関するさらに詳しい情報は例えばBoomら、Rapid and simple method for purification of nucleic acids、Journal of Clinical Microbiology、vol.(3)28,p495−503;Shaferら、Interlaboratory comparison of sequence−specific PCR and ligase detection reaction to detect a human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutation.エイズ臨床試験研究班ウイルス学委員会薬物耐性ワーキンググループ(The AIDS Clinical Trials Group Virology Committee Drug Resistance Working Group)、J.Clin.Microbiol.1996 34:1849−1853およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版);Sambrookら;CSHLプレス社から得ることができる。
【0032】
好ましくは、抽出されたRNAは、特定のウイルスRNA配列(以下に標的ウイルス配列と呼ばれる)は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが使用される増幅プロトコールを行なって、選択された配列を増幅し得る。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、特定のヌクレオチド配列により特異的にハイブリダイズするようにデザインされる。
【0033】
1つの実施形態において、標的ウイルス配列は特定のウイルスの構造成分および/または非構造成分をコードする。例えば、標的ウイルス配列は、1種以上のカプシドタンパク質をコードし得る。
【0034】
有利には、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ウイルス配列のcDNAコピーの生成を許容する条件下で、ウイルスRNAと接触させられる。かかる条件は、RNAをcDNAへの逆転写が可能な酵素の使用を含み得る。1つの実施形態において、標的配列は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって増幅される。RT−PCRに関するさらに詳しい情報は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版);Sambrookら;CSHLプレス中で見出すことができる。
【0035】
好ましくは、1つの実施形態において、標的ウイルス配列は、対応する野生型ウイルス配列に比べた場合、改変されているか、または何らかの形で異なる配列を提供するように修飾され得る。例えば、標的ウイルス配列は、ウイルスの野生型形態における対応するアミノ酸配列に比べた場合、1種以上の付加、欠失、置換、または反転したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含むように修飾され得る。
【0036】
有利には、標的ウイルス配列は増幅プロトコールの間に修飾され得る。好ましくは、上述されたRT−PCR増幅プロトコールで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに加えて、生じたcDNAに導入される修飾をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。さらにまたはあるいは、オリゴヌクレオチドは、ウイルス標的配列によってコードされた1種以上のアミノ酸の欠失、置換または反転をもたらすヌクレオチド配列を含み得る。
【0037】
したがって、本明細書において記述された方法は、レオウイルスゲノムの修飾部分および/またはレオウイルスの修飾成分をコードする相補的DNA(cDNA)を細胞に導入する工程を含み得る。
【0038】
細胞への核酸の導入に関与する工程は、当業者に周知であり、例えば、トランスフェクションプロトコール、または転写カセット、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター(例えば真核生物遺伝子発現ベクター)の使用を含み得る。望ましくは、ベクターはワクシニアウイルスではなく、T7 RNDポリメラーゼ駆動ベクターは、有利には、本方法ではヘルパーウイルスの使用に依存しない。
【0039】
典型的には、トランスフェクションプロトコールは、細胞膜を核酸などの化合物に対して透過性があるようにする条件を利用する。一例として、エレクトロポレーション、熱ショックおよび/またはリン酸カルシウムなどの化合物を使用して、核酸を細胞にトランスフェクションすることが可能であり得る。
【0040】
さらに、またはあるいは、核酸は遺伝子銃によって細胞に導入することができる。かかる事例において、導入される核酸は、細胞に直接送達することができる粒子を結合させるかまたは他の場合にはコンジュゲートさせ得る。
【0041】
好ましくは、細胞に導入される核酸は、例えばウイルスベクターなどのRNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に含まれる。このような方法で、核酸は安定的に発現することができる。1つの実施形態において、導入された核酸の産物が安定的に発現されるように、転写カセットを細胞のゲノムへと安定的に組込むことが可能である。好ましくは、RNAポリメラーゼII依存性転写カセットはレンチウイルスベクターである。
【0042】
したがって、1つの実施形態において、本発明は、例えばベクターなどのRNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に核酸(例えばcDNA)が含まれる、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムおよび/または成分を修飾する方法を提供する。
【0043】
有利には、ベクターはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである。
【0044】
レオウイルス科に属するウイルスは、特定の細胞の表面上に存在する特定のタイプの受容体分子に結合し得る。例えば、接合部接着分子A(JAM−A:他の場合には接合部接着分子1、またはJam−1として公知)は、オルトレオウイルス属のタイプ1およびタイプ3のための受容体として作用する(結合および感染を仲介する)ことが公知である。より具体的には、T3Dのカプシドタンパク質σ−1(S1)の部分(球状頭部の領域)は、Jam−Aと相互作用するが、S1のシャフトドメイン内の特定の他の配列は細胞表面上に存在するシアル酸分子と相互作用することができる。特定の細胞分子(以下、「細胞受容体」と呼ばれる)を結合すると同時に、ウイルスは内部移行され、従って細胞に「感染する」。
【0045】
ウイルス構造成分と細胞受容体との間の特異的な相互作用は、レオウイルス科に属するウイルスによって示される特定の細胞指向性(すなわち結合および伝染力の特異性)に寄与する。
【0046】
したがって、およびさらなる態様において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
(a)レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(b)細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの修飾成分を含む方法が提供される。
【0047】
好ましくは、レオウイルスの修飾成分はウイルスカプシドタンパク質などの修飾構造成分でありえる。有利には、修飾は、ウイルス成分を、工程(b)において使用されるレオウイルスが結合できない細胞受容体に結合可能なようにする。
【0048】
さらなる実施形態において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法は、特定の細胞への結合が可能なタンパク質をコードするようにウイルスのゲノムを修飾する工程を含み得る。このような方法で、樹状細胞、マクロファージ、および/または他のタイプの免疫学的細胞または白血球、および/またはヒトまたは動物の身体の組織および器官に由来する細胞などの細胞に対してレオウイルス粒子を標的化することが可能であり得る。
【0049】
1つの実施形態において、本発明は、T3Dの細胞指向性を修飾する方法であって、
(a)修飾S1カプシドタンパク質をコードする核酸を提供する工程、
(b)核酸を細胞に導入する工程、
(c)細胞にT3Dウイルスを感染させる工程、及び
(d)修飾された細胞指向性の新規のT3Dウイルスの産生に適切な条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記新規のT3Dが、工程(c)で使用されるT3Dウイルスと比較して、前記修飾されたS1カプシドタンパク質を含む方法を提供する。
【0050】
典型的には、工程(c)において使用されるT3Dウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0051】
好ましくは、修飾S1タンパク質は、S1タンパク質を、工程(c)において使用されるT3DレオウイルスのS1タンパク質が結合できない細胞受容体に結合が可能なようにする修飾一次構造を含む。1つの実施形態において、S1タンパク質に対する修飾は、工程(c)で使用されるレオウイルスのS1タンパク質と比較して、S1アミノ酸一次配列に対する、またはそれからの1種以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または反転を含み得る。有利には、その修飾は、S1タンパク質のカルボキシ末端に対する修飾を含み得る。より好ましくは、修飾はS1一次配列に対するアミノ酸の付加を含み、1つの実施形態において、修飾は、S1カプシドタンパク質のカルボキシ末端に対する1種以上のヒスチジン残基の付加を含む。
【0052】
さらなる実施形態において、上述された細胞指向性を修飾する方法が行なわれるレオウイルスは、特定の疾患および/または条件の研究および/または治療において使用し得る。疾患および/または条件の中で研究および/または治療が可能であるものは、癌などの細胞増殖および/または分化障害である。レオウイルスが癌細胞においてアポトーシスを誘導することが公知であるので、特定の細胞型についての指向性を示すように修飾されるレオウイルスを使用して、癌を治療し得る。
【0053】
有利には、またさらなる実施形態において、レオウイルスは、細胞死もしくはアポトーシスを誘導し得るかまたは1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る一化合物又は複数の化合物をコードする、1種以上の核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。例えば、化合物は、タンパク質産生および/または細胞(分裂)サイクルに関与するプロセスに影響し得る。例えば、レオウイルスゲノムは、化合物、例えば、正常な細胞過程を干渉または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、siRNA配列および/またはiRNA配列などをコードする核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。さらなる実施形態において、修飾ゲノムは、細胞に対する細胞毒性効果、アポトーシス効果および/または阻害効果を有する化合物をコードする核酸配列を含み得る。このような方法で、本発明に従う修飾レオウイルス粒子を使用して、特定の疾患または状態を治療し得る。
【0054】
さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムは、細胞内での検出を許容する1種以上の化合物をコードする核酸配列を含むように修飾し得る。例えば、修飾ゲノムは、GFPまたは同種のものなどの蛍光化合物をコードする核酸を含み得る。
【0055】
なおさらなる実施形態において、本発明は、レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)のσ−1(S1)カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
(a)修飾T3DのS1タンパク質をコードするcDNAを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
(b)細胞にT3Dレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾S1タンパク質を有する修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾S1カプシドタンパク質を有する前記修飾T3Dウイルスが、工程(b)で使用されるT3Dレオウイルスと比較して、修飾されたS1カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む方法を提供する。
【0056】
典型的には、工程(b)において使用されるT3Dレオウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0057】
第4の態様において、本明細書において記述された方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルスが提供される。
【0058】
第5の態様において、修飾レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)であって、そのカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含む修飾S1カプシドタンパク質を含む前記ウイルスが提供される。
【0059】
第6の態様において、修飾S1カプシドタンパク質を含むレオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)を作製する方法であって、
(a)修飾T3DのS1カプシドタンパク質をコードするcDNAを細胞に導入する工程、
(b)細胞にT3Dレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾T3Dウイルスが、野生型ウイルスと比較して、修飾されたS1カプシドタンパク質を含む方法が提供される。
【0060】
典型的には、工程(b)において使用されるT3Dレオウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型または突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0061】
第7の態様において、本発明は、レオウイルスを増殖する方法を提供する。これらの方法は、本明細書において記述された方法のいずれかに従うレオウイルスの1種以上の成分の修飾、および続いて修飾レオウイルスの修飾成分との結合または相互作用が可能な部分(moiety)(タンパク性化合物など、例えば、抗体または同種のもの)を発現する細胞(例えば修飾細胞)と修飾レオウイルスを接触させることを必要とし得る。有利には、レオウイルスは、細胞によって発現されるかまたは細胞上に存在する化合物または部分との相互作用または結合が可能な修飾カプシド成分を含むように修飾され得る。このような方法で、細胞の部分とレオウイルスの修飾成分との相互作用(またはその間の結合)によって、細胞は修飾レオウイルスにより感染され得る。当業者は、新規のウイルスの産生/生成を許容する条件下での修飾細胞の維持によって、レオウイルスを増殖させることが可能なことを認識するだろう。
【0062】
それゆえ、本発明は、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、、修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
(b)修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法を提供する。
【0063】
上記を考慮して、および1つの実施形態において、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)そのカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含むように、本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従うS1カプシドタンパク質を修飾する工程、
(b)修飾レオウイルスを、少なくとも1つのヒスチジン残基の結合が可能な部分を発現するように修飾された細胞と接触させる工程、及び
(c)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法が提供される。
【0064】
好ましくは、修飾レオウイルスは修飾レオウイルスT3Dであり、「細胞」は神経膠芽腫細胞株に由来する。1つの実施形態において、細胞はU118MG細胞である。
【0065】
有利には、少なくとも1つのヒスチジン残基を結合することができる部分は、例えば抗体などのペプチドである。用語「結合部分」は、任意のかかるペプチドまたは抗体のヒスチジン結合断片/部分をもまた包含するようにとることができる。例えば、および抗体の事例において、断片は1種以上の重鎖および/または軽鎖および/またはF(ab)および/またはF(ab)2断片を含み得る。例えば、結合部分は一本鎖抗体であり得る。
【0066】
当業者は、生来のレオウイルス受容体(例えばJAM−A受容体)の欠落にもかかわらず、HIS修飾S1カプシドタンパク質を保有する修飾レオウイルスは、修飾S1カプシドタンパク質の少なくとも1つのヒスチジン残基と相互作用する一本鎖抗体を発現するように修飾された細胞(U118MG細胞などの)において感染および増殖することができることを認識するだろう。
【0067】
1つの特定の実施形態において、第7の態様に従う方法は、カプシドタンパク質の修飾に加えて、1種以上の他のカプシドタンパク質に対する修飾をさらに含むレオウイルスの増殖を許容し得る。例えば、増殖されるレオウイルスは、同じまたは代替のカプシドタンパク質に対する1種以上の付加の修飾とともに、S1カプシドタンパク質のカルボキシ末端に少なくとも1つのヒスチジン残基を付加する修飾も含み得る。かかる付加の修飾は、例えば、生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するカプシド(例えばS1)タンパク質を構成する1種以上のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換を含み得る。「生来の」レオウイルス受容体は、細胞に感染するためにレオウイルスによって通常は結合される受容体と見なされることが理解されるべきである。かかる受容体は正常な健全細胞上に存在し得る。レオウイルスT3Dの事例において、生来の受容体はJAM−Aと見なし得る。生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するアミノ酸配列の修飾によって、修飾レオウイルスと生来のレオウイルス受容体との間の結合、相互作用および/または会合を妨害または阻害することが可能であり得る。
【0068】
したがって、さらなる実施形態において、第7の態様に従う方法は、そのカルボキシ末端に少なくとも1つのヒスチジン残基を付加する修飾、および生来のレオウイルス受容体と相互作用するアミノ酸を改変するカプシドタンパク質に対するさらなる修飾を含む修飾レオウイルスを増殖する方法に関する。有利には、さらなる修飾は、レオウイルスT3DのS1タンパク質のアミノ酸Asn369〜Glu384に対する修飾を含むことができる。当業者は、これらの特定の残基がJAM−Aと相互作用すると示唆されることを認識するだろう(Campbellら、(2005)Junctional Adhesion Molecule A Serves as a Receptor for Prototype and Field−Isolate Strains of Mammalian Reovirus.JOURNAL OF VIROLOGY,79:7967−7978)。
【0069】
上述の方法を使用して、S1タンパク質のカルボキシ末端に対するヒスチジン修飾の保有に加えて、ウイルスが生来の受容体と相互作用、結合または他の場合には会合することを妨害する修飾をカプシドタンパク質へと導入する修飾もまた含むウイルスを増殖し得る。かかるウイルスは、正常細胞とは対照的に腫瘍細胞を特異的に標的化できるので癌などの疾患の治療において有用であり得る。
【0070】
第8の態様において、修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、少なくとも1つの修飾カプシド成分と少なくとも1つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分との間の結合を許容する条件下で、少なくとも1つの修飾カプシド成分を有する修飾レオウイルスを、少なくとも1つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分と接触させる工程を含む方法が提供される。例えば、本方法は、少なくとも1つのヒスチジン残基とヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で、ヒスチジン結合部分とS1タンパク質のカルボキシ末端で1つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを接触させる工程を含み得る。
【0071】
当業者は、ヒスチジン結合部分が上述された部分のうちの任意の1つであり得ることを理解するだろう。さらにまたはあるいは、ヒスチジン結合部分は、ニッケルイオンなどの金属イオンを含み得る。好ましくは、金属イオンは、例えば、セファロース、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、アガロースまたは同種のものなどの支持基質のいくつかの形態に結合または他の場合には固定し得る。
【0072】
ヒスチジン結合部分は、カラムの形態で提供され得る。一例として、カラムは、ニッケルイオンにカップリングまたはコンジュゲートしたセファロースを含み得る。
【0073】
本方法は、ヒスチジン結合部分に結合されない任意の修飾レオウイルスを除去する洗浄工程を含み得る。
【0074】
このような方法で、修飾レオウイルスは、水性溶液、細胞溶解物または同種のものから単離および/または濃縮し得る。
【0075】
第9の態様において、本発明は、レオウイルス科のメンバーによって引き起されるかまたはそれらが寄与する疾患に対するワクチンの調製における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用を提供する。
【0076】
第10の態様において、例えば癌などの細胞増殖および分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用が提供される。
本発明はここで以下の図に対する参照によって記述されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【図1】異なる細胞株におけるレオウイルス収率。
【図2】S1 cDNA配列およびそれによってコードされたσ1タンパク質のアミノ酸配列。
【図3】S1HIS cDNA配列およびそれによってコードされたσ1−HISタンパク質のアミノ酸配列。
【図4】HAJam−A、scFvHISおよびS1HISをコードするレンチウイルスコンストラクトの図式的な表示。
【図5】U118MG細胞におけるJam−A mRNAの不在を実証する逆転写酵素PCR解析。下部は、Jam−A mRNAに対するプライムの位置を示す。
【図6】WST細胞生存率分析により決定されるようなレオウイルスのT3Dに感染した911細胞およびU118MG細胞の生存。
【図7】HA抗血清によるウエスタン解析によって検出されるU118MG細胞におけるHAJamの異種発現。
【図8】レオウイルスT3D感染2日後のU118MG−HAJam細胞およびU118MG細胞における細胞変性効果。
【図9】レオウイルスT3D感染細胞の[35S]−メチオニン標識化は、示されるようなレオウイルスタンパク質のλクラス、σクラスおよびμクラスを検出する。
【図10】LV−S1HIS−IRES−Neoにより形質導入された911細胞におけるσ1−HISタンパク質。抗HISの抗血清によるウエスタン解析によって検出された。
【図11】911−S1HIS細胞または対照としての911細胞で2回(P2)または3回(P3)継代したレオウイルスT3Dからの抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析をペンタ−HIS血清により実行して、HISタグを含むσ1タンパク質の存在を検出した。
【図12】LV−scFvHIS−IRES−Neo細胞に感染したU118MG細胞の抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析を抗HA血清により実行して、形質導入細胞におけるHAタグscFvHISの存在を検出した。
【図13】WST細胞生存分析により検出された、野生型レオウイルスT3Dおよびσ1−HISをロードしたレオウイルスによる感染後の細胞生存。
【図14】S1−HISゲノムセグメントを獲得したレオウイルスT3Dを濃縮する選択システムの図式的なアウトライン。
【図15】HISタグσ1タンパク質を検出するペンタHIS血清を使用する、それぞれ911−S1His細胞およびU118MG−scFvHIS細胞についての連続継代(P)および選択(S)の間のレオウイルスT3Dのウエスタン解析。M=分子量マーカー、wtは911細胞から単離した野生型レオウイルスT3Dのサンプル。
【図16】野生型レオウイルスT3DおよびU118MG−ScFvHIS細胞で選択されたS1−HISレオウイルスの修飾S1ゲノムセグメントを検出する逆転写酵素PCR。
【図17】U118MG−scFvHIS細胞でHISタグの存在について選択されたレオウイルスからのS1−HIS分節によってコードされたσ1_HISタンパク質のアミノ酸配列。4つの単離物のRT5、RT6、RT8およびRT10からの配列は、911細胞において発現されたσ1−HIS(上部列)と比較される。
【発明を実施するための形態】
【0078】
この開示は、σ−1タンパク質またはレオウイルスT3Dにおけるアミノ酸の異種ストレッチの操作のための本発明の使用について記述する。これらのアミノ酸は、修飾σ−1タンパク質を保有するウイルスが腫瘍細胞の外側の新しいタンパク質受容体を結合し利用することを可能にする。親野生型レオウイルスT3Dではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dは、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞に感染できるという観察から明白なように、相互作用は機能的である。親野生型レオウイルスT3Dではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dを、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞株で、増殖させることができる。
【0079】
本発明の方法は、従来の真核生物遺伝子発現ベクターを使用する修飾レオウイルスT3Dゲノムセグメントの発現に依存する。この開示において、出願人は、6つのヒスチジンのトラクトからなるカルボキシ末端の伸長を保有するσ1タンパク質をコードするようにσ1ゲノムセグメントを修飾した。mRNAがプラス鎖σ−1RNAの真のCAP部位で開始するように、発現カセットを構築した。野生型S1ゲノムセグメントとは対照的に、修飾バージョンはプラス鎖RNAの正常な3'末端で短縮せず、伸長し、ポリAトラクトを含む。任意の従来のRNAポリメラーゼH依存性転写カセットはこれを達成することができる。本形態において、スタンダードレンチウイルスベクターを使用した。スタンダードレンチウイルスベクター法の補助により(Carlottiら、2004)、発現カセットをいわゆる911細胞へと導入した。結果として生じる細胞において、野生型レオウイルスT3Dは3回の継代で増殖させた。結果として生じるウイルスストックを使用して、HISタグを結合する一本鎖(scFv)抗体を表面上に発現するU118MG細胞を感染させる。U118MG細胞は正常なレオウイルスT3D受容体Jam−Aを欠く。U118MG細胞もそのscFvHIS受容体発現誘導体も野生型レオウイルスによって感染できない。しかしながら、修飾レオウイルスT3D(HISタグS1タンパク質を含む)は、サロゲート受容体としてscFvHIS受容体を使用することができ、これらの細胞において増殖することができる。ウエスタンブロッティング、およびS1分節のヌクレオチド配列分析によって子孫ウイルスにおいてHISタグの存在を確認した。総合すれば、本データは、(i)ポリアデニル化mRNAによるレオウイルス科のリバースジェネティクスが実行可能であること、(ii)レオウイルス科の遺伝子再標的化が実行可能であること、および(iii)S1タンパク質のC末端は、宿主域修飾変異の挿入のための有用な場所であることを実証する。これはより効果的な癌溶解レオウイルスの生成に直接的に役立つようになり、病原性レオウイルス科のための新しいワクチンの開発を促進するだろう。
プライマー
表1:この研究において使用されるプライマー
【表1】
制限部位(NotIおよびHindIII)およびHISタグの配列に下線を引く。
【実施例】
【0080】
実施例1:Reoウイルス受容体およびレオウイルスσ1の異種発現のためのベクターの構築
第1の実験において、レオウイルスT3DはマウスL細胞で増殖される。感染5日後、子孫ウイルスを培地の凍結融解によって感染細胞から放出し、その中で細胞を再懸濁した。この溶解物のアリコートを使用して、911細胞(Fallauxら、1996)、911細胞のSV40ラージT発現クローン(PER.C6細胞)(Fallauxら、1998)およびもとは293/tsA1609neoと呼ばれた293T細胞(DuBridgeら、1987)を感染させた。初回感染(37℃、5%CO2で2時間)の後に、10%ウシ胎仔血清(FCS)を含む通常のダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)により培地を置換し、インキュベーションを継続した。細胞変性効果は、すべてのレオウイルスT3Dに感染した細胞株の感染48時間後において明らかだった。様々なタイムポイントで、培養培地を採取し、細胞は109/mLの密度で2%FCS含有リン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁した。ウイルスは3サイクルの凍結融解によって細胞から放出された。溶解物はテーブルトップ遠心分離機中で1200×g10分間の遠心分離によって清澄化した。ウイルスの濃度は、911細胞でアデノウイルスベクターについて今までに記述されたように、スタンダードのプラーク分析を実行することによって決定された(Fallauxら、1996)。図1において表わされたデータは、検査したすべての細胞株が妥当な量のレオウイルスT3Dを産生したことを示す。最も高い収率が911細胞の感染48時間後で得られた。便宜上、細胞株911はスタンダードの細胞株としてウイルス産生およびプラーク分析による量子化のために使用した。
【0081】
σ1ゲノムセグメントの相補的DNA(cDNA)クローンを得るために、DMEM/2%FCS中で5プラーク形成単位/細胞(pfu)のレオウイルスT3Dにより911細胞を感染させた。初回感染(37℃、5%CO2で2時間)の後に、10%FCSを含む通常のDMEMにより培地を置換した。RNAは、製造業者のプロトコールに従って、ストラタジーン社アブソルートリーRNA RT−PCRミニプレップキット(Stratagene Absolutely RNA RT−PCR Miniprep Kit)を使用して、感染24時間後の感染細胞から抽出した。プライマーペアのReoS1/H3およびReoS1/N1(表1)により、およびインビトロゲン(Invitrogen)社からのスーパースクリプト(Superscript)II逆転写酵素を使用して、S1ゲノムセグメントを相補的DNA(cDNA)にコピーし、プロメガ(Promega)社から得たTaqポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。アガロースゲル電気泳動の後に、ジェットソーブ(JETsorb)ゲル抽出キット(ゲノメッド(Genomed)社)によりS1DNA断片を精製し、制限酵素のHindIIIおよびNotIにより消化した。結果として生じる断片を、HindIIIおよびNotIで消化したプラスミドpcDNA3.1+中にクローン化した。結果として生じるライゲーション混合物を使用して大腸菌(Escherichia coli)株TOP10F'を形質転換し、予想される構造を備えたプラスミドを含むクローン(pCDNART3S1と呼ばれる)を単離し増やした。クローンpCDNART3S1からのプラスミドDNAを、ライデンゲノムテクノロジーセンターでのプライマーペアのReoS1/H3およびReoS1/N1による配列解析のために使用した。S1分節のcDNAを表わす配列は、図2において表わされる。概念的な翻訳開始配列に下線を引く。σ−1タンパク質の予測されたアミノ酸配列が示される。
【0082】
代わりの受容体に対して再標的化したレオウイルスに関して、新しいペプチドリガンドをウイルスカプシド中に含むことができる。1つの選択肢は、カプシド成分をコードする遺伝子断片のうちの1つの中にかかるリガンドをコードするコドンを組み入れることである。カプシド成分および位置の選択においては、ウイルス粒子においてリガンドが標的とされた受容体に接近することができ、修飾カプシド成分の基本的な構造または機能が妨害されないような方法でリガンドについてのコドンの挿入のための部位を選ぶことが必要である。したがって、我々は、σ−1タンパク質へとリガンドを挿入することを選んだ。レオウイルスT3Dのσ−1タンパク質の一部の結晶構造が公知であり(Chappellら、2002b)、IKKE(DOI/pdblkke/pdb 10.2210)としてブルックヘヴン(Brookhaven)タンパク質データバンクに寄託されている。
【0083】
人工リガンドをσ−1タンパク質のカルボキシル末端に挿入した。これは、この領域が、レオウイルスT3Dのための天然の受容体として働くJam−Aタンパク質と相互作用することが提唱される領域に近い頭部ドメイン中に位置するためである(Chappellら、2002b)。さらに、末端アミノ酸が外側へ伸びるように、σ1のカルボキシル末端は位置する。したがって、カルボキシル末端での付加アミノ酸の融合が頭部ドメインの空間構成に影響を及ぼさないはずであることが推測された。付加アミノ酸が頭部ドメインの表面で露出され、これはそれらを評価可能にし、それらが標的とした受容体と相互作用することを可能にするだろうとさらに提唱された。
【0084】
σ−1タンパク質をコードする領域のカルボキシル末端終了に6つのヒスチジン残基(「HISタグ」)のためのヌクレオチド配列コーディングを付加するために、ポリメラーゼ連鎖反応クローニング戦略を使用した。異なる2つのコンストラクトが作製され、両方は、σ1のコドンと融合したHISタグのコドンを含む。第1のコンストラクトはHISタグを含むが、HISタグσ1の下流のレオウイルス配列をすべて欠く。従って、このプラスミドはHISにタグσ1タンパク質コード領域の下流の非コードの配列を欠く。第2のコンストラクトは、HISにタグσ−1の分節コーディングの完全なcDNAを含む。このコンストラクトは3'非翻訳領域全体を含む。
【0085】
第1のプラスミドは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、プライマーペアHisReoS1M2およびReoS1H3により作製した(それらの配列については表1を参照)。平滑末端を含む産物を生成するために、Pfuポリメラーゼ(プロメガ社)を使用した。PCR産物をHindIIIにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、HindIIIおよびEcoRVにより消化したpCDNA3.1+のプラスミドDNAへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはpRT3S1HISstopと命名され、さらなる研究のために使用した。pCDNA3.1+中に挿入した断片の配列はDNA配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。
【0086】
プラスミドpRT3S1HISCompleteを、鋳型としてpRT3S1HISstop、およびSigmaEndRevおよびReoS1H3のプライマーの組合せを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって生成した。PCR産物をHindIIIにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、HindIIIおよびEcoRVにより消化したpCDNA3.1+のプラスミドDNAへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはpRT3S1HISCompleteと命名され、さらなる研究のために使用した。pCDNA3.1+中に挿入した断片の配列はDNA配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。修飾レオウイルスS1ゲノムセグメントのcDNA配列は図3中に表わされ、この配列の下にσ−1−HISタンパク質のアミノ酸配列を表わす。
【0087】
安定的に異種の相補的DNA(cDNA)クローンを発現する細胞株の生成のために、レンチウイルスベクターを比較的容易に用いることができる。後続する実験のために、4つの異なるレンチウイルスベクターがスタンダードのクローン技術によって生成された。この研究において使用されるレンチウイルスコンストラクトはすべて、pLV−CMV−IRES−NEOベクターにおいて作製したベクターに基づいた(Vellingaら、2006)。図4は、作製されたコンストラクトの図式的な説明を示す。
【0088】
プラスミドpLV−CMV−S1HIS−IRES−NEOおよびpLV−CMV−S1HISstop−IRES−NEOを生成するために、コンストラクトpRT3SlHISCompleteおよびpRT3S1HISstopをEco105IおよびXbaIにより消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEco105I部位とXbaIの部位の間にクローン化した。
【0089】
プラスミドpLV−CMV−HAJam−IRES−NEOプラスミドを生成するために、pCDNA−HAJam(Naikら、2001)(U.P Naik博士によって快く提供された)を制限酵素のEcol05IおよびXbaIを使用して消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEcol05I部位とXbaIの部位の間に挿入した。
【0090】
一本鎖HISタグ受容体をコードするコンストラクトを生成するために、pHISsFv.rec(Douglasら、1999)(D.T.Curiel博士からの親切な寄贈)を、Ecol05IおよびXhoIにより消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEcol05IおよびXhoIの部位の間に挿入した。図4は、作製されたコンストラクトの全体図を示す。
【0091】
以前に記述されたように(Carlottiら、2004;Vellingaら、2006)、リン酸カルシウム共沈殿方法を使用して、293T細胞で、レンチウイルスベクターストックの産生を正確に実行した。すべてのレンチウイルスベクターはトランスフェクションの48時間後に採取した。
【0092】
安定的に導入遺伝子を発現する細胞株を生成するために、異なるレンチウイルスベクターストックの適切な希釈物を、8μg/mlポリブレン(シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)社、ツビンドレヒト、オランダ)の存在下において、細胞株に添加し(2500細胞あたり1〜10ngの間のp24の濃度で)、一晩インキュベートした。翌日、細胞に新鮮な培地を与えた。48時間後、細胞をトリプシン処理によって剥がし、700μg/mlのG418(インビトロゲン社、ブレダ、オランダ)を含む培地中に再プレーティングして、G418耐性細胞集団を選択した。選択開始の3〜5日後に、培地は1mlあたり200μgのG418含有培地により置換された。
【0093】
実施例2:U118MG細胞は受容体Jam−Aの非存在に起因してレオウイルス感染症に耐性がある。
いくつかのグループは、U118MGはレオウイルス感染症に完全に耐性があることを実証した(Wilcox ら、2001;Yangら、2003)。U118MG細胞についてのこの観察を確認するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)によってJam−A mRNAの存在を解析した。この解析中に陽性対照として911細胞を含む。
【0094】
逆転写酵素反応のために使用したプライマーを表1中にリストする。U118MG細胞および911細胞を5cmのディッシュに播種した。培養の密集と同時に、ストラタジーン社からのアブソルートリーRNAミニプレップキットを使用して、細胞からRNAを単離した。1細胞株あたり600ngのRNAを、RevRThJamプライマー(マニュアルに従って1反応あたり2pmole)を使用して、スーパースクリプトII(インビトロゲン社)によるファーストストランド合成で使用した。2μlのcDNAをRevRThJamおよびhJam new Fのプライマーの組合せによる増幅のために使用して、hJam−Aの完全なコード領域(928bp)を増幅した。さらに、プライマーペア組合せhJamnest Rおよびhjam new Fをより短い産物(359bp)の増幅のために使用した。Taqポリメラーゼ(プロメガ社)を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった:3分95℃、(30秒95℃−40秒58℃−1分72℃)×30−10分72℃−10分40℃−終了。結果を図5中に図示する。911細胞においてJam−A RNAは容易に検出されたが、U118MG由来サンプルにおいてシグナルは明らかではなく、MG118細胞のJam−A mRNAが検出可能なレベルに足りないことを示す。
【0095】
U118MG細胞がレオウイルスT3D感染に耐性があることを確認するために、U118MG細胞の培養を様々な感染多重度でレオウイルスT3Dウイルスに暴露した。この実験において、対照として911細胞の培養を同じ多重度で暴露した。911細胞の培養において細胞変性効果は容易に観察されたが、MG118培養においてウイルス感染に際してはインキュベーション時間を延長しても変化は明らかではなかった。これらの培養における細胞の生存能力をWST細胞生存率分析により分析した(図6)。これらのデータは、再び、レオウイルスT3Dは容易に911細胞を殺傷するが、U118MG細胞はレオウイルスT3D感染に完全に耐性があることに確証を与えた。これがJam−A受容体の非存在のためであることを実証するために、レオウイルスT3Dのための一次受容体として働くHAタグJam−Aタンパク質を合成をさせるようにレンチウイルスベクターpLV−CMV−HAJam−IRES−NEOに、U118MG細胞を暴露した。G418耐性LV−CMV−HAJam−IRES−NEO形質導入細胞集団のHAに特異的抗血清を使用するタンパク質溶解物のウエスタン解析は、これらの細胞中のHAにタグJam−Aの着実な発現を実証した(図7)。これは、HA−Jam−Aシグナリングが形質導入および選択された細胞集団中の細胞の大部分で検出可能であることを明らかにする免疫蛍光顕微鏡によって、さらなる確証が与えられた。レオウイルスT3Dに対するこれらの細胞の暴露は、親U118MG細胞ではなく、HA−Jam発現U118MG細胞において細胞変性効果の徴候の急速な発生を導いた(図8)。これは、ウイルスタンパク質の代謝的標識によってさらなる確証が与えられた。感染細胞またはモック感染細胞を、様々な感染後のタイムポイントでレディビュー(Redivue)[35S]メチオニンプロミックス(200μCi/ml;アマシャム(Amersham)社、ローセンダール、オランダ)により4時間標識した。細胞をPBSにより一回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(コンプリートミニタブレット、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社、アルメレ、オランダ)のカクテルを含むジョルダーノ溶解緩衝液(50mMトリスHCl(pH7.4)、250mM NaCl、0.1%トリトン、5mM EDTA)中に溶解した。すべての標識分析は1ウェルあたり5μlのプロミックスにより24−ウェルプレート中で行われ、溶解緩衝液の体積は1ウェルあたり100μlであった。サンプル緩衝液の添加後に、これの50μlを10%SDSポリアクリルアミドゲルに添加した。ゲルを乾燥して放射線用フィルムに暴露し、スタンダードな手順に従って処理した(図9)。この結果は、未修飾のU118MG細胞ではなく、911細胞およびHA−Jam−A発現U118MG細胞におけるウイルスタンパク質の存在を実証した。これらのデータから、U118MG細胞はレオウイルスT3D感染に耐性があり、これはもっぱらレオウイルスT3D感染のための一次受容体として働くことができるJam−Aタンパク質の不在のためであると結論する。
【0096】
実施例3:σ1産生911細胞株の生成。
次の工程として、レオウイルスT3Dタンパク質を産生する細胞株を生成した。この目的のために、911細胞は、2500細胞あたり1〜10ngのp24の濃度でLV−CMV−S1HIS−IRES−NEOベクターウイルスに暴露された。G418耐性細胞集団(ここで911−S1HIS細胞と命名した)についての選択の後に、タンパク質溶解物をこれらの細胞から生成し、1:1500に希釈したα−ペンタ−His血清(キアゲン・ベネルクス社(Qiagen Benelux bv)オランダ)を使用するウエスタン解析によって解析して、HISタグを含むσ1タンパク質を検出した。結果を図10中に図示する。これらのデータは、親911細胞ではなく、G418選択を生き延びたLV−CMV−S1HIS−IRES−NEO形質導入細胞における49kDaバンドの存在を実証する。これらのデータから、911細胞株が有意な量のHISタグS1タンパク質を含むと結論する。これは、S1過剰発現が細胞に対して毒性がないことを示唆する。
【0097】
実施例4:ウイルスカプシド中の修飾σ1タンパク質の機能的取り込み
次に、およそ10の感染多重度でレオウイルスT3Dにより911−S1HIS細胞を感染させた。細胞変性効果の出現1日後に、ウイルスを採取し、凍結融解によって細胞に結合したウイルスを放出させ、収量の100分の1を使用して911−S1HIS細胞の第2の培養を感染させた。ウイルスは911−S1HISで連続して3回継代した。単離したウイルスのアリコートは、α−ペンタ−His血清を使用するウエスタン解析によって解析した。結果を図11中に図示する。抗HIS血清は予想されるサイズに移動したタンパク質を検出し、レオウイルスがカプシド中にHISタグσ1タンパク質を組み入れできたことを示唆した。
【0098】
この位置に挿入されたアミノ酸が機能的にHISタグと相互作用できるかどうかを検査するために、U118MG細胞は細胞表面上でHISタグと相互作用することができる一本鎖抗体を発現するように修飾された。この目的のために、U118MG細胞をレンチウイルスベクターLV−CMV−scFvHIS−IRES−NEOに暴露した。プローブとしてHA抗血清を使用する細胞のタンパク質溶解物のウエスタン解析から明白であるように、G418耐性細胞集団は一本鎖HIS受容体を発現した(図12)。親U118MG細胞においてシグナルは存在しない。また、免疫蛍光顕微鏡は、培養におけるすべての細胞の均質の染色を示し、すべての細胞において類似した量のタンパク質が実証された。これらのデータから、ここでU118MG細胞が表面上に一本鎖HIS受容体を発現すると結論する。
【0099】
HISタグσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dのためのサロゲート受容体として一本鎖HIS受容体を使用できるかどうか検査するために、細胞株を、増加した量のウイルスストック、および対照として親野生型レオウイルスT3Dの同等量に暴露した。HAタグJAM−Aを発現するU118MG細胞は、911由来T3Dレオウイルスおよび911−S1HIS由来レオウイルスの両方に感受性があるが、U118MG−scFvHIS細胞は、911由来T3Dレオウイルスではなく911−S1HIS由来レオウイルスにのみ感受性がある。細胞変性効果の徴候は、911−S1HIS株で増殖させたT3Dウイルスによる感染3日後のU118MG−scFv−HIS細胞の顕微鏡検査に際して明らかであった。これらのデータはWST細胞生存率分析により定量された(図13)。総合すれば、これらのデータは、U118MG細胞においてscFv−HISを人工受容体として使用できるかもしれないことを実証する。これは、U118MG細胞の感染が通常のレオウイルスT3D受容体Jam−Aに非依存的に進行することを可能にする。さらに、これは、ウイルスカプシド中にHISタグσ−Iタンパク質の存在を確認し、HISタグがウイルスカプシドで暴露され、U118MG−scFv−HIS細胞の感染を可能にすることを実証する。
【0100】
実施例5:レオウイルスにおける修飾S1ゲノムセグメントの取り込み
レオウイルスT3Dが、911−S1HIS細胞での増殖の間に組み入れられたHISタグS1ゲノムセグメントを獲得したかどうかを検査するために、911−S1HIS細胞から採取したウイルスを使用してU118MG−scFvHIS細胞を感染させた。細胞変性効果の明らかな徴候に際して、細胞を穏やかにフラッシングすることによってディッシュの表面から細胞を剥がし、馴化培地中での細胞の粉砕によって懸濁した。ウイルスは凍結融解によって細胞から放出された。次に、レオウイルスバッチはテーブルトップ遠心分離機中で2000rpm10分間の遠心分離によって清澄化された。このバッチを再び使用してU118MG−scFvHIS細胞を感染させ、感染4日後に細胞を採取した。この手順を6回繰り返した。選択スキームを図14中に略述する。連続的増殖に際して、細胞変性効果の徴候は、911細胞から単離したレオウイルスT3Dにより感染した細胞よりも、911−S1HIS細胞から採取されたレオウイルスT3Dにより最初に感染したU118MG−scFvHISにおいてより明らかであった。これは、U119MG−scFvHIS細胞でウイルスを増殖できるかもしれないことを示唆した。911−S1HIS細胞で増殖されたレオウイルスに感染させたU118MG−scFvHIS細胞およびその連続継代のタンパク質溶解物のウエスタン分析は、溶解物におけるHISタグS1タンパク質の存在を実証した(図15)。
【0101】
HISタグS1ゲノムセグメントの存在を実証するために、継代7で連続的に継代したレオウイルスT3Dから単離したRNAについて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)解析を実行した。ウイルスに連続的に感染させたU118MG−scFvHIS細胞における細胞変性効果の徴候に際して、ストラタジーン社からのアブソルートリーRNAミニプレップキットを使用して細胞からRNAを単離した。1細胞株あたり600ngのRNAを、HisRevプライマー(マニュアルに従って1反応あたり2pmole)を使用して、スーパースクリプトII(インビトロゲン社)によるファーストストランド合成で使用した。2μlのcDNAをHisRevおよびReoS1N1のプライマーの組合せによる増幅のために使用して、S1ゲノムセグメントの完全なコード領域を増幅した。Taqポリメラーゼ(プロメガ社)を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった:3分95℃、(30秒95℃−40秒58℃−80秒72℃)×30−10分72℃−10分4℃−終了。結果を図16中に図示する。HISタグS1産物はU118MG−scFvHISにおいて容易に検出されたが、未修飾911細胞由来レオウイルスT3Dにより感染されたU118MG−scFvHIS細胞においてはシグナルは明らかではない。PCR産物は、製造者の使用説明書に従ってプラスミドpCRII−TOPO(インビトロゲン社)中にクローン化した。挿入された断片を有するクローンを個別に増やし、これらのクローンから単離したプラスミドDNAをそれぞれM13リバースプライマーおよびM123フォワードプライマーによるDNA配列解析のために使用した。クローン化されたPCR産物の配列解析から、σ1のコーディングのC末端の予想される位置でHISタグについてのコドンの存在が確認された。4つの異なるS1HIS cDNAクローンによってコードされたσ−1タンパク質のアミノ酸配列は、図17中に表わされる。親配列(図3からの)は上部列において表わされ、σ1−His(クローン化された)と表記される。クローンのRT5およびRT6のアミノ酸配列は親クローンと同一であるが、RT8およびRT10はそれぞれ1つおよび2つのアミノ酸の違いを有する。それにもかかわらず、HISタグは、すべての事例においてσ1のカルボキシル末端に予想通りに結合される。
【0102】
これらのデータから、911 S1HIS細胞での増殖に際して、レオウイルスT3DがHISタグについてのコドンを獲得したと結論する。これは、親野生型親S1ゲノムセグメントと異種S1 RNAとの間の再集合プロセスの結果である可能性が最も高い。しかしながら、組換えなどの他の機構、または複製の間の鋳型スイッチングは、これまで得られたデータに基づいて除外することができない。
【0103】
連続的に増殖させたウイルスは未修飾U118MG細胞に感染することができず、形質導入は、サロゲート受容体として働く細胞上のscFv−HISタンパク質に厳密に依存することが実証される。
【0104】
総合すれば、本データは、再標的化されたレオウイルスの生成は、レオウイルスS1ゲノムセグメントに組み込まれているポリアデニル化されたmRNAを含むレオウイルスを細胞で増殖させることによって比較的容易に行なえることを示す。細胞において発現されたmRNAは一本鎖であり、S1ゲノムセグメントのプラス鎖RNA全体を含む。しかしながら、異種S1 mRNAは、5'末端の真のS1ゲノムセグメントの位置またはその付近で開始するが、3'末端は有意に伸長され、IRES配列、NEO遺伝子、B型肝炎ウイルス(HBV)由来転写後調節エレメント(PRE)、およびヒト免疫不全ウイルスタイプ1(HIV−I)長末端反復の一部を含む。S1ゲノムセグメントのプラス鎖上の3'伸長の存在が、再標的化変異の獲得を妨害しないことは明らかである。
【0105】
参考文献リスト
【技術分野】
【0001】
本発明は、レオウイルス科に属するウイルス(すなわちレオウイルス)のためのリバースジェネティクスシステム、その様々な使用、遺伝的に修飾したレオウイルス、レオウイルス選択/産生および増殖システム、薬剤およびワクチンを提供する。
【背景技術】
【0002】
レオウイルス科(Reoviridae(Respiratory Enteritic Orphan viruses))は、分節された二本鎖RNAゲノムを備えた非エンベロープウイルスのファミリーを構成する。レオウイルス科は、胃腸系に影響するウイルス(ロタウイルスなど)を含み、それは呼吸器感染を引き起こす。用語「オーファンウイルス」は、特定のウイルスが任意の公知の疾患に関連しないことを示しており、レオウイルス科は多数の疾患に関連するが、オリジナル名がなお使用されている(Tyler、2001)。ロタウイルスは、ヒトからヒトへ直接伝達されることが可能であり、世界の全体で2歳未満の小児においておよそ1年で500,000人死亡を生じる深刻な下痢性疾病の主要な原因微生物である(Kapikianら、2001)。
【0003】
哺乳類オルトレオウイルスのプロトタイプはヒト呼吸管および腸管から単離されていたが、重篤なヒト疾患と関連しない。これらのうちの1つ、ヒトレオウイルスタイプ3ディアリング(Dearing)(T3D)がしばしば研究され、通常この科のモデルとされる(Nibertら、2001)。さらに、最近十年間の間に、哺乳類オルトレオウイルス(特にT3D)は前臨床および臨床の癌治療実験において癌溶解剤として使用されてきた(Normanら、2000;Shmulevitzら、2005)。本発明は、レオウイルスが、健康な非形質転換細胞ではなく腫瘍細胞の細胞死およびアポトーシスを誘導するという観察に部分的に基づく(Hashiroら、1977;Duncanら、1978)。現在までに、癌治療に対するかかるアプローチの実施可能性を研究するために、複数の臨床試験がカナダ、米国およびイギリスで開始された。
【0004】
野生型レオウイルスは、標的細胞への結合のための受容体として複数の別個のタンパク質を使用することができる。最初に、接合部接着分子(Junction Adhesion Molecule)−A(Jam−A、接合部接着分子1、またはJam−1としても公知)は、オルトレオウイルス属(Orthoreovirus)のタイプ1およびタイプ3のための受容体として働き、ウイルスの付着および感染を仲介できることが実証されている(Chappellら、2002d)。Jam−Aは組込まれた密着結合タンパク質であり、レオウイルスT3Dのσ−1タンパク質の球状頭部中の領域はJam−Aと相互作用する(Chappellら、2002c)。さらに、スパイクタンパク質σ−1のシャフトドメインの配列は、産生性感染のための細胞表面シアル酸分子と相互作用することができる(Chappellら、1997)。σ−1タンパク質はRNA分節S1(σ1としても公知である)によってコードされる。
【0005】
レオウイルス受容体が高い頻度で出現するにもかかわらず、いくつかの腫瘍細胞は細胞表面上に限られた数の受容体を有する。例えば、Smakman(2005)は、結腸直腸転移をともなう患者からの13の腫瘍の断片のどれもレオウイルスT3D感染に感受性がないことを記載した(Smakman、2005)。腫瘍細胞上のレオウイルス受容体の欠乏は、癌溶解剤としてのレオウイルスの効率を妨げる。
【0006】
レオウイルス科の遺伝子修飾は、それらの二本鎖RNAゲノムの分節構造のために困難なことが有名である。それゆえ、本発明はレオウイルス科のメンバーのためのリバースジェネティクス法に関する。Ronerら、2001、およびRonerら、1990は、RNA分節のうちの1つのインビトロ合成、このRNAのインビトロキャッピング、および他の9つの分節の一本鎖(プラス鎖)RNAおよび/または二本鎖RNAとのこのRNAのコトランスフェクションを含む、複雑なレオウイルスリバースジェネティクスシステムを開発した。複製を開始するために、トランスフェクションした細胞を、ヘルパーウイルスとしてゆっくり溶菌するレオウイルスバリアントのレオウイルスT2またはT1により感染させた(Ronerら、2001)。クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を保持する単一の組換えレオウイルスT3Dは生成されたが、方法は非能率的で煩わしいものである。
【0007】
代わりのアプローチはKomotoおよびSasaki(Komotoら、2006)によって記述され、ロタウイルスのためのリバースジェネティクスシステムの確立について記述する。彼らは再集合されたロタウイルスのレスキューに成功したが、方法は非常に非能率的であり、改善する必要がある。Kobayashiおよび共同研究者は、完全にプラスミドに基づいたシステムを使用する組換えレオウイルスT3Dの生成について最近記述した(Kobayashi,T.、A.A.R.Antar、K.W.Boehme、P.Danthi、E.A.Eby、K.M.Guglielmi、G.H.Holm、E.M.Johnson、M.S.Maginnis、S.Naik、W.B.Skelton、J.D.Wetzel、G.J.Wilson、J.D.Chappell,およびT.S.Dermody.2007.A Plasmid−Based Reverse Genetics System for Animal Double−Stranded RNA Viruses.Cell Host & Microbe 1:147−157)。
【0008】
これらの両方の方法は、真の分節末端を備えた一本鎖プラス鎖RNAの産生に依存する。一般にポリアデニル化されていない一本鎖RNAが哺乳類細胞中で非常に短命であることが周知であるので、このことは組換体の形成を妨げる(Zeeviら、1982)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、本発明の目的は、先行技術に関する上述の問題を回避または軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、例えば、遺伝的に修飾されたレオウイルスおよび/またはレオウイルスの宿主域バリアントの開発に特定の適用を有することができるレオウイルス科のための効率的なリバースジェネティクスシステムの開発に基づく。
【0011】
第1の態様において、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
(a)レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(b)細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む方法を提供する。
【0012】
本発明は、細胞中で発現された場合、レオウイルスゲノムの修飾部分が新しく形成されたレオウイルス粒子へと組み入れられうるという意外な観察に基づく。理論に束縛されるものではないが、細胞へといったん導入された修飾レオウイルスゲノム部分は転写されて、真の5'キャップで開始し、3'末端で短縮せず、ポリAトラクトを含むようにさらに伸長されるmRNAの分子をもたらすと考えられている。
【0013】
レオウイルス科は、分節二本鎖RNAゲノムを有する非エンベロープウイルス(他の場合にはレオウイルスとして既知である)の科であり、例えば、オルトレオウイルス(Orthoreovirus)、オルビウイルス(Orbivirus)、ロタウイルス(Rotavirus)およびコルティウイルス(Coltivirus)種を含む。そのようなものとして、本発明は、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、例えばレオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)などのオルトレオウイルス種のゲノムを遺伝的に修飾する方法を提供する。
【0014】
典型的には、細胞にレオウイルスを感染させる工程(上記の工程(b))は、「野生型レオウイルス」の使用を必要としうる。野生型レオウイルスは、レオウイルス科に属する任意のウイルスの生来の形態または自然発生の形態でありえる。好ましくは、野生型レオウイルスは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスの野生型形態である。一例として、方法がオルトレオウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルトレオウイルス種の野生型形態でありえる。
【0015】
あるいは、細胞にレオウイルスを感染させる工程は、レオウイルス突然変異体(mutant)またはバリアントにより実行することができる。例えば、特定の実施形態において、例えば、高温感受性変異体および/または宿主域変異体を使用することは望ましいだろう。さらに、またはあるいは、工程(b)において上で言及されたレオウイルスは、参照または同じ種の野生型株に比べて、修飾されたゲノムを含むレオウイルスでありえる。かかる事例において、本明細書において記述した方法の工程(b)において使用するレオウイルスのゲノムは、本明細書において記述した方法または既に当業者に公知方法のうちのいずれかに従って修飾することができる。上述のように、工程(b)において使用したバリアント、突然変異体または修飾レオウイルスは、好ましくは、本明細書において記述した方法が行なわれるレオウイルスのバリアント、変異体または修飾バージョンである。一例として、方法がオルビウイルス種のゲノムの修飾に関するならば、細胞の感染に使用されるレオウイルスは前記オルビウイルス種のバリアント、突然変異体および/または修飾形態でありえる。
【0016】
本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスは、細胞の感染に使用するレオウイルスと比較して、「修飾された」こと、および工程(b)において使用されるレオウイルスは、同じウイルスの野生型、バリアント、突然変異体または修飾形態でありえることが理解されるべきである。したがって、語句「修飾ゲノム」は、工程(b)で使用されるウイルスに由来したゲノムに比べた場合に、改変されているか、または何らかの形で異なるゲノムを意味するように意図される。例えば、ゲノムは、付加ヌクレオチドおよび/または置換ヌクレオチドおよび/または反転ヌクレオチドを含むように修飾することができる。さらに、またはあるいは、ゲノムは、細胞の感染に使用されるウイルスのゲノムと比較して、特定のヌクレオチドが欠失されるように修飾することができる。
【0017】
さらに、用語「細胞」は、野生型レオウイルスによる感染が可能な任意のタイプの細胞を包含する。周知の例は、細胞株「911」、PER.C6、「293」、HeLa、A549、およびL929を含む。
【0018】
1つの実施形態において、本明細書において記述した方法を使用して、レオウイルスゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントを修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾することができる。
【0019】
本明細書において記述した方法により導入されたゲノム修飾は、第1の態様に従う方法の工程(b)において感染した細胞によって産生されたウイルスの成分(例えば、1種以上の構造的および/または非構造的タンパク質)における1種以上の修飾として現われうることが理解されるべきである。言いかえれば、本明細書において記述した方法によって産生された修飾ゲノムは、1種以上の修飾ウイルス成分をコードし得る。したがって、本発明は、修飾ゲノムを有するレオウイルスの産生が可能な方法の提供に加えて、ゲノムによってコードされた1種以上のウイルス成分を修飾する方法もまた提供する。この手段で、上記の工程(b)において感染した細胞によって産生されたウイルスは、1種以上の修飾成分(例えば、構造的タンパク質および/または非構造的タンパク質)および/または修飾ゲノムを含むことができる。
【0020】
さらなる実施形態において、本方法を使用して、例えば、コアまたはカプシドの構造を含むものなどの1種以上の構造成分を修飾することができる。さらに、またはあるいは、本方法を使用して、1種以上の非構造成分、例えば、感染、複製、集合および/または放出に関与するタンパク質などを修飾し得る。特に、本方法を使用して、ウイルスカプシドを含むタンパク質の1つまたは複数を修飾し得る。
【0021】
さらに、またはあるいは、本明細書において記述した方法を使用して、1種以上の異種核酸配列を含むように、レオウイルスゲノムを修飾することができる。1つの実施形態において、異種核酸配列は異種成分および/またはタンパク質をコードし得る。例えば、ゲノムを修飾して、1種以上の生来または天然のレオウイルス成分を対応する異種成分と置換し得る。さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムによってコードされた生来または天然の成分に加えて、1種以上の異種成分および/またはタンパク質をコードするように、レオウイルスゲノムを修飾し得る。
【0022】
またさらなる実施形態において、異種核酸配列は、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードし得る。
【0023】
用語「異種の」は、本明細書において記述した方法が行なわれている特定のレオウイルス以外のソースに由来する核酸配列および/またはその産物(例えばそれによってコードされたタンパク質)を指すことが理解されるべきである。
【0024】
オルトレオウイルス属(レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D))の事例において、本明細書において記述した方法のうちのいずれかを使用して、ゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAセグメント(またはその一部分もしくは複数部分)を修飾することに加えて、T3Dの1種以上の成分、例えば、構造的成分および/または非構造成分を修飾し得る。特に、本方法を使用して、T3Dの内殻および/または外殻のカプシドを含む1種以上のタンパク質を修飾し得る。タンパク質σ1、σ3、λ2およびμ1cは、外殻カプシドの成分であり、タンパク質λ1、λ3、σ2およびμ2は、内殻カプシドの一部である。
【0025】
当業者は、多数のウイルス成分を修飾するために、細胞へと多数の核酸(ウイルスの修飾成分をそれぞれコードしている)を導入できることを認識するだろう。
【0026】
好ましくは、成分は、構造成分および/または非構造成分である。例えば、構造成分はウイルスカプシドを含むタンパク質でありえる。
【0027】
好ましくは、および1つの実施形態において、細胞に導入される核酸は、ウイルスのゲノムの選択された部分の相補的なDNA(cDNA)コピーを生成する工程を含む方法によって提供し得る。有利には、ウイルスゲノムの選択された部分は、ウイルスの1種以上の成分をコードし得る。
【0028】
1つの実施形態において、細胞(宿主細胞)を使用して、本明細書において記述した方法が行なわれるウイルスを増殖し得る。宿主細胞としての使用のために適切な細胞は、例えば、911細胞、PER.C6細胞、293の細胞、HeLa細胞、A549細胞、およびL929細胞を含むことができる。
【0029】
典型的には、その中でウイルスを増殖させた細胞はRNA抽出プロトコールにさらされ得る。1つの実施形態において、RNA抽出プロトコールは、溶解を誘導する条件に宿主細胞をさらす工程を含み得る。かかる条件は、ウイルスを含む細胞懸濁液の凍結融解の使用を含み得る。このように、宿主細胞内の任意のウイルス粒子は、例えば遠心分離、好ましくは超遠心分離によって放出および採取し得る。
【0030】
有利には、採取されたウイルス粒子は、溶解を誘導する条件にさらし得る。かかる条件は、例えばウイルス粒子の変性および酵素の不活性化を可能にし、他の場合には核酸を変性および/または破壊し得るカオトロピック化合物の使用を含み得る。かかる化合物は、例えば、塩化グアニジンまたはグアニジウムチオシアネートなどの、尿素および/またはグアニジン化合物を含み得る。典型的には、残存ウイルスおよび/または細胞残屑をさらなる遠心分離ラウンドによって除去して、ウイルスRNAを含む上清を残し得る。
【0031】
好ましくは、RNA抽出は、フェノール−クロロホルム、シリカビーズ、粒子または珪藻などの化合物、および/または溶液からRNAを抽出するようにデザインされたミクロスピンのカラム(キアゲン(QIAGEN)社)の使用を含む核酸沈殿技術によって達成し得る。これらの技術に関するさらに詳しい情報は例えばBoomら、Rapid and simple method for purification of nucleic acids、Journal of Clinical Microbiology、vol.(3)28,p495−503;Shaferら、Interlaboratory comparison of sequence−specific PCR and ligase detection reaction to detect a human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutation.エイズ臨床試験研究班ウイルス学委員会薬物耐性ワーキンググループ(The AIDS Clinical Trials Group Virology Committee Drug Resistance Working Group)、J.Clin.Microbiol.1996 34:1849−1853およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版);Sambrookら;CSHLプレス社から得ることができる。
【0032】
好ましくは、抽出されたRNAは、特定のウイルスRNA配列(以下に標的ウイルス配列と呼ばれる)は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが使用される増幅プロトコールを行なって、選択された配列を増幅し得る。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、特定のヌクレオチド配列により特異的にハイブリダイズするようにデザインされる。
【0033】
1つの実施形態において、標的ウイルス配列は特定のウイルスの構造成分および/または非構造成分をコードする。例えば、標的ウイルス配列は、1種以上のカプシドタンパク質をコードし得る。
【0034】
有利には、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ウイルス配列のcDNAコピーの生成を許容する条件下で、ウイルスRNAと接触させられる。かかる条件は、RNAをcDNAへの逆転写が可能な酵素の使用を含み得る。1つの実施形態において、標的配列は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって増幅される。RT−PCRに関するさらに詳しい情報は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版);Sambrookら;CSHLプレス中で見出すことができる。
【0035】
好ましくは、1つの実施形態において、標的ウイルス配列は、対応する野生型ウイルス配列に比べた場合、改変されているか、または何らかの形で異なる配列を提供するように修飾され得る。例えば、標的ウイルス配列は、ウイルスの野生型形態における対応するアミノ酸配列に比べた場合、1種以上の付加、欠失、置換、または反転したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含むように修飾され得る。
【0036】
有利には、標的ウイルス配列は増幅プロトコールの間に修飾され得る。好ましくは、上述されたRT−PCR増幅プロトコールで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに加えて、生じたcDNAに導入される修飾をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。さらにまたはあるいは、オリゴヌクレオチドは、ウイルス標的配列によってコードされた1種以上のアミノ酸の欠失、置換または反転をもたらすヌクレオチド配列を含み得る。
【0037】
したがって、本明細書において記述された方法は、レオウイルスゲノムの修飾部分および/またはレオウイルスの修飾成分をコードする相補的DNA(cDNA)を細胞に導入する工程を含み得る。
【0038】
細胞への核酸の導入に関与する工程は、当業者に周知であり、例えば、トランスフェクションプロトコール、または転写カセット、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター(例えば真核生物遺伝子発現ベクター)の使用を含み得る。望ましくは、ベクターはワクシニアウイルスではなく、T7 RNDポリメラーゼ駆動ベクターは、有利には、本方法ではヘルパーウイルスの使用に依存しない。
【0039】
典型的には、トランスフェクションプロトコールは、細胞膜を核酸などの化合物に対して透過性があるようにする条件を利用する。一例として、エレクトロポレーション、熱ショックおよび/またはリン酸カルシウムなどの化合物を使用して、核酸を細胞にトランスフェクションすることが可能であり得る。
【0040】
さらに、またはあるいは、核酸は遺伝子銃によって細胞に導入することができる。かかる事例において、導入される核酸は、細胞に直接送達することができる粒子を結合させるかまたは他の場合にはコンジュゲートさせ得る。
【0041】
好ましくは、細胞に導入される核酸は、例えばウイルスベクターなどのRNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に含まれる。このような方法で、核酸は安定的に発現することができる。1つの実施形態において、導入された核酸の産物が安定的に発現されるように、転写カセットを細胞のゲノムへと安定的に組込むことが可能である。好ましくは、RNAポリメラーゼII依存性転写カセットはレンチウイルスベクターである。
【0042】
したがって、1つの実施形態において、本発明は、例えばベクターなどのRNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に核酸(例えばcDNA)が含まれる、レオウイルス科に属するウイルスのゲノムおよび/または成分を修飾する方法を提供する。
【0043】
有利には、ベクターはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである。
【0044】
レオウイルス科に属するウイルスは、特定の細胞の表面上に存在する特定のタイプの受容体分子に結合し得る。例えば、接合部接着分子A(JAM−A:他の場合には接合部接着分子1、またはJam−1として公知)は、オルトレオウイルス属のタイプ1およびタイプ3のための受容体として作用する(結合および感染を仲介する)ことが公知である。より具体的には、T3Dのカプシドタンパク質σ−1(S1)の部分(球状頭部の領域)は、Jam−Aと相互作用するが、S1のシャフトドメイン内の特定の他の配列は細胞表面上に存在するシアル酸分子と相互作用することができる。特定の細胞分子(以下、「細胞受容体」と呼ばれる)を結合すると同時に、ウイルスは内部移行され、従って細胞に「感染する」。
【0045】
ウイルス構造成分と細胞受容体との間の特異的な相互作用は、レオウイルス科に属するウイルスによって示される特定の細胞指向性(すなわち結合および伝染力の特異性)に寄与する。
【0046】
したがって、およびさらなる態様において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
(a)レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(b)細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの修飾成分を含む方法が提供される。
【0047】
好ましくは、レオウイルスの修飾成分はウイルスカプシドタンパク質などの修飾構造成分でありえる。有利には、修飾は、ウイルス成分を、工程(b)において使用されるレオウイルスが結合できない細胞受容体に結合可能なようにする。
【0048】
さらなる実施形態において、レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法は、特定の細胞への結合が可能なタンパク質をコードするようにウイルスのゲノムを修飾する工程を含み得る。このような方法で、樹状細胞、マクロファージ、および/または他のタイプの免疫学的細胞または白血球、および/またはヒトまたは動物の身体の組織および器官に由来する細胞などの細胞に対してレオウイルス粒子を標的化することが可能であり得る。
【0049】
1つの実施形態において、本発明は、T3Dの細胞指向性を修飾する方法であって、
(a)修飾S1カプシドタンパク質をコードする核酸を提供する工程、
(b)核酸を細胞に導入する工程、
(c)細胞にT3Dウイルスを感染させる工程、及び
(d)修飾された細胞指向性の新規のT3Dウイルスの産生に適切な条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記新規のT3Dが、工程(c)で使用されるT3Dウイルスと比較して、前記修飾されたS1カプシドタンパク質を含む方法を提供する。
【0050】
典型的には、工程(c)において使用されるT3Dウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0051】
好ましくは、修飾S1タンパク質は、S1タンパク質を、工程(c)において使用されるT3DレオウイルスのS1タンパク質が結合できない細胞受容体に結合が可能なようにする修飾一次構造を含む。1つの実施形態において、S1タンパク質に対する修飾は、工程(c)で使用されるレオウイルスのS1タンパク質と比較して、S1アミノ酸一次配列に対する、またはそれからの1種以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または反転を含み得る。有利には、その修飾は、S1タンパク質のカルボキシ末端に対する修飾を含み得る。より好ましくは、修飾はS1一次配列に対するアミノ酸の付加を含み、1つの実施形態において、修飾は、S1カプシドタンパク質のカルボキシ末端に対する1種以上のヒスチジン残基の付加を含む。
【0052】
さらなる実施形態において、上述された細胞指向性を修飾する方法が行なわれるレオウイルスは、特定の疾患および/または条件の研究および/または治療において使用し得る。疾患および/または条件の中で研究および/または治療が可能であるものは、癌などの細胞増殖および/または分化障害である。レオウイルスが癌細胞においてアポトーシスを誘導することが公知であるので、特定の細胞型についての指向性を示すように修飾されるレオウイルスを使用して、癌を治療し得る。
【0053】
有利には、またさらなる実施形態において、レオウイルスは、細胞死もしくはアポトーシスを誘導し得るかまたは1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る一化合物又は複数の化合物をコードする、1種以上の核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。例えば、化合物は、タンパク質産生および/または細胞(分裂)サイクルに関与するプロセスに影響し得る。例えば、レオウイルスゲノムは、化合物、例えば、正常な細胞過程を干渉または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、siRNA配列および/またはiRNA配列などをコードする核酸配列を含むようにさらに修飾し得る。さらなる実施形態において、修飾ゲノムは、細胞に対する細胞毒性効果、アポトーシス効果および/または阻害効果を有する化合物をコードする核酸配列を含み得る。このような方法で、本発明に従う修飾レオウイルス粒子を使用して、特定の疾患または状態を治療し得る。
【0054】
さらなる実施形態において、レオウイルスゲノムは、細胞内での検出を許容する1種以上の化合物をコードする核酸配列を含むように修飾し得る。例えば、修飾ゲノムは、GFPまたは同種のものなどの蛍光化合物をコードする核酸を含み得る。
【0055】
なおさらなる実施形態において、本発明は、レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)のσ−1(S1)カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
(a)修飾T3DのS1タンパク質をコードするcDNAを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
(b)細胞にT3Dレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾S1タンパク質を有する修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
修飾S1カプシドタンパク質を有する前記修飾T3Dウイルスが、工程(b)で使用されるT3Dレオウイルスと比較して、修飾されたS1カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む方法を提供する。
【0056】
典型的には、工程(b)において使用されるT3Dレオウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型、突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0057】
第4の態様において、本明細書において記述された方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルスが提供される。
【0058】
第5の態様において、修飾レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)であって、そのカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含む修飾S1カプシドタンパク質を含む前記ウイルスが提供される。
【0059】
第6の態様において、修飾S1カプシドタンパク質を含むレオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)を作製する方法であって、
(a)修飾T3DのS1カプシドタンパク質をコードするcDNAを細胞に導入する工程、
(b)細胞にT3Dレオウイルスを感染させる工程、及び
(c)修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含み、
前記修飾T3Dウイルスが、野生型ウイルスと比較して、修飾されたS1カプシドタンパク質を含む方法が提供される。
【0060】
典型的には、工程(b)において使用されるT3Dレオウイルスは、上述された方法が行なわれるT3Dの野生型または突然変異体、バリアントまたは修飾形態である。
【0061】
第7の態様において、本発明は、レオウイルスを増殖する方法を提供する。これらの方法は、本明細書において記述された方法のいずれかに従うレオウイルスの1種以上の成分の修飾、および続いて修飾レオウイルスの修飾成分との結合または相互作用が可能な部分(moiety)(タンパク性化合物など、例えば、抗体または同種のもの)を発現する細胞(例えば修飾細胞)と修飾レオウイルスを接触させることを必要とし得る。有利には、レオウイルスは、細胞によって発現されるかまたは細胞上に存在する化合物または部分との相互作用または結合が可能な修飾カプシド成分を含むように修飾され得る。このような方法で、細胞の部分とレオウイルスの修飾成分との相互作用(またはその間の結合)によって、細胞は修飾レオウイルスにより感染され得る。当業者は、新規のウイルスの産生/生成を許容する条件下での修飾細胞の維持によって、レオウイルスを増殖させることが可能なことを認識するだろう。
【0062】
それゆえ、本発明は、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、、修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
(b)修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法を提供する。
【0063】
上記を考慮して、および1つの実施形態において、修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)そのカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含むように、本明細書において記述された方法のうちのいずれかに従うS1カプシドタンパク質を修飾する工程、
(b)修飾レオウイルスを、少なくとも1つのヒスチジン残基の結合が可能な部分を発現するように修飾された細胞と接触させる工程、及び
(c)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、細胞を維持する工程を含む方法が提供される。
【0064】
好ましくは、修飾レオウイルスは修飾レオウイルスT3Dであり、「細胞」は神経膠芽腫細胞株に由来する。1つの実施形態において、細胞はU118MG細胞である。
【0065】
有利には、少なくとも1つのヒスチジン残基を結合することができる部分は、例えば抗体などのペプチドである。用語「結合部分」は、任意のかかるペプチドまたは抗体のヒスチジン結合断片/部分をもまた包含するようにとることができる。例えば、および抗体の事例において、断片は1種以上の重鎖および/または軽鎖および/またはF(ab)および/またはF(ab)2断片を含み得る。例えば、結合部分は一本鎖抗体であり得る。
【0066】
当業者は、生来のレオウイルス受容体(例えばJAM−A受容体)の欠落にもかかわらず、HIS修飾S1カプシドタンパク質を保有する修飾レオウイルスは、修飾S1カプシドタンパク質の少なくとも1つのヒスチジン残基と相互作用する一本鎖抗体を発現するように修飾された細胞(U118MG細胞などの)において感染および増殖することができることを認識するだろう。
【0067】
1つの特定の実施形態において、第7の態様に従う方法は、カプシドタンパク質の修飾に加えて、1種以上の他のカプシドタンパク質に対する修飾をさらに含むレオウイルスの増殖を許容し得る。例えば、増殖されるレオウイルスは、同じまたは代替のカプシドタンパク質に対する1種以上の付加の修飾とともに、S1カプシドタンパク質のカルボキシ末端に少なくとも1つのヒスチジン残基を付加する修飾も含み得る。かかる付加の修飾は、例えば、生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するカプシド(例えばS1)タンパク質を構成する1種以上のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換を含み得る。「生来の」レオウイルス受容体は、細胞に感染するためにレオウイルスによって通常は結合される受容体と見なされることが理解されるべきである。かかる受容体は正常な健全細胞上に存在し得る。レオウイルスT3Dの事例において、生来の受容体はJAM−Aと見なし得る。生来のレオウイルス受容体の相互作用に関与するアミノ酸配列の修飾によって、修飾レオウイルスと生来のレオウイルス受容体との間の結合、相互作用および/または会合を妨害または阻害することが可能であり得る。
【0068】
したがって、さらなる実施形態において、第7の態様に従う方法は、そのカルボキシ末端に少なくとも1つのヒスチジン残基を付加する修飾、および生来のレオウイルス受容体と相互作用するアミノ酸を改変するカプシドタンパク質に対するさらなる修飾を含む修飾レオウイルスを増殖する方法に関する。有利には、さらなる修飾は、レオウイルスT3DのS1タンパク質のアミノ酸Asn369〜Glu384に対する修飾を含むことができる。当業者は、これらの特定の残基がJAM−Aと相互作用すると示唆されることを認識するだろう(Campbellら、(2005)Junctional Adhesion Molecule A Serves as a Receptor for Prototype and Field−Isolate Strains of Mammalian Reovirus.JOURNAL OF VIROLOGY,79:7967−7978)。
【0069】
上述の方法を使用して、S1タンパク質のカルボキシ末端に対するヒスチジン修飾の保有に加えて、ウイルスが生来の受容体と相互作用、結合または他の場合には会合することを妨害する修飾をカプシドタンパク質へと導入する修飾もまた含むウイルスを増殖し得る。かかるウイルスは、正常細胞とは対照的に腫瘍細胞を特異的に標的化できるので癌などの疾患の治療において有用であり得る。
【0070】
第8の態様において、修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、少なくとも1つの修飾カプシド成分と少なくとも1つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分との間の結合を許容する条件下で、少なくとも1つの修飾カプシド成分を有する修飾レオウイルスを、少なくとも1つの修飾カプシド成分との結合または相互作用が可能な部分と接触させる工程を含む方法が提供される。例えば、本方法は、少なくとも1つのヒスチジン残基とヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で、ヒスチジン結合部分とS1タンパク質のカルボキシ末端で1つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを接触させる工程を含み得る。
【0071】
当業者は、ヒスチジン結合部分が上述された部分のうちの任意の1つであり得ることを理解するだろう。さらにまたはあるいは、ヒスチジン結合部分は、ニッケルイオンなどの金属イオンを含み得る。好ましくは、金属イオンは、例えば、セファロース、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、アガロースまたは同種のものなどの支持基質のいくつかの形態に結合または他の場合には固定し得る。
【0072】
ヒスチジン結合部分は、カラムの形態で提供され得る。一例として、カラムは、ニッケルイオンにカップリングまたはコンジュゲートしたセファロースを含み得る。
【0073】
本方法は、ヒスチジン結合部分に結合されない任意の修飾レオウイルスを除去する洗浄工程を含み得る。
【0074】
このような方法で、修飾レオウイルスは、水性溶液、細胞溶解物または同種のものから単離および/または濃縮し得る。
【0075】
第9の態様において、本発明は、レオウイルス科のメンバーによって引き起されるかまたはそれらが寄与する疾患に対するワクチンの調製における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用を提供する。
【0076】
第10の態様において、例えば癌などの細胞増殖および分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書において記述した方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用が提供される。
本発明はここで以下の図に対する参照によって記述されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【図1】異なる細胞株におけるレオウイルス収率。
【図2】S1 cDNA配列およびそれによってコードされたσ1タンパク質のアミノ酸配列。
【図3】S1HIS cDNA配列およびそれによってコードされたσ1−HISタンパク質のアミノ酸配列。
【図4】HAJam−A、scFvHISおよびS1HISをコードするレンチウイルスコンストラクトの図式的な表示。
【図5】U118MG細胞におけるJam−A mRNAの不在を実証する逆転写酵素PCR解析。下部は、Jam−A mRNAに対するプライムの位置を示す。
【図6】WST細胞生存率分析により決定されるようなレオウイルスのT3Dに感染した911細胞およびU118MG細胞の生存。
【図7】HA抗血清によるウエスタン解析によって検出されるU118MG細胞におけるHAJamの異種発現。
【図8】レオウイルスT3D感染2日後のU118MG−HAJam細胞およびU118MG細胞における細胞変性効果。
【図9】レオウイルスT3D感染細胞の[35S]−メチオニン標識化は、示されるようなレオウイルスタンパク質のλクラス、σクラスおよびμクラスを検出する。
【図10】LV−S1HIS−IRES−Neoにより形質導入された911細胞におけるσ1−HISタンパク質。抗HISの抗血清によるウエスタン解析によって検出された。
【図11】911−S1HIS細胞または対照としての911細胞で2回(P2)または3回(P3)継代したレオウイルスT3Dからの抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析をペンタ−HIS血清により実行して、HISタグを含むσ1タンパク質の存在を検出した。
【図12】LV−scFvHIS−IRES−Neo細胞に感染したU118MG細胞の抽出タンパク質のウエスタン解析。ウエスタン解析を抗HA血清により実行して、形質導入細胞におけるHAタグscFvHISの存在を検出した。
【図13】WST細胞生存分析により検出された、野生型レオウイルスT3Dおよびσ1−HISをロードしたレオウイルスによる感染後の細胞生存。
【図14】S1−HISゲノムセグメントを獲得したレオウイルスT3Dを濃縮する選択システムの図式的なアウトライン。
【図15】HISタグσ1タンパク質を検出するペンタHIS血清を使用する、それぞれ911−S1His細胞およびU118MG−scFvHIS細胞についての連続継代(P)および選択(S)の間のレオウイルスT3Dのウエスタン解析。M=分子量マーカー、wtは911細胞から単離した野生型レオウイルスT3Dのサンプル。
【図16】野生型レオウイルスT3DおよびU118MG−ScFvHIS細胞で選択されたS1−HISレオウイルスの修飾S1ゲノムセグメントを検出する逆転写酵素PCR。
【図17】U118MG−scFvHIS細胞でHISタグの存在について選択されたレオウイルスからのS1−HIS分節によってコードされたσ1_HISタンパク質のアミノ酸配列。4つの単離物のRT5、RT6、RT8およびRT10からの配列は、911細胞において発現されたσ1−HIS(上部列)と比較される。
【発明を実施するための形態】
【0078】
この開示は、σ−1タンパク質またはレオウイルスT3Dにおけるアミノ酸の異種ストレッチの操作のための本発明の使用について記述する。これらのアミノ酸は、修飾σ−1タンパク質を保有するウイルスが腫瘍細胞の外側の新しいタンパク質受容体を結合し利用することを可能にする。親野生型レオウイルスT3Dではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dは、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞に感染できるという観察から明白なように、相互作用は機能的である。親野生型レオウイルスT3Dではなく、アミノ酸のストレッチを含むσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dを、アミノ酸の前記ストレッチの結合が可能な同族タンパク質受容体を発現する腫瘍細胞株で、増殖させることができる。
【0079】
本発明の方法は、従来の真核生物遺伝子発現ベクターを使用する修飾レオウイルスT3Dゲノムセグメントの発現に依存する。この開示において、出願人は、6つのヒスチジンのトラクトからなるカルボキシ末端の伸長を保有するσ1タンパク質をコードするようにσ1ゲノムセグメントを修飾した。mRNAがプラス鎖σ−1RNAの真のCAP部位で開始するように、発現カセットを構築した。野生型S1ゲノムセグメントとは対照的に、修飾バージョンはプラス鎖RNAの正常な3'末端で短縮せず、伸長し、ポリAトラクトを含む。任意の従来のRNAポリメラーゼH依存性転写カセットはこれを達成することができる。本形態において、スタンダードレンチウイルスベクターを使用した。スタンダードレンチウイルスベクター法の補助により(Carlottiら、2004)、発現カセットをいわゆる911細胞へと導入した。結果として生じる細胞において、野生型レオウイルスT3Dは3回の継代で増殖させた。結果として生じるウイルスストックを使用して、HISタグを結合する一本鎖(scFv)抗体を表面上に発現するU118MG細胞を感染させる。U118MG細胞は正常なレオウイルスT3D受容体Jam−Aを欠く。U118MG細胞もそのscFvHIS受容体発現誘導体も野生型レオウイルスによって感染できない。しかしながら、修飾レオウイルスT3D(HISタグS1タンパク質を含む)は、サロゲート受容体としてscFvHIS受容体を使用することができ、これらの細胞において増殖することができる。ウエスタンブロッティング、およびS1分節のヌクレオチド配列分析によって子孫ウイルスにおいてHISタグの存在を確認した。総合すれば、本データは、(i)ポリアデニル化mRNAによるレオウイルス科のリバースジェネティクスが実行可能であること、(ii)レオウイルス科の遺伝子再標的化が実行可能であること、および(iii)S1タンパク質のC末端は、宿主域修飾変異の挿入のための有用な場所であることを実証する。これはより効果的な癌溶解レオウイルスの生成に直接的に役立つようになり、病原性レオウイルス科のための新しいワクチンの開発を促進するだろう。
プライマー
表1:この研究において使用されるプライマー
【表1】
制限部位(NotIおよびHindIII)およびHISタグの配列に下線を引く。
【実施例】
【0080】
実施例1:Reoウイルス受容体およびレオウイルスσ1の異種発現のためのベクターの構築
第1の実験において、レオウイルスT3DはマウスL細胞で増殖される。感染5日後、子孫ウイルスを培地の凍結融解によって感染細胞から放出し、その中で細胞を再懸濁した。この溶解物のアリコートを使用して、911細胞(Fallauxら、1996)、911細胞のSV40ラージT発現クローン(PER.C6細胞)(Fallauxら、1998)およびもとは293/tsA1609neoと呼ばれた293T細胞(DuBridgeら、1987)を感染させた。初回感染(37℃、5%CO2で2時間)の後に、10%ウシ胎仔血清(FCS)を含む通常のダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)により培地を置換し、インキュベーションを継続した。細胞変性効果は、すべてのレオウイルスT3Dに感染した細胞株の感染48時間後において明らかだった。様々なタイムポイントで、培養培地を採取し、細胞は109/mLの密度で2%FCS含有リン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁した。ウイルスは3サイクルの凍結融解によって細胞から放出された。溶解物はテーブルトップ遠心分離機中で1200×g10分間の遠心分離によって清澄化した。ウイルスの濃度は、911細胞でアデノウイルスベクターについて今までに記述されたように、スタンダードのプラーク分析を実行することによって決定された(Fallauxら、1996)。図1において表わされたデータは、検査したすべての細胞株が妥当な量のレオウイルスT3Dを産生したことを示す。最も高い収率が911細胞の感染48時間後で得られた。便宜上、細胞株911はスタンダードの細胞株としてウイルス産生およびプラーク分析による量子化のために使用した。
【0081】
σ1ゲノムセグメントの相補的DNA(cDNA)クローンを得るために、DMEM/2%FCS中で5プラーク形成単位/細胞(pfu)のレオウイルスT3Dにより911細胞を感染させた。初回感染(37℃、5%CO2で2時間)の後に、10%FCSを含む通常のDMEMにより培地を置換した。RNAは、製造業者のプロトコールに従って、ストラタジーン社アブソルートリーRNA RT−PCRミニプレップキット(Stratagene Absolutely RNA RT−PCR Miniprep Kit)を使用して、感染24時間後の感染細胞から抽出した。プライマーペアのReoS1/H3およびReoS1/N1(表1)により、およびインビトロゲン(Invitrogen)社からのスーパースクリプト(Superscript)II逆転写酵素を使用して、S1ゲノムセグメントを相補的DNA(cDNA)にコピーし、プロメガ(Promega)社から得たTaqポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。アガロースゲル電気泳動の後に、ジェットソーブ(JETsorb)ゲル抽出キット(ゲノメッド(Genomed)社)によりS1DNA断片を精製し、制限酵素のHindIIIおよびNotIにより消化した。結果として生じる断片を、HindIIIおよびNotIで消化したプラスミドpcDNA3.1+中にクローン化した。結果として生じるライゲーション混合物を使用して大腸菌(Escherichia coli)株TOP10F'を形質転換し、予想される構造を備えたプラスミドを含むクローン(pCDNART3S1と呼ばれる)を単離し増やした。クローンpCDNART3S1からのプラスミドDNAを、ライデンゲノムテクノロジーセンターでのプライマーペアのReoS1/H3およびReoS1/N1による配列解析のために使用した。S1分節のcDNAを表わす配列は、図2において表わされる。概念的な翻訳開始配列に下線を引く。σ−1タンパク質の予測されたアミノ酸配列が示される。
【0082】
代わりの受容体に対して再標的化したレオウイルスに関して、新しいペプチドリガンドをウイルスカプシド中に含むことができる。1つの選択肢は、カプシド成分をコードする遺伝子断片のうちの1つの中にかかるリガンドをコードするコドンを組み入れることである。カプシド成分および位置の選択においては、ウイルス粒子においてリガンドが標的とされた受容体に接近することができ、修飾カプシド成分の基本的な構造または機能が妨害されないような方法でリガンドについてのコドンの挿入のための部位を選ぶことが必要である。したがって、我々は、σ−1タンパク質へとリガンドを挿入することを選んだ。レオウイルスT3Dのσ−1タンパク質の一部の結晶構造が公知であり(Chappellら、2002b)、IKKE(DOI/pdblkke/pdb 10.2210)としてブルックヘヴン(Brookhaven)タンパク質データバンクに寄託されている。
【0083】
人工リガンドをσ−1タンパク質のカルボキシル末端に挿入した。これは、この領域が、レオウイルスT3Dのための天然の受容体として働くJam−Aタンパク質と相互作用することが提唱される領域に近い頭部ドメイン中に位置するためである(Chappellら、2002b)。さらに、末端アミノ酸が外側へ伸びるように、σ1のカルボキシル末端は位置する。したがって、カルボキシル末端での付加アミノ酸の融合が頭部ドメインの空間構成に影響を及ぼさないはずであることが推測された。付加アミノ酸が頭部ドメインの表面で露出され、これはそれらを評価可能にし、それらが標的とした受容体と相互作用することを可能にするだろうとさらに提唱された。
【0084】
σ−1タンパク質をコードする領域のカルボキシル末端終了に6つのヒスチジン残基(「HISタグ」)のためのヌクレオチド配列コーディングを付加するために、ポリメラーゼ連鎖反応クローニング戦略を使用した。異なる2つのコンストラクトが作製され、両方は、σ1のコドンと融合したHISタグのコドンを含む。第1のコンストラクトはHISタグを含むが、HISタグσ1の下流のレオウイルス配列をすべて欠く。従って、このプラスミドはHISにタグσ1タンパク質コード領域の下流の非コードの配列を欠く。第2のコンストラクトは、HISにタグσ−1の分節コーディングの完全なcDNAを含む。このコンストラクトは3'非翻訳領域全体を含む。
【0085】
第1のプラスミドは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、プライマーペアHisReoS1M2およびReoS1H3により作製した(それらの配列については表1を参照)。平滑末端を含む産物を生成するために、Pfuポリメラーゼ(プロメガ社)を使用した。PCR産物をHindIIIにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、HindIIIおよびEcoRVにより消化したpCDNA3.1+のプラスミドDNAへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはpRT3S1HISstopと命名され、さらなる研究のために使用した。pCDNA3.1+中に挿入した断片の配列はDNA配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。
【0086】
プラスミドpRT3S1HISCompleteを、鋳型としてpRT3S1HISstop、およびSigmaEndRevおよびReoS1H3のプライマーの組合せを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって生成した。PCR産物をHindIIIにより消化して、ゲル電気泳動、ゲル抽出および断片精製を行なった。この産物を、HindIIIおよびEcoRVにより消化したpCDNA3.1+のプラスミドDNAへとクローン化した。予想される制限パターンを備えたプラスミドはpRT3S1HISCompleteと命名され、さらなる研究のために使用した。pCDNA3.1+中に挿入した断片の配列はDNA配列解析によって決定された。結果から同一性および断片の予想される配列が確認された。修飾レオウイルスS1ゲノムセグメントのcDNA配列は図3中に表わされ、この配列の下にσ−1−HISタンパク質のアミノ酸配列を表わす。
【0087】
安定的に異種の相補的DNA(cDNA)クローンを発現する細胞株の生成のために、レンチウイルスベクターを比較的容易に用いることができる。後続する実験のために、4つの異なるレンチウイルスベクターがスタンダードのクローン技術によって生成された。この研究において使用されるレンチウイルスコンストラクトはすべて、pLV−CMV−IRES−NEOベクターにおいて作製したベクターに基づいた(Vellingaら、2006)。図4は、作製されたコンストラクトの図式的な説明を示す。
【0088】
プラスミドpLV−CMV−S1HIS−IRES−NEOおよびpLV−CMV−S1HISstop−IRES−NEOを生成するために、コンストラクトpRT3SlHISCompleteおよびpRT3S1HISstopをEco105IおよびXbaIにより消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEco105I部位とXbaIの部位の間にクローン化した。
【0089】
プラスミドpLV−CMV−HAJam−IRES−NEOプラスミドを生成するために、pCDNA−HAJam(Naikら、2001)(U.P Naik博士によって快く提供された)を制限酵素のEcol05IおよびXbaIを使用して消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEcol05I部位とXbaIの部位の間に挿入した。
【0090】
一本鎖HISタグ受容体をコードするコンストラクトを生成するために、pHISsFv.rec(Douglasら、1999)(D.T.Curiel博士からの親切な寄贈)を、Ecol05IおよびXhoIにより消化し、プラスミドpLV−CMV−IRES−NEO中のEcol05IおよびXhoIの部位の間に挿入した。図4は、作製されたコンストラクトの全体図を示す。
【0091】
以前に記述されたように(Carlottiら、2004;Vellingaら、2006)、リン酸カルシウム共沈殿方法を使用して、293T細胞で、レンチウイルスベクターストックの産生を正確に実行した。すべてのレンチウイルスベクターはトランスフェクションの48時間後に採取した。
【0092】
安定的に導入遺伝子を発現する細胞株を生成するために、異なるレンチウイルスベクターストックの適切な希釈物を、8μg/mlポリブレン(シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)社、ツビンドレヒト、オランダ)の存在下において、細胞株に添加し(2500細胞あたり1〜10ngの間のp24の濃度で)、一晩インキュベートした。翌日、細胞に新鮮な培地を与えた。48時間後、細胞をトリプシン処理によって剥がし、700μg/mlのG418(インビトロゲン社、ブレダ、オランダ)を含む培地中に再プレーティングして、G418耐性細胞集団を選択した。選択開始の3〜5日後に、培地は1mlあたり200μgのG418含有培地により置換された。
【0093】
実施例2:U118MG細胞は受容体Jam−Aの非存在に起因してレオウイルス感染症に耐性がある。
いくつかのグループは、U118MGはレオウイルス感染症に完全に耐性があることを実証した(Wilcox ら、2001;Yangら、2003)。U118MG細胞についてのこの観察を確認するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)によってJam−A mRNAの存在を解析した。この解析中に陽性対照として911細胞を含む。
【0094】
逆転写酵素反応のために使用したプライマーを表1中にリストする。U118MG細胞および911細胞を5cmのディッシュに播種した。培養の密集と同時に、ストラタジーン社からのアブソルートリーRNAミニプレップキットを使用して、細胞からRNAを単離した。1細胞株あたり600ngのRNAを、RevRThJamプライマー(マニュアルに従って1反応あたり2pmole)を使用して、スーパースクリプトII(インビトロゲン社)によるファーストストランド合成で使用した。2μlのcDNAをRevRThJamおよびhJam new Fのプライマーの組合せによる増幅のために使用して、hJam−Aの完全なコード領域(928bp)を増幅した。さらに、プライマーペア組合せhJamnest Rおよびhjam new Fをより短い産物(359bp)の増幅のために使用した。Taqポリメラーゼ(プロメガ社)を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった:3分95℃、(30秒95℃−40秒58℃−1分72℃)×30−10分72℃−10分40℃−終了。結果を図5中に図示する。911細胞においてJam−A RNAは容易に検出されたが、U118MG由来サンプルにおいてシグナルは明らかではなく、MG118細胞のJam−A mRNAが検出可能なレベルに足りないことを示す。
【0095】
U118MG細胞がレオウイルスT3D感染に耐性があることを確認するために、U118MG細胞の培養を様々な感染多重度でレオウイルスT3Dウイルスに暴露した。この実験において、対照として911細胞の培養を同じ多重度で暴露した。911細胞の培養において細胞変性効果は容易に観察されたが、MG118培養においてウイルス感染に際してはインキュベーション時間を延長しても変化は明らかではなかった。これらの培養における細胞の生存能力をWST細胞生存率分析により分析した(図6)。これらのデータは、再び、レオウイルスT3Dは容易に911細胞を殺傷するが、U118MG細胞はレオウイルスT3D感染に完全に耐性があることに確証を与えた。これがJam−A受容体の非存在のためであることを実証するために、レオウイルスT3Dのための一次受容体として働くHAタグJam−Aタンパク質を合成をさせるようにレンチウイルスベクターpLV−CMV−HAJam−IRES−NEOに、U118MG細胞を暴露した。G418耐性LV−CMV−HAJam−IRES−NEO形質導入細胞集団のHAに特異的抗血清を使用するタンパク質溶解物のウエスタン解析は、これらの細胞中のHAにタグJam−Aの着実な発現を実証した(図7)。これは、HA−Jam−Aシグナリングが形質導入および選択された細胞集団中の細胞の大部分で検出可能であることを明らかにする免疫蛍光顕微鏡によって、さらなる確証が与えられた。レオウイルスT3Dに対するこれらの細胞の暴露は、親U118MG細胞ではなく、HA−Jam発現U118MG細胞において細胞変性効果の徴候の急速な発生を導いた(図8)。これは、ウイルスタンパク質の代謝的標識によってさらなる確証が与えられた。感染細胞またはモック感染細胞を、様々な感染後のタイムポイントでレディビュー(Redivue)[35S]メチオニンプロミックス(200μCi/ml;アマシャム(Amersham)社、ローセンダール、オランダ)により4時間標識した。細胞をPBSにより一回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(コンプリートミニタブレット、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社、アルメレ、オランダ)のカクテルを含むジョルダーノ溶解緩衝液(50mMトリスHCl(pH7.4)、250mM NaCl、0.1%トリトン、5mM EDTA)中に溶解した。すべての標識分析は1ウェルあたり5μlのプロミックスにより24−ウェルプレート中で行われ、溶解緩衝液の体積は1ウェルあたり100μlであった。サンプル緩衝液の添加後に、これの50μlを10%SDSポリアクリルアミドゲルに添加した。ゲルを乾燥して放射線用フィルムに暴露し、スタンダードな手順に従って処理した(図9)。この結果は、未修飾のU118MG細胞ではなく、911細胞およびHA−Jam−A発現U118MG細胞におけるウイルスタンパク質の存在を実証した。これらのデータから、U118MG細胞はレオウイルスT3D感染に耐性があり、これはもっぱらレオウイルスT3D感染のための一次受容体として働くことができるJam−Aタンパク質の不在のためであると結論する。
【0096】
実施例3:σ1産生911細胞株の生成。
次の工程として、レオウイルスT3Dタンパク質を産生する細胞株を生成した。この目的のために、911細胞は、2500細胞あたり1〜10ngのp24の濃度でLV−CMV−S1HIS−IRES−NEOベクターウイルスに暴露された。G418耐性細胞集団(ここで911−S1HIS細胞と命名した)についての選択の後に、タンパク質溶解物をこれらの細胞から生成し、1:1500に希釈したα−ペンタ−His血清(キアゲン・ベネルクス社(Qiagen Benelux bv)オランダ)を使用するウエスタン解析によって解析して、HISタグを含むσ1タンパク質を検出した。結果を図10中に図示する。これらのデータは、親911細胞ではなく、G418選択を生き延びたLV−CMV−S1HIS−IRES−NEO形質導入細胞における49kDaバンドの存在を実証する。これらのデータから、911細胞株が有意な量のHISタグS1タンパク質を含むと結論する。これは、S1過剰発現が細胞に対して毒性がないことを示唆する。
【0097】
実施例4:ウイルスカプシド中の修飾σ1タンパク質の機能的取り込み
次に、およそ10の感染多重度でレオウイルスT3Dにより911−S1HIS細胞を感染させた。細胞変性効果の出現1日後に、ウイルスを採取し、凍結融解によって細胞に結合したウイルスを放出させ、収量の100分の1を使用して911−S1HIS細胞の第2の培養を感染させた。ウイルスは911−S1HISで連続して3回継代した。単離したウイルスのアリコートは、α−ペンタ−His血清を使用するウエスタン解析によって解析した。結果を図11中に図示する。抗HIS血清は予想されるサイズに移動したタンパク質を検出し、レオウイルスがカプシド中にHISタグσ1タンパク質を組み入れできたことを示唆した。
【0098】
この位置に挿入されたアミノ酸が機能的にHISタグと相互作用できるかどうかを検査するために、U118MG細胞は細胞表面上でHISタグと相互作用することができる一本鎖抗体を発現するように修飾された。この目的のために、U118MG細胞をレンチウイルスベクターLV−CMV−scFvHIS−IRES−NEOに暴露した。プローブとしてHA抗血清を使用する細胞のタンパク質溶解物のウエスタン解析から明白であるように、G418耐性細胞集団は一本鎖HIS受容体を発現した(図12)。親U118MG細胞においてシグナルは存在しない。また、免疫蛍光顕微鏡は、培養におけるすべての細胞の均質の染色を示し、すべての細胞において類似した量のタンパク質が実証された。これらのデータから、ここでU118MG細胞が表面上に一本鎖HIS受容体を発現すると結論する。
【0099】
HISタグσ−1タンパク質を保有するレオウイルスT3Dのためのサロゲート受容体として一本鎖HIS受容体を使用できるかどうか検査するために、細胞株を、増加した量のウイルスストック、および対照として親野生型レオウイルスT3Dの同等量に暴露した。HAタグJAM−Aを発現するU118MG細胞は、911由来T3Dレオウイルスおよび911−S1HIS由来レオウイルスの両方に感受性があるが、U118MG−scFvHIS細胞は、911由来T3Dレオウイルスではなく911−S1HIS由来レオウイルスにのみ感受性がある。細胞変性効果の徴候は、911−S1HIS株で増殖させたT3Dウイルスによる感染3日後のU118MG−scFv−HIS細胞の顕微鏡検査に際して明らかであった。これらのデータはWST細胞生存率分析により定量された(図13)。総合すれば、これらのデータは、U118MG細胞においてscFv−HISを人工受容体として使用できるかもしれないことを実証する。これは、U118MG細胞の感染が通常のレオウイルスT3D受容体Jam−Aに非依存的に進行することを可能にする。さらに、これは、ウイルスカプシド中にHISタグσ−Iタンパク質の存在を確認し、HISタグがウイルスカプシドで暴露され、U118MG−scFv−HIS細胞の感染を可能にすることを実証する。
【0100】
実施例5:レオウイルスにおける修飾S1ゲノムセグメントの取り込み
レオウイルスT3Dが、911−S1HIS細胞での増殖の間に組み入れられたHISタグS1ゲノムセグメントを獲得したかどうかを検査するために、911−S1HIS細胞から採取したウイルスを使用してU118MG−scFvHIS細胞を感染させた。細胞変性効果の明らかな徴候に際して、細胞を穏やかにフラッシングすることによってディッシュの表面から細胞を剥がし、馴化培地中での細胞の粉砕によって懸濁した。ウイルスは凍結融解によって細胞から放出された。次に、レオウイルスバッチはテーブルトップ遠心分離機中で2000rpm10分間の遠心分離によって清澄化された。このバッチを再び使用してU118MG−scFvHIS細胞を感染させ、感染4日後に細胞を採取した。この手順を6回繰り返した。選択スキームを図14中に略述する。連続的増殖に際して、細胞変性効果の徴候は、911細胞から単離したレオウイルスT3Dにより感染した細胞よりも、911−S1HIS細胞から採取されたレオウイルスT3Dにより最初に感染したU118MG−scFvHISにおいてより明らかであった。これは、U119MG−scFvHIS細胞でウイルスを増殖できるかもしれないことを示唆した。911−S1HIS細胞で増殖されたレオウイルスに感染させたU118MG−scFvHIS細胞およびその連続継代のタンパク質溶解物のウエスタン分析は、溶解物におけるHISタグS1タンパク質の存在を実証した(図15)。
【0101】
HISタグS1ゲノムセグメントの存在を実証するために、継代7で連続的に継代したレオウイルスT3Dから単離したRNAについて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)解析を実行した。ウイルスに連続的に感染させたU118MG−scFvHIS細胞における細胞変性効果の徴候に際して、ストラタジーン社からのアブソルートリーRNAミニプレップキットを使用して細胞からRNAを単離した。1細胞株あたり600ngのRNAを、HisRevプライマー(マニュアルに従って1反応あたり2pmole)を使用して、スーパースクリプトII(インビトロゲン社)によるファーストストランド合成で使用した。2μlのcDNAをHisRevおよびReoS1N1のプライマーの組合せによる増幅のために使用して、S1ゲノムセグメントの完全なコード領域を増幅した。Taqポリメラーゼ(プロメガ社)を増幅のために使用して、以下のサイクルからなるスキームを行なった:3分95℃、(30秒95℃−40秒58℃−80秒72℃)×30−10分72℃−10分4℃−終了。結果を図16中に図示する。HISタグS1産物はU118MG−scFvHISにおいて容易に検出されたが、未修飾911細胞由来レオウイルスT3Dにより感染されたU118MG−scFvHIS細胞においてはシグナルは明らかではない。PCR産物は、製造者の使用説明書に従ってプラスミドpCRII−TOPO(インビトロゲン社)中にクローン化した。挿入された断片を有するクローンを個別に増やし、これらのクローンから単離したプラスミドDNAをそれぞれM13リバースプライマーおよびM123フォワードプライマーによるDNA配列解析のために使用した。クローン化されたPCR産物の配列解析から、σ1のコーディングのC末端の予想される位置でHISタグについてのコドンの存在が確認された。4つの異なるS1HIS cDNAクローンによってコードされたσ−1タンパク質のアミノ酸配列は、図17中に表わされる。親配列(図3からの)は上部列において表わされ、σ1−His(クローン化された)と表記される。クローンのRT5およびRT6のアミノ酸配列は親クローンと同一であるが、RT8およびRT10はそれぞれ1つおよび2つのアミノ酸の違いを有する。それにもかかわらず、HISタグは、すべての事例においてσ1のカルボキシル末端に予想通りに結合される。
【0102】
これらのデータから、911 S1HIS細胞での増殖に際して、レオウイルスT3DがHISタグについてのコドンを獲得したと結論する。これは、親野生型親S1ゲノムセグメントと異種S1 RNAとの間の再集合プロセスの結果である可能性が最も高い。しかしながら、組換えなどの他の機構、または複製の間の鋳型スイッチングは、これまで得られたデータに基づいて除外することができない。
【0103】
連続的に増殖させたウイルスは未修飾U118MG細胞に感染することができず、形質導入は、サロゲート受容体として働く細胞上のscFv−HISタンパク質に厳密に依存することが実証される。
【0104】
総合すれば、本データは、再標的化されたレオウイルスの生成は、レオウイルスS1ゲノムセグメントに組み込まれているポリアデニル化されたmRNAを含むレオウイルスを細胞で増殖させることによって比較的容易に行なえることを示す。細胞において発現されたmRNAは一本鎖であり、S1ゲノムセグメントのプラス鎖RNA全体を含む。しかしながら、異種S1 mRNAは、5'末端の真のS1ゲノムセグメントの位置またはその付近で開始するが、3'末端は有意に伸長され、IRES配列、NEO遺伝子、B型肝炎ウイルス(HBV)由来転写後調節エレメント(PRE)、およびヒト免疫不全ウイルスタイプ1(HIV−I)長末端反復の一部を含む。S1ゲノムセグメントのプラス鎖上の3'伸長の存在が、再標的化変異の獲得を妨害しないことは明らかである。
【0105】
参考文献リスト
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
(d)レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(e)前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(f)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、前記レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む、前記方法。
【請求項2】
前記レオウイルス科に属するウイルスが、オルトレオウイルス種、オルビウイルス種、ロタウイルス種またはコルティウイルス種である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記レオウイルスゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントを修飾する、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
1種以上の前記二本鎖RNAゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ゲノムによってコードされた1種以上のウイルス成分を修飾する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記1種以上のウイルス成分が、構造成分および/または非構造成分である、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記レオウイルスゲノムを、1種以上の異種核酸配列を含むように修飾する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記異種核酸配列が、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードする、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞に導入される前記核酸が、RNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に含まれる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記RNAポリメラーゼII依存性転写カセットが、レンチウイルスベクターである、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
(d)レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(e)前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(f)修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの前記修飾成分を含む、前記方法。
【請求項12】
レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)のσ−1(S1)カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
(a)修飾T3DのS1タンパク質をコードするcDNAを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
(d)前記細胞にT3Dウイルスを感染させる工程、及び
(e)修飾S1タンパク質を有する修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾S1カプシドタンパク質を有する前記修飾T3Dウイルスが、工程(b)で使用されるT3Dウイルスと比較して、前記修飾S1カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む、前記方法。
【請求項13】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルス。
【請求項14】
修飾レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)であって、カルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含む修飾S1カプシドタンパク質を含む、前記ウイルス。
【請求項15】
修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)請求項13もしくは14に記載のレオウイルスまたは請求項1〜12の方法のいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、前記修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
(b)修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含む、前記方法。
【請求項16】
前記修飾レオウイルスが、カルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含むように修飾されたS1カプシドタンパク質を含むT3Dレオウイルスであり、さらに細胞の前記部分が、前記修飾S1カプシドタンパク質の前記少なくとも1つのヒスチジン残基を結合することができる、請求項15に記載の方法。
【請求項17】
前記修飾レオウイルスが、カプシドタンパク質に対する1種以上の付加の修飾をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記付加の修飾が、レオウイルスT3DのS1タンパク質のアミノ酸Asn369〜Glu384に対する修飾を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
癌などの疾患の治療における請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法によって増殖されたウイルスの使用。
【請求項20】
修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、S1タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを、ヒスチジン結合部分と、前記少なくとも1つのヒスチジン残基と前記ヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項21】
レオウイルス科のメンバーによって引き起こされるかまたはレオウイルス科のメンバーが寄与する疾患の予防のためのワクチンの調製における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【請求項22】
細胞増殖及び分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【請求項1】
レオウイルス科に属するウイルスのゲノムを修飾する方法であって、
(d)レオウイルスゲノムの修飾部分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(e)前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(f)修飾ウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
前記修飾ウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、前記レオウイルスゲノムの修飾部分を含む修飾ゲノムを含む、前記方法。
【請求項2】
前記レオウイルス科に属するウイルスが、オルトレオウイルス種、オルビウイルス種、ロタウイルス種またはコルティウイルス種である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記レオウイルスゲノムを含む1種以上の二本鎖RNAゲノムセグメントを修飾する、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
1種以上の前記二本鎖RNAゲノムセグメントの一部分又は複数部分を修飾する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ゲノムによってコードされた1種以上のウイルス成分を修飾する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記1種以上のウイルス成分が、構造成分および/または非構造成分である、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記レオウイルスゲノムを、1種以上の異種核酸配列を含むように修飾する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記異種核酸配列が、細胞死もしくはアポトーシスを誘導するか、または1種以上の細胞過程を阻害もしくは抑制し得る化合物をコードする、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞に導入される前記核酸が、RNAポリメラーゼII依存性転写カセット内に含まれる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記RNAポリメラーゼII依存性転写カセットが、レンチウイルスベクターである、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
レオウイルス科に属するウイルスの細胞指向性を修飾する方法であって、
(d)レオウイルスの修飾成分をコードする核酸を細胞に導入する工程、
(e)前記細胞にレオウイルスを感染させる工程、及び
(f)修飾された細胞指向性の修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾された指向性の前記修飾レオウイルスが、工程(b)で使用されるレオウイルスと比較して、レオウイルスの前記修飾成分を含む、前記方法。
【請求項12】
レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)のσ−1(S1)カプシドタンパク質を修飾する方法であって、
(a)修飾T3DのS1タンパク質をコードするcDNAを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入する工程、
(d)前記細胞にT3Dウイルスを感染させる工程、及び
(e)修飾S1タンパク質を有する修飾T3Dウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含み、
修飾S1カプシドタンパク質を有する前記修飾T3Dウイルスが、工程(b)で使用されるT3Dウイルスと比較して、前記修飾S1カプシドタンパク質をコードする修飾ゲノムを更に含む、前記方法。
【請求項13】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって産生されたレオウイルス科に属する修飾ウイルス。
【請求項14】
修飾レオウイルスタイプ3、ディアリング株(T3D)であって、カルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含む修飾S1カプシドタンパク質を含む、前記ウイルス。
【請求項15】
修飾レオウイルスを増殖する方法であって、
(a)請求項13もしくは14に記載のレオウイルスまたは請求項1〜12の方法のいずれかに従って修飾されたレオウイルスを、前記修飾レオウイルスと結合または相互作用することができる部分を含む細胞と、修飾レオウイルスによる細胞の感染を許容する条件下で接触させる工程、及び
(b)修飾レオウイルスの産生を誘導する条件下で、前記細胞を維持する工程を含む、前記方法。
【請求項16】
前記修飾レオウイルスが、カルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を含むように修飾されたS1カプシドタンパク質を含むT3Dレオウイルスであり、さらに細胞の前記部分が、前記修飾S1カプシドタンパク質の前記少なくとも1つのヒスチジン残基を結合することができる、請求項15に記載の方法。
【請求項17】
前記修飾レオウイルスが、カプシドタンパク質に対する1種以上の付加の修飾をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記付加の修飾が、レオウイルスT3DのS1タンパク質のアミノ酸Asn369〜Glu384に対する修飾を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
癌などの疾患の治療における請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法によって増殖されたウイルスの使用。
【請求項20】
修飾レオウイルス粒子を単離する方法であって、S1タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも1つのヒスチジン残基を有する修飾レオウイルスを、ヒスチジン結合部分と、前記少なくとも1つのヒスチジン残基と前記ヒスチジン結合部分との間の結合を許容する条件下で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項21】
レオウイルス科のメンバーによって引き起こされるかまたはレオウイルス科のメンバーが寄与する疾患の予防のためのワクチンの調製における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【請求項22】
細胞増殖及び分化障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生された修飾レオウイルスの使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【公表番号】特表2011−500049(P2011−500049A)
【公表日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−529468(P2010−529468)
【出願日】平成20年10月16日(2008.10.16)
【国際出願番号】PCT/IB2008/002758
【国際公開番号】WO2009/050573
【国際公開日】平成21年4月23日(2009.4.23)
【出願人】(510110507)アカデミッシュ ジーケンハイス レイデン アー/ユー レイデン ウニ メディカル セーテーエル (1)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【国際特許分類】
【出願日】平成20年10月16日(2008.10.16)
【国際出願番号】PCT/IB2008/002758
【国際公開番号】WO2009/050573
【国際公開日】平成21年4月23日(2009.4.23)
【出願人】(510110507)アカデミッシュ ジーケンハイス レイデン アー/ユー レイデン ウニ メディカル セーテーエル (1)
【Fターム(参考)】
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