ウイルス検査方法、及び、モデル動物
【課題】デングウイルスのワクチン及び治療薬を開発するために好適なウイルス検査方法を提供する。
【解決手段】マーモセット科のサルにデングウイルスを接種する接種工程と、前記サルの血液、尿などからデングウイルスを検出する検出工程とを有するデングウイルスの検出方法、及びデングウイルスを増殖するのに好適なモデル動物に関する。検出行程はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む。
【解決手段】マーモセット科のサルにデングウイルスを接種する接種工程と、前記サルの血液、尿などからデングウイルスを検出する検出工程とを有するデングウイルスの検出方法、及びデングウイルスを増殖するのに好適なモデル動物に関する。検出行程はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デングウイルスの検査方法及びモデル動物に関する。より詳しくは、デングウイルスをマーモセット科のサルに感染させ、該サルの尿、血液等から検出されたデングウイルスを検査する方法、及び、デングウイルスを増殖するのに好適なモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するウイルスである。デングウイルスは、世界の熱帯及び亜熱帯地域全体に広範に分布しており、媒介動物である蚊によりヒトに伝染する。ヒトはデングウイルスに最も感受性が高い宿主であり、デングウイルスはヒトにおいてデング熱・デング出血熱等を引き起こす。熱帯・亜熱帯地域においては、年間約２０００万人のデングウイルス感染者が発生しており、特に出血熱・ショック症候群をきたすと致死的である。
【０００３】
日本においても、海外渡航者の増加に伴い、海外渡航中にデングウイルスに感染し、帰国後に発病する輸入例が年間５０例以上報告されており、診断されずに見逃されている例もかなりの数におよんでいると考えられる。２００５年には７４の輸入症例及び１の死亡例が報告され、近年デングウイルス感染者は増大していることから深刻な問題となっている。
【０００４】
デングウイルスには、１型から４型までの４つの血清型が存在し、初期型と異なる型のデングウイルスに感染したときには出血熱・ショック症状などの重篤な症状を呈する。これは、初感染時に生成された抗デングウイルス抗体が異なる型のウイルス自体を増強する、いわゆるＡＤＥ（Antibody-Dependent Enhancement）がウイルス増殖促進や病態悪化の一因となることが知られている。このため、感染発症を目的としたワクチン接種により誘導された抗デングウイルス抗体が、むしろ病態の増悪化をきたす可能性が危惧されている。
【０００５】
かかる事情の下、ワクチンの臨床応用に当たっては、まず動物モデルを用いた前臨床試験において、その有効性や安全性を充分評価することが求められている。また、発症の機序を明らかにすることにより、病態解明及び治療法の確立が求められている。
【０００６】
従来のモデル動物として、旧世界ザルのオナガザル科マカク属に属するアカゲザルを利用したものがある（例えば、特許文献１、２参照）。また、マウスを利用したものがある（例えば、特許文献３参照）。さらに、新世界ザルのオマキザル科ヨザル属に属するサルを利用したものがある（例えば、非特許文献１参照）。
【特許文献１】特表２００２−５４０１６９
【特許文献２】特表２００５−５３２０４４
【特許文献３】特表２００７−５２４３５０
【非特許文献１】Vaccine 24, p.1427-1432 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１及び２並びに非特許文献１に開示されている構成では、ヒトと同様の免疫機構を有する霊長類を用いた感染モデルであることからワクチン評価系として理想的であるが、個体内でのデングウイルス増殖が非常に低レベルであること、またヒトで見られるような病態を示さないことが問題となっている。
【０００８】
また、特許文献３に開示されている構成では、ヒト臍帯血細胞や骨髄幹細胞を移植したヒト免疫システムとは異なる免疫不全マウスを利用しているため、有効性や安全性の評価には問題がある。
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、デングウイルスのワクチン及び治療薬を開発するために好適なウイルス検査方法を提供することを目的とする。また、本発明は、デングウイルスの感染及び増殖に好適なモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るウイルス検査方法は、
マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種する接種工程と、
前記サルから前記デングウイルスを検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。
【００１１】
前記サルは、コモンマーモセット、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリンのいずれかである、ことも可能である。
【００１２】
前記接種工程は、前記サルの皮下、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、又は、経皮のうち少なくともいずれか１つを経由させて接種する、ことも可能である。
【００１３】
前記検出工程は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む、ことも可能である。
【００１４】
前記デングウイルスの血清型は１型から４型のいずれかである、ことも可能である。
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係るマーモセット科に属するモデル動物は、
デングウイルスが皮下に接種され、当該デングウイルスを増殖させる、
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ワクチン及び治療薬を開発するために、モデル動物においてデングウイルスを検査することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の実施形態に係るウイルス検査方法について説明する。本発明は、新世界ザルのマーモセット科に属するコモンマーモセット（モデル動物）にデングウイルスを接種し、該コモンマーモセットの血液等からデングウイルスを検出する方法である。接種されたデングウイルスは当該サルの体内で増殖され、血液等から検出される。デングウイルスには、１型から４型（ＤＥＮ−１からＤＥＮ−４）のすべての血清型が含まれる。
【００１８】
まず、マーモセット科に属するサルが用意される。当該サルにウイルスを接種する前に、血液を採取し、血液検査（例えば、ＣＢＣ（Complete Blood Count）、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等）を行うことにより、サルが正常状態であることを確認する。また、ウイルス抗体検出方法である後述するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ（Immunoglobulin G - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法に用いる基準となる抗体量を測定する。
【００１９】
次に、サルにデングウイルスを接種する方法について説明する。デングウイルスを含有する溶液を注射によりサルの皮下に投与する。デングウイルスは蚊を媒介として伝染するため、デングウイルスの接種は、好ましくは、サルの血液に行う。デングウイルスの力価は、１．０×１０５ＰＦＵ／ｍｌから１．０×１０９ＰＦＵ／ｍｌであり、好ましくは、１．０×１０６ＰＦＵ／ｍｌから１．０×１０８ＰＦＵ／ｍｌである。また、接種する溶液量は、０．０１ｍｌから１０ｍｌであり、好ましくは、０．５ｍｌから１ｍｌである。当該溶液は、例えば、生理食塩水、麻酔液等、任意の溶媒・溶液を含有することができる。なお、ウイルスの汚染やコンタミネーションを防止するための方法は、従来と同様である。
【００２０】
次に、デングウイルスを検出する方法について説明する。検出方法には、ウイルス遺伝子の検出を行う遺伝子検査法（病原学的検査法）と、ウイルス感染後に体内で産生される抗体を検出する抗体価測定法（血清学的検査法）とがある。デングウイルスに感染したか否かの判断基準は、遺伝子検査法によりデングウイルスの特異的遺伝子が検出されること、又は、抗体価測定法によりデングウイルスの特異的抗体が認められること、若しくは、回復期のウイルス抗体価が急性期のウイルス抗体価の４倍以上の上昇が認められることである。さらに、平常時に比べ体温が上昇すること等が含まれる。
【００２１】
まず、遺伝子検査法であるＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction）法について説明する（国立感染症研究所 デングウイルス感染症診断マニュアル、衛生微生物技術協議会第２６回研究会資料（デング熱／デング出血熱））。
【００２２】
まず、血液、血清及び尿からＲＮＡを抽出する方法を示す。抽出したＲＮＡを逆転写によってｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡに対してＰＣＲ法を行うことにより、ＤＮＡを増幅させる。ここで、血清は、血液（全血）を凝固させ血小板や凝固因子を除いたものである。
【００２３】
デングウイルスを接種した被検体（サル）から血液、血清又は尿のサンプルを採取する。当該サンプル５０μｌにＲＮＡ抽出薬ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（和光純薬社）２００μｌを加える。攪拌機で当該サンプルを撹拌する。クロロフォルム４０μｌを当該サンプルに加え、攪拌機で激しく撹拌する。４℃の下、遠心分離器により１２０００ｒｐｍ以上で、１０分間遠心する。上清１５０μｌを採取し、当該上清にイソプロパノール１５０μｌを加え、軽くかき混ぜて室温で５分間放置する。４℃の下、遠心分離器により１２０００ｒｐｍ以上で、１０分間遠心する。上清を捨てる。ペレットを約３００μｌの７５％エタノールで洗浄する。４℃の下、遠心分離器により７５００ｒｐｍで６分間遠心する。上清を捨て、室温で５分から６分間乾燥する。純水（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ−ｎｏｎｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ、０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒｅｄ Ｈ２Ｏ）５０μｌで再浮遊する。再浮遊したサンプルを−８０度で保存する。
【００２４】
次に、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ ５μｌと、リボヌクレアーゼ インヒビタ（宝酒造社）１００Ｕとを混合する。当該混合液を５００μｌのチューブに５μｌずつ分注する。分注した混合液５μｌに、当該サンプル５μｌを加え、精製ＲＮＡ１０μｌとする。泡を立てないようにピペッティングして、ＲＴ−ＰＣＲ ｍｉｘ（純水８０μｌ、ｄＮＴＰ１μｌ（２０ｍＭ）、プライマＳ１μｌ（１００ｐＭ）、プライマＣ１μｌ（１００ｐＭ）、１０倍希釈のバッファ（トリス−塩酸１００ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍＭ、塩化カルシウム８００ｍＭ、ビストリメチルシリルアセトアミド（ＢＳＡ）５ｍｇ／ｍｌ、１％コール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）１０μｌ、逆転写酵素ＲＴａｓｅ（ライフサイエンス社）０．５μｌ（１０Ｕ）、ＴＴＨ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡社 ＴＴＨ−１０４）０．５μｌ（４Ｕ）を含む）９０μｌを当該精製ＲＮＡに添加して、攪拌機で撹拌する。
【００２５】
サーマルシーケンサ（ABI Prism 7000）を用いて、当該溶液について次のＲＴ及びＰＣＲ反応を行う。４８℃の下、３０分間、ＲＮＡを逆転写する。９５℃の下、６００秒間、２本鎖ＤＮＡ断片を熱変性する。５７℃の下、６０秒間、熱変性により生じた１本鎖鋳型ＤＮＡにプライマをアニーリングおよび相補鎖ＤＮＡを合成する。熱変性、アニーリング・合成の２つの工程を１サイクルとして、４０サイクル繰り返す。７２℃の下、３００秒間、ＤＮＡを増幅する。反応産生物５μｌをアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅されたＤＮＡ断片のバンドを確認することにより、デングウイルスの特異的遺伝子を検出する。
【００２６】
次に、抗体価測定法であるＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法について説明する。デングウイルス感染後の体内で産生されるＩｇＧ抗体を検出することによりデングウイルスの感染を検出することができる。検査キットであるＤｅｎｇｕｅ ＩｇＧ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＰａｎＢｉｏ社）の使用方法を説明する（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ−ＤＥＮ０１Ｇ）。
【００２７】
まず、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、３つのカットオフキャリブレータが用意される。血清１０μｌに血清希釈液１０００μｌを加え、ウェルを撹拌する。または、血清１０μｌに血清希釈液９０μｌを加え、当該希釈した血清２０μｌに血清希釈液１８０μｌを加え、ウェルを撹拌することも可能である。サンプル、２つのコントロール及び３つのカットオフキャリブレータ１００μｌを各ウェルにピペットする。プレートをカバーして、３７℃において３０分間、培養する。希釈バッファにより６回洗浄する。抗ヒトＩｇＧを反応させたＨＲＰ（HorseRadish Peroxidase）１００μｌを各ウェルにピペットする。プレートをカバーして、３７℃において３０分間、培養する。希釈バッファにより６回洗浄する。発色剤ＴＭＢ（Tetra Methyl Benzidine）１００μｌを各ウェルにピペットする。室温で１０分間、培養する。全てのウェルの反応を中止させる。６００ｎｍから６５０ｎｍの基準フィルタを用いて、波長４５０ｎｍにおいて、各ウェルの吸光度を測定する。得られた吸光度よりＩｇＧ抗体量を測定する。なお、ウイルス接種前の基準値を１として正規化を行い、１．５をカットオフ値とする。
【００２８】
また、当該検査キットを使用しないデングウイルスの抗体検出方法について説明する。
蔗糖密度勾配法により濃縮精製したウイルス抗原をコートした９６穴プレートに血清希釈液（０．１％ＢＳＡ、界面活性剤０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（東京化成工業社製）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）を含む）１００μｌを各ウェルに入れて、室温で５分間、反応させる。血清希釈液で１００倍に希釈した血清を各ウェルに入れ、室温で９０分間、培養する。希釈液を用いてプレートを６回洗浄する。抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させたＨＲＰを１００００倍に希釈し、当該ＨＲＰ１００μｌを各ウェルにピペットする。室温で６０分間、反応させる。希釈液でプレートを４回洗浄する。発色剤ＴＭＢ１００μｌを各ウェルにピペットする。遮光下で１０分間、反応させる。硫酸を添加し、反応を停止させる。波長４５０ｎｍにおいて、吸光度を測定する。ＨＩ（Hemagglutination Inhibition）抗体陰性血清の吸光度の平均値＋３標準偏差の吸光度をカットオフとして、ＨＩ抗体養成検体を評価する。なお、ウイルス接種前の基準値を１として正規化を行い、１．５をカットオフ値とする。
【００２９】
以上説明したように、マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種し、該サルの血液等からデングウイルスを検出することにより、ワクチン及び治療薬を開発するためのウイルス検査を行うことができる。
【００３０】
なお、本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。
【００３１】
マーモセット科に属するサル（モデル動物）は、コモンマーモセットに限定されず、例えば、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリン等、任意である。
また、マーモセット科は、マーモセット属、ピグミーマーモセット属、ライオンタマリン属、タマリン属、ゲルディモンキー属から構成されるため、ゲルディモンキー属に属するサルも含まれる。
【００３２】
デングウイルスを接種する箇所は、皮下に限定されず、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、経皮等、任意である。
【００３３】
接種方法は、注射に限定されず、噴霧、塗布等、任意である。また、接種工程において、血清型の異なるデングウイルスを混合したものをマーモセットに接種することもできる。
【００３４】
接種回数は、１回に限定されず、複数回とすることもできる。また、複数回接種するときには、当初接種した血清型とは異なる血清型のデングウイルスを接種することもできる。
【００３５】
デングウイルスの検出工程には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等に限定されず、サルの体温（発熱）検査法、尿（血尿を含む）及び臓器の肉眼検査法等も含まれる。
【００３６】
抗体検査キットは、Ｄｅｎｇｕｅ ＩｇＧ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキットに限定されず、任意である。
【００３７】
抗体価測定法において、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＨＩ抗体及び中和抗体を検出することにより、デングウイルスの感染を検出することもできる。
【００３８】
サルに接種する溶液量、及びサルから採取する血液等の量は、サルの個体サイズに応じて任意である。また、デングウイルスの検出方法において記載した濃度、容量、温度、反応時間等は、一例であり、適宜変更することができる。
【実施例】
【００３９】
マーモセット科に属するサルであるコモンマーモセットにデングウイルスを接種した実施例を説明する。
【００４０】
（実施例１）
従来のモデル動物であるオナガザル科に属するカニクイザルとマーモセット科に属するマーモセットとにおいて、デングウイルスの複製、免疫原性及び防御効力等を評価した。
【００４１】
力価６．７×１０７ＰＦＵ／ｍｌのデングウイルス２型を２匹のカニクイザルと１匹のコモンマーモセットに０．５ｍｌずつ皮下注射した。デングウイルスを接種した日を０日目とし、１４日目までサルを毎日観察し、適宜採血及び採尿を行った。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法により検出した血清中のウイルス量（ｃｏｐｙ／ｍｌ）を表１に示す。なお、以下に示す表中の「ＮＴ（Not Tested）」はウイルス検査を実施しなかったことを示し、「−」はウイルスを検出できなかったことを示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
カニクイザルと比較して、マーモセットの血清中から数百から数千倍高いウイルスを検出した。マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。
【００４５】
（実施例２）
マーモセットにおいて、血清型の異なるデングウイルス１型から４型（ＤＥＮ−１からＤＥＮ−４）の複製、免疫原性及び防御効力を評価した。デングウイルスの接種方法、検出方法等は、実施例１と同様である。
【００４６】
１型から４型のデングウイルスをマーモセットに接種した。接種したデングウイルスの力価と接種量を表２に示す。
【表２】
【００４７】
表２に示すデングウイルス１型から４型をマーモセットに接種した後、採取した血清中のウイルス量を表３に示す。また、尿中のウイルス量を表４に示す。さらに、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ法により血清中から検出されたＩｇＧ抗体量を表５に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
表３から５に示すように、マーモセットはすべての血清型のデングウイルスに感染し、マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。
【００５２】
また、５日目に採取した尿を図１に示す。肉眼検査において、デングウイルス２型を接種したマーモセットに血尿を確認した。マーモセットがヒトに近似した病態（血尿）を呈することを実証した。
【００５３】
さらに、１４日目に４匹すべてのマーモセットを解剖し、肝臓、腎臓、脾臓、腋下リンパ節、鼠径リンパ節から採取した細胞についてＰＣＲ検査を行った。
【００５４】
デングウイルス１型を接種したマーモセットの腋下リンパ節、２型を接種したマーモセットの脾臓及び鼠径リンパ節、並びに、３型を接種したマーモセットの腎臓の各細胞からデングウイルスを検出した。また、肉眼検査では、２型を接種したマーモセットの腎臓について、退色変化と表面の凹凸を確認した。
【００５５】
（実施例３）
デングウイルス３型を接種したマーモセットをコントロールとして、４匹のマーモセットにデングウイルス２型を接種した。デングウイルスの接種方法、検出方法等は、実施例１と同様である。また、接種したデングウイルスの力価及び摂取量は、実施例２と同様である。
【００５６】
各マーモセットにデングウイルスを接種した後、採取した血清中のウイルス量を表６に示す。また、尿中のウイルス量を表７に示す。さらに、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ法により血清中から検出されたＩｇＧ抗体量を表８に示す。
【００５７】
また、デングウイルス２型を接種したマーモセットを順次解剖した。マーモセットの臓器別のウイルス量（ｃｏｐｙ／１００μｌ）を表９に示す。なお、以下の表中の斜線部はマーモセットを解剖したことにより、解剖以後のウイルス検査を実施しなかったことを示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
【表７】
【００６０】
【表８】
【００６１】
【表９】
【００６２】
表６から８に示すように、マーモセットはデングウイルスに感染し、マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。また、表９に示すように、マーモセットの各臓器からデングウイルスを検出した。
【００６３】
以上に示すように、マーモセットはデングウイルスの感染及び増殖に好適なモデル動物であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】デングウイルスを接種したマーモセットから採取した尿を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デングウイルスの検査方法及びモデル動物に関する。より詳しくは、デングウイルスをマーモセット科のサルに感染させ、該サルの尿、血液等から検出されたデングウイルスを検査する方法、及び、デングウイルスを増殖するのに好適なモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するウイルスである。デングウイルスは、世界の熱帯及び亜熱帯地域全体に広範に分布しており、媒介動物である蚊によりヒトに伝染する。ヒトはデングウイルスに最も感受性が高い宿主であり、デングウイルスはヒトにおいてデング熱・デング出血熱等を引き起こす。熱帯・亜熱帯地域においては、年間約２０００万人のデングウイルス感染者が発生しており、特に出血熱・ショック症候群をきたすと致死的である。
【０００３】
日本においても、海外渡航者の増加に伴い、海外渡航中にデングウイルスに感染し、帰国後に発病する輸入例が年間５０例以上報告されており、診断されずに見逃されている例もかなりの数におよんでいると考えられる。２００５年には７４の輸入症例及び１の死亡例が報告され、近年デングウイルス感染者は増大していることから深刻な問題となっている。
【０００４】
デングウイルスには、１型から４型までの４つの血清型が存在し、初期型と異なる型のデングウイルスに感染したときには出血熱・ショック症状などの重篤な症状を呈する。これは、初感染時に生成された抗デングウイルス抗体が異なる型のウイルス自体を増強する、いわゆるＡＤＥ（Antibody-Dependent Enhancement）がウイルス増殖促進や病態悪化の一因となることが知られている。このため、感染発症を目的としたワクチン接種により誘導された抗デングウイルス抗体が、むしろ病態の増悪化をきたす可能性が危惧されている。
【０００５】
かかる事情の下、ワクチンの臨床応用に当たっては、まず動物モデルを用いた前臨床試験において、その有効性や安全性を充分評価することが求められている。また、発症の機序を明らかにすることにより、病態解明及び治療法の確立が求められている。
【０００６】
従来のモデル動物として、旧世界ザルのオナガザル科マカク属に属するアカゲザルを利用したものがある（例えば、特許文献１、２参照）。また、マウスを利用したものがある（例えば、特許文献３参照）。さらに、新世界ザルのオマキザル科ヨザル属に属するサルを利用したものがある（例えば、非特許文献１参照）。
【特許文献１】特表２００２−５４０１６９
【特許文献２】特表２００５−５３２０４４
【特許文献３】特表２００７−５２４３５０
【非特許文献１】Vaccine 24, p.1427-1432 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１及び２並びに非特許文献１に開示されている構成では、ヒトと同様の免疫機構を有する霊長類を用いた感染モデルであることからワクチン評価系として理想的であるが、個体内でのデングウイルス増殖が非常に低レベルであること、またヒトで見られるような病態を示さないことが問題となっている。
【０００８】
また、特許文献３に開示されている構成では、ヒト臍帯血細胞や骨髄幹細胞を移植したヒト免疫システムとは異なる免疫不全マウスを利用しているため、有効性や安全性の評価には問題がある。
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、デングウイルスのワクチン及び治療薬を開発するために好適なウイルス検査方法を提供することを目的とする。また、本発明は、デングウイルスの感染及び増殖に好適なモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るウイルス検査方法は、
マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種する接種工程と、
前記サルから前記デングウイルスを検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。
【００１１】
前記サルは、コモンマーモセット、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリンのいずれかである、ことも可能である。
【００１２】
前記接種工程は、前記サルの皮下、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、又は、経皮のうち少なくともいずれか１つを経由させて接種する、ことも可能である。
【００１３】
前記検出工程は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む、ことも可能である。
【００１４】
前記デングウイルスの血清型は１型から４型のいずれかである、ことも可能である。
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係るマーモセット科に属するモデル動物は、
デングウイルスが皮下に接種され、当該デングウイルスを増殖させる、
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ワクチン及び治療薬を開発するために、モデル動物においてデングウイルスを検査することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の実施形態に係るウイルス検査方法について説明する。本発明は、新世界ザルのマーモセット科に属するコモンマーモセット（モデル動物）にデングウイルスを接種し、該コモンマーモセットの血液等からデングウイルスを検出する方法である。接種されたデングウイルスは当該サルの体内で増殖され、血液等から検出される。デングウイルスには、１型から４型（ＤＥＮ−１からＤＥＮ−４）のすべての血清型が含まれる。
【００１８】
まず、マーモセット科に属するサルが用意される。当該サルにウイルスを接種する前に、血液を採取し、血液検査（例えば、ＣＢＣ（Complete Blood Count）、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等）を行うことにより、サルが正常状態であることを確認する。また、ウイルス抗体検出方法である後述するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ（Immunoglobulin G - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法に用いる基準となる抗体量を測定する。
【００１９】
次に、サルにデングウイルスを接種する方法について説明する。デングウイルスを含有する溶液を注射によりサルの皮下に投与する。デングウイルスは蚊を媒介として伝染するため、デングウイルスの接種は、好ましくは、サルの血液に行う。デングウイルスの力価は、１．０×１０５ＰＦＵ／ｍｌから１．０×１０９ＰＦＵ／ｍｌであり、好ましくは、１．０×１０６ＰＦＵ／ｍｌから１．０×１０８ＰＦＵ／ｍｌである。また、接種する溶液量は、０．０１ｍｌから１０ｍｌであり、好ましくは、０．５ｍｌから１ｍｌである。当該溶液は、例えば、生理食塩水、麻酔液等、任意の溶媒・溶液を含有することができる。なお、ウイルスの汚染やコンタミネーションを防止するための方法は、従来と同様である。
【００２０】
次に、デングウイルスを検出する方法について説明する。検出方法には、ウイルス遺伝子の検出を行う遺伝子検査法（病原学的検査法）と、ウイルス感染後に体内で産生される抗体を検出する抗体価測定法（血清学的検査法）とがある。デングウイルスに感染したか否かの判断基準は、遺伝子検査法によりデングウイルスの特異的遺伝子が検出されること、又は、抗体価測定法によりデングウイルスの特異的抗体が認められること、若しくは、回復期のウイルス抗体価が急性期のウイルス抗体価の４倍以上の上昇が認められることである。さらに、平常時に比べ体温が上昇すること等が含まれる。
【００２１】
まず、遺伝子検査法であるＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction）法について説明する（国立感染症研究所 デングウイルス感染症診断マニュアル、衛生微生物技術協議会第２６回研究会資料（デング熱／デング出血熱））。
【００２２】
まず、血液、血清及び尿からＲＮＡを抽出する方法を示す。抽出したＲＮＡを逆転写によってｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡに対してＰＣＲ法を行うことにより、ＤＮＡを増幅させる。ここで、血清は、血液（全血）を凝固させ血小板や凝固因子を除いたものである。
【００２３】
デングウイルスを接種した被検体（サル）から血液、血清又は尿のサンプルを採取する。当該サンプル５０μｌにＲＮＡ抽出薬ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（和光純薬社）２００μｌを加える。攪拌機で当該サンプルを撹拌する。クロロフォルム４０μｌを当該サンプルに加え、攪拌機で激しく撹拌する。４℃の下、遠心分離器により１２０００ｒｐｍ以上で、１０分間遠心する。上清１５０μｌを採取し、当該上清にイソプロパノール１５０μｌを加え、軽くかき混ぜて室温で５分間放置する。４℃の下、遠心分離器により１２０００ｒｐｍ以上で、１０分間遠心する。上清を捨てる。ペレットを約３００μｌの７５％エタノールで洗浄する。４℃の下、遠心分離器により７５００ｒｐｍで６分間遠心する。上清を捨て、室温で５分から６分間乾燥する。純水（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ−ｎｏｎｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ、０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒｅｄ Ｈ２Ｏ）５０μｌで再浮遊する。再浮遊したサンプルを−８０度で保存する。
【００２４】
次に、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ ５μｌと、リボヌクレアーゼ インヒビタ（宝酒造社）１００Ｕとを混合する。当該混合液を５００μｌのチューブに５μｌずつ分注する。分注した混合液５μｌに、当該サンプル５μｌを加え、精製ＲＮＡ１０μｌとする。泡を立てないようにピペッティングして、ＲＴ−ＰＣＲ ｍｉｘ（純水８０μｌ、ｄＮＴＰ１μｌ（２０ｍＭ）、プライマＳ１μｌ（１００ｐＭ）、プライマＣ１μｌ（１００ｐＭ）、１０倍希釈のバッファ（トリス−塩酸１００ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍＭ、塩化カルシウム８００ｍＭ、ビストリメチルシリルアセトアミド（ＢＳＡ）５ｍｇ／ｍｌ、１％コール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）１０μｌ、逆転写酵素ＲＴａｓｅ（ライフサイエンス社）０．５μｌ（１０Ｕ）、ＴＴＨ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡社 ＴＴＨ−１０４）０．５μｌ（４Ｕ）を含む）９０μｌを当該精製ＲＮＡに添加して、攪拌機で撹拌する。
【００２５】
サーマルシーケンサ（ABI Prism 7000）を用いて、当該溶液について次のＲＴ及びＰＣＲ反応を行う。４８℃の下、３０分間、ＲＮＡを逆転写する。９５℃の下、６００秒間、２本鎖ＤＮＡ断片を熱変性する。５７℃の下、６０秒間、熱変性により生じた１本鎖鋳型ＤＮＡにプライマをアニーリングおよび相補鎖ＤＮＡを合成する。熱変性、アニーリング・合成の２つの工程を１サイクルとして、４０サイクル繰り返す。７２℃の下、３００秒間、ＤＮＡを増幅する。反応産生物５μｌをアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅されたＤＮＡ断片のバンドを確認することにより、デングウイルスの特異的遺伝子を検出する。
【００２６】
次に、抗体価測定法であるＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法について説明する。デングウイルス感染後の体内で産生されるＩｇＧ抗体を検出することによりデングウイルスの感染を検出することができる。検査キットであるＤｅｎｇｕｅ ＩｇＧ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＰａｎＢｉｏ社）の使用方法を説明する（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ−ＤＥＮ０１Ｇ）。
【００２７】
まず、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、３つのカットオフキャリブレータが用意される。血清１０μｌに血清希釈液１０００μｌを加え、ウェルを撹拌する。または、血清１０μｌに血清希釈液９０μｌを加え、当該希釈した血清２０μｌに血清希釈液１８０μｌを加え、ウェルを撹拌することも可能である。サンプル、２つのコントロール及び３つのカットオフキャリブレータ１００μｌを各ウェルにピペットする。プレートをカバーして、３７℃において３０分間、培養する。希釈バッファにより６回洗浄する。抗ヒトＩｇＧを反応させたＨＲＰ（HorseRadish Peroxidase）１００μｌを各ウェルにピペットする。プレートをカバーして、３７℃において３０分間、培養する。希釈バッファにより６回洗浄する。発色剤ＴＭＢ（Tetra Methyl Benzidine）１００μｌを各ウェルにピペットする。室温で１０分間、培養する。全てのウェルの反応を中止させる。６００ｎｍから６５０ｎｍの基準フィルタを用いて、波長４５０ｎｍにおいて、各ウェルの吸光度を測定する。得られた吸光度よりＩｇＧ抗体量を測定する。なお、ウイルス接種前の基準値を１として正規化を行い、１．５をカットオフ値とする。
【００２８】
また、当該検査キットを使用しないデングウイルスの抗体検出方法について説明する。
蔗糖密度勾配法により濃縮精製したウイルス抗原をコートした９６穴プレートに血清希釈液（０．１％ＢＳＡ、界面活性剤０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（東京化成工業社製）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）を含む）１００μｌを各ウェルに入れて、室温で５分間、反応させる。血清希釈液で１００倍に希釈した血清を各ウェルに入れ、室温で９０分間、培養する。希釈液を用いてプレートを６回洗浄する。抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させたＨＲＰを１００００倍に希釈し、当該ＨＲＰ１００μｌを各ウェルにピペットする。室温で６０分間、反応させる。希釈液でプレートを４回洗浄する。発色剤ＴＭＢ１００μｌを各ウェルにピペットする。遮光下で１０分間、反応させる。硫酸を添加し、反応を停止させる。波長４５０ｎｍにおいて、吸光度を測定する。ＨＩ（Hemagglutination Inhibition）抗体陰性血清の吸光度の平均値＋３標準偏差の吸光度をカットオフとして、ＨＩ抗体養成検体を評価する。なお、ウイルス接種前の基準値を１として正規化を行い、１．５をカットオフ値とする。
【００２９】
以上説明したように、マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種し、該サルの血液等からデングウイルスを検出することにより、ワクチン及び治療薬を開発するためのウイルス検査を行うことができる。
【００３０】
なお、本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。
【００３１】
マーモセット科に属するサル（モデル動物）は、コモンマーモセットに限定されず、例えば、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリン等、任意である。
また、マーモセット科は、マーモセット属、ピグミーマーモセット属、ライオンタマリン属、タマリン属、ゲルディモンキー属から構成されるため、ゲルディモンキー属に属するサルも含まれる。
【００３２】
デングウイルスを接種する箇所は、皮下に限定されず、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、経皮等、任意である。
【００３３】
接種方法は、注射に限定されず、噴霧、塗布等、任意である。また、接種工程において、血清型の異なるデングウイルスを混合したものをマーモセットに接種することもできる。
【００３４】
接種回数は、１回に限定されず、複数回とすることもできる。また、複数回接種するときには、当初接種した血清型とは異なる血清型のデングウイルスを接種することもできる。
【００３５】
デングウイルスの検出工程には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等に限定されず、サルの体温（発熱）検査法、尿（血尿を含む）及び臓器の肉眼検査法等も含まれる。
【００３６】
抗体検査キットは、Ｄｅｎｇｕｅ ＩｇＧ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキットに限定されず、任意である。
【００３７】
抗体価測定法において、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＨＩ抗体及び中和抗体を検出することにより、デングウイルスの感染を検出することもできる。
【００３８】
サルに接種する溶液量、及びサルから採取する血液等の量は、サルの個体サイズに応じて任意である。また、デングウイルスの検出方法において記載した濃度、容量、温度、反応時間等は、一例であり、適宜変更することができる。
【実施例】
【００３９】
マーモセット科に属するサルであるコモンマーモセットにデングウイルスを接種した実施例を説明する。
【００４０】
（実施例１）
従来のモデル動物であるオナガザル科に属するカニクイザルとマーモセット科に属するマーモセットとにおいて、デングウイルスの複製、免疫原性及び防御効力等を評価した。
【００４１】
力価６．７×１０７ＰＦＵ／ｍｌのデングウイルス２型を２匹のカニクイザルと１匹のコモンマーモセットに０．５ｍｌずつ皮下注射した。デングウイルスを接種した日を０日目とし、１４日目までサルを毎日観察し、適宜採血及び採尿を行った。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法により検出した血清中のウイルス量（ｃｏｐｙ／ｍｌ）を表１に示す。なお、以下に示す表中の「ＮＴ（Not Tested）」はウイルス検査を実施しなかったことを示し、「−」はウイルスを検出できなかったことを示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
カニクイザルと比較して、マーモセットの血清中から数百から数千倍高いウイルスを検出した。マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。
【００４５】
（実施例２）
マーモセットにおいて、血清型の異なるデングウイルス１型から４型（ＤＥＮ−１からＤＥＮ−４）の複製、免疫原性及び防御効力を評価した。デングウイルスの接種方法、検出方法等は、実施例１と同様である。
【００４６】
１型から４型のデングウイルスをマーモセットに接種した。接種したデングウイルスの力価と接種量を表２に示す。
【表２】
【００４７】
表２に示すデングウイルス１型から４型をマーモセットに接種した後、採取した血清中のウイルス量を表３に示す。また、尿中のウイルス量を表４に示す。さらに、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ法により血清中から検出されたＩｇＧ抗体量を表５に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
表３から５に示すように、マーモセットはすべての血清型のデングウイルスに感染し、マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。
【００５２】
また、５日目に採取した尿を図１に示す。肉眼検査において、デングウイルス２型を接種したマーモセットに血尿を確認した。マーモセットがヒトに近似した病態（血尿）を呈することを実証した。
【００５３】
さらに、１４日目に４匹すべてのマーモセットを解剖し、肝臓、腎臓、脾臓、腋下リンパ節、鼠径リンパ節から採取した細胞についてＰＣＲ検査を行った。
【００５４】
デングウイルス１型を接種したマーモセットの腋下リンパ節、２型を接種したマーモセットの脾臓及び鼠径リンパ節、並びに、３型を接種したマーモセットの腎臓の各細胞からデングウイルスを検出した。また、肉眼検査では、２型を接種したマーモセットの腎臓について、退色変化と表面の凹凸を確認した。
【００５５】
（実施例３）
デングウイルス３型を接種したマーモセットをコントロールとして、４匹のマーモセットにデングウイルス２型を接種した。デングウイルスの接種方法、検出方法等は、実施例１と同様である。また、接種したデングウイルスの力価及び摂取量は、実施例２と同様である。
【００５６】
各マーモセットにデングウイルスを接種した後、採取した血清中のウイルス量を表６に示す。また、尿中のウイルス量を表７に示す。さらに、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ法により血清中から検出されたＩｇＧ抗体量を表８に示す。
【００５７】
また、デングウイルス２型を接種したマーモセットを順次解剖した。マーモセットの臓器別のウイルス量（ｃｏｐｙ／１００μｌ）を表９に示す。なお、以下の表中の斜線部はマーモセットを解剖したことにより、解剖以後のウイルス検査を実施しなかったことを示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
【表７】
【００６０】
【表８】
【００６１】
【表９】
【００６２】
表６から８に示すように、マーモセットはデングウイルスに感染し、マーモセットの体内でデングウイルスが増殖することを実証した。また、表９に示すように、マーモセットの各臓器からデングウイルスを検出した。
【００６３】
以上に示すように、マーモセットはデングウイルスの感染及び増殖に好適なモデル動物であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】デングウイルスを接種したマーモセットから採取した尿を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種する接種工程と、
前記サルから前記デングウイルスを検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とするウイルス検査方法。
【請求項２】
前記サルは、コモンマーモセット、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリンのいずれかである、
ことを特徴とする請求項１に記載のウイルス検査方法。
【請求項３】
前記接種工程は、前記サルの皮下、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、又は、経皮のうち少なくともいずれか１つを経由させて接種する、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス検査方法。
【請求項４】
前記検出工程は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む、
ことを特徴とする請求項１、２又は３に記載のウイルス検査方法。
【請求項５】
前記デングウイルスの血清型は１型から４型のいずれかである、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のウイルス検査方法。
【請求項６】
デングウイルスが皮下に接種され、当該デングウイルスを増殖させる、
ことを特徴とするマーモセット科に属するモデル動物。
【請求項１】
マーモセット科に属するサルにデングウイルスを接種する接種工程と、
前記サルから前記デングウイルスを検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とするウイルス検査方法。
【請求項２】
前記サルは、コモンマーモセット、シルバーマーモセット、シロミミマーモセット、キアタママーモセット、シロガオマーモセット、シロカタマーモセット、クロミミマーモセット、サンタレムマーモセット、ピグミーマーモセット、ワタボウシタマリン、セマダラタマリン、ミダスタマリン、クロクビタマリン、クチヒゲタマリン、シロクチタマリン、エンペラータマリン、ハゲタマリン、ムネアカタマリン、ライオンタマリン、キンクロライオンタマリン、キンゴシライオンタマリンのいずれかである、
ことを特徴とする請求項１に記載のウイルス検査方法。
【請求項３】
前記接種工程は、前記サルの皮下、非経口、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、バッカル、舌下、鼻腔内、又は、経皮のうち少なくともいずれか１つを経由させて接種する、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス検査方法。
【請求項４】
前記検出工程は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウイルス感染価測定法、プラーク形成法、ＰＡＰ（Peroxidase Anti-Peroxidase）法、ＩｇＭ捕捉ＥＬＩＳＡ法、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法、又は、中和抗体価測定法のうち少なくともいずれかの１つの方法を含む、
ことを特徴とする請求項１、２又は３に記載のウイルス検査方法。
【請求項５】
前記デングウイルスの血清型は１型から４型のいずれかである、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のウイルス検査方法。
【請求項６】
デングウイルスが皮下に接種され、当該デングウイルスを増殖させる、
ことを特徴とするマーモセット科に属するモデル動物。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１８９３２７（Ｐ２００９−１８９３２７Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３５１７８（Ｐ２００８−３５１７８）
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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