エストロゲンレセプターモジュレーターおよびそれらの使用
本開示は、細胞性腫瘍形成および癌生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、エストロゲン応答性細胞型における腫瘍形成および癌に関する。この細胞型としては、例えば、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織、乳腺組織、脳組織、骨格筋組織、および肺組織が挙げられる。本開示はさらに、ポリペプチドを含む組成物、オリゴペプチドを含む組成物、ペプチド模倣物を含む組成物、抗体を含む組成物、および核酸を含む組成物、ならびに、エストロゲン応答性細胞型における腫瘍形成の診断または処置において有用である薬学的組成物、診断キット、および治療キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、薬剤および腫瘍治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、エストロゲンレセプターの調節、およびホルモン依存性腫瘍の処置において有効である薬学的組成物に関する。
【０００２】
（関連出願の援用）
本出願は、２００３年８月２６日に出願された仮出願第６０／４９８，１１８号の優先権の利益を主張する。
【０００３】
（連邦政府により後援された研究または開発に関する陳述）
本発明は、全体または一部が、アメリカ国立衛生研究所助成金第９−７１５０７４１号および第ＲＯ１ ＣＡ０９５６８１号によって支援された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
核ホルモンレセプター（ＮＲ）は、リガンド依存性の様式で遺伝子発現を調節する転写因子の大きなファミリーを構成する。ＮＲは、脊椎動物発生において重要な役割を果たし、かつ、このＮＲは、広範囲の細胞応答（例えば、分化、増殖、および恒常性）に関連付けられている（非特許文献１；非特許文献２）。現在、ＮＲスーパーファミリーは、３つのサブファミリーに分かれる。タイプＩは、ステロイドホルモンレセプター（例えば、エストロゲンレセプター、プロゲスチンレセプター、アンドロゲンレセプター、またはグルココルチコイドレセプター）を包含する。タイプＩＩは、非ステロイドホルモンレセプター（例えば、レチノイン酸レセプター、甲状腺ホルモンレセプター、およびビタミンＤレセプター）を包含する。タイプＩＩＩは、現在、十分に特徴づけられたリガントを有さないオーファンレセプターを包含する（非特許文献３）。
【０００５】
ＮＲは、Ｎ末端リガンド非依存性転写活性化機能ドメイン１（ＡＦ１）、ＮＲを特異的なＤＮＡモチーフに標的化させる高度に保存されたＤＮＡ結合中央ドメイン（ＤＢＤ）、Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、およびＣ末端リガンド依存転写活性化機能ドメイン（ＡＦ２）を含む、いくつかの構造的特徴を共有する（非特許文献３；非特許文献４）。ホルモン結合がＮＲに結合することが、コンフォメーションの変化を誘発し、ＮＲを標的遺伝子のプロモーターのうちの応答エレメントに結合させる。ＮＲのＬＢＤは、配列が多様であり、これはリガンドの多様性を説明するが、類似する全体的三次元構造を共有する（非特許文献３）。ＡＦ２は、種々のＮＲ間で高度に保存されるが、ＡＦ１は、保存されない（非特許文献２）。
【０００６】
ＮＲの転写活性は、ホルモンのみならず、いくつかの調節コアクチベーター、および調節コリプレッサーによって影響される（非特許文献３；非特許文献５）。そのコアクチベーターは、通常は、ＤＮＡに結合しないが、ＮＲとのタンパク質間相互作用を介して標的遺伝子のプロモーターへ補充される（非特許文献６）。ｐ１６０ファミリーは、十分に研究されたＮＲコアクチベーターファミリーであり、このファミリーは、ステロイドレセプターコアクチベーターＳＲＣ１、グルココルチコイドレセプター相互作用タンパク質ＧＲＩＰ１／ＴＩＦ２、およびグルココルチコイドレセプター相互作用タンパク質Ｐ／ＣＩＰ（ＡＩＢ１、ＴＲＡＭ１、またはＲＡＣ３としても公知である）を包含する（非特許文献７）。第二のコアクチベーターファミリーは、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ＣＢＰ、およびｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ｐ３００を包含する（非特許文献８）。コリプレッサーの中で、核レセプターコリプレッサー（ＮｃｏＲ）、ならびにレチノイ酸および甲状腺レセプターのためのサイレンシングメディエーター（ＳＭＲＴ）は、甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、およびビタミンＤレセプターと、リガンド非存在下で、正常に反応する遺伝子の転写サイレンシングにおいて広く特徴づけられかつ関連づけられている（非特許文献３）。コレプレッサーは、アンダゴニストで占められたＮＲと優先的に結合することが示されている（非特許文献９）。ＮＲのコアクチベーターとコレプレッサーの両方として作用し得る少数の二機能性コレギュレーターもまた報告されており、これには、マウスのジンクフィンガータンパク質（アポトーシスおよび細胞周期停止のレギュレーター）（ＺＡＣ１）（非特許文献９）、ＮＲ結合セットドメイン含有タンパク質（ＮＳＤ１）（非特許文献１０）、ならびにＲＩＰ１４０（非特許文献１１）が挙げられる。
【０００７】
証拠は、コアクチベーターと、ＮＲと、転写レギュレーターとを含む多タンパク質複合体が、ホルモン結合に応答して集まり、そして、転写を活性化することを示唆する（非特許文献３）。研究者はまた、組織型および細胞型に特異的な応答をホルモンが誘発する分子機構、ならびに関与するコアクチベータータンパク質の組成を、活発的に研究している。コアクチベーターの構造分析は、コレギュレーターのリガンドＮＲ複合体との結合を仲介するのに十分である５アミノ酸ＬＸＸＬＬ（Ｘは任意のアミノ酸）からなるモチーフを同定した（非特許文献１３）。コアクチベーターＳＲＣ１、コアクチベーターＣＢＰ、およびコアクチベーターｐ３００は、固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し（非特許文献１４）、一方で、ＮｃｏＲおよびＳＭＲＴは、ヒストンデアセチラーゼおよびｍＳｉｎ３Ａと関連する（非特許文献１５）。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性およびヒストンデアセチラーゼ活性と、コレギュレーターとの関連は、コレギュレーター機能の潜在的機構をクロマチン構造の調節が構成することを示唆する（非特許文献２）。遺伝子の転写調節における別の機構は、コレギュレーターのリン酸化に関与する（非特許文献１６）。
【０００８】
ステロイドホルモン１７β−エストラジオール（Ｅ２）は、発生、恒常性、心血管系の調節、骨密度の決定、および乳癌の進行を含む、幅広い生物学プロセスに関与する遺伝子の発現を調節する重要な役割を果たす（非特許文献１７）。エストロゲンの生物学的効果は、エストロゲンが、構造的かつ機能的に異なるエストロゲンレセプター（ＥＲαおよびＥＲβ）に結合することによって仲介される。ＥＲαは、乳房上皮にある主要なＥＲである（非特許文献１８）。他のステロイドレセプターと同様に、ＥＲαは、Ｎ末端ＡＦ１、ＤＢＤ、およびＡＦ２ドメインを含むＣ末端ＬＢＤを含む（非特許文献１９）。Ｅ２とＥＲαが結合することで、リガンド活性化ＥＲαは、核へトランスロケートし、標的遺伝子の１３塩基対のパリンドロームエストロゲン応答エンハンサーエレメント（ＥＲＥ）と結合し、そして、遺伝子の転写を刺激し、その結果、乳癌細胞の増殖は促進される（非特許文献２０）。エストロゲンの種々の機能のうちのいくつかは、Ｅ２−ＥＲ複合体へのコレギュレーターの差次的な補充に依存する。ＥＲの転写機能は、ＳＲＣ１、ＧＲＩＰ１、ＡＩＢ１、ＣＢＰ／ｐ３００、ＴＩＦ１、ＰＧＣ１、およびＤＡＸ１を含むいくつかのコレギュレーターによって影響され得る（非特許文献３；非特許文献２１；非特許文献２２）。コレギュレーターの構造についてはよく知られているが、発生、ホルモン調節、および癌の進行におけるコレギュレータータンパク質の生理学的な役割については、ほとんど知られていない。
【０００９】
抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーターは、それらの拮抗性特質および抗エストロゲン性特質に大きく起因して、ホルモン依存性腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害することが示されている。しかしながら、抗エストロゲン治療に応答する多くの患者は、最終的には、この治療に対する耐性を発生し、ホルモン非依存性となる。乳癌における進行および最終的な耐性（ホルモン依存性からホルモン非依存性へ）に関与する機構としては、ＥＲ改変体またはＥＲ変異体の発現、ＥＲのリガンド非依存性活性化、より低濃度のエストロゲンに対する腫瘍の順応、およびＥＲコレギュレーターの薬理学的な変化が挙げられると考えられる。
【００１０】
プロリン、グルタミン酸、およびロイシンリッチタンパク質１（ＰＥＬＰ１）は、ＮＲのコレギュレーターのファミリーの一員として最近同定された（非特許文献２３、本明細書中にその全体が参考として援用される）。このＰＥＬＰ１ポリペプチドは、その名前が示唆しているように、プロリン、グルタミン酸、およびロイシンといったアミノ酸が異常に豊富である。ＰＥＬＰ１のＮ末端領域は、９つのＬＸＸＬＬモチーフを有する（同書）。ＬＸＸＬＬモチーフは、ＮＲとのリガンド依存性コアクチベーター結合を仲介することが示された。ＰＥＬＰ１はさらに、アミノ酸４９５〜４９８の中央に位置するコンセンサス核局在化モチーフによって特徴づけられる（同書、また非特許文献２４も参照のこと）。中央核局在化モチーフに隣接しているのは、３つのジンクフィンガーを潜在的に形成する２つのシステインリッチ領域である（同書）。ＰＥＬＰ１のＣ末端領域は、２つのプロリンリッチＣ末端領域（３１％プロリン（アミノ酸７５１〜８７０）、２３％プロリン（アミノ酸９７０〜１１３０））を含み、このＣ末端領域は、転写活性化ドメインを構成する（同書）。酸性アミノ酸が豊富な領域が、これら２つのプロリンリッチ領域の間に位置する（同書）。ＰＥＬＰ１はまた、いくつかのコンセンサスリン酸化部位を含む（同書）。ＰＥＬＰ１は、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織、乳腺組織、脳組織、骨格筋組織、および肺組織を含む種々のエストロゲン応答組織中で差次的に発現される（同書）。さらに、ＰＥＬＰ１の増加した発現は、乳癌細胞に加えて、卵巣腫瘍および子宮腫瘍中でも生じる。
【００１１】
ＰＥＬＰ１は、リガンド依存性コアクチベーターとしてＥＲ経路において能動的に関与する。ＰＥＬＰ１は、ＥＲαアイソフォームおよびＥＲβアイソフォームの両方のコアクチベーターとして、相互作用しかつ機能する。ＥＲ経路は、乳癌腫瘍形成の進行と関連付けられており、そして、ＥＲ経路のコレギュレーターは、腫瘍進行において一定の役割を果たす。ＰＥＬＰ１の発現は、ＥＲ−Ｅ２複合体の転写活性を増強する。ＰＥＬＰ１はまた、乳房腫瘍細胞において過剰発現する。これは、ＰＥＬＰ１が、ホルモン依存性癌におけるエストロゲンおよび抗エストロゲンの応答を調節する核シグナル伝達経路（具体的には、エストロゲンレセプター経路）に影響を与えることを示唆している。さらに、転写調節のためのＥＲ応答エレメントへのＰＥＬＰ１補充は、ホルモン依存性であり、このことは、ＰＥＬＰ１の過剰発現がエストロゲンレベルに対して細胞を過剰感作することを示す。低下したホルモンレベルに対するこのＰＥＬＰ１誘導過剰感作は、癌細胞中におけるホルモン耐性を導く一つの機構である。この過剰感作のブロックは、ホルモン耐性癌における腫瘍形成を遅らすかまたは止めるための強固な機構を提供する。
【００１２】
さらなる研究が、細胞周期の進行においてのＲＥＬＰ１の関与が実証した（非特許文献２５）。具体的には、乳癌細胞におけるＰＥＬＰ１過剰発現は、エストラジオールシグナル伝達に対して乳癌細胞を過剰感作し、乳癌細胞における細胞周期のＳ期への促進された進行を導く。細胞周期中の、乳癌細胞におけるこの増加した進行は、細胞周期におけるＰＥＬＰ１媒介性過剰リン酸化が、タンパク質を細胞芽腫（ｐＲｂ）へと転換することに関係付けられた。細胞芽腫のリン酸化は、細胞周期の進行において重要な役割を果たし、かつ、増加したｐＲｂのリン酸化が、Ｇ１期からＳ期への細胞の進行を導くことが当該分野において周知である。さらに、ＰＥＬＰ１とｐＲｂとの間での相互作用はまた、サイクリンＤ１（多数の乳癌において調節不全であることが公知であるタンパク質）の発現を増加する。細胞周期中の、癌細胞における増加した進行のブロックはまた、腫瘍形成の進行を遅らすかまたは止めるための所望される標的を提供する。
【００１３】
現在、種々の選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）は、乳癌の処置において用いられる。しかしながら、ＳＥＲＭの不利益の一つは、非標的組織中のこれらモジュレーターの化合物の部分的なアゴニスト作用である。例えば、タモキシフェン（最も一般的に処方されているＳＥＲＭ）は、乳癌の処置において非常に効果的であるがまた、子宮内膜腫瘍への刺激を与えてしまう。細胞型に関係なくエストロゲン応答をブロックし得る効果的な治療が必要である。
【００１４】
さらなる研究は、ＰＥＬＰ１のＮ末端領域におけるいくつかのＥＲ相互作用部位へと、ＥＲとのＰＥＬＰ１相互作用を位置決めした。活性化ドメインが欠けているＰＥＬＰ１の発現か、または、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用の妨害は、子宮内膜細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト応答をブロックする。従って、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用の妨害は、腫瘍形成を遅らすかまたは止めるさらなる標的を提供し、一方で、非標的組織における伝統的なＳＥＲＭの部分的なアゴニスト作用をうまく減らす。
【００１５】
ＥＲシグナル伝達経路および細胞周期の両方におけるＰＥＬＰ１の役割は、ＲＥＬＰ１を、このような治療のための望ましい標的にする。ＰＥＬＰ１活性の調節またはブロックは、乳腺組織、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織を含む種々のエストロゲン応答組織における腫瘍形成の進行を阻害する強固な機構を提供する。加えて、ＰＥＬＰ１活性を阻害することは、従来の抗エストロゲン化合物とは異なり、組織型に関係なくエストロゲン応答をブロックする可能性が高い。ＰＥＬＰ１活性はまた、診断ツールとして、腫瘍中のホルモン過敏性マーカーとして用いられ得る。
【非特許文献１】Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，７５７−７６０ （１９９９）
【非特許文献２】Ｘｕ，Ｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９，１４０−１４７（１９９９）
【非特許文献３】ＭｃＫｅｎｎａ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０，３２１−３４４（１９９９）
【非特許文献４】Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３，４５１−４８６（１９９４）
【非特許文献５】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９，２２２−２３２（１９９７）
【非特許文献６】Ｍａ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，６１６４−６１７３（１９９９）
【非特許文献７】Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０，３７３−３８３（１９９８）
【非特許文献８】Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８３，９９−１０３（１９９６）
【非特許文献９】Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１３６９−１３７８（１９９８）
【非特許文献１０】Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍ．およびＳｔａｌｌｃｕｐ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，１８５５−１８６７（２０００）
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇ，Ｎ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３３９８−３４１２（１９９８）
【非特許文献１２】Ｃａｖａｉｌｌｅｓ，Ｖ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４，８７４１−３７５１（１９９５）
【非特許文献１３】Ｈｅｅｒｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８７，７３３−７３６（１９９７）
【非特許文献１４】Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｔ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８９，１９４−１９８（１９９７）
【非特許文献１５】Ｎａｇｙ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ８９，３７３−３８０（１９９７）
【非特許文献１６】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１２１−１４１（２０００）
【非特許文献１７】Ｃｏｕｓｅ，Ｊ．Ｆ．およびＫｏｒａｃｈ，Ｋ．Ｓ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０，３５８−４１７（１９９９）
【非特許文献１８】Ｗａｒｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１１，２４９−２５４（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ５１，９４１−９５１（１９８７）
【非特許文献２０】Ｄｕｂｉｋ，Ｄ．およびＳｈｉｕ，Ｒ．Ｐ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１２７０５−１２７０８（１９８８）
【非特許文献２１】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３９８５５−３９８５９（２０００）
【非特許文献２２】Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６３０２−１６３０８（２０００）
【非特許文献２３】Ｖａｄｌａｍｕｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４１）：３８２７２−３８２７９（２００１）
【非特許文献２４】Ｃｈｅｌｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２４８７−２４９２（１９８９）
【非特許文献２５】Ｓｅｔｈａｒａｍａｎ Ｂ．およびＶａｄｌａｍｕｄｉ，Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２２１１８−２２１２７（２００３）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本開示は、腫瘍細胞におけるＰＥＬＰ１の変化または調節に関連するいくつかの驚くべき発見に起因する。第一に、ＰＥＬＰ１のＣ末端領域からのアミノ酸の欠失（配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）；配列番号３（ＰＥＬＰ１のＣ末端領域）；および配列番号１４（Ｃ末端欠失ＰＥＬＰ１変異体（ＰＥＬＰ１−Ｈ１））
は、腫瘍細胞におけるエストロゲン応答をブロックし、結果として、腫瘍形成および細胞周期の進行が減少された。第二に、エストロゲンレセプターとのＰＥＬＰ１の相互作用は、ＰＥＬＰ１タンパク質のＮ末端領域（配列番号５（ＰＥＬＰ１のＮ末端領域））中に位置するいくつかのＥＲ相互作用部位に位置決めされた。ＰＥＬＰ１とＥＲとの間の相互作用を妨害することは、子宮内膜細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト応答をブロックする。従って、ＰＥＬＰ１活性の妨害は、エストロゲン応答細胞型（例えば、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織、乳腺組織、脳組織、骨格筋組織、および肺組織のような細胞型が挙げられる）において腫瘍形成および癌の進行を遅らすかまたは止める、ならびに、非標的組織におけるＳＥＲＭの部分的なアゴニスト作用を減少する治療活性についての新規経路を提供する。
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、一つ以上のポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物を含む組成物に関連し、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）およびそれらの改変体が挙げられるが、限定はされない。本発明に従うポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、天然供給源からの単離、原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞における組換え体の産出、または化学合成を含む、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る。
【００１８】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、発現を促進する状況下で宿主細胞を培養し、そしてその培養培地からそのポリペプチドまたはオリゴペプチドを回収することによって、生成される。原核生物細胞または真核生物細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞）におけるこれらのポリペプチドまたはオリゴペプチドの発現は、本発明によって包含される。他の実施形態において、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、当該分野において周知の方法を用いる化学合成によって生成される。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ＰＥＬＰ１の転写または翻訳を調節または妨害する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸を提供する。ｓｉＲＮＡは、代表的には、１００ｂｐ未満の長さであり、そして好ましくは、３０ｂｐ以下である。本発明に従うｓｉＲＮＡの例は、配列番号１６〜配列番号１９のうちのいずれかにて提供される。アンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡは、相補ＤＮＡ鎖の使用含む当該分野において公知の任意の方法によって、または化学合成を介して、作製され得る。
【００２０】
本発明の代替的な実施形態は、本明細書中に開示されたポリペプチドのうちのいずれかをコードする単離された核酸分子である。この単離された核酸の配列は、ＰＥＬＰ１遺伝子（配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１）もしくは配列番号１５（ＰＥＬＰ Ｈ１変異体））に由来する天然に存在する核酸配列、ＰＥＬＰ１遺伝子のＣ末端領域（配列番号４）に由来する天然に存在する核酸配列、ＰＥＬＰ１遺伝子のＮ末端領域（配列番号６）に由来する天然に存在する核酸配列、または、開示されたポリペプチドをコードするこのような配列の変化型であり、これらの核酸配列は、これらの配列に対して相補的な核酸を含む。一本鎖および二本鎖のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方が、本発明によって包含され、同様に、本発明の変性された二本鎖のＤＮＡ分子とハイブリダイズする核酸分子も包含される。さらに含まれるのは、核酸分子の変異誘発により誘導される単離された核酸分子である。この核酸分子は、
配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１遺伝子）、配列番号４（Ｃ末端領域）、配列番号６（Ｎ末端領域）、または配列番号１５（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体）のうちのいずれかの配列、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号１５のうちのいずれかの対立遺伝子改変体、および
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号１５のうちのいずれかの縮重改変体
を含む。本発明の核酸はまた、発現されるべき所望のアミノ酸コードに基づき化学的に合成され得る。
【００２１】
本発明に従う単離された核酸分子は、好ましくは、適切な宿主細胞内で上記ポリペプチドの発現を指向し得る発現ベクターを含むベクター中に含まれる。適切な宿主細胞とは、上記発現ベクターからの上記ポリペプチドの発現が生物学的に機能的なポリペプチドを生じる宿主細胞である。生物学的機能は、真核細胞発現、および特には哺乳動物細胞発現が好ましくなるような、上記ポリペプチドの適切な折り畳みおよび適切な構造安定性と関連付けられ得る。本発明における単離された核酸はまた、遺伝子を送達するために使用されるベクターまたは送達系が特定の細胞型を標的とし、そして標的細胞内での上記ポリペプチドの安定な発現を生じる、細胞特異的遺伝子治療組成物のうちに含まれ得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は、高い特異性でＰＥＬＰ１ポリペプチドと結合する抗体を提供する。抗体は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）のうちのいずれかに対して生成され得るか、あるいは、野生型エピトープおよび変異体エピトープ（例えば、配列番号７〜配列番号１３、および配列番号２０（ＰＥＬＰ１抗体生成エピトープ）として開示されるエピトープ）を含むエピトープコア領域を含む、より小さな構築物を含む任意の部分に対して生成され得る。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、ＰＥＬＰ１活性の潜在的なモジュレーターをスクリーニングする方法を包含する。スクリーニング方法の例は、
候補分子を提供する工程；
単離された化合物、細胞、または実験動物と候補分子とを混合する工程；
その化合物、細胞、または実験動物の一つ以上の特性を測定する工程；および
その一つ以上の特性に対するその候補分子の効果を測定する工程
を包含する。測定可能な特性としては、細胞増殖率、ＰＥＬＰ１局在化、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用、またはＰＥＬＰ１−クロマチン相互作用が挙げられるが、限定はされない。アッセイは、無細胞系、単離された細胞、または生物（トランスジェニック動物を含む）のうちで行われ得る。
【００２４】
本発明の特定の実施形態において、上記のポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ｓｉＲＮＡ、または抗体は、薬学的組成物を提供するための薬学的に受容可能なキャリアのうちに含まれるか、または、これらのキャリアと組み合わされる。上記活性化合物はまた、当業者によって有用であると認められた任意の経路（非経口経路または腹腔内経路を含む）により投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての上記活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性化剤と適切に混合された水中で、調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製され得る。通常の保存条件および使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ防腐剤、またはこの調製物に所望の特性を与える他の賦形剤を含む。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、エストロゲンレセプター経路に関連する障害（特に、癌）、およびエストロゲン受容性細胞における他の腫瘍形成障害の処置または診断のための治療キットまたは診断キットに関連する。このようなキットは、市販のために包装された一つ以上の治療成分または診断成分を含む。
【００２６】
（詳細な説明）
（ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチド模倣物）
ＰＥＬＰ１活性のブロックまたは妨害（特に、ヒストンＨ１とＰＥＬＰ１との結合、またはＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用のブロック）は、エストロゲン応答細胞型における腫瘍形成および癌の進行を遅らすかまたは止める治療活性についての新規経路を提供する。ＰＥＬＰ１活性は、ＰＥＬＰ１アミノ酸配列の一つ以上の部分（特に、Ｃ末端の２５３個のアミノ酸、またはＰＥＬＰ１ポリペプチドのＮ末端部分における種々のＥＲ相互作用領域の一つ）に相当する、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物の投与によって、妨害され得る。このようなポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）の全体または一部に対応する。
【００２７】
本発明の一つの実施形態は、ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る多様な形態でのポリペプチド、フラグメント、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物を一つ以上含む組成物に関連し、これらのポリペプチド、フラグメント、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、天然に生じるものか、または種々の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成に関する手順）を介して生成されるものを含む。このような形態としては、誘導体、改変体、およびオリゴマー、ならびに、融合タンパク質またはそれらのフラグメントが挙げられるが、限定はされない。
【００２８】
本発明のポリペプチド改変体は、実質的には天然形態と相同であるが、一つ以上の欠失、挿入、または置換があるため天然形態のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含む。所与のアミノ酸は、例えば、類似の生理化学的特性を有する残基で置換され得る。このような保存的置換の例としては、１個の脂肪族残基で別の残基を（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに）置換すること、１個の極性残基で別の残基を（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｎとＡｓｐとの間、またはＧｌｕとＡｓｎとの間で）置換すること、あるいは、１個の芳香族残基で別の残基を（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに）置換することが挙げられる。他の保存的置換（例えば、類似する疎水性特性を有する領域全体の置換に関与する）が、周知である。
【００２９】
本発明のペプチド模倣物は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）、あるいは、それらのフラグメントまたは改変体の一次構造、二次構造、または三次構造を模倣する。好ましいペプチド模倣物は、プロテアーゼ抵抗性である。本発明のペプチド模倣物としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴウレア、βペプチド、γペプチド、オリゴ（フェニレン、エチニレン）、ビニル性スルホノペプチド、およびポリＮ置換グリシン（ペプトイド）が挙げられる。本発明のペプチド模倣物は、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖ．２３），Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，Ｗ．Ｍ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に概要が述べられるような、当該分野において周知の技術を用いて設計され得、かつ化学的に合成され得る。
【００３０】
（核酸）
本発明の代替的な実施形態は、本明細書中に開示されるポリペプチド（配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号４（Ｃ末端領域）、配列番号６（Ｎ末端領域）、または配列番号１５（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体）を含む）、あるいは相補配列を含むそれらのフラグメントまたは改変体のうちのいずれかをコードする、単離された核酸分子である。単離された核酸配列は、ＰＥＬＰ１遺伝子のＮ末端領域またはＣ末端領域由来の天然に生じる核酸配列であり得るか、または、開示されたポリペプチドをコードするこのような配列の変形（遺伝コード中の重複性によって生じる改変体を含む）であり得る。あるいは、このような核酸は、発現される所望のアミノ酸コードに基づいて化学的に合成され得る。本発明に従う単離された核酸は、好ましくは、ベクター（適切な宿主細胞内で上記ポリペプチドの発現を指示し得る発現ベクターを含む）中に含まれる。本発明の単離された核酸はまた、細胞特異的遺伝子治療組成物のうちに含まれ得る。本発明に従う遺伝子治療は、ポリペプチドをコードする核酸を細胞に提供することを含む。このポリペプチドは、次いで、細胞の転写機構および翻訳機構によって合成され、同様に、発現構築物によって提供され得る任意のポリペプチドも合成される。アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、および他のインヒビターの提供において、上記方法はまた、阻害性構築物をコードする核酸を細胞に提供する。全てのこのような方法は、本明細書中において用語「遺伝子治療」の範囲内に包含される。
【００３１】
本発明にさらに含まれるのは、ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，１６：９４８−５８，２００２）を含む低分子干渉ＲＮＡを指し、このｓｉＲＮＡは、細胞中の特定の遺伝子の干渉そしておそらく転写後サイレンシングを引き起こし得る。ＲＮＡ干渉は、干渉ＲＮＡを生成する方法を含み、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−２９，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−９８，２００１；およびＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−１１，１９９８において記載されかつ議論されている。本発明のｓｉＲＮＡは、典型的に、長さ１００塩基対（ｂｐ）未満であり、そしてより好ましくは、長さ約２０ｂｐ〜３０ｂｐ以下である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１個〜６個のヌクレオチドリーダーまたはヌクレオチドテールを有する。ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る４つのｓｉＲＮＡが、単離された。これは、配列番号１６〜配列番号１９として含まれている。本発明のｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡ分子がＰＥＬＰ１遺伝子もしくはその転写物と相互作用する場合において、裸のオリゴヌクレオチド形態、センス核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子形態、ベクター形態で送達され得るか、または、当業者に公知の他の任意の方法で送達され得る。本発明のｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれかの相互作用は、ヒト細胞を含む哺乳類細胞において、転写後サイレンシングか、またはＰＥＬＰ１遺伝子の減少した活性を引き起こす。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、ＰＥＬＰ１遺伝子をコードする核酸、ＰＥＬＰ１遺伝子のモジュレーターをコードする核酸、またはそれらの有用なフラグメントをコードする核酸は、細胞のゲノム中に、安定に組み込まれ得る。なおさらなる実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして、細胞中に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞の周期とは独立してか、または同期化して、維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞にどのようにして送達されるか、および、その核酸が細胞中のどこで残存するのかは、用いられた発現構築物の型、および構築物が形質転換される細胞の型に依存する。当業者は、送達構築物ならびに細胞株および細胞型を、彼らの必要性を満たすために慣用的に選択し、そして、この当業者は、本発明の種々の実施形態で使うためにこのような系を容易に最適化し得る。
【００３３】
特定のウィルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に入り、そして、宿主細胞ゲノム中に組み込み、かつウィルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力は、そのウィルスを、外来遺伝子を哺乳類細胞内に移入するための魅力的な候補にする。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般に、ウィルス性ベクターである。
【００３４】
外来遺伝物質を受け入れ得るいくつかのウィルスは、これらのウイルスが感染する細胞の範囲で収容し得るヌクレオチドの数が限られるが、これらのウイルスは、遺伝子発現を首尾よくもたらすことが実証されている。アデノウィルスは、しかしながら、このウィルスの遺伝物質を宿主ゲノム中に組み込まないが、それ故、遺伝子発現のための宿主の複製を必要とにない。このことは、このウィルスを、迅速で効率的な異種遺伝子発現に理想的に適するようにする。複製欠陥性感染性ウィルスの調製技術は、当該分野において周知である。
【００３５】
当然、ウィルス性伝達系の使用において、当業者は、ビリオンを、望ましくない混入物を基本的に含まないようにするのに十分に精製して、ベクター構築物を受け取る細胞、哺乳動物、または個体において有害反応を何も生じないようにすることを望む（例えば、欠陥性干渉ウィルス性粒子またはエンドトキシン、および他の発熱物質）。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配（例えば、勾配塩化セシウム勾配遠心分離）の使用を含むが、当該分野において公知であるベクター精製のための任意の有効な手段が、使用され得る。
【００３６】
細胞に核酸を送達するさらなる方法としては、リポソーム媒介性トランスフェクションまたはレセプター媒介性トランスフェクションが挙げられる。本発明のさらなる実施形態において、発現構築物は、リポソーム内に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層および内側の水性媒体によって特徴付けられる、小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらのリポソームは、過剰の水溶液中にリン脂質を懸濁した場合に、自然に形成する。そのリン脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再配列を起こし、水を捕捉し、そして上記脂質二重層の間で溶質を溶解する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また企図されるのは、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と複合体化された発現構築物である。
【００３７】
開示された核酸構築物を標的細胞へ送達するために利用され得るなおさらなる発現構築物は、レセプター媒介性送達ビヒクルである。これらのレセプター媒介性送達ビヒクルは、上記標的細胞で生じるレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布を考慮すると、この送達方法は、本発明にさらなる程度の特異性を加える。特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子を含む。他のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、送達されるＤＮＡ構築物が可能に結合されている細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子導入のために用いられている。本発明の特定の局面において、上記リガンドは、エストロゲン応答性標的細胞（例えば、精巣細胞、卵巣組織細胞および子宮組織細胞、乳腺組織細胞、脳組織細胞、骨格筋組織細胞、および肺組織細胞）において特異的に発現されるレセプターに対応するように、選ばれる。
【００３８】
他の実施形態において、細胞特異的遺伝子標的化ビヒクルのＤＮＡ送達ビヒクル成分は、リポソームと組み合わせた特異的結合リガンドを含み得る。送達される核酸は、上記リポソーム内に収容され、そして、上記特異的結合リガンドは、リポソーム膜内へ機能的に取り込まれる。上記リポソームは、従って、上記標的細胞のレセプターに特異的に結合し、そして上記細胞に内容物を送達する。
【００３９】
（抗体）
特定の実施形態において、本発明は、高い特異性でＰＥＬＰ１ポリペプチドと結合する抗体を提供する。完全長のＮ末端領域またはＣ末端領域に対して生成された抗体に加えて、抗体はまた、エピトープコア領域（野生型エピトープおよび変異体エピトープを含む）を含むより小さい構築物に応答して生成され得る。このようなエピトープの一つの例は、配列番号２０として開示される。このエピトープは、ウサギにおけるＰＥＬＰ１に対する抗体を生成するために用いられている。さらなるエピトープは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列のうちのいずれかに由来し得る。さらに、上に記載されたポリペプチド、フラグメント、改変体、融合タンパク質がは、それらと免疫反応性である抗体を生成する際に、「免疫原」として利用され得る。一般に、単独のＩｇＧもしくはＩｇＭか、またはＩｇＧとＩｇＭの組み合わせが、好ましい。なぜなら、これらは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、そして、どの抗体型にも用いられ得るが、これらが実験環境で最も容易に作製されるからである。
【００４０】
これらの抗原性決定基またはエピトープは、直線状またはコンフォメーション（非連続）のいずれかである。直線状エピトープは、ＰＥＬＰ１ポリペプチドのアミノ酸の一部分から構成され、一方で、コンフォメーションエピトープまたは非連続エピトープは、タンパク質のフォールディングのときに近づく、ポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，ＪｒおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，第２版 １９９６））。エピトープは、当該分野において公知の方法のうちのいずれかによって同定され得る。
【００４１】
従って、本発明の一つの局面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。このようなエピトープは、以下により詳細に記載されるような抗体（特に、モノクローナル抗体）を惹起させるために有用である。加えて、本発明のポリペプチドからのエピトープは、研究試薬として、アッセイにおいて、物質から特異的結合抗体を（例えば、培養ハブリドーマからポリクローナル血清または上精を）精製するために、用いられ得る。このようなエピトープまたはそれらの改変体は、当該分野において周知の技術（例えば、固相合成、ポリペプチドの化学的切断もしくは酵素的切断）を用いてか、または組換えＤＮＡ技術を用いて、精製され得る。
【００４２】
本発明のポリペプチドのエピトープによって励起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、このようなエピトープが単離されていようと、またはそのポリペプチドの一部のままであろうとも、従来技術によって調製され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９９８）参照のこと。
【００４３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、一定の利点（例えば、再現性および大量生産）を有することが認められ、そして、それらモノクローナル抗体の使用は、一般に好ましい。従って、本発明は、ヒトのモノクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体、サルのモノクローナル抗体、ラットのモノクローナル抗体、ハムスターのモノクローナル抗体、ウサギのモノクローナル抗体、ニワトリのモノクローナル抗体、または当業者に公知な任意の他の種源のモノクローナル抗体を提供する。試薬の調製の容易さおよび入手しやすさに起因して、マウスのモノクローナル抗体が、しばしば好ましい。「ヒト化」抗体もまた、企図されるが、しかしながら、ヒトの定常領域ドメインもしくは可変領域ドメインを単独で有するか組み合わせて有するマウス、ラット、または他の種からのキメラ抗体、二重特異性抗体、組換え抗体および改変抗体、ならびにそれらのフラグメントもまた企図される。それらの抗体は、キメラ抗体、およびさらなる改変モノクローナル抗体の生成のための手順としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９、１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９）、ならびにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９，Ｍａｙ，１９９３）に記載された手順を含む。抗体を遺伝子組換え生成する手順は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、およびそれら優先権を主張する関連特許中に見出され得、これらすべては、本明細書中において参考として援用される。
【００４４】
抗体の抗原結合フラグメントは、従来技術によって生成され得、このフラグメントもまた、本発明によって包含される。このようなフラグメントの例としては、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢＳ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などが挙げられるが、限定はされない。遺伝子工学技術によって生成された抗体フラグメントおよび誘導体はまた、提供される。
【００４５】
本発明は、一般的にはモノクローナル型であるＰＥＬＰ１タンパク質、ＰＥＬＰ１ポリペプチド、またはＰＥＬＰ１ペプチドに対する抗体をさらに提供し、これらは、抗体結合体を形成するために一つ以上の他の因子と結合される。十分な選択性、特異性、および親和性の任意の抗体が、抗体結合体の基礎として利用され得る。このような特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法論を用いて評価され得る。
【００４６】
抗体結合体の特定の例は、その抗体が検出可能な標識に結合されている結合体である。「検出可能な標識」は、それらの化合物または要素の特定の機能的特性または化学的特徴に起因して検出され得る化合物または要素であり、それらの使用によって、それらが結合している抗体が検出され、必要に応じてさらに定量化されるが可能になる。別のこのような例は、細胞傷害性因子または抗細胞性因子（「免疫毒素」と呼ば得る）と結合した抗体を含む結合体の形成である。
【００４７】
抗体結合体は、従って、診断用因子として好ましい。抗体診断剤は、一般に、２つのクラス（インビトロ診断剤（例えば、種々の免疫測定法）における使用のため、およびインビボ診断プロトコル用のクラス（抗体指向画像化として一般に公知である））に当てはまる。
【００４８】
標的化合物のアクチベーターまたはインヒビターの構造を確認するために抗体を使用することもまた、可能である。このアプローチは、その後の薬物設計が基礎とし得るファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。抗イディオタイプ抗体を機能的で薬理学的に活性な抗体にすることによりタンパク質結晶学を全て回避することが、可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、もとの抗体のアナログであることが予期される。上記抗イディオタイプは、化学的または生物学的に生成されたポリペプチドの貯蔵源からポリペプチドを同定および単離するために用いられ得る。選択されたポリペプチドは、上記ファーマコアとして役立つ。抗イディオタイプは、抗原としての抗体を用いて、抗体を生成するために本明細書中に記載される方法を用いて生成され得る。
【００４９】
（薬剤）
本発明の特定の実施形態において、上記ポリペプチド、ペプチド模倣物、核酸、または抗体は、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれるか、またはそれらキャリアと組み合わされる。活性化合物はまた、当該分野に公知の任意の経路（非経口経路、腹腔内経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、舌下経路、吸入経路、経口経路などが挙げられる）によって投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての上記活性化合物の溶液は、界面活性化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で、調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。これらの調製物は、保存の間に微生物の増殖を防ぐ防腐剤をしばしば含む。有用かつ望ましいキャリアまたは賦形剤を単独でかまたは組み合わせて選択する方法は、当業者に周知である。
【００５０】
水溶液における非経口投与について、例えば、この溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、そして、液体希釈剤が、十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に、特に適している。この点について、利用され得る滅菌した水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、ある投薬量が、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして、１０００ｍＬの皮下注入液体に加えられる得るか、または提唱された注入部位に注射され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化は、処置される被験体の状態に依存して、必ず生じる。投与の担当者は、いずれにせよ、個々の被験体のための適切な投与量を決定する。
【００５１】
注入可能な使用に適切な薬学的形態としては、滅菌された水溶液または水性分散物、および、滅菌された注入可能な溶液または分散物の即時調製物のための滅菌された粉末が挙げられる。いかなる場合でも、上記形態は、滅菌されなければならず、かつ適切に液体状でなければならない。その形態は、製品条件および保存条件下において、安定でなければならない。そして、上記形態は、微生物（例えば、細菌および新菌）の混入に対して保護されなければならない。上記キャリアは、溶媒または分散媒体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む）であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合には必要粒径の維持によって、ならびに界面活性剤の使用によって維持され得る。本発明の微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって引き起こされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注入可能な組成物の長期に渡る吸収は、吸収を遅らす薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をその組成物中で使用することによって引き起こされ得る。
【００５２】
滅菌された注入可能な溶液は、上に列挙された種々の他の成分とともに、適切な溶媒中で上記活性化合物を必須量取り込むことによって調製され、必要に応じて、ろ過滅菌される。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、滅菌されたビヒクル（基本的な分散媒体、および上に列挙された成分からの他の必要成分を含む）中に取り込むことによって調製される。滅菌された注入可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥技術および凍結乾燥技術である。この技術は、以前に滅菌ろ過した溶液からのさらに望ましい成分を加えることによって、活性成分の粉末を産出する。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、ありとあらゆる溶媒分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。何らかの従来の媒体または因子が上記活性成分と不適合である範囲を除いて、治療組成物におけるそれらの使用が、企図される。補助活性成分もまた、上記組成物中に含まれ得る。
【００５４】
活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野において十分に理解される。典型的に、このような組成物は、注入可能な物質として調製され、溶液または液体懸濁分散物のいずれかとして調製される（注入前の液体中に溶液または懸濁物のために適した固体形態もまた、調製され得る）。上記調製物はまた、乳化され得る。
【００５５】
（スクリーニング）
本発明はまた、化合物がＰＥＬＰ１を調製する能力についての化合物のスクリーニングを企図する。スクリーニング方法は、無細胞系、単離された細胞、または生物（トランスジェニック動物を含む）において行われ得る。無細胞スクリーニング方法の例は、
候補遺伝子を提供する工程；
その候補分子を、単離された化合物、細胞、または実験動物と混合する工程；
その化合物、細胞、または実験動物の一つ以上の特性を測定する工程；および
その一つ以上の特性に対するその候補分子の効果を測定する工程
を包含する。測定可能な特性としては、細胞中の細胞増殖速度、ＰＥＬＰ１局在化、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用、またはＰＥＬＰ１−クロマチン相互作用が挙げられるが、限定はされない。
【００５６】
種々の細胞株が、単離された細胞アッセイのために用いられ得る。その細胞株としては、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞、ＭＤＡヒト乳癌細胞、ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞、およびＺＲ７５Ｒヒト乳癌細胞、ＳＡＯＳ−２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｕ２ＯＳ骨細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ子宮内膜細胞、ＲＬ ９５−２子宮内膜細胞、ＳＷ１７４８子宮内膜細胞、ＨＥＣ１Ａ子宮内膜細胞、ＨＥＣ１Ｂ子宮内膜細胞、ＨｅＬａ細胞が挙げられるが、限定はされない。またはこの目的のために特に操作された細胞（ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１細胞、ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ−ＰＥＬＰ１野生型細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ−ＰＥＬＰ１−ＨＩ変異細胞、もしくはＰＥＬＰ１−Ｔｅｔｏｎ野生型誘導性細胞、ＰＥＬＰ１ ＮＬＳ変異細胞を含むが、限定はされないが、このようなスクリーニングアッセイのために利用され得る。
【００５７】
上記アッセイに依存して、培養が、必要とされ得る。上記細胞は、多数の異なる生理学的アッセイのうちのいずれかを用いて調べられる。あるいは、分子分析（例えば、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現（全細胞もしくはＰｏｌｙＡ ＲＮＡの差次的なディスプレイを含む）などを観察すること）が実施され得る。さらなるスクリーニング方法およびスクリーニングプロトコルの構成は、当業者に周知であり、かつ本発明において有用である。
【００５８】
（治療キットまたは診察キット）
本発明の治療キットまたは診察キットは、適切な容器中に供給された薬学的に受容可能な処方物中にＰＥＬＰ１の少なくとも一つのモジュレーター（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、インヒビター、遺伝子、ベクター、抗体、抗体結合体、または他のエフェクター含むが、限定はされない）を含むキットである。上記キットはまた、伝統的なＳＥＲＭ（例えば、タモキシフェン、または当該分野において公知の他の選択的エストロゲンレセプターモジュレーター）と一緒に、本発明のＰＥＬＰ１モジュレーターのうちのいずれかを含む。上記キットは、単一の容器を有し得るか、または、完全なキットを構成するために多様に供給された化合物各々のための別個の容器を有し得る。
【００５９】
上記キットの構成要素が、一つ以上の液体溶液中に提供される場合は、その溶液は、特に好ましい滅菌された水溶液を含む水溶液である。ＰＥＬＰ１モジュレーターまたは薬学的に受容可能なそれらの塩の組成物はまた、注入可能な組成物へと処方され得る。この場合、上記容器は、シリンジ、ピペット、または他のこのような装置であり得る。この容器から、上記処方物は、体の感染領域に適用され得、動物中に注入され得、またはそのキットの他の構成要素に適用され得るかもしくはその構成要素と混合さえされ得る。
【００６０】
そのキットの構成要素はまた、乾燥粉末として提供され得る。構成要素が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒を加えることにより再構成され得る。上記溶媒は、キットの一部として別々の容器中に提供され得ることが、想定される。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を説明する目的のために提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用された、全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、本明細書によって、本明細書中において参考として援用される。
【実施例１】
【００６２】
（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体のヒストンＨ１結合の特徴付け）
ＰＥＬＰ１中のヒストン結合ドメインの存在を実証するために実験を行った。これらの実験は、ＰＥＬＰ１がクロマチンに補充されるかどうか、ならびに、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１と相互作用するかどうかを調べる。図１Ａは、チャコール処理血清（ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｓｅｒｕｍ）中でＰＥＬＰ１安定クローンを２日間増殖したＣＨＩＰ分析の結果（３０分間、１時間、または３時間、Ｅ２で処理もしくはＥ２無しで処理したか、あるいは、３時間、ＴＳＡで処理した）を示す。Ｔ７−ＰＥＬＰ１を、抗Ｔ７抗体で免疫沈降し、結合したクロマチンを溶出し、そして、ｐＳ２遺伝子（−３５９〜−３０）に特異的なＰＣＲ増幅プライマーを上記ＣＨＩＰ分析に用いた。上記ＣＨＩＰ分析は、エストロゲン刺激がない場合において、ＰＥＬＰ１の基礎蓄積（ｂａｓａｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を示した。３０分間の処理では、ＰＥＬＰ１との結合を何も示さなかった。その後、６０分間のＥ２処理後に補充が増加した。３時間に渡るＥ２処理の継続は、ｐＳ２プロモーターからＰＥＬＰ１の完全な喪失をもたらした。これらの結果は、ＰＥＬＰ１が、動力学的様式でＥ２応答性プロモーターへ補充されること、ならびに、デアセチラーゼ複合体がｐＳ２プロモーターへのＰＥＬＰ１の補充において役割を有し得ることを、示唆する。
【００６３】
図１Ｂに描写されたファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）アッセイの結果は、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１と相互作用することを示す。ネイティブなヒストンを、ＭＣＦ−７細胞から精製し、精製されたＨ３ヒストンもしくはＨ１ヒストン（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。そのゲルを、ニトロセルロースにトランスフェクトし、そして、３５Ｓ標識化ＰＥＬＰ１を、プローブとしての使用するためにインビトロ転写および翻訳系を用いて生成した。ＰＥＬＰ１相互作用バンドを、オートラジオグラフィーによって同定した。この実験の結果は、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１（全ヒストンの構成要素としてのヒストンＨ１、および精製されたヒストンＨ１としてのヒストンＨ１の両方）と特異的に相互作用し得ることを示す。他のヒストン、または精製されたヒストンＨ３との結合は、観察されなかった。
【００６４】
図１Ｃは、発明者によって調製されたＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の構造と、野生型ＰＥＬＰ１の構造とを比較する図である。この変異体は、部位特異的変異誘発によって構築した。ここで、終止コドンは、変異体ＰＥＬＰ１のアミノ酸８７７のコドンの後ろに導入した。コンセンサス核局在化モチーフの位置を、図中の略語「ＮＬＳ」によって示す。
【００６５】
図１Ｄは、野生型ＰＥＬＰ１と対比したＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の発現を示す。Ｃ末端領域の欠失は、一過性トランスフェクションアッセイおよびその後のウェスタン分析によって示されるような、より小さいタンパク質の発現をもたらす。
【００６６】
ヒストンＨ１結合ドメインを欠くＰＥＬＰ Ｈ１変異体の発現は、エストロゲン媒介性転写活性化のブロックをもたらす。ＰＥＬＰ１変異体の機能性は、図１Ｅに描写されたＥＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて実証された。Ｉｓｉｋａｗａ（ヒト子宮内膜腺癌）細胞を、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体と一緒にかまたは無しで、ＥＲＥレポーター遺伝子でトランスフェクトした。次いで、この細胞を、エストロゲンで処理するかまたは処理せず、そして、上記レポーター遺伝子活性を測定した。
【実施例２】
【００６７】
（ＰＥＬＰ１ドミナントネガティブ変異体の特徴付け）
乳癌細胞株ＭＣＦ−７、子宮内膜癌細胞株Ｉｓｈｉｋａｗａ、子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ、および骨肉種ＳａｏＳ２細胞とに、ドミナントネガティブＰＥＬＰ Ｈ１変異体と一緒にかまたは無しで、ＥＲＥルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＥ２（１０−９Ｍ）で処理したかまたは処理せず、そして、２４時間後のルシフェラーゼレポーター活性を測定した。このアッセイの結果は、図２に示される。試験された４つのモデル細胞全てにおいて、エストロゲンの追加は、そのレポーター遺伝子からの転写を数倍刺激した。しかし、ヒストンＨ１変異体の発現は、エストロゲンによる転写活性化の大きさを十分に減少した。これらの結果は、Ｃ末端領域またはＰＥＬＰ１が、正常なエストロゲン媒介性転写機能の維持に重要なヒストンＨ１結合領域を含むことを示す。ＰＥＬＰ１とヒストンＨ１との相互作用は、驚くべきである。なぜなら、ＰＥＬＰ１は、他のＮＲコレギュレータータンパク質とはほとんど相同性を共有しないからである。
【００６８】
従って、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の発現は、乳癌細胞、骨肉種癌細胞、および子宮内膜癌細胞におけるエストロゲン媒介性ＥＲ同時活性化機能を有効に抑制した。
【実施例３】
【００６９】
（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の効果と、一般に使用される特定の抗エストロゲンの効果との比較）
ＭＣＦ−７細胞またはＨｅｌａ細胞を、ＥＲ応答性レポーター（ＥＲＥルシフェラーゼ）でトランスフェクトした。いくつかの細胞を、ＰＥＬＰ Ｈ１変異体をトランスフェクトし、そして、いくつかの細胞はトランスフェクトしなかった。この細胞を、さらに、エストロゲンでか、ＩＣＩ１８２７８０存在下でのエストロゲンでか、タモキシフェン存在下でのエストロゲンでか、タモキシフェン＋ＰＥＬＰ Ｈ１変異体でか、またはタモキシフェン＋エストロゲン＋ＰＥＬＰ Ｈ１変異体で処理した（図３に示される）。
【００７０】
ＭＣＦ−７細胞株およびＨｅｌａ細胞株の両方において、エストロゲンは、ＥＲＥレポーター遺伝子を刺激し、そして、抗エストロゲンＩＣＩおよびタモキシフェンは、図３の棒グラフに示されるように、ＥＲＥ活性の大きさを減少した。ＰＥＬＰ Ｈ１変異体はまた、Ｅ２媒介性レポーター活性を顕著にブロックし、かつ、ＩＣＩまたはタモキシフェンよりもさらにより強力であった。加えて、タモキシフェンとＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体とを合わせると、試験された１因子または因子の組合せよりも、さらにより有意な阻害をもたらした。
【実施例４】
【００７１】
（腫瘍細胞株におけるＰＥＬＰ１の調節不全）
ＰＥＬＰ１の発現を、種々の細胞株において研究した。タモキシフェン感受性細胞およびタモキシフェン耐性細胞の両方は、同様のレベルのＰＥＬＰ１を発現した。しかし、ＰＥＬＰ１は、タモキシフェン耐性細胞内において差次的に局在することが見出された。腫瘍細胞におけるＰＥＬＰ１発現の免疫組織学的検査は、正常な細胞においてはＰＥＬＰ１が核内に局在化するのに対して、ＰＥＬＰ１がその腫瘍細胞の細胞質内に主に局在することを示した。ＰＥＬＰ１発現の調節不全は、乳房腫瘍および子宮内膜腫瘍の両方において観察された。
【００７２】
理論によって拘束されないが、癌細胞株におけるＰＥＬＰ１の変化した局在化、および、ＳＥＲＭの活性を調節するＰＥＬＰ１の能力は、ＰＥＬＰ１が、ＰＥＬＰ１による非ゲノム性シグナル伝達の活性化機構を介して、タモキシフェンおよびホルモン耐性において一定の役割を果たすことを示すと考えられる。提唱されるＰＥＬＰ１の機構のモデルが、図４に描写される。
【００７３】
通常の生理学的条件下において、ＰＥＬＰ１は、核区画に局在する。エストロゲンは、ＥＲおよびｐＲｂとのＰＥＬＰ１相互作用を促進し、ＥＲ媒介性ゲノム応答（古典的なゲノム経路）を増強する。病理学的な状態（例えば、乳癌）において、ＰＥＬＰ１の局在化は変化し、そして、ＰＥＬＰ１は主に細胞質内に局在する。ＰＥＬＰ１が細胞質内に存在する場合、エストロゲンは、ＰＥＬＰ１−ＥＲとＰＥＬＰ−ｓｒｃのキナーゼとの相互作用を増強する。これらの増強された相互作用は、最終的に、ＭＡＰＫ経路（非ゲノム経路）の活性化、およびＥＲの増加したリン酸化をもたらす。このことは、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）に対する変化したホルモン応答をもたらし、それにより、タモキシフェンの影響に対する耐性に寄与する。
【実施例５】
【００７４】
（ＰＥＬＰ１機能の妨害は、子宮内膜細胞株におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト活性をブロックする）
ＰＥＬＰ１機能の破壊を、タモキシフェン媒介性アゴニストシグナル伝達の妨害を評価するために、子宮内膜細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ）および乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）において行ったレポーター遺伝子活性および細胞増殖アッセイを用いて調べた。癌細胞を、
（ａ）ＰＥＬＰ１ ｃＤＮＡ、
（ｂ）ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体ｃＤＮＡ（アミノ酸 １〜８７７）、
（ｃ）核局在化シグナルを欠くＰＥＬＰ１変異体ｃＤＮＡ（ＰＥＬＰ−ＮＬＳ変異体）、または
（ｄ）ＰＥＬＰ１特異的ｓｉＲＮＡ
のいずれかと一緒に、ＥＲＥレポーター遺伝子で同時にトランスフェクトした。細胞をエストロゲンで２日間刺激し、そして、レポーター遺伝子活性および細胞数を測定した。野生型ＰＥＬＰ１１の過剰発現は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞においては、タモキシフェン媒介性アゴニスト活性を増強したが、ＭＣＦ−７細胞においては増強しなかった。興味深いことに、ＰＥＬＰ１−ＮＬＳ変異体の発現（この変異体は、細胞質内に主に局在する）は、ＭＣＦ−７およびＩｓｈｉｋａｗａ細胞の両方においてタモキシフェン媒介性アゴニストシグナル伝達を増強した。ＰＥＬＰ Ｈ１変異体（１〜８７７）の発現は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト活性を妨害した。さらに、ＰＥＬＰ１特異的ｓｉＲＮＡの発現もまた、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞によってタモキシフェン媒介性活性を妨害した。
【実施例６】
【００７５】
（ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡでの細胞の処理は、ＰＥＬＰ１発現レベルを十分に減少した）
ＭＣＦ−７細胞を、コントロールｓｉＲＮＡ、または４種のＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡのカクテルのいずれかと一緒に、ＥＲＥレポーター遺伝子でトランスフェクトした。細胞を、エストロゲンでかまたはエストロゲン無しで処理し、そして、レポーター活性を測定した。細胞溶解物をまた、ＰＥＬＰ１レベルを調べるためにウェスタンブロッティングによって分析した。
【００７６】
図５に示されるように、ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡでのＭＣＦ−７細胞の処理は、ＰＥＬＰ１の発現を十分に減少した。ｓｉＲＮＡを用いるＰＥＬＰ１のダウンレギュレーションはまた、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体を発現する細胞において観察されたレベルと同様のレベルになるまでＥＲ媒介性トランス活性化機能に影響した。これらの結果は、ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡが、癌細胞におけるシグナル伝達を操作する代替的な方法を提供し得ることを示す。この方法は、ＰＥＬＰ１ポリペプチドおよびＰＥＬＰ１変異体に関与する前に記載された方法と同様である。
【実施例７】
【００７７】
（正常な子宮内膜細胞および癌性子宮内膜細胞におけるＰＥＬＰの発現および局在化）
ＰＥＬＰ１の発現および局在化を、正常な子宮内膜および癌性子宮内膜の両方において特徴付けた。図６は、ＰＥＬＰ１が子宮内膜のすべての段階において発現される一方で、このタンパク質が病期に依存して特徴的な局在化を示すことを示す。
【００７８】
ＰＥＬＰ１は、子宮内膜癌細胞（広く用いられる子宮内膜細胞株（ＩｓｈｉｋａｗａおよびＲＬ ９５−２）を含む）において、広範に発現される。コントロールＭＣＦ−７乳癌細胞（ＥＲα陽性）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲβ陽性）乳癌細胞もまた、分析した（図７Ａ）。モデル系としてＥＲ陽性Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を用いるＥＲトランス活性化アッセイは、ＰＥＬＰ１の同時発現が、リガンドで刺激された細胞において、ベクターでトランスフェクトされた細胞においてＥＲＥルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性の６倍の増加が観察されたのと比較して、９倍増加したことを示す。このことは、ＰＥＬＰ１はまた、子宮内膜細胞においてＥＲのコアクチベーターとして作用することを示唆する（図７Ｂ）。両方のＥＲサブタイプのトランス活性化機能のＰＥＬＰ１による調節は、ＥＲα特異的リガンドまたはＥＲβ特異的リガンドを用いて行われた。ＰＥＬＰ１でトランスフェクトされた細胞を、ＰＰＴ（ＥＲα特異的リガンド）で処理した場合、３ＸＥＲＥｌｕｃレポーター活性は、上記ベクターでトランスフェクトされたコントロールより９倍多く増加した（図７Ｃ）。このことは、ＰＥＬＰ１が、ＥＲα依存性転写を同時活性し、そして、内因性ＥＲαおよびそれの特異的リガンドＰＰＴと協働することを示唆する。これらの結果と一致して、Ｅ２によるＩｓｈｉｋａｗａ細胞の処理は、インビボにおいてＥＲαとＰＥＬＰ１との増強された結合をもたらした（図７Ｄ）。図７Ｅに示されるように、ＥＲβ特異的リガンドＤＰＮでのＩｓｉｋａｗａ細胞の処理はまた、ＥＲＥ−ｌｕｃ活性を刺激した（コントロール細胞において観察されるよりも３倍だけ大きい活性ではあったが）。このことは、ＰＥＬＰ１がまた、ＥＲβの転写活性と協働し得ることを示唆する。ＰＥＬＰ１はまた、ＰＥＬＰ１で同時にトランスフェクトした場合に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＥＲβ転写活性を増強する（図７Ｆ）。さらに、内因性ＰＥＬＰ１は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、リガンド依存性様式で有効にＥＲβと相互作用する（図７Ｇ）。総じてこれらの結果は、ＰＥＬＰ１が両方のＥＲサブタイプのコアチベクターとして作用することを示唆するが、しかしながら、ＰＥＬＰ１は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、ＥＲβより規模の大きいＥＲαの同時活性化を示した。
【実施例８】
【００７９】
（ヒストンとのＰＥＬＰ１の相互作用）
生化学的分析および走査型共焦点顕微鏡分析を、ＰＥＬＰ１の核局在化および機能的関連を実証するために用いた。原子核内分画は、クロマチン画分および核基質画分とのＰＥＬＰ１の結合を示した。リガンド刺激は、１７−β−エストラジオール（Ｅ２）応答プロモーターへのＰＥＬＰ１の補充を促進し、そのＰＥＬＰ１のアセチル化Ｈ３との共局在化を促進し、そして、ＰＥＬＰ１に関連するヒストンアセチルトランスフェラーゼの増加した酵素活性を促進した。ファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析は、ＰＥＬＰ１がヒストン１およびヒストン３（Ｈ１およびＨ３）と相互作用する（Ｈ１に対しての方が優先的である）ことを明らかにした（図８）。欠失分析を用いて、ＰＥＬＰ１のＣ末端領域は、Ｈ１結合部位として同定されている。Ｈ１結合ドメインを欠くＰＥＬＰ１変異体は、ドミナントネガティブとして作用し、そして、ＥＲα媒介性転写をブロックする（図９）。クロマチン免疫沈降分析は、プロモーターとのＰＥＬＰ１の周期的な結合および解離を示す。この周期的な結合および解離は、逆位相で生じるＨ１およびＰＥＬＰ１の補充を伴う。ＰＥＬＰ１の過剰発現は、エストロゲン応答エレメント含有ヌクレオソームのミクロコッカスヌクレアーゼの感受性を増加する。これらの結果は、ＰＥＬＰ１が、癌細胞におけるＨ１の置換を介するクロマチン再構築活性に関与することを示唆する。
【実施例９】
【００８０】
（タモキシフェン耐性におけるＰＥＬＰ１の役割）
６０個の乳癌標本におけるＰＥＬＰ１の局在化を、免疫組織化学によって分析した。ＥＲコアクチベーターであるＰＥＬＰ１の変化した局在化の機能的な結果を調べるために、細胞質中でＰＥＬＰ１を特異的に発現するＭＣＦ−７モデル細胞（ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ）を作製した。ＭＣＦ−７モデル細胞、ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１野生型モデル細胞、およびＭＣＦ７−ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏモデル細胞に関して、タモキシフェン感受性がＰＥＬＰ１の局在化によって影響されることを示すために、レポーター遺伝子アッセイ、タンパク質ベースの方法、共焦点ベースの方法、および細胞生物学ベースの方法を用いた（図１０）。６０個の乳腺腫瘍標本におけるＰＥＬＰ１の免疫組織学的検査は、ＰＥＬＰ１は、正常な組織中での核局在化とは対照的に、細胞質中に主に位置することを示唆した。ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞は、エストロゲンに対する高感受性を与え、そして、タモキシフェンに対する耐性を示した。ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞はまた、Ｅ２処理の際に過度のＭＡＰＫ活性化を示し、そして構成的なＰ１３Ｋ活性を示した。さらに、ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞は、Ｐ１３Ｋのｐ８５サブユニットとＰＥＬＰ１との構成的結合を示した。ＰＥＬＰ１ｃｙｔｏ細胞はまた、Ｓｅｒ １１８およびｓｅｒ １６７においてＥＲの増加したリン酸化を示した。これらの結果は、非ゲノムシグナル伝達経路（例えば、ＭＡＰＫおよびＰ１３Ｋ）を活性化し、従って、ＥＲリン酸化を促進する能力を有し、タモキシフェンアゴニスト作用をもたらすコアクチベーター（例えば、ＰＥＬＰ１）の変化した局在化と、そのような作用とが、タモキシフェン耐性をもたらし得ることを示唆する。
【００８１】
本発明の上記の記述は、単に本発明を例示することが意図され、そして、本発明の他の実施形態、改変、および等価物は、本発明書に添付された特許請求の範囲において記載される本発明の範囲内にある。開示される概念および具体的な実施形態が、本発明と同じ目的を実施するために他の組成物または方法を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって認識されるべきである。このような同等な組成物または方法が、添付された特許請求の範囲において示される本発明の精神と範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されるべきである。
【００８２】
（参考文献）
【００８３】
【化１】
【００８４】
【化２】
【００８５】
【化３】
【００８６】
【化４】
【００８７】
【化５】
【００８８】
【化６】
【００８９】
【化７】
【００９０】
【化８】
【図面の簡単な説明】
【００９１】
以下の図面は、本明細書の一部であり、そして本発明の特定の局面をさらに例示するために含まれる。本発明は、一つ以上のこれらの図を、本発明の要旨および本明細書中に提示された具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良く理解され得る。
【図１】図１Ａは、エストロゲン存在下でのＰＥＬＰ１とクロマチンとの基礎的かつ動的な関連を示す、クロマチン免疫沈降分析である。図１Ｂは、ファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）方法によるＰＥＬＰ１ヒストンＨ１結合アッセイである。図１Ｃは、ＰＥＬＰ１野生型およびＰＥＬＰ１変異体の図である。図１Ｄは、ＰＥＬＰ１野生型、およびＰＥＬＰ１（１〜８７７）欠失変異体ＰＥＬＰ１ Ｈ１ＭＴのポリアクリルアミドゲルである。図１Ｅは、ＥＲＥレポーター遺伝子アッセイによって決定されたＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体（ＰＥＬＰ１ Ｈ１ＭＴ）の発現によるレポーター遺伝子活性化のエストロゲン媒介性誘導のダウンレギュレーションを示す棒グラフである。
【図２】図２は、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、子宮内膜癌細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、および骨癌細胞株（ＳａｏＳ２）における、エストロゲン媒介性レポーター遺伝子活性に対するＰＥＬＰ（アミノ酸 １−８７７）Ｈ１変異体の効果を示す。
【図３】図３は、一般に使用される特定の抗エストロゲンの効果と比較した、エストロゲン媒介性レポーター遺伝子活性のブロックにおけるＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の効果を示す。
【図４】図４は、ＰＥＬＰ１の機能についての提唱モデルを描写した図であるが、本発明は、この理論図によって拘束されない。
【図５】図５は、ＭＣＦ−７細胞におけるエストロゲン媒介性ＥＲＥレポーター遺伝子の発現に対するＰＥＬＰ１のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図６】図６は、ヒトの子宮内膜におけるＥＲα、ＥＲβ、およびＰＥＬＰ１の免疫反応性染色の概要を示す。
【図７】図７は、子宮内膜細胞におけるＥＲαおよびＥＲβとのＰＥＬＰ１の機能的相互作用に関連する結果を示す。
【図８】図８は、ヒストンＨ１およびヒストンＨ３とのＰＥＬＰ１の相互作用を示す。
【図９】図９は、Ｅ２媒介性トランス活性化に対する、Ｃ末端ヒストン結合領域が欠けているＰＥＬＰ１変異体に効果を示す。
【図１０】図１０は、タモキシフェン耐性に対するＰＥＬＰ１の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、薬剤および腫瘍治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、エストロゲンレセプターの調節、およびホルモン依存性腫瘍の処置において有効である薬学的組成物に関する。
【０００２】
（関連出願の援用）
本出願は、２００３年８月２６日に出願された仮出願第６０／４９８，１１８号の優先権の利益を主張する。
【０００３】
（連邦政府により後援された研究または開発に関する陳述）
本発明は、全体または一部が、アメリカ国立衛生研究所助成金第９−７１５０７４１号および第ＲＯ１ ＣＡ０９５６８１号によって支援された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
核ホルモンレセプター（ＮＲ）は、リガンド依存性の様式で遺伝子発現を調節する転写因子の大きなファミリーを構成する。ＮＲは、脊椎動物発生において重要な役割を果たし、かつ、このＮＲは、広範囲の細胞応答（例えば、分化、増殖、および恒常性）に関連付けられている（非特許文献１；非特許文献２）。現在、ＮＲスーパーファミリーは、３つのサブファミリーに分かれる。タイプＩは、ステロイドホルモンレセプター（例えば、エストロゲンレセプター、プロゲスチンレセプター、アンドロゲンレセプター、またはグルココルチコイドレセプター）を包含する。タイプＩＩは、非ステロイドホルモンレセプター（例えば、レチノイン酸レセプター、甲状腺ホルモンレセプター、およびビタミンＤレセプター）を包含する。タイプＩＩＩは、現在、十分に特徴づけられたリガントを有さないオーファンレセプターを包含する（非特許文献３）。
【０００５】
ＮＲは、Ｎ末端リガンド非依存性転写活性化機能ドメイン１（ＡＦ１）、ＮＲを特異的なＤＮＡモチーフに標的化させる高度に保存されたＤＮＡ結合中央ドメイン（ＤＢＤ）、Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、およびＣ末端リガンド依存転写活性化機能ドメイン（ＡＦ２）を含む、いくつかの構造的特徴を共有する（非特許文献３；非特許文献４）。ホルモン結合がＮＲに結合することが、コンフォメーションの変化を誘発し、ＮＲを標的遺伝子のプロモーターのうちの応答エレメントに結合させる。ＮＲのＬＢＤは、配列が多様であり、これはリガンドの多様性を説明するが、類似する全体的三次元構造を共有する（非特許文献３）。ＡＦ２は、種々のＮＲ間で高度に保存されるが、ＡＦ１は、保存されない（非特許文献２）。
【０００６】
ＮＲの転写活性は、ホルモンのみならず、いくつかの調節コアクチベーター、および調節コリプレッサーによって影響される（非特許文献３；非特許文献５）。そのコアクチベーターは、通常は、ＤＮＡに結合しないが、ＮＲとのタンパク質間相互作用を介して標的遺伝子のプロモーターへ補充される（非特許文献６）。ｐ１６０ファミリーは、十分に研究されたＮＲコアクチベーターファミリーであり、このファミリーは、ステロイドレセプターコアクチベーターＳＲＣ１、グルココルチコイドレセプター相互作用タンパク質ＧＲＩＰ１／ＴＩＦ２、およびグルココルチコイドレセプター相互作用タンパク質Ｐ／ＣＩＰ（ＡＩＢ１、ＴＲＡＭ１、またはＲＡＣ３としても公知である）を包含する（非特許文献７）。第二のコアクチベーターファミリーは、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ＣＢＰ、およびｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ｐ３００を包含する（非特許文献８）。コリプレッサーの中で、核レセプターコリプレッサー（ＮｃｏＲ）、ならびにレチノイ酸および甲状腺レセプターのためのサイレンシングメディエーター（ＳＭＲＴ）は、甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、およびビタミンＤレセプターと、リガンド非存在下で、正常に反応する遺伝子の転写サイレンシングにおいて広く特徴づけられかつ関連づけられている（非特許文献３）。コレプレッサーは、アンダゴニストで占められたＮＲと優先的に結合することが示されている（非特許文献９）。ＮＲのコアクチベーターとコレプレッサーの両方として作用し得る少数の二機能性コレギュレーターもまた報告されており、これには、マウスのジンクフィンガータンパク質（アポトーシスおよび細胞周期停止のレギュレーター）（ＺＡＣ１）（非特許文献９）、ＮＲ結合セットドメイン含有タンパク質（ＮＳＤ１）（非特許文献１０）、ならびにＲＩＰ１４０（非特許文献１１）が挙げられる。
【０００７】
証拠は、コアクチベーターと、ＮＲと、転写レギュレーターとを含む多タンパク質複合体が、ホルモン結合に応答して集まり、そして、転写を活性化することを示唆する（非特許文献３）。研究者はまた、組織型および細胞型に特異的な応答をホルモンが誘発する分子機構、ならびに関与するコアクチベータータンパク質の組成を、活発的に研究している。コアクチベーターの構造分析は、コレギュレーターのリガンドＮＲ複合体との結合を仲介するのに十分である５アミノ酸ＬＸＸＬＬ（Ｘは任意のアミノ酸）からなるモチーフを同定した（非特許文献１３）。コアクチベーターＳＲＣ１、コアクチベーターＣＢＰ、およびコアクチベーターｐ３００は、固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し（非特許文献１４）、一方で、ＮｃｏＲおよびＳＭＲＴは、ヒストンデアセチラーゼおよびｍＳｉｎ３Ａと関連する（非特許文献１５）。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性およびヒストンデアセチラーゼ活性と、コレギュレーターとの関連は、コレギュレーター機能の潜在的機構をクロマチン構造の調節が構成することを示唆する（非特許文献２）。遺伝子の転写調節における別の機構は、コレギュレーターのリン酸化に関与する（非特許文献１６）。
【０００８】
ステロイドホルモン１７β−エストラジオール（Ｅ２）は、発生、恒常性、心血管系の調節、骨密度の決定、および乳癌の進行を含む、幅広い生物学プロセスに関与する遺伝子の発現を調節する重要な役割を果たす（非特許文献１７）。エストロゲンの生物学的効果は、エストロゲンが、構造的かつ機能的に異なるエストロゲンレセプター（ＥＲαおよびＥＲβ）に結合することによって仲介される。ＥＲαは、乳房上皮にある主要なＥＲである（非特許文献１８）。他のステロイドレセプターと同様に、ＥＲαは、Ｎ末端ＡＦ１、ＤＢＤ、およびＡＦ２ドメインを含むＣ末端ＬＢＤを含む（非特許文献１９）。Ｅ２とＥＲαが結合することで、リガンド活性化ＥＲαは、核へトランスロケートし、標的遺伝子の１３塩基対のパリンドロームエストロゲン応答エンハンサーエレメント（ＥＲＥ）と結合し、そして、遺伝子の転写を刺激し、その結果、乳癌細胞の増殖は促進される（非特許文献２０）。エストロゲンの種々の機能のうちのいくつかは、Ｅ２−ＥＲ複合体へのコレギュレーターの差次的な補充に依存する。ＥＲの転写機能は、ＳＲＣ１、ＧＲＩＰ１、ＡＩＢ１、ＣＢＰ／ｐ３００、ＴＩＦ１、ＰＧＣ１、およびＤＡＸ１を含むいくつかのコレギュレーターによって影響され得る（非特許文献３；非特許文献２１；非特許文献２２）。コレギュレーターの構造についてはよく知られているが、発生、ホルモン調節、および癌の進行におけるコレギュレータータンパク質の生理学的な役割については、ほとんど知られていない。
【０００９】
抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーターは、それらの拮抗性特質および抗エストロゲン性特質に大きく起因して、ホルモン依存性腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害することが示されている。しかしながら、抗エストロゲン治療に応答する多くの患者は、最終的には、この治療に対する耐性を発生し、ホルモン非依存性となる。乳癌における進行および最終的な耐性（ホルモン依存性からホルモン非依存性へ）に関与する機構としては、ＥＲ改変体またはＥＲ変異体の発現、ＥＲのリガンド非依存性活性化、より低濃度のエストロゲンに対する腫瘍の順応、およびＥＲコレギュレーターの薬理学的な変化が挙げられると考えられる。
【００１０】
プロリン、グルタミン酸、およびロイシンリッチタンパク質１（ＰＥＬＰ１）は、ＮＲのコレギュレーターのファミリーの一員として最近同定された（非特許文献２３、本明細書中にその全体が参考として援用される）。このＰＥＬＰ１ポリペプチドは、その名前が示唆しているように、プロリン、グルタミン酸、およびロイシンといったアミノ酸が異常に豊富である。ＰＥＬＰ１のＮ末端領域は、９つのＬＸＸＬＬモチーフを有する（同書）。ＬＸＸＬＬモチーフは、ＮＲとのリガンド依存性コアクチベーター結合を仲介することが示された。ＰＥＬＰ１はさらに、アミノ酸４９５〜４９８の中央に位置するコンセンサス核局在化モチーフによって特徴づけられる（同書、また非特許文献２４も参照のこと）。中央核局在化モチーフに隣接しているのは、３つのジンクフィンガーを潜在的に形成する２つのシステインリッチ領域である（同書）。ＰＥＬＰ１のＣ末端領域は、２つのプロリンリッチＣ末端領域（３１％プロリン（アミノ酸７５１〜８７０）、２３％プロリン（アミノ酸９７０〜１１３０））を含み、このＣ末端領域は、転写活性化ドメインを構成する（同書）。酸性アミノ酸が豊富な領域が、これら２つのプロリンリッチ領域の間に位置する（同書）。ＰＥＬＰ１はまた、いくつかのコンセンサスリン酸化部位を含む（同書）。ＰＥＬＰ１は、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織、乳腺組織、脳組織、骨格筋組織、および肺組織を含む種々のエストロゲン応答組織中で差次的に発現される（同書）。さらに、ＰＥＬＰ１の増加した発現は、乳癌細胞に加えて、卵巣腫瘍および子宮腫瘍中でも生じる。
【００１１】
ＰＥＬＰ１は、リガンド依存性コアクチベーターとしてＥＲ経路において能動的に関与する。ＰＥＬＰ１は、ＥＲαアイソフォームおよびＥＲβアイソフォームの両方のコアクチベーターとして、相互作用しかつ機能する。ＥＲ経路は、乳癌腫瘍形成の進行と関連付けられており、そして、ＥＲ経路のコレギュレーターは、腫瘍進行において一定の役割を果たす。ＰＥＬＰ１の発現は、ＥＲ−Ｅ２複合体の転写活性を増強する。ＰＥＬＰ１はまた、乳房腫瘍細胞において過剰発現する。これは、ＰＥＬＰ１が、ホルモン依存性癌におけるエストロゲンおよび抗エストロゲンの応答を調節する核シグナル伝達経路（具体的には、エストロゲンレセプター経路）に影響を与えることを示唆している。さらに、転写調節のためのＥＲ応答エレメントへのＰＥＬＰ１補充は、ホルモン依存性であり、このことは、ＰＥＬＰ１の過剰発現がエストロゲンレベルに対して細胞を過剰感作することを示す。低下したホルモンレベルに対するこのＰＥＬＰ１誘導過剰感作は、癌細胞中におけるホルモン耐性を導く一つの機構である。この過剰感作のブロックは、ホルモン耐性癌における腫瘍形成を遅らすかまたは止めるための強固な機構を提供する。
【００１２】
さらなる研究が、細胞周期の進行においてのＲＥＬＰ１の関与が実証した（非特許文献２５）。具体的には、乳癌細胞におけるＰＥＬＰ１過剰発現は、エストラジオールシグナル伝達に対して乳癌細胞を過剰感作し、乳癌細胞における細胞周期のＳ期への促進された進行を導く。細胞周期中の、乳癌細胞におけるこの増加した進行は、細胞周期におけるＰＥＬＰ１媒介性過剰リン酸化が、タンパク質を細胞芽腫（ｐＲｂ）へと転換することに関係付けられた。細胞芽腫のリン酸化は、細胞周期の進行において重要な役割を果たし、かつ、増加したｐＲｂのリン酸化が、Ｇ１期からＳ期への細胞の進行を導くことが当該分野において周知である。さらに、ＰＥＬＰ１とｐＲｂとの間での相互作用はまた、サイクリンＤ１（多数の乳癌において調節不全であることが公知であるタンパク質）の発現を増加する。細胞周期中の、癌細胞における増加した進行のブロックはまた、腫瘍形成の進行を遅らすかまたは止めるための所望される標的を提供する。
【００１３】
現在、種々の選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）は、乳癌の処置において用いられる。しかしながら、ＳＥＲＭの不利益の一つは、非標的組織中のこれらモジュレーターの化合物の部分的なアゴニスト作用である。例えば、タモキシフェン（最も一般的に処方されているＳＥＲＭ）は、乳癌の処置において非常に効果的であるがまた、子宮内膜腫瘍への刺激を与えてしまう。細胞型に関係なくエストロゲン応答をブロックし得る効果的な治療が必要である。
【００１４】
さらなる研究は、ＰＥＬＰ１のＮ末端領域におけるいくつかのＥＲ相互作用部位へと、ＥＲとのＰＥＬＰ１相互作用を位置決めした。活性化ドメインが欠けているＰＥＬＰ１の発現か、または、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用の妨害は、子宮内膜細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト応答をブロックする。従って、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用の妨害は、腫瘍形成を遅らすかまたは止めるさらなる標的を提供し、一方で、非標的組織における伝統的なＳＥＲＭの部分的なアゴニスト作用をうまく減らす。
【００１５】
ＥＲシグナル伝達経路および細胞周期の両方におけるＰＥＬＰ１の役割は、ＲＥＬＰ１を、このような治療のための望ましい標的にする。ＰＥＬＰ１活性の調節またはブロックは、乳腺組織、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織を含む種々のエストロゲン応答組織における腫瘍形成の進行を阻害する強固な機構を提供する。加えて、ＰＥＬＰ１活性を阻害することは、従来の抗エストロゲン化合物とは異なり、組織型に関係なくエストロゲン応答をブロックする可能性が高い。ＰＥＬＰ１活性はまた、診断ツールとして、腫瘍中のホルモン過敏性マーカーとして用いられ得る。
【非特許文献１】Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｓ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，７５７−７６０ （１９９９）
【非特許文献２】Ｘｕ，Ｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９，１４０−１４７（１９９９）
【非特許文献３】ＭｃＫｅｎｎａ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０，３２１−３４４（１９９９）
【非特許文献４】Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３，４５１−４８６（１９９４）
【非特許文献５】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９，２２２−２３２（１９９７）
【非特許文献６】Ｍａ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，６１６４−６１７３（１９９９）
【非特許文献７】Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０，３７３−３８３（１９９８）
【非特許文献８】Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８３，９９−１０３（１９９６）
【非特許文献９】Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１３６９−１３７８（１９９８）
【非特許文献１０】Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍ．およびＳｔａｌｌｃｕｐ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，１８５５−１８６７（２０００）
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇ，Ｎ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７，３３９８−３４１２（１９９８）
【非特許文献１２】Ｃａｖａｉｌｌｅｓ，Ｖ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４，８７４１−３７５１（１９９５）
【非特許文献１３】Ｈｅｅｒｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８７，７３３−７３６（１９９７）
【非特許文献１４】Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｔ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８９，１９４−１９８（１９９７）
【非特許文献１５】Ｎａｇｙ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ８９，３７３−３８０（１９９７）
【非特許文献１６】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１２１−１４１（２０００）
【非特許文献１７】Ｃｏｕｓｅ，Ｊ．Ｆ．およびＫｏｒａｃｈ，Ｋ．Ｓ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０，３５８−４１７（１９９９）
【非特許文献１８】Ｗａｒｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１１，２４９−２５４（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ５１，９４１−９５１（１９８７）
【非特許文献２０】Ｄｕｂｉｋ，Ｄ．およびＳｈｉｕ，Ｒ．Ｐ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１２７０５−１２７０８（１９８８）
【非特許文献２１】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３９８５５−３９８５９（２０００）
【非特許文献２２】Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６３０２−１６３０８（２０００）
【非特許文献２３】Ｖａｄｌａｍｕｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４１）：３８２７２−３８２７９（２００１）
【非特許文献２４】Ｃｈｅｌｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２４８７−２４９２（１９８９）
【非特許文献２５】Ｓｅｔｈａｒａｍａｎ Ｂ．およびＶａｄｌａｍｕｄｉ，Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２２１１８−２２１２７（２００３）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本開示は、腫瘍細胞におけるＰＥＬＰ１の変化または調節に関連するいくつかの驚くべき発見に起因する。第一に、ＰＥＬＰ１のＣ末端領域からのアミノ酸の欠失（配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）；配列番号３（ＰＥＬＰ１のＣ末端領域）；および配列番号１４（Ｃ末端欠失ＰＥＬＰ１変異体（ＰＥＬＰ１−Ｈ１））
は、腫瘍細胞におけるエストロゲン応答をブロックし、結果として、腫瘍形成および細胞周期の進行が減少された。第二に、エストロゲンレセプターとのＰＥＬＰ１の相互作用は、ＰＥＬＰ１タンパク質のＮ末端領域（配列番号５（ＰＥＬＰ１のＮ末端領域））中に位置するいくつかのＥＲ相互作用部位に位置決めされた。ＰＥＬＰ１とＥＲとの間の相互作用を妨害することは、子宮内膜細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト応答をブロックする。従って、ＰＥＬＰ１活性の妨害は、エストロゲン応答細胞型（例えば、精巣組織、卵巣組織、および子宮組織、乳腺組織、脳組織、骨格筋組織、および肺組織のような細胞型が挙げられる）において腫瘍形成および癌の進行を遅らすかまたは止める、ならびに、非標的組織におけるＳＥＲＭの部分的なアゴニスト作用を減少する治療活性についての新規経路を提供する。
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、一つ以上のポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物を含む組成物に関連し、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）およびそれらの改変体が挙げられるが、限定はされない。本発明に従うポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、天然供給源からの単離、原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞における組換え体の産出、または化学合成を含む、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る。
【００１８】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、発現を促進する状況下で宿主細胞を培養し、そしてその培養培地からそのポリペプチドまたはオリゴペプチドを回収することによって、生成される。原核生物細胞または真核生物細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞）におけるこれらのポリペプチドまたはオリゴペプチドの発現は、本発明によって包含される。他の実施形態において、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、当該分野において周知の方法を用いる化学合成によって生成される。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ＰＥＬＰ１の転写または翻訳を調節または妨害する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸を提供する。ｓｉＲＮＡは、代表的には、１００ｂｐ未満の長さであり、そして好ましくは、３０ｂｐ以下である。本発明に従うｓｉＲＮＡの例は、配列番号１６〜配列番号１９のうちのいずれかにて提供される。アンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡは、相補ＤＮＡ鎖の使用含む当該分野において公知の任意の方法によって、または化学合成を介して、作製され得る。
【００２０】
本発明の代替的な実施形態は、本明細書中に開示されたポリペプチドのうちのいずれかをコードする単離された核酸分子である。この単離された核酸の配列は、ＰＥＬＰ１遺伝子（配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１）もしくは配列番号１５（ＰＥＬＰ Ｈ１変異体））に由来する天然に存在する核酸配列、ＰＥＬＰ１遺伝子のＣ末端領域（配列番号４）に由来する天然に存在する核酸配列、ＰＥＬＰ１遺伝子のＮ末端領域（配列番号６）に由来する天然に存在する核酸配列、または、開示されたポリペプチドをコードするこのような配列の変化型であり、これらの核酸配列は、これらの配列に対して相補的な核酸を含む。一本鎖および二本鎖のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方が、本発明によって包含され、同様に、本発明の変性された二本鎖のＤＮＡ分子とハイブリダイズする核酸分子も包含される。さらに含まれるのは、核酸分子の変異誘発により誘導される単離された核酸分子である。この核酸分子は、
配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１遺伝子）、配列番号４（Ｃ末端領域）、配列番号６（Ｎ末端領域）、または配列番号１５（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体）のうちのいずれかの配列、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号１５のうちのいずれかの対立遺伝子改変体、および
配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号１５のうちのいずれかの縮重改変体
を含む。本発明の核酸はまた、発現されるべき所望のアミノ酸コードに基づき化学的に合成され得る。
【００２１】
本発明に従う単離された核酸分子は、好ましくは、適切な宿主細胞内で上記ポリペプチドの発現を指向し得る発現ベクターを含むベクター中に含まれる。適切な宿主細胞とは、上記発現ベクターからの上記ポリペプチドの発現が生物学的に機能的なポリペプチドを生じる宿主細胞である。生物学的機能は、真核細胞発現、および特には哺乳動物細胞発現が好ましくなるような、上記ポリペプチドの適切な折り畳みおよび適切な構造安定性と関連付けられ得る。本発明における単離された核酸はまた、遺伝子を送達するために使用されるベクターまたは送達系が特定の細胞型を標的とし、そして標的細胞内での上記ポリペプチドの安定な発現を生じる、細胞特異的遺伝子治療組成物のうちに含まれ得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は、高い特異性でＰＥＬＰ１ポリペプチドと結合する抗体を提供する。抗体は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）のうちのいずれかに対して生成され得るか、あるいは、野生型エピトープおよび変異体エピトープ（例えば、配列番号７〜配列番号１３、および配列番号２０（ＰＥＬＰ１抗体生成エピトープ）として開示されるエピトープ）を含むエピトープコア領域を含む、より小さな構築物を含む任意の部分に対して生成され得る。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、ＰＥＬＰ１活性の潜在的なモジュレーターをスクリーニングする方法を包含する。スクリーニング方法の例は、
候補分子を提供する工程；
単離された化合物、細胞、または実験動物と候補分子とを混合する工程；
その化合物、細胞、または実験動物の一つ以上の特性を測定する工程；および
その一つ以上の特性に対するその候補分子の効果を測定する工程
を包含する。測定可能な特性としては、細胞増殖率、ＰＥＬＰ１局在化、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用、またはＰＥＬＰ１−クロマチン相互作用が挙げられるが、限定はされない。アッセイは、無細胞系、単離された細胞、または生物（トランスジェニック動物を含む）のうちで行われ得る。
【００２４】
本発明の特定の実施形態において、上記のポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ｓｉＲＮＡ、または抗体は、薬学的組成物を提供するための薬学的に受容可能なキャリアのうちに含まれるか、または、これらのキャリアと組み合わされる。上記活性化合物はまた、当業者によって有用であると認められた任意の経路（非経口経路または腹腔内経路を含む）により投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての上記活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性化剤と適切に混合された水中で、調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製され得る。通常の保存条件および使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ防腐剤、またはこの調製物に所望の特性を与える他の賦形剤を含む。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、エストロゲンレセプター経路に関連する障害（特に、癌）、およびエストロゲン受容性細胞における他の腫瘍形成障害の処置または診断のための治療キットまたは診断キットに関連する。このようなキットは、市販のために包装された一つ以上の治療成分または診断成分を含む。
【００２６】
（詳細な説明）
（ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチド模倣物）
ＰＥＬＰ１活性のブロックまたは妨害（特に、ヒストンＨ１とＰＥＬＰ１との結合、またはＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用のブロック）は、エストロゲン応答細胞型における腫瘍形成および癌の進行を遅らすかまたは止める治療活性についての新規経路を提供する。ＰＥＬＰ１活性は、ＰＥＬＰ１アミノ酸配列の一つ以上の部分（特に、Ｃ末端の２５３個のアミノ酸、またはＰＥＬＰ１ポリペプチドのＮ末端部分における種々のＥＲ相互作用領域の一つ）に相当する、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物の投与によって、妨害され得る。このようなポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）の全体または一部に対応する。
【００２７】
本発明の一つの実施形態は、ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る多様な形態でのポリペプチド、フラグメント、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物を一つ以上含む組成物に関連し、これらのポリペプチド、フラグメント、オリゴペプチド、またはペプチド模倣物は、天然に生じるものか、または種々の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成に関する手順）を介して生成されるものを含む。このような形態としては、誘導体、改変体、およびオリゴマー、ならびに、融合タンパク質またはそれらのフラグメントが挙げられるが、限定はされない。
【００２８】
本発明のポリペプチド改変体は、実質的には天然形態と相同であるが、一つ以上の欠失、挿入、または置換があるため天然形態のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含む。所与のアミノ酸は、例えば、類似の生理化学的特性を有する残基で置換され得る。このような保存的置換の例としては、１個の脂肪族残基で別の残基を（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに）置換すること、１個の極性残基で別の残基を（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｎとＡｓｐとの間、またはＧｌｕとＡｓｎとの間で）置換すること、あるいは、１個の芳香族残基で別の残基を（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに）置換することが挙げられる。他の保存的置換（例えば、類似する疎水性特性を有する領域全体の置換に関与する）が、周知である。
【００２９】
本発明のペプチド模倣物は、配列番号１（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号３（Ｃ末端領域）、配列番号５（Ｎ末端領域）、配列番号７〜配列番号１３（ＰＥＬＰ１−ＥＲブロッキングペプチド）、または配列番号１４（ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異体）、あるいは、それらのフラグメントまたは改変体の一次構造、二次構造、または三次構造を模倣する。好ましいペプチド模倣物は、プロテアーゼ抵抗性である。本発明のペプチド模倣物としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴウレア、βペプチド、γペプチド、オリゴ（フェニレン、エチニレン）、ビニル性スルホノペプチド、およびポリＮ置換グリシン（ペプトイド）が挙げられる。本発明のペプチド模倣物は、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖ．２３），Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，Ｗ．Ｍ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に概要が述べられるような、当該分野において周知の技術を用いて設計され得、かつ化学的に合成され得る。
【００３０】
（核酸）
本発明の代替的な実施形態は、本明細書中に開示されるポリペプチド（配列番号２（完全長ＰＥＬＰ１）、配列番号４（Ｃ末端領域）、配列番号６（Ｎ末端領域）、または配列番号１５（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体）を含む）、あるいは相補配列を含むそれらのフラグメントまたは改変体のうちのいずれかをコードする、単離された核酸分子である。単離された核酸配列は、ＰＥＬＰ１遺伝子のＮ末端領域またはＣ末端領域由来の天然に生じる核酸配列であり得るか、または、開示されたポリペプチドをコードするこのような配列の変形（遺伝コード中の重複性によって生じる改変体を含む）であり得る。あるいは、このような核酸は、発現される所望のアミノ酸コードに基づいて化学的に合成され得る。本発明に従う単離された核酸は、好ましくは、ベクター（適切な宿主細胞内で上記ポリペプチドの発現を指示し得る発現ベクターを含む）中に含まれる。本発明の単離された核酸はまた、細胞特異的遺伝子治療組成物のうちに含まれ得る。本発明に従う遺伝子治療は、ポリペプチドをコードする核酸を細胞に提供することを含む。このポリペプチドは、次いで、細胞の転写機構および翻訳機構によって合成され、同様に、発現構築物によって提供され得る任意のポリペプチドも合成される。アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、および他のインヒビターの提供において、上記方法はまた、阻害性構築物をコードする核酸を細胞に提供する。全てのこのような方法は、本明細書中において用語「遺伝子治療」の範囲内に包含される。
【００３１】
本発明にさらに含まれるのは、ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，１６：９４８−５８，２００２）を含む低分子干渉ＲＮＡを指し、このｓｉＲＮＡは、細胞中の特定の遺伝子の干渉そしておそらく転写後サイレンシングを引き起こし得る。ＲＮＡ干渉は、干渉ＲＮＡを生成する方法を含み、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−２９，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−９８，２００１；およびＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−１１，１９９８において記載されかつ議論されている。本発明のｓｉＲＮＡは、典型的に、長さ１００塩基対（ｂｐ）未満であり、そしてより好ましくは、長さ約２０ｂｐ〜３０ｂｐ以下である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１個〜６個のヌクレオチドリーダーまたはヌクレオチドテールを有する。ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る４つのｓｉＲＮＡが、単離された。これは、配列番号１６〜配列番号１９として含まれている。本発明のｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡ分子がＰＥＬＰ１遺伝子もしくはその転写物と相互作用する場合において、裸のオリゴヌクレオチド形態、センス核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子形態、ベクター形態で送達され得るか、または、当業者に公知の他の任意の方法で送達され得る。本発明のｓｉＲＮＡ分子のうちのいずれかの相互作用は、ヒト細胞を含む哺乳類細胞において、転写後サイレンシングか、またはＰＥＬＰ１遺伝子の減少した活性を引き起こす。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、ＰＥＬＰ１遺伝子をコードする核酸、ＰＥＬＰ１遺伝子のモジュレーターをコードする核酸、またはそれらの有用なフラグメントをコードする核酸は、細胞のゲノム中に、安定に組み込まれ得る。なおさらなる実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして、細胞中に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞の周期とは独立してか、または同期化して、維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞にどのようにして送達されるか、および、その核酸が細胞中のどこで残存するのかは、用いられた発現構築物の型、および構築物が形質転換される細胞の型に依存する。当業者は、送達構築物ならびに細胞株および細胞型を、彼らの必要性を満たすために慣用的に選択し、そして、この当業者は、本発明の種々の実施形態で使うためにこのような系を容易に最適化し得る。
【００３３】
特定のウィルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に入り、そして、宿主細胞ゲノム中に組み込み、かつウィルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力は、そのウィルスを、外来遺伝子を哺乳類細胞内に移入するための魅力的な候補にする。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般に、ウィルス性ベクターである。
【００３４】
外来遺伝物質を受け入れ得るいくつかのウィルスは、これらのウイルスが感染する細胞の範囲で収容し得るヌクレオチドの数が限られるが、これらのウイルスは、遺伝子発現を首尾よくもたらすことが実証されている。アデノウィルスは、しかしながら、このウィルスの遺伝物質を宿主ゲノム中に組み込まないが、それ故、遺伝子発現のための宿主の複製を必要とにない。このことは、このウィルスを、迅速で効率的な異種遺伝子発現に理想的に適するようにする。複製欠陥性感染性ウィルスの調製技術は、当該分野において周知である。
【００３５】
当然、ウィルス性伝達系の使用において、当業者は、ビリオンを、望ましくない混入物を基本的に含まないようにするのに十分に精製して、ベクター構築物を受け取る細胞、哺乳動物、または個体において有害反応を何も生じないようにすることを望む（例えば、欠陥性干渉ウィルス性粒子またはエンドトキシン、および他の発熱物質）。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配（例えば、勾配塩化セシウム勾配遠心分離）の使用を含むが、当該分野において公知であるベクター精製のための任意の有効な手段が、使用され得る。
【００３６】
細胞に核酸を送達するさらなる方法としては、リポソーム媒介性トランスフェクションまたはレセプター媒介性トランスフェクションが挙げられる。本発明のさらなる実施形態において、発現構築物は、リポソーム内に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層および内側の水性媒体によって特徴付けられる、小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらのリポソームは、過剰の水溶液中にリン脂質を懸濁した場合に、自然に形成する。そのリン脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再配列を起こし、水を捕捉し、そして上記脂質二重層の間で溶質を溶解する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また企図されるのは、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と複合体化された発現構築物である。
【００３７】
開示された核酸構築物を標的細胞へ送達するために利用され得るなおさらなる発現構築物は、レセプター媒介性送達ビヒクルである。これらのレセプター媒介性送達ビヒクルは、上記標的細胞で生じるレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布を考慮すると、この送達方法は、本発明にさらなる程度の特異性を加える。特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子を含む。他のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、送達されるＤＮＡ構築物が可能に結合されている細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子導入のために用いられている。本発明の特定の局面において、上記リガンドは、エストロゲン応答性標的細胞（例えば、精巣細胞、卵巣組織細胞および子宮組織細胞、乳腺組織細胞、脳組織細胞、骨格筋組織細胞、および肺組織細胞）において特異的に発現されるレセプターに対応するように、選ばれる。
【００３８】
他の実施形態において、細胞特異的遺伝子標的化ビヒクルのＤＮＡ送達ビヒクル成分は、リポソームと組み合わせた特異的結合リガンドを含み得る。送達される核酸は、上記リポソーム内に収容され、そして、上記特異的結合リガンドは、リポソーム膜内へ機能的に取り込まれる。上記リポソームは、従って、上記標的細胞のレセプターに特異的に結合し、そして上記細胞に内容物を送達する。
【００３９】
（抗体）
特定の実施形態において、本発明は、高い特異性でＰＥＬＰ１ポリペプチドと結合する抗体を提供する。完全長のＮ末端領域またはＣ末端領域に対して生成された抗体に加えて、抗体はまた、エピトープコア領域（野生型エピトープおよび変異体エピトープを含む）を含むより小さい構築物に応答して生成され得る。このようなエピトープの一つの例は、配列番号２０として開示される。このエピトープは、ウサギにおけるＰＥＬＰ１に対する抗体を生成するために用いられている。さらなるエピトープは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列のうちのいずれかに由来し得る。さらに、上に記載されたポリペプチド、フラグメント、改変体、融合タンパク質がは、それらと免疫反応性である抗体を生成する際に、「免疫原」として利用され得る。一般に、単独のＩｇＧもしくはＩｇＭか、またはＩｇＧとＩｇＭの組み合わせが、好ましい。なぜなら、これらは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、そして、どの抗体型にも用いられ得るが、これらが実験環境で最も容易に作製されるからである。
【００４０】
これらの抗原性決定基またはエピトープは、直線状またはコンフォメーション（非連続）のいずれかである。直線状エピトープは、ＰＥＬＰ１ポリペプチドのアミノ酸の一部分から構成され、一方で、コンフォメーションエピトープまたは非連続エピトープは、タンパク質のフォールディングのときに近づく、ポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，ＪｒおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，第２版 １９９６））。エピトープは、当該分野において公知の方法のうちのいずれかによって同定され得る。
【００４１】
従って、本発明の一つの局面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。このようなエピトープは、以下により詳細に記載されるような抗体（特に、モノクローナル抗体）を惹起させるために有用である。加えて、本発明のポリペプチドからのエピトープは、研究試薬として、アッセイにおいて、物質から特異的結合抗体を（例えば、培養ハブリドーマからポリクローナル血清または上精を）精製するために、用いられ得る。このようなエピトープまたはそれらの改変体は、当該分野において周知の技術（例えば、固相合成、ポリペプチドの化学的切断もしくは酵素的切断）を用いてか、または組換えＤＮＡ技術を用いて、精製され得る。
【００４２】
本発明のポリペプチドのエピトープによって励起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、このようなエピトープが単離されていようと、またはそのポリペプチドの一部のままであろうとも、従来技術によって調製され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９９８）参照のこと。
【００４３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、一定の利点（例えば、再現性および大量生産）を有することが認められ、そして、それらモノクローナル抗体の使用は、一般に好ましい。従って、本発明は、ヒトのモノクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体、サルのモノクローナル抗体、ラットのモノクローナル抗体、ハムスターのモノクローナル抗体、ウサギのモノクローナル抗体、ニワトリのモノクローナル抗体、または当業者に公知な任意の他の種源のモノクローナル抗体を提供する。試薬の調製の容易さおよび入手しやすさに起因して、マウスのモノクローナル抗体が、しばしば好ましい。「ヒト化」抗体もまた、企図されるが、しかしながら、ヒトの定常領域ドメインもしくは可変領域ドメインを単独で有するか組み合わせて有するマウス、ラット、または他の種からのキメラ抗体、二重特異性抗体、組換え抗体および改変抗体、ならびにそれらのフラグメントもまた企図される。それらの抗体は、キメラ抗体、およびさらなる改変モノクローナル抗体の生成のための手順としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９、１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９）、ならびにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９，Ｍａｙ，１９９３）に記載された手順を含む。抗体を遺伝子組換え生成する手順は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、およびそれら優先権を主張する関連特許中に見出され得、これらすべては、本明細書中において参考として援用される。
【００４４】
抗体の抗原結合フラグメントは、従来技術によって生成され得、このフラグメントもまた、本発明によって包含される。このようなフラグメントの例としては、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢＳ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などが挙げられるが、限定はされない。遺伝子工学技術によって生成された抗体フラグメントおよび誘導体はまた、提供される。
【００４５】
本発明は、一般的にはモノクローナル型であるＰＥＬＰ１タンパク質、ＰＥＬＰ１ポリペプチド、またはＰＥＬＰ１ペプチドに対する抗体をさらに提供し、これらは、抗体結合体を形成するために一つ以上の他の因子と結合される。十分な選択性、特異性、および親和性の任意の抗体が、抗体結合体の基礎として利用され得る。このような特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法論を用いて評価され得る。
【００４６】
抗体結合体の特定の例は、その抗体が検出可能な標識に結合されている結合体である。「検出可能な標識」は、それらの化合物または要素の特定の機能的特性または化学的特徴に起因して検出され得る化合物または要素であり、それらの使用によって、それらが結合している抗体が検出され、必要に応じてさらに定量化されるが可能になる。別のこのような例は、細胞傷害性因子または抗細胞性因子（「免疫毒素」と呼ば得る）と結合した抗体を含む結合体の形成である。
【００４７】
抗体結合体は、従って、診断用因子として好ましい。抗体診断剤は、一般に、２つのクラス（インビトロ診断剤（例えば、種々の免疫測定法）における使用のため、およびインビボ診断プロトコル用のクラス（抗体指向画像化として一般に公知である））に当てはまる。
【００４８】
標的化合物のアクチベーターまたはインヒビターの構造を確認するために抗体を使用することもまた、可能である。このアプローチは、その後の薬物設計が基礎とし得るファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。抗イディオタイプ抗体を機能的で薬理学的に活性な抗体にすることによりタンパク質結晶学を全て回避することが、可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、もとの抗体のアナログであることが予期される。上記抗イディオタイプは、化学的または生物学的に生成されたポリペプチドの貯蔵源からポリペプチドを同定および単離するために用いられ得る。選択されたポリペプチドは、上記ファーマコアとして役立つ。抗イディオタイプは、抗原としての抗体を用いて、抗体を生成するために本明細書中に記載される方法を用いて生成され得る。
【００４９】
（薬剤）
本発明の特定の実施形態において、上記ポリペプチド、ペプチド模倣物、核酸、または抗体は、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれるか、またはそれらキャリアと組み合わされる。活性化合物はまた、当該分野に公知の任意の経路（非経口経路、腹腔内経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、舌下経路、吸入経路、経口経路などが挙げられる）によって投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての上記活性化合物の溶液は、界面活性化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で、調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。これらの調製物は、保存の間に微生物の増殖を防ぐ防腐剤をしばしば含む。有用かつ望ましいキャリアまたは賦形剤を単独でかまたは組み合わせて選択する方法は、当業者に周知である。
【００５０】
水溶液における非経口投与について、例えば、この溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、そして、液体希釈剤が、十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に、特に適している。この点について、利用され得る滅菌した水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、ある投薬量が、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして、１０００ｍＬの皮下注入液体に加えられる得るか、または提唱された注入部位に注射され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化は、処置される被験体の状態に依存して、必ず生じる。投与の担当者は、いずれにせよ、個々の被験体のための適切な投与量を決定する。
【００５１】
注入可能な使用に適切な薬学的形態としては、滅菌された水溶液または水性分散物、および、滅菌された注入可能な溶液または分散物の即時調製物のための滅菌された粉末が挙げられる。いかなる場合でも、上記形態は、滅菌されなければならず、かつ適切に液体状でなければならない。その形態は、製品条件および保存条件下において、安定でなければならない。そして、上記形態は、微生物（例えば、細菌および新菌）の混入に対して保護されなければならない。上記キャリアは、溶媒または分散媒体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む）であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合には必要粒径の維持によって、ならびに界面活性剤の使用によって維持され得る。本発明の微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって引き起こされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注入可能な組成物の長期に渡る吸収は、吸収を遅らす薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をその組成物中で使用することによって引き起こされ得る。
【００５２】
滅菌された注入可能な溶液は、上に列挙された種々の他の成分とともに、適切な溶媒中で上記活性化合物を必須量取り込むことによって調製され、必要に応じて、ろ過滅菌される。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、滅菌されたビヒクル（基本的な分散媒体、および上に列挙された成分からの他の必要成分を含む）中に取り込むことによって調製される。滅菌された注入可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥技術および凍結乾燥技術である。この技術は、以前に滅菌ろ過した溶液からのさらに望ましい成分を加えることによって、活性成分の粉末を産出する。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、ありとあらゆる溶媒分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。何らかの従来の媒体または因子が上記活性成分と不適合である範囲を除いて、治療組成物におけるそれらの使用が、企図される。補助活性成分もまた、上記組成物中に含まれ得る。
【００５４】
活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野において十分に理解される。典型的に、このような組成物は、注入可能な物質として調製され、溶液または液体懸濁分散物のいずれかとして調製される（注入前の液体中に溶液または懸濁物のために適した固体形態もまた、調製され得る）。上記調製物はまた、乳化され得る。
【００５５】
（スクリーニング）
本発明はまた、化合物がＰＥＬＰ１を調製する能力についての化合物のスクリーニングを企図する。スクリーニング方法は、無細胞系、単離された細胞、または生物（トランスジェニック動物を含む）において行われ得る。無細胞スクリーニング方法の例は、
候補遺伝子を提供する工程；
その候補分子を、単離された化合物、細胞、または実験動物と混合する工程；
その化合物、細胞、または実験動物の一つ以上の特性を測定する工程；および
その一つ以上の特性に対するその候補分子の効果を測定する工程
を包含する。測定可能な特性としては、細胞中の細胞増殖速度、ＰＥＬＰ１局在化、ＰＥＬＰ１−ＥＲ相互作用、またはＰＥＬＰ１−クロマチン相互作用が挙げられるが、限定はされない。
【００５６】
種々の細胞株が、単離された細胞アッセイのために用いられ得る。その細胞株としては、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞、ＭＤＡヒト乳癌細胞、ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞、およびＺＲ７５Ｒヒト乳癌細胞、ＳＡＯＳ−２細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、Ｕ２ＯＳ骨細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ子宮内膜細胞、ＲＬ ９５−２子宮内膜細胞、ＳＷ１７４８子宮内膜細胞、ＨＥＣ１Ａ子宮内膜細胞、ＨＥＣ１Ｂ子宮内膜細胞、ＨｅＬａ細胞が挙げられるが、限定はされない。またはこの目的のために特に操作された細胞（ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１細胞、ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１ ＨＩ変異細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ−ＰＥＬＰ１野生型細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ−ＰＥＬＰ１−ＨＩ変異細胞、もしくはＰＥＬＰ１−Ｔｅｔｏｎ野生型誘導性細胞、ＰＥＬＰ１ ＮＬＳ変異細胞を含むが、限定はされないが、このようなスクリーニングアッセイのために利用され得る。
【００５７】
上記アッセイに依存して、培養が、必要とされ得る。上記細胞は、多数の異なる生理学的アッセイのうちのいずれかを用いて調べられる。あるいは、分子分析（例えば、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現（全細胞もしくはＰｏｌｙＡ ＲＮＡの差次的なディスプレイを含む）などを観察すること）が実施され得る。さらなるスクリーニング方法およびスクリーニングプロトコルの構成は、当業者に周知であり、かつ本発明において有用である。
【００５８】
（治療キットまたは診察キット）
本発明の治療キットまたは診察キットは、適切な容器中に供給された薬学的に受容可能な処方物中にＰＥＬＰ１の少なくとも一つのモジュレーター（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、インヒビター、遺伝子、ベクター、抗体、抗体結合体、または他のエフェクター含むが、限定はされない）を含むキットである。上記キットはまた、伝統的なＳＥＲＭ（例えば、タモキシフェン、または当該分野において公知の他の選択的エストロゲンレセプターモジュレーター）と一緒に、本発明のＰＥＬＰ１モジュレーターのうちのいずれかを含む。上記キットは、単一の容器を有し得るか、または、完全なキットを構成するために多様に供給された化合物各々のための別個の容器を有し得る。
【００５９】
上記キットの構成要素が、一つ以上の液体溶液中に提供される場合は、その溶液は、特に好ましい滅菌された水溶液を含む水溶液である。ＰＥＬＰ１モジュレーターまたは薬学的に受容可能なそれらの塩の組成物はまた、注入可能な組成物へと処方され得る。この場合、上記容器は、シリンジ、ピペット、または他のこのような装置であり得る。この容器から、上記処方物は、体の感染領域に適用され得、動物中に注入され得、またはそのキットの他の構成要素に適用され得るかもしくはその構成要素と混合さえされ得る。
【００６０】
そのキットの構成要素はまた、乾燥粉末として提供され得る。構成要素が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒を加えることにより再構成され得る。上記溶媒は、キットの一部として別々の容器中に提供され得ることが、想定される。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を説明する目的のために提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用された、全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、本明細書によって、本明細書中において参考として援用される。
【実施例１】
【００６２】
（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体のヒストンＨ１結合の特徴付け）
ＰＥＬＰ１中のヒストン結合ドメインの存在を実証するために実験を行った。これらの実験は、ＰＥＬＰ１がクロマチンに補充されるかどうか、ならびに、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１と相互作用するかどうかを調べる。図１Ａは、チャコール処理血清（ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｓｅｒｕｍ）中でＰＥＬＰ１安定クローンを２日間増殖したＣＨＩＰ分析の結果（３０分間、１時間、または３時間、Ｅ２で処理もしくはＥ２無しで処理したか、あるいは、３時間、ＴＳＡで処理した）を示す。Ｔ７−ＰＥＬＰ１を、抗Ｔ７抗体で免疫沈降し、結合したクロマチンを溶出し、そして、ｐＳ２遺伝子（−３５９〜−３０）に特異的なＰＣＲ増幅プライマーを上記ＣＨＩＰ分析に用いた。上記ＣＨＩＰ分析は、エストロゲン刺激がない場合において、ＰＥＬＰ１の基礎蓄積（ｂａｓａｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を示した。３０分間の処理では、ＰＥＬＰ１との結合を何も示さなかった。その後、６０分間のＥ２処理後に補充が増加した。３時間に渡るＥ２処理の継続は、ｐＳ２プロモーターからＰＥＬＰ１の完全な喪失をもたらした。これらの結果は、ＰＥＬＰ１が、動力学的様式でＥ２応答性プロモーターへ補充されること、ならびに、デアセチラーゼ複合体がｐＳ２プロモーターへのＰＥＬＰ１の補充において役割を有し得ることを、示唆する。
【００６３】
図１Ｂに描写されたファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）アッセイの結果は、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１と相互作用することを示す。ネイティブなヒストンを、ＭＣＦ−７細胞から精製し、精製されたＨ３ヒストンもしくはＨ１ヒストン（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。そのゲルを、ニトロセルロースにトランスフェクトし、そして、３５Ｓ標識化ＰＥＬＰ１を、プローブとしての使用するためにインビトロ転写および翻訳系を用いて生成した。ＰＥＬＰ１相互作用バンドを、オートラジオグラフィーによって同定した。この実験の結果は、ＰＥＬＰ１がヒストンＨ１（全ヒストンの構成要素としてのヒストンＨ１、および精製されたヒストンＨ１としてのヒストンＨ１の両方）と特異的に相互作用し得ることを示す。他のヒストン、または精製されたヒストンＨ３との結合は、観察されなかった。
【００６４】
図１Ｃは、発明者によって調製されたＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の構造と、野生型ＰＥＬＰ１の構造とを比較する図である。この変異体は、部位特異的変異誘発によって構築した。ここで、終止コドンは、変異体ＰＥＬＰ１のアミノ酸８７７のコドンの後ろに導入した。コンセンサス核局在化モチーフの位置を、図中の略語「ＮＬＳ」によって示す。
【００６５】
図１Ｄは、野生型ＰＥＬＰ１と対比したＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の発現を示す。Ｃ末端領域の欠失は、一過性トランスフェクションアッセイおよびその後のウェスタン分析によって示されるような、より小さいタンパク質の発現をもたらす。
【００６６】
ヒストンＨ１結合ドメインを欠くＰＥＬＰ Ｈ１変異体の発現は、エストロゲン媒介性転写活性化のブロックをもたらす。ＰＥＬＰ１変異体の機能性は、図１Ｅに描写されたＥＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて実証された。Ｉｓｉｋａｗａ（ヒト子宮内膜腺癌）細胞を、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体と一緒にかまたは無しで、ＥＲＥレポーター遺伝子でトランスフェクトした。次いで、この細胞を、エストロゲンで処理するかまたは処理せず、そして、上記レポーター遺伝子活性を測定した。
【実施例２】
【００６７】
（ＰＥＬＰ１ドミナントネガティブ変異体の特徴付け）
乳癌細胞株ＭＣＦ−７、子宮内膜癌細胞株Ｉｓｈｉｋａｗａ、子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ、および骨肉種ＳａｏＳ２細胞とに、ドミナントネガティブＰＥＬＰ Ｈ１変異体と一緒にかまたは無しで、ＥＲＥルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＥ２（１０−９Ｍ）で処理したかまたは処理せず、そして、２４時間後のルシフェラーゼレポーター活性を測定した。このアッセイの結果は、図２に示される。試験された４つのモデル細胞全てにおいて、エストロゲンの追加は、そのレポーター遺伝子からの転写を数倍刺激した。しかし、ヒストンＨ１変異体の発現は、エストロゲンによる転写活性化の大きさを十分に減少した。これらの結果は、Ｃ末端領域またはＰＥＬＰ１が、正常なエストロゲン媒介性転写機能の維持に重要なヒストンＨ１結合領域を含むことを示す。ＰＥＬＰ１とヒストンＨ１との相互作用は、驚くべきである。なぜなら、ＰＥＬＰ１は、他のＮＲコレギュレータータンパク質とはほとんど相同性を共有しないからである。
【００６８】
従って、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の発現は、乳癌細胞、骨肉種癌細胞、および子宮内膜癌細胞におけるエストロゲン媒介性ＥＲ同時活性化機能を有効に抑制した。
【実施例３】
【００６９】
（ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の効果と、一般に使用される特定の抗エストロゲンの効果との比較）
ＭＣＦ−７細胞またはＨｅｌａ細胞を、ＥＲ応答性レポーター（ＥＲＥルシフェラーゼ）でトランスフェクトした。いくつかの細胞を、ＰＥＬＰ Ｈ１変異体をトランスフェクトし、そして、いくつかの細胞はトランスフェクトしなかった。この細胞を、さらに、エストロゲンでか、ＩＣＩ１８２７８０存在下でのエストロゲンでか、タモキシフェン存在下でのエストロゲンでか、タモキシフェン＋ＰＥＬＰ Ｈ１変異体でか、またはタモキシフェン＋エストロゲン＋ＰＥＬＰ Ｈ１変異体で処理した（図３に示される）。
【００７０】
ＭＣＦ−７細胞株およびＨｅｌａ細胞株の両方において、エストロゲンは、ＥＲＥレポーター遺伝子を刺激し、そして、抗エストロゲンＩＣＩおよびタモキシフェンは、図３の棒グラフに示されるように、ＥＲＥ活性の大きさを減少した。ＰＥＬＰ Ｈ１変異体はまた、Ｅ２媒介性レポーター活性を顕著にブロックし、かつ、ＩＣＩまたはタモキシフェンよりもさらにより強力であった。加えて、タモキシフェンとＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体とを合わせると、試験された１因子または因子の組合せよりも、さらにより有意な阻害をもたらした。
【実施例４】
【００７１】
（腫瘍細胞株におけるＰＥＬＰ１の調節不全）
ＰＥＬＰ１の発現を、種々の細胞株において研究した。タモキシフェン感受性細胞およびタモキシフェン耐性細胞の両方は、同様のレベルのＰＥＬＰ１を発現した。しかし、ＰＥＬＰ１は、タモキシフェン耐性細胞内において差次的に局在することが見出された。腫瘍細胞におけるＰＥＬＰ１発現の免疫組織学的検査は、正常な細胞においてはＰＥＬＰ１が核内に局在化するのに対して、ＰＥＬＰ１がその腫瘍細胞の細胞質内に主に局在することを示した。ＰＥＬＰ１発現の調節不全は、乳房腫瘍および子宮内膜腫瘍の両方において観察された。
【００７２】
理論によって拘束されないが、癌細胞株におけるＰＥＬＰ１の変化した局在化、および、ＳＥＲＭの活性を調節するＰＥＬＰ１の能力は、ＰＥＬＰ１が、ＰＥＬＰ１による非ゲノム性シグナル伝達の活性化機構を介して、タモキシフェンおよびホルモン耐性において一定の役割を果たすことを示すと考えられる。提唱されるＰＥＬＰ１の機構のモデルが、図４に描写される。
【００７３】
通常の生理学的条件下において、ＰＥＬＰ１は、核区画に局在する。エストロゲンは、ＥＲおよびｐＲｂとのＰＥＬＰ１相互作用を促進し、ＥＲ媒介性ゲノム応答（古典的なゲノム経路）を増強する。病理学的な状態（例えば、乳癌）において、ＰＥＬＰ１の局在化は変化し、そして、ＰＥＬＰ１は主に細胞質内に局在する。ＰＥＬＰ１が細胞質内に存在する場合、エストロゲンは、ＰＥＬＰ１−ＥＲとＰＥＬＰ−ｓｒｃのキナーゼとの相互作用を増強する。これらの増強された相互作用は、最終的に、ＭＡＰＫ経路（非ゲノム経路）の活性化、およびＥＲの増加したリン酸化をもたらす。このことは、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）に対する変化したホルモン応答をもたらし、それにより、タモキシフェンの影響に対する耐性に寄与する。
【実施例５】
【００７４】
（ＰＥＬＰ１機能の妨害は、子宮内膜細胞株におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト活性をブロックする）
ＰＥＬＰ１機能の破壊を、タモキシフェン媒介性アゴニストシグナル伝達の妨害を評価するために、子宮内膜細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ）および乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）において行ったレポーター遺伝子活性および細胞増殖アッセイを用いて調べた。癌細胞を、
（ａ）ＰＥＬＰ１ ｃＤＮＡ、
（ｂ）ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体ｃＤＮＡ（アミノ酸 １〜８７７）、
（ｃ）核局在化シグナルを欠くＰＥＬＰ１変異体ｃＤＮＡ（ＰＥＬＰ−ＮＬＳ変異体）、または
（ｄ）ＰＥＬＰ１特異的ｓｉＲＮＡ
のいずれかと一緒に、ＥＲＥレポーター遺伝子で同時にトランスフェクトした。細胞をエストロゲンで２日間刺激し、そして、レポーター遺伝子活性および細胞数を測定した。野生型ＰＥＬＰ１１の過剰発現は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞においては、タモキシフェン媒介性アゴニスト活性を増強したが、ＭＣＦ−７細胞においては増強しなかった。興味深いことに、ＰＥＬＰ１−ＮＬＳ変異体の発現（この変異体は、細胞質内に主に局在する）は、ＭＣＦ−７およびＩｓｈｉｋａｗａ細胞の両方においてタモキシフェン媒介性アゴニストシグナル伝達を増強した。ＰＥＬＰ Ｈ１変異体（１〜８７７）の発現は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるタモキシフェン媒介性アゴニスト活性を妨害した。さらに、ＰＥＬＰ１特異的ｓｉＲＮＡの発現もまた、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞によってタモキシフェン媒介性活性を妨害した。
【実施例６】
【００７５】
（ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡでの細胞の処理は、ＰＥＬＰ１発現レベルを十分に減少した）
ＭＣＦ−７細胞を、コントロールｓｉＲＮＡ、または４種のＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡのカクテルのいずれかと一緒に、ＥＲＥレポーター遺伝子でトランスフェクトした。細胞を、エストロゲンでかまたはエストロゲン無しで処理し、そして、レポーター活性を測定した。細胞溶解物をまた、ＰＥＬＰ１レベルを調べるためにウェスタンブロッティングによって分析した。
【００７６】
図５に示されるように、ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡでのＭＣＦ−７細胞の処理は、ＰＥＬＰ１の発現を十分に減少した。ｓｉＲＮＡを用いるＰＥＬＰ１のダウンレギュレーションはまた、ＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体を発現する細胞において観察されたレベルと同様のレベルになるまでＥＲ媒介性トランス活性化機能に影響した。これらの結果は、ＰＥＬＰ１ ｓｉＲＮＡが、癌細胞におけるシグナル伝達を操作する代替的な方法を提供し得ることを示す。この方法は、ＰＥＬＰ１ポリペプチドおよびＰＥＬＰ１変異体に関与する前に記載された方法と同様である。
【実施例７】
【００７７】
（正常な子宮内膜細胞および癌性子宮内膜細胞におけるＰＥＬＰの発現および局在化）
ＰＥＬＰ１の発現および局在化を、正常な子宮内膜および癌性子宮内膜の両方において特徴付けた。図６は、ＰＥＬＰ１が子宮内膜のすべての段階において発現される一方で、このタンパク質が病期に依存して特徴的な局在化を示すことを示す。
【００７８】
ＰＥＬＰ１は、子宮内膜癌細胞（広く用いられる子宮内膜細胞株（ＩｓｈｉｋａｗａおよびＲＬ ９５−２）を含む）において、広範に発現される。コントロールＭＣＦ−７乳癌細胞（ＥＲα陽性）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲβ陽性）乳癌細胞もまた、分析した（図７Ａ）。モデル系としてＥＲ陽性Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を用いるＥＲトランス活性化アッセイは、ＰＥＬＰ１の同時発現が、リガンドで刺激された細胞において、ベクターでトランスフェクトされた細胞においてＥＲＥルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性の６倍の増加が観察されたのと比較して、９倍増加したことを示す。このことは、ＰＥＬＰ１はまた、子宮内膜細胞においてＥＲのコアクチベーターとして作用することを示唆する（図７Ｂ）。両方のＥＲサブタイプのトランス活性化機能のＰＥＬＰ１による調節は、ＥＲα特異的リガンドまたはＥＲβ特異的リガンドを用いて行われた。ＰＥＬＰ１でトランスフェクトされた細胞を、ＰＰＴ（ＥＲα特異的リガンド）で処理した場合、３ＸＥＲＥｌｕｃレポーター活性は、上記ベクターでトランスフェクトされたコントロールより９倍多く増加した（図７Ｃ）。このことは、ＰＥＬＰ１が、ＥＲα依存性転写を同時活性し、そして、内因性ＥＲαおよびそれの特異的リガンドＰＰＴと協働することを示唆する。これらの結果と一致して、Ｅ２によるＩｓｈｉｋａｗａ細胞の処理は、インビボにおいてＥＲαとＰＥＬＰ１との増強された結合をもたらした（図７Ｄ）。図７Ｅに示されるように、ＥＲβ特異的リガンドＤＰＮでのＩｓｉｋａｗａ細胞の処理はまた、ＥＲＥ−ｌｕｃ活性を刺激した（コントロール細胞において観察されるよりも３倍だけ大きい活性ではあったが）。このことは、ＰＥＬＰ１がまた、ＥＲβの転写活性と協働し得ることを示唆する。ＰＥＬＰ１はまた、ＰＥＬＰ１で同時にトランスフェクトした場合に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＥＲβ転写活性を増強する（図７Ｆ）。さらに、内因性ＰＥＬＰ１は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、リガンド依存性様式で有効にＥＲβと相互作用する（図７Ｇ）。総じてこれらの結果は、ＰＥＬＰ１が両方のＥＲサブタイプのコアチベクターとして作用することを示唆するが、しかしながら、ＰＥＬＰ１は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、ＥＲβより規模の大きいＥＲαの同時活性化を示した。
【実施例８】
【００７９】
（ヒストンとのＰＥＬＰ１の相互作用）
生化学的分析および走査型共焦点顕微鏡分析を、ＰＥＬＰ１の核局在化および機能的関連を実証するために用いた。原子核内分画は、クロマチン画分および核基質画分とのＰＥＬＰ１の結合を示した。リガンド刺激は、１７−β−エストラジオール（Ｅ２）応答プロモーターへのＰＥＬＰ１の補充を促進し、そのＰＥＬＰ１のアセチル化Ｈ３との共局在化を促進し、そして、ＰＥＬＰ１に関連するヒストンアセチルトランスフェラーゼの増加した酵素活性を促進した。ファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析は、ＰＥＬＰ１がヒストン１およびヒストン３（Ｈ１およびＨ３）と相互作用する（Ｈ１に対しての方が優先的である）ことを明らかにした（図８）。欠失分析を用いて、ＰＥＬＰ１のＣ末端領域は、Ｈ１結合部位として同定されている。Ｈ１結合ドメインを欠くＰＥＬＰ１変異体は、ドミナントネガティブとして作用し、そして、ＥＲα媒介性転写をブロックする（図９）。クロマチン免疫沈降分析は、プロモーターとのＰＥＬＰ１の周期的な結合および解離を示す。この周期的な結合および解離は、逆位相で生じるＨ１およびＰＥＬＰ１の補充を伴う。ＰＥＬＰ１の過剰発現は、エストロゲン応答エレメント含有ヌクレオソームのミクロコッカスヌクレアーゼの感受性を増加する。これらの結果は、ＰＥＬＰ１が、癌細胞におけるＨ１の置換を介するクロマチン再構築活性に関与することを示唆する。
【実施例９】
【００８０】
（タモキシフェン耐性におけるＰＥＬＰ１の役割）
６０個の乳癌標本におけるＰＥＬＰ１の局在化を、免疫組織化学によって分析した。ＥＲコアクチベーターであるＰＥＬＰ１の変化した局在化の機能的な結果を調べるために、細胞質中でＰＥＬＰ１を特異的に発現するＭＣＦ−７モデル細胞（ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ）を作製した。ＭＣＦ−７モデル細胞、ＭＣＦ−７−ＰＥＬＰ１野生型モデル細胞、およびＭＣＦ７−ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏモデル細胞に関して、タモキシフェン感受性がＰＥＬＰ１の局在化によって影響されることを示すために、レポーター遺伝子アッセイ、タンパク質ベースの方法、共焦点ベースの方法、および細胞生物学ベースの方法を用いた（図１０）。６０個の乳腺腫瘍標本におけるＰＥＬＰ１の免疫組織学的検査は、ＰＥＬＰ１は、正常な組織中での核局在化とは対照的に、細胞質中に主に位置することを示唆した。ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞は、エストロゲンに対する高感受性を与え、そして、タモキシフェンに対する耐性を示した。ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞はまた、Ｅ２処理の際に過度のＭＡＰＫ活性化を示し、そして構成的なＰ１３Ｋ活性を示した。さらに、ＰＥＬＰ１−ｃｙｔｏ細胞は、Ｐ１３Ｋのｐ８５サブユニットとＰＥＬＰ１との構成的結合を示した。ＰＥＬＰ１ｃｙｔｏ細胞はまた、Ｓｅｒ １１８およびｓｅｒ １６７においてＥＲの増加したリン酸化を示した。これらの結果は、非ゲノムシグナル伝達経路（例えば、ＭＡＰＫおよびＰ１３Ｋ）を活性化し、従って、ＥＲリン酸化を促進する能力を有し、タモキシフェンアゴニスト作用をもたらすコアクチベーター（例えば、ＰＥＬＰ１）の変化した局在化と、そのような作用とが、タモキシフェン耐性をもたらし得ることを示唆する。
【００８１】
本発明の上記の記述は、単に本発明を例示することが意図され、そして、本発明の他の実施形態、改変、および等価物は、本発明書に添付された特許請求の範囲において記載される本発明の範囲内にある。開示される概念および具体的な実施形態が、本発明と同じ目的を実施するために他の組成物または方法を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって認識されるべきである。このような同等な組成物または方法が、添付された特許請求の範囲において示される本発明の精神と範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されるべきである。
【００８２】
（参考文献）
【００８３】
【化１】
【００８４】
【化２】
【００８５】
【化３】
【００８６】
【化４】
【００８７】
【化５】
【００８８】
【化６】
【００８９】
【化７】
【００９０】
【化８】
【図面の簡単な説明】
【００９１】
以下の図面は、本明細書の一部であり、そして本発明の特定の局面をさらに例示するために含まれる。本発明は、一つ以上のこれらの図を、本発明の要旨および本明細書中に提示された具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良く理解され得る。
【図１】図１Ａは、エストロゲン存在下でのＰＥＬＰ１とクロマチンとの基礎的かつ動的な関連を示す、クロマチン免疫沈降分析である。図１Ｂは、ファーウェスタン（Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）方法によるＰＥＬＰ１ヒストンＨ１結合アッセイである。図１Ｃは、ＰＥＬＰ１野生型およびＰＥＬＰ１変異体の図である。図１Ｄは、ＰＥＬＰ１野生型、およびＰＥＬＰ１（１〜８７７）欠失変異体ＰＥＬＰ１ Ｈ１ＭＴのポリアクリルアミドゲルである。図１Ｅは、ＥＲＥレポーター遺伝子アッセイによって決定されたＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体（ＰＥＬＰ１ Ｈ１ＭＴ）の発現によるレポーター遺伝子活性化のエストロゲン媒介性誘導のダウンレギュレーションを示す棒グラフである。
【図２】図２は、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、子宮内膜癌細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、および骨癌細胞株（ＳａｏＳ２）における、エストロゲン媒介性レポーター遺伝子活性に対するＰＥＬＰ（アミノ酸 １−８７７）Ｈ１変異体の効果を示す。
【図３】図３は、一般に使用される特定の抗エストロゲンの効果と比較した、エストロゲン媒介性レポーター遺伝子活性のブロックにおけるＰＥＬＰ１ Ｈ１変異体の効果を示す。
【図４】図４は、ＰＥＬＰ１の機能についての提唱モデルを描写した図であるが、本発明は、この理論図によって拘束されない。
【図５】図５は、ＭＣＦ−７細胞におけるエストロゲン媒介性ＥＲＥレポーター遺伝子の発現に対するＰＥＬＰ１のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図６】図６は、ヒトの子宮内膜におけるＥＲα、ＥＲβ、およびＰＥＬＰ１の免疫反応性染色の概要を示す。
【図７】図７は、子宮内膜細胞におけるＥＲαおよびＥＲβとのＰＥＬＰ１の機能的相互作用に関連する結果を示す。
【図８】図８は、ヒストンＨ１およびヒストンＨ３とのＰＥＬＰ１の相互作用を示す。
【図９】図９は、Ｅ２媒介性トランス活性化に対する、Ｃ末端ヒストン結合領域が欠けているＰＥＬＰ１変異体に効果を示す。
【図１０】図１０は、タモキシフェン耐性に対するＰＥＬＰ１の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、５、７〜１３、または１４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７〜１３、１４、または２０の少なくとも７アミノ酸のＲＥＬＰ１ポリペプチドと結合し得る、ＰＥＬＰ１特異的抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体であって、該抗体はモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項４】
配列番号４、６、または１５のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５】
ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号１６、１７、１８、または１９のｓｉＲＮＡを含む、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、ペプチド模倣物。
【請求項８】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項２に記載のＰＥＬＰ１特異的抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項５に記載のｓｉＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載のペプチド模倣物と、薬学的に容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１】
配列番号３、５、７〜１３、または１４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７〜１３、１４、または２０の少なくとも７アミノ酸のＲＥＬＰ１ポリペプチドと結合し得る、ＰＥＬＰ１特異的抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体であって、該抗体はモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項４】
配列番号４、６、または１５のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５】
ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号１６、１７、１８、または１９のｓｉＲＮＡを含む、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
ＰＥＬＰ１活性を妨害し得る、ペプチド模倣物。
【請求項８】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項２に記載のＰＥＬＰ１特異的抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項５に記載のｓｉＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載のペプチド模倣物と、薬学的に容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５０３８１０（Ｐ２００７−５０３８１０Ａ）
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２４８６９（Ｐ２００６−５２４８６９）
【出願日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１８５７５
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５０３０４９６６７）ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１８５７５
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５０３０４９６６７）ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム (8)
【Ｆターム（参考）】
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