エリスロポエチンの精製
本発明において、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を使用する少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含むエリスロポエチンの精製する方法を報告する。この方法は、以下の工程：ｉ）カルシウムイオンを含有する溶液中のエリスロポエチンを、カルシウムイオンを含有する溶液で平衡化させた、即ち、エリスロポエチンがヒドロキシアパタイトを含有する固定相と結合する条件下で、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触させ、ii）前溶液より少ないカルシウムイオンを含有する溶液を、ｉ）由来のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、その際はエリスロポエチンがヒドロキシアパタイト含有固定相から分離されず、そして、iii）０．５mMを下回るカルシウムイオンを含有するさらなる溶液を、ii）由来のヒドロキシアパタイト含有固定相を通過させ、それにより、エリスロポエチンをヒドロキシアパタイト含有固定相から分離する、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用するエリスロポエチン（ＥＰＯ）の精製方法を報告するものである。さらに、宿主細胞のタンパク質を涸渇させる方法およびＥＰＯ組成物のイソ型分布を改変する方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の産生を刺激するヒトの糖タンパク質である。その作用および治療適用は、例えばＥＰ０１４８６０５、ＥＰ０２０５５６４、ＥＰ０２０９５３９およびＥＰ０４１１６７８、ならびにHuang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712、Lai, P.H., et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、およびSasaki, H., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076に詳細に記載されている。
【０００３】
ＥＰＯは、健康な人間の血漿中にはごく低濃度でしか存在しない。再生不良性貧血患者の尿からのヒトＥＰＯの単離が知られている（Miyake, T., et al., J. Biol. Chem. 252 (1977) 5558-5564）。イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過および吸着クロマトグラフィーを含む７段階法が記載されている。ＥＰ０１４８６０５およびＥＰ０２０５５６４は、ＣＨＯ細胞における組換えヒトＥＰＯの生産を報告している。組換え産生されたＥＰＯの精製方法は、Nobuo, I., et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359に記載された。
【０００４】
エリスロポエチンを生産および精製するさらなる方法が知られており、特にＥＰ０１４８６０５、ＥＰ０２０５５６４、ＥＰ０２５５２３１、ＥＰ０８３０３７６、ＥＰ０２６７６７８、ＥＰ０２２８４５２、ＥＰ１１２７０６３、ＥＰ０２０９５３９、ＥＰ０３５８４６３、ＥＰ１０１０７５８、ＥＰ０８２０４６８、ＥＰ０９８４０６２、ＥＰ０６４０６１９、ＥＰ０４２８２６７、ＥＰ１０３７９２１ならびにLai, P.H., et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、Broudy, V.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 265 (1988) 329-336、Zou, Z., et al., Journal of Chrom. 16 (1998) 263-264、Inoue, N., et al., Biol Pharm. Bull. 17 (1994) 180-184、Qian, R.L., et al., Blood 68(1) (1986) 258-262、Krystal, G., et al., Blood 67(1) (1986) 71-79、Lange, R.D., et al., Blood Cells 10(2-3) (1984) 305-314、Sasaki, R., et al., Methods Enzymol. 147 (1987) 328-340、Ben Ghanem, A., et al., Prep. Biochem, 24 (1994) 127-142、Cifuentes, A., et al., J. Chrom. A 830 (1999) 453-463；およびGokana, A., et al., J. Chromat. A 791 (1997) 109-118に記載されている。
【０００５】
ＥＰ１３９４１７９は、動物タンパク質を含まないエリスロポエチンを生産する方法を報告している。ＥＰ０９８６６４４の主題はウイルスプロモーターを用いた内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの生産である。ＥＰ１４２８８７８には、組換え糖タンパク質、特にエリスロポエチンの生産方法が報告されている。ＥＰ１４９２８７８には、所望プロファイルのエリスロポエチン糖イソ型を生産する方法が報告されている。
【発明の概要】
【０００６】
組換えエリスロポエチンの生産および精製には、幾つかの工程、特にクロマトグラフィー工程が必要である。
【０００７】
本発明の第一の局面は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を有する少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含むエリスロポエチンの生産方法であって、
ｉ）０．５mM〜２０mM濃度でカルシウムイオンを含有するエリスロポエチン含有溶液を、同濃度０．５mM〜２０mMでカルシウムイオンを含有する溶液で平衡化したヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触すること、
ii）０．５mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過すること、
iii）０．５mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、それによりエリスロポエチンを生産すること、
を含む、エリスロポエチンの生産方法である。
【０００８】
或る態様では、生産されたエリスロポエチンは、ｉ）のエリスロポエチン含有溶液と比較して、ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ種およびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ種が涸渇している。さらなる態様では、本発明は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を伴うクロマトグラフィー工程に加えて、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィー工程を含む。さらなる態様では、全てのクロマトグラフィー工程が各々異なるクロマトグラフィー原理に基づいており、それにより、各クロマトグラフィー原理がその方法において１回だけ利用される。さらなる態様では、そのクロマトグラフィー原理は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および／または陰イオン交換クロマトグラフィーから選ばれる。さらなる態様では、クロマトグラフィー工程の順序は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー、場合により逆相クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーである。或る態様では、本発明方法は、該クロマトグラフィー工程に加えて、場合により中間工程、例えば塩析、濃縮、透析濾過、限外濾過、透析、および／またはエタノール沈殿を含む。
【０００９】
本発明の１つの局面は、本発明方法を用いて取得したエリスロポエチン組成物である。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、本発明に係るヒドロキシアパタイト含有固定相を伴うクロマトグラフィー工程を含む、エリスロポエチン調製物からチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞タンパク質を涸渇させる方法であって、この場合、エリスロポエチン含有画分の収集が、２８０nmでの光吸収により調節され、１５mAU〜７５mAUの吸収で始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する。
【００１１】
或る態様では、ヒドロキシアパタイト含有固定相は純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトである。別の態様では、工程ii）および／またはiii）のクロマトグラフィーで使用される溶液は、およそ５mM濃度のリン酸イオンを含有し、別の態様では、５mMのリン酸ナトリウムまたは同カリウムを含有する。
【００１２】
本発明の別の局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比率が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲であるエリスロポエチンイソ型の混合物であるエリスロポエチン組成物を調製する方法である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１３】
したがって、本発明のさらなる局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比率が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲であるエリスロポエチンイソ型の混合物であるエリスロポエチン組成物である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１４】
或る態様では、エリスロポエチン組成物は、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１５】
したがって、本発明のさらなる局面は、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲であるエリスロポエチン組成物である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有するエリスロポエチンイソ型の混合物であり且つ本発明方法により得られたエリスロポエチン組成物である。
【００１７】
さらに別の本発明の局面は、エリスロポエチンをコードしている核酸を含む宿主細胞を、適当な培地中でエリスロポエチンの産生に好適な条件下で培養し、そのエリスロポエチンを培地または該細胞から単離することを含む、組換えエリスロポエチンの生産方法である。或る態様では、該細胞を浮遊培養する。さらなる態様では、該細胞を発酵槽、特に１０ｌ〜５００００ｌ容量の発酵槽で培養する。
【００１８】
培地からのエリスロポエチンの単離は以下の工程を含む：
（ａ）細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｂ）場合により、（ａ）の画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の画分を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、および本発明方法を利用してエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｄ）（ｃ）の画分を濃縮しまたは／そして逆相ＨＰＬＣ材料を通過させること
【００１９】
精製方法の工程（ａ）は、場合により前処理されていてもよい細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に通すことを含む。或る態様では、そのアフィニティークロマトグラフィー材料は、青色染料をカップリングさせてあるアフィニティークロマトグラフィー材料である。一例はブルーセファロースである。或る態様では、発酵／その産生に血清含有量が≧２％（ｖ／ｖ）の培地が使用された場合には、エリスロポエチンを含有する溶出液をアフィニティークロマトグラフィー材料から溶出させた後、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を通過させる。或る態様では、その疎水性相互作用クロマトグラフィー材料はブチルセファロースである。工程（ａ）、または採用された場合には工程（ｂ）由来の溶出液を、工程（ｃ）においてヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、エリスロポエチンを含有する溶出液を単離する。或る態様では、濃縮は排除クロマトグラフィー、例えば膜濾過による。この場合、例えば排除サイズ１０kDaの膜の使用が有利であることが判明している。本発明方法によって得られるエリスロポエチンは、α−２，３−結合した、または／およびα−２，６−結合したシアル酸残基を含み得る。
【００２０】
本発明の別の局面は、以下の工程：
ａ）活性化ポリ（エチレングリコール）試薬を用いてエリスロポエチンを共有結合させ、即ちＰＥＧ化すること、
ｂ）このポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを、２つの連続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製すること、およびそれによりポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産すること、
を含む、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法であって、
工程ａ）で使用されるエリスロポエチンは、本発明方法により取得する、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法である。
【００２１】
本発明の別の局面は、本発明方法により得られたエリスロポエチンを含む、医薬組成物である。本発明に係る組成物は、場合により従来の薬学的希釈剤、賦形剤、助剤および担剤と共に、薬学的調製物として調合できる。薬学的調製物の生産に使用できる本発明に係る組成物は、逆相ＨＰＬＣ（例えばヴィダックＣ４カラムによる）または／およびサイズ排除クロマトグラフィー（例えばＴＳＫ ２０００ＳＷ ウルトラパックカラムによる）で測定した場合、少なくとも９９％、または別の態様では少なくとも９９．９％の純度を有する。本発明のさらなる局面は、本発明方法を用いて得られたエリスロポエチンを含む、貧血を処置するための医薬組成物である。
【００２２】
発明の詳細な説明
異なった物質がクロマトグラフィーによって相互に分離できるかどうかは、特に、そのクロマトグラフィーが実施される条件、加えて良好なカラム充填およびクロマトグラフィー材料（固定相）の選択に依存する。これには、緩衝系の選択に加えて、不純物および生成物が溶離される様式が包含される。
【００２３】
本発明は、以下の工程：
ｉ）第一濃度のカルシウムイオンを含有する、精製すべきエリスロポエチン溶液を、第二濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触させること、
ii）ｉ）由来の溶液より低い濃度、即ち第三濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に通すこと（それにより、この通過の間、エリスロポエチンは、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に結合したままであり／ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離されない）、および、
iii）０．５mMを下回る、即ち第四濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ii）由来のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること（それにより、エリスロポエチンが、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離され溶出する）、
を含む、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含む、エリスロポエチンの精製方法を報告するものである。
【００２４】
或る態様では、第一および第二ならびに／または第三および第四濃度は異なっている。別の態様では、第三および第四のカルシウムイオン濃度は、第一および第二カルシウムイオン濃度の１０％またはそれ以下である。
【００２５】
以下、ＥＰＯとも称するエリスロポエチンは、赤血球前駆細胞の分化および分裂プロセスを刺激し赤血球を与える生物学的能力を有するタンパク質として理解される。このタンパク質は好ましくはヒトエリスロポエチンであり、１６５または１６６アミノ酸で構成され（配列番号１および２）、分子量は約３４〜３８kDaである。グリコシル残基が分子量の約４０％を占める。類似の生物学的性質を有しＥＰＯ産生宿主細胞の培養により得られるエリスロポエチンを含む、ＰＥＧ化ＥＰＯ、即ちポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンのようなＥＰＯの誘導体およびフラグメントもまた本発明方法により製造できる。ヒトＥＰＯのＤＮＡ配列およびタンパク質配列が、特にＥＰ０２０５５６４およびＥＰ０２０９５３９に記載されている。
【００２６】
ＥＰＯの構造は２個のジスルフィド橋および幾つかの糖鎖を含む。以下、グリコシル残基とも称するこの糖鎖は、タンパク質骨格に結合している。幾つかの鎖はアスパラギン残基を介してＮ−グリコシド結合でこのタンパク質に結合し、１個の鎖はセリン残基を介してＯ−グリコシド結合でこのタンパク質に結合している。
【００２７】
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）は通常、（分岐または非分岐）グリコシル残基の末端に組み込まれている。このグリコシル残基はその後もはや延長できない。シアル酸はＧａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃのα２−３結合にのみ結合できる（Nimtz, M., et al., Eur. J. Biochem. 213 (1993) 39-56）。
【００２８】
「アンテナリティ」または「グリコシル残基のアンテナリティ」という語は、グリコシル残基の分岐の程度を指す。或るグリコシル残基が例えば２本の腕を有する場合、そのグリコシル残基はバイアンテナリーであり、即ちそれはバイアンテナリーグリコシル残基である。グリコシル残基は、反復部分、いわゆるリピートを有することがある。これらは、配列ＧｌｃＮＡｃおよびガラクトース（Ｎ−アセチルラクトサミン）が反復している領域である。グリコシル残基の鎖長、したがってそのタンパク質の分子量は、リピートの数が相違しているために異なっている（Nimtz, M., et al., Eur. J. Biochem. 213 (1993) 39-56）。ＥＰＯの場合、トリアンテナリーグリコシル残基は最大１リピートしか含むことができず、一方テトラアンテナリーグリコシル残基は２リピートより多くを含むことができない。バイアンテナリーグリコシル残基はリピートを持たない。
【００２９】
エリスロポエチンは多重グリコシル化タンパク質である。グリコシル残基の変異および様々な程度のシアリデーション（sialidation）の故に、自然界でもバイオテクノロジー的生産においても、異なったグリコシル化型およびイソ型が出現する。高率のリピートはさらに、in vivo活性に好ましい影響を及ぼす（例えばＥＰ０４０９１１３を参照されたい）。
【００３０】
エリスロポエチンは１０の主要なイソ型で構成される。「イソ型」という語は、同一のアミノ酸配列および同数の結合シアル酸残基を有するＥＰＯ分子の一群を指す。このイソ型群は、同じ等電点を持ち、アミノ酸配列に結合したグリコシル残基の広がり、複雑性およびアンテナリティに関して相違する。例えば、「ＥＰＯのイソ型２」という語は、１４個のシアル酸残基を有するＥＰＯ分子の一群を包含する。イソ型３は１３個のシアル酸を有する、等々である。さらに、末端に存在しないさらなるシアル酸を有する稀な型のＥＰＯがある。即ち、イソ型１は１５個、そしてイソ型１’は１６個の、グリコシル残基に結合したシアル酸を有する。
【００３１】
本発明の或る局面は、高純度且つ或るエリスロポエチンイソ型分布を有するエリスロポエチンを製造する方法であり、その方法は、最初のエリスロポエチンイソ型分布が変化するような、異なるクロマトグラフィー工程の組み合わせを含む。該方法の、異なるクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を有するクロマトグラフィー工程、ならびに、ｉ）色素アフィニティークロマトグラフィー、ii）疎水性相互作用クロマトグラフィー、iii）陰イオン交換クロマトグラフィー、iv）逆相クロマトグラフィー、および／またはｖ）ゲル浸透クロマトグラフィー、から選ばれるクロマトグラフィーのうち少なくとも１つを含む。この局面の１つの態様では、減少した数のシアル酸残基を有するエリスロポエチンイソ型が涸渇しまたは完全に分離される。本出願の中では、「完全に」という語は、濃度／量がその方法の検出限界を下回るため、対応化合物が所定の分析方法によってもはや検出できないことを意味する。或る態様では、エリスロポエチン１分子あたり最大３、または最大４、または最大５（５を含む）個のシアル酸残基を有するエリスロポエチンイソ型が涸渇し、または完全に分離される。或る態様では、イソ型混合物が６〜１５のシアル酸基、または７〜１５のシアル酸基を有するイソ型を含むエリスロポエチンが得られる。
【００３２】
様々なグリコシル残基およびイソ型に加えて、さらなるＥＰＯ型が存在する。ｄｅ−Ｎ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ型の場合、これらは、完全には翻訳後グリコシル化されておらず、セリン残基１２６（ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ）またはアスパラギン残基２４（ｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ）においてグリコシル化されていない種である。
【００３３】
ヒドロキシアパタイトは、実験式Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨを有するリン酸カルシウムに基づく無機化合物である。クロマトグラフィー固定相として、それはタンパク質、酵素、免疫グロブリンおよび核酸の分離に好適である。それは自然界では主に骨および歯牙エナメル質に存在している。ヒドロキシアパタイトの形成は高いｐＨ値が有利である。ヒドロキシアパタイトは酸性ｐＨ値で溶解する。ヒドロキシアパタイトの様々な結合メカニズムがクロマトグラフィー分離に利用されており、クロマトグラフィー分離においてそれは主として吸着剤として働くが、イオン交換材料の性質も持っている。タンパク質の正に荷電したアミノ基（例えばリジン）および固定相の負に荷電したリン酸基の間にはイオン結合の形成が可能である。さらに、タンパク質のカルボキシ基（例えばアスパラギン酸）はヒドロキシアパタイトのカルシウムイオンと結合できる。この材料の特徴は、固定相のリン酸基および溶液中のカルシウムまたはマグネシウムイオンおよびタンパク質のカルボキシ基の間に複雑な結合が生じ得ることである（M. Kratzel, “Pharmazeutische Bioanalytik” Part 5, University of Vienna）。
【００３４】
種々のヒドロキシアパタイト材料が知られている。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、或る態様では低いリン酸塩濃度において溶出する。
【００３５】
本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相はアガロース骨格中に組み込まれたヒドロキシアパタイトで構成される。好適なカラム材料は例えばヒドロキシアパタイトウルトロゲル（BioSepra, Germany）またはＨＡバイオゲルＨＴ（Biorad, Germany）である。クロマトグラフィーはほぼ中性ｐＨで実施するのが有利である。アガロースマトリックスに埋め込まれたヒドロキシアパタイトは、純粋なヒドロキシアパタイトと比較して、より高い耐圧性を有する（例えばＨＡ ウルトロゲルとして入手可能）。この材料は５０μm〜１６０μmという不均一な粒子サイズ分布を持ち、主要な画分は７０μm〜９０μmである。表面は非常に粗く、粒子は限られた範囲内でのみ球状である。
【００３６】
別の態様では、本発明方法で使用されるヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、高温高圧で焼結させた純粋なヒドロキシアパタイトで構成される（例えばＣＨＴ（Biorad由来のセラミックヒドロキシアパタイト）として入手可能）。これは耐圧性材料であり、比較的対称性且つ一様に球状であり、比較的滑らかな表面を有する粒子で構成される。この粒子はＣＨＴ−１型では約４０μmのサイズおよび約４０m2/gの比表面積を有する。平均粒子サイズは２０μm〜３０μmである。ＣＨＴ材料２型は、特に免疫グロブリンのようなより大きな分子のために開発された。ＣＨＴ−２型の比表面積は１９m2/gであり、よってＣＨＴ−１型の比表面積のほぼ半分である。その粒子はＣＨＴ−１型と類似の形態である。この粒子もまた約４０μmのサイズを有する。したがって本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、高温高圧で焼結させた、比表面積約４０m2/gのヒドロキシアパタイトである。
【００３７】
さらなる態様では、本発明方法で使用するためのヒドロキシアパタイト含有固定相は、純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトで構成される（例えば、Calbiochem由来のヒドロキシアパタイトファストフローとして入手可能）。その粒子は菱形であり、５０μm〜１００μmのサイズである。
【００３８】
図１は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相（ＨＡ−ウルトロゲル）によるエリスロポエチンのクロマトグラフィーのクロマトグラム例を示す。枠で囲んだ領域は、分画された生成物のピークであり、これを画分１〜１６に細分した。画分１７はピークショルダーであり、別個の画分として集めた。個々の画分の純度はピークを超えるとほぼ直線的に減少している（図２を参照されたい）。
【００３９】
ヒドロキシアパタイトを含有する前記の様々な固定相を、エリスロポエチンを精製するための同じクロマトグラフィー法を用いて比較し、それを実施例４に記載する。
【００４０】
【表１】
【００４１】
或る態様では、ＣＨＯタンパク質の濃度が１５ng/mlを下回るならばその試料はＣＨＯタンパク質を含まないとみなした。セラミックおよび結晶性ヒドロキシアパタイト材料は、異なる量のエリスロポエチンをロードした場合同等であるが、一方アガロースを基礎とする材料では、収量および生成物の品質は、５mgＥＰＯ／mlカラム材料のロードにおいてかなり低下することが見出された。即ち、ＨＡウルトロゲルヒドロキシアパタイト材料による分離では、分離中に１０％近いエリスロポエチンが失われる。
【００４２】
分析用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるエリスロポエチン含有画分の分析は、エリスロポエチンピークの減少側にあるほぼ全ての画分において生成物ピークが肩部を有することを示し（図３）、それがｄｅ−Ｏ−ＥＰＯであると同定された。このｄｅ−Ｏ−ＥＰＯの割合を、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムに垂線を引くことにより半定量的に決定し、ＥＰＯの量と共に図４に示す。この肩部が形成される理由は、バイアンテナリーおよびトリアンテナリーグリコシル残基含有ＥＰＯ型がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて特に涸渇するためである。これらの型は一方で、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣではｄｅ−Ｏ−ＥＰＯの直前に溶出する。この選択的涸渇の結果、ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ肩部が際立つのである。
【００４３】
タンパク質様不純物は溶出ピーク全体にわたって分布するが、前方の画分は、後方の画分より低い割合のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有する（図５を参照されたい）。
【００４４】
疎水性ＥＰＯグリコシル型がより多いため、エリスロポエチンの疎水性は後方のＥＰＯ含有画分で増大する。ヒドロキシアパタイトを含有する固定相でのクロマトグラフィーは、特に塩基性イソ型、即ちより少ないシアル酸を含有するイソ型を涸渇させる。図６に示すように、シアル酸残基の数はエリスロポエチン含有画分全体で一様に低下する。塩基性は、イソ型１からイソ型９までは増大する。一方酸性イソ型は最初のエリスロポエチン含有画分（画分１〜画分５）に多く、最後の方のエリスロポエチン含有画分（画分１２〜画分１６）では塩基性イソ型へのかなりのシフトが見られる（図７）。グリコシル型の分析は、親水性ＥＰＯ型が最初の画分に溶出し、それが高い含有量のテトラアンテナリー構造およびより多くのリピートを有することを示している。より少ないリピートまたは高い比率のトリアンテナリー構造を有するより疎水性のＥＰＯ型は後で溶出し、その過程はテトラアンテナリーグリコシル型とは逆である（図８）。バイアンテナリーグリコシル型の比率は徐々に増大する（図９）が、一方その増加は一様ではなく段階的である。
【００４５】
図１０もまた生成物ピーク全体におけるグリコシル型の分布を示している。高いリピート含量を有するテトラアンテナリーグリコシル型が最初のＥＰＯ含有画分（例えばＦ１、画分１）に存在するのに対し、最後のＥＰＯ含有画分（例えばＦ１６、画分１６）には高い比率のトリアンテナリーおよびバイアンテナリーグリコシル型が存在する。したがって、本発明方法によるヒドロキシアパタイト含有固定相のクロマトグラフィーでは、よりグリコシル化の少ないＥＰＯ型は涸渇し、後で溶出することが見出された。
【００４６】
ＣＨＯ宿主細胞タンパク質の含有量もまた末期のＥＰＯ含有画分において増大する。その結果、より良好なＥＰＯおよびＣＨＯ宿主細胞タンパク質の分離ができる、即ちＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有するより著明な肩部を伴うクロマトグラフィー法を利用して、良好な分離、およびＣＨＯ宿主細胞タンパク質の涸渇が達成できる（図１１を参照されたい）。故に、本発明の或る局面は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィーにおいてエリスロポエチン含有画分中のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を除去する方法であって、本発明の或る態様において、エリスロポエチン含有画分の収集が、１５mAU〜７５mAUで始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する波長２８０nmでの光吸収によって調節されることを特徴とする、方法である。
【００４７】
或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は結晶性ヒドロキシアパタイトである。この固定相は、生成物ピークが一般に極めて平坦であり、際立った肩部を有するが故に好適である。さらなる態様では、クロマトグラフィーに使用される洗浄および溶離工程の溶液は、５mM濃度のリン酸イオンを含有する。このリン酸濃度を採用することにより、ＥＰＯ含有画分中のＣＨＯ宿主細胞タンパク質の量を、対応する分析法の定量または検出限界未満の値まで低下／涸渇させることができるため、このリン酸イオン濃度が、セラミックヒドロキシアパタイト含有固定相によるエリスロポエチンの精製にとって有利であることが見出されている。
【００４８】
ヒドロキシアパタイトを含有する種々の固定相を用いて得られたエリスロポエチンのイソ型分布を図１２に示す。ヒドロキシアパタイト含有固定相の種類およびロードのいずれもイソ型分布に大きな影響を及ぼさないことが見出された。セラミックおよび結晶性ヒドロキシアパタイト相の特徴は、これらはアガロース型ヒドロキシアパタイト相よりも塩基性イソ型を幾分多く涸渇させるということである。或る態様では、本発明により得られたエリスロポエチンの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したところ９９．３％を上回る。或る態様では、場合により５mg/mlのロードにおいて、得られるＥＰＯの純度はＲＰ−ＨＰＬＣで測定したところ９９．３％〜９９．９％である（％＝ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムに基づく面積パーセント）。固定相間の相違はＣＨＯ宿主細胞タンパク質の涸渇／分離においても観察される。アガロース型ヒドロキシアパタイト相および結晶性ヒドロキシアパタイト相は、セラミックヒドロキシアパタイト相より有効性が低い。よって本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相はセラミックヒドロキシアパタイト相である。
【００４９】
ヒドロキシアパタイト含有固定相によるクロマトグラフィーに使用される溶液中に含まれるカルシウムイオン濃度は精製に明らかな影響力を持ち、故に、それにより得られるエリスロポエチンの純度にも影響力を持つことが見出された。溶液中のカルシウムイオン濃度が低下すると、殆どのエリスロポエチンが、段階的溶離によって（即ち、溶液３〜溶液４の工程によって）ヒドロキシアパタイト含有固定相から取得できる（実施例４および８、ならびに図１３を参照されたい）。エリスロポエチンの溶出後に（溶液５への変更に伴う）カルシウムイオン濃度が増大すると、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質およびＤＮＡがヒドロキシアパタイト含有固定相から溶出する。低下したカルシウムイオン濃度の溶液により得られたエリスロポエチン画分は、その後溶出するエリスロポエチン画分より遙かに酸性である（図１４を参照されたい）。増大したカルシウムイオン濃度で得られたピークの減少側は極めて平坦であり、即ち、それは多くのＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有する。これに対して、低下したカルシウムイオン濃度で得られたピークは極めて対称性である。
【００５０】
本発明は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を使用する少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含むエリスロポエチンの精製法を含み、その方法は、
ｉ）ａ）エリスロポエチンおよび第一濃度でカルシウムイオンを含有する第一溶液を提供すること、
ｂ）第二濃度でカルシウムイオンを含有する、或る容量の第二溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイト含有固定相を提供すること（平衡化工程）、
ｃ）ａ）の溶液をｂ）で得られた固定相に適用すること、
ii）第一および第二溶液よりも低い第三濃度のカルシウムイオンを含有する第三溶液を、工程ｉ）で得られたヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること（洗浄工程）、および、
iii）０．５mMまたはそれ以下のカルシウムイオンを含有する第四溶液の或る容量を、ii）由来のヒドロキシアパタイト含有固定相を通過させること、それにより、ヒドロキシアパタイト含有固定相からエリスロポエチンを分離回収すること、およびこのことによって精製エリスロポエチンを得ること（溶出工程）、
を含む。
【００５１】
第一の態様では、カルシウムイオンの第一濃度はカルシウムイオンの第二濃度と同じである。さらなる態様では、第二溶液および第三溶液は２−プロパノールを含有する。さらなる態様では、カルシウムイオンの第一および／または第二濃度は４mM〜２０mMである。さらなる態様では、カルシウムイオンの第一および／または第二濃度は５mMである。さらなる態様では、この溶液のｐＨ値はｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、２−プロパノール含有量は７〜１２％（ｖ／ｖ）であり、或る態様では９％（ｖ／ｖ）である。さらなる態様では、カルシウムイオンの第三濃度は０．５mMに等しいかそれ以下であり、或る態様では０．０００００１mM〜０．５mMである。さらなる態様では、カルシウムイオンの第三濃度は０．１mMに等しいかそれ以下であり、或る態様では０．０００００１mM〜０．１mMである。別の態様では、第四溶液は０．１mMまたはそれ以下のカルシウムイオンを含有し、或る態様では０．０００００１mM〜０．１mMである。さらなる態様では、４〜７カラム容量の第二溶液をカラムに適用する。さらなる態様では、カラムに適用する第三溶液の容量は０．５〜２．５カラム容量である。さらなる態様では、工程ii）において固定相から少量のエリスロポエチンしか溶出／分離されない。さらなる態様では、この量は固定相に結合しているエリスロポエチンの１０％未満であり、別の態様では５％未満であり、最後の態様では１％未満である。さらなる態様では、カルシウムイオンはＣａＣｌ２としてこの溶液に導入される。本発明方法の或る態様では、第二溶液は、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５M ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノールを含有しｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、第三溶液は、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５M ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノールを含有しｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、第四溶液は、１０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌを含有しｐＨ６．９±０．２である。例えば９％（ｖ／ｖ）という値は、９％の２−プロパノールを提供し、調製された溶液を、最終容量が得られるまで添加することによってその溶液が作製されることを意味する。
【００５２】
テトラアンテナリーグリコシル型の量は、第五溶液で得られた画分に比較して第四溶液で得られた画分において増加する。しかしながら、第五溶液で得られた画分は、バイアンテナリーおよびトリアンテナリーグリコシル型の比率がより高い。さらに、第五溶液を使用すると、修飾無しのＣａＣｌ２によるＣＨＴ２型のランに比較して、より高率のｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ種が画分中に見出されることが判明した。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、ＥＰＯをコードしている核酸を含む細胞を適当な培地で適当な条件下に培養し、培地または細胞からエリスロポエチンを単離することを含む、エリスロポエチンの生産方法である。或る態様では、この細胞を浮遊培養する。さらなる態様では、この培養を発酵槽、特に１０ｌ〜５００００ｌ容量の発酵槽で実施する。この細胞の培地からのエリスロポエチンの単離は、以下の工程：
ａ）細胞培養上清または破砕した細胞懸濁液の上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
ｂ）場合により、工程ａ）で得られたエリスロポエチン含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびＥＰＯを含有する画分を回収／収集すること、
ｃ）ａ）またはｂ）のＥＰＯを含有する画分をヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、本発明方法を使用してエリスロポエチン含有画分を回収／収集すること、および、
ｄ）ｃ）のＥＰＯを含有する画分を、濃縮しまたは／そして逆相ＨＰＬＣ材料に適用すること、
を含む。
【００５４】
精製方法の工程ａ）は、場合により前処理されていてもよい細胞培養上清を、アフィニティークロマトグラフィー材料に適用することを含む。或る態様では、このアフィニティークロマトグラフィー材料は、青色色素を共有結合させた材料である。その一例はブルーセファロースである。或る態様では、２％に等しいまたはそれ以上（≧２％）（ｖ／ｖ）の血清含有量の培地を使用した場合に、アフィニティークロマトグラフィー材料から溶出させた後、このエリスロポエチン含有溶出液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用する。或る態様では、この相互作用クロマトグラフィー材料はブチルセファロースである。工程ａ）、または採用した場合には工程ｂ）から得た溶出液を、本方法の工程ｃ）においてヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用し、エリスロポエチンを含有する溶出液を本発明方法に従って回収する。或る態様では、この溶出液を排除クロマトグラフィーによって、例えば膜濾過によって濃縮するが、その場合、排除サイズ１０kDaの媒体、例えば膜の使用が好都合であると判明している。本発明方法により得られるエリスロポエチンは、α−２，３−結合または／およびα−２，６−結合したシアル酸残基を含み得る。
【００５５】
組換えエリスロポエチンを生産するため、無細胞培養上清を単離し本発明方法に付す。必要ならば濁りを分離するための濾過および／または濃縮を精製工程の前に追加で実施することができる。
【００５６】
第一の工程では、色素クロマトグラフィーがプロテアーゼによる夾雑物を除去する。或る態様では、Cibachron（登録商標）ブルーのような青色トリアジン色素を色素として使用する。他のトリアジン色素もまた好適である。色素クロマトグラフィーの支持材料は重要でないが、好ましくは多糖類型支持材料、例えばセファロース、好ましくはセファロース６ファストフローが用いられる。カラムは、４．５〜５．５のｐＨ値、或る態様ではｐＨ４．８〜５．２の緩衝液で平衡化し、さらなる態様では酢酸緩衝液または酢酸で平衡化する。或る態様では、このクロマトグラフィーを１℃〜１０℃の温度で、別の態様では約５℃の温度で操作する。或る態様では、溶出／回収は、酸性または中性ｐＨ（或る態様ではｐＨ５〜７）で塩濃度を増大させることによる。塩基性ｐＨ、或る態様ではｐＨ８．５〜９．５、別の態様ではｐＨ８．８〜９．２において、塩濃度を大きく変化させずにエリスロポエチンを溶出させることも可能である。
【００５７】
第二の工程では、疎水化支持体によるクロマトグラフィーを実施する。疎水性クロマトグラフィーのための好適な吸着剤は、例えばProtein Purification Methods, A practical Approach, Ed. Harris, E.L.V. and Angal, S., IRL Press, Oxford, England(1989), p.224；およびProtein Purification, Janson, J.C., Ryden, L., (ed.), VCH Publisher, Weinheim, Germany (1989), p.207-226に記載されている。支持材料自体は重要でなく、例えばアクリル酸およびメタクリル酸のコポリマーであるセファロース、またはシリカゲルとすることができる。疎水性基、或る態様ではブチル基が支持体に共有結合していることが重要である。好適な支持体が市販されている（例えば、Tosoh Haas, Germany由来のブチルトヨパール、またはPharmacia, Germany由来のブチルセファロース）。或る態様ではブチル化支持体が使用される。その他のアルキル化またはアリール化支持体は、エリスロポエチンと不可逆的に結合したり、より良好でない分離となることがある。疎水性クロマトグラフィーにおける溶出は、ヨウ化物、過塩素酸塩またはチオシアン酸塩のようなカオトロピック剤の添加により、またはグリセロール、エチレングリコールまたは２−プロパノールのようなアルコールの添加により、塩濃度を下げる（例えば、４mol/l〜０mol/lの勾配で）ことによって起こる。或る態様では、この疎水性クロマトグラフィーを中性ｐＨで塩の存在下に、或る態様では約０．７５mol/lＮａＣｌの存在下に実施する。低分子量アルコール、或る態様ではイソプロパノール（＝２−プロパノール）の存在下に疎水性クロマトグラフィーを実施することも可能である。溶離緩衝液中の低分子量アルコールの濃度は平衡化緩衝液中の約２〜３倍である。洗浄緩衝液においては、低分子量アルコールの濃度は平衡化緩衝液中の約２倍である。平衡化のためには約１０〜１５％、或る態様では約１０％の２−プロパノールを加え（クロマトグラフィー材料のロード）；溶離のためには約２５〜３５％、或る態様では約２７％の２−プロパノールを加え、そして洗浄緩衝液には１９％の２−プロパノールを加える（指定した濃度は他のアルコールに対しても好適である。容量％、ｖ／ｖで表記）。疎水性クロマトグラフィーは１０℃〜４０℃という広い温度範囲で実施できる。しかしながら、２７±２℃の制御温度で操作するのが好都合である。
【００５８】
次に、本発明方法に従い、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相での分離を実施できる。
【００５９】
精製のための任意の工程として、ヒドロキシアパタイト工程に引き続き疎水化支持体による逆相クロマトグラフィーを行ってもよい。しかしながら通常これは、本発明に係るヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを利用する場合もはや必要ではなく、そのため省略できる。時間の節約に加えて、このことは費用をも削減し、後で分離せねばならない有機溶媒の使用を回避させる。以下のものが例えば逆相クロマトグラフィーのクロマトグラフィー材料として好適である：フェニルセファロースおよびオクチルセファロース（Pharmacia, Sweden）、ブチルトヨパール（Tosoh Haas, Germany）またはプロピル−ＴＳＫ（Merck, Germany）。但しこの工程では、より長いアルキル基（例えばＣ８またはＣ１８）を含む支持体の使用もまた有利である。或る態様では、カラムを２〜７の範囲のｐＨで、別の態様ではｐＨ２．５で平衡化し、別の態様では水性トリフルオロ酢酸を使用する。溶離には、平衡化緩衝液から極性有機溶媒、例えばアセトニトリルの水溶液に至る勾配を使用する。クロマトグラフィー後、溶出液を中和するのが好都合である。
【００６０】
本発明に係る精製法の次の工程として、陰イオン交換クロマトグラフィーが続く。この工程では、或る態様においてＤＥＡＥセファロースファストフロークロマトグラフィー材料をカラム材料として使用する。これを用いて平衡化をｐＨ６〜ｐＨ９のｐＨ値で、別の態様ではｐＨ７．５で実施する。或る態様では場合により、酸性溶液（およそ４．５のｐＨ値）で洗浄した後、溶離を中性または弱塩基性範囲（ｐＨ６〜９、或る態様ではイオン強度を高めつつ（或る態様ではＮａＣｌで）ｐＨ７．５）で実施する。或る態様では緩衝液としてリン酸緩衝液を使用する。
【００６１】
或る態様では、このタンパク質調製物を０．１ｇ〜１０ｇのバッチで生産する。色素によるアフィニティークロマトグラフィー後の第二工程として疎水性クロマトグラフィーを実施すると、ＥＰＯが、或る態様では天然の哺乳動物タンパク質を含まない培地での培養後に、治療的用途に充分となる程精製され得ることが判明した（ＥＰ１３９４１７９）。Nobuo, I., et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359またはＷＯ８６／０７４９４に記載のように、クロマトグラフィー精製前にプロテアーゼインヒビター（例えばＣｕＳＯ４）を加える必要はない。疎水性クロマトグラフィーは、或る態様ではアルキル化（Ｃ４−Ｃ１８）またはアリール化（或る態様ではフェニル化またはベンジル化）支持体で実施する。別の態様では特にブチル化支持体を使用する。
【００６２】
本明細書において「天然の哺乳動物タンパク質を全く含まない」とは、その調製物が検出可能な量のそのようなタンパク質を含有しないことを意味する。その調製物は、宿主細胞由来でなく、そして細胞増殖を維持改善し収量を最適化するために培地に通常添加される、意図的に加えられる哺乳動物タンパク質を全く含まない。天然の哺乳動物タンパク質とは、ヒトまたは動物といった天然供給源に由来する哺乳動物タンパク質であり、例えば大腸菌（E. coli）のような原核生物中で産生された組換え哺乳動物タンパク質ではないと理解する。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、以下の工程：
ａ）２０kDa〜４０kDaの分子量を有する活性化ＰＥＧ試薬を使用することによりエリスロポエチンをポリ（エチレングリコール）にコンジュゲートさせ（エリスロポエチンのＰＥＧ化）、
ｂ）工程ａ）で得られたＰＥＧ化エリスロポエチンを、各々同じ固定相で異なる溶離法を用いる２種類の連続的陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製し、
ｃ）第二固定相からＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））にコンジュゲートしたエリスロポエチンを単離する、
を含む、１個のポリ（エチレングリコール）ポリマーに共有結合したエリスロポエチン（モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチン）を生産する方法である。
【００６４】
この方法は、組換え生産されその後化学的にＰＥＧ化されたＰＥＧ化ＥＰＯの精製に特に好適である。この方法の第一工程は、エリスロポエチンのＰＥＧ化である。この反応に使用するポリ（エチレングリコール）ポリマー（ＰＥＧ）は、およそ２０kDa〜４０kDaの分子量を有する（ＰＥＧは確定した分子量を伴って得られる訳ではなく、分子量分布を有するポリマー化合物であるため、この文脈における「分子量」という語は、ポリ（エチレングリコール）の平均分子量を指す）。「およそ」という語は、幾らかのＰＥＧ分子はより高い分子量を、そして幾らかはより低い分子量を有することを意味する。即ち「およそ」という語は、それが分子量分布であってＰＥＧ分子の９５％が記載の分子量の＋／−１０％の分子量を有するということを意味する。
【００６５】
「ＰＥＧ化」という語は、ポリ（エチレングリコール）分子および或るポリペプチドのＮ末端またはリジン側鎖の間の共有結合を指す。タンパク質のＰＥＧ化は特にVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417に記載されている。ポリ（エチレングリコール）は種々の官能基によってタンパク質に結合でき、そして様々な分子量を有する（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304）。ポリ（エチレングリコール）およびエリスロポエチンの共有結合は、例えばＷＯ００／４４７８５に報告されたように水溶液中で実施でき、或る態様では、５kDa〜４０kDaの分子量を持つＮＨＳ活性化直鎖状または分岐ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子を使用して実施できる。ＰＥＧ化反応は、固相反応として実施することもできる（Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229）。選択的Ｎ末端ＰＥＧ化タンパク質が、ＷＯ９４／０１４５１またはFelix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (poly(ethyleneglycol))(1997) 218-238に従って取得できる。
【００６６】
以下の実施例、配列表および図面を本発明の理解を助けるために提供するが、本発明の真の範囲は付記する請求項に開示する。本発明の精神を逸脱することなく、開示された方法に改変を施すことができるということを理解されたい。
【００６７】
配列表の説明
配列番号１ １６５残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
配列番号２ １６６残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ヒドロキシアパタイトを含有する固定相（ＨＡ−ウルトロゲル）を用いるエリスロポエチンのクロマトグラフィーの例示的クロマトグラム。
【図２】個々のエリスロポエチン含有画分の純度のプロット。
【図３】分析用逆相ＨＰＬＣによるエリスロポエチン含有画分の分析的クロマトグラフィー。
【図４】エリスロポエチン含有画分中のｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびＥＰＯのパーセンテージの略図。
【図５】エリスロポエチン含有画分中のタンパク質様不純物の分布。
【図６】エリスロポエチン含有画分のシアル酸数のプロット。
【図７】エリスロポエチン含有画分中の酸性および塩基性イソ型の分布。
【図８】エリスロポエチン含有画分中のトリアンテナリーグリコシル型の分布。
【図９】エリスロポエチン含有画分中のバイアンテナリーグリコシル型の分布。
【図１０】エリスロポエチン含有画分中のグリコシル型の分布の概略。
【図１１】エリスロポエチン含有ピークにおける肩部の比較例。
【図１２】ヒドロキシアパタイトを含有する種々の固定相を用いて得られたエリスロポエチンのイソ型分布。
【図１３】本発明方法を用いて得られたクロマトグラム。
【図１４】種々のクロマトグラフィー法におけるイソ型分布の比較。
【００６９】
材料および方法
クロマトグラフィーのための緩衝液
溶液は全て保存溶液から調製した。別途記載の無い限り、全ての緩衝液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨまたは１Ｍ ＨＣｌで調節した。II型超純水（ミリＱ水）を常に使用した。
【００７０】
保存溶液（水中）
１mol/lリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．９±０．２、
１mol/lトリス（ヒドロキシアミノメタン）緩衝液（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）、ｐＨ６．９±０．２、
５mol/l塩化ナトリウム、
１mol/l塩化カルシウム、
１０mol/l水酸化ナトリウム。
【００７１】
標準クロマトグラフィー緩衝液：
標準洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＨＡウルトロゲル／ファストフロー：
２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＣＨＴ： ２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ９〜１０
再生緩衝液１ ＨＡウルトロゲル：
２００mMリン酸カリウム、０．１mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
再生緩衝液１ ＣＨＴ、ファストフロー：
２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
アルカリ性再生： ０．５Ｍ ＮａＯＨ
平衡緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、
ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．５mMＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
【００７２】
分析的決定のための緩衝液
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ：
溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、水
溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ、７０％アセトニトリル、水
タンパク質決定Ａ２８０：
１０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、０．１mol/lＮａＣｌ、ｐＨ７．５±０．２
【００７３】
タンパク質決定
光路長１cmの水晶キュベットを使用した。試料を、測定される吸光度が０．２〜１．０AUとなるよう希釈した。希釈が必要な場合、試料を相互に独立して希釈し、トリプリケートで測定した。希釈しなかった試料は１回の測定で決定した。エリスロポエチン最終生成物緩衝液を試料の希釈およびブランク測定に使用した。
【００７４】
測定は２８０nmで実施した。エリスロポエチンリファレンス標準試料を系の対照として最初に測定した。実際の試料は、分析に先立ち平均タンパク質濃度１．８６mg/ml〜２．０５mg/mlに調節した。タンパク質濃度は以下の式に基づいて算出した：
【００７５】
【数１】
１）０．１％溶液の吸光係数：ε＝１．２５ml・(mg・cm)−１
２）試料の希釈係数
【００７６】
タンパク質の量は以下の式で与えられる：
ｍ［ｇ］＝ｃ［mg/ml］・Ｖ［Ｌ］
【００７７】
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）において、全ての試料は溶離液Ａで最大濃度０．１２mg/mlに希釈した。タンパク質濃度は２８０nmの光度測定により決定した。試料の分析に先立ち１００％溶離液Ａの試料４個を注入した。このことによりカラムが完全に平衡化されていることを確実とした。エリスロポエチンリファレンス標準を、試料の連続分析の開始時および終了時に分析した。偏位を回避するため、クロマトグラムを標準化積分法で解析した。基線に垂直な線を引くことにより各ピークを相互に分離した。
【００７８】
ＣＨＯタンパク質含有量／宿主細胞タンパク質含有量の決定
ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってＣＨＯ細胞タンパク質を測定した。ここではストレプトアビジン／ビオチン技術に基づくサンドイッチ法を利用した。このアッセイにはストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレートを使用した。ＣＨＯ細胞タンパク質に対する抗体を、ビオチンによってこのプレートに結合させた。分析しようとする試料溶液を、１５〜１５０ng/mlのＣＨＯタンパク質濃度でピペットにより添加した。濃度が１５ng/mlを下回った場合、その試料をＣＨＯタンパク質を含まないとみなした。濃度が１５０ng/mlを超えた場合には、より高希釈で試験を反復した。
【００７９】
結果をＣＨＯタンパク質［ppm］として記載した。
【００８０】
【数２】
【００８１】
イソ型分布の決定
キャピラリー電気泳動によってイソ型分布を決定した。この分析のため、試料を水中で透析濾過した。続いてそのキャピラリーを電解質溶液ですすぎ、その後、希釈試料をキャピラリー内に適用した。２５０００Ｖの高電圧をかけることにより分離した。移動相緩衝液は過剰の陽イオンを有し、それが電気浸透流をもたらした。水晶のキャピラリーの使用が、キャピラリー中のタンパク質の光度検出およびピーク面積による定量を可能にした。
【００８２】
糖の分析
糖の分析には酵素試験法を利用した。この方法では、エリスロポエチンのＮ−グリコシド結合したオリゴ糖を酵素Ｎ−グリコシダーゼで開裂させた。さらに、酵素ノイラミニダーゼの助けを借りてこのオリゴ糖からシアル酸を除去した。得られたＮ−オリゴ糖を陰イオン交換体を用いて分離および分析した。試料と全く同じ方法で処理したエリスロポエチンリファレンス標準を、一連の試験の最中に測定した。以下の糖構造が検出された：バイアンテナリー、トリアンテナリー、トリアンテナリー１リピート、テトラアンテナリー、テトラアンテナリー１リピート、テトラアンテナリー２リピート。
【００８３】
排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
ＳＥ−ＨＰＬＣのため、分離を開始する前に、クロマトグラフィーカラムを３〜５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液で平衡化し、余分なピークの無い均一な基線を得た。試料を０．２mg/ml濃度に希釈し、ＳＥ−ＨＰＬＣに注入した。標準法に従いピークを積分した。垂線を降ろすことによりピークを相互に分離した。
【００８４】
ＤＮＡ測定
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖ＤＮＡおよびビオチン化一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の反応混合物を添加した。この結合タンパク質はＤＮＡに結合でき、ビオチン化された。このようにして試料混合物からＤＮＡを特異的に除去することが可能となった。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチンおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質にカップリングしたビオチンに結合した。この全複合体に、ウレアーゼにカップリングさせたＤＮＡ特異抗体を加えた。尿素を添加すると尿素の加水分解が導かれ、それがｐＨの局所的変化を惹起した。この変化は表面電位の変化として検出され得る。表面電位の変化は結合しているＤＮＡの量に比例した。一本鎖ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ消化およびＳＤＳによる変性により得られた。
【００８５】
ペプチドマップ
ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯのような不完全にグリコシル化されたエリスロポエチン種はペプチドマッピングによって定量できる。この目的のため、エリスロポエチン分子をエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによりペプチドへと開裂し、これらのペプチドをＨＰＬＣで分離した。得られたペプチドパターンをリファレンス標準と比較した。得られた結果を、ピークサイズ、ピークの外観および保持時間について標準と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
実施例１
ＣＨＯ細胞におけるエリスロポエチンの組換え生産
ＥＰＯをバッチ法によってＣＨＯ細胞において生産した。発酵槽に前培養を接種し、約５日後、この発酵槽の内容物を収穫する。無傷のＣＨＯ細胞および細胞フラグメントを遠心分離により発酵上清から除去した。この無細胞培養上清のｐＨを酢酸（１mol/l）でｐＨ５．０〜５．２に調節し、その後このｐＨ調節した溶液を１〜９℃で濾過した。基本培地ＤＭＥ（ＨＧ）ＨＡＭのＦ−１２改変（Ｒ５）（GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, Order No. 57-736）、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−（＋）グルタミン、Ｄ−（＋）グルコース、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄（II）、アスパラギン、アスパラギン酸、セリンおよびポリビニルアルコールで構成される無血清培地を培養として使用した。
【００８７】
実施例２
ブルーセファロースクロマトグラフィー
ブルーセファロース（Pharmacia）は、色素Cibachron（登録商標）ブルーを共有結合させたセファロースビーズで構成される。エリスロポエチンは、低イオン強度および中性ないし酸性ｐＨ値でこの支持体に結合する。エリスロポエチンはイオン強度およびｐＨ値を上げることにより溶出する。
【００８８】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ４４０ ｘ ５００、Amicon, GB）に６０〜８０ｌのブルーセファロースを満たし、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを約３カラム容量（ＣＶ）の酢酸緩衝液で平衡化する。ｐＨ５に調節した無細胞培養上清を、温度１０＋／−５℃および流速８００〜１４００ml/分でカラムに導入する。このカラムを、同じ流速および５＋／−４℃で、約１ＣＶの洗浄緩衝液１、次いで約２ＣＶの洗浄緩衝液２で再洗浄する。その後カラムを約３ＣＶの溶離緩衝液で溶離する。タンパク質ピーク全体を集め（約３０〜６０ｌ）、ＨＣｌでｐＨ６．９に調節し、さらなる加工まで５＋／−４℃で保存する。生成物溶液はこのクロマトグラフィー工程で濃縮され、約４０〜５０％の純度が達成される。
【００８９】
平衡化緩衝液： ２０mM 酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液１： ２０mM 酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液２： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．５±０．３
溶離緩衝液： １００mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ９．０±０．２
【００９０】
実施例３
ブチルトヨパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）
ブチルトヨパール（Tosoh Haas）は、表面にブチル残基が共有結合している支持体である。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、２−プロパノールを含有する緩衝液で溶出される。
【００９１】
１０％ ２−プロパノールを含有する平衡化緩衝液中でタンパク質がブチルマトリックスに結合した後、エリスロポエチンを、水性緩衝液および５０％ ２−プロパノールより成る勾配によって溶出させた。この溶出は約２０％ ２−プロパノールで開始する。
【００９２】
クロマトグラフィーカラム（Pharmacia BPG 300/500）に３０〜４０ｌのブチルトヨパールを満たし、４Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを少なくとも３ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。ブルーセファロースカラムの溶出液を１０％ ２−プロパノールに調節し、温度２７±２℃および流速８００〜１２００ml/分でカラムに導入する。このカラムを、同じ温度および流速で、約１ＣＶの平衡化緩衝液で、そして次に約２ＣＶの洗浄緩衝液で再洗浄する。その後エリスロポエチンを約３ＣＶの溶離緩衝液で溶離する。タンパク質ピーク全体を集め（約１０〜１８ｌ）、直ちに希釈緩衝液で３倍に希釈し、１５℃で保存する。このクロマトグラフィーにおいて約９０％の純度が達成される。
【００９３】
平衡化緩衝液：２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
１０％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
１９％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
２７％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
希釈緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
第一溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
【００９４】
実施例４
ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー
現行の工程条件に対する適切な比較を可能とするため、ヒドロキシアパタイトを含有する各固定相による分離において、同じ基本法の工程を利用した。その順序は、
再生 − 平衡化 − 分離 − 再生、
であった。
【００９５】
緩衝液は、再生のための製造者の指示に適合させた。
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
分離のためのクロマトグラフィーパラメータを以下の表４に示す。同パラメータを全ての材料に使用した。
【００９９】
【表４】
【０１００】
ＵＶ吸収シグナルに基づきピークを集めた。収集は１５mAUで開始し、各々のピーク最大値が過ぎた後に４０mAUで停止した。分離後に再生を行った。溶離および再生工程のピークを集め、−２０℃で保存した。再生のカットリミットは立上がり１５mAU〜立下がり１５mAUであった。溶離流速は個々の工程において０．３５cm/分から１．７cm/分の間で変化させた。
【０１０１】
標準溶液：
標準洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＨＡウルトロゲル／ファストフロー：
２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＣＨＴ： ２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ９−１０
再生緩衝液１ ＨＡウルトロゲル：
２００mMリン酸カリウム、０．１mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
再生緩衝液１ ＣＨＴ、ファストフロー：
２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
アルカリ性再生： ０．５Ｍ ＮａＯＨ
平衡化緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、
ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．５mM ＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
【０１０２】
実施例５
ヒドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（BioSepra）は、その機械的および流体力学的性質を改善するためにアガロース骨格に組み込まれたヒドロキシアパタイトで構成される。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、殆どのタンパク質性不純物よりも低いリン酸濃度で溶出する。
【０１０３】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ４４０ｘ５００または同等品）に３０〜４０ｌのヒドロキシアパタイトウルトロゲルを充填し、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを少なくとも４ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。精製しようとするエリスロポエチン溶液を、温度約１５℃および流速５００〜１２００ml/分でカラムに吸着させる。カラムを、約１ＣＶの平衡化緩衝液、次いで約２ＣＶの洗浄緩衝液により、同じ温度および流速で再洗浄する。次いで約３ＣＶの溶離緩衝液で溶出する。タンパク質ピーク全体を集め（約１０〜１８ｌ）、さらなる加工を行うまで１５℃で保存する。このクロマトグラフィーにおいて９５％を超える純度が達成される。
【０１０４】
平衡化緩衝液： ２０mM酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液１： ２０mM酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液２： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．５±０．３
溶離緩衝液： １００mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ９．０±０．２
【０１０５】
実施例６
ヒドロキシアパタイトファストフロークロマトグラフィー
この材料は製造者から固体で供給された。適当量の材料を秤量し、標準洗浄緩衝液に懸濁した。粒子の表面全体を濡らすため、粉末を緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー（約２０％（ｖ／ｖ））を充填に使用した。このゲル材料を２日間沈殿させることにより、圧力をかけずにカラムに充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを流速０．５ml/分（０．６４cm/分）で５ＣＶによりすすいだ。その後カラムを再生した。
【０１０６】
クロマトグラフィーを実施例４に記載のように実施した。
【０１０７】
実施例７
ヒドロキシアパタイトＣＨＴクロマトグラフィー
このセラミック材料（ＣＨＴ１型および２型）は製造者から固体で供給された。満たすべき量を秤量し、充填緩衝液ＣＨＴ１、２型に懸濁した。この材料の全面を濡らすため、ＣＨＴを充填緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー（約２０％（ｖ／ｖ））を充填に使用し、スラリー全体をカラムに満たし、流速１ml/分（１．３cm/時）で充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを再生した。
【０１０８】
クロマトグラフィーを実施例４に記載のように実施した。
【０１０９】
実施例８
ＣａＣｌ２を使用しない、本発明に係るヒドロキシアパタイトＣＨＴクロマトグラフィー
実施例７に記載のようにカラムを充填し、実施例４に記載のようにクロマトグラフィーを実施した。
【０１１０】
実施例４とは対照的に、以下の溶液を使用した：
第二溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
第三溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
第四溶液： １０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ６．９±０．２
第五溶液： １０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、ｐＨ６．９±０．２
【０１１１】
実施例９
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料、例えばヴィダックＣ４（Vydac, USA）は、その表面にＣ４アルキル鎖を担持するシリカゲル粒子で構成されている。エリスロポエチンは疎水性相互作用の結果このマトリックスに結合し、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配で選択的に溶出される。
【０１１２】
２２±４℃の温度でＭｅｒｃｋ Ｐｒｅｐｂａｒ １００分離系（または同等品）を用いて分取ＨＰＬＣを実施した。分離カラム（１００mm x ４００mm、３．２ｌ）にヴィダックＣ４材料を充填した。使用前に緩衝液Ａから１００％溶媒に至る勾配を数回適用することにより、カラムを再生し、その後緩衝液Ａで平衡化した。このヒドロキシアパタイトカラムの溶出液をトリフルオロ酢酸で約ｐＨ２．５に酸性化し、濾過滅菌した。その後、温度２２±４℃および流速２５０〜３１０ml/分でエリスロポエチンをカラムに吸収させる。このカラムを同じ温度および流速で、緩衝液Ａから緩衝液Ｂに至る直線勾配で溶出した。溶出ピークを画分として集める。ＨＰＬＣ希釈緩衝液４容量を添加することにより、溶出液を直ちに中和する。
【０１１３】
分析用ＨＰＬＣで少なくとも９９％純度を有する画分をプールする（プール容量約４〜６ｌ）。このクロマトグラフィーにおいて微量の不純物が分離され、９９％を上回る純度が達成される。
【０１１４】
緩衝液Ａ： 水中０．１％トリフルオロ酢酸
緩衝液Ｂ： ８０％アセトニトリル、水中０．１％トリフルオロ酢酸
ＨＰＬＣ希釈緩衝液： １０mM リン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ７．５±０．２
【０１１５】
実施例１０
ＤＥＡＥセファロースＦＦクロマトグラフィー
ＤＥＡＥセファロースファストフロー（Pharmacia）は、セファロースビーズ表面に共有結合させたＤＥＡＥ基で構成されている。エリスロポエチンはイオン相互作用の結果このマトリックスに結合し、イオン強度を上げることにより溶離する。
【０１１６】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ９０ ｘ ２５０または同等品）に、適用された試料中のエリスロポエチン１ｇあたり１００〜２００mlのゲルを満たし、０．５Ｍ ＮａＯＨで再生した。続いてこのカラムを、１００mMＮａ／Ｋ緩衝液（ｐＨ７．５）、その後少なくとも１２ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。ＨＰＬＣカラムの溶出液を、温度５±４℃および流速約１５０ml/分でカラムに吸収させる。カラムを同じ温度および流速で、少なくとも５ＣＶの平衡化緩衝液、次いで約１０ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。続いて、カラムを約１０ＣＶの平衡化緩衝液で再洗浄し、約７ＣＶの溶離緩衝液でエリスロポエチンを溶離した。全タンパク質ピークを集め（約２〜５ｌ）、濾過滅菌し分注する。
【０１１７】
このクロマトグラフィーにおいてＨＰＬＣ工程由来の溶媒が分離され、微量の不純物が除去される。純度は９９％を上回る。
【０１１８】
平衡化緩衝液： １０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ７．５±０．２
洗浄緩衝液： ３０mM酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５±０．１
溶離緩衝液： １０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、８０mMＮａＣｌ、ｐＨ７．５±０．２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用するエリスロポエチン（ＥＰＯ）の精製方法を報告するものである。さらに、宿主細胞のタンパク質を涸渇させる方法およびＥＰＯ組成物のイソ型分布を改変する方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の産生を刺激するヒトの糖タンパク質である。その作用および治療適用は、例えばＥＰ０１４８６０５、ＥＰ０２０５５６４、ＥＰ０２０９５３９およびＥＰ０４１１６７８、ならびにHuang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712、Lai, P.H., et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、およびSasaki, H., et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076に詳細に記載されている。
【０００３】
ＥＰＯは、健康な人間の血漿中にはごく低濃度でしか存在しない。再生不良性貧血患者の尿からのヒトＥＰＯの単離が知られている（Miyake, T., et al., J. Biol. Chem. 252 (1977) 5558-5564）。イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過および吸着クロマトグラフィーを含む７段階法が記載されている。ＥＰ０１４８６０５およびＥＰ０２０５５６４は、ＣＨＯ細胞における組換えヒトＥＰＯの生産を報告している。組換え産生されたＥＰＯの精製方法は、Nobuo, I., et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359に記載された。
【０００４】
エリスロポエチンを生産および精製するさらなる方法が知られており、特にＥＰ０１４８６０５、ＥＰ０２０５５６４、ＥＰ０２５５２３１、ＥＰ０８３０３７６、ＥＰ０２６７６７８、ＥＰ０２２８４５２、ＥＰ１１２７０６３、ＥＰ０２０９５３９、ＥＰ０３５８４６３、ＥＰ１０１０７５８、ＥＰ０８２０４６８、ＥＰ０９８４０６２、ＥＰ０６４０６１９、ＥＰ０４２８２６７、ＥＰ１０３７９２１ならびにLai, P.H., et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、Broudy, V.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 265 (1988) 329-336、Zou, Z., et al., Journal of Chrom. 16 (1998) 263-264、Inoue, N., et al., Biol Pharm. Bull. 17 (1994) 180-184、Qian, R.L., et al., Blood 68(1) (1986) 258-262、Krystal, G., et al., Blood 67(1) (1986) 71-79、Lange, R.D., et al., Blood Cells 10(2-3) (1984) 305-314、Sasaki, R., et al., Methods Enzymol. 147 (1987) 328-340、Ben Ghanem, A., et al., Prep. Biochem, 24 (1994) 127-142、Cifuentes, A., et al., J. Chrom. A 830 (1999) 453-463；およびGokana, A., et al., J. Chromat. A 791 (1997) 109-118に記載されている。
【０００５】
ＥＰ１３９４１７９は、動物タンパク質を含まないエリスロポエチンを生産する方法を報告している。ＥＰ０９８６６４４の主題はウイルスプロモーターを用いた内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの生産である。ＥＰ１４２８８７８には、組換え糖タンパク質、特にエリスロポエチンの生産方法が報告されている。ＥＰ１４９２８７８には、所望プロファイルのエリスロポエチン糖イソ型を生産する方法が報告されている。
【発明の概要】
【０００６】
組換えエリスロポエチンの生産および精製には、幾つかの工程、特にクロマトグラフィー工程が必要である。
【０００７】
本発明の第一の局面は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を有する少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含むエリスロポエチンの生産方法であって、
ｉ）０．５mM〜２０mM濃度でカルシウムイオンを含有するエリスロポエチン含有溶液を、同濃度０．５mM〜２０mMでカルシウムイオンを含有する溶液で平衡化したヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触すること、
ii）０．５mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過すること、
iii）０．５mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、それによりエリスロポエチンを生産すること、
を含む、エリスロポエチンの生産方法である。
【０００８】
或る態様では、生産されたエリスロポエチンは、ｉ）のエリスロポエチン含有溶液と比較して、ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ種およびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ種が涸渇している。さらなる態様では、本発明は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を伴うクロマトグラフィー工程に加えて、少なくとも１つのさらなるクロマトグラフィー工程を含む。さらなる態様では、全てのクロマトグラフィー工程が各々異なるクロマトグラフィー原理に基づいており、それにより、各クロマトグラフィー原理がその方法において１回だけ利用される。さらなる態様では、そのクロマトグラフィー原理は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および／または陰イオン交換クロマトグラフィーから選ばれる。さらなる態様では、クロマトグラフィー工程の順序は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー、場合により逆相クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーである。或る態様では、本発明方法は、該クロマトグラフィー工程に加えて、場合により中間工程、例えば塩析、濃縮、透析濾過、限外濾過、透析、および／またはエタノール沈殿を含む。
【０００９】
本発明の１つの局面は、本発明方法を用いて取得したエリスロポエチン組成物である。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、本発明に係るヒドロキシアパタイト含有固定相を伴うクロマトグラフィー工程を含む、エリスロポエチン調製物からチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞タンパク質を涸渇させる方法であって、この場合、エリスロポエチン含有画分の収集が、２８０nmでの光吸収により調節され、１５mAU〜７５mAUの吸収で始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する。
【００１１】
或る態様では、ヒドロキシアパタイト含有固定相は純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトである。別の態様では、工程ii）および／またはiii）のクロマトグラフィーで使用される溶液は、およそ５mM濃度のリン酸イオンを含有し、別の態様では、５mMのリン酸ナトリウムまたは同カリウムを含有する。
【００１２】
本発明の別の局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比率が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲であるエリスロポエチンイソ型の混合物であるエリスロポエチン組成物を調製する方法である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１３】
したがって、本発明のさらなる局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比率が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲であるエリスロポエチンイソ型の混合物であるエリスロポエチン組成物である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１４】
或る態様では、エリスロポエチン組成物は、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１５】
したがって、本発明のさらなる局面は、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲であるエリスロポエチン組成物である。或る態様では、この比率はこの範囲において線形である。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、エリスロポエチン１分子あたり６より多く１７より少ないシアル酸残基数を有するエリスロポエチンイソ型の混合物であり且つ本発明方法により得られたエリスロポエチン組成物である。
【００１７】
さらに別の本発明の局面は、エリスロポエチンをコードしている核酸を含む宿主細胞を、適当な培地中でエリスロポエチンの産生に好適な条件下で培養し、そのエリスロポエチンを培地または該細胞から単離することを含む、組換えエリスロポエチンの生産方法である。或る態様では、該細胞を浮遊培養する。さらなる態様では、該細胞を発酵槽、特に１０ｌ〜５００００ｌ容量の発酵槽で培養する。
【００１８】
培地からのエリスロポエチンの単離は以下の工程を含む：
（ａ）細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｂ）場合により、（ａ）の画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の画分を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、および本発明方法を利用してエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
（ｄ）（ｃ）の画分を濃縮しまたは／そして逆相ＨＰＬＣ材料を通過させること
【００１９】
精製方法の工程（ａ）は、場合により前処理されていてもよい細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に通すことを含む。或る態様では、そのアフィニティークロマトグラフィー材料は、青色染料をカップリングさせてあるアフィニティークロマトグラフィー材料である。一例はブルーセファロースである。或る態様では、発酵／その産生に血清含有量が≧２％（ｖ／ｖ）の培地が使用された場合には、エリスロポエチンを含有する溶出液をアフィニティークロマトグラフィー材料から溶出させた後、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を通過させる。或る態様では、その疎水性相互作用クロマトグラフィー材料はブチルセファロースである。工程（ａ）、または採用された場合には工程（ｂ）由来の溶出液を、工程（ｃ）においてヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、エリスロポエチンを含有する溶出液を単離する。或る態様では、濃縮は排除クロマトグラフィー、例えば膜濾過による。この場合、例えば排除サイズ１０kDaの膜の使用が有利であることが判明している。本発明方法によって得られるエリスロポエチンは、α−２，３−結合した、または／およびα−２，６−結合したシアル酸残基を含み得る。
【００２０】
本発明の別の局面は、以下の工程：
ａ）活性化ポリ（エチレングリコール）試薬を用いてエリスロポエチンを共有結合させ、即ちＰＥＧ化すること、
ｂ）このポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを、２つの連続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製すること、およびそれによりポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産すること、
を含む、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法であって、
工程ａ）で使用されるエリスロポエチンは、本発明方法により取得する、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法である。
【００２１】
本発明の別の局面は、本発明方法により得られたエリスロポエチンを含む、医薬組成物である。本発明に係る組成物は、場合により従来の薬学的希釈剤、賦形剤、助剤および担剤と共に、薬学的調製物として調合できる。薬学的調製物の生産に使用できる本発明に係る組成物は、逆相ＨＰＬＣ（例えばヴィダックＣ４カラムによる）または／およびサイズ排除クロマトグラフィー（例えばＴＳＫ ２０００ＳＷ ウルトラパックカラムによる）で測定した場合、少なくとも９９％、または別の態様では少なくとも９９．９％の純度を有する。本発明のさらなる局面は、本発明方法を用いて得られたエリスロポエチンを含む、貧血を処置するための医薬組成物である。
【００２２】
発明の詳細な説明
異なった物質がクロマトグラフィーによって相互に分離できるかどうかは、特に、そのクロマトグラフィーが実施される条件、加えて良好なカラム充填およびクロマトグラフィー材料（固定相）の選択に依存する。これには、緩衝系の選択に加えて、不純物および生成物が溶離される様式が包含される。
【００２３】
本発明は、以下の工程：
ｉ）第一濃度のカルシウムイオンを含有する、精製すべきエリスロポエチン溶液を、第二濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触させること、
ii）ｉ）由来の溶液より低い濃度、即ち第三濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に通すこと（それにより、この通過の間、エリスロポエチンは、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に結合したままであり／ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離されない）、および、
iii）０．５mMを下回る、即ち第四濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ii）由来のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること（それにより、エリスロポエチンが、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離され溶出する）、
を含む、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含む、エリスロポエチンの精製方法を報告するものである。
【００２４】
或る態様では、第一および第二ならびに／または第三および第四濃度は異なっている。別の態様では、第三および第四のカルシウムイオン濃度は、第一および第二カルシウムイオン濃度の１０％またはそれ以下である。
【００２５】
以下、ＥＰＯとも称するエリスロポエチンは、赤血球前駆細胞の分化および分裂プロセスを刺激し赤血球を与える生物学的能力を有するタンパク質として理解される。このタンパク質は好ましくはヒトエリスロポエチンであり、１６５または１６６アミノ酸で構成され（配列番号１および２）、分子量は約３４〜３８kDaである。グリコシル残基が分子量の約４０％を占める。類似の生物学的性質を有しＥＰＯ産生宿主細胞の培養により得られるエリスロポエチンを含む、ＰＥＧ化ＥＰＯ、即ちポリ（エチレングリコール）コンジュゲート化エリスロポエチンのようなＥＰＯの誘導体およびフラグメントもまた本発明方法により製造できる。ヒトＥＰＯのＤＮＡ配列およびタンパク質配列が、特にＥＰ０２０５５６４およびＥＰ０２０９５３９に記載されている。
【００２６】
ＥＰＯの構造は２個のジスルフィド橋および幾つかの糖鎖を含む。以下、グリコシル残基とも称するこの糖鎖は、タンパク質骨格に結合している。幾つかの鎖はアスパラギン残基を介してＮ−グリコシド結合でこのタンパク質に結合し、１個の鎖はセリン残基を介してＯ−グリコシド結合でこのタンパク質に結合している。
【００２７】
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）は通常、（分岐または非分岐）グリコシル残基の末端に組み込まれている。このグリコシル残基はその後もはや延長できない。シアル酸はＧａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃのα２−３結合にのみ結合できる（Nimtz, M., et al., Eur. J. Biochem. 213 (1993) 39-56）。
【００２８】
「アンテナリティ」または「グリコシル残基のアンテナリティ」という語は、グリコシル残基の分岐の程度を指す。或るグリコシル残基が例えば２本の腕を有する場合、そのグリコシル残基はバイアンテナリーであり、即ちそれはバイアンテナリーグリコシル残基である。グリコシル残基は、反復部分、いわゆるリピートを有することがある。これらは、配列ＧｌｃＮＡｃおよびガラクトース（Ｎ−アセチルラクトサミン）が反復している領域である。グリコシル残基の鎖長、したがってそのタンパク質の分子量は、リピートの数が相違しているために異なっている（Nimtz, M., et al., Eur. J. Biochem. 213 (1993) 39-56）。ＥＰＯの場合、トリアンテナリーグリコシル残基は最大１リピートしか含むことができず、一方テトラアンテナリーグリコシル残基は２リピートより多くを含むことができない。バイアンテナリーグリコシル残基はリピートを持たない。
【００２９】
エリスロポエチンは多重グリコシル化タンパク質である。グリコシル残基の変異および様々な程度のシアリデーション（sialidation）の故に、自然界でもバイオテクノロジー的生産においても、異なったグリコシル化型およびイソ型が出現する。高率のリピートはさらに、in vivo活性に好ましい影響を及ぼす（例えばＥＰ０４０９１１３を参照されたい）。
【００３０】
エリスロポエチンは１０の主要なイソ型で構成される。「イソ型」という語は、同一のアミノ酸配列および同数の結合シアル酸残基を有するＥＰＯ分子の一群を指す。このイソ型群は、同じ等電点を持ち、アミノ酸配列に結合したグリコシル残基の広がり、複雑性およびアンテナリティに関して相違する。例えば、「ＥＰＯのイソ型２」という語は、１４個のシアル酸残基を有するＥＰＯ分子の一群を包含する。イソ型３は１３個のシアル酸を有する、等々である。さらに、末端に存在しないさらなるシアル酸を有する稀な型のＥＰＯがある。即ち、イソ型１は１５個、そしてイソ型１’は１６個の、グリコシル残基に結合したシアル酸を有する。
【００３１】
本発明の或る局面は、高純度且つ或るエリスロポエチンイソ型分布を有するエリスロポエチンを製造する方法であり、その方法は、最初のエリスロポエチンイソ型分布が変化するような、異なるクロマトグラフィー工程の組み合わせを含む。該方法の、異なるクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を有するクロマトグラフィー工程、ならびに、ｉ）色素アフィニティークロマトグラフィー、ii）疎水性相互作用クロマトグラフィー、iii）陰イオン交換クロマトグラフィー、iv）逆相クロマトグラフィー、および／またはｖ）ゲル浸透クロマトグラフィー、から選ばれるクロマトグラフィーのうち少なくとも１つを含む。この局面の１つの態様では、減少した数のシアル酸残基を有するエリスロポエチンイソ型が涸渇しまたは完全に分離される。本出願の中では、「完全に」という語は、濃度／量がその方法の検出限界を下回るため、対応化合物が所定の分析方法によってもはや検出できないことを意味する。或る態様では、エリスロポエチン１分子あたり最大３、または最大４、または最大５（５を含む）個のシアル酸残基を有するエリスロポエチンイソ型が涸渇し、または完全に分離される。或る態様では、イソ型混合物が６〜１５のシアル酸基、または７〜１５のシアル酸基を有するイソ型を含むエリスロポエチンが得られる。
【００３２】
様々なグリコシル残基およびイソ型に加えて、さらなるＥＰＯ型が存在する。ｄｅ−Ｎ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ型の場合、これらは、完全には翻訳後グリコシル化されておらず、セリン残基１２６（ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ）またはアスパラギン残基２４（ｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ）においてグリコシル化されていない種である。
【００３３】
ヒドロキシアパタイトは、実験式Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨを有するリン酸カルシウムに基づく無機化合物である。クロマトグラフィー固定相として、それはタンパク質、酵素、免疫グロブリンおよび核酸の分離に好適である。それは自然界では主に骨および歯牙エナメル質に存在している。ヒドロキシアパタイトの形成は高いｐＨ値が有利である。ヒドロキシアパタイトは酸性ｐＨ値で溶解する。ヒドロキシアパタイトの様々な結合メカニズムがクロマトグラフィー分離に利用されており、クロマトグラフィー分離においてそれは主として吸着剤として働くが、イオン交換材料の性質も持っている。タンパク質の正に荷電したアミノ基（例えばリジン）および固定相の負に荷電したリン酸基の間にはイオン結合の形成が可能である。さらに、タンパク質のカルボキシ基（例えばアスパラギン酸）はヒドロキシアパタイトのカルシウムイオンと結合できる。この材料の特徴は、固定相のリン酸基および溶液中のカルシウムまたはマグネシウムイオンおよびタンパク質のカルボキシ基の間に複雑な結合が生じ得ることである（M. Kratzel, “Pharmazeutische Bioanalytik” Part 5, University of Vienna）。
【００３４】
種々のヒドロキシアパタイト材料が知られている。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、或る態様では低いリン酸塩濃度において溶出する。
【００３５】
本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相はアガロース骨格中に組み込まれたヒドロキシアパタイトで構成される。好適なカラム材料は例えばヒドロキシアパタイトウルトロゲル（BioSepra, Germany）またはＨＡバイオゲルＨＴ（Biorad, Germany）である。クロマトグラフィーはほぼ中性ｐＨで実施するのが有利である。アガロースマトリックスに埋め込まれたヒドロキシアパタイトは、純粋なヒドロキシアパタイトと比較して、より高い耐圧性を有する（例えばＨＡ ウルトロゲルとして入手可能）。この材料は５０μm〜１６０μmという不均一な粒子サイズ分布を持ち、主要な画分は７０μm〜９０μmである。表面は非常に粗く、粒子は限られた範囲内でのみ球状である。
【００３６】
別の態様では、本発明方法で使用されるヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、高温高圧で焼結させた純粋なヒドロキシアパタイトで構成される（例えばＣＨＴ（Biorad由来のセラミックヒドロキシアパタイト）として入手可能）。これは耐圧性材料であり、比較的対称性且つ一様に球状であり、比較的滑らかな表面を有する粒子で構成される。この粒子はＣＨＴ−１型では約４０μmのサイズおよび約４０m2/gの比表面積を有する。平均粒子サイズは２０μm〜３０μmである。ＣＨＴ材料２型は、特に免疫グロブリンのようなより大きな分子のために開発された。ＣＨＴ−２型の比表面積は１９m2/gであり、よってＣＨＴ−１型の比表面積のほぼ半分である。その粒子はＣＨＴ−１型と類似の形態である。この粒子もまた約４０μmのサイズを有する。したがって本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、高温高圧で焼結させた、比表面積約４０m2/gのヒドロキシアパタイトである。
【００３７】
さらなる態様では、本発明方法で使用するためのヒドロキシアパタイト含有固定相は、純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトで構成される（例えば、Calbiochem由来のヒドロキシアパタイトファストフローとして入手可能）。その粒子は菱形であり、５０μm〜１００μmのサイズである。
【００３８】
図１は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相（ＨＡ−ウルトロゲル）によるエリスロポエチンのクロマトグラフィーのクロマトグラム例を示す。枠で囲んだ領域は、分画された生成物のピークであり、これを画分１〜１６に細分した。画分１７はピークショルダーであり、別個の画分として集めた。個々の画分の純度はピークを超えるとほぼ直線的に減少している（図２を参照されたい）。
【００３９】
ヒドロキシアパタイトを含有する前記の様々な固定相を、エリスロポエチンを精製するための同じクロマトグラフィー法を用いて比較し、それを実施例４に記載する。
【００４０】
【表１】
【００４１】
或る態様では、ＣＨＯタンパク質の濃度が１５ng/mlを下回るならばその試料はＣＨＯタンパク質を含まないとみなした。セラミックおよび結晶性ヒドロキシアパタイト材料は、異なる量のエリスロポエチンをロードした場合同等であるが、一方アガロースを基礎とする材料では、収量および生成物の品質は、５mgＥＰＯ／mlカラム材料のロードにおいてかなり低下することが見出された。即ち、ＨＡウルトロゲルヒドロキシアパタイト材料による分離では、分離中に１０％近いエリスロポエチンが失われる。
【００４２】
分析用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるエリスロポエチン含有画分の分析は、エリスロポエチンピークの減少側にあるほぼ全ての画分において生成物ピークが肩部を有することを示し（図３）、それがｄｅ−Ｏ−ＥＰＯであると同定された。このｄｅ−Ｏ−ＥＰＯの割合を、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムに垂線を引くことにより半定量的に決定し、ＥＰＯの量と共に図４に示す。この肩部が形成される理由は、バイアンテナリーおよびトリアンテナリーグリコシル残基含有ＥＰＯ型がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて特に涸渇するためである。これらの型は一方で、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣではｄｅ−Ｏ−ＥＰＯの直前に溶出する。この選択的涸渇の結果、ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯ肩部が際立つのである。
【００４３】
タンパク質様不純物は溶出ピーク全体にわたって分布するが、前方の画分は、後方の画分より低い割合のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有する（図５を参照されたい）。
【００４４】
疎水性ＥＰＯグリコシル型がより多いため、エリスロポエチンの疎水性は後方のＥＰＯ含有画分で増大する。ヒドロキシアパタイトを含有する固定相でのクロマトグラフィーは、特に塩基性イソ型、即ちより少ないシアル酸を含有するイソ型を涸渇させる。図６に示すように、シアル酸残基の数はエリスロポエチン含有画分全体で一様に低下する。塩基性は、イソ型１からイソ型９までは増大する。一方酸性イソ型は最初のエリスロポエチン含有画分（画分１〜画分５）に多く、最後の方のエリスロポエチン含有画分（画分１２〜画分１６）では塩基性イソ型へのかなりのシフトが見られる（図７）。グリコシル型の分析は、親水性ＥＰＯ型が最初の画分に溶出し、それが高い含有量のテトラアンテナリー構造およびより多くのリピートを有することを示している。より少ないリピートまたは高い比率のトリアンテナリー構造を有するより疎水性のＥＰＯ型は後で溶出し、その過程はテトラアンテナリーグリコシル型とは逆である（図８）。バイアンテナリーグリコシル型の比率は徐々に増大する（図９）が、一方その増加は一様ではなく段階的である。
【００４５】
図１０もまた生成物ピーク全体におけるグリコシル型の分布を示している。高いリピート含量を有するテトラアンテナリーグリコシル型が最初のＥＰＯ含有画分（例えばＦ１、画分１）に存在するのに対し、最後のＥＰＯ含有画分（例えばＦ１６、画分１６）には高い比率のトリアンテナリーおよびバイアンテナリーグリコシル型が存在する。したがって、本発明方法によるヒドロキシアパタイト含有固定相のクロマトグラフィーでは、よりグリコシル化の少ないＥＰＯ型は涸渇し、後で溶出することが見出された。
【００４６】
ＣＨＯ宿主細胞タンパク質の含有量もまた末期のＥＰＯ含有画分において増大する。その結果、より良好なＥＰＯおよびＣＨＯ宿主細胞タンパク質の分離ができる、即ちＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有するより著明な肩部を伴うクロマトグラフィー法を利用して、良好な分離、およびＣＨＯ宿主細胞タンパク質の涸渇が達成できる（図１１を参照されたい）。故に、本発明の或る局面は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィーにおいてエリスロポエチン含有画分中のＣＨＯ宿主細胞タンパク質を除去する方法であって、本発明の或る態様において、エリスロポエチン含有画分の収集が、１５mAU〜７５mAUで始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する波長２８０nmでの光吸収によって調節されることを特徴とする、方法である。
【００４７】
或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は結晶性ヒドロキシアパタイトである。この固定相は、生成物ピークが一般に極めて平坦であり、際立った肩部を有するが故に好適である。さらなる態様では、クロマトグラフィーに使用される洗浄および溶離工程の溶液は、５mM濃度のリン酸イオンを含有する。このリン酸濃度を採用することにより、ＥＰＯ含有画分中のＣＨＯ宿主細胞タンパク質の量を、対応する分析法の定量または検出限界未満の値まで低下／涸渇させることができるため、このリン酸イオン濃度が、セラミックヒドロキシアパタイト含有固定相によるエリスロポエチンの精製にとって有利であることが見出されている。
【００４８】
ヒドロキシアパタイトを含有する種々の固定相を用いて得られたエリスロポエチンのイソ型分布を図１２に示す。ヒドロキシアパタイト含有固定相の種類およびロードのいずれもイソ型分布に大きな影響を及ぼさないことが見出された。セラミックおよび結晶性ヒドロキシアパタイト相の特徴は、これらはアガロース型ヒドロキシアパタイト相よりも塩基性イソ型を幾分多く涸渇させるということである。或る態様では、本発明により得られたエリスロポエチンの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したところ９９．３％を上回る。或る態様では、場合により５mg/mlのロードにおいて、得られるＥＰＯの純度はＲＰ−ＨＰＬＣで測定したところ９９．３％〜９９．９％である（％＝ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムに基づく面積パーセント）。固定相間の相違はＣＨＯ宿主細胞タンパク質の涸渇／分離においても観察される。アガロース型ヒドロキシアパタイト相および結晶性ヒドロキシアパタイト相は、セラミックヒドロキシアパタイト相より有効性が低い。よって本発明方法の或る態様では、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相はセラミックヒドロキシアパタイト相である。
【００４９】
ヒドロキシアパタイト含有固定相によるクロマトグラフィーに使用される溶液中に含まれるカルシウムイオン濃度は精製に明らかな影響力を持ち、故に、それにより得られるエリスロポエチンの純度にも影響力を持つことが見出された。溶液中のカルシウムイオン濃度が低下すると、殆どのエリスロポエチンが、段階的溶離によって（即ち、溶液３〜溶液４の工程によって）ヒドロキシアパタイト含有固定相から取得できる（実施例４および８、ならびに図１３を参照されたい）。エリスロポエチンの溶出後に（溶液５への変更に伴う）カルシウムイオン濃度が増大すると、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質およびＤＮＡがヒドロキシアパタイト含有固定相から溶出する。低下したカルシウムイオン濃度の溶液により得られたエリスロポエチン画分は、その後溶出するエリスロポエチン画分より遙かに酸性である（図１４を参照されたい）。増大したカルシウムイオン濃度で得られたピークの減少側は極めて平坦であり、即ち、それは多くのＣＨＯ宿主細胞タンパク質を含有する。これに対して、低下したカルシウムイオン濃度で得られたピークは極めて対称性である。
【００５０】
本発明は、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を使用する少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を含むエリスロポエチンの精製法を含み、その方法は、
ｉ）ａ）エリスロポエチンおよび第一濃度でカルシウムイオンを含有する第一溶液を提供すること、
ｂ）第二濃度でカルシウムイオンを含有する、或る容量の第二溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイト含有固定相を提供すること（平衡化工程）、
ｃ）ａ）の溶液をｂ）で得られた固定相に適用すること、
ii）第一および第二溶液よりも低い第三濃度のカルシウムイオンを含有する第三溶液を、工程ｉ）で得られたヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること（洗浄工程）、および、
iii）０．５mMまたはそれ以下のカルシウムイオンを含有する第四溶液の或る容量を、ii）由来のヒドロキシアパタイト含有固定相を通過させること、それにより、ヒドロキシアパタイト含有固定相からエリスロポエチンを分離回収すること、およびこのことによって精製エリスロポエチンを得ること（溶出工程）、
を含む。
【００５１】
第一の態様では、カルシウムイオンの第一濃度はカルシウムイオンの第二濃度と同じである。さらなる態様では、第二溶液および第三溶液は２−プロパノールを含有する。さらなる態様では、カルシウムイオンの第一および／または第二濃度は４mM〜２０mMである。さらなる態様では、カルシウムイオンの第一および／または第二濃度は５mMである。さらなる態様では、この溶液のｐＨ値はｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、２−プロパノール含有量は７〜１２％（ｖ／ｖ）であり、或る態様では９％（ｖ／ｖ）である。さらなる態様では、カルシウムイオンの第三濃度は０．５mMに等しいかそれ以下であり、或る態様では０．０００００１mM〜０．５mMである。さらなる態様では、カルシウムイオンの第三濃度は０．１mMに等しいかそれ以下であり、或る態様では０．０００００１mM〜０．１mMである。別の態様では、第四溶液は０．１mMまたはそれ以下のカルシウムイオンを含有し、或る態様では０．０００００１mM〜０．１mMである。さらなる態様では、４〜７カラム容量の第二溶液をカラムに適用する。さらなる態様では、カラムに適用する第三溶液の容量は０．５〜２．５カラム容量である。さらなる態様では、工程ii）において固定相から少量のエリスロポエチンしか溶出／分離されない。さらなる態様では、この量は固定相に結合しているエリスロポエチンの１０％未満であり、別の態様では５％未満であり、最後の態様では１％未満である。さらなる態様では、カルシウムイオンはＣａＣｌ２としてこの溶液に導入される。本発明方法の或る態様では、第二溶液は、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５M ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノールを含有しｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、第三溶液は、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５M ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノールを含有しｐＨ６．９±０．２である。さらなる態様では、第四溶液は、１０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌを含有しｐＨ６．９±０．２である。例えば９％（ｖ／ｖ）という値は、９％の２−プロパノールを提供し、調製された溶液を、最終容量が得られるまで添加することによってその溶液が作製されることを意味する。
【００５２】
テトラアンテナリーグリコシル型の量は、第五溶液で得られた画分に比較して第四溶液で得られた画分において増加する。しかしながら、第五溶液で得られた画分は、バイアンテナリーおよびトリアンテナリーグリコシル型の比率がより高い。さらに、第五溶液を使用すると、修飾無しのＣａＣｌ２によるＣＨＴ２型のランに比較して、より高率のｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯ種が画分中に見出されることが判明した。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、ＥＰＯをコードしている核酸を含む細胞を適当な培地で適当な条件下に培養し、培地または細胞からエリスロポエチンを単離することを含む、エリスロポエチンの生産方法である。或る態様では、この細胞を浮遊培養する。さらなる態様では、この培養を発酵槽、特に１０ｌ〜５００００ｌ容量の発酵槽で実施する。この細胞の培地からのエリスロポエチンの単離は、以下の工程：
ａ）細胞培養上清または破砕した細胞懸濁液の上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
ｂ）場合により、工程ａ）で得られたエリスロポエチン含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびＥＰＯを含有する画分を回収／収集すること、
ｃ）ａ）またはｂ）のＥＰＯを含有する画分をヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、本発明方法を使用してエリスロポエチン含有画分を回収／収集すること、および、
ｄ）ｃ）のＥＰＯを含有する画分を、濃縮しまたは／そして逆相ＨＰＬＣ材料に適用すること、
を含む。
【００５４】
精製方法の工程ａ）は、場合により前処理されていてもよい細胞培養上清を、アフィニティークロマトグラフィー材料に適用することを含む。或る態様では、このアフィニティークロマトグラフィー材料は、青色色素を共有結合させた材料である。その一例はブルーセファロースである。或る態様では、２％に等しいまたはそれ以上（≧２％）（ｖ／ｖ）の血清含有量の培地を使用した場合に、アフィニティークロマトグラフィー材料から溶出させた後、このエリスロポエチン含有溶出液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用する。或る態様では、この相互作用クロマトグラフィー材料はブチルセファロースである。工程ａ）、または採用した場合には工程ｂ）から得た溶出液を、本方法の工程ｃ）においてヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用し、エリスロポエチンを含有する溶出液を本発明方法に従って回収する。或る態様では、この溶出液を排除クロマトグラフィーによって、例えば膜濾過によって濃縮するが、その場合、排除サイズ１０kDaの媒体、例えば膜の使用が好都合であると判明している。本発明方法により得られるエリスロポエチンは、α−２，３−結合または／およびα−２，６−結合したシアル酸残基を含み得る。
【００５５】
組換えエリスロポエチンを生産するため、無細胞培養上清を単離し本発明方法に付す。必要ならば濁りを分離するための濾過および／または濃縮を精製工程の前に追加で実施することができる。
【００５６】
第一の工程では、色素クロマトグラフィーがプロテアーゼによる夾雑物を除去する。或る態様では、Cibachron（登録商標）ブルーのような青色トリアジン色素を色素として使用する。他のトリアジン色素もまた好適である。色素クロマトグラフィーの支持材料は重要でないが、好ましくは多糖類型支持材料、例えばセファロース、好ましくはセファロース６ファストフローが用いられる。カラムは、４．５〜５．５のｐＨ値、或る態様ではｐＨ４．８〜５．２の緩衝液で平衡化し、さらなる態様では酢酸緩衝液または酢酸で平衡化する。或る態様では、このクロマトグラフィーを１℃〜１０℃の温度で、別の態様では約５℃の温度で操作する。或る態様では、溶出／回収は、酸性または中性ｐＨ（或る態様ではｐＨ５〜７）で塩濃度を増大させることによる。塩基性ｐＨ、或る態様ではｐＨ８．５〜９．５、別の態様ではｐＨ８．８〜９．２において、塩濃度を大きく変化させずにエリスロポエチンを溶出させることも可能である。
【００５７】
第二の工程では、疎水化支持体によるクロマトグラフィーを実施する。疎水性クロマトグラフィーのための好適な吸着剤は、例えばProtein Purification Methods, A practical Approach, Ed. Harris, E.L.V. and Angal, S., IRL Press, Oxford, England(1989), p.224；およびProtein Purification, Janson, J.C., Ryden, L., (ed.), VCH Publisher, Weinheim, Germany (1989), p.207-226に記載されている。支持材料自体は重要でなく、例えばアクリル酸およびメタクリル酸のコポリマーであるセファロース、またはシリカゲルとすることができる。疎水性基、或る態様ではブチル基が支持体に共有結合していることが重要である。好適な支持体が市販されている（例えば、Tosoh Haas, Germany由来のブチルトヨパール、またはPharmacia, Germany由来のブチルセファロース）。或る態様ではブチル化支持体が使用される。その他のアルキル化またはアリール化支持体は、エリスロポエチンと不可逆的に結合したり、より良好でない分離となることがある。疎水性クロマトグラフィーにおける溶出は、ヨウ化物、過塩素酸塩またはチオシアン酸塩のようなカオトロピック剤の添加により、またはグリセロール、エチレングリコールまたは２−プロパノールのようなアルコールの添加により、塩濃度を下げる（例えば、４mol/l〜０mol/lの勾配で）ことによって起こる。或る態様では、この疎水性クロマトグラフィーを中性ｐＨで塩の存在下に、或る態様では約０．７５mol/lＮａＣｌの存在下に実施する。低分子量アルコール、或る態様ではイソプロパノール（＝２−プロパノール）の存在下に疎水性クロマトグラフィーを実施することも可能である。溶離緩衝液中の低分子量アルコールの濃度は平衡化緩衝液中の約２〜３倍である。洗浄緩衝液においては、低分子量アルコールの濃度は平衡化緩衝液中の約２倍である。平衡化のためには約１０〜１５％、或る態様では約１０％の２−プロパノールを加え（クロマトグラフィー材料のロード）；溶離のためには約２５〜３５％、或る態様では約２７％の２−プロパノールを加え、そして洗浄緩衝液には１９％の２−プロパノールを加える（指定した濃度は他のアルコールに対しても好適である。容量％、ｖ／ｖで表記）。疎水性クロマトグラフィーは１０℃〜４０℃という広い温度範囲で実施できる。しかしながら、２７±２℃の制御温度で操作するのが好都合である。
【００５８】
次に、本発明方法に従い、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相での分離を実施できる。
【００５９】
精製のための任意の工程として、ヒドロキシアパタイト工程に引き続き疎水化支持体による逆相クロマトグラフィーを行ってもよい。しかしながら通常これは、本発明に係るヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを利用する場合もはや必要ではなく、そのため省略できる。時間の節約に加えて、このことは費用をも削減し、後で分離せねばならない有機溶媒の使用を回避させる。以下のものが例えば逆相クロマトグラフィーのクロマトグラフィー材料として好適である：フェニルセファロースおよびオクチルセファロース（Pharmacia, Sweden）、ブチルトヨパール（Tosoh Haas, Germany）またはプロピル−ＴＳＫ（Merck, Germany）。但しこの工程では、より長いアルキル基（例えばＣ８またはＣ１８）を含む支持体の使用もまた有利である。或る態様では、カラムを２〜７の範囲のｐＨで、別の態様ではｐＨ２．５で平衡化し、別の態様では水性トリフルオロ酢酸を使用する。溶離には、平衡化緩衝液から極性有機溶媒、例えばアセトニトリルの水溶液に至る勾配を使用する。クロマトグラフィー後、溶出液を中和するのが好都合である。
【００６０】
本発明に係る精製法の次の工程として、陰イオン交換クロマトグラフィーが続く。この工程では、或る態様においてＤＥＡＥセファロースファストフロークロマトグラフィー材料をカラム材料として使用する。これを用いて平衡化をｐＨ６〜ｐＨ９のｐＨ値で、別の態様ではｐＨ７．５で実施する。或る態様では場合により、酸性溶液（およそ４．５のｐＨ値）で洗浄した後、溶離を中性または弱塩基性範囲（ｐＨ６〜９、或る態様ではイオン強度を高めつつ（或る態様ではＮａＣｌで）ｐＨ７．５）で実施する。或る態様では緩衝液としてリン酸緩衝液を使用する。
【００６１】
或る態様では、このタンパク質調製物を０．１ｇ〜１０ｇのバッチで生産する。色素によるアフィニティークロマトグラフィー後の第二工程として疎水性クロマトグラフィーを実施すると、ＥＰＯが、或る態様では天然の哺乳動物タンパク質を含まない培地での培養後に、治療的用途に充分となる程精製され得ることが判明した（ＥＰ１３９４１７９）。Nobuo, I., et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359またはＷＯ８６／０７４９４に記載のように、クロマトグラフィー精製前にプロテアーゼインヒビター（例えばＣｕＳＯ４）を加える必要はない。疎水性クロマトグラフィーは、或る態様ではアルキル化（Ｃ４−Ｃ１８）またはアリール化（或る態様ではフェニル化またはベンジル化）支持体で実施する。別の態様では特にブチル化支持体を使用する。
【００６２】
本明細書において「天然の哺乳動物タンパク質を全く含まない」とは、その調製物が検出可能な量のそのようなタンパク質を含有しないことを意味する。その調製物は、宿主細胞由来でなく、そして細胞増殖を維持改善し収量を最適化するために培地に通常添加される、意図的に加えられる哺乳動物タンパク質を全く含まない。天然の哺乳動物タンパク質とは、ヒトまたは動物といった天然供給源に由来する哺乳動物タンパク質であり、例えば大腸菌（E. coli）のような原核生物中で産生された組換え哺乳動物タンパク質ではないと理解する。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、以下の工程：
ａ）２０kDa〜４０kDaの分子量を有する活性化ＰＥＧ試薬を使用することによりエリスロポエチンをポリ（エチレングリコール）にコンジュゲートさせ（エリスロポエチンのＰＥＧ化）、
ｂ）工程ａ）で得られたＰＥＧ化エリスロポエチンを、各々同じ固定相で異なる溶離法を用いる２種類の連続的陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製し、
ｃ）第二固定相からＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））にコンジュゲートしたエリスロポエチンを単離する、
を含む、１個のポリ（エチレングリコール）ポリマーに共有結合したエリスロポエチン（モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチン）を生産する方法である。
【００６４】
この方法は、組換え生産されその後化学的にＰＥＧ化されたＰＥＧ化ＥＰＯの精製に特に好適である。この方法の第一工程は、エリスロポエチンのＰＥＧ化である。この反応に使用するポリ（エチレングリコール）ポリマー（ＰＥＧ）は、およそ２０kDa〜４０kDaの分子量を有する（ＰＥＧは確定した分子量を伴って得られる訳ではなく、分子量分布を有するポリマー化合物であるため、この文脈における「分子量」という語は、ポリ（エチレングリコール）の平均分子量を指す）。「およそ」という語は、幾らかのＰＥＧ分子はより高い分子量を、そして幾らかはより低い分子量を有することを意味する。即ち「およそ」という語は、それが分子量分布であってＰＥＧ分子の９５％が記載の分子量の＋／−１０％の分子量を有するということを意味する。
【００６５】
「ＰＥＧ化」という語は、ポリ（エチレングリコール）分子および或るポリペプチドのＮ末端またはリジン側鎖の間の共有結合を指す。タンパク質のＰＥＧ化は特にVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417に記載されている。ポリ（エチレングリコール）は種々の官能基によってタンパク質に結合でき、そして様々な分子量を有する（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304）。ポリ（エチレングリコール）およびエリスロポエチンの共有結合は、例えばＷＯ００／４４７８５に報告されたように水溶液中で実施でき、或る態様では、５kDa〜４０kDaの分子量を持つＮＨＳ活性化直鎖状または分岐ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子を使用して実施できる。ＰＥＧ化反応は、固相反応として実施することもできる（Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229）。選択的Ｎ末端ＰＥＧ化タンパク質が、ＷＯ９４／０１４５１またはFelix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (poly(ethyleneglycol))(1997) 218-238に従って取得できる。
【００６６】
以下の実施例、配列表および図面を本発明の理解を助けるために提供するが、本発明の真の範囲は付記する請求項に開示する。本発明の精神を逸脱することなく、開示された方法に改変を施すことができるということを理解されたい。
【００６７】
配列表の説明
配列番号１ １６５残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
配列番号２ １６６残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ヒドロキシアパタイトを含有する固定相（ＨＡ−ウルトロゲル）を用いるエリスロポエチンのクロマトグラフィーの例示的クロマトグラム。
【図２】個々のエリスロポエチン含有画分の純度のプロット。
【図３】分析用逆相ＨＰＬＣによるエリスロポエチン含有画分の分析的クロマトグラフィー。
【図４】エリスロポエチン含有画分中のｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびＥＰＯのパーセンテージの略図。
【図５】エリスロポエチン含有画分中のタンパク質様不純物の分布。
【図６】エリスロポエチン含有画分のシアル酸数のプロット。
【図７】エリスロポエチン含有画分中の酸性および塩基性イソ型の分布。
【図８】エリスロポエチン含有画分中のトリアンテナリーグリコシル型の分布。
【図９】エリスロポエチン含有画分中のバイアンテナリーグリコシル型の分布。
【図１０】エリスロポエチン含有画分中のグリコシル型の分布の概略。
【図１１】エリスロポエチン含有ピークにおける肩部の比較例。
【図１２】ヒドロキシアパタイトを含有する種々の固定相を用いて得られたエリスロポエチンのイソ型分布。
【図１３】本発明方法を用いて得られたクロマトグラム。
【図１４】種々のクロマトグラフィー法におけるイソ型分布の比較。
【００６９】
材料および方法
クロマトグラフィーのための緩衝液
溶液は全て保存溶液から調製した。別途記載の無い限り、全ての緩衝液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨまたは１Ｍ ＨＣｌで調節した。II型超純水（ミリＱ水）を常に使用した。
【００７０】
保存溶液（水中）
１mol/lリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．９±０．２、
１mol/lトリス（ヒドロキシアミノメタン）緩衝液（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）、ｐＨ６．９±０．２、
５mol/l塩化ナトリウム、
１mol/l塩化カルシウム、
１０mol/l水酸化ナトリウム。
【００７１】
標準クロマトグラフィー緩衝液：
標準洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＨＡウルトロゲル／ファストフロー：
２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＣＨＴ： ２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ９〜１０
再生緩衝液１ ＨＡウルトロゲル：
２００mMリン酸カリウム、０．１mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
再生緩衝液１ ＣＨＴ、ファストフロー：
２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
アルカリ性再生： ０．５Ｍ ＮａＯＨ
平衡緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、
ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mMＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．５mMＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
【００７２】
分析的決定のための緩衝液
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ：
溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、水
溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ、７０％アセトニトリル、水
タンパク質決定Ａ２８０：
１０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、０．１mol/lＮａＣｌ、ｐＨ７．５±０．２
【００７３】
タンパク質決定
光路長１cmの水晶キュベットを使用した。試料を、測定される吸光度が０．２〜１．０AUとなるよう希釈した。希釈が必要な場合、試料を相互に独立して希釈し、トリプリケートで測定した。希釈しなかった試料は１回の測定で決定した。エリスロポエチン最終生成物緩衝液を試料の希釈およびブランク測定に使用した。
【００７４】
測定は２８０nmで実施した。エリスロポエチンリファレンス標準試料を系の対照として最初に測定した。実際の試料は、分析に先立ち平均タンパク質濃度１．８６mg/ml〜２．０５mg/mlに調節した。タンパク質濃度は以下の式に基づいて算出した：
【００７５】
【数１】
１）０．１％溶液の吸光係数：ε＝１．２５ml・(mg・cm)−１
２）試料の希釈係数
【００７６】
タンパク質の量は以下の式で与えられる：
ｍ［ｇ］＝ｃ［mg/ml］・Ｖ［Ｌ］
【００７７】
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）において、全ての試料は溶離液Ａで最大濃度０．１２mg/mlに希釈した。タンパク質濃度は２８０nmの光度測定により決定した。試料の分析に先立ち１００％溶離液Ａの試料４個を注入した。このことによりカラムが完全に平衡化されていることを確実とした。エリスロポエチンリファレンス標準を、試料の連続分析の開始時および終了時に分析した。偏位を回避するため、クロマトグラムを標準化積分法で解析した。基線に垂直な線を引くことにより各ピークを相互に分離した。
【００７８】
ＣＨＯタンパク質含有量／宿主細胞タンパク質含有量の決定
ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってＣＨＯ細胞タンパク質を測定した。ここではストレプトアビジン／ビオチン技術に基づくサンドイッチ法を利用した。このアッセイにはストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレートを使用した。ＣＨＯ細胞タンパク質に対する抗体を、ビオチンによってこのプレートに結合させた。分析しようとする試料溶液を、１５〜１５０ng/mlのＣＨＯタンパク質濃度でピペットにより添加した。濃度が１５ng/mlを下回った場合、その試料をＣＨＯタンパク質を含まないとみなした。濃度が１５０ng/mlを超えた場合には、より高希釈で試験を反復した。
【００７９】
結果をＣＨＯタンパク質［ppm］として記載した。
【００８０】
【数２】
【００８１】
イソ型分布の決定
キャピラリー電気泳動によってイソ型分布を決定した。この分析のため、試料を水中で透析濾過した。続いてそのキャピラリーを電解質溶液ですすぎ、その後、希釈試料をキャピラリー内に適用した。２５０００Ｖの高電圧をかけることにより分離した。移動相緩衝液は過剰の陽イオンを有し、それが電気浸透流をもたらした。水晶のキャピラリーの使用が、キャピラリー中のタンパク質の光度検出およびピーク面積による定量を可能にした。
【００８２】
糖の分析
糖の分析には酵素試験法を利用した。この方法では、エリスロポエチンのＮ−グリコシド結合したオリゴ糖を酵素Ｎ−グリコシダーゼで開裂させた。さらに、酵素ノイラミニダーゼの助けを借りてこのオリゴ糖からシアル酸を除去した。得られたＮ−オリゴ糖を陰イオン交換体を用いて分離および分析した。試料と全く同じ方法で処理したエリスロポエチンリファレンス標準を、一連の試験の最中に測定した。以下の糖構造が検出された：バイアンテナリー、トリアンテナリー、トリアンテナリー１リピート、テトラアンテナリー、テトラアンテナリー１リピート、テトラアンテナリー２リピート。
【００８３】
排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
ＳＥ−ＨＰＬＣのため、分離を開始する前に、クロマトグラフィーカラムを３〜５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液で平衡化し、余分なピークの無い均一な基線を得た。試料を０．２mg/ml濃度に希釈し、ＳＥ−ＨＰＬＣに注入した。標準法に従いピークを積分した。垂線を降ろすことによりピークを相互に分離した。
【００８４】
ＤＮＡ測定
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖ＤＮＡおよびビオチン化一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の反応混合物を添加した。この結合タンパク質はＤＮＡに結合でき、ビオチン化された。このようにして試料混合物からＤＮＡを特異的に除去することが可能となった。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチンおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質にカップリングしたビオチンに結合した。この全複合体に、ウレアーゼにカップリングさせたＤＮＡ特異抗体を加えた。尿素を添加すると尿素の加水分解が導かれ、それがｐＨの局所的変化を惹起した。この変化は表面電位の変化として検出され得る。表面電位の変化は結合しているＤＮＡの量に比例した。一本鎖ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ消化およびＳＤＳによる変性により得られた。
【００８５】
ペプチドマップ
ｄｅ−Ｏ−ＥＰＯおよびｄｅ−Ｎ−ＥＰＯのような不完全にグリコシル化されたエリスロポエチン種はペプチドマッピングによって定量できる。この目的のため、エリスロポエチン分子をエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによりペプチドへと開裂し、これらのペプチドをＨＰＬＣで分離した。得られたペプチドパターンをリファレンス標準と比較した。得られた結果を、ピークサイズ、ピークの外観および保持時間について標準と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
実施例１
ＣＨＯ細胞におけるエリスロポエチンの組換え生産
ＥＰＯをバッチ法によってＣＨＯ細胞において生産した。発酵槽に前培養を接種し、約５日後、この発酵槽の内容物を収穫する。無傷のＣＨＯ細胞および細胞フラグメントを遠心分離により発酵上清から除去した。この無細胞培養上清のｐＨを酢酸（１mol/l）でｐＨ５．０〜５．２に調節し、その後このｐＨ調節した溶液を１〜９℃で濾過した。基本培地ＤＭＥ（ＨＧ）ＨＡＭのＦ−１２改変（Ｒ５）（GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, Order No. 57-736）、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−（＋）グルタミン、Ｄ−（＋）グルコース、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄（II）、アスパラギン、アスパラギン酸、セリンおよびポリビニルアルコールで構成される無血清培地を培養として使用した。
【００８７】
実施例２
ブルーセファロースクロマトグラフィー
ブルーセファロース（Pharmacia）は、色素Cibachron（登録商標）ブルーを共有結合させたセファロースビーズで構成される。エリスロポエチンは、低イオン強度および中性ないし酸性ｐＨ値でこの支持体に結合する。エリスロポエチンはイオン強度およびｐＨ値を上げることにより溶出する。
【００８８】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ４４０ ｘ ５００、Amicon, GB）に６０〜８０ｌのブルーセファロースを満たし、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを約３カラム容量（ＣＶ）の酢酸緩衝液で平衡化する。ｐＨ５に調節した無細胞培養上清を、温度１０＋／−５℃および流速８００〜１４００ml/分でカラムに導入する。このカラムを、同じ流速および５＋／−４℃で、約１ＣＶの洗浄緩衝液１、次いで約２ＣＶの洗浄緩衝液２で再洗浄する。その後カラムを約３ＣＶの溶離緩衝液で溶離する。タンパク質ピーク全体を集め（約３０〜６０ｌ）、ＨＣｌでｐＨ６．９に調節し、さらなる加工まで５＋／−４℃で保存する。生成物溶液はこのクロマトグラフィー工程で濃縮され、約４０〜５０％の純度が達成される。
【００８９】
平衡化緩衝液： ２０mM 酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液１： ２０mM 酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液２： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．５±０．３
溶離緩衝液： １００mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ９．０±０．２
【００９０】
実施例３
ブチルトヨパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）
ブチルトヨパール（Tosoh Haas）は、表面にブチル残基が共有結合している支持体である。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、２−プロパノールを含有する緩衝液で溶出される。
【００９１】
１０％ ２−プロパノールを含有する平衡化緩衝液中でタンパク質がブチルマトリックスに結合した後、エリスロポエチンを、水性緩衝液および５０％ ２−プロパノールより成る勾配によって溶出させた。この溶出は約２０％ ２−プロパノールで開始する。
【００９２】
クロマトグラフィーカラム（Pharmacia BPG 300/500）に３０〜４０ｌのブチルトヨパールを満たし、４Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを少なくとも３ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。ブルーセファロースカラムの溶出液を１０％ ２−プロパノールに調節し、温度２７±２℃および流速８００〜１２００ml/分でカラムに導入する。このカラムを、同じ温度および流速で、約１ＣＶの平衡化緩衝液で、そして次に約２ＣＶの洗浄緩衝液で再洗浄する。その後エリスロポエチンを約３ＣＶの溶離緩衝液で溶離する。タンパク質ピーク全体を集め（約１０〜１８ｌ）、直ちに希釈緩衝液で３倍に希釈し、１５℃で保存する。このクロマトグラフィーにおいて約９０％の純度が達成される。
【００９３】
平衡化緩衝液：２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
１０％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
１９％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
２７％ ２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
希釈緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
第一溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
【００９４】
実施例４
ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー
現行の工程条件に対する適切な比較を可能とするため、ヒドロキシアパタイトを含有する各固定相による分離において、同じ基本法の工程を利用した。その順序は、
再生 − 平衡化 − 分離 − 再生、
であった。
【００９５】
緩衝液は、再生のための製造者の指示に適合させた。
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
分離のためのクロマトグラフィーパラメータを以下の表４に示す。同パラメータを全ての材料に使用した。
【００９９】
【表４】
【０１００】
ＵＶ吸収シグナルに基づきピークを集めた。収集は１５mAUで開始し、各々のピーク最大値が過ぎた後に４０mAUで停止した。分離後に再生を行った。溶離および再生工程のピークを集め、−２０℃で保存した。再生のカットリミットは立上がり１５mAU〜立下がり１５mAUであった。溶離流速は個々の工程において０．３５cm/分から１．７cm/分の間で変化させた。
【０１０１】
標準溶液：
標準洗浄緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＨＡウルトロゲル／ファストフロー：
２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
充填緩衝液ＣＨＴ： ２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ９−１０
再生緩衝液１ ＨＡウルトロゲル：
２００mMリン酸カリウム、０．１mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
再生緩衝液１ ＣＨＴ、ファストフロー：
２００mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
アルカリ性再生： ０．５Ｍ ＮａＯＨ
平衡化緩衝液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、
ｐＨ６．９±０．２
洗浄緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．９±０．２
溶離緩衝液： １０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．５mM ＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、
ｐＨ６．９±０．２
【０１０２】
実施例５
ヒドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（BioSepra）は、その機械的および流体力学的性質を改善するためにアガロース骨格に組み込まれたヒドロキシアパタイトで構成される。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、殆どのタンパク質性不純物よりも低いリン酸濃度で溶出する。
【０１０３】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ４４０ｘ５００または同等品）に３０〜４０ｌのヒドロキシアパタイトウルトロゲルを充填し、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生する。続いてこのカラムを少なくとも４ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。精製しようとするエリスロポエチン溶液を、温度約１５℃および流速５００〜１２００ml/分でカラムに吸着させる。カラムを、約１ＣＶの平衡化緩衝液、次いで約２ＣＶの洗浄緩衝液により、同じ温度および流速で再洗浄する。次いで約３ＣＶの溶離緩衝液で溶出する。タンパク質ピーク全体を集め（約１０〜１８ｌ）、さらなる加工を行うまで１５℃で保存する。このクロマトグラフィーにおいて９５％を超える純度が達成される。
【０１０４】
平衡化緩衝液： ２０mM酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液１： ２０mM酢酸Ｎａ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ５．０±０．２
洗浄緩衝液２： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
ｐＨ６．５±０．３
溶離緩衝液： １００mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ９．０±０．２
【０１０５】
実施例６
ヒドロキシアパタイトファストフロークロマトグラフィー
この材料は製造者から固体で供給された。適当量の材料を秤量し、標準洗浄緩衝液に懸濁した。粒子の表面全体を濡らすため、粉末を緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー（約２０％（ｖ／ｖ））を充填に使用した。このゲル材料を２日間沈殿させることにより、圧力をかけずにカラムに充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを流速０．５ml/分（０．６４cm/分）で５ＣＶによりすすいだ。その後カラムを再生した。
【０１０６】
クロマトグラフィーを実施例４に記載のように実施した。
【０１０７】
実施例７
ヒドロキシアパタイトＣＨＴクロマトグラフィー
このセラミック材料（ＣＨＴ１型および２型）は製造者から固体で供給された。満たすべき量を秤量し、充填緩衝液ＣＨＴ１、２型に懸濁した。この材料の全面を濡らすため、ＣＨＴを充填緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー（約２０％（ｖ／ｖ））を充填に使用し、スラリー全体をカラムに満たし、流速１ml/分（１．３cm/時）で充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを再生した。
【０１０８】
クロマトグラフィーを実施例４に記載のように実施した。
【０１０９】
実施例８
ＣａＣｌ２を使用しない、本発明に係るヒドロキシアパタイトＣＨＴクロマトグラフィー
実施例７に記載のようにカラムを充填し、実施例４に記載のようにクロマトグラフィーを実施した。
【０１１０】
実施例４とは対照的に、以下の溶液を使用した：
第二溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
第三溶液： ２０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、
９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、ｐＨ６．９±０．２
第四溶液： １０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ６．９±０．２
第五溶液： １０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、
１０mMリン酸カリウム、ｐＨ６．９±０．２
【０１１１】
実施例９
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料、例えばヴィダックＣ４（Vydac, USA）は、その表面にＣ４アルキル鎖を担持するシリカゲル粒子で構成されている。エリスロポエチンは疎水性相互作用の結果このマトリックスに結合し、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配で選択的に溶出される。
【０１１２】
２２±４℃の温度でＭｅｒｃｋ Ｐｒｅｐｂａｒ １００分離系（または同等品）を用いて分取ＨＰＬＣを実施した。分離カラム（１００mm x ４００mm、３．２ｌ）にヴィダックＣ４材料を充填した。使用前に緩衝液Ａから１００％溶媒に至る勾配を数回適用することにより、カラムを再生し、その後緩衝液Ａで平衡化した。このヒドロキシアパタイトカラムの溶出液をトリフルオロ酢酸で約ｐＨ２．５に酸性化し、濾過滅菌した。その後、温度２２±４℃および流速２５０〜３１０ml/分でエリスロポエチンをカラムに吸収させる。このカラムを同じ温度および流速で、緩衝液Ａから緩衝液Ｂに至る直線勾配で溶出した。溶出ピークを画分として集める。ＨＰＬＣ希釈緩衝液４容量を添加することにより、溶出液を直ちに中和する。
【０１１３】
分析用ＨＰＬＣで少なくとも９９％純度を有する画分をプールする（プール容量約４〜６ｌ）。このクロマトグラフィーにおいて微量の不純物が分離され、９９％を上回る純度が達成される。
【０１１４】
緩衝液Ａ： 水中０．１％トリフルオロ酢酸
緩衝液Ｂ： ８０％アセトニトリル、水中０．１％トリフルオロ酢酸
ＨＰＬＣ希釈緩衝液： １０mM リン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ７．５±０．２
【０１１５】
実施例１０
ＤＥＡＥセファロースＦＦクロマトグラフィー
ＤＥＡＥセファロースファストフロー（Pharmacia）は、セファロースビーズ表面に共有結合させたＤＥＡＥ基で構成されている。エリスロポエチンはイオン相互作用の結果このマトリックスに結合し、イオン強度を上げることにより溶離する。
【０１１６】
クロマトグラフィーカラム（アミコンＰ９０ ｘ ２５０または同等品）に、適用された試料中のエリスロポエチン１ｇあたり１００〜２００mlのゲルを満たし、０．５Ｍ ＮａＯＨで再生した。続いてこのカラムを、１００mMＮａ／Ｋ緩衝液（ｐＨ７．５）、その後少なくとも１２ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化する。ＨＰＬＣカラムの溶出液を、温度５±４℃および流速約１５０ml/分でカラムに吸収させる。カラムを同じ温度および流速で、少なくとも５ＣＶの平衡化緩衝液、次いで約１０ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。続いて、カラムを約１０ＣＶの平衡化緩衝液で再洗浄し、約７ＣＶの溶離緩衝液でエリスロポエチンを溶離した。全タンパク質ピークを集め（約２〜５ｌ）、濾過滅菌し分注する。
【０１１７】
このクロマトグラフィーにおいてＨＰＬＣ工程由来の溶媒が分離され、微量の不純物が除去される。純度は９９％を上回る。
【０１１８】
平衡化緩衝液： １０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、ｐＨ７．５±０．２
洗浄緩衝液： ３０mM酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５±０．１
溶離緩衝液： １０mMリン酸Ｎａ／Ｋ、８０mMＮａＣｌ、ｐＨ７．５±０．２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）エリスロポエチンおよびii）第一濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を提供すること、
ｂ）ヒドロキシアパタイト含有固定相を含むクロマトグラフィーカラムを提供すること、
ｃ）第二濃度でカルシウムイオンを含有する溶液をｂ）のカラムに適用すること、
ｄ）ａ）の溶液をｃ）で得られたカラムに適用すること、
ｅ）第三濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を、ｄ）で得られたカラムに適用すること、および、
ｆ）第四濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を、ｅ）で得られたカラムに適用することにより、精製されたエリスロポエチンを回収すること、
を含む、エリスロポエチンの精製方法であって、
該第一および第二カルシウムイオン濃度は、同じであり、そして該第三および第四カルシウムイオン濃度は、同じであって、該第一および第二カルシウムイオン濃度より低い、エリスロポエチンの精製方法。
【請求項２】
該第三および第四カルシウムイオン濃度が、０．５mMまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一および第二カルシウムイオン濃度が、５mMであることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）およびｅ）の溶液が、２−プロパノールを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｅ）およびｆ）の溶液が、好ましくはリン酸ナトリウムまたは同カリウムの形態である、濃度５mMのリン酸イオンを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｅ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｆ）の溶液が、１０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
以下のような一連のクロマトグラフィー工程：
ｉ）アフィニティークロマトグラフィー、
ii）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii）ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー、
を用いる、エリスロポエチンの生産方法であって、
ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィーは、前記請求項のいずれか１項に従って実施する、エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１１】
ＥＰＯをコードしている核酸を含む細胞を培養し、その細胞または培地からエリスロポエチンを単離することを含む、エリスロポエチンの生産方法であって、エリスロポエチンの単離が、以下の工程：
ｉ）細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
ii）場合により、ｉ）由来のエリスロポエチンを含有する画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
iii）ｉ）またはii）由来のエリスロポエチンを含有する画分を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、および請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を用いてエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
を含むことを特徴とする、エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１２】
以下の工程：
ｉ）２０kDa〜４０kDaの分子量を有する活性化ＰＥＧを用いてエリスロポエチンをＰＥＧ化すること、
ii）工程ｉ）で得られたＰＥＧ化エリスロポエチンを、同じ固定相を用いる２つの連続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製すること、
iii）第二の固定相からモノＰＥＧ化エリスロポエチンを回収し、それによりモノＰＥＧ化エリスロポエチンを生産すること、
を含む、モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチンの生産方法であって、
工程ｉ）で使用されるエリスロポエチンは、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られる、モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られたエリスロポエチン。
【請求項１４】
エリスロポエチン１分子あたり６以上１７以下のシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
【請求項１５】
エリスロポエチン１分子あたり６以上１７以下のシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
【請求項１６】
場合により薬学的希釈剤、助剤および／または担剤と共に、請求項１３または請求項１４または請求項１５に記載のエリスロポエチンを含有する医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を使用するクロマトグラフィー工程であって、ＥＰＯ含有画分の収集が、１５mAU〜７５mAUの吸収で始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する２８０nmでの光吸収により調節され、そして、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトであり、そして、溶液は、５mMのリン酸イオン濃度を有する、
を含む、エリスロポエチン中のＣＨＯ細胞タンパク質を涸渇させる方法。
【請求項１】
ａ）ｉ）エリスロポエチンおよびii）第一濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を提供すること、
ｂ）ヒドロキシアパタイト含有固定相を含むクロマトグラフィーカラムを提供すること、
ｃ）第二濃度でカルシウムイオンを含有する溶液をｂ）のカラムに適用すること、
ｄ）ａ）の溶液をｃ）で得られたカラムに適用すること、
ｅ）第三濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を、ｄ）で得られたカラムに適用すること、および、
ｆ）第四濃度でカルシウムイオンを含有する溶液を、ｅ）で得られたカラムに適用することにより、精製されたエリスロポエチンを回収すること、
を含む、エリスロポエチンの精製方法であって、
該第一および第二カルシウムイオン濃度は、同じであり、そして該第三および第四カルシウムイオン濃度は、同じであって、該第一および第二カルシウムイオン濃度より低い、エリスロポエチンの精製方法。
【請求項２】
該第三および第四カルシウムイオン濃度が、０．５mMまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一および第二カルシウムイオン濃度が、５mMであることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）およびｅ）の溶液が、２−プロパノールを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｅ）およびｆ）の溶液が、好ましくはリン酸ナトリウムまたは同カリウムの形態である、濃度５mMのリン酸イオンを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、５mM ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｅ）の溶液が、２０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、９％（ｖ／ｖ）２−プロパノール（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｆ）の溶液が、１０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９±０．２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
以下のような一連のクロマトグラフィー工程：
ｉ）アフィニティークロマトグラフィー、
ii）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
iii）ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー、
を用いる、エリスロポエチンの生産方法であって、
ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィーは、前記請求項のいずれか１項に従って実施する、エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１１】
ＥＰＯをコードしている核酸を含む細胞を培養し、その細胞または培地からエリスロポエチンを単離することを含む、エリスロポエチンの生産方法であって、エリスロポエチンの単離が、以下の工程：
ｉ）細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
ii）場合により、ｉ）由来のエリスロポエチンを含有する画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
iii）ｉ）またはii）由来のエリスロポエチンを含有する画分を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、および請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を用いてエリスロポエチンを含有する画分を回収／収集すること、
を含むことを特徴とする、エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１２】
以下の工程：
ｉ）２０kDa〜４０kDaの分子量を有する活性化ＰＥＧを用いてエリスロポエチンをＰＥＧ化すること、
ii）工程ｉ）で得られたＰＥＧ化エリスロポエチンを、同じ固定相を用いる２つの連続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製すること、
iii）第二の固定相からモノＰＥＧ化エリスロポエチンを回収し、それによりモノＰＥＧ化エリスロポエチンを生産すること、
を含む、モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチンの生産方法であって、
工程ｉ）で使用されるエリスロポエチンは、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られる、モノ−ＰＥＧ化エリスロポエチンの生産方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られたエリスロポエチン。
【請求項１４】
エリスロポエチン１分子あたり６以上１７以下のシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリー：トリアンテナリー：バイアンテナリーグリコシル型の比が８３：１４：２〜７４：２１：６の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
【請求項１５】
エリスロポエチン１分子あたり６以上１７以下のシアル酸残基数を有し、テトラアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：２リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型：トリアンテナリーグリコシル型：１リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型：バイアンテナリーグリコシル型の比率が４３：２８：１２：８：６：２〜４５：２１：７：１４：７：６の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
【請求項１６】
場合により薬学的希釈剤、助剤および／または担剤と共に、請求項１３または請求項１４または請求項１５に記載のエリスロポエチンを含有する医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を使用するクロマトグラフィー工程であって、ＥＰＯ含有画分の収集が、１５mAU〜７５mAUの吸収で始まり、最大ピークが過ぎ去った後に２００mAU〜４０mAUの吸収で終了する２８０nmでの光吸収により調節され、そして、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相は、純粋な結晶性ヒドロキシアパタイトであり、そして、溶液は、５mMのリン酸イオン濃度を有する、
を含む、エリスロポエチン中のＣＨＯ細胞タンパク質を涸渇させる方法。
【図１】
【図３】
【図１１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図３】
【図１１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５０２９３９（Ｐ２０１２−５０２９３９Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７２５２（Ｐ２０１１−５２７２５２）
【出願日】平成２１年９月２１日（２００９．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６７８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３４４４２
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２１日（２００９．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６７８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３４４４２
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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