エンドプラスミンフラグメントおよびその誘導体の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のためのバイオマーカーとしての使用、検出のための方法および試験システム
本発明は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための方法であって、以下の工程：ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、を包含する方法に関する。本発明はさらに、結腸直腸腺腫と結腸直腸癌との間の識別のための方法、そして結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の進展および／または経過、ならびに／あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置をモニタリングするための方法に関する。さらに、本発明は、これらの方法での使用のための試験システムおよびアレイに関する。さらに、本発明は、個体中の結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のためのバイオマーカーとしてのエンドプラスミンフラグメントの使用に関する。さらに、本発明は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置における化合物の有効性を決定するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、世界中で三番目に高い頻度で診断される癌（９．４％）である。２００３年には、世界中でほぼ９４５０００の結腸直腸癌の新規な症例が診断され、そしてほぼ４９２０００人がこの疾患で死亡した。結腸直腸癌の罹患率は増大しているが、結腸直腸癌の死亡率は減少している。結腸直腸癌の罹患率は年齢とともに増え、ほぼ４０歳で始まり、女性よりも男性で高い（男性での４０．６に対して女性での３０．６、１年あたり１０００００例）（Ｗｏｒｌｄ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｐｏｒｔ，２００３，Ｅｄ．ＢＷ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｐ．Ｋｌｅｉｈｕｅｓ．ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｙｏｎ）。
【０００３】
ほとんどの患者では、結腸直腸癌の進展は、前癌性の腺腫から転移の性向を有する浸潤性の悪性腫瘍への多段階の進行に従う。
【０００４】
結腸鏡検査のような従来の不快な結腸直腸スクリーニング試験しか、早期段階の結腸直腸癌およびその前駆体の検出を達成できないことが示されている。しかし、１０ｍｍの直径より小さい平坦な腫瘍性病変およびポリープ状病変については高い偽陰性率が観察されている（Ｋｕｄｏ Ｓ．（１９９７） Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．７：８７〜９８）。従って、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の早期の検出ならびに種々の腫瘍段階の間での特異的な識別を可能にする試験システムを有することが所望されている。これによってまた、治療の特異的適応が可能になる。
【０００５】
血液サンプル中の腫瘍マーカー検出に基づく現在公知のスクリーニング試験は、必要な感度および特異性を欠く。例えば、血液サンプル中のＣＥＡ（癌胎児抗原）レベルが、結腸癌を検出するために用いられている。しかし、ＣＥＡレベルは結腸癌で特異的に上昇しているのではなく、他の悪性疾患（例えば、胃、膵臓、乳房および肺の癌）を有する患者および種々の非悪性の状態（例えば、アルコール性肝臓病、炎症性腸疾患、重度タバコ喫煙、慢性気管支炎および膵炎）にある患者でも上昇していることが示されている。（Ｐｏｓｎｅｒ ＭＲ，Ｍａｙｅｒ ＲＪ：Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ８：５３３，１９９４）。さらに、ＣＥＡレベルは、結腸腺腫では上昇していない。加えて、ＣＥＡレベルは、結腸直腸癌からの結腸直腸腺腫の識別や種々の腫瘍段階の識別には適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、結腸腺腫および／または結腸癌の早期検出を可能にする手段、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別を可能にする手段を提供することである。
【０００７】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出において用いられ得る、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別に用いられ得るバイオマーカーを提供することがさらなる目的である。
【０００８】
本発明の別の目的は、費用効果的であって、かつ広範に用いられ得る、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムを提供することである。
【０００９】
さらに、この試験システムは、取り扱いが容易でなければならない。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、腫瘍の特定の段階に依存して腺腫および／または癌の処置のために特異的である化合物の有効性を検出するためのスクリーニングシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の根底にある目的は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の、個体における結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のためのバイオマーカーとしての使用によって解決される。検出は、インビボでそしてインビトロで行われてもよい。好ましい実施形態に従って、検出はインビトロで行われる。
【００１２】
この目的はさらに、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための方法によって解決され、この方法は、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１３】
この目的はさらに、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌を識別するための、ならびに／あるいはさらなる腫瘍状態を識別するための方法によって解決され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１４】
この目的はまた、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の進展および／または経過および／または処置をモニタリングするための方法によって解決され、この方法は、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１５】
好ましい実施形態では、外科的または治療的な手段の有効性は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌が完全に除去されたか否かについて決定するために制御される。別の実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の患者の、１つ以上の化学物質、抗体、タンパク質、ペプチド、低分子薬物、アンチセンスＲＮＡ、放射線、例えば、Ｘ線またはそれらの組み合わせでの処置による治療は、その処置の有効性を制御するために管理される。
【００１６】
本発明の根底にある目的は、個体のサンプル中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムを提供することによって解決され、この試験システムは以下の：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合する抗体またはレセプターと、
ｂ）この抗体またはレセプターを支持する固体支持体と、
ｃ）この抗体またはレセプターに対するエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープの結合を検出するための試薬と、
を含む。
【００１７】
本発明の目的はさらに、個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための検出分子を含むアレイを提供することによって解決され、このアレイは、検出分子として：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された核酸プローブ、または
ｂ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された抗体、または
ｃ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定されたレセプターを含み、
検出分子の好ましい種々の量が、定量の正確性を増大するために固体支持体に固定される。
【００１８】
核酸プローブは、例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、アプタマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。アプタマーとは、特異的な配列依存性の形状を帯び、高い特異性および親和性でタンパク質標的に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて確認される（Ｔｕｅｒｋ Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８〜８２２）。
【００１９】
この目的はさらに、ある化合物が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置に有効であるか否かを決定するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための方法によって解決され、この方法は以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００２０】
好ましい実施形態は、従属項で特定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明によれば、「サンプル物質」という用語はまた「サンプル」とも表わされる。
【００２２】
本発明によれば、「バイオマーカー」という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の罹患の指標であるタンパク質またはタンパク質フラグメントまたは核酸を指すことを意味する。それは、「バイオマーカー」が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出する手段として用いられることを意味する。
【００２３】
「個体」またはその複数という用語は、哺乳動物を指すことを意味する。好ましくは、この哺乳動物は、患者のようなヒトである。
【００２４】
「健常な個体」またはその複数という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹っていない個体（単数または複数）を指すことを意味する。すなわち、「健常な個体（単数または複数）」という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の病理的状態に関してのみ用いられ、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌以外の疾患に罹患している個体を除外しない。
【００２５】
本発明による「種々の腫瘍段階の識別」という用語は、結腸直腸腺腫対結腸直腸癌の識別、および／または種々の腫瘍段階、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの識別を意味する。
【００２６】
「その誘導体」という用語は、例えば、短縮された遺伝子、この遺伝子のフラグメント、変異された遺伝子、または改変された遺伝子もしくはそのそれぞれの遺伝子産物を含む、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでの任意の改変を記述するものとする。「その誘導体」という用語は、核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質配列またはペプチド配列を含む。その誘導体は、遺伝子の欠失、置換または挿入の結果である改変であってもよい。この遺伝子改変は、自然界で起こる遺伝子の可変性の結果であってもよい。「自然界で起こる遺伝子の可変性」という用語は、遺伝子操作の結果ではない改変を意味する。この誘導体は、身体および／または分解産物内の遺伝子または遺伝子産物の処理の結果であってもよい。タンパク質レベルでの改変は、身体内の酵素的または化学的な改変に起因し得る。例えば、この改変は、グリコシル化またはリン酸化またはファルネシル化であってもよい。
【００２７】
本発明において用いられる「エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体」という用語は、変異されたエンドプラスミンフラグメントまたは改変されたエンドプラスミンフラグメントまたは改変されたエンドプラスミンのフラグメントも含む。「エンドプラスミンフラグメント」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因し得る。
【００２８】
「腫瘍」および「癌」という用語は、交換可能に用いられ、同じ意味を有する。
【００２９】
１つの実施形態では、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体は、エンドプラスミンのＮ末端フラグメントまたはＣ末端フラグメントを含むタンパク質である。Ｎ末端フラグメントまたはＣ末端フラグメントという用語は、これらの配列がそれぞれエンドプラスミンの完全なＮ末端フラグメントまたはＣ末端を含むというのではなく、そのフラグメントが、エンドプラスミンのＮ末端またはＣ末端の領域から生成されるというように解釈されるべきである。
【００３０】
フラグメントはまた、エンドプラスミンのタンパク質配列の中央部分から生成されてもよい。
【００３１】
エンドプラスミン（配列番号１）のフラグメントの配列長さは、エンドプラスミンに特異的であるために十分長くなければならない。少なくとも７つ連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも８つ連続する、エンドプラスミンの配列（配列番号１）のアミノ酸を含む、エンドプラスミンのフラグメントは、エンドプラスミンに極めて特異的である。本発明の好ましい実施形態に従えば、フラグメントは、エンドプラスミン（配列番号１）の少なくとも９つ連続するアミノ酸を含む。
【００３２】
ｇｒｐ９４とも命名される完全長のエンドプラスミン（配列番号１）の特異的な切断によって、約１０〜１４ｋＤａおよび８０ｋＤａの２つのフラグメントがもたらされる。このエンドプラスミンの切断は、カルパインによって誘導されると推測される（図４）。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、約８０ｋＤａの分子量を有するＣ末端フラグメントまたは約１０〜１４ｋＤａの分子量を有するＮ末端フラグメントを含む。本発明の別の実施形態によれば、約１０〜１４ｋＤａまたは約８０ｋＤａの分子量を有するフラグメントは、カルパインによる切断によって誘導される。
【００３４】
本発明のある実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号１の配列の一部を含む。本発明の好ましい実施形態では、このエンドプラスミンフラグメントは、Ｎ末端フラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、配列番号２のペプチド配列および／または配列番号３のペプチド配列を含む。本発明の別の実施形態によれば、このフラグメントは、配列番号４のペプチド配列を含む。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、１０〜１４ｋＤａ、より好ましくは１０．３ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４（図１）と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるかまたはそれを含み、そして結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を特異的に検出し得るペプチドまたはタンパク質である。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号１と、フラグメントの配列に基づいて、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３８】
グルコース関連タンパク質（ｇｒｐｓ）は、ストレス誘導の後に合成される高度に保存されたタンパク質の群である。ｇｒｐｓは、それらのそれぞれの標的タンパク質を輸送、折りたたみおよび処理することを助ける分子シャペロンとして作用する。免疫組織化学的染色によって、ｇｒｐ９４は主に細胞質中で検出される。ｇｒｐ９４はまた、エンドプラスミンとも呼ばれる。ｇｒｐ９４（エンドプラスミン）は、小胞体内において２つの異なる形態で存在することを示唆する管腔タンパク質および内在性タンパク質の二つの特性を示す。
【００３９】
「エピトープ」という用語は、抗体、抗体フラグメント、タンパク質またはペプチド構造またはレセプターの特異的な結合を可能にするタンパク質またはペプチドまたは任意のタンパク質の性質を持つ構造の任意の構造要素を指すことを意味する。
【００４０】
本発明の方法は、ヒトの身体から既に単離されている体液または組織サンプルのようなサンプル物質を用いて行われる。好ましくはこのサンプル物質は組織サンプルである。サンプル物質は、後で分画されても、および／または精製されてもよい。例えば、試験されるべきサンプル物質をフリーザー中に貯蔵して、そして本発明の方法を、それぞれのサンプル物質を解凍した後に適切な時点で行うことが可能である。
【００４１】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、バイオマーカーとして、好ましくは早期のバイオマーカーとして用いられ得るということが本発明者らによって驚くべきことに発見されている。
【００４２】
本発明者らは、組織サンプルまたは体液のようなサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のタンパク質レベルは、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌をともなう個体で上昇するということを驚くべきことにいまや見出した。さらに、本発明者らは、組織サンプルまたは体液中の、エンドプラスミンフラグメントのタンパク質レベルまたはその誘導体は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌をともなう人から健常な人を識別するために、ならびに結腸直腸癌から結腸直腸腺腫を識別するために用いられ得るということを驚くべきことに見出した。さらに、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、種々の腫瘍段階、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶの間を識別するために用いられ得る。エンドプラスミンフラグメントは、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階を識別するために用いられ得る特異的なバイオマーカーである。この種々の腫瘍段階は、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶであってよい。エンドプラスミンフラグメントは、組織病理学によって得られる診断を確認するために用いられ得る選択的かつ特異的なマーカーである。
【００４３】
しかし、本発明者らはまた、組織または生物学的な液体、例えば、血清または血漿のようなサンプル物質中の完全なエンドプラスミンのレベルの上昇が、結腸直腸腺腫に特異的であるということを見出している。従って、完全なエンドプラスミンのレベルの上昇は、結腸直腸腺腫の指標でもある。その観点から、上記または下記の全ての説明は、それぞれ完全なエンドプラスミンにあてはまる。
【００４４】
しかし、本発明者らはまた驚くべきことに、組織または体液のようなサンプル物質中のエンドプラスミンのフラグメントのレベルの上昇が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のかなりより特異的かつ敏感なバイオマーカーであるということを見出している。
【００４５】
本発明によれば、サンプル物質は、組織、細胞または体液であってよい。サンプル物質は、体液、例えば、血液、血漿、血清、骨髄、糞便、滑液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、母乳、精液、浸出液およびその混合物であってもよい。本発明のある実施形態では、体液は、クロマトグラフィーによって分画される。
【００４６】
好ましくは、体液は、本発明の方法を行う前に単離されている。本発明の方法は好ましくは、実験室の技術者によってインビトロで行われる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、血漿、血清または尿で測定される。血清は、医学的に検査される個体から血液を採取することによって、および凝固した血液から上清を分離することによって容易に得ることができる。
【００４８】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、結腸直腸腺腫の形成の進行にともなってより高くなる。結腸直腸腺腫は、良性の新生物であって、悪性になり得る。良性の結腸直腸腺腫から結腸直腸癌に進展する場合、体液、好ましくは血清中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルはさらに増大する。
【００４９】
結腸直腸癌への結腸直腸腺腫の形質転換の後、罹患した個体の病理学的な状態は、転移の形成によってさらに増悪され得る。エンドプラスミンフラグメントのレベルがより高いことは、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌および／または転移の発生と相関する。
【００５０】
本発明は、早期に、および／またはまだなお良性段階で、および／または早期の腫瘍段階で、新生物性の疾患を検出できる早期段階のバイオマーカーを提供する。早期の検出によって、医師は、結腸直腸腺腫を時機を得て除去し、その個体が生存する機会を劇的に増大させることが可能になる。
【００５１】
さらに、本発明は、長期間にわたって、例えば数年にわたって血清のような体液中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルをモニターすることを可能にする。
【００５２】
長期間のモニタリングによって、結腸直腸腺腫と結腸直腸癌との間の識別が可能になる。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、規則的に、体液中で、例えば、１年に１回または２回チエックされ得る。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの増大が検出される場合、これは、結腸直腸腺腫の指標であり得る。次いで、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルのさらなる増大は、悪性の結腸直腸癌への形質転換の指標であり得る。
【００５３】
さらに、疾患および／または処置の経過がモニターされてもよい。例えば、結腸直腸腺腫の除去後、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルがさらに増大する場合、これは、病理学的な状態の増悪の指標であり得る。
【００５４】
そのことは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出および／またはモニタリングのための有用な臨床的パラメーターであるということを意味する。体液中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、結腸直腸腺腫の発生後に増大する。従って、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、早期の診断、およびその後の疾患の早期の処置を可能にする重要な臨床的パラメーターである。さらに、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、外科手術および／または他の治療の有効性をチエックするために用いられ得る。
【００５５】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の間を識別するための本発明の方法は、個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、次いで、この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、最終的に、このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程とを包含する。１つの実施形態では、１つ以上のさらなるバイオマーカーをさらに、個体から採取されている単離されたサンプル中において検出し、そのバイオマーカーのレベルを決定して、１つ以上の参照値と比較する。
【００５６】
参照値は、健常な個体、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹患している個体の複数の単離されたサンプルで決定されたエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の平均レベルとして算出され得る。この参照値は、正常とみなされる範囲をカバーする健常な人から、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹患している患者から上昇しているとみなされる範囲から確立され得る。通常、参照値は、ある範囲として与えられる。従って、本発明において用いられる参照値および参照値の範囲という用語は、同じ意味を有すると規定される。
【００５７】
次いで、ある参照値の範囲内の特定の値は、健常な状態、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の病理的な状態の指標であってもよい。この参照値の範囲は、任意の他の医学的パラメーター範囲、例えば、血糖などで行われるように、健常な個体の、ならびに結腸腺腫および／または結腸癌に罹患している個体の、血清サンプルのような、組織サンプルまたは体液サンプルの統計学的に関連する数を取り上げることによって確立され得る。健常な状態の参照値はまた、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腫瘍の患者の健常な組織から得てもよい。
【００５８】
好ましくは、陰性コントロールおよび陽性コントロール１と命名される２つの参照値が算出される。陰性コントロールの参照値は、健常な個体、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腫瘍の患者の健常な組織から算出され、そして陽性コントロールは、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌に罹患している個体から算出される。より好ましくは、陰性コントロールおよび陽性コントロール１および陽性コントロール２と命名される３つの参照値が算出される。陽性コントロール１は、結腸直腸癌に罹患している個体から算出されてもよく、そして陽性コントロール２は、結腸直腸腺腫から算出されてもよい。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、参照値は、ある期間にわたって個体から採取された複数の単離されたサンプルで決定されたエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の平均レベルとして算出された個々の参照値であってもよい。
【００６０】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを長期間、例えば、数ヶ月または数年にわたってモニタリングする場合、個々の平均レベルを確立することが可能である。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、例えば、血糖を測定する場合の同じ血清サンプルから測定されてもよく、そしてエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの任意の個々の増大を特異的に検出することを可能にする個々の検量線を確立するために用いてもよい。
【００６１】
さらなるバイオマーカーについての参照値はまた、エンドプラスミンについて記載されたのと同じ方法で算出され得る。エンドプラスミンフラグメントまたはさらなるバイオマーカーの平均レベルは、平均または中央のレベルであってよい。
【００６２】
別の見地では、本発明はさらに、個体の単離されたサンプル物質中の結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための試験システムを提供する。この試験システムは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープまたは適切な構造的要素に特異的に結合する抗体またはレセプターの特異性のいずれかに基づく。レセプターは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合し得る任意の構造であってよい。レセプターは、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメント、あるいはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合し得る任意の他のタンパク質またはペプチド構造であってよい。レセプターはまた、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合するアプタマーであってもよい。
【００６３】
抗体、抗体フラグメントまたはレセプターは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体と結合して、そしてその検出を可能にするために、例えば、プラスチック表面またはビーズのような固体支持体に結合される。例えば、従来からのマイクロタイタープレートは、プラスチック表面として用いられ得る。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の結合の検出は、例えば、検出可能な基で標識された二次抗体を用いることによって、達成され得る。検出可能な基は、例えば、放射性同位元素または、例えば、色または蛍光のシグナルを生じる適切な基質を加えることによって検出できる、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素であってもよい。
【００６４】
この試験システムは、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）であってよい。しかし、抗体または抗体のフラグメントの特異性を用いる任意の他の免疫学的試験システム、例えば、ウエスタンブロッティングまたは免疫沈降が用いられてもよい。
【００６５】
本発明はまた、個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための検出分子を含むアレイを提供し、ここでこの検出分子は、エンドプラスミンフラグメント、その変異体、改変体もしくはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定された核酸プローブ、またはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定された抗体、またはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定されたレセプターであってよい。好ましくは、アレイはさらに、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌を検出するためのバイオマーカーに対するさらなる検出分子を含む。好ましくは、核酸プローブは、配列番号２および／または配列番号３、あるいは配列番号４に相当する核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００６６】
あるいは、本発明はまた、上記で規定された検出分子によって検出され得る固体支持体上に固定された患者サンプルを含む逆のアレイを含む。
【００６７】
好ましくは、アレイは、同定可能な位置で固体表面に固定された検出分子を含む。
【００６８】
本発明において用いられる「アレイ」という用語は、分類または配置をいい、規則的な配列の必要はない。アレイは、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは５つ、最も好ましくは１０の異なる検出分子のセットを含む。好ましくは、本発明のアレイは、少なくとも５０セットの検出分子、さらに好ましくは少なくとも１００セットの検出分子を含む。本発明の別の実施形態によれば、本発明のアレイは、少なくとも５００セットの検出分子を含む。検出分子は、例えば、既に上記されているような核酸プローブ、または抗体、またはレセプターであってよい。
【００６９】
核酸プローブは、任意の天然に存在するかまたは合成のオリゴヌクレオチド、アプアマー、ならびにｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどであってよい。
【００７０】
記載されたアレイは、本発明による試験システムで用いられ得る。本発明において用いられる「アレイ」という用語は、マクロアレイおよびマイクロアレイの両方に関する。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、質量分析によって決定される。
【００７２】
質量分析によって、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を、その分子量を介して特異的に検出すること、そしてエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の量を極めて容易に定量することが可能になる。
【００７３】
当該分野で公知の質量分析の分野における任意の適切なイオン化方法は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体分子、フラグメント、変異体、改変体またはその誘導体をイオン化するために使用され得る。このイオン化方法は、電子衝撃（ＥＩ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電界イオン化（ＦＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）および表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を含む。
【００７４】
当該分野で公知の質量分析の分野における任意の適切な検出方法は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の分子量を決定するために使用され得る。この検出方法は、四重極質量分析（ＱＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴ−ＭＳ）および飛行時間質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）を含む。
【００７５】
好ましくは、この質量分析は、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）である。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行う前に、単離されたサンプル中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を、活性な表面を有するチップまたは固体支持体上に固定するのが好ましい。活性な表面は、好ましくは、例えば、ウサギポリクローナル抗体のような、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に対して固定された抗体を含む。抗体にエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を結合させた後、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置での飛行時間分析を行い、これが、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの決定のための強度シグナルを送出する。
【００７６】
さらに、質量分析によって、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出に関して関連性を有し得る他のタンパク質を同時に検出することが可能になる。
【００７７】
本発明のある実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の感度および／または特異性は、１つ以上のさらなるバイオマーカーのさらなる検出によって増強される。
【００７８】
好ましくは、本発明に従う方法、アレイ、試験システムおよび使用の感度および特異性は、エンドプラスミンフラグメントおよびその誘導体、ならびにα−デフェンシン１、２もしくは３またはその誘導体の検出の組み合わせによって増大される。
【００７９】
本発明において用いられる「α−デフェンシン１、２、３またはその誘導体」という用語はまた、短縮されたα−デフェンシン１、２もしくは３、α−デフェンシン１、２もしくは３のフラグメント、変異されたα−デフェンシン１、２もしくは３、または改変されたα−デフェンシン１、２もしくは３を含む。「α−デフェンシン１、２または３」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。α−デフェンシン１、２および３はまた、それぞれヒト好中球ペプチド（ＨＮＰ）１、２および３とも命名される。３つのペプチドは、３４４５±１０、３３７４±１０および３４８９±１０という質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。
【００８０】
ＨＮＰ１〜３のペプチドは、免疫系の基礎的な成分であり、広範な病原体を殺傷／不活性化する能力を有するデフェンシンファミリーのペプチドの一部である。デフェンシンはまた、先天性および適応性の免疫系の両方の調節因子として機能することが公知である。
【００８１】
これまでの研究は、腫瘍におけるＨＮＰ１〜３の発現は、好酸球および好中球を冒す腫瘍に主に由来することを示す。しかし、それはまた、癌細胞（例えば膀胱癌細胞）によって生成されてもよい。
（Ａｌｂｒｅｔｈｓｅｎ Ｊ，Ｂｏｇｅｂｏ Ｒ，Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ Ｓ，Ｏｌｓｅｎ Ｊ，Ｗｉｎｔｈｅｒ Ｂ，Ｒａｓｋｏｖ Ｈ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ １，２ ａｎｄ ３（ＨＮＰ １−３）ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｓ：ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００５，５：８．）。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別の感度および／または特異性は、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓ（一塩基多型）ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のさらなるバイオマーカーと組み合わせてエンドプラスミンフラグメントを検出することによって増強され得る。
【００８３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための他のバイオマーカーは、４，８３８±２５Ｄａ、好ましくは４，８３８±１０Ｄａの分子量を有するタンパク質またはポリペプチドを含んでもよい。好ましい実施形態では、エンドプラスミンフラグメント、および４，８３８±２５Ｄａ、好ましくは４，８３８±１０Ｄａの分子量を有するタンパク質またはポリペプチドは両方とも、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するために用いられる。
【００８４】
１つの実施形態では、Ｃ３ａまたは誘導体および／またはトランスサイレチンまたはその誘導体と組み合わせた、エンドプラスミンのフラグメントまたはその誘導体は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階を識別するためのバイオマーカーとして用いられる。
【００８５】
本発明において用いられる「トランスサイレチンまたはその誘導体」という用語はまた、短縮されたトランスサイレチン、トランスサイレチンのフラグメント、変異されたトランスサイレチン、または改変されたトランスサイレチンを含む。「トランスサイレチン」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。さらに、「トランスサイレチン」という用語はまた、トランスサイレチンの単量体型または多量体型を指すために用いられる。例えば、「トランスサイレチン」という用語は、特に、ホモ四量体タンパク質トランスサイレチンの通常一部である単量体タンパク質鎖を包含する。
【００８６】
トランスサイレチンはまた、プレアルブミンとも命名される。トランスサイレチンは、主に肝臓で合成される約５４，０００Ｄａの分子量を有する四量体タンパク質である。トランスサイレチンは通常、各々約１４，０００Ｄａの分子量を有する４つのタンパク質鎖を含むホモ四量体である。質量分析を用いて、本発明者らは、とりわけ、１３，７７６Ｄａ、１３，８８４Ｄａまたは１４，１０３Ｄａの分子量を有するトランスサイレチンのタンパク質鎖のいくつかの変異体を検出している。本発明者らは、特に、１３，７７６Ｄａおよび１３，８８４Ｄａの分子量を有するトランスサイレチンの分子変異体のレベルが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の発生の場合に、血清のような体液中で減少することを見出している。
【００８７】
本発明において用いられる「Ｃ３ａまたはその誘導体」という用語はまた、短縮されたＣ３ａ、Ｃ３ａのフラグメント、変異されたＣ３ａ、改変されたＣ３ａまたは前駆体Ｃ３（図２、配列番号５）またはＣ３のフラグメントを含む。１つの実施形態では、この誘導体は、配列番号６（図３Ａ、配列番号６）の配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するタンパク質配列を有するかまたは含む。
【００８８】
「Ｃ３ａ」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。とりわけ、Ｃ３ａまたはその誘導体という用語は特に、好ましくは８，９５０±２５Ｄａの範囲；より好ましくは８，９５０±２０Ｄａの範囲の分子量を有する短縮されたＣ３ａタンパク質を含む。好ましい実施形態では、この短縮されたＣ３ａタンパク質は、８，９３９Ｄａの分子量を有する。好ましくは、このＣ３ａタンパク質は、Ｃ末端アルギニンを有さず、そして場合によって、８，９５０±２０Ｄａの範囲の分子量を有する。１つの実施形態では、Ｃ３ａ誘導体は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ（図３Ｂ、配列番号７）である。１つの実施形態では、Ｃ３ａ誘導体は、マスト細胞キマーゼによるＣ３ａの切断によって得られる。別の実施形態では、Ｃ３ａは、Ｃ３転換酵素によるＣ３の切断によって得られる。本発明はまた、上述の実施形態の組み合わせを含む。
【００８９】
Ｃ３ａはアナフィラトキシンのグループに属する。Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａは、補体系のセリンプロテアーゼのタンパク質分解産物である。Ｃ３ａ（配列番号６）は、補体が活性化される間の血液補体系の第三成分（Ｃ３）（配列番号５）由来である。Ｃ３ａは、局所有効性を有するホルモンである。Ｃ３ａ中のアミノ酸残基の約４０％がらせん構造に含まれる。血清アナフィラトキシンは、種々の細胞性免疫応答に関与し、強力な炎症促進性因子である。Ｃ３ａは、血管壁、平滑筋の収縮および血管透過性の増大に対して強力に作用する。Ｃ３ａ中のＣ末端アルギニンは、その生物学的活性のために基本的に重要なものである。アナフィラトキシンは、カルボキシ末端のアルギニンの２番目内を除去するカルボキシペプチダーゼＮ（アナフィラトキシン不活性化因子）によって調節される。この機構は、完全なアナフィラトキシンを活性の少ないＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ型（配列番号７）に変換する。
【００９０】
これによって、感度および／または特異性の増大をともなう結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出、ならびに／あるいは種々の腫瘍状態の識別が可能になる。さらに、本発明の方法は、患者によって十分に受け入れられる。なぜなら、これらの方法は、結腸鏡検査ほど不快ではないためである。本発明によれば、個体から単離されたサンプル物質であって、組織標本または生物学的液体であってもよいサンプル物質、例えば、血漿または血清が、本発明の方法でスクリーニングされる。サンプル物質は、例えば、血液の採取または生検によって得ることができる。
【００９１】
感度および特異性は、以下のとおり規定される：
【００９２】
感度は、全ての患者の数（１００％）に対する真の陽性と検出された患者の数（％）である。この患者は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を有する個体であってよい。
【００９３】
特異性は、全ての健常な個体の数（１００％）に対する真の陰性と検出された個体の数（％）である。
【００９４】
感度および特異性は、以下の式によって代替的に規定され得る：
【００９５】
【数１】
【００９６】
ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、ＦＮから選択される各々の分析グループの結果は、健常な個体、結腸直腸腺腫患者および／または結腸直腸癌患者からなる群より選択される複数の単離されたサンプルについて算出される。ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、ＦＮは、それぞれ、真の陽性、偽陽性、真の陰性、偽の陰性の状態と相関する個体の数に関する。
【００９７】
本発明の方法は、総合的な感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための他の診断方法と組み合わせて行ってもよい。エンドプラスミンフラグメントの検出によって、結腸直腸腺腫の極めて早期の検出が可能になり、従って、極めて早期のバイオマーカーとして用いられ得る。さらに、エンドプラスミンフラグメントの検出によって、種々の腫瘍段階の識別が可能になる。
【００９８】
好ましくは、本発明の方法は、早期の検出および／またはモニタリングの方法として行われる。本発明の方法の結果が、体液のサンプル中の結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腺腫の発生を示す場合、結腸鏡検査のようなさらなる検査を行ってもよい。組織サンプルを用いた組織化学によって得られる結果が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腺腫の発生を示す場合、エンドプラスミンフラグメントのレベルが、種々の腫瘍段階を識別するために、必要に応じてさらなるバイオマーカーと組み合わせて分析されるべきである。
【００９９】
本発明はさらに、ある化合物が結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置において有効であるか否かを決定するための方法を提供する。さらに、本発明は、特定の腫瘍段階を処置するために有用である特異的な化合物を選択するための方法を提供する。
【０１００】
好ましくは、ある化合物が結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置において、ならびに／あるいは特定の腫瘍段階の処置のために有効であるか否かを決定するための方法は、以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【０１０１】
本出願において用いられる「患者」という用語は、ヒトおよび動物のような非ヒトを包含する。動物は好ましくは、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよび他の動物、例えば、モルモット、ウサギ、野ウサギ、イヌおよびブタからなる群より選択される。
【０１０２】
これらの動物は、研究目的のために、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌のような特定の疾患状態を特異的に誘導するために用いられ得る。この疾患状態の誘導は、例えば、結腸直腸癌または結腸直腸腺腫の疾患状態を誘導することが公知である放射性物質または化学物質を用いる、動物の処置によって例えば、達成され得る。この疾患状態はまた、ウイルスのトランスフェクションシステムを用いて誘導され得る。１つ以上の特定の遺伝子機能が変更されている遺伝子操作動物、またはノックアウト動物、例えば、特定の遺伝子機能が欠失されているノックアウトマウスを用いることも可能である。
【０１０３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置のための化合物は、１つ以上の化学物質、抗体、タンパク質、ペプチド、低分子薬物またはアンチセンスｍＲＮＡであってよい。あるいは、１つ以上の化合物の代わりに、放射線照射を単独で、または１つ以上の化合物と組み合わせて用いてもよい。
【０１０４】
この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、上記の検出技術によって決定され得る。
【０１０５】
以下の図および実施例は、例示目的でのみ示す。本発明は、以下の実施例に限定して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０６】
他に言及しない限り、全ての方法は、分析システムの製造業者のプロトコールに従って行った。
【０１０７】
実施例１：
サンプル調製
組織サンプル 腺腫および結腸直腸癌の患者（ＴＮＭステージＩＩＩ）由来の腫瘍組織、および各々の患者由来の適合した正常な結腸組織を分析した。患者：倫理的ガイドラインおよび患者の秘密は厳格に保証されており、かつ全ての患者は本研究に参加する書面の承諾を与えた。全ての患者に外科手術の時点で絶食時間および投薬のような共通の術前の準備を行った。
【０１０８】
組織抽出物の調製 新鮮な凍結腫瘍および正常な組織由来のクリオスタット切片（５μｍ）を、ヘマトキシリン／エオジンで染色して、腫瘍／間質の組織病理および量を管理した。腫瘍含量または腺腫含量が５０％を超える組織塊および正常な組織を切片（８×２０μｍ）に切断して、５００μｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、６．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に直ちに移した。この切片を４℃で１０分間１３，２００ｒｐｍで遠心分離した。そのペレットを１５０μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．２、０．１％のｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、氷上で１０分間抽出操作した。十分なボルテックスの後に、その溶解液を１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって測定して、各々のサンプルについて、溶解緩衝液を用いて５μｇ／５０μｌの濃度に調節した。
【０１０９】
実施例２
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイの調製。タンパク質溶解液を、強陰イオン交換体アレイ（ＳＡＸ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析した。ＳＡＸタンパク質アレイ（強陰イオン交換体）をバイオプロセッサー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）中で処理した。チップを２×５分間、結合緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化し、引き続き各々のスポット上で５０μｌのタンパク質溶解液とともにインキュベートした。４５分後、未結合物質を除去して、チップを緩衝液で３回、そして水で２回洗浄した。乾燥後、シナピン酸（１．０μｌ）の２回の適用を加えて、そのチップをＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ（ｍｏｄｅｌ ＰＢＳＩＩ）で分析した。データのバラツキを最小限にするために、測定は、チップ上にランダムに分布させた全ての患者群由来のサンプルを用いて２日内に行った。正規化のための標準コントロールとして、癌患者由来の１つの組織抽出物を全ての測定について平行して用いた。
【０１１０】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析。タンパク質の質量スペクトルは、１８０のレーザー強度で平均が１９５のレーザーショットを用いることによって生成させた。検出器は、６の感度で作動させた。データ取得のために、検出サイズ範囲は２，０００〜４０，０００Ｄａの間とした。レーザーは、１０，０００Ｄａにフォーカスした。データは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＢｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ピーク強度は、全イオン電流に対して正規化した。
【０１１１】
実施例３
データの統計的な評価
３つの患者群についてのカットオフ値を、決定木解析に基づくＣ＆ＲＴ（ＣＡＲＴ）アルゴリズムによって算出する（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｏｌｓｈｅｎ，Ｒ．Ａ．，＆ Ｓｔｏｎｅ，Ｃ．Ｊ．（１９８４）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ．Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ：Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ ＆ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｏｏｋｓ ＆ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。このカットオフ値は、種々の分析群の間の極限値を選択しかつ特定するために算出されている。評価は、ＳＴＡＴＳＯＦＴ ＩＮＣのＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｓ ７．１を用いて行い、決定木解析は、Ｄａｔａ−Ｍｉｎｅｒ Ｍｏｄｕｌ ｓｕｂｐｒｏｇｒａｍ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ（ＣＡｎｄＲＴ）（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．（２００５）．ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ（データ解析ソフトウェアシステム），ｖｅｒｓｉｏｎ ７．１．ｗｗｗ．ｓｔａｔｓｏｆｔ．ｃｏｍ．）を用いて行う。
【０１１２】
統計学的データは、平均値および標準偏差に基づいて評価する。さらに、図６、８および９は、平均±０．９５の信頼区間を示し、これは、この区間内において９５％の確率で観察患者群の真の平均値を見出すことを示している。統計学的な評価は、Ｔ検定によって行う（表１）。この検定では、ｐ値が０．０５未満で有意であるとみなした。ボックスプロットのウィスカーは、標準偏差を示す。
【０１１３】
実施例４
１例の腺腫および１例の結腸直腸癌の患者（ＴＮＭステージＩＩ）由来の腫瘍組織、ならびに正常な結腸組織のタンパク質サンプルを、調製して、実施例１および２に従って分析している。図５は、正常な結腸、線腫および腫瘍組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ１０．３の強度は、組織中で、健常な患者から癌の患者へ有意に増大する。
【０１１４】
図６は、正常な組織、線腫および結腸癌の組織におけるｐ１０．３（エンドプラスミンフラグメント）の平均強度を示す。３０の結腸癌および２９の腺腫組織サンプル、ならびに対応する正常な結腸組織を、実施例１〜３に従って分析した。正常および結腸腫瘍の組織における、ならびに正常および腺腫の組織におけるｐ１０．３の平均強度の相違は統計学的に有意であった。腫瘍サンプルの識別のために、９７％の特異性および９３％の感度を達成した。腺腫サンプルの特異性は８６％の感度で９０％であった。
【０１１５】
図８は、同じ患者集団において確認されたα−デフェンシンファミリーのメンバーのうちの１つ（ピーク３，４８９）の平均強度を示す。線腫および結腸癌の群における平均強度は、正常な結腸組織レベルに比較して有意に上昇していた。腺腫サンプルの識別は、５２％の感度および９０％の特異性で達成した。腫瘍サンプルの識別のためのそれぞれの値は、９０％および８９．６％であった。
【０１１６】
図９は、腺腫群のサンプルにおけるピーク４８３８の特異的に上昇したレベルを示す。腺腫サンプルは、７６％の感度および１００％の特異性で腫瘍および正常な患者のサンプルから識別され得る。
【０１１７】
表１は、患者群における検出されたピーク強度を、ピーク１０，３２４、４，８３８およびデフェンシンファミリーのメンバーのピーク３，３７５、３，４４５および３，４８９についてまとめたものである。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
表１の全てのデータはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得た。
【０１２０】
実施例５
種々の組織でのｐ１０．３の発現
結腸特異的なバイオマーカーとしてのｐ１０．３を確認するために、種々の腫瘍組織、すなわち、乳房、胃、食道、肺および前立腺について、実施例１および２に従って、細胞抽出物を調製して、質量分析によって分析した。図７および表２に示されるとおり、ｐ１０．３の最高強度は、結腸直腸癌で見出され得る（病期ＩおよびＩＩＩ）。しかし、エンドプラスミンフラグメントは、食道、肺および前立腺の癌ならびに正常な組織ではそれより低レベルで発現している。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
エンドプラスミンフラグメント、特に１０，３００Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質フラグメント（ｐ１０．３）は、結腸癌に極めて特異的であるということが図７からわかる。乳房、肺、胃、食道または前立腺の腫瘍とは対照的に、健常な患者と罹患している患者との間のｐ１０．３のレベルには有意な相違がある。さらに、ｐ１０．３のレベルは、癌の段階とともに増大する（病期Ｉ対病期ＩＩＩ）。
【０１２３】
実施例６
３０の結腸癌および２９の腺腫の組織サンプル、ならびに対応する正常な結腸組織を単離して、４，８３８Ｄａの分子量を有するタンパク質（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａの分子量を有するタンパク質（ｐ３．４）のいずれかである第二のマーカーを、エンドプラスミンフラグメントのピークと組み合わせて用いたこと以外は、実施例１〜３に記載のとおりの分析をした。第二のマーカータンパク質、例えば、４，８３８Ｄａ（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａ（ｐ３．４）と組み合わせて、腺腫および／または癌の組織からの正常な組織の分離を同時に達成した。ｐ１０．３を第一のマーカーとして、そしてｐ４．８を第二のマーカーとして用いて、２９の正常な組織サンプルのうち２６(特異性９０％)、２９の腺腫サンプルのうち２３（感度７９％）、ならびに３０の癌サンプルのうち２７（感度９０％）が、正確に分離された（図１０Ａ）。ピーク３４８９との組み合わせで、腺腫サンプルについて９０％の特異性および８２％の感度、そして腫瘍サンプルについて７０％が達成された（図１０Ｂ）。
【０１２４】
結果
図６に示されるとおり、エンドプラスミンフラグメントの量は、３つの群（Ｎ＝正常 Ａ＝腺腫 Ｔ＝癌）の間で有意に異なる。エンドプラスミンフラグメントのレベルは、健常個体から結腸直腸腺腫患者を超え結腸直腸癌患者へと増大する。
【０１２５】
エンドプラスミンフラグメントは、必要に応じて、４，８３８Ｄａ（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａ（ｐ３．４）の分子量を有するタンパク質のような他のバイオマーカーと組み合わせて、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための優れたバイオマーカーであるということがこれらのデータによって示される。
【０１２６】
既に公知のバイオマーカーであるＣＥＡおよびＣＡ１９−９とは対照的に、健常個体と腺腫患者との間を識別することが可能である。さらに、腺腫患者と結腸直腸癌患者とを識別することが可能である。エンドプラスミンフラグメント試験の感度および特異性は高く、そして腺腫の早期の特異的な検出、および種々の腫瘍段階の間の識別が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１Ａではエンドプラスミンのタンパク質配列（配列番号１）を示す。図１ＢではＮ末端エンドプラスミンフラグメントの各々の部分である３つのペプチド配列（配列番号２、３および４）を示す。
【図２】Ｃ３のタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図３】図３ＡではＣ３ａのタンパク質配列（配列番号６）を示す。図３ＢではＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図４】約８０ｋＤａおよび約１４ｋＤａのフラグメントを生じる、カルパインによるエンドプラスミンの推定切断部位を示す。
【図５】正常な結腸、腺腫および腫瘍組織からの溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ１０．３（エンドプラスミンのＮ末端部分、１０，３００Ｄａ）の強度は、組織中で、健常患者から腺腫患者へ、癌患者へと有意に増大する。
【図６】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるエンドプラスミンフラグメントｐ１０．３の解析を示す。結腸癌由来の３０サンプルおよび腺腫組織由来の２９サンプル、ならびに対応する正常な健常な結腸組織を分析した。エンドプラスミンフラグメントｐ１０．３の平均濃度は、健常群（Ｎ）に比較して、腺腫群（Ａ）および／または癌群（Ｔ）において有意に高い。
【図７】ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによる種々の癌のタイプでのｐ１０．３の検出を示す。ｐ１０．３の発現レベルは、種々の結腸癌の段階に比較して、胃、食道、肺、前立腺および乳房の癌の分析されたサンプルで有意に低かった。溶解液を、ＳＡＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ（登録商標）Ａｒｒａｙで分析した。正常組織と腫瘍組織との間のｐ１０．３の発現レベルの相違は、統計学的に有意である。Ｎ＝正常組織、Ｔ＝癌組織。
【図８】正常な結腸、腺腫および癌組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ３４８９（α−デフェンシンファミリーのメンバー、ｐ３．４）のピーク強度は、組織中で、結腸直腸腺腫患者から癌患者へと有意に増大する。Ｎ＝正常組織、Ａ＝腺腫組織、Ｔ＝癌組織。
【図９】正常な結腸、腺腫および癌組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ４８３８（ｐ４．８）のピーク強度は、健常な対照組織および結腸直腸癌組織に比較して、結腸直腸腺腫患者の組織で有意に増大する。Ｎ＝正常組織、Ａ＝腺腫組織、Ｔ＝癌組織。
【図１０】腺腫組織および癌組織のための、感度および特異性の両方について、異種の患者集団で改善された２つのマーカー（ｐ１０．３およびｐ４．８またはｐ１０．３およびｐ３．４）の組み合わせを示す。Ａ）検出がｐ１０．３およびｐ４．８の組み合わせに基づいた場合、癌組織について９０％の感度（腺腫について７９％）そして、９０％の特異性が達成された。Ｂ）ｐ１０．３およびαデフェンシンファミリーのメンバーであるｐ３．４の組み合わせを用いた場合、一致した数は、９０％の特異性で癌サンプルについて７０％（腺腫について８２％）であった。Ｎ＝正常結腸粘膜、Ｔ＝癌組織、Ａ＝腺腫組織。文字の前の数字は、別々の個体の数を示す。他の数字は、カットオフ値を指す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、世界中で三番目に高い頻度で診断される癌（９．４％）である。２００３年には、世界中でほぼ９４５０００の結腸直腸癌の新規な症例が診断され、そしてほぼ４９２０００人がこの疾患で死亡した。結腸直腸癌の罹患率は増大しているが、結腸直腸癌の死亡率は減少している。結腸直腸癌の罹患率は年齢とともに増え、ほぼ４０歳で始まり、女性よりも男性で高い（男性での４０．６に対して女性での３０．６、１年あたり１０００００例）（Ｗｏｒｌｄ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｐｏｒｔ，２００３，Ｅｄ．ＢＷ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｐ．Ｋｌｅｉｈｕｅｓ．ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｙｏｎ）。
【０００３】
ほとんどの患者では、結腸直腸癌の進展は、前癌性の腺腫から転移の性向を有する浸潤性の悪性腫瘍への多段階の進行に従う。
【０００４】
結腸鏡検査のような従来の不快な結腸直腸スクリーニング試験しか、早期段階の結腸直腸癌およびその前駆体の検出を達成できないことが示されている。しかし、１０ｍｍの直径より小さい平坦な腫瘍性病変およびポリープ状病変については高い偽陰性率が観察されている（Ｋｕｄｏ Ｓ．（１９９７） Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．７：８７〜９８）。従って、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の早期の検出ならびに種々の腫瘍段階の間での特異的な識別を可能にする試験システムを有することが所望されている。これによってまた、治療の特異的適応が可能になる。
【０００５】
血液サンプル中の腫瘍マーカー検出に基づく現在公知のスクリーニング試験は、必要な感度および特異性を欠く。例えば、血液サンプル中のＣＥＡ（癌胎児抗原）レベルが、結腸癌を検出するために用いられている。しかし、ＣＥＡレベルは結腸癌で特異的に上昇しているのではなく、他の悪性疾患（例えば、胃、膵臓、乳房および肺の癌）を有する患者および種々の非悪性の状態（例えば、アルコール性肝臓病、炎症性腸疾患、重度タバコ喫煙、慢性気管支炎および膵炎）にある患者でも上昇していることが示されている。（Ｐｏｓｎｅｒ ＭＲ，Ｍａｙｅｒ ＲＪ：Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ８：５３３，１９９４）。さらに、ＣＥＡレベルは、結腸腺腫では上昇していない。加えて、ＣＥＡレベルは、結腸直腸癌からの結腸直腸腺腫の識別や種々の腫瘍段階の識別には適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、結腸腺腫および／または結腸癌の早期検出を可能にする手段、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別を可能にする手段を提供することである。
【０００７】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出において用いられ得る、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別に用いられ得るバイオマーカーを提供することがさらなる目的である。
【０００８】
本発明の別の目的は、費用効果的であって、かつ広範に用いられ得る、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムを提供することである。
【０００９】
さらに、この試験システムは、取り扱いが容易でなければならない。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、腫瘍の特定の段階に依存して腺腫および／または癌の処置のために特異的である化合物の有効性を検出するためのスクリーニングシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の根底にある目的は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の、個体における結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のためのバイオマーカーとしての使用によって解決される。検出は、インビボでそしてインビトロで行われてもよい。好ましい実施形態に従って、検出はインビトロで行われる。
【００１２】
この目的はさらに、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための方法によって解決され、この方法は、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１３】
この目的はさらに、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌を識別するための、ならびに／あるいはさらなる腫瘍状態を識別するための方法によって解決され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１４】
この目的はまた、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の進展および／または経過および／または処置をモニタリングするための方法によって解決され、この方法は、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００１５】
好ましい実施形態では、外科的または治療的な手段の有効性は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌が完全に除去されたか否かについて決定するために制御される。別の実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の患者の、１つ以上の化学物質、抗体、タンパク質、ペプチド、低分子薬物、アンチセンスＲＮＡ、放射線、例えば、Ｘ線またはそれらの組み合わせでの処置による治療は、その処置の有効性を制御するために管理される。
【００１６】
本発明の根底にある目的は、個体のサンプル中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムを提供することによって解決され、この試験システムは以下の：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合する抗体またはレセプターと、
ｂ）この抗体またはレセプターを支持する固体支持体と、
ｃ）この抗体またはレセプターに対するエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープの結合を検出するための試薬と、
を含む。
【００１７】
本発明の目的はさらに、個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための検出分子を含むアレイを提供することによって解決され、このアレイは、検出分子として：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された核酸プローブ、または
ｂ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された抗体、または
ｃ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定されたレセプターを含み、
検出分子の好ましい種々の量が、定量の正確性を増大するために固体支持体に固定される。
【００１８】
核酸プローブは、例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、アプタマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。アプタマーとは、特異的な配列依存性の形状を帯び、高い特異性および親和性でタンパク質標的に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて確認される（Ｔｕｅｒｋ Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８〜８２２）。
【００１９】
この目的はさらに、ある化合物が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置に有効であるか否かを決定するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための方法によって解決され、この方法は以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【００２０】
好ましい実施形態は、従属項で特定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明によれば、「サンプル物質」という用語はまた「サンプル」とも表わされる。
【００２２】
本発明によれば、「バイオマーカー」という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の罹患の指標であるタンパク質またはタンパク質フラグメントまたは核酸を指すことを意味する。それは、「バイオマーカー」が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出する手段として用いられることを意味する。
【００２３】
「個体」またはその複数という用語は、哺乳動物を指すことを意味する。好ましくは、この哺乳動物は、患者のようなヒトである。
【００２４】
「健常な個体」またはその複数という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹っていない個体（単数または複数）を指すことを意味する。すなわち、「健常な個体（単数または複数）」という用語は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の病理的状態に関してのみ用いられ、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌以外の疾患に罹患している個体を除外しない。
【００２５】
本発明による「種々の腫瘍段階の識別」という用語は、結腸直腸腺腫対結腸直腸癌の識別、および／または種々の腫瘍段階、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの識別を意味する。
【００２６】
「その誘導体」という用語は、例えば、短縮された遺伝子、この遺伝子のフラグメント、変異された遺伝子、または改変された遺伝子もしくはそのそれぞれの遺伝子産物を含む、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでの任意の改変を記述するものとする。「その誘導体」という用語は、核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質配列またはペプチド配列を含む。その誘導体は、遺伝子の欠失、置換または挿入の結果である改変であってもよい。この遺伝子改変は、自然界で起こる遺伝子の可変性の結果であってもよい。「自然界で起こる遺伝子の可変性」という用語は、遺伝子操作の結果ではない改変を意味する。この誘導体は、身体および／または分解産物内の遺伝子または遺伝子産物の処理の結果であってもよい。タンパク質レベルでの改変は、身体内の酵素的または化学的な改変に起因し得る。例えば、この改変は、グリコシル化またはリン酸化またはファルネシル化であってもよい。
【００２７】
本発明において用いられる「エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体」という用語は、変異されたエンドプラスミンフラグメントまたは改変されたエンドプラスミンフラグメントまたは改変されたエンドプラスミンのフラグメントも含む。「エンドプラスミンフラグメント」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因し得る。
【００２８】
「腫瘍」および「癌」という用語は、交換可能に用いられ、同じ意味を有する。
【００２９】
１つの実施形態では、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体は、エンドプラスミンのＮ末端フラグメントまたはＣ末端フラグメントを含むタンパク質である。Ｎ末端フラグメントまたはＣ末端フラグメントという用語は、これらの配列がそれぞれエンドプラスミンの完全なＮ末端フラグメントまたはＣ末端を含むというのではなく、そのフラグメントが、エンドプラスミンのＮ末端またはＣ末端の領域から生成されるというように解釈されるべきである。
【００３０】
フラグメントはまた、エンドプラスミンのタンパク質配列の中央部分から生成されてもよい。
【００３１】
エンドプラスミン（配列番号１）のフラグメントの配列長さは、エンドプラスミンに特異的であるために十分長くなければならない。少なくとも７つ連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも８つ連続する、エンドプラスミンの配列（配列番号１）のアミノ酸を含む、エンドプラスミンのフラグメントは、エンドプラスミンに極めて特異的である。本発明の好ましい実施形態に従えば、フラグメントは、エンドプラスミン（配列番号１）の少なくとも９つ連続するアミノ酸を含む。
【００３２】
ｇｒｐ９４とも命名される完全長のエンドプラスミン（配列番号１）の特異的な切断によって、約１０〜１４ｋＤａおよび８０ｋＤａの２つのフラグメントがもたらされる。このエンドプラスミンの切断は、カルパインによって誘導されると推測される（図４）。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、約８０ｋＤａの分子量を有するＣ末端フラグメントまたは約１０〜１４ｋＤａの分子量を有するＮ末端フラグメントを含む。本発明の別の実施形態によれば、約１０〜１４ｋＤａまたは約８０ｋＤａの分子量を有するフラグメントは、カルパインによる切断によって誘導される。
【００３４】
本発明のある実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号１の配列の一部を含む。本発明の好ましい実施形態では、このエンドプラスミンフラグメントは、Ｎ末端フラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、配列番号２のペプチド配列および／または配列番号３のペプチド配列を含む。本発明の別の実施形態によれば、このフラグメントは、配列番号４のペプチド配列を含む。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、１０〜１４ｋＤａ、より好ましくは１０．３ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態では、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４（図１）と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるかまたはそれを含み、そして結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を特異的に検出し得るペプチドまたはタンパク質である。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントは、配列番号１と、フラグメントの配列に基づいて、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３８】
グルコース関連タンパク質（ｇｒｐｓ）は、ストレス誘導の後に合成される高度に保存されたタンパク質の群である。ｇｒｐｓは、それらのそれぞれの標的タンパク質を輸送、折りたたみおよび処理することを助ける分子シャペロンとして作用する。免疫組織化学的染色によって、ｇｒｐ９４は主に細胞質中で検出される。ｇｒｐ９４はまた、エンドプラスミンとも呼ばれる。ｇｒｐ９４（エンドプラスミン）は、小胞体内において２つの異なる形態で存在することを示唆する管腔タンパク質および内在性タンパク質の二つの特性を示す。
【００３９】
「エピトープ」という用語は、抗体、抗体フラグメント、タンパク質またはペプチド構造またはレセプターの特異的な結合を可能にするタンパク質またはペプチドまたは任意のタンパク質の性質を持つ構造の任意の構造要素を指すことを意味する。
【００４０】
本発明の方法は、ヒトの身体から既に単離されている体液または組織サンプルのようなサンプル物質を用いて行われる。好ましくはこのサンプル物質は組織サンプルである。サンプル物質は、後で分画されても、および／または精製されてもよい。例えば、試験されるべきサンプル物質をフリーザー中に貯蔵して、そして本発明の方法を、それぞれのサンプル物質を解凍した後に適切な時点で行うことが可能である。
【００４１】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、バイオマーカーとして、好ましくは早期のバイオマーカーとして用いられ得るということが本発明者らによって驚くべきことに発見されている。
【００４２】
本発明者らは、組織サンプルまたは体液のようなサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のタンパク質レベルは、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌をともなう個体で上昇するということを驚くべきことにいまや見出した。さらに、本発明者らは、組織サンプルまたは体液中の、エンドプラスミンフラグメントのタンパク質レベルまたはその誘導体は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌をともなう人から健常な人を識別するために、ならびに結腸直腸癌から結腸直腸腺腫を識別するために用いられ得るということを驚くべきことに見出した。さらに、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、種々の腫瘍段階、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶの間を識別するために用いられ得る。エンドプラスミンフラグメントは、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階を識別するために用いられ得る特異的なバイオマーカーである。この種々の腫瘍段階は、例えば、ＴＮＭ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶであってよい。エンドプラスミンフラグメントは、組織病理学によって得られる診断を確認するために用いられ得る選択的かつ特異的なマーカーである。
【００４３】
しかし、本発明者らはまた、組織または生物学的な液体、例えば、血清または血漿のようなサンプル物質中の完全なエンドプラスミンのレベルの上昇が、結腸直腸腺腫に特異的であるということを見出している。従って、完全なエンドプラスミンのレベルの上昇は、結腸直腸腺腫の指標でもある。その観点から、上記または下記の全ての説明は、それぞれ完全なエンドプラスミンにあてはまる。
【００４４】
しかし、本発明者らはまた驚くべきことに、組織または体液のようなサンプル物質中のエンドプラスミンのフラグメントのレベルの上昇が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のかなりより特異的かつ敏感なバイオマーカーであるということを見出している。
【００４５】
本発明によれば、サンプル物質は、組織、細胞または体液であってよい。サンプル物質は、体液、例えば、血液、血漿、血清、骨髄、糞便、滑液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、母乳、精液、浸出液およびその混合物であってもよい。本発明のある実施形態では、体液は、クロマトグラフィーによって分画される。
【００４６】
好ましくは、体液は、本発明の方法を行う前に単離されている。本発明の方法は好ましくは、実験室の技術者によってインビトロで行われる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、血漿、血清または尿で測定される。血清は、医学的に検査される個体から血液を採取することによって、および凝固した血液から上清を分離することによって容易に得ることができる。
【００４８】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、結腸直腸腺腫の形成の進行にともなってより高くなる。結腸直腸腺腫は、良性の新生物であって、悪性になり得る。良性の結腸直腸腺腫から結腸直腸癌に進展する場合、体液、好ましくは血清中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルはさらに増大する。
【００４９】
結腸直腸癌への結腸直腸腺腫の形質転換の後、罹患した個体の病理学的な状態は、転移の形成によってさらに増悪され得る。エンドプラスミンフラグメントのレベルがより高いことは、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌および／または転移の発生と相関する。
【００５０】
本発明は、早期に、および／またはまだなお良性段階で、および／または早期の腫瘍段階で、新生物性の疾患を検出できる早期段階のバイオマーカーを提供する。早期の検出によって、医師は、結腸直腸腺腫を時機を得て除去し、その個体が生存する機会を劇的に増大させることが可能になる。
【００５１】
さらに、本発明は、長期間にわたって、例えば数年にわたって血清のような体液中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルをモニターすることを可能にする。
【００５２】
長期間のモニタリングによって、結腸直腸腺腫と結腸直腸癌との間の識別が可能になる。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、規則的に、体液中で、例えば、１年に１回または２回チエックされ得る。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの増大が検出される場合、これは、結腸直腸腺腫の指標であり得る。次いで、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルのさらなる増大は、悪性の結腸直腸癌への形質転換の指標であり得る。
【００５３】
さらに、疾患および／または処置の経過がモニターされてもよい。例えば、結腸直腸腺腫の除去後、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルがさらに増大する場合、これは、病理学的な状態の増悪の指標であり得る。
【００５４】
そのことは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出および／またはモニタリングのための有用な臨床的パラメーターであるということを意味する。体液中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、結腸直腸腺腫の発生後に増大する。従って、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、早期の診断、およびその後の疾患の早期の処置を可能にする重要な臨床的パラメーターである。さらに、エンドプラスミンフラグメントのレベルは、外科手術および／または他の治療の有効性をチエックするために用いられ得る。
【００５５】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の間を識別するための本発明の方法は、個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、次いで、この単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、最終的に、このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程とを包含する。１つの実施形態では、１つ以上のさらなるバイオマーカーをさらに、個体から採取されている単離されたサンプル中において検出し、そのバイオマーカーのレベルを決定して、１つ以上の参照値と比較する。
【００５６】
参照値は、健常な個体、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹患している個体の複数の単離されたサンプルで決定されたエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の平均レベルとして算出され得る。この参照値は、正常とみなされる範囲をカバーする健常な人から、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌に罹患している患者から上昇しているとみなされる範囲から確立され得る。通常、参照値は、ある範囲として与えられる。従って、本発明において用いられる参照値および参照値の範囲という用語は、同じ意味を有すると規定される。
【００５７】
次いで、ある参照値の範囲内の特定の値は、健常な状態、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の病理的な状態の指標であってもよい。この参照値の範囲は、任意の他の医学的パラメーター範囲、例えば、血糖などで行われるように、健常な個体の、ならびに結腸腺腫および／または結腸癌に罹患している個体の、血清サンプルのような、組織サンプルまたは体液サンプルの統計学的に関連する数を取り上げることによって確立され得る。健常な状態の参照値はまた、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腫瘍の患者の健常な組織から得てもよい。
【００５８】
好ましくは、陰性コントロールおよび陽性コントロール１と命名される２つの参照値が算出される。陰性コントロールの参照値は、健常な個体、あるいは結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腫瘍の患者の健常な組織から算出され、そして陽性コントロールは、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌に罹患している個体から算出される。より好ましくは、陰性コントロールおよび陽性コントロール１および陽性コントロール２と命名される３つの参照値が算出される。陽性コントロール１は、結腸直腸癌に罹患している個体から算出されてもよく、そして陽性コントロール２は、結腸直腸腺腫から算出されてもよい。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、参照値は、ある期間にわたって個体から採取された複数の単離されたサンプルで決定されたエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の平均レベルとして算出された個々の参照値であってもよい。
【００６０】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを長期間、例えば、数ヶ月または数年にわたってモニタリングする場合、個々の平均レベルを確立することが可能である。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、例えば、血糖を測定する場合の同じ血清サンプルから測定されてもよく、そしてエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの任意の個々の増大を特異的に検出することを可能にする個々の検量線を確立するために用いてもよい。
【００６１】
さらなるバイオマーカーについての参照値はまた、エンドプラスミンについて記載されたのと同じ方法で算出され得る。エンドプラスミンフラグメントまたはさらなるバイオマーカーの平均レベルは、平均または中央のレベルであってよい。
【００６２】
別の見地では、本発明はさらに、個体の単離されたサンプル物質中の結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための試験システムを提供する。この試験システムは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープまたは適切な構造的要素に特異的に結合する抗体またはレセプターの特異性のいずれかに基づく。レセプターは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合し得る任意の構造であってよい。レセプターは、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメント、あるいはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合し得る任意の他のタンパク質またはペプチド構造であってよい。レセプターはまた、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に特異的に結合するアプタマーであってもよい。
【００６３】
抗体、抗体フラグメントまたはレセプターは、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体と結合して、そしてその検出を可能にするために、例えば、プラスチック表面またはビーズのような固体支持体に結合される。例えば、従来からのマイクロタイタープレートは、プラスチック表面として用いられ得る。エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の結合の検出は、例えば、検出可能な基で標識された二次抗体を用いることによって、達成され得る。検出可能な基は、例えば、放射性同位元素または、例えば、色または蛍光のシグナルを生じる適切な基質を加えることによって検出できる、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素であってもよい。
【００６４】
この試験システムは、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）であってよい。しかし、抗体または抗体のフラグメントの特異性を用いる任意の他の免疫学的試験システム、例えば、ウエスタンブロッティングまたは免疫沈降が用いられてもよい。
【００６５】
本発明はまた、個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための検出分子を含むアレイを提供し、ここでこの検出分子は、エンドプラスミンフラグメント、その変異体、改変体もしくはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定された核酸プローブ、またはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定された抗体、またはエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体上に固定されたレセプターであってよい。好ましくは、アレイはさらに、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌を検出するためのバイオマーカーに対するさらなる検出分子を含む。好ましくは、核酸プローブは、配列番号２および／または配列番号３、あるいは配列番号４に相当する核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００６６】
あるいは、本発明はまた、上記で規定された検出分子によって検出され得る固体支持体上に固定された患者サンプルを含む逆のアレイを含む。
【００６７】
好ましくは、アレイは、同定可能な位置で固体表面に固定された検出分子を含む。
【００６８】
本発明において用いられる「アレイ」という用語は、分類または配置をいい、規則的な配列の必要はない。アレイは、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは５つ、最も好ましくは１０の異なる検出分子のセットを含む。好ましくは、本発明のアレイは、少なくとも５０セットの検出分子、さらに好ましくは少なくとも１００セットの検出分子を含む。本発明の別の実施形態によれば、本発明のアレイは、少なくとも５００セットの検出分子を含む。検出分子は、例えば、既に上記されているような核酸プローブ、または抗体、またはレセプターであってよい。
【００６９】
核酸プローブは、任意の天然に存在するかまたは合成のオリゴヌクレオチド、アプアマー、ならびにｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどであってよい。
【００７０】
記載されたアレイは、本発明による試験システムで用いられ得る。本発明において用いられる「アレイ」という用語は、マクロアレイおよびマイクロアレイの両方に関する。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、質量分析によって決定される。
【００７２】
質量分析によって、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を、その分子量を介して特異的に検出すること、そしてエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の量を極めて容易に定量することが可能になる。
【００７３】
当該分野で公知の質量分析の分野における任意の適切なイオン化方法は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体分子、フラグメント、変異体、改変体またはその誘導体をイオン化するために使用され得る。このイオン化方法は、電子衝撃（ＥＩ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電界イオン化（ＦＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）および表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を含む。
【００７４】
当該分野で公知の質量分析の分野における任意の適切な検出方法は、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の分子量を決定するために使用され得る。この検出方法は、四重極質量分析（ＱＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴ−ＭＳ）および飛行時間質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）を含む。
【００７５】
好ましくは、この質量分析は、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）である。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行う前に、単離されたサンプル中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を、活性な表面を有するチップまたは固体支持体上に固定するのが好ましい。活性な表面は、好ましくは、例えば、ウサギポリクローナル抗体のような、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体に対して固定された抗体を含む。抗体にエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体を結合させた後、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置での飛行時間分析を行い、これが、エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの決定のための強度シグナルを送出する。
【００７６】
さらに、質量分析によって、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出に関して関連性を有し得る他のタンパク質を同時に検出することが可能になる。
【００７７】
本発明のある実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の感度および／または特異性は、１つ以上のさらなるバイオマーカーのさらなる検出によって増強される。
【００７８】
好ましくは、本発明に従う方法、アレイ、試験システムおよび使用の感度および特異性は、エンドプラスミンフラグメントおよびその誘導体、ならびにα−デフェンシン１、２もしくは３またはその誘導体の検出の組み合わせによって増大される。
【００７９】
本発明において用いられる「α−デフェンシン１、２、３またはその誘導体」という用語はまた、短縮されたα−デフェンシン１、２もしくは３、α−デフェンシン１、２もしくは３のフラグメント、変異されたα−デフェンシン１、２もしくは３、または改変されたα−デフェンシン１、２もしくは３を含む。「α−デフェンシン１、２または３」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。α−デフェンシン１、２および３はまた、それぞれヒト好中球ペプチド（ＨＮＰ）１、２および３とも命名される。３つのペプチドは、３４４５±１０、３３７４±１０および３４８９±１０という質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。
【００８０】
ＨＮＰ１〜３のペプチドは、免疫系の基礎的な成分であり、広範な病原体を殺傷／不活性化する能力を有するデフェンシンファミリーのペプチドの一部である。デフェンシンはまた、先天性および適応性の免疫系の両方の調節因子として機能することが公知である。
【００８１】
これまでの研究は、腫瘍におけるＨＮＰ１〜３の発現は、好酸球および好中球を冒す腫瘍に主に由来することを示す。しかし、それはまた、癌細胞（例えば膀胱癌細胞）によって生成されてもよい。
（Ａｌｂｒｅｔｈｓｅｎ Ｊ，Ｂｏｇｅｂｏ Ｒ，Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ Ｓ，Ｏｌｓｅｎ Ｊ，Ｗｉｎｔｈｅｒ Ｂ，Ｒａｓｋｏｖ Ｈ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ １，２ ａｎｄ ３（ＨＮＰ １−３）ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｓ：ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００５，５：８．）。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態では、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出の、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別の感度および／または特異性は、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓ（一塩基多型）ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のさらなるバイオマーカーと組み合わせてエンドプラスミンフラグメントを検出することによって増強され得る。
【００８３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための他のバイオマーカーは、４，８３８±２５Ｄａ、好ましくは４，８３８±１０Ｄａの分子量を有するタンパク質またはポリペプチドを含んでもよい。好ましい実施形態では、エンドプラスミンフラグメント、および４，８３８±２５Ｄａ、好ましくは４，８３８±１０Ｄａの分子量を有するタンパク質またはポリペプチドは両方とも、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するために用いられる。
【００８４】
１つの実施形態では、Ｃ３ａまたは誘導体および／またはトランスサイレチンまたはその誘導体と組み合わせた、エンドプラスミンのフラグメントまたはその誘導体は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階を識別するためのバイオマーカーとして用いられる。
【００８５】
本発明において用いられる「トランスサイレチンまたはその誘導体」という用語はまた、短縮されたトランスサイレチン、トランスサイレチンのフラグメント、変異されたトランスサイレチン、または改変されたトランスサイレチンを含む。「トランスサイレチン」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。さらに、「トランスサイレチン」という用語はまた、トランスサイレチンの単量体型または多量体型を指すために用いられる。例えば、「トランスサイレチン」という用語は、特に、ホモ四量体タンパク質トランスサイレチンの通常一部である単量体タンパク質鎖を包含する。
【００８６】
トランスサイレチンはまた、プレアルブミンとも命名される。トランスサイレチンは、主に肝臓で合成される約５４，０００Ｄａの分子量を有する四量体タンパク質である。トランスサイレチンは通常、各々約１４，０００Ｄａの分子量を有する４つのタンパク質鎖を含むホモ四量体である。質量分析を用いて、本発明者らは、とりわけ、１３，７７６Ｄａ、１３，８８４Ｄａまたは１４，１０３Ｄａの分子量を有するトランスサイレチンのタンパク質鎖のいくつかの変異体を検出している。本発明者らは、特に、１３，７７６Ｄａおよび１３，８８４Ｄａの分子量を有するトランスサイレチンの分子変異体のレベルが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の発生の場合に、血清のような体液中で減少することを見出している。
【００８７】
本発明において用いられる「Ｃ３ａまたはその誘導体」という用語はまた、短縮されたＣ３ａ、Ｃ３ａのフラグメント、変異されたＣ３ａ、改変されたＣ３ａまたは前駆体Ｃ３（図２、配列番号５）またはＣ３のフラグメントを含む。１つの実施形態では、この誘導体は、配列番号６（図３Ａ、配列番号６）の配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するタンパク質配列を有するかまたは含む。
【００８８】
「Ｃ３ａ」の改変は、酵素的または化学的な改変に起因してよい。とりわけ、Ｃ３ａまたはその誘導体という用語は特に、好ましくは８，９５０±２５Ｄａの範囲；より好ましくは８，９５０±２０Ｄａの範囲の分子量を有する短縮されたＣ３ａタンパク質を含む。好ましい実施形態では、この短縮されたＣ３ａタンパク質は、８，９３９Ｄａの分子量を有する。好ましくは、このＣ３ａタンパク質は、Ｃ末端アルギニンを有さず、そして場合によって、８，９５０±２０Ｄａの範囲の分子量を有する。１つの実施形態では、Ｃ３ａ誘導体は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ（図３Ｂ、配列番号７）である。１つの実施形態では、Ｃ３ａ誘導体は、マスト細胞キマーゼによるＣ３ａの切断によって得られる。別の実施形態では、Ｃ３ａは、Ｃ３転換酵素によるＣ３の切断によって得られる。本発明はまた、上述の実施形態の組み合わせを含む。
【００８９】
Ｃ３ａはアナフィラトキシンのグループに属する。Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａは、補体系のセリンプロテアーゼのタンパク質分解産物である。Ｃ３ａ（配列番号６）は、補体が活性化される間の血液補体系の第三成分（Ｃ３）（配列番号５）由来である。Ｃ３ａは、局所有効性を有するホルモンである。Ｃ３ａ中のアミノ酸残基の約４０％がらせん構造に含まれる。血清アナフィラトキシンは、種々の細胞性免疫応答に関与し、強力な炎症促進性因子である。Ｃ３ａは、血管壁、平滑筋の収縮および血管透過性の増大に対して強力に作用する。Ｃ３ａ中のＣ末端アルギニンは、その生物学的活性のために基本的に重要なものである。アナフィラトキシンは、カルボキシ末端のアルギニンの２番目内を除去するカルボキシペプチダーゼＮ（アナフィラトキシン不活性化因子）によって調節される。この機構は、完全なアナフィラトキシンを活性の少ないＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ型（配列番号７）に変換する。
【００９０】
これによって、感度および／または特異性の増大をともなう結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出、ならびに／あるいは種々の腫瘍状態の識別が可能になる。さらに、本発明の方法は、患者によって十分に受け入れられる。なぜなら、これらの方法は、結腸鏡検査ほど不快ではないためである。本発明によれば、個体から単離されたサンプル物質であって、組織標本または生物学的液体であってもよいサンプル物質、例えば、血漿または血清が、本発明の方法でスクリーニングされる。サンプル物質は、例えば、血液の採取または生検によって得ることができる。
【００９１】
感度および特異性は、以下のとおり規定される：
【００９２】
感度は、全ての患者の数（１００％）に対する真の陽性と検出された患者の数（％）である。この患者は、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を有する個体であってよい。
【００９３】
特異性は、全ての健常な個体の数（１００％）に対する真の陰性と検出された個体の数（％）である。
【００９４】
感度および特異性は、以下の式によって代替的に規定され得る：
【００９５】
【数１】
【００９６】
ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、ＦＮから選択される各々の分析グループの結果は、健常な個体、結腸直腸腺腫患者および／または結腸直腸癌患者からなる群より選択される複数の単離されたサンプルについて算出される。ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、ＦＮは、それぞれ、真の陽性、偽陽性、真の陰性、偽の陰性の状態と相関する個体の数に関する。
【００９７】
本発明の方法は、総合的な感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための他の診断方法と組み合わせて行ってもよい。エンドプラスミンフラグメントの検出によって、結腸直腸腺腫の極めて早期の検出が可能になり、従って、極めて早期のバイオマーカーとして用いられ得る。さらに、エンドプラスミンフラグメントの検出によって、種々の腫瘍段階の識別が可能になる。
【００９８】
好ましくは、本発明の方法は、早期の検出および／またはモニタリングの方法として行われる。本発明の方法の結果が、体液のサンプル中の結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腺腫の発生を示す場合、結腸鏡検査のようなさらなる検査を行ってもよい。組織サンプルを用いた組織化学によって得られる結果が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸腺腫の発生を示す場合、エンドプラスミンフラグメントのレベルが、種々の腫瘍段階を識別するために、必要に応じてさらなるバイオマーカーと組み合わせて分析されるべきである。
【００９９】
本発明はさらに、ある化合物が結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置において有効であるか否かを決定するための方法を提供する。さらに、本発明は、特定の腫瘍段階を処置するために有用である特異的な化合物を選択するための方法を提供する。
【０１００】
好ましくは、ある化合物が結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置において、ならびに／あるいは特定の腫瘍段階の処置のために有効であるか否かを決定するための方法は、以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）このエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する。
【０１０１】
本出願において用いられる「患者」という用語は、ヒトおよび動物のような非ヒトを包含する。動物は好ましくは、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよび他の動物、例えば、モルモット、ウサギ、野ウサギ、イヌおよびブタからなる群より選択される。
【０１０２】
これらの動物は、研究目的のために、結腸直腸腺腫および結腸直腸癌のような特定の疾患状態を特異的に誘導するために用いられ得る。この疾患状態の誘導は、例えば、結腸直腸癌または結腸直腸腺腫の疾患状態を誘導することが公知である放射性物質または化学物質を用いる、動物の処置によって例えば、達成され得る。この疾患状態はまた、ウイルスのトランスフェクションシステムを用いて誘導され得る。１つ以上の特定の遺伝子機能が変更されている遺伝子操作動物、またはノックアウト動物、例えば、特定の遺伝子機能が欠失されているノックアウトマウスを用いることも可能である。
【０１０３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の処置のための化合物は、１つ以上の化学物質、抗体、タンパク質、ペプチド、低分子薬物またはアンチセンスｍＲＮＡであってよい。あるいは、１つ以上の化合物の代わりに、放射線照射を単独で、または１つ以上の化合物と組み合わせて用いてもよい。
【０１０４】
この患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルは、上記の検出技術によって決定され得る。
【０１０５】
以下の図および実施例は、例示目的でのみ示す。本発明は、以下の実施例に限定して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０６】
他に言及しない限り、全ての方法は、分析システムの製造業者のプロトコールに従って行った。
【０１０７】
実施例１：
サンプル調製
組織サンプル 腺腫および結腸直腸癌の患者（ＴＮＭステージＩＩＩ）由来の腫瘍組織、および各々の患者由来の適合した正常な結腸組織を分析した。患者：倫理的ガイドラインおよび患者の秘密は厳格に保証されており、かつ全ての患者は本研究に参加する書面の承諾を与えた。全ての患者に外科手術の時点で絶食時間および投薬のような共通の術前の準備を行った。
【０１０８】
組織抽出物の調製 新鮮な凍結腫瘍および正常な組織由来のクリオスタット切片（５μｍ）を、ヘマトキシリン／エオジンで染色して、腫瘍／間質の組織病理および量を管理した。腫瘍含量または腺腫含量が５０％を超える組織塊および正常な組織を切片（８×２０μｍ）に切断して、５００μｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、６．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に直ちに移した。この切片を４℃で１０分間１３，２００ｒｐｍで遠心分離した。そのペレットを１５０μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．２、０．１％のｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、氷上で１０分間抽出操作した。十分なボルテックスの後に、その溶解液を１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって測定して、各々のサンプルについて、溶解緩衝液を用いて５μｇ／５０μｌの濃度に調節した。
【０１０９】
実施例２
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイの調製。タンパク質溶解液を、強陰イオン交換体アレイ（ＳＡＸ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析した。ＳＡＸタンパク質アレイ（強陰イオン交換体）をバイオプロセッサー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）中で処理した。チップを２×５分間、結合緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化し、引き続き各々のスポット上で５０μｌのタンパク質溶解液とともにインキュベートした。４５分後、未結合物質を除去して、チップを緩衝液で３回、そして水で２回洗浄した。乾燥後、シナピン酸（１．０μｌ）の２回の適用を加えて、そのチップをＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ（ｍｏｄｅｌ ＰＢＳＩＩ）で分析した。データのバラツキを最小限にするために、測定は、チップ上にランダムに分布させた全ての患者群由来のサンプルを用いて２日内に行った。正規化のための標準コントロールとして、癌患者由来の１つの組織抽出物を全ての測定について平行して用いた。
【０１１０】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析。タンパク質の質量スペクトルは、１８０のレーザー強度で平均が１９５のレーザーショットを用いることによって生成させた。検出器は、６の感度で作動させた。データ取得のために、検出サイズ範囲は２，０００〜４０，０００Ｄａの間とした。レーザーは、１０，０００Ｄａにフォーカスした。データは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＢｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ピーク強度は、全イオン電流に対して正規化した。
【０１１１】
実施例３
データの統計的な評価
３つの患者群についてのカットオフ値を、決定木解析に基づくＣ＆ＲＴ（ＣＡＲＴ）アルゴリズムによって算出する（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｏｌｓｈｅｎ，Ｒ．Ａ．，＆ Ｓｔｏｎｅ，Ｃ．Ｊ．（１９８４）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ．Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ：Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ ＆ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｏｏｋｓ ＆ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。このカットオフ値は、種々の分析群の間の極限値を選択しかつ特定するために算出されている。評価は、ＳＴＡＴＳＯＦＴ ＩＮＣのＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｓ ７．１を用いて行い、決定木解析は、Ｄａｔａ−Ｍｉｎｅｒ Ｍｏｄｕｌ ｓｕｂｐｒｏｇｒａｍ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ（ＣＡｎｄＲＴ）（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．（２００５）．ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ（データ解析ソフトウェアシステム），ｖｅｒｓｉｏｎ ７．１．ｗｗｗ．ｓｔａｔｓｏｆｔ．ｃｏｍ．）を用いて行う。
【０１１２】
統計学的データは、平均値および標準偏差に基づいて評価する。さらに、図６、８および９は、平均±０．９５の信頼区間を示し、これは、この区間内において９５％の確率で観察患者群の真の平均値を見出すことを示している。統計学的な評価は、Ｔ検定によって行う（表１）。この検定では、ｐ値が０．０５未満で有意であるとみなした。ボックスプロットのウィスカーは、標準偏差を示す。
【０１１３】
実施例４
１例の腺腫および１例の結腸直腸癌の患者（ＴＮＭステージＩＩ）由来の腫瘍組織、ならびに正常な結腸組織のタンパク質サンプルを、調製して、実施例１および２に従って分析している。図５は、正常な結腸、線腫および腫瘍組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ１０．３の強度は、組織中で、健常な患者から癌の患者へ有意に増大する。
【０１１４】
図６は、正常な組織、線腫および結腸癌の組織におけるｐ１０．３（エンドプラスミンフラグメント）の平均強度を示す。３０の結腸癌および２９の腺腫組織サンプル、ならびに対応する正常な結腸組織を、実施例１〜３に従って分析した。正常および結腸腫瘍の組織における、ならびに正常および腺腫の組織におけるｐ１０．３の平均強度の相違は統計学的に有意であった。腫瘍サンプルの識別のために、９７％の特異性および９３％の感度を達成した。腺腫サンプルの特異性は８６％の感度で９０％であった。
【０１１５】
図８は、同じ患者集団において確認されたα−デフェンシンファミリーのメンバーのうちの１つ（ピーク３，４８９）の平均強度を示す。線腫および結腸癌の群における平均強度は、正常な結腸組織レベルに比較して有意に上昇していた。腺腫サンプルの識別は、５２％の感度および９０％の特異性で達成した。腫瘍サンプルの識別のためのそれぞれの値は、９０％および８９．６％であった。
【０１１６】
図９は、腺腫群のサンプルにおけるピーク４８３８の特異的に上昇したレベルを示す。腺腫サンプルは、７６％の感度および１００％の特異性で腫瘍および正常な患者のサンプルから識別され得る。
【０１１７】
表１は、患者群における検出されたピーク強度を、ピーク１０，３２４、４，８３８およびデフェンシンファミリーのメンバーのピーク３，３７５、３，４４５および３，４８９についてまとめたものである。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
表１の全てのデータはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得た。
【０１２０】
実施例５
種々の組織でのｐ１０．３の発現
結腸特異的なバイオマーカーとしてのｐ１０．３を確認するために、種々の腫瘍組織、すなわち、乳房、胃、食道、肺および前立腺について、実施例１および２に従って、細胞抽出物を調製して、質量分析によって分析した。図７および表２に示されるとおり、ｐ１０．３の最高強度は、結腸直腸癌で見出され得る（病期ＩおよびＩＩＩ）。しかし、エンドプラスミンフラグメントは、食道、肺および前立腺の癌ならびに正常な組織ではそれより低レベルで発現している。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
エンドプラスミンフラグメント、特に１０，３００Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質フラグメント（ｐ１０．３）は、結腸癌に極めて特異的であるということが図７からわかる。乳房、肺、胃、食道または前立腺の腫瘍とは対照的に、健常な患者と罹患している患者との間のｐ１０．３のレベルには有意な相違がある。さらに、ｐ１０．３のレベルは、癌の段階とともに増大する（病期Ｉ対病期ＩＩＩ）。
【０１２３】
実施例６
３０の結腸癌および２９の腺腫の組織サンプル、ならびに対応する正常な結腸組織を単離して、４，８３８Ｄａの分子量を有するタンパク質（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａの分子量を有するタンパク質（ｐ３．４）のいずれかである第二のマーカーを、エンドプラスミンフラグメントのピークと組み合わせて用いたこと以外は、実施例１〜３に記載のとおりの分析をした。第二のマーカータンパク質、例えば、４，８３８Ｄａ（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａ（ｐ３．４）と組み合わせて、腺腫および／または癌の組織からの正常な組織の分離を同時に達成した。ｐ１０．３を第一のマーカーとして、そしてｐ４．８を第二のマーカーとして用いて、２９の正常な組織サンプルのうち２６(特異性９０％)、２９の腺腫サンプルのうち２３（感度７９％）、ならびに３０の癌サンプルのうち２７（感度９０％）が、正確に分離された（図１０Ａ）。ピーク３４８９との組み合わせで、腺腫サンプルについて９０％の特異性および８２％の感度、そして腫瘍サンプルについて７０％が達成された（図１０Ｂ）。
【０１２４】
結果
図６に示されるとおり、エンドプラスミンフラグメントの量は、３つの群（Ｎ＝正常 Ａ＝腺腫 Ｔ＝癌）の間で有意に異なる。エンドプラスミンフラグメントのレベルは、健常個体から結腸直腸腺腫患者を超え結腸直腸癌患者へと増大する。
【０１２５】
エンドプラスミンフラグメントは、必要に応じて、４，８３８Ｄａ（ｐ４．８）または３，４８９Ｄａ（ｐ３．４）の分子量を有するタンパク質のような他のバイオマーカーと組み合わせて、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための優れたバイオマーカーであるということがこれらのデータによって示される。
【０１２６】
既に公知のバイオマーカーであるＣＥＡおよびＣＡ１９−９とは対照的に、健常個体と腺腫患者との間を識別することが可能である。さらに、腺腫患者と結腸直腸癌患者とを識別することが可能である。エンドプラスミンフラグメント試験の感度および特異性は高く、そして腺腫の早期の特異的な検出、および種々の腫瘍段階の間の識別が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１Ａではエンドプラスミンのタンパク質配列（配列番号１）を示す。図１ＢではＮ末端エンドプラスミンフラグメントの各々の部分である３つのペプチド配列（配列番号２、３および４）を示す。
【図２】Ｃ３のタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図３】図３ＡではＣ３ａのタンパク質配列（配列番号６）を示す。図３ＢではＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図４】約８０ｋＤａおよび約１４ｋＤａのフラグメントを生じる、カルパインによるエンドプラスミンの推定切断部位を示す。
【図５】正常な結腸、腺腫および腫瘍組織からの溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ１０．３（エンドプラスミンのＮ末端部分、１０，３００Ｄａ）の強度は、組織中で、健常患者から腺腫患者へ、癌患者へと有意に増大する。
【図６】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるエンドプラスミンフラグメントｐ１０．３の解析を示す。結腸癌由来の３０サンプルおよび腺腫組織由来の２９サンプル、ならびに対応する正常な健常な結腸組織を分析した。エンドプラスミンフラグメントｐ１０．３の平均濃度は、健常群（Ｎ）に比較して、腺腫群（Ａ）および／または癌群（Ｔ）において有意に高い。
【図７】ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによる種々の癌のタイプでのｐ１０．３の検出を示す。ｐ１０．３の発現レベルは、種々の結腸癌の段階に比較して、胃、食道、肺、前立腺および乳房の癌の分析されたサンプルで有意に低かった。溶解液を、ＳＡＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ（登録商標）Ａｒｒａｙで分析した。正常組織と腫瘍組織との間のｐ１０．３の発現レベルの相違は、統計学的に有意である。Ｎ＝正常組織、Ｔ＝癌組織。
【図８】正常な結腸、腺腫および癌組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ３４８９（α−デフェンシンファミリーのメンバー、ｐ３．４）のピーク強度は、組織中で、結腸直腸腺腫患者から癌患者へと有意に増大する。Ｎ＝正常組織、Ａ＝腺腫組織、Ｔ＝癌組織。
【図９】正常な結腸、腺腫および癌組織由来の溶解液のＳＥＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによるタンパク質プロファイルを示す。ｐ４８３８（ｐ４．８）のピーク強度は、健常な対照組織および結腸直腸癌組織に比較して、結腸直腸腺腫患者の組織で有意に増大する。Ｎ＝正常組織、Ａ＝腺腫組織、Ｔ＝癌組織。
【図１０】腺腫組織および癌組織のための、感度および特異性の両方について、異種の患者集団で改善された２つのマーカー（ｐ１０．３およびｐ４．８またはｐ１０．３およびｐ３．４）の組み合わせを示す。Ａ）検出がｐ１０．３およびｐ４．８の組み合わせに基づいた場合、癌組織について９０％の感度（腺腫について７９％）そして、９０％の特異性が達成された。Ｂ）ｐ１０．３およびαデフェンシンファミリーのメンバーであるｐ３．４の組み合わせを用いた場合、一致した数は、９０％の特異性で癌サンプルについて７０％（腺腫について８２％）であった。Ｎ＝正常結腸粘膜、Ｔ＝癌組織、Ａ＝腺腫組織。文字の前の数字は、別々の個体の数を示す。他の数字は、カットオフ値を指す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項２】
結腸直腸腺腫と結腸直腸癌との間またはさらなる腫瘍状態を識別するための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の進展および／または経過および／または処置をモニタリングするため、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の間の識別のための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者から採取された前記サンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルが、健常な個体のサンプル物質と比較して増大される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、第一のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの第一の増大が、結腸直腸腺腫の指標であり、かつ前記第一のサンプル物質よりも後の時点で前記個体から単離された第二のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの第二の増大が、結腸直腸癌の指標であり、ただしこれは、前記第二の増大が前記第一の増大よりも強いという条件下である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｂ）において、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための１つ以上のさらなるバイオマーカーが、前記単離されたサンプル物質中で決定され、かつ工程（ｃ）において、前記バイオマーカーの決定されたレベルが、１つ以上のそれぞれの参照値と比較される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための前記のさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体の参照値、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の参照値が、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の、個体のそれぞれの群の複数の単離されたサンプル中における平均レベルとして算出され、前記個体群が、健常な個体、結腸直腸腺腫患者および／または結腸直腸癌患者である、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記参照値が、経時的に前記個体から採取された複数の単離されたサンプル物質中で決定された、エンドプラスミンフラグメントおよび必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の平均レベルとして算出された個体の参照値である、方法。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離されたサンプル物質が体液または組織であって、前記体液が必要に応じて、血液、血漿、血清、骨髄、糞便、滑液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、母乳、精液、浸出液およびその混合物からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル物質中の、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーのレベルが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルで決定される、方法。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル物質中の、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーのレベルが、核酸ハイブリダイゼーション技術、免疫学的方法もしくはプロテオミクス技術、および／または質量分析によって決定される、方法。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法が、感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の他の診断方法と組み合わせて行われる、方法。
【請求項１４】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の、個体中の、または個体から単離されたサンプル中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のためのバイオマーカーとしての使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用であって、個体の単離されたサンプル中の、結腸直腸および／または結腸直腸癌腺腫の早期検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための、使用。
【請求項１６】
請求項１４または１５のいずれか１項に記載の使用であって、感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための１つ以上のさらなるバイオマーカーと組み合わせた、使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、使用。
【請求項１８】
個体の単離されたサンプル物質中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するため、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムであって：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合する抗体またはレセプターと、
ｂ）前記抗体またはレセプターを支持する固体支持体と、
ｃ）前記抗体またはレセプターに対するエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープの結合を検出するための試薬と、
を含む、試験システム。
【請求項１９】
請求項１８に記載の試験システムであって、前記試験システムが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための、１つ以上のさらなるバイオマーカーの検出のための１つ以上の抗体またはレセプターを含む、試験システム。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の試験システムであって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、試験システム。
【請求項２１】
個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための検出分子を含むアレイであって、検出分子として：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された核酸プローブ、または
ｂ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された抗体、または
ｃ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定されたレセプターを含み、
検出分子の好ましい種々の量が、定量の正確性を増大するために固体支持体に固定される、アレイ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のアレイであって、前記試験システムが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための、１つ以上のさらなるバイオマーカーの検出のための１つ以上の抗体またはレセプターを含む、アレイ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のアレイであって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、アレイ。
【請求項２４】
ある化合物が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌および／または特定の腫瘍段階の処置において有効であるか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）前記患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、工程（ｂ）において、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための１つ以上のさらなるバイオマーカーが、前記単離されたサンプル物質中で決定され、かつ工程（ｃ）において、前記該バイオマーカーの決定されたレベルが、１つ以上のそれぞれの参照値と比較される、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される群から選択される、方法。
【請求項１】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項２】
結腸直腸腺腫と結腸直腸癌との間またはさらなる腫瘍状態を識別するための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項３】
結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の進展および／または経過および／または処置をモニタリングするため、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の間の識別のための方法であって、以下の工程：
ａ）個体から採取されている単離されたサンプル物質を準備する工程と、
ｂ）前記単離されたサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者から採取された前記サンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルが、健常な個体のサンプル物質と比較して増大される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、第一のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの第一の増大が、結腸直腸腺腫の指標であり、かつ前記第一のサンプル物質よりも後の時点で前記個体から単離された第二のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルの第二の増大が、結腸直腸癌の指標であり、ただしこれは、前記第二の増大が前記第一の増大よりも強いという条件下である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｂ）において、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための１つ以上のさらなるバイオマーカーが、前記単離されたサンプル物質中で決定され、かつ工程（ｃ）において、前記バイオマーカーの決定されたレベルが、１つ以上のそれぞれの参照値と比較される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための前記のさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体の参照値、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の参照値が、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の、個体のそれぞれの群の複数の単離されたサンプル中における平均レベルとして算出され、前記個体群が、健常な個体、結腸直腸腺腫患者および／または結腸直腸癌患者である、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記参照値が、経時的に前記個体から採取された複数の単離されたサンプル物質中で決定された、エンドプラスミンフラグメントおよび必要に応じたさらなるバイオマーカーおよび／またはその誘導体の平均レベルとして算出された個体の参照値である、方法。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離されたサンプル物質が体液または組織であって、前記体液が必要に応じて、血液、血漿、血清、骨髄、糞便、滑液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、母乳、精液、浸出液およびその混合物からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル物質中の、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーのレベルが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルで決定される、方法。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル物質中の、エンドプラスミンフラグメントおよび／またはその誘導体、ならびに必要に応じたさらなるバイオマーカーのレベルが、核酸ハイブリダイゼーション技術、免疫学的方法もしくはプロテオミクス技術、および／または質量分析によって決定される、方法。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法が、感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の他の診断方法と組み合わせて行われる、方法。
【請求項１４】
エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の、個体中の、または個体から単離されたサンプル中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のためのバイオマーカーとしての使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用であって、個体の単離されたサンプル中の、結腸直腸および／または結腸直腸癌腺腫の早期検出のための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための、使用。
【請求項１６】
請求項１４または１５のいずれか１項に記載の使用であって、感度および／または特異性を増大するために、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための１つ以上のさらなるバイオマーカーと組み合わせた、使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、使用。
【請求項１８】
個体の単離されたサンプル物質中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するため、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための試験システムであって：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合する抗体またはレセプターと、
ｂ）前記抗体またはレセプターを支持する固体支持体と、
ｃ）前記抗体またはレセプターに対するエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープの結合を検出するための試薬と、
を含む、試験システム。
【請求項１９】
請求項１８に記載の試験システムであって、前記試験システムが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための、１つ以上のさらなるバイオマーカーの検出のための１つ以上の抗体またはレセプターを含む、試験システム。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の試験システムであって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、試験システム。
【請求項２１】
個体中の、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌を検出するための、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための検出分子を含むアレイであって、検出分子として：
ａ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体をコードするｍＲＮＡに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された核酸プローブ、または
ｂ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定された抗体、または
ｃ）エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のエピトープに結合してそれを検出するための固体支持体に固定されたレセプターを含み、
検出分子の好ましい種々の量が、定量の正確性を増大するために固体支持体に固定される、アレイ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のアレイであって、前記試験システムが、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌のための、１つ以上のさらなるバイオマーカーの検出のための１つ以上の抗体またはレセプターを含む、アレイ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のアレイであって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａのみかけの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、アレイ。
【請求項２４】
ある化合物が、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌および／または特定の腫瘍段階の処置において有効であるか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）ある化合物を用いて、結腸直腸腺腫または結腸直腸癌の患者を処置する工程と、
ｂ）前記患者のサンプル物質中のエンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体のレベルを決定する工程と、
ｃ）前記エンドプラスミンフラグメントまたはその誘導体の決定されたレベルと１つ以上の参照値とを比較する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、工程（ｂ）において、結腸直腸腺腫および／または結腸直腸癌の検出、ならびに／あるいは種々の腫瘍段階の識別のための１つ以上のさらなるバイオマーカーが、前記単離されたサンプル物質中で決定され、かつ工程（ｃ）において、前記該バイオマーカーの決定されたレベルが、１つ以上のそれぞれの参照値と比較される、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが、４，８３８±２５Ｄａの分子量を有するタンパク質、α−デフェンシン１、２または３、トランスサイレチン、ｐ５３、Ｃ３ａ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ−１２５、Ｋｒａｓ、β−カテニン、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｃ−反応性タンパク質血漿およびその誘導体、ならびにＥ−カドヘリン、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６の遺伝子における変異、ならびにＭＨＬ１またはＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性ならびにＳＮＰｓならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される群から選択される、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５０５０８０（Ｐ２００９−５０５０８０Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２６３７９（Ｐ２００８−５２６３７９）
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００９００５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９８７５
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５２３３４７９）インディヴュームド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００９００５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９８７５
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５２３３４７９）インディヴュームド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
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