オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用
【課題】より設計自由度が高く汎用性の高い蛍光オリゴヌクレオチドプローブの提供。
【解決手段】ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される少なくとも１個の式（１）のフルオロホアと、前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアに対応する部位に配置されるユニットに連結される少なくとも１個のクエンチャーとを備えるプローブを用いる。
【解決手段】ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される少なくとも１個の式（１）のフルオロホアと、前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアに対応する部位に配置されるユニットに連結される少なくとも１個のクエンチャーとを備えるプローブを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドプローブには、蛍光を自己生成するプローブがある。こうした蛍光自己生成プローブとして、モレキュラービーコンが知られている。モレキュラービーコンは、標的核酸をハイブリダイズすると検出可能な蛍光シグナルを発するオリゴヌクレオチドである（特許文献１）。モレキュラービーコンは、ステム・ループ構造を有しており、蛍光物質（フルオロホア）と蛍光発色阻害物質（クエンチャー）とを両末端に有する人工オリゴヌクレオチドである。モレキュラービーコンは、通常、単鎖の状態では、ステム領域が二重鎖を形成し、両末端に導入したフルオロホアとクエンチャーとが互いに近接する結果、フルオロホアの蛍光がクエンチャーにより消光されている。一方、プローブ中のループ領域の塩基配列と相補的であるオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたときには、フルオロホアとクエンチャーとが引き離されて蛍光シグナルが発せられる。このようなモレキュラービーコンをプローブとして用いることで、ターゲットを蛍光標識しなくても標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することができる。
【０００３】
従来この種のモレキュラービーコンは、リアルタイムＰＣＲ等において増幅産物の検出に用いられるなど液相反応を主体に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３２９２０９号公報
【発明の概要】
【０００５】
モレキュラービーコンは、ステムの融解温度より十分低い温度では安定したステムを形成して消光するが、標的核酸が存在すると標的核酸とのハイブリダイゼーションによりステムが開いてフルオロホアに基づく蛍光を発する。しかしながら、このような標的核酸との挙動及び発色強度は、温度によって大きく変化する。すなわち、ステムの融解温度よりも低い温度条件下で標的核酸が存在するとモレキュラービーコンは標的核酸と二重鎖を形成して蛍光を発するが、温度が上がれば、モレキュラービーコンは、標的核酸から離れて消光してしまう。したがって、標的核酸非存在時の消光状態を確保してバックグラウンドを低下させるためには、ステムの融解温度を十分に高くして安定した消光状態を形成させるようにする必要がある。同時に、標的核酸とモレキュラービーコンとハイブリダイズをより確実に検出するには、モレキュラービーコンと標的核酸との融解温度をできるだけ高くしステムの融解温度に近づけることが好ましい。
【０００６】
しかしながら、モレキュラービーコン全体の長さにはある程度制限があるため、ステムの融解温度を上げるためにステムを長くすると、プローブの設計自由度が低下し標的核酸の検出特異性が低下するおそれがあった。
【０００７】
また、特に、多種類の標的核酸にそれぞれ対応して検出するモレキュラービーコンを固相担体に固定化したモレキュラービーコンアレイを考慮したとき、検出精度を確保するためには、ステムの融解温度を高めるとともに十分に長い標的核酸とハイブリダイズ可能に設計するのが好ましい。しかしながら、上記した同様の理由から、モレキュラービーコンでこれらの双方を同時に実現することは困難であった。
【０００８】
すなわち、従来のモレキュラービーコンでは、バックグラウンドを抑制しつつ標的核酸に対する特異性を確保することは極めて困難であった。
【０００９】
そこで、本発明は、より設計自由度が高く汎用性の高い蛍光オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用を提供することをその目的とする。
【００１０】
本発明者らは、ステムの形成に伴うによる近接効果及び標的核酸との二重鎖形成による離反効果にのみ大きく依存して消光・発光するのでなく、ステムの形成によって近接されることで安定なスタック構造を形成できるようにフルオロホアとクエンチャーとを配置することにより、より確実に消光できしかもステム熱的安定性を向上できるという知見を得た。また、標的核酸との二重鎖形成時にフルオロホアを標的核酸との二重鎖内にくるようにすることで発光を増強できる場合があるという知見を得た。これらの知見に基づき本発明者らは、本発明を完成するに至った。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、前記ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される以下の式（１）で表されるユニットに連結される少なくとも１個のフルオロホアと、
【化１】
（式中、Ｘはフルオロホアを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアと対合可能な部位に配置される以下の式（２）で表されるユニットに連結される少なくとも２個のクエンチャーと、
【化２】
（式中、Ｙはクエンチャーを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
を備える、プローブが提供される。なお、上記式（１）及び（２）において、ホスホジエステル結合におけるリン酸基（ＰＯ3-）は、非解離型（ＰＯ3Ｈ）であってもよい。
【００１２】
本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、前記フルオロホアは、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖の内部に配置されていることが好ましい。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブにおいては、前記フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香族環系色素及びキサンテン系色素からなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、アゾ系色素からなる群から選択されるいずれかであることが好ましい。より好ましくは、前記フルオロホアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、 チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかであることが好ましい。
【００１３】
また、前記フルオロホアは、縮合芳香環系色素であり、前記クエンチャーは、アントラキノン又はその誘導体であることが好ましく、前記フルオロホアはペリレンであり、前記クエンチャーはアントラキノンであることがより好ましい。
【００１４】
また、本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブは、一つの前記ステムと一つの前記ループを形成可能であることが好ましい。
【００１５】
本明細書の開示によれば、標的核酸を検出するためのプローブ固定化体であって、固相担体と、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、前記固相担体に保持された上記いずれのオリゴヌクレオチドプローブと、を備える、固定化体が提供される。本明細書に開示のプローブ固定化体において、前記固相担体は、プレート状体であることが好ましい。また、本明細書に開示のプローブ固定化体は、複数の標的核酸をそれぞれ検出可能な複数のオリゴヌクレオチドプローブをアレイ状に備えることが好ましい。また、本明細書に開示のプローブ固定化体は、ＳＮＰｓ又は遺伝子変異の検出用であることが好ましい。
【００１６】
本明細書の開示によれば、標的核酸の検出方法であって、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する、方法が提供される。
【００１７】
本明細書の開示の検出方法においては、複数の標的核酸に対応してハイブリダイゼーション可能な複数の前記オリゴヌクレオチドプローブを固相担体上に保持した固定化体を用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブの概要をその一例を挙げて説明する図である。
【図２】本明細書の開示のオリゴヌクレチドプローブをモレキュラービーコン型プローブとした場合の一例を示す図である。
【図３Ａ】チアゾールオレンジを備える各種オリゴヌクレオチドの吸収スペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】チアゾールオレンジを備える各種オリゴヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】ペリレンを備えるオリゴヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書の開示は、蛍光オリゴヌクレオチドプローブに関し、さらに、当該プローブの固定化体、当該プローブを利用した標的核酸の検出方法に関する。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブによれば、標的核酸が存在しないときには、ステムにおいて１個のフルオロホアと２個のクエンチャーが安定したスタック構造を形成して熱的安定性を高めるとともに安定的に消光する。一方、標的核酸が存在するときには、オリゴヌクレオチドプローブは、その中の標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖（以下、プローブ配列ともいう。)において、標的核酸とハイブリダイゼーションする。この結果、ステムが崩壊し、フルオロホアはクエンチャーにより消光されなくなり蛍光を発する。
【００２０】
本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブによれば、ステムがフルオロホアとクエンチャーとにより熱的に安定化されているため、より高い融解温度を得やすくなり、しかもより長いあるいはより多様な標的核酸（プローブ配列）を選択することができる。このため、標的核酸の種類、ハイブリダイゼーション条件に応じて、オリゴヌクレオチドプローブをより高い自由度で設計できる汎用性に優れたオリゴヌクレオチドプローブが提供される。また、１個のフルオロホアに対して２個のクエンチャーを対合させることにより、バックグラウンドレベルをより低減してより高い感度で標的核酸を検出できる。
【００２１】
さらに、フルオロホアとクエンチャーとを、従来のモレキュラービーコンのようにその両末端に位置させる必要がないため、固相担体への固定化が容易であり、固定化による消光や蛍光への影響を回避又は抑制できる。
【００２２】
以下、本明細書に開示される手段の実施形態として、蛍光オリゴヌクレオチドプローブ、その固定化体及び標的核酸の検出方法について、適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本明細書の開示の蛍光オリゴヌクレオチドプローブの一例としてのモレキュラービーコン型プローブの作用を示す図であり、図２は、モレキュラービーコン型プローブを固相担体上に備えた状態の一例を示す図である。
【００２３】
なお、本明細書においてオリゴヌクレオチドは、検出しようとする天然、天然由来の及び非天然のＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイゼーションする機能を発揮可能に天然あるいは非天然の塩基、ヌクレオチドやヌクレオシドを備えるものであればよい。また、オリゴヌクレオチドは、プローブとしての用途を考慮するとおおよそ１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒ程度を意味するが、特にその数を限定するものではなく１００ｍｅｒを越える場合であっても、本明細書においてオリゴヌクレオチドプローブに含まれる。また、本明細書において標的核酸とは、採取源等特に限定するものではなく、検出しようとする天然、天然由来のあるいは非天然のＤＮＡ（１重鎖であっても２重鎖であってもよい。）やＲＮＡ（１重鎖であっても、２重鎖であってもよい）、あるいはこれらのキメラ及びハイブリットとすることができる。なお、天然由来のＤＮＡとは、天然のＤＮＡの塩基配列に基づいて遺伝子工学的、酵素合成にあるいは化学合成により作製したＤＮＡを意味する。
【００２４】
（オリゴヌクレオチドプローブ）
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、図１及び図２に示すように、ステム及びループを形成可能であり、そのステムにおいてフルオロホアとクエンチャーとを備えている。
【００２５】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１個のステムと少なくとも１個のループを形成可能であればよく、それぞれを複数個形成可能であってもよい。したがって、図１及び図２に示すように１個のステムと１個のループとを備えるいわゆるモレキュラービーコン型のプローブを形成可能であってもよいし、ｔＲＮＡあるいはその類の構造体などの、複数のステム及び複数のループを形成可能であってもよい。後述するように、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、最も簡易なモレキュラービーコン型を採ることでも、十分な検出特異性を得ることができる。
【００２６】
なお、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブがステム及びループを形成可能であるとは、互いに対合して少なくとも１個のステムを形成する一対のステム形成鎖を備えるとともに、当該ステム形成鎖によって形成されるステムに連続してループを形成するループ形成鎖を備えていることが意味している。本明細書において、単にステム又はループに言及するとき、これらが形成された状態を意図している。
【００２７】
ステムを形成するステム形成鎖の長さは特に限定しないが、それぞれのステム形成鎖は、４以上９以下の塩基対を形成する鎖長とすることができる。モレキュラービーコン型プローブとしては、８以上４０以下の塩基対を形成する鎖長とすることが好ましく、より好ましくは１５以上３０以下である。なお、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブにおけるステムは、オリゴヌクレオチド鎖の両末端側で構成されるものに限定されない。一方のステム形成鎖がオリゴヌクレオチドプローブの末端以外の部分にあって他方のステム形成鎖が当該プローブ末端にあってもよいし、双方のステム形成鎖がプローブ末端以外の部分にあってもよい。
【００２８】
また、ループを形成可能なループ鎖の長さも特に限定しないが、５以上４０以下程度とすることができる。例えば、モレキュラービーコンとしては、８以上３０以下とすることが好ましく、より好ましくは１０以上２０以下である。
【００２９】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１個のステムの一方のステム形成鎖に少なくとも一つのフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に少なくとも２つのクエンチャーを備えており、一つのフルオロホアに対して２つのクエンチャーが対合可能に配置されている。すなわち、一つのフルオロホアと２つのフルオロホアからなる対合ユニットを、ステムにおいて形成可能となっている。対合ユニットの数や配置形態は特に限定されない。図１に示すように、対合ユニットはステムにおいて１個であってもよいし、２個以上であってもよい。また、対合ユニットは、例えば、図１に示すように、一方のステム形成鎖において一つのフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に２つのクエンチャーを備えて、対合ユニットを形成できるが、この対合ユニットに加えて、一方のステム形成鎖に複数のフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に複数のクエンチャー（複数のフルオロホアの２倍数）を備えて、フルオロホアの個数に対応する対合ユニットを形成してもよい。さらに、一方のステム形成鎖に一つの対合ユニットのフルオロホアを備え、他の一つの対合ユニットのクエンチャーを備えるようにしてもよい。
【００３０】
こうした対合ユニットを形成可能とすることで、プローブの末端でなく、より内側で、５’末端または３’末端から３塩基相当部位あるいは４塩基相当部位より内側となるようなステム内位置でも感度よくターゲット配列を検出できるようになる。すなわち、オリゴヌクレオチドの配列中にあってもその配列に依存性を抑制できる。また、ターゲット配列がループからステムに及ぶような場合であっても、感度よく、ターゲット配列を検出できるようになる。
【００３１】
一つのステムにおいて複数個の対合ユニットを形成可能とする場合、異種類のフルオロホアを用いることもできるが、好ましくは、同一波長域で検出可能な蛍光を発し、同程度に消光するフルオロホアの組み合わせを用いることが好ましい。より好ましくは、同一のフルオロホアを用いる。また、一つの対合ユニットにおいて２つのクエンチャーは消光可能である限り、同つであっても異なっているもよいが、同一であってもよい。
【００３２】
一つの対合ユニットを構成する２つのクエンチャーは、一つのステム形成鎖に連続して備えられている。すなわち、２つのクエンチャー間には、ヌクレオチドを含んでいない。複数の対合ユニットを形成可能とする場合には、隣合う対合ユニットの同一のステム形成鎖上のフルオロホアの間には１以上のヌクレオチドがあってもよいし、なくてもよいが、フルオロホアの会合によるクエンチが起きる場合は、ヌクレオチドが１以上あるほうが好ましい。同様に、隣合う対合ユニットの同一のステム形成鎖上のクエンチャーの間には１以上のヌクレオチドがあってもよいし、なくてもよい。介在されるヌクレオチドにおける塩基は、特に限定しないで、プリン系塩基及び／又はピリミジン系塩基から選択されてもよいし、人工的に合成された塩基であってもよい。
【００３３】
また、対合するステム形成鎖において、フルオロホア及びクエンチャーは、いずれもオリゴヌクレオチドプローブの５’末端及び３’末端よりも外側に連結されるものではない。フルオロホア及びクエンチャーは、最も末端側にある場合であっても、最末端のヌクレオチドよりも内側（最末端が５’末端の場合にはより３’側に、同３’末端の場合にはより５’末端側に）に備えられている。
【００３４】
フルオロホアは、上記のとおりステム内に配置されるが、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブのプローブ配列の内部に配置される。フルオロホアは、その種類により標的核酸とのハイブリダイゼーションにより二重鎖を形成したとき、その二重鎖内にインターカレーションされることで、蛍光が増強されることがあるからである。このようなフルオロホアについては後述する。
【００３５】
フルオロホア及びクエンチャーは、また、隣接するヌクレオチドの塩基の種類やさらにそのヌクレオチドに隣接する遠位のヌクレオチドの塩基種類も特に限定されない。
【００３６】
フルオロホアは、ステム形成鎖のヌクレオチド間に式（１）で表されるユニットにＸとして含まれている。フルオロホア（Ｘ）は、ユニットの一部としてあるいはＹ以外のユニット部分に連結されて、結果としてステムに備えられる。式（１）における、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を意味している。Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を意味している。ただし、Ｒ2は、Ｒ1のポリアルキレン鎖の５’側の酸素原子から２つ目の炭素原子に結合していることが好ましい。Ｚは、直接の結合であってもよいし、フルオロホアとの連結基であり特に限定されない。例えば、−ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＳ−、ＣＯＮＨ−、−Ｏ−等あるいはこれらの基を含むものが挙げられる。
【００３７】
上記Ｒ1〜Ｒ2の置換基としては、未置換の又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基で当業者で置換された炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基又はアルコキシ基；未置換又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基若しくはアルキニル基；水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基等が挙げられる。さらに、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基が挙げられる。Ｒ1の置換基は、アルキレン鎖のいずれの炭素原子に連結されていてもよいが、Ｒ2と同様に、５’の酸素から２つ目又は３つ目の炭素原子に連結されることが好ましい。
【００３８】
ステムにおいて対合されるフルオロホア及びクエンチャーに関し、式（１）及び式（２）における、Ｒ1におけるアルキレン鎖の炭素数は、同一であっても異なっていてもよい。
【００３９】
例えば、式（１）又は式（２）で表されるユニットとして以下のものが挙げられる。
【００４０】
【化３】
【化４】
【化５】
【００４１】
式（１）においてＸはフルオロホアを表す。フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、アクリジン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、フラビン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素等が挙げられ、これらから適宜選択して使用できる。なかでも、シアニン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、縮合芳香族環色素、キサンテン系色素が好ましく用いることができる。より好ましくは、Ｃｙ３，Ｃｙ５，チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群から選択されるいずれかである。なかでもチアゾールオレンジなどのシアニン系色素をもちいることが好ましい。フルオロホアとして使用する化合物は、式（１）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよいし、クエンチャーとの対合を考慮して連結基との間に、置換されていてもよいアルキレン鎖、アルケニレン基、アルキニレン基が付与されていてもよい。また、式（１）で表されるユニットに対して連結されるフルオロホア上の原子は特に限定されない。
【００４２】
インターカレーションにより蛍光が増強するフルオロホアとしては、チアゾールオレンジ、オキサゾールオレンジ、ペリレン等が挙げられる。これらのフルオロホアは、プローブ配列内部に配置させてインターカレートさせることが好ましい。一方、フルオロホアやR1、R2の組み合わせにより、フルオロホアの蛍光強度がインターカレートによって減少する場合には、フルオロホアはインターカレートしないようにし、反対にクエンチャーがインターカレートするようにビーコンを設計する方が好ましい。
【００４３】
式（１）において連結されるフルオロホア（Ｘ）としては以下ものが挙げられる。なお、以下の例の各種化合物は例示であり、水素原子はいずれも適宜置換基で置換されていてもよい。また、連結基への連結部分（点線部分）において、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基を介在させてもよい。
【００４４】
【化６】
【化７】
【００４５】
クエンチャーは、ステム形成鎖のヌクレオチド間に以下の式（２）で表されるユニットに含まれている。すなわち、クエンチャー（Ｙ）は、ユニットの一部としてあるいはＹ以外のユニット部分に連結されて、結果としてステムに備えられる。式（２）における、Ｒ1、Ｒ2及びＺは、式（１）におけるのと同義である。また、Ｒ1〜Ｒ2の置換基も式（１）におけるのと同義である。
【００４６】
式（２）においてＹはクエンチャーを表す。クエンチャーとしては、使用するフルオロホアとを本明細書に開示におけるスタック構造の形成により消光できるものであれば特に限定されないが、例えば、アゾベンゼン及びその誘導体が挙げられる。これらはいずれも光異性化する化合物であるが、-N=N-の存在により消光作用を奏するものと考えられる。クエンチャーとしては好ましくは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかである。典型的なアゾ系クエンチャーは、ペリレンなどの多環縮合系のフロオロホアとの関係において、フルオロホアのＨＯＭＯがクエンチャーのＨＯＭＯより低いタイプのクエンチャーで、換言すれば還元力の強いクエンチャーであるということができる。
【００４７】
また、クエンチャーとしては、アントラキノン骨格を有する化合物が挙げられる。アントラキノン骨格を有する化合物としては、アントラキノンの他、アントラキノンのベンゼン環を構成する炭素原子に結合する１個又は２個以上の水素原子を、水酸基、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、ハロゲン原子、アルキルアミノ基等から選択される１種又は２種以上の官能基で置換した各種のアントラキノン誘導体が挙げられる。各種のアントラキノン誘導体は、例えば、東京化成株式会社等からから容易に入手できる。例えば、アントラキノン誘導体としては、天然には、コチニール色素、アリザリン等のアカネ色素、ラック色素の化合物が挙げられる。アントラキノン誘導体としては、フルオロホアよりも低いＬＵＭＯを持つアントラキノン誘導体ならば、どのような誘導体でも使用することが出来るが、ニトロ基やカルボキシル基など、ＬＵＭＯのエネルギー準位を上げない電子吸引性の置換基が好ましい。好ましくはアントラキノンである。アントラキノンなど典型的なアントラキノン系のクエンチャーは、ペリレンなどの縮合芳香環系のフロオロホアとの関係において、フルオロホアのＬＵＭＯがクエンチャーのＬＵＭＯより高いという条件を満たしたクエンチャーで、酸化力の強いクエンチャーということができる。
【００４８】
また、クエンチャーは、消光能力の観点から、その極大吸収波長が、対を形成するフルオロホアの極大吸収波長との差が１５０ｎｍ以内であることが好ましい。クエンチャーの極大吸収波長とフロオロホアの極大吸収波長との差は、より好ましくは１００ｎｍ以内であり、さらに好ましくは５０ｎｍ以内である。さらに、クエンチャーの極大吸収波長は、フルオロホアの極大吸収波長よりも短波長側にあることが好ましい。用いるフルオロホアとの関係で、クエンチャーの極大吸収波長を制御することで、クエンチャーを最適化することができる。
【００４９】
クエンチャーの極大吸収波長の制御（長波長側又は短波長側へのシフト）は、例えば、クエンチャーの基本骨格に対して電子吸引性基や電子供与性基などを導入するなどによって可能である。例えば、後段の〔化８Ｂ〕に示すように、メチルレッド等のアゾベンゼン系骨格のアゾ基に対してオルト位又はパラ位に電子吸引性基（例えば、ニトロ基、ハロゲン）や電子供与性基（例えば、メトキシ基）を適宜導入することが考えられる。
【００５０】
クエンチャーとして使用する化合物は、式（２）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよいし、クエンチャーとの対合を考慮して連結基との間に置換されていてもよいアルキレン鎖が付与されていてもよい。また、クエンチャーの連結基との連結部分は、適宜選択される。
【００５１】
式（２）において連結されるクエンチャー（Ｙ）としては以下のものが挙げられる。なお、以下の例の各種化合物は例示であり、水素原子はいずれも適宜置換基で置換されていてもよい。また、連結基への連結部分（点線部分）において、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基又はアルキニレン基を介在させてもよい。また、式（２）で表されるユニットに対して連結されるフルオロホア上の原子は特に限定されない。
【００５２】
【化８Ａ】
【００５３】
【化８Ｂ】
【００５４】
【化９】
【００５５】
なお、本明細書に開示におけるフルオロホアとクエンチャーとの組合せは、以下に示す蛍光消光作用に基づいて選択することができる。一般に蛍光消光は、１）フェルスター型の励起エネルギー移動、２）電子移動型の二種類がある。フェルスター型のエネルギー移動に基づく蛍光消光では、フルオロホアの蛍光スペクトルとクエンチャーの吸収スペクトルが重なっている必要がある。従ってフェルスター型の励起エネルギー移動を利用する場合は、このような条件を満足するようなフルオロホアとクエンチャーの組み合わせを選ぶのが好ましい。なおフェルスター型ならばフルオロホアとクエンチャーの距離が２〜１０ｎｍ離れていても消光させることが出来るが、本明細書に開示ではフルオロホアとクエンチャーが接触しているので、蛍光−吸収スペクトルの条件さえ満たしていればフェルスター型で十分に消光可能である。
【００５６】
一方２）の電子移動型では、フルオロホアとクエンチャーそれぞれの最高被占軌道（ＨＯＭＯ）と最低空軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー順位の関係が重要である。フルオロホアの蛍光のメカニズムは、ＨＯＭＯからＬＵＭＯに励起された電子が再びＨＯＭＯに戻る際に、励起エネルギーを蛍光という形で放出することに基づく。フルオロホアのＨＯＭＯにある二つの電子のうち一つが光励起されてＬＵＭＯに移動すると、フルオロホアのＨＯＭＯが空になる。クエンチャーのＨＯＭＯのエネルギー順位がフルオロホアのＨＯＭＯより高い場合には、空になったフルオロホアのＨＯＭＯに、クエンチャーのＨＯＭＯにある電子が移動する。すると励起されたフルオロホアの電子は、元のＨＯＭＯに戻れなくなるので、蛍光を発することが出来ない。またクエンチャーのＬＵＭＯがフルオロホアのＨＯＭＯより低い場合は、励起されてＬＵＭＯに遷移した電子がクエンチャーのＬＵＭＯに移動するため、元のＨＯＭＯに戻れなくなり、蛍光を発することが出来ない。すなわち電子移動型での蛍光消光は、１）フルオロホアのＨＯＭＯがクエンチャーのＨＯＭＯより低い、あるいは２）フルオロホアのＬＵＭＯがクエンチャーのＬＵＭＯより高いという条件を満たした組み合わせが好ましい。更に電子移動は短距離でしか起きないので、フルオロホアとクエンチャーは接触していることが望ましい。本明細書に開示ではフルオロホアとクエンチャーが接触（スタッキング）しているので、上記の条件さえ満たした組み合わせならば電子移動型で十分に消光可能である。なお、本明細書に開示のフルオロホアとクエンチャーの組み合わせは、ほとんどが電子移動型の消光を起こすための条件を満たしている。
【００５７】
なお、アントラキノン又はその誘導体によるペリレン等の縮合芳香環系フルオロホアのクエンチは、励起電子がアントラキノンのLUMOへ移動することで起きる。すなわち“電子トラップ”によるクエンチである。電子移動型のクエンチ現象は、本来的に電子が移動しやすいことのほか、アントラキノン系クエンチャーと縮合芳香環系フルオロホアとによる対合形成が強固であることによって一層電子移動が促進されていることが推論される。アントラキノン系クエンチャーと縮合芳香環系フルオロホアとの対合の数が増加することにより、それに応じてこうした電子移動型のトラップ現象が一層強化されるとともに、フルオロホアから対を形成していない方のクエンチャーへ天然の塩基対を通じて電子が移動しやすくなっていることでさらに強化されるものと考えられる。一方、アゾ系のクエンチャーは、フルオロホアの励起でＨＯＭＯに生じた正孔（ホール）に、アゾ系のクエンチャーのＨＯＭＯに存在する電子が移動することによるクエンチ、すなわち“ホールトラップ”型である。ホールよりも電子の方が移動度が大きいため、“電子トラップ”型のペリレン−アントラキノンの方が効率よくクエンチすることができる。
【００５８】
フルオロホア及びクエンチャーを導入することは、例えば、通常の固相合成法において、ヌクレオチドに対応するアミダイト誘導体に代えてこの種のユニットを導入なアミダイド誘導体を用いることによって可能となる。例えば、Ｄ−トレオニールや３−アミノ１，２−プロパンジールなどのアミノアルキルジオール類のアミノ基をアリルオキシカルボニル基などの適当な保護基で保護した上、一方の水酸基をジメトキシトリチルクロリド等で保護し、その後、他方の水酸基に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイドを導入する。そしてこのアミダイト体に対して、フルオロホア又はクエンチャーを導入してアミダイトモノマー化してもよい。例えば、アゾベンゼン系化合物、ペリレン系化合物については、例えば、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００３年１２５巻２２１７−２２２３頁記載の方法で、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）誌２００７年第４８巻６７５９−６７６２頁記載の方法を適用することができる。こうしたモノマーを取得した場合には、従来公知のＤＮＡ合成法、例えばネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法にしたがって、所望の部位にフルオロホア又はクエンチャーを連結したユニットを備えるオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００５９】
また、フルオロホアやクエンチャーは、アリルオキシカルボニル基等でアミノ基を保護した上記アミダイト体を所望の位置に備えるオリゴヌクレオチドを合成後に導入してもよい。例えば、アミノ基を保護したままのユニットを備えたオリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上においてアミノ基を脱保護した後、当該アミノ基と反応可能にカルボン酸基やイソシアネート基を導入したあるいは保持するフルオロホアやクエンチャーを反応させることで、フルオロホア等を導入してもよい。
【００６０】
以上説明した本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光シグナルを自己生成するプローブであるため、標的核酸を蛍光物質等で標識する必要がないことのほか、標的核酸の設計自由度が高く、高い特異性での検出が可能となる利点がある。さらに、ステム内にフルオロホア及びクエンチャーを備えることから、固相担体への固定化の容易性ほか固定化が発光・消光に及ぼす影響を回避又は抑制することができる。
【００６１】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、従来モレキュラービーコンが適用されるリアルタイムＰＣＲなどの液相での標的核酸の検出のほか、遺伝子発現パターン、疾患分類、疾病等の原因遺伝子解析、遺伝子診断などの遺伝子発現モニタリング、ＳＮＰなどの多型検出、各種変異の検出に有利である。特に、多型や変異などの検出に有利であり、さらに網羅的な多型や変異の検出に有利である。特に、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブのフルオロホア及びクエンチャーを備えるステムは、フルオロホア及びクエンチャーを含まない以外は同一のステムよりも熱的安定性が高くなり、Ｔｍが上昇する。このため、長い配列を標的核酸とするプローブ配列を備えることができ、特異性の高いＤＮＡ解析が可能となる。また、複数の好ましくは数十以上の多数のＳＮＰや変異部位などを有する標的核酸を同時に検出可能なモレキュラービーコンプローブを固定化するアレイにあっては、多数の標的核酸に区別するのに十分に長いプローブ配列を備える必要がある。従来のモレキュラービーコンの場合、ステムを長くするとループをこのような場合には、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、ステムのＴｍが高くしかもフルオロホアを含んだ範囲をプローブ配列とすることができ、結果としてプローブ配列をより長く確保できる点において有利である。
【００６２】
（プローブ固定化体）
本明細書に開示のプローブ固定化体は、固相担体と、前記標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることができる。本明細書に開示のプローブ固定化体においては、モレキュラービーコンをプローブとして用いることが好ましい。
【００６３】
固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のオリゴヌクレオチドプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよい。
【００６４】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、その末端にフルオロホアとクエンチャーとを備えていないため、固相担体への固定化を従来と同様の手法で容易に行うことができる。
【００６５】
このようなプローブ固定化体の用途は特に限定されないで、遺伝子発現パターン、疾患分類、疾病等の原因遺伝子解析、遺伝子診断などの遺伝子発現モニタリング、ＳＮＰなどの多型検出、各種変異の検出に有利である。特に、多型や変異などの検出に有利であり、さらに網羅的な多型や変異の検出に有利である。
【００６６】
（標的核酸の検出方法）
本明細書に開示の標的核酸の検出方法は、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブであって、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記モレキュラービーコンの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する方法とすることができる。本明細書に開示の検出方法においては、オリゴヌクレオチドプローブはモレキュラービーコンであることが好ましく、より好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブ（典型的にはモレキュラービーコン）を固相担体に固定化した固定化体を用いることが好ましい。
【００６７】
本明細書に開示の検出方法においては、例えば、以下のように実施することができる。まず、複数の標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能なモレキュラービーコンを固相担体に固定化したアレイを準備する。その後、標的核酸を含む可能性のある核酸試料（典型的には、血液や組織から採取した生体試料から核酸を抽出して得られたもの又はさらに一定条件下ＰＣＲ等で増幅したものなど）を、所定組成のハイブリダイゼーション液の存在下にアレイ上のモレキュラービーコンに供給する。所定のハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーション温度は、ステムのＴｍ及びプローブ配列と標的核酸とのＴｍのいずれよりも低い温度とすることが好ましい。予め定めた間経過後、アレイを洗浄し、核酸試料中に存在した標的核酸とのハイブリダイゼーションをフルオロホアの発する蛍光シグナルを検出することによって行う。蛍光シグナルの検出は、蛍光スキャナー等により行うことができる。取得した蛍光シグナルに基づき、標的核酸の検出、同定、定量等に必要な解析を行う。
【００６８】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書に開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００６９】
（アリルオキシカルボニル（(allyloxy)carbonyl ）基で保護したD-トレオニノール（D-threoninol）のアミダイトモノマー化 ）
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット（炭素数３）のアミダイトモノマー（化合物Ａ）を以下のスキームに従い合成した。３００ｍｌのナスフラスコにＤ−トレオニノール（０．９９ｇ，９．４１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）７５ｍｌに溶解させ、トリエチルアミン１５ｍｌを加え、攪拌した。次に、７５ｍｌのＴＨＦに溶解させておいたクロロギ酸アリル（１．０１ｍｌ，９．５１ｍｍｏｌ）を、氷浴中で上記のＴＨＦ溶液に滴下した。１５分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、ＴＨＦ溶液を滴下し終わってから１時間３０分後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物１−１を得た。
【００７０】
【化１０】
【００７１】
次に、得られた化合物１（１．７２ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン３０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ，Ｎ，ジイソプロピリエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：１．５４ｍＬ、９．０９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。次に、５０ｍｌの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ：３．０８ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：０．１４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン１０ｍｌを加えて溶解させた。えこのジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。１５分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後４時間３０分後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝６６：３３：３）で精製し、化合物１−２を得た。
【００７２】
化合物１−２（０．７４ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル３０ｍｌを加えて溶解させ、これに更に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ¢，Ｎ¢ −ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄｉｔｅ：０．５４ｇ，１．７９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。別の二口ナスフラスコに１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ：０．１３７ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル１５ｍｌを加えて溶解させた。この１Ｈ−テトラゾール溶液を、上記の化合物１−２のアセトニトリル溶液に氷浴下で滴下し、１５分程度攪拌した後に氷浴を除き、室温に戻して更に攪拌を続けた。この後およそ１時間３０分程度で反応を停止した。この後溶媒をエバポレーターで留去した後、残ったオイル状の化合物に酢酸エチルを加えて溶解した。この酢酸エチル溶液を、分液ロートを用いて重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で２回振とうし、続いて塩化ナトリウムの飽和水溶液で同様に２回振とうした。この後、硫酸マグネシウムを加えて水分を除いてから酢酸エチルをエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：３）精製し、化合物Ａを得た。
【実施例２】
【００７３】
（アリルオキシカルボニル（(allyloxy)carbonyl ）基で保護した３−アミノ１，２−プロパンジオール（3-amino-1,2-propanediol）のアミダイトモノマー化）
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット（炭素数２）のアミダイトモノマー（化合物Ｂ）を以下のスキームに従い合成した。
【００７４】
【化１１】
【００７５】
２００ｍｌのナスフラスコに３−アミノ１，２−プロパンジオール（３−ａｍｉｎｏ−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）（１．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに溶解させ、トリエチルアミン１５ｍｌを加え、攪拌した。次に、２０ｍｌのＤＭＦに溶解させておいたクロロギ酸アリル（１．４ｍｌ，１１ｍｍｏｌ）を、氷浴中で上記のＤＭＦ溶液に滴下した。１５分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、ＤＭＦ溶液を滴下し終わってから２時間後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物１−３を得た。原料として化合物１−３を使用する以外は実施例１と同様の方法で化合物１−４続いて化合物Ｂを得た。
【００７６】
以下に示す化合物Ｃはネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、化合物Ｄはジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００３年１２５巻２２１７−２２２３頁記載の方法で、化合物Ｅはテトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）誌２００７年第４８巻６７５９−６７６２頁記載の方法で得た。
【００７７】
【化１２】
【実施例３】
【００７８】
（チアゾール・オレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）の合成）
本実施例では、フルオロホアとしてのチアゾールオレンジ誘導体を以下のスキームに従い、合成した。
【００７９】
【化１３】
【００８０】
２００ｍｌのナスフラスコに２−（メチルチオ）ベンゾチアゾール（２．０４ｇ，１１．３ｍｍｏｌ）を秤り取り、５ｍｌのエタノールを加えて溶解させ、この溶液にヨードメタン（１．５ｍｌ、２４．１ｍｍｏｌ）を加えてから６５℃で３時間加熱還流した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−１（０．５２ｇ）を得た。
【００８１】
次に２００ｍｌのナスフラスコにブロモ酢酸（１．９４ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を秤取り、酢酸エチル１０ｍＬを加えて溶解させた。これにレピジン（２ｍｌ、１５．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間３０分攪拌した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−２（０．４１ｇ）を得た。上記と同様に次に２００ｍｌのナスフラスコにブロモ酪酸（８．０８ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）を秤取り、酢酸エチル１０ｍｌを加えて溶解させた。これにレピジン（７ｍｌ、５２．８ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で終夜攪拌した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−３（４．８５ｇ）を得た。
【００８２】
チアゾールオレンジＴＯ−１は、化合物２−１（０．４２ｇ，２ｍｍｏｌ）と化合物２−２（０．４１ｇ，２ｍｍｏｌ）を脱水エタノール１０ｍｌを加えて溶解させ、６０℃で５分間還流した後にトリエチルアミン（０．２７ｍｌ，２ｍｍｏｌ）を加え、赤色に変化した後に攪拌しながら室温に戻した。この赤色の反応溶液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加えて生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、チアゾールオレンジ（ＴＯ−１，０．５９ｇ）を得た。チアゾールオレンジＴＯ−２は、化合物２−３を用いる以外は同様の手法で得た。
【実施例４】
【００８３】
（オリゴヌクレオチドの合成）
本実施例では、以下に示すクエンチャーが導入されたオリゴヌクレオチド及びフルオロホアが導入されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。ただし、ＰＥはペリレンを表し、ＭＲはメチルレッドを表し、Ａｚｏはアゾベンゼンを表す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
（アゾベンゼン、メチルレッド、ペリレンを導入したオリゴヌクレオチドの合成）
クエンチャーとしてのアゾベンゼン、メチルレッド、あるいはペリレンを導入したＤＮＡの合成は、ABI394型ＤＮＡ合成機を使用し、対応するホスホロアミダイトモノマー（化合物Ｃ，Ｄ，Ｅ）と４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いてネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で合成・精製した。
【００８６】
（チアゾールオレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）およびＦＩＴＣのオリゴヌクレオチドへの導入）
チアゾールオレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）とＦＩＴＣのオリゴヌクレオチドへの導入は、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由した以下のスキームに示す方法で行った。
【００８７】
【化１４】
【００８８】
ＡＢＩ３９４型ＤＮＡ合成機を使用し、Ｄ−トレオニノールのアミノ基をアリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーＡ、４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマー、および既述のアミダイトモノマーＣ，Ｄ，Ｅを適宜用いて、コントロールドポアグラス（ＣＰＧ）担体上に所定の配列を持つＤＮＡを伸長させた（化合物３−１）。このＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．４５μｍｏｌ）を、フィルターを装着しているプラスチックのシリンジに秤取り、アセトニトリル１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍＬで３回洗浄した。次にＰｄ（Ｐｈ３）４（５．２ｍｇ，４．５μｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン溶液５００μＬにＮ−メチルアニリン４８．８μＬ（４５０μｍｏｌ）を加え、これを上述のＣＰＧ担体（化合物４−１）に加えて３５℃で３時間反応させることで、アリルオキシカルボニル基のみをＣＰＧ担体上から脱保護した（化合物３−２）。
【００８９】
次にチアゾールオレンジＴＯ−１（１０ｍｇ、４５μｍｏｌ）とｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｐａｒａ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＰＰＴＳ：１１．３ｍｇ，４５μｍｏｌ）を４００μＬのＤＭＦに溶解させ、これにｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢＯＰ：５９ｍｇ，１１２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液１００μｌを加えたものを、上記のＣＰＧ担体（化合物３−２）が入ったシリンジに加え、３日間室温で振とうした。この後、反応溶液をろ過で除き、続いて０．１ＭのＰＰＴＳのＤＭＦ溶液１ｍＬをシリンジに加えて１分間振とうしてＣＰＧ担体を洗浄し、更にＤＭＦ１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍｌで３回洗浄して、ＴＯ−１を導入したＣＰＧ担体を得た（化合物３−３）。
【００９０】
続いて、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法でＣＰＧ担体からＤＮＡを切り出し、高速液体クロマトグラフィーで同誌同頁に記載の方法で目的とするＤＮＡを分離精製した（化合物３−４）。
【００９１】
チアゾールオレンジＴＯ−２を導入したＤＮＡは、ＴＯ−１の代わりにＴＯ−２を用いる以外は上記と同様の方法で得た。
【００９２】
ＦＩＴＣ導入ＤＮＡは、ＦＩＴＣ（１４．０２ｍｇ、１８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５００μＬ）にＤＩＰＥＡ（６．１２μｌ，１８μｍｏｌ）を加え、これをアリルオキシカルボニル基のみを脱保護したＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．３６μｍｏｌ）（化合物３−２）に加え三日間攪拌した後、ＴＯ導入ＤＮＡと同様の操作を行うことで調製した。
【００９３】
化合物Ａに代えて化合物Ｂを用いること以外は上記と全く同様の手法で、ＴＯ−１，ＴＯ−２，あるいはＦＩＴＣを導入して連結基Ｒ1（C2：炭素数２）を含むオリゴヌクレオチドを合成した（化合物３−５）。
【実施例５】
【００９４】
（クエンチャーとの組み合わせによる蛍光消光の確認）
各種のフルオロホアがクエンチャーとの“塩基対形成”によって消光することを確認するため、実施例４で合成したオリゴヌクレオチドを用いて蛍光および吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りである。
【００９５】
Ｆａ配列のオリゴヌクレオチド：５μｍｏｌ／ｌ
Ｑｂ配列あるいはＮｂのオリゴヌクレオチド：５μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【００９６】
なお、フルオロホアを含む各種オリゴヌクレオチドＦａの標的核酸として、Ｆａと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（クエンチャー含まず）（Ｎｂ）を別途用意した。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
【００９７】
図３Ａに、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ１（一本鎖）とＦａ−Ｃ３−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖それぞれの２０℃における吸収スペクトルを示し、図３Ｂに、蛍光スペクトルを示す。図３Ａに示すように、チアゾールオレンジに基づく５１５ｎｍの吸収がＱｂ−ＭＲとの二重鎖形成で大きく減少した。この事実は、クエンチャーであるメチルレッドとチアゾールオレンジがスタッキング（積層構造）していることを示している。またＦａ−Ｃ２−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖の融解温度Ｔｍは５４℃と、チアゾールオレンジとメチルレッドの入っていない天然のＤＮＡ二重鎖（５’−ＧＧＴＡＴＣＧＣＡＡＴＣ−３’／３’−ＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧ−５’）のＴｍ（４８℃）より高かった。この事実もチアゾールオレンジとメチルレッドの強固なスタッキングを支持している。同様の吸収スペクトル変化とＴｍの上昇は、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ２／Ｑｂ−ＭＲ，Ｆａ−Ｃ３−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ、およびＦａ−Ｃ３−ＴＯ２／Ｑｂ−ＭＲでも観察された。
【００９８】
蛍光スペクトルも図３Ｂに示すように（５１１ｎｍ励起）、一本鎖状態のＦａ−Ｃ２−ＴＯ１と比べてＦａ−Ｃ２−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖からのチアゾールオレンジに基づく５３３ｎｍの蛍光強度は１／１０に低下した。一方、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ１を相補オリゴヌクレオチド（Ｎｂ）と二重鎖形成させたところ、一本鎖状態のＦａ−Ｃ２−ＴＯ１と比べて５３３ｎｍの蛍光強度が２０℃で２倍に増強した。従ってこの組み合わせでビーコンを作成すると、２０倍程度のシグナル／ノイズ比が期待できることがわかった。
【００９９】
次にペリレンを含むＦａ−Ｃ３−ＰＥを、Ｑｂ−ＭＲあるいはＱｂ−Ａｚｏと二重鎖形成させた。結果を図４に示す。図４に示すように、４２５ｎｍで励起した場合の４６１ｎｍの蛍光強度は、図４に示したように２０℃で一本鎖のＦａ−Ｃ３−ＰＥよりもＱｂ−ＭＲで１／１５に、Ｑｂ−Ａｚｏでは１／３０に低下した。一方、Ｆａ−Ｃ３−ＰＥをＮｂと二重鎖形成させたところ、一本鎖のＦａ−Ｃ３−ＰＥと同程度の蛍光が観察された。従ってペリレンの場合アゾベンゼン組み合わせると、２０℃前後で３０倍程度のシグナル／ノイズ比が期待できることがわかった。
【実施例６】
【０１００】
実施例５の結果に基づいて、以下の表２に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
【化１５】
＊下線部がステム形成鎖である。
なお比較例のMB0Fに用いた５’末端のFITCと３’末端のMRは、本明細書に開示のビーコンへの導入に使用したリンカーと異なり、以下の構造を持つ。
【化１６】
【０１０３】
これらのビーコンのうちMB1-C2-TO1-MR及びMB2-C2-TO1-MRに標的核酸であるＭＢｔを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表３及び表４に示す。
【０１０４】
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１０５】
＜ＭＢ１−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲ＞
ＭＢ１−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲにＭＢ−ｔを加える前後での５２０ｎｍでの励起における５３１ｎｍのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１０６】
【表３】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min
【０１０７】
表３に示すように、このモレキュラービーコン型プローブは、広い温度範囲にわたってバッググランド値（ＭＢ−ｔ添加前）はおおよそ安定し、シグナル強度比も広い温度で安定化していた。後述する比較例との対比から、このモレキュラービーコン型プローブはステムの熱安定性に優れる傾向があることがわかった。また、シグナル強度比も安定化されているため、ＳＮＰや変異などの変異を検出するのに都合がよいことがわかった。
【０１０８】
＜ＭＢ２−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲ＞
ＭＢ２−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲにＭＢｔを加える前と後での、５１０ｎｍでの励起における５３１ｎｍのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下に示す。
【０１０９】
【表４】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min
【０１１０】
表４に示すように、このモレキュラービーコン型プローブは、３０℃〜５０℃にかけてバッググランド（ＭＢ−ｔ添加前）はおおよそ安定し、シグナル強度比もこの範囲で安定化する傾向があった。後述する比較例との対比から、このモレキュラービーコン型プローブはステムの熱安定性に優れる傾向があることがわかった。また、シグナル強度比も安定化されているため、ＳＮＰや変異などの変異を検出するのに都合がよいことがわかった。
【０１１１】
＜比較例：ＭＢ０Ｆ＞
比較例として、ＭＢ−ｃｏｎｔにＭＢｔを加える前後での４９４ｎｍでの励起における５２０ｎｍのＦＩＴＣからの蛍光強度を以下に示す。
【０１１２】
【表５】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１３】
表５に示すように、従来のモレキュラービーコンは、温度上昇とともにバッググランド（ＭＢ−ｔ添加前）が上昇し、４０℃以上で急激に増加した。一方、ハイブリダイゼーションによる発光（ＭＢ−ｔ添加後）は５０℃以上で急激に減少した。この結果、４０℃以上では、急激にシグナル強度比が低下した。ＳＮＰや変異などを検出するには相対的に高いハイブリダイゼーション温度が必要とされることから、ＳＮＰや変異などの検出には不向きであることがわかった。また、このような不安定性から固相反応では一層のバラツキが推測され、固相反応にも不向きであることがわかった。
【０１１４】
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ａｚｏ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＡｚｏにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１１５】
【表６】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１６】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ａｚｏ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＡｚｏにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１１７】
【表７】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１８】
表６及び表７に示すように、ハイブリダイゼーション温度の違いによる蛍光強度比の変化は抑制されていることがわかった。
【実施例７】
【０１１９】
以下に示す化合物Anthは、ケミカル・コミュニケーションズ（Chemical Communications）誌２００６巻５０６２−５０６４に記載の方法で得た。
【化１７】
【０１２０】
（4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、パラ-ニトロソ安息香酸エチル(4-1)を、ジャーナル・オブ・ジ・オーガニック・ケミストリー（Journal of the Organic Chemistry）誌１９７０年第３５巻５０５−５０８頁に記載の方法で合成した。このニトロソ化合物４−１を二口ナスフラスコに入れ窒素置換し、ｐ−メチルチオアニリン４−２を加え、更に酢酸を溶媒として加えて、遮光しながら終夜反応させた。この反応溶液に蒸留水を加えた後に、酢酸エチルを加えて分液漏斗で十分に振とうした。続いて酢酸エチル層を蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒の酢酸エチルを留去した。得られたものを更にシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物４−３を得た（収率５０％）。
【０１２１】
得られた化合物４−３にエタノールと２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶解し、遮光しながら１７時間攪拌した。この後塩酸を加えてｐＨを５程度にしてから酢酸エチルを加えて分液漏斗で十分に振とうした。続いて、酢酸エチル層を蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒の酢酸エチルを留去し、パラ-ニトロソ安息香酸４−４を得た（収率９９％以上）。次に、アゾベンゼンの代わりにパラ-ニトロソ安息香酸４−４を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー４−５を得た。
【０１２２】
【化１８】
【０１２３】
（Cy３を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、Ｃｙ３を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００１年第１２５巻３６１−３６２ページ記載の方法で、Ｃｙ３（５−１）を得た。次に、アゾベンゼンの代わりにＣｙ３（５-１）を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー５−２を得た。
【化１９】
【０１２４】
続いて以下の表６に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【０１２５】
【表８】
【０１２６】
なお、表８にある略号は、以下の図に示したとおりである。なお実施例６の表２に用いた略号も、以下の図と全く同じである。
【化２０】
【０１２７】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるＭＢｔを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表９〜表１５に示す。
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１２８】
１．ペリレン−（4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸による消光−発光の確認
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ｓ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＳにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１２９】
【表９】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３０】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ｓ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＳにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３１】
【表１０】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３２】
表９及び１０に示すように、ペリレンに対して4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、ペリレンをフルオロホアとして、4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸をクエンチャーとして用いることができることがわかった。
【０１３３】
２．ペリレン−アントラキノンによる消光−発光の確認
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３４】
【表１１】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３５】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３６】
【表１２】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３７】
＜ＭＢ３−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ３−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３８】
【表１３】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３９】
表１１〜１３に示すように、ペリレンに対してアントラキノンを用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、ペリレンをフルオロホアとして、アントラキノンをクエンチャーとして用いることができることがわかった。特に、表１３に示すように、ペリレン及びアントラキノンをモレキュラービーコンの対合するステム鎖に２個づつ備えることで、安定した消光と強い発光を確認できた。以上の結果から、ビーコンが閉じた状態での消光が、シグナル強度比の向上に寄与していることが判る。これは対を形成しているペリレンとアントラキノン同士だけで蛍光消光が起きているのではなく、対を形成していない方のアントラキノンへ天然の塩基対を通じて電子が移動したことで蛍光消光が起きたものと考えられる。すなわち、ステム部分に導入した２つのペリレン−アントラキノンの対はそれぞれ独立に機能しているのではなく、安定した消光に相乗的に寄与していることがわかった。
【０１４０】
３．Ｃｙ３−ＭＲによる消光−発光の確認
＜ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲ＞
ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲにＭＢｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６３ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１４１】
【表１４】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１４２】
＜ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲ＞
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲにＭＢｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６３ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１４３】
【表１５】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１４４】
表１４及び１５に示すように、Ｃｙ３に対してメチルレッドを用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、Ｃｙ３をフルオロホアとして、メチルレッドをクエンチャーとして用いることができることがわかった。
【実施例８】
【０１４５】
（MRNO2を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、MRNO2を含むアミダイトモノマーを合成した。4−アミノ−3−ニトロ安息香酸を酢酸と水の混合溶媒に溶解し、これに亜硝酸ナトリウムの塩酸酸性溶液を加え15−20℃で15分間攪拌し、さらに氷水を加えることでジアゾニウム塩の水溶液を得た。次にN,N−ジメチルアニリンの塩酸酸性溶液を氷浴上で0-5℃に保ちつつ、上記ジアゾニウム塩の水溶液を滴下することで、４’−ジメチルアミノ―２−ニトロアゾベンゼン―４−カルボン酸（６−１）を得た。次に、アゾベンゼンの代わりに４’−ジメチルアミノ―２−ニトロアゾベンゼン―４−カルボン酸（６−１）を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー（６−２）を得た。
【化２１】
【０１４６】
続いて以下の表１６に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【表１６】
【０１４７】
表１６にある略号は、以下の図に示したとおりである。なお、表２と表８に用いた略号も、以下の図と全く同じである。
【０１４８】
【化２２】
【０１４９】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるＭＢｔあるいはＭＢｔ２を加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表１７〜表２０に示す。
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１５０】
＜ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２＞
ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５１】
【表１７】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５２】
ＭＢ１−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔ２を加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【表１８】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５３】
＜ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２＞
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５４】
【表１９】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５５】
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔ２を加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５６】
【表２０】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500、励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５７】
表１７〜２０に示すように、Ｃｙ３に対してMRNO2を用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、Ｃｙ３をフルオロホアとして、MRNO2をクエンチャーとして用いることができることがわかった。また、Ｃｙ３の極大吸収波長は５４６ｎｍであり、MRNO２は５１３ｎｍであり、その差は３３ｎｍであった。
さらに、表１７と表１９のように標的核酸がビーコンの蛍光色素側の鎖と二重鎖を形成しても、表１８と表２０のようにビーコンのクエンチャー側の鎖と二重鎖を形成しても、消光−発光現象を確認できた。
【実施例９】
【０１５８】
本実施例では、フルオロホア：クエンチャー（１：２）の会合を形成可能なモデル二重鎖につき、会合に伴う消光能を評価した。まず、以下の各種類の修飾DNAを合成し、クエンチャー色素を二つ連続して導入した場合の消光の程度を観察した。
蛍光鎖 1a-Cy3 5’-GGTATC-Cy3-GCAATC-3’
消光鎖 1b-MR 3’-CCATAG-MR-CGTTAG-5’
1b-NMR 3’-CCATAG-NMR-CGTTAG-5’
1b-2 MR 3’-CCATAG-MR-MR-CGTTAG-5’
1b- 2NMR 3’-CCATAG-MR-MR-CGTTAG-5’
1b-MR-NMR 3’-CCATAG-MR-NMR-CGTTAG-5’
1b-NMR-MR 3’-CCATAG-NMR-MR-CGTTAG-5’
【０１５９】
【化２３】
【０１６０】
次に、蛍光鎖1a-Cy3を0.2 μM、消光鎖を蛍光鎖の2倍過剰（0.4μM）の濃度になるよう、バッファー溶液（[NaCl] = 100 mM、pH 7.0 10 mM リン酸緩衝液）に溶解し、５４６ｎｍでの励起における５６４ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を測定した。結果を表２１に示す。
【０１６１】
【表２１】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：5 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min；測定温度：２０℃
【０１６２】
表２１に示すように、一つのフルオロホアに対して同一あるいは異なるクエンチャーを二つ連続的に導入することで、フルオロホア（Cy3）の蛍光を、より効率的に消光することができることがわかった。
【実施例１０】
【０１６３】
本実施例では、ダブルクエンチャー型ビーコンによる標的核酸検出の感度について評価した。実施例８の結果に基づき、以下の構成のビーコンを設計・合成した。
【０１６４】
（ビーコン）
dqMB1-cy3-NMR 5’-TG-Cy3-GTCCTTGAGAAAGGGCGAC-NMR-NMR-CA-3’
dqMB2-cy3-NMR 5’-TGG-Cy3-TCCTTGAGAAAGGGCGA-NMR-NMR-CCA-3’
Mb1-cy3-NMR 5’-TG-Cy3-GTCCTTGAGAAAGGGCGAC-NMR-CA-3’
Mb2-cy3-NMR 5’-TGG-Cy3-TCCTTGAGAAAGGGCGA-NMR-CCA-3’
（標的核酸）
Sba 3’-ACCAGGAACTCTTTCCCG-5’
Sbb 3’-GAACTCTTTCCCGCTGGT-5’
【０１６５】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるSbaあるいはSbbを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。５４６ｎｍでの励起における５６４ｎｍの蛍光強度から算出した結果を表２２に示す。
（蛍光スペクトル測定条件）ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ；標的核酸の濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ；塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ；リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１６６】
【表２２】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500、；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min；測定温度：２０℃
【０１６７】
以上のように、フルオロホアとクエンチャーのステム内の位置に依存せず、良好なS/N比を示した。特に、感度の低かったMb2-cy3-NMRにおいて、ダブルクエンチャー型にすることで(dbMB2-cy3-NMR)、S/N比の顕著な改善効果があることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドプローブには、蛍光を自己生成するプローブがある。こうした蛍光自己生成プローブとして、モレキュラービーコンが知られている。モレキュラービーコンは、標的核酸をハイブリダイズすると検出可能な蛍光シグナルを発するオリゴヌクレオチドである（特許文献１）。モレキュラービーコンは、ステム・ループ構造を有しており、蛍光物質（フルオロホア）と蛍光発色阻害物質（クエンチャー）とを両末端に有する人工オリゴヌクレオチドである。モレキュラービーコンは、通常、単鎖の状態では、ステム領域が二重鎖を形成し、両末端に導入したフルオロホアとクエンチャーとが互いに近接する結果、フルオロホアの蛍光がクエンチャーにより消光されている。一方、プローブ中のループ領域の塩基配列と相補的であるオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたときには、フルオロホアとクエンチャーとが引き離されて蛍光シグナルが発せられる。このようなモレキュラービーコンをプローブとして用いることで、ターゲットを蛍光標識しなくても標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出することができる。
【０００３】
従来この種のモレキュラービーコンは、リアルタイムＰＣＲ等において増幅産物の検出に用いられるなど液相反応を主体に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３２９２０９号公報
【発明の概要】
【０００５】
モレキュラービーコンは、ステムの融解温度より十分低い温度では安定したステムを形成して消光するが、標的核酸が存在すると標的核酸とのハイブリダイゼーションによりステムが開いてフルオロホアに基づく蛍光を発する。しかしながら、このような標的核酸との挙動及び発色強度は、温度によって大きく変化する。すなわち、ステムの融解温度よりも低い温度条件下で標的核酸が存在するとモレキュラービーコンは標的核酸と二重鎖を形成して蛍光を発するが、温度が上がれば、モレキュラービーコンは、標的核酸から離れて消光してしまう。したがって、標的核酸非存在時の消光状態を確保してバックグラウンドを低下させるためには、ステムの融解温度を十分に高くして安定した消光状態を形成させるようにする必要がある。同時に、標的核酸とモレキュラービーコンとハイブリダイズをより確実に検出するには、モレキュラービーコンと標的核酸との融解温度をできるだけ高くしステムの融解温度に近づけることが好ましい。
【０００６】
しかしながら、モレキュラービーコン全体の長さにはある程度制限があるため、ステムの融解温度を上げるためにステムを長くすると、プローブの設計自由度が低下し標的核酸の検出特異性が低下するおそれがあった。
【０００７】
また、特に、多種類の標的核酸にそれぞれ対応して検出するモレキュラービーコンを固相担体に固定化したモレキュラービーコンアレイを考慮したとき、検出精度を確保するためには、ステムの融解温度を高めるとともに十分に長い標的核酸とハイブリダイズ可能に設計するのが好ましい。しかしながら、上記した同様の理由から、モレキュラービーコンでこれらの双方を同時に実現することは困難であった。
【０００８】
すなわち、従来のモレキュラービーコンでは、バックグラウンドを抑制しつつ標的核酸に対する特異性を確保することは極めて困難であった。
【０００９】
そこで、本発明は、より設計自由度が高く汎用性の高い蛍光オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用を提供することをその目的とする。
【００１０】
本発明者らは、ステムの形成に伴うによる近接効果及び標的核酸との二重鎖形成による離反効果にのみ大きく依存して消光・発光するのでなく、ステムの形成によって近接されることで安定なスタック構造を形成できるようにフルオロホアとクエンチャーとを配置することにより、より確実に消光できしかもステム熱的安定性を向上できるという知見を得た。また、標的核酸との二重鎖形成時にフルオロホアを標的核酸との二重鎖内にくるようにすることで発光を増強できる場合があるという知見を得た。これらの知見に基づき本発明者らは、本発明を完成するに至った。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、前記ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される以下の式（１）で表されるユニットに連結される少なくとも１個のフルオロホアと、
【化１】
（式中、Ｘはフルオロホアを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアと対合可能な部位に配置される以下の式（２）で表されるユニットに連結される少なくとも２個のクエンチャーと、
【化２】
（式中、Ｙはクエンチャーを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
を備える、プローブが提供される。なお、上記式（１）及び（２）において、ホスホジエステル結合におけるリン酸基（ＰＯ3-）は、非解離型（ＰＯ3Ｈ）であってもよい。
【００１２】
本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、前記フルオロホアは、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖の内部に配置されていることが好ましい。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブにおいては、前記フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香族環系色素及びキサンテン系色素からなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、アゾ系色素からなる群から選択されるいずれかであることが好ましい。より好ましくは、前記フルオロホアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、 チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかであることが好ましい。
【００１３】
また、前記フルオロホアは、縮合芳香環系色素であり、前記クエンチャーは、アントラキノン又はその誘導体であることが好ましく、前記フルオロホアはペリレンであり、前記クエンチャーはアントラキノンであることがより好ましい。
【００１４】
また、本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブは、一つの前記ステムと一つの前記ループを形成可能であることが好ましい。
【００１５】
本明細書の開示によれば、標的核酸を検出するためのプローブ固定化体であって、固相担体と、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、前記固相担体に保持された上記いずれのオリゴヌクレオチドプローブと、を備える、固定化体が提供される。本明細書に開示のプローブ固定化体において、前記固相担体は、プレート状体であることが好ましい。また、本明細書に開示のプローブ固定化体は、複数の標的核酸をそれぞれ検出可能な複数のオリゴヌクレオチドプローブをアレイ状に備えることが好ましい。また、本明細書に開示のプローブ固定化体は、ＳＮＰｓ又は遺伝子変異の検出用であることが好ましい。
【００１６】
本明細書の開示によれば、標的核酸の検出方法であって、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する、方法が提供される。
【００１７】
本明細書の開示の検出方法においては、複数の標的核酸に対応してハイブリダイゼーション可能な複数の前記オリゴヌクレオチドプローブを固相担体上に保持した固定化体を用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブの概要をその一例を挙げて説明する図である。
【図２】本明細書の開示のオリゴヌクレチドプローブをモレキュラービーコン型プローブとした場合の一例を示す図である。
【図３Ａ】チアゾールオレンジを備える各種オリゴヌクレオチドの吸収スペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】チアゾールオレンジを備える各種オリゴヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】ペリレンを備えるオリゴヌクレオチドの蛍光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書の開示は、蛍光オリゴヌクレオチドプローブに関し、さらに、当該プローブの固定化体、当該プローブを利用した標的核酸の検出方法に関する。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブによれば、標的核酸が存在しないときには、ステムにおいて１個のフルオロホアと２個のクエンチャーが安定したスタック構造を形成して熱的安定性を高めるとともに安定的に消光する。一方、標的核酸が存在するときには、オリゴヌクレオチドプローブは、その中の標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖（以下、プローブ配列ともいう。)において、標的核酸とハイブリダイゼーションする。この結果、ステムが崩壊し、フルオロホアはクエンチャーにより消光されなくなり蛍光を発する。
【００２０】
本明細書の開示のオリゴヌクレオチドプローブによれば、ステムがフルオロホアとクエンチャーとにより熱的に安定化されているため、より高い融解温度を得やすくなり、しかもより長いあるいはより多様な標的核酸（プローブ配列）を選択することができる。このため、標的核酸の種類、ハイブリダイゼーション条件に応じて、オリゴヌクレオチドプローブをより高い自由度で設計できる汎用性に優れたオリゴヌクレオチドプローブが提供される。また、１個のフルオロホアに対して２個のクエンチャーを対合させることにより、バックグラウンドレベルをより低減してより高い感度で標的核酸を検出できる。
【００２１】
さらに、フルオロホアとクエンチャーとを、従来のモレキュラービーコンのようにその両末端に位置させる必要がないため、固相担体への固定化が容易であり、固定化による消光や蛍光への影響を回避又は抑制できる。
【００２２】
以下、本明細書に開示される手段の実施形態として、蛍光オリゴヌクレオチドプローブ、その固定化体及び標的核酸の検出方法について、適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本明細書の開示の蛍光オリゴヌクレオチドプローブの一例としてのモレキュラービーコン型プローブの作用を示す図であり、図２は、モレキュラービーコン型プローブを固相担体上に備えた状態の一例を示す図である。
【００２３】
なお、本明細書においてオリゴヌクレオチドは、検出しようとする天然、天然由来の及び非天然のＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイゼーションする機能を発揮可能に天然あるいは非天然の塩基、ヌクレオチドやヌクレオシドを備えるものであればよい。また、オリゴヌクレオチドは、プローブとしての用途を考慮するとおおよそ１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒ程度を意味するが、特にその数を限定するものではなく１００ｍｅｒを越える場合であっても、本明細書においてオリゴヌクレオチドプローブに含まれる。また、本明細書において標的核酸とは、採取源等特に限定するものではなく、検出しようとする天然、天然由来のあるいは非天然のＤＮＡ（１重鎖であっても２重鎖であってもよい。）やＲＮＡ（１重鎖であっても、２重鎖であってもよい）、あるいはこれらのキメラ及びハイブリットとすることができる。なお、天然由来のＤＮＡとは、天然のＤＮＡの塩基配列に基づいて遺伝子工学的、酵素合成にあるいは化学合成により作製したＤＮＡを意味する。
【００２４】
（オリゴヌクレオチドプローブ）
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、図１及び図２に示すように、ステム及びループを形成可能であり、そのステムにおいてフルオロホアとクエンチャーとを備えている。
【００２５】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１個のステムと少なくとも１個のループを形成可能であればよく、それぞれを複数個形成可能であってもよい。したがって、図１及び図２に示すように１個のステムと１個のループとを備えるいわゆるモレキュラービーコン型のプローブを形成可能であってもよいし、ｔＲＮＡあるいはその類の構造体などの、複数のステム及び複数のループを形成可能であってもよい。後述するように、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、最も簡易なモレキュラービーコン型を採ることでも、十分な検出特異性を得ることができる。
【００２６】
なお、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブがステム及びループを形成可能であるとは、互いに対合して少なくとも１個のステムを形成する一対のステム形成鎖を備えるとともに、当該ステム形成鎖によって形成されるステムに連続してループを形成するループ形成鎖を備えていることが意味している。本明細書において、単にステム又はループに言及するとき、これらが形成された状態を意図している。
【００２７】
ステムを形成するステム形成鎖の長さは特に限定しないが、それぞれのステム形成鎖は、４以上９以下の塩基対を形成する鎖長とすることができる。モレキュラービーコン型プローブとしては、８以上４０以下の塩基対を形成する鎖長とすることが好ましく、より好ましくは１５以上３０以下である。なお、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブにおけるステムは、オリゴヌクレオチド鎖の両末端側で構成されるものに限定されない。一方のステム形成鎖がオリゴヌクレオチドプローブの末端以外の部分にあって他方のステム形成鎖が当該プローブ末端にあってもよいし、双方のステム形成鎖がプローブ末端以外の部分にあってもよい。
【００２８】
また、ループを形成可能なループ鎖の長さも特に限定しないが、５以上４０以下程度とすることができる。例えば、モレキュラービーコンとしては、８以上３０以下とすることが好ましく、より好ましくは１０以上２０以下である。
【００２９】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１個のステムの一方のステム形成鎖に少なくとも一つのフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に少なくとも２つのクエンチャーを備えており、一つのフルオロホアに対して２つのクエンチャーが対合可能に配置されている。すなわち、一つのフルオロホアと２つのフルオロホアからなる対合ユニットを、ステムにおいて形成可能となっている。対合ユニットの数や配置形態は特に限定されない。図１に示すように、対合ユニットはステムにおいて１個であってもよいし、２個以上であってもよい。また、対合ユニットは、例えば、図１に示すように、一方のステム形成鎖において一つのフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に２つのクエンチャーを備えて、対合ユニットを形成できるが、この対合ユニットに加えて、一方のステム形成鎖に複数のフルオロホアを備え、他方のステム形成鎖に複数のクエンチャー（複数のフルオロホアの２倍数）を備えて、フルオロホアの個数に対応する対合ユニットを形成してもよい。さらに、一方のステム形成鎖に一つの対合ユニットのフルオロホアを備え、他の一つの対合ユニットのクエンチャーを備えるようにしてもよい。
【００３０】
こうした対合ユニットを形成可能とすることで、プローブの末端でなく、より内側で、５’末端または３’末端から３塩基相当部位あるいは４塩基相当部位より内側となるようなステム内位置でも感度よくターゲット配列を検出できるようになる。すなわち、オリゴヌクレオチドの配列中にあってもその配列に依存性を抑制できる。また、ターゲット配列がループからステムに及ぶような場合であっても、感度よく、ターゲット配列を検出できるようになる。
【００３１】
一つのステムにおいて複数個の対合ユニットを形成可能とする場合、異種類のフルオロホアを用いることもできるが、好ましくは、同一波長域で検出可能な蛍光を発し、同程度に消光するフルオロホアの組み合わせを用いることが好ましい。より好ましくは、同一のフルオロホアを用いる。また、一つの対合ユニットにおいて２つのクエンチャーは消光可能である限り、同つであっても異なっているもよいが、同一であってもよい。
【００３２】
一つの対合ユニットを構成する２つのクエンチャーは、一つのステム形成鎖に連続して備えられている。すなわち、２つのクエンチャー間には、ヌクレオチドを含んでいない。複数の対合ユニットを形成可能とする場合には、隣合う対合ユニットの同一のステム形成鎖上のフルオロホアの間には１以上のヌクレオチドがあってもよいし、なくてもよいが、フルオロホアの会合によるクエンチが起きる場合は、ヌクレオチドが１以上あるほうが好ましい。同様に、隣合う対合ユニットの同一のステム形成鎖上のクエンチャーの間には１以上のヌクレオチドがあってもよいし、なくてもよい。介在されるヌクレオチドにおける塩基は、特に限定しないで、プリン系塩基及び／又はピリミジン系塩基から選択されてもよいし、人工的に合成された塩基であってもよい。
【００３３】
また、対合するステム形成鎖において、フルオロホア及びクエンチャーは、いずれもオリゴヌクレオチドプローブの５’末端及び３’末端よりも外側に連結されるものではない。フルオロホア及びクエンチャーは、最も末端側にある場合であっても、最末端のヌクレオチドよりも内側（最末端が５’末端の場合にはより３’側に、同３’末端の場合にはより５’末端側に）に備えられている。
【００３４】
フルオロホアは、上記のとおりステム内に配置されるが、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブのプローブ配列の内部に配置される。フルオロホアは、その種類により標的核酸とのハイブリダイゼーションにより二重鎖を形成したとき、その二重鎖内にインターカレーションされることで、蛍光が増強されることがあるからである。このようなフルオロホアについては後述する。
【００３５】
フルオロホア及びクエンチャーは、また、隣接するヌクレオチドの塩基の種類やさらにそのヌクレオチドに隣接する遠位のヌクレオチドの塩基種類も特に限定されない。
【００３６】
フルオロホアは、ステム形成鎖のヌクレオチド間に式（１）で表されるユニットにＸとして含まれている。フルオロホア（Ｘ）は、ユニットの一部としてあるいはＹ以外のユニット部分に連結されて、結果としてステムに備えられる。式（１）における、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を意味している。Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を意味している。ただし、Ｒ2は、Ｒ1のポリアルキレン鎖の５’側の酸素原子から２つ目の炭素原子に結合していることが好ましい。Ｚは、直接の結合であってもよいし、フルオロホアとの連結基であり特に限定されない。例えば、−ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＳ−、ＣＯＮＨ−、−Ｏ−等あるいはこれらの基を含むものが挙げられる。
【００３７】
上記Ｒ1〜Ｒ2の置換基としては、未置換の又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基で当業者で置換された炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基又はアルコキシ基；未置換又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基若しくはアルキニル基；水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基等が挙げられる。さらに、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はカルボキシ基が挙げられる。Ｒ1の置換基は、アルキレン鎖のいずれの炭素原子に連結されていてもよいが、Ｒ2と同様に、５’の酸素から２つ目又は３つ目の炭素原子に連結されることが好ましい。
【００３８】
ステムにおいて対合されるフルオロホア及びクエンチャーに関し、式（１）及び式（２）における、Ｒ1におけるアルキレン鎖の炭素数は、同一であっても異なっていてもよい。
【００３９】
例えば、式（１）又は式（２）で表されるユニットとして以下のものが挙げられる。
【００４０】
【化３】
【化４】
【化５】
【００４１】
式（１）においてＸはフルオロホアを表す。フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、アクリジン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、フラビン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素等が挙げられ、これらから適宜選択して使用できる。なかでも、シアニン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、縮合芳香族環色素、キサンテン系色素が好ましく用いることができる。より好ましくは、Ｃｙ３，Ｃｙ５，チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群から選択されるいずれかである。なかでもチアゾールオレンジなどのシアニン系色素をもちいることが好ましい。フルオロホアとして使用する化合物は、式（１）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよいし、クエンチャーとの対合を考慮して連結基との間に、置換されていてもよいアルキレン鎖、アルケニレン基、アルキニレン基が付与されていてもよい。また、式（１）で表されるユニットに対して連結されるフルオロホア上の原子は特に限定されない。
【００４２】
インターカレーションにより蛍光が増強するフルオロホアとしては、チアゾールオレンジ、オキサゾールオレンジ、ペリレン等が挙げられる。これらのフルオロホアは、プローブ配列内部に配置させてインターカレートさせることが好ましい。一方、フルオロホアやR1、R2の組み合わせにより、フルオロホアの蛍光強度がインターカレートによって減少する場合には、フルオロホアはインターカレートしないようにし、反対にクエンチャーがインターカレートするようにビーコンを設計する方が好ましい。
【００４３】
式（１）において連結されるフルオロホア（Ｘ）としては以下ものが挙げられる。なお、以下の例の各種化合物は例示であり、水素原子はいずれも適宜置換基で置換されていてもよい。また、連結基への連結部分（点線部分）において、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基を介在させてもよい。
【００４４】
【化６】
【化７】
【００４５】
クエンチャーは、ステム形成鎖のヌクレオチド間に以下の式（２）で表されるユニットに含まれている。すなわち、クエンチャー（Ｙ）は、ユニットの一部としてあるいはＹ以外のユニット部分に連結されて、結果としてステムに備えられる。式（２）における、Ｒ1、Ｒ2及びＺは、式（１）におけるのと同義である。また、Ｒ1〜Ｒ2の置換基も式（１）におけるのと同義である。
【００４６】
式（２）においてＹはクエンチャーを表す。クエンチャーとしては、使用するフルオロホアとを本明細書に開示におけるスタック構造の形成により消光できるものであれば特に限定されないが、例えば、アゾベンゼン及びその誘導体が挙げられる。これらはいずれも光異性化する化合物であるが、-N=N-の存在により消光作用を奏するものと考えられる。クエンチャーとしては好ましくは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかである。典型的なアゾ系クエンチャーは、ペリレンなどの多環縮合系のフロオロホアとの関係において、フルオロホアのＨＯＭＯがクエンチャーのＨＯＭＯより低いタイプのクエンチャーで、換言すれば還元力の強いクエンチャーであるということができる。
【００４７】
また、クエンチャーとしては、アントラキノン骨格を有する化合物が挙げられる。アントラキノン骨格を有する化合物としては、アントラキノンの他、アントラキノンのベンゼン環を構成する炭素原子に結合する１個又は２個以上の水素原子を、水酸基、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、ハロゲン原子、アルキルアミノ基等から選択される１種又は２種以上の官能基で置換した各種のアントラキノン誘導体が挙げられる。各種のアントラキノン誘導体は、例えば、東京化成株式会社等からから容易に入手できる。例えば、アントラキノン誘導体としては、天然には、コチニール色素、アリザリン等のアカネ色素、ラック色素の化合物が挙げられる。アントラキノン誘導体としては、フルオロホアよりも低いＬＵＭＯを持つアントラキノン誘導体ならば、どのような誘導体でも使用することが出来るが、ニトロ基やカルボキシル基など、ＬＵＭＯのエネルギー準位を上げない電子吸引性の置換基が好ましい。好ましくはアントラキノンである。アントラキノンなど典型的なアントラキノン系のクエンチャーは、ペリレンなどの縮合芳香環系のフロオロホアとの関係において、フルオロホアのＬＵＭＯがクエンチャーのＬＵＭＯより高いという条件を満たしたクエンチャーで、酸化力の強いクエンチャーということができる。
【００４８】
また、クエンチャーは、消光能力の観点から、その極大吸収波長が、対を形成するフルオロホアの極大吸収波長との差が１５０ｎｍ以内であることが好ましい。クエンチャーの極大吸収波長とフロオロホアの極大吸収波長との差は、より好ましくは１００ｎｍ以内であり、さらに好ましくは５０ｎｍ以内である。さらに、クエンチャーの極大吸収波長は、フルオロホアの極大吸収波長よりも短波長側にあることが好ましい。用いるフルオロホアとの関係で、クエンチャーの極大吸収波長を制御することで、クエンチャーを最適化することができる。
【００４９】
クエンチャーの極大吸収波長の制御（長波長側又は短波長側へのシフト）は、例えば、クエンチャーの基本骨格に対して電子吸引性基や電子供与性基などを導入するなどによって可能である。例えば、後段の〔化８Ｂ〕に示すように、メチルレッド等のアゾベンゼン系骨格のアゾ基に対してオルト位又はパラ位に電子吸引性基（例えば、ニトロ基、ハロゲン）や電子供与性基（例えば、メトキシ基）を適宜導入することが考えられる。
【００５０】
クエンチャーとして使用する化合物は、式（２）で表されるユニットに連結されるために適宜誘導体化されていてもよいし、クエンチャーとの対合を考慮して連結基との間に置換されていてもよいアルキレン鎖が付与されていてもよい。また、クエンチャーの連結基との連結部分は、適宜選択される。
【００５１】
式（２）において連結されるクエンチャー（Ｙ）としては以下のものが挙げられる。なお、以下の例の各種化合物は例示であり、水素原子はいずれも適宜置換基で置換されていてもよい。また、連結基への連結部分（点線部分）において、置換されていてもよいアルキレン基、アルケニレン基又はアルキニレン基を介在させてもよい。また、式（２）で表されるユニットに対して連結されるフルオロホア上の原子は特に限定されない。
【００５２】
【化８Ａ】
【００５３】
【化８Ｂ】
【００５４】
【化９】
【００５５】
なお、本明細書に開示におけるフルオロホアとクエンチャーとの組合せは、以下に示す蛍光消光作用に基づいて選択することができる。一般に蛍光消光は、１）フェルスター型の励起エネルギー移動、２）電子移動型の二種類がある。フェルスター型のエネルギー移動に基づく蛍光消光では、フルオロホアの蛍光スペクトルとクエンチャーの吸収スペクトルが重なっている必要がある。従ってフェルスター型の励起エネルギー移動を利用する場合は、このような条件を満足するようなフルオロホアとクエンチャーの組み合わせを選ぶのが好ましい。なおフェルスター型ならばフルオロホアとクエンチャーの距離が２〜１０ｎｍ離れていても消光させることが出来るが、本明細書に開示ではフルオロホアとクエンチャーが接触しているので、蛍光−吸収スペクトルの条件さえ満たしていればフェルスター型で十分に消光可能である。
【００５６】
一方２）の電子移動型では、フルオロホアとクエンチャーそれぞれの最高被占軌道（ＨＯＭＯ）と最低空軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー順位の関係が重要である。フルオロホアの蛍光のメカニズムは、ＨＯＭＯからＬＵＭＯに励起された電子が再びＨＯＭＯに戻る際に、励起エネルギーを蛍光という形で放出することに基づく。フルオロホアのＨＯＭＯにある二つの電子のうち一つが光励起されてＬＵＭＯに移動すると、フルオロホアのＨＯＭＯが空になる。クエンチャーのＨＯＭＯのエネルギー順位がフルオロホアのＨＯＭＯより高い場合には、空になったフルオロホアのＨＯＭＯに、クエンチャーのＨＯＭＯにある電子が移動する。すると励起されたフルオロホアの電子は、元のＨＯＭＯに戻れなくなるので、蛍光を発することが出来ない。またクエンチャーのＬＵＭＯがフルオロホアのＨＯＭＯより低い場合は、励起されてＬＵＭＯに遷移した電子がクエンチャーのＬＵＭＯに移動するため、元のＨＯＭＯに戻れなくなり、蛍光を発することが出来ない。すなわち電子移動型での蛍光消光は、１）フルオロホアのＨＯＭＯがクエンチャーのＨＯＭＯより低い、あるいは２）フルオロホアのＬＵＭＯがクエンチャーのＬＵＭＯより高いという条件を満たした組み合わせが好ましい。更に電子移動は短距離でしか起きないので、フルオロホアとクエンチャーは接触していることが望ましい。本明細書に開示ではフルオロホアとクエンチャーが接触（スタッキング）しているので、上記の条件さえ満たした組み合わせならば電子移動型で十分に消光可能である。なお、本明細書に開示のフルオロホアとクエンチャーの組み合わせは、ほとんどが電子移動型の消光を起こすための条件を満たしている。
【００５７】
なお、アントラキノン又はその誘導体によるペリレン等の縮合芳香環系フルオロホアのクエンチは、励起電子がアントラキノンのLUMOへ移動することで起きる。すなわち“電子トラップ”によるクエンチである。電子移動型のクエンチ現象は、本来的に電子が移動しやすいことのほか、アントラキノン系クエンチャーと縮合芳香環系フルオロホアとによる対合形成が強固であることによって一層電子移動が促進されていることが推論される。アントラキノン系クエンチャーと縮合芳香環系フルオロホアとの対合の数が増加することにより、それに応じてこうした電子移動型のトラップ現象が一層強化されるとともに、フルオロホアから対を形成していない方のクエンチャーへ天然の塩基対を通じて電子が移動しやすくなっていることでさらに強化されるものと考えられる。一方、アゾ系のクエンチャーは、フルオロホアの励起でＨＯＭＯに生じた正孔（ホール）に、アゾ系のクエンチャーのＨＯＭＯに存在する電子が移動することによるクエンチ、すなわち“ホールトラップ”型である。ホールよりも電子の方が移動度が大きいため、“電子トラップ”型のペリレン−アントラキノンの方が効率よくクエンチすることができる。
【００５８】
フルオロホア及びクエンチャーを導入することは、例えば、通常の固相合成法において、ヌクレオチドに対応するアミダイト誘導体に代えてこの種のユニットを導入なアミダイド誘導体を用いることによって可能となる。例えば、Ｄ−トレオニールや３−アミノ１，２−プロパンジールなどのアミノアルキルジオール類のアミノ基をアリルオキシカルボニル基などの適当な保護基で保護した上、一方の水酸基をジメトキシトリチルクロリド等で保護し、その後、他方の水酸基に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイドを導入する。そしてこのアミダイト体に対して、フルオロホア又はクエンチャーを導入してアミダイトモノマー化してもよい。例えば、アゾベンゼン系化合物、ペリレン系化合物については、例えば、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００３年１２５巻２２１７−２２２３頁記載の方法で、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）誌２００７年第４８巻６７５９−６７６２頁記載の方法を適用することができる。こうしたモノマーを取得した場合には、従来公知のＤＮＡ合成法、例えばネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法にしたがって、所望の部位にフルオロホア又はクエンチャーを連結したユニットを備えるオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００５９】
また、フルオロホアやクエンチャーは、アリルオキシカルボニル基等でアミノ基を保護した上記アミダイト体を所望の位置に備えるオリゴヌクレオチドを合成後に導入してもよい。例えば、アミノ基を保護したままのユニットを備えたオリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上においてアミノ基を脱保護した後、当該アミノ基と反応可能にカルボン酸基やイソシアネート基を導入したあるいは保持するフルオロホアやクエンチャーを反応させることで、フルオロホア等を導入してもよい。
【００６０】
以上説明した本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光シグナルを自己生成するプローブであるため、標的核酸を蛍光物質等で標識する必要がないことのほか、標的核酸の設計自由度が高く、高い特異性での検出が可能となる利点がある。さらに、ステム内にフルオロホア及びクエンチャーを備えることから、固相担体への固定化の容易性ほか固定化が発光・消光に及ぼす影響を回避又は抑制することができる。
【００６１】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、従来モレキュラービーコンが適用されるリアルタイムＰＣＲなどの液相での標的核酸の検出のほか、遺伝子発現パターン、疾患分類、疾病等の原因遺伝子解析、遺伝子診断などの遺伝子発現モニタリング、ＳＮＰなどの多型検出、各種変異の検出に有利である。特に、多型や変異などの検出に有利であり、さらに網羅的な多型や変異の検出に有利である。特に、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブのフルオロホア及びクエンチャーを備えるステムは、フルオロホア及びクエンチャーを含まない以外は同一のステムよりも熱的安定性が高くなり、Ｔｍが上昇する。このため、長い配列を標的核酸とするプローブ配列を備えることができ、特異性の高いＤＮＡ解析が可能となる。また、複数の好ましくは数十以上の多数のＳＮＰや変異部位などを有する標的核酸を同時に検出可能なモレキュラービーコンプローブを固定化するアレイにあっては、多数の標的核酸に区別するのに十分に長いプローブ配列を備える必要がある。従来のモレキュラービーコンの場合、ステムを長くするとループをこのような場合には、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、ステムのＴｍが高くしかもフルオロホアを含んだ範囲をプローブ配列とすることができ、結果としてプローブ配列をより長く確保できる点において有利である。
【００６２】
（プローブ固定化体）
本明細書に開示のプローブ固定化体は、固相担体と、前記標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることができる。本明細書に開示のプローブ固定化体においては、モレキュラービーコンをプローブとして用いることが好ましい。
【００６３】
固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のオリゴヌクレオチドプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよい。
【００６４】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、その末端にフルオロホアとクエンチャーとを備えていないため、固相担体への固定化を従来と同様の手法で容易に行うことができる。
【００６５】
このようなプローブ固定化体の用途は特に限定されないで、遺伝子発現パターン、疾患分類、疾病等の原因遺伝子解析、遺伝子診断などの遺伝子発現モニタリング、ＳＮＰなどの多型検出、各種変異の検出に有利である。特に、多型や変異などの検出に有利であり、さらに網羅的な多型や変異の検出に有利である。
【００６６】
（標的核酸の検出方法）
本明細書に開示の標的核酸の検出方法は、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブであって、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記モレキュラービーコンの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する方法とすることができる。本明細書に開示の検出方法においては、オリゴヌクレオチドプローブはモレキュラービーコンであることが好ましく、より好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブ（典型的にはモレキュラービーコン）を固相担体に固定化した固定化体を用いることが好ましい。
【００６７】
本明細書に開示の検出方法においては、例えば、以下のように実施することができる。まず、複数の標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能なモレキュラービーコンを固相担体に固定化したアレイを準備する。その後、標的核酸を含む可能性のある核酸試料（典型的には、血液や組織から採取した生体試料から核酸を抽出して得られたもの又はさらに一定条件下ＰＣＲ等で増幅したものなど）を、所定組成のハイブリダイゼーション液の存在下にアレイ上のモレキュラービーコンに供給する。所定のハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーション温度は、ステムのＴｍ及びプローブ配列と標的核酸とのＴｍのいずれよりも低い温度とすることが好ましい。予め定めた間経過後、アレイを洗浄し、核酸試料中に存在した標的核酸とのハイブリダイゼーションをフルオロホアの発する蛍光シグナルを検出することによって行う。蛍光シグナルの検出は、蛍光スキャナー等により行うことができる。取得した蛍光シグナルに基づき、標的核酸の検出、同定、定量等に必要な解析を行う。
【００６８】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書に開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００６９】
（アリルオキシカルボニル（(allyloxy)carbonyl ）基で保護したD-トレオニノール（D-threoninol）のアミダイトモノマー化 ）
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット（炭素数３）のアミダイトモノマー（化合物Ａ）を以下のスキームに従い合成した。３００ｍｌのナスフラスコにＤ−トレオニノール（０．９９ｇ，９．４１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）７５ｍｌに溶解させ、トリエチルアミン１５ｍｌを加え、攪拌した。次に、７５ｍｌのＴＨＦに溶解させておいたクロロギ酸アリル（１．０１ｍｌ，９．５１ｍｍｏｌ）を、氷浴中で上記のＴＨＦ溶液に滴下した。１５分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、ＴＨＦ溶液を滴下し終わってから１時間３０分後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物１−１を得た。
【００７０】
【化１０】
【００７１】
次に、得られた化合物１（１．７２ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン３０ｍｌを加えて溶解させ、これにＮ，Ｎ，ジイソプロピリエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：１．５４ｍＬ、９．０９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。次に、５０ｍｌの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ：３．０８ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：０．１４ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン１０ｍｌを加えて溶解させた。えこのジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。１５分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後４時間３０分後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝６６：３３：３）で精製し、化合物１−２を得た。
【００７２】
化合物１−２（０．７４ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を二口ナスフラスコに採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル３０ｍｌを加えて溶解させ、これに更に２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ¢，Ｎ¢ −ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄｉｔｅ：０．５４ｇ，１．７９ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。別の二口ナスフラスコに１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ：０．１３７ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を採取し、脱水アセトニトリル８ｍｌで３回共沸して水分を除去した後、脱水アセトニトリル１５ｍｌを加えて溶解させた。この１Ｈ−テトラゾール溶液を、上記の化合物１−２のアセトニトリル溶液に氷浴下で滴下し、１５分程度攪拌した後に氷浴を除き、室温に戻して更に攪拌を続けた。この後およそ１時間３０分程度で反応を停止した。この後溶媒をエバポレーターで留去した後、残ったオイル状の化合物に酢酸エチルを加えて溶解した。この酢酸エチル溶液を、分液ロートを用いて重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で２回振とうし、続いて塩化ナトリウムの飽和水溶液で同様に２回振とうした。この後、硫酸マグネシウムを加えて水分を除いてから酢酸エチルをエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：３）精製し、化合物Ａを得た。
【実施例２】
【００７３】
（アリルオキシカルボニル（(allyloxy)carbonyl ）基で保護した３−アミノ１，２−プロパンジオール（3-amino-1,2-propanediol）のアミダイトモノマー化）
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット（炭素数２）のアミダイトモノマー（化合物Ｂ）を以下のスキームに従い合成した。
【００７４】
【化１１】
【００７５】
２００ｍｌのナスフラスコに３−アミノ１，２−プロパンジオール（３−ａｍｉｎｏ−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）（１．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに溶解させ、トリエチルアミン１５ｍｌを加え、攪拌した。次に、２０ｍｌのＤＭＦに溶解させておいたクロロギ酸アリル（１．４ｍｌ，１１ｍｍｏｌ）を、氷浴中で上記のＤＭＦ溶液に滴下した。１５分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、ＤＭＦ溶液を滴下し終わってから２時間後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物１−３を得た。原料として化合物１−３を使用する以外は実施例１と同様の方法で化合物１−４続いて化合物Ｂを得た。
【００７６】
以下に示す化合物Ｃはネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、化合物Ｄはジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００３年１２５巻２２１７−２２２３頁記載の方法で、化合物Ｅはテトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）誌２００７年第４８巻６７５９−６７６２頁記載の方法で得た。
【００７７】
【化１２】
【実施例３】
【００７８】
（チアゾール・オレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）の合成）
本実施例では、フルオロホアとしてのチアゾールオレンジ誘導体を以下のスキームに従い、合成した。
【００７９】
【化１３】
【００８０】
２００ｍｌのナスフラスコに２−（メチルチオ）ベンゾチアゾール（２．０４ｇ，１１．３ｍｍｏｌ）を秤り取り、５ｍｌのエタノールを加えて溶解させ、この溶液にヨードメタン（１．５ｍｌ、２４．１ｍｍｏｌ）を加えてから６５℃で３時間加熱還流した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−１（０．５２ｇ）を得た。
【００８１】
次に２００ｍｌのナスフラスコにブロモ酢酸（１．９４ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を秤取り、酢酸エチル１０ｍＬを加えて溶解させた。これにレピジン（２ｍｌ、１５．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間３０分攪拌した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−２（０．４１ｇ）を得た。上記と同様に次に２００ｍｌのナスフラスコにブロモ酪酸（８．０８ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）を秤取り、酢酸エチル１０ｍｌを加えて溶解させた。これにレピジン（７ｍｌ、５２．８ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で終夜攪拌した。生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、化合物２−３（４．８５ｇ）を得た。
【００８２】
チアゾールオレンジＴＯ−１は、化合物２−１（０．４２ｇ，２ｍｍｏｌ）と化合物２−２（０．４１ｇ，２ｍｍｏｌ）を脱水エタノール１０ｍｌを加えて溶解させ、６０℃で５分間還流した後にトリエチルアミン（０．２７ｍｌ，２ｍｍｏｌ）を加え、赤色に変化した後に攪拌しながら室温に戻した。この赤色の反応溶液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加えて生成した沈殿を吸引ろ過で回収し、チアゾールオレンジ（ＴＯ−１，０．５９ｇ）を得た。チアゾールオレンジＴＯ−２は、化合物２−３を用いる以外は同様の手法で得た。
【実施例４】
【００８３】
（オリゴヌクレオチドの合成）
本実施例では、以下に示すクエンチャーが導入されたオリゴヌクレオチド及びフルオロホアが導入されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。ただし、ＰＥはペリレンを表し、ＭＲはメチルレッドを表し、Ａｚｏはアゾベンゼンを表す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
（アゾベンゼン、メチルレッド、ペリレンを導入したオリゴヌクレオチドの合成）
クエンチャーとしてのアゾベンゼン、メチルレッド、あるいはペリレンを導入したＤＮＡの合成は、ABI394型ＤＮＡ合成機を使用し、対応するホスホロアミダイトモノマー（化合物Ｃ，Ｄ，Ｅ）と４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いてネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で合成・精製した。
【００８６】
（チアゾールオレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）およびＦＩＴＣのオリゴヌクレオチドへの導入）
チアゾールオレンジ（ＴＯ−１、ＴＯ−２）とＦＩＴＣのオリゴヌクレオチドへの導入は、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由した以下のスキームに示す方法で行った。
【００８７】
【化１４】
【００８８】
ＡＢＩ３９４型ＤＮＡ合成機を使用し、Ｄ−トレオニノールのアミノ基をアリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーＡ、４つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマー、および既述のアミダイトモノマーＣ，Ｄ，Ｅを適宜用いて、コントロールドポアグラス（ＣＰＧ）担体上に所定の配列を持つＤＮＡを伸長させた（化合物３−１）。このＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．４５μｍｏｌ）を、フィルターを装着しているプラスチックのシリンジに秤取り、アセトニトリル１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍＬで３回洗浄した。次にＰｄ（Ｐｈ３）４（５．２ｍｇ，４．５μｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン溶液５００μＬにＮ−メチルアニリン４８．８μＬ（４５０μｍｏｌ）を加え、これを上述のＣＰＧ担体（化合物４−１）に加えて３５℃で３時間反応させることで、アリルオキシカルボニル基のみをＣＰＧ担体上から脱保護した（化合物３−２）。
【００８９】
次にチアゾールオレンジＴＯ−１（１０ｍｇ、４５μｍｏｌ）とｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｐａｒａ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＰＰＴＳ：１１．３ｍｇ，４５μｍｏｌ）を４００μＬのＤＭＦに溶解させ、これにｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢＯＰ：５９ｍｇ，１１２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液１００μｌを加えたものを、上記のＣＰＧ担体（化合物３−２）が入ったシリンジに加え、３日間室温で振とうした。この後、反応溶液をろ過で除き、続いて０．１ＭのＰＰＴＳのＤＭＦ溶液１ｍＬをシリンジに加えて１分間振とうしてＣＰＧ担体を洗浄し、更にＤＭＦ１ｍＬで３回、続いてジクロロメタン１ｍｌで３回洗浄して、ＴＯ−１を導入したＣＰＧ担体を得た（化合物３−３）。
【００９０】
続いて、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法でＣＰＧ担体からＤＮＡを切り出し、高速液体クロマトグラフィーで同誌同頁に記載の方法で目的とするＤＮＡを分離精製した（化合物３−４）。
【００９１】
チアゾールオレンジＴＯ−２を導入したＤＮＡは、ＴＯ−１の代わりにＴＯ−２を用いる以外は上記と同様の方法で得た。
【００９２】
ＦＩＴＣ導入ＤＮＡは、ＦＩＴＣ（１４．０２ｍｇ、１８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５００μＬ）にＤＩＰＥＡ（６．１２μｌ，１８μｍｏｌ）を加え、これをアリルオキシカルボニル基のみを脱保護したＣＰＧ担体（１０ｍｇ，０．３６μｍｏｌ）（化合物３−２）に加え三日間攪拌した後、ＴＯ導入ＤＮＡと同様の操作を行うことで調製した。
【００９３】
化合物Ａに代えて化合物Ｂを用いること以外は上記と全く同様の手法で、ＴＯ−１，ＴＯ−２，あるいはＦＩＴＣを導入して連結基Ｒ1（C2：炭素数２）を含むオリゴヌクレオチドを合成した（化合物３−５）。
【実施例５】
【００９４】
（クエンチャーとの組み合わせによる蛍光消光の確認）
各種のフルオロホアがクエンチャーとの“塩基対形成”によって消光することを確認するため、実施例４で合成したオリゴヌクレオチドを用いて蛍光および吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りである。
【００９５】
Ｆａ配列のオリゴヌクレオチド：５μｍｏｌ／ｌ
Ｑｂ配列あるいはＮｂのオリゴヌクレオチド：５μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【００９６】
なお、フルオロホアを含む各種オリゴヌクレオチドＦａの標的核酸として、Ｆａと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（クエンチャー含まず）（Ｎｂ）を別途用意した。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
【００９７】
図３Ａに、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ１（一本鎖）とＦａ−Ｃ３−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖それぞれの２０℃における吸収スペクトルを示し、図３Ｂに、蛍光スペクトルを示す。図３Ａに示すように、チアゾールオレンジに基づく５１５ｎｍの吸収がＱｂ−ＭＲとの二重鎖形成で大きく減少した。この事実は、クエンチャーであるメチルレッドとチアゾールオレンジがスタッキング（積層構造）していることを示している。またＦａ−Ｃ２−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖の融解温度Ｔｍは５４℃と、チアゾールオレンジとメチルレッドの入っていない天然のＤＮＡ二重鎖（５’−ＧＧＴＡＴＣＧＣＡＡＴＣ−３’／３’−ＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧ−５’）のＴｍ（４８℃）より高かった。この事実もチアゾールオレンジとメチルレッドの強固なスタッキングを支持している。同様の吸収スペクトル変化とＴｍの上昇は、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ２／Ｑｂ−ＭＲ，Ｆａ−Ｃ３−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ、およびＦａ−Ｃ３−ＴＯ２／Ｑｂ−ＭＲでも観察された。
【００９８】
蛍光スペクトルも図３Ｂに示すように（５１１ｎｍ励起）、一本鎖状態のＦａ−Ｃ２−ＴＯ１と比べてＦａ−Ｃ２−ＴＯ１／Ｑｂ−ＭＲ二重鎖からのチアゾールオレンジに基づく５３３ｎｍの蛍光強度は１／１０に低下した。一方、Ｆａ−Ｃ２−ＴＯ１を相補オリゴヌクレオチド（Ｎｂ）と二重鎖形成させたところ、一本鎖状態のＦａ−Ｃ２−ＴＯ１と比べて５３３ｎｍの蛍光強度が２０℃で２倍に増強した。従ってこの組み合わせでビーコンを作成すると、２０倍程度のシグナル／ノイズ比が期待できることがわかった。
【００９９】
次にペリレンを含むＦａ−Ｃ３−ＰＥを、Ｑｂ−ＭＲあるいはＱｂ−Ａｚｏと二重鎖形成させた。結果を図４に示す。図４に示すように、４２５ｎｍで励起した場合の４６１ｎｍの蛍光強度は、図４に示したように２０℃で一本鎖のＦａ−Ｃ３−ＰＥよりもＱｂ−ＭＲで１／１５に、Ｑｂ−Ａｚｏでは１／３０に低下した。一方、Ｆａ−Ｃ３−ＰＥをＮｂと二重鎖形成させたところ、一本鎖のＦａ−Ｃ３−ＰＥと同程度の蛍光が観察された。従ってペリレンの場合アゾベンゼン組み合わせると、２０℃前後で３０倍程度のシグナル／ノイズ比が期待できることがわかった。
【実施例６】
【０１００】
実施例５の結果に基づいて、以下の表２に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
【化１５】
＊下線部がステム形成鎖である。
なお比較例のMB0Fに用いた５’末端のFITCと３’末端のMRは、本明細書に開示のビーコンへの導入に使用したリンカーと異なり、以下の構造を持つ。
【化１６】
【０１０３】
これらのビーコンのうちMB1-C2-TO1-MR及びMB2-C2-TO1-MRに標的核酸であるＭＢｔを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表３及び表４に示す。
【０１０４】
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１０５】
＜ＭＢ１−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲ＞
ＭＢ１−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲにＭＢ−ｔを加える前後での５２０ｎｍでの励起における５３１ｎｍのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１０６】
【表３】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min
【０１０７】
表３に示すように、このモレキュラービーコン型プローブは、広い温度範囲にわたってバッググランド値（ＭＢ−ｔ添加前）はおおよそ安定し、シグナル強度比も広い温度で安定化していた。後述する比較例との対比から、このモレキュラービーコン型プローブはステムの熱安定性に優れる傾向があることがわかった。また、シグナル強度比も安定化されているため、ＳＮＰや変異などの変異を検出するのに都合がよいことがわかった。
【０１０８】
＜ＭＢ２−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲ＞
ＭＢ２−Ｃ２−ＴＯ１−ＭＲにＭＢｔを加える前と後での、５１０ｎｍでの励起における５３１ｎｍのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下に示す。
【０１０９】
【表４】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min
【０１１０】
表４に示すように、このモレキュラービーコン型プローブは、３０℃〜５０℃にかけてバッググランド（ＭＢ−ｔ添加前）はおおよそ安定し、シグナル強度比もこの範囲で安定化する傾向があった。後述する比較例との対比から、このモレキュラービーコン型プローブはステムの熱安定性に優れる傾向があることがわかった。また、シグナル強度比も安定化されているため、ＳＮＰや変異などの変異を検出するのに都合がよいことがわかった。
【０１１１】
＜比較例：ＭＢ０Ｆ＞
比較例として、ＭＢ−ｃｏｎｔにＭＢｔを加える前後での４９４ｎｍでの励起における５２０ｎｍのＦＩＴＣからの蛍光強度を以下に示す。
【０１１２】
【表５】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１３】
表５に示すように、従来のモレキュラービーコンは、温度上昇とともにバッググランド（ＭＢ−ｔ添加前）が上昇し、４０℃以上で急激に増加した。一方、ハイブリダイゼーションによる発光（ＭＢ−ｔ添加後）は５０℃以上で急激に減少した。この結果、４０℃以上では、急激にシグナル強度比が低下した。ＳＮＰや変異などを検出するには相対的に高いハイブリダイゼーション温度が必要とされることから、ＳＮＰや変異などの検出には不向きであることがわかった。また、このような不安定性から固相反応では一層のバラツキが推測され、固相反応にも不向きであることがわかった。
【０１１４】
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ａｚｏ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＡｚｏにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１１５】
【表６】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１６】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ａｚｏ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＡｚｏにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１１７】
【表７】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１１８】
表６及び表７に示すように、ハイブリダイゼーション温度の違いによる蛍光強度比の変化は抑制されていることがわかった。
【実施例７】
【０１１９】
以下に示す化合物Anthは、ケミカル・コミュニケーションズ（Chemical Communications）誌２００６巻５０６２−５０６４に記載の方法で得た。
【化１７】
【０１２０】
（4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、パラ-ニトロソ安息香酸エチル(4-1)を、ジャーナル・オブ・ジ・オーガニック・ケミストリー（Journal of the Organic Chemistry）誌１９７０年第３５巻５０５−５０８頁に記載の方法で合成した。このニトロソ化合物４−１を二口ナスフラスコに入れ窒素置換し、ｐ−メチルチオアニリン４−２を加え、更に酢酸を溶媒として加えて、遮光しながら終夜反応させた。この反応溶液に蒸留水を加えた後に、酢酸エチルを加えて分液漏斗で十分に振とうした。続いて酢酸エチル層を蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒の酢酸エチルを留去した。得られたものを更にシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物４−３を得た（収率５０％）。
【０１２１】
得られた化合物４−３にエタノールと２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶解し、遮光しながら１７時間攪拌した。この後塩酸を加えてｐＨを５程度にしてから酢酸エチルを加えて分液漏斗で十分に振とうした。続いて、酢酸エチル層を蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒の酢酸エチルを留去し、パラ-ニトロソ安息香酸４−４を得た（収率９９％以上）。次に、アゾベンゼンの代わりにパラ-ニトロソ安息香酸４−４を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー４−５を得た。
【０１２２】
【化１８】
【０１２３】
（Cy３を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、Ｃｙ３を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）誌２００１年第１２５巻３６１−３６２ページ記載の方法で、Ｃｙ３（５−１）を得た。次に、アゾベンゼンの代わりにＣｙ３（５-１）を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー５−２を得た。
【化１９】
【０１２４】
続いて以下の表６に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【０１２５】
【表８】
【０１２６】
なお、表８にある略号は、以下の図に示したとおりである。なお実施例６の表２に用いた略号も、以下の図と全く同じである。
【化２０】
【０１２７】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるＭＢｔを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表９〜表１５に示す。
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１２８】
１．ペリレン−（4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸による消光−発光の確認
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ｓ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＳにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１２９】
【表９】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３０】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ｓ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＳにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３１】
【表１０】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３２】
表９及び１０に示すように、ペリレンに対して4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、ペリレンをフルオロホアとして、4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸をクエンチャーとして用いることができることがわかった。
【０１３３】
２．ペリレン−アントラキノンによる消光−発光の確認
＜ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ１−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３４】
【表１１】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３５】
＜ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ２−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３６】
【表１２】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３７】
＜ＭＢ３−Ｃ３−ＰＥ−Ｑ＞
ＭＢ３−Ｃ３−ＰＥ−ＱにＭＢｔを加える前後での４２５ｎｍでの励起における４６０ｎｍのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１３８】
【表１３】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１３９】
表１１〜１３に示すように、ペリレンに対してアントラキノンを用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、ペリレンをフルオロホアとして、アントラキノンをクエンチャーとして用いることができることがわかった。特に、表１３に示すように、ペリレン及びアントラキノンをモレキュラービーコンの対合するステム鎖に２個づつ備えることで、安定した消光と強い発光を確認できた。以上の結果から、ビーコンが閉じた状態での消光が、シグナル強度比の向上に寄与していることが判る。これは対を形成しているペリレンとアントラキノン同士だけで蛍光消光が起きているのではなく、対を形成していない方のアントラキノンへ天然の塩基対を通じて電子が移動したことで蛍光消光が起きたものと考えられる。すなわち、ステム部分に導入した２つのペリレン−アントラキノンの対はそれぞれ独立に機能しているのではなく、安定した消光に相乗的に寄与していることがわかった。
【０１４０】
３．Ｃｙ３−ＭＲによる消光−発光の確認
＜ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲ＞
ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲにＭＢｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６３ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１４１】
【表１４】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１４２】
＜ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲ＞
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲにＭＢｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６３ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１４３】
【表１５】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１４４】
表１４及び１５に示すように、Ｃｙ３に対してメチルレッドを用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、Ｃｙ３をフルオロホアとして、メチルレッドをクエンチャーとして用いることができることがわかった。
【実施例８】
【０１４５】
（MRNO2を含むアミダイトモノマーの合成）
以下のスキームに従い、MRNO2を含むアミダイトモノマーを合成した。4−アミノ−3−ニトロ安息香酸を酢酸と水の混合溶媒に溶解し、これに亜硝酸ナトリウムの塩酸酸性溶液を加え15−20℃で15分間攪拌し、さらに氷水を加えることでジアゾニウム塩の水溶液を得た。次にN,N−ジメチルアニリンの塩酸酸性溶液を氷浴上で0-5℃に保ちつつ、上記ジアゾニウム塩の水溶液を滴下することで、４’−ジメチルアミノ―２−ニトロアゾベンゼン―４−カルボン酸（６−１）を得た。次に、アゾベンゼンの代わりに４’−ジメチルアミノ―２−ニトロアゾベンゼン―４−カルボン酸（６−１）を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー（６−２）を得た。
【化２１】
【０１４６】
続いて以下の表１６に示すモレキュラービーコン型のオリゴヌクレオチドプローブを設計し合成した。各種モレキュラービーコンは、実施例１〜３で合成又は準備した各種アミダイドモノマー及び各種フルオロホア及びクエンチャーを用いて実施例４に記載の方法に準じて合成した。なお、各種配列も併せて示す。
【表１６】
【０１４７】
表１６にある略号は、以下の図に示したとおりである。なお、表２と表８に用いた略号も、以下の図と全く同じである。
【０１４８】
【化２２】
【０１４９】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるＭＢｔあるいはＭＢｔ２を加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。結果を表１７〜表２０に示す。
ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ
標的核酸Ｎｂの濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ
塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ
リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１５０】
＜ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２＞
ＭＢ1−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５１】
【表１７】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５２】
ＭＢ１−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔ２を加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【表１８】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５３】
＜ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２＞
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔを加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５４】
【表１９】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５５】
ＭＢ２−Ｃ３−Ｃｙ３−ＭＲＮＯ２にＭＢ−ｔ２を加える前後での５４６ｎｍでの励起における５６６ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を以下の表に示す。
【０１５６】
【表２０】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500、励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min
【０１５７】
表１７〜２０に示すように、Ｃｙ３に対してMRNO2を用いることで、標的核酸の供給により消光−発光現象を確認できた。したがって、Ｃｙ３をフルオロホアとして、MRNO2をクエンチャーとして用いることができることがわかった。また、Ｃｙ３の極大吸収波長は５４６ｎｍであり、MRNO２は５１３ｎｍであり、その差は３３ｎｍであった。
さらに、表１７と表１９のように標的核酸がビーコンの蛍光色素側の鎖と二重鎖を形成しても、表１８と表２０のようにビーコンのクエンチャー側の鎖と二重鎖を形成しても、消光−発光現象を確認できた。
【実施例９】
【０１５８】
本実施例では、フルオロホア：クエンチャー（１：２）の会合を形成可能なモデル二重鎖につき、会合に伴う消光能を評価した。まず、以下の各種類の修飾DNAを合成し、クエンチャー色素を二つ連続して導入した場合の消光の程度を観察した。
蛍光鎖 1a-Cy3 5’-GGTATC-Cy3-GCAATC-3’
消光鎖 1b-MR 3’-CCATAG-MR-CGTTAG-5’
1b-NMR 3’-CCATAG-NMR-CGTTAG-5’
1b-2 MR 3’-CCATAG-MR-MR-CGTTAG-5’
1b- 2NMR 3’-CCATAG-MR-MR-CGTTAG-5’
1b-MR-NMR 3’-CCATAG-MR-NMR-CGTTAG-5’
1b-NMR-MR 3’-CCATAG-NMR-MR-CGTTAG-5’
【０１５９】
【化２３】
【０１６０】
次に、蛍光鎖1a-Cy3を0.2 μM、消光鎖を蛍光鎖の2倍過剰（0.4μM）の濃度になるよう、バッファー溶液（[NaCl] = 100 mM、pH 7.0 10 mM リン酸緩衝液）に溶解し、５４６ｎｍでの励起における５６４ｎｍのＣｙ３からの蛍光強度を測定した。結果を表２１に示す。
【０１６１】
【表２１】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：5 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：high；走査速度：200 nm/min；測定温度：２０℃
【０１６２】
表２１に示すように、一つのフルオロホアに対して同一あるいは異なるクエンチャーを二つ連続的に導入することで、フルオロホア（Cy3）の蛍光を、より効率的に消光することができることがわかった。
【実施例１０】
【０１６３】
本実施例では、ダブルクエンチャー型ビーコンによる標的核酸検出の感度について評価した。実施例８の結果に基づき、以下の構成のビーコンを設計・合成した。
【０１６４】
（ビーコン）
dqMB1-cy3-NMR 5’-TG-Cy3-GTCCTTGAGAAAGGGCGAC-NMR-NMR-CA-3’
dqMB2-cy3-NMR 5’-TGG-Cy3-TCCTTGAGAAAGGGCGA-NMR-NMR-CCA-3’
Mb1-cy3-NMR 5’-TG-Cy3-GTCCTTGAGAAAGGGCGAC-NMR-CA-3’
Mb2-cy3-NMR 5’-TGG-Cy3-TCCTTGAGAAAGGGCGA-NMR-CCA-3’
（標的核酸）
Sba 3’-ACCAGGAACTCTTTCCCG-5’
Sbb 3’-GAACTCTTTCCCGCTGGT-5’
【０１６５】
これらのビーコンにつき、標的核酸であるSbaあるいはSbbを加える前後での蛍光強度の変化を観察した。蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りとした。５４６ｎｍでの励起における５６４ｎｍの蛍光強度から算出した結果を表２２に示す。
（蛍光スペクトル測定条件）ビーコンの濃度：０．２μｍｏｌ／ｌ；標的核酸の濃度：０．４μｍｏｌ／ｌ；塩化ナトリウム：０．１ｍｏｌ／ｌ；リン酸バッファー：１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．０）
【０１６６】
【表２２】
（蛍光測定の条件）分光蛍光光度計：日本分光製FP-6500、；励起バンド幅：3 nm；蛍光バンド幅：3 nm；レスポンス：0.1 sec；感度：middle；走査速度：200 nm/min；測定温度：２０℃
【０１６７】
以上のように、フルオロホアとクエンチャーのステム内の位置に依存せず、良好なS/N比を示した。特に、感度の低かったMb2-cy3-NMRにおいて、ダブルクエンチャー型にすることで(dbMB2-cy3-NMR)、S/N比の顕著な改善効果があることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される以下の式（１）で表されるユニットに連結される少なくとも１個のフルオロホアと、
【化２４】
（式中、Ｘはフルオロホアを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアに対応する部位に配置される以下の式（２）で表されるユニットに連結される少なくとも２個のクエンチャーと、
【化２５】
（式中、Ｙはクエンチャーを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
を備える、プローブ。
【請求項２】
前記フルオロホアは、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖の内部に配置される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、アゾ系色素からなる群から選択されるいずれかである、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記フルオロホアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、クマリン及びアクリジンから選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかである、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記フルオロホアは、縮合芳香環系色素であり、前記クエンチャーは、アントラキノン又はその誘導体である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
前記フルオロホアはペリレンであり、前記クエンチャーはアントラキノンである、請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
一つの前記ステムと一つの前記ループを形成可能である、請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
標的核酸を検出するためのプローブ固定化体であって、
固相担体と、
前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、前記固相担体に保持された請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を備える、固定化体。
【請求項９】
前記固相担体は、プレート状体である、請求項８に記載の固定化体。
【請求項１０】
複数の前記標的核酸をそれぞれ検出可能な複数のオリゴヌクレオチドプローブを備える、請求項８又は９に記載の固定化体。
【請求項１１】
ＳＮＰ又は遺伝子変異の検出用である、請求項８〜１０のいずれかに記載の固定化体。
【請求項１２】
標的核酸の検出方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する、方法。
【請求項１３】
複数の標的核酸に対応してハイブリダイゼーション可能な複数の前記オリゴヌクレオチドプローブを固相担体上に保持した固定化体を用いる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される以下の式（１）で表されるユニットに連結される少なくとも１個のフルオロホアと、
【化２４】
（式中、Ｘはフルオロホアを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも１個のフルオロホアに対応する部位に配置される以下の式（２）で表されるユニットに連結される少なくとも２個のクエンチャーと、
【化２５】
（式中、Ｙはクエンチャーを表し、Ｒ1は、炭素数が２又は３であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｒ2は、炭素数が０以上２以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Ｚは、直接の結合又は連結基を表す。）
を備える、プローブ。
【請求項２】
前記フルオロホアは、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖の内部に配置される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、アゾ系色素からなる群から選択されるいずれかである、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記フルオロホアは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、クマリン及びアクリジンから選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかである、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記フルオロホアは、縮合芳香環系色素であり、前記クエンチャーは、アントラキノン又はその誘導体である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
前記フルオロホアはペリレンであり、前記クエンチャーはアントラキノンである、請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
一つの前記ステムと一つの前記ループを形成可能である、請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
標的核酸を検出するためのプローブ固定化体であって、
固相担体と、
前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、前記固相担体に保持された請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を備える、固定化体。
【請求項９】
前記固相担体は、プレート状体である、請求項８に記載の固定化体。
【請求項１０】
複数の前記標的核酸をそれぞれ検出可能な複数のオリゴヌクレオチドプローブを備える、請求項８又は９に記載の固定化体。
【請求項１１】
ＳＮＰ又は遺伝子変異の検出用である、請求項８〜１０のいずれかに記載の固定化体。
【請求項１２】
標的核酸の検出方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する、方法。
【請求項１３】
複数の標的核酸に対応してハイブリダイゼーション可能な複数の前記オリゴヌクレオチドプローブを固相担体上に保持した固定化体を用いる、請求項１２に記載の方法。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１３５８２３（Ｐ２０１１−１３５８２３Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９８１６０（Ｐ２００９−２９８１６０）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学技術省、科学技術総合研究委託事業「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成 分析・診断医工学による予防早期医療の創生」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（０００００４０６４）日本碍子株式会社 (2,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学技術省、科学技術総合研究委託事業「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成 分析・診断医工学による予防早期医療の創生」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（０００００４０６４）日本碍子株式会社 (2,325)
【Ｆターム（参考）】
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