オリゴヌクレオチド修飾粒子をベースとするバイオバーコード
【課題】サンプル中の１つまたは複数のタンパク質、たとえば抗体の有無を検出するためのスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明は、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物、たとえば抗体などのタンパク質の有無を検出するためのスクリーニング方法、組成物、およびキットに関する。特に、本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造またはその他の標的分析物を検出するために生化学的バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。
【解決手段】本発明は、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物、たとえば抗体などのタンパク質の有無を検出するためのスクリーニング方法、組成物、およびキットに関する。特に、本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造またはその他の標的分析物を検出するために生化学的バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の１つまたは複数のタンパク質、たとえば抗体の有無を検出するためのスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年３月２８日出願の米国特許出願第０９／８２０，２７９号の一部継続であり、本願明細書に援用する２０００年３月２８日出願の米国仮特許出願第６０／１９２，６９９号、および２００１年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６０／３５０，５６０号の恩典を主張する。本出願で報告される研究は、ＮＳＦ、ＡＲＯ、およびＮＩＨの助成金によって一部資金を得ている。したがって、米国政府は、本出願に記載の発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
タンパク質の検出は、分子生物学の研究と医学的用途の双方にとって重要である。現在、蛍光、質量分析法、ゲル電気泳動、レーザー・スキャニングおよび電気化学をベースとする診断法が、さまざまなタンパク質構造を同定するために利用可能である１〜４。血液細胞の遺伝学的なタンパク質変異体を同定し、疾患を診断し、組織中で分子プローブを突き止め、分子を精製し、または分離工程を行うため、抗体を用いた反応が広く用いられる５。医学的診断用途（たとえば、マラリアおよびＨＩＶ）の場合、エライザ、ウエスタンブロッティングなどの抗体検査、および間接的蛍光抗体検査は、単一の標的タンパク質構造を同定するために極めて有用である６、７。複数の抗体の存在について迅速かつ同時にサンプルをスクリーニングすることは、研究と臨床応用のいずれにおいても有益と思われる。しかしながら、前述の関連プロトコルを用いる均一系アッセイ条件下で１溶液中のいくつかのタンパク質構造を同時に検出することは困難で費用がかかり、多大な時間を必要とする。
【特許文献１】米国特許第４，６５０，７７０号
【特許文献２】２００２年１２月２８日出願の米国特許出願第１０／０３４，４５１号
【特許文献３】２００２年１２月２８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号
【特許文献４】米国特許第５，４７２，８８１号
【特許文献５】米国特許出願第０９／７６０，５００号
【特許文献６】米国特許出願第０９／８２０，２７９号
【特許文献７】２００１年１月１２日出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号
【特許文献８】２００１年３月２８日出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号
【特許文献９】１９９９年６月２５日出願の米国特許出願第０９／３４４，６６７号
【特許文献１０】２０００年６月２６日出願の米国特許出願第０９／６０３，８３０号
【特許文献１１】２００１年１月１２日出願の米国特許出願第０９／７６０，５００号
【特許文献１２】２００１年３月２８日出願の米国特許出願第０９／８２０，２７９号
【特許文献１３】２００１年８月１０日出願の米国特許出願第０９／９２７，７７７号
【特許文献１４】１９９７年７月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号
【特許文献１５】２０００年６月２６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号
【非特許文献１】サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（第２版、１９８９年）
【非特許文献２】ビー ディー ヘームスおよびエス ジェー ヒギンス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年）
【非特許文献３】シュミット ジー（Ｓｃｈｍｉｄ、Ｇ．）（編）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４年）
【非特許文献４】ハヤット エム エー（Ｈａｙａｔ、Ｍ．Ａ．）（編）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９１年）
【非特許文献５】マサール アール（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥ Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、１２４７ページ（１９８１年）
【非特許文献６】アフマディー ティー エスら（Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７２巻、１９２４ページ（１９９６年）
【非特許文献７】ヘングライン エイら（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９９巻、１４１２９ページ（１９９５年）
【非特許文献８】カーチス エイ シーら（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第２７巻、１５３０ページ（１９８８年）
【非特許文献９】ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第３２巻、４１ページ（１９９３年）
【非特許文献１０】ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．、第１４３巻、１１３ページ（１９８８年）
【非特許文献１１】ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、第８９巻、１８６１ページ（１９８９年）
【非特許文献１２】ブルス（Ｂｒｕｓ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．、第５３巻、４６５ページ（１９９１年）
【非特許文献１３】バーンスマン（Ｂａｈｎｃｍａｎｎ）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｓｏｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ（ペリゼッティ（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ）およびスキアヴェロ（Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ）編、１９９１年）、２５１ページ
【非特許文献１４】ワン（Ｗａｎｇ）およびヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５２５ページ（１９９１年）
【非特許文献１５】オルシャフスキーら（Ｏｌｓｈａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１２巻、９４３８ページ（１９９０年）
【非特許文献１６】ウチダら（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５３８２ページ（１９９２年）
【非特許文献１７】ホワイトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、テキサス州ヒューストン、１０９〜１２１ページ（１９９５年）
【非特許文献１８】ムシックら（Ｍｕｃｉｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５５５〜５５７ページ（１９９６年）
【非特許文献１９】バーウェル（Ｂｕｒｗｅｌｌ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４巻、３７０〜３７７ページ（１９７４年）
【非特許文献２０】マッテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０３巻、３１８５〜３１９１ページ（１９８１年）
【非特許文献２１】グラバールら（Ｇｒａｂａｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５〜７４３ページ
【非特許文献２２】ヌッゾら（Ｎｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０９巻、２３５８ページ（１９８７年）
【非特許文献２３】アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびヌッゾ（Ｎｕｚｚｏ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１巻、４５ページ（１９８５年）
【非特許文献２４】アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびトンプキンス（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ）、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、第４９巻、４１０〜４２１ページ（１９７４年）
【非特許文献２５】イラー（Ｉｌｅｒ）、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ、第６章、（Ｗｉｌｅｙ、１９７９年）
【非特許文献２６】ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）およびズィスマン（Ｚｉｓｍａｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第６９巻、９８４〜９９０ページ（１９６５年）
【非特許文献２７】ソリアガ（Ｓｏｒｉａｇａ）およびハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０４巻、３９３７ページ（１９８２年）
【非特許文献２８】ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、第１３巻、１７７ページ（１９８０年）
【非特許文献２９】ヒックマンら（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１１巻、７２７１ページ（１９８９年）
【非特許文献３０】マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギフ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、１０４５ページ（１９８７年）
【非特許文献３１】マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギフ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、１０３４ページ（１９８７年）
【非特許文献３２】ワッセルマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第５巻、１０７４ページ（１９８９年）
【非特許文献３３】エルテコバ（Ｅｌｔｅｋｏｖａ）およびエルテコフ（Ｅｌｔｅｋｏｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、９５１ページ（１９８７年）
【非特許文献３４】レックら（Ｌｅｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９２巻、２５９７ページ（１９８８年）
【非特許文献３５】エフ エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）
【非特許文献３６】クリセイら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、３０３１〜３０３９ページ（１９９６年）
【非特許文献３７】クリセイら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、３０４０〜３０４７ページ（１９９６年）
【非特許文献３８】ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）およびコクス（Ｃｏｘ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２２巻、４９２ページ（１９９４年）
【非特許文献３９】ボトムリーら（Ｂｏｔｔｏｍｌｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ、第１０巻、５９１ぺージ（１９９２年）
【非特許文献４０】ヘグナーら（Ｈｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第３３６巻、４５２ページ（１９９３年）
【非特許文献４１】バッセルら（Ｂａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１２６巻、８６３〜８７６ページ（１９９４年）
【非特許文献４２】ブラウン−ハウランドら（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１３巻、９２８〜９３１ページ（１９９２年）
【非特許文献４３】ブラウンら（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、７７５ページ（１９９８年）
【非特許文献４４】フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、２０ページ（１９７３年）
【非特許文献４５】グラバール（Ｇｒａｂａｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５ページ（１９９５年）
【非特許文献４６】エクスタイン エフ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、サンプル中の１つまたは複数のタンパク質、たとえば抗体の有無を検出するためのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部および該特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズして該ＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に該凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を要旨とする。
【０００６】
請求項２に記載の発明は、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を要旨とする。
【０００７】
請求項３に記載の発明は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブを要旨とする。
【０００８】
請求項４に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子がナノ粒子からなることを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子が金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子であることを要旨とする。
【０００９】
請求項６に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子が金ナノ粒子であることを要旨とする。
本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法、組成物およびキットに関する。この手法は、オリゴヌクレオチド鎖によって機能化されたタンパク質認識要素と、金ナノ粒子の凝集をもたらすハイブリダイゼーション事象により金ナノ粒子の物理的性質（たとえば、光学的、電気的、機械的）を著しく変化させうるというこれまでの知見とを、うまく利用している８〜１２。個々の調整可能なハイブリダイゼーション特性と融解特性とを有する様々なオリゴヌクレオチド配列、および、融解の際には変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化（ｄｅｃｏｄｅ）するナノ粒子に関係する物理的特徴によって、各タンパク質認識要素を符号化（ｅｎｃｏｄｅ）することが可能である、というのが概略的な構想である。
【００１０】
本発明の一実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対し特異的に結合する相補体（特異結合性相補体）が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部はＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；および
凝集体生成が起きたか否かを観察するステップ、からなる方法を提供する。
【００１１】
標的分析物の存在下では、粒子複合体プローブと標的分析物との間の結合性相互作用の結果として凝集体が生成する。この凝集体は、任意の好適な手段によって検出することができる。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離するステップ；および
凝集性複合体を分析し、異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判定するステップ、からなる方法を提供する。
【００１３】
各タイプの粒子複合体プローブは、特定の標的分析物のためにあらかじめ定められたリポーター・オリゴヌクレオチドすなわちバーコードを含む。標的分析物の存在下では、ナノ粒子複合体と標的分析物との間の結合性相互作用の結果としてナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体を、任意の好適な手段、たとえば熱変性によって単離し分析し、１つまたは複数の異なるタイプのリポーター・オリゴヌクレオチドの存在を検出することが可能である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を提供する。
【００１５】
標的分析物の存在下では、ナノ粒子複合体と標的分析物との間の結合性相互作用の結果としてナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体を単離し、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離するのに有効な条件下に供する。次いで、リポーター・オリゴヌクレオチドを単離する。望ましい場合には、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドを増幅することができる。分析物の検出は、ＤＮＡチップなどの任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドすなわちバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行なわれる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、１つまたは複数の分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定がサンプル中の特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００１７】
１つまたは複数の標的分析物の存在下では、粒子複合体プローブと標的分析物との間の結合性相互作用の結果として凝集体が生成される。これらの凝集体を単離し、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離するのに有効な条件下に供する。次いで、リポーター・オリゴヌクレオチドを単離する。望ましい場合には、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドを増幅することができる。分析物検出は、ＤＮＡチップなどの任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行われる。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の抗体の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的抗体に対するハプテンが結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特定の標的抗体に対するハプテンが結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的抗体の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
抗体と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、１つまたは複数の標的抗体の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が、特定の標的抗体の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕで粒子複合体プローブを生成する必要のあるサンプル中で標的分析物の存在を検出するための方法も提供する。本発明の一実施形態では、標的分析物の存在を検出するための方法は、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；および
凝集体生成が起きたか否かを観察するステップ、からなる。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的分析物と特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が、１つまたは複数の特定の標的分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離するステップ；および
凝集性複合体を分析し、１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判定するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの存在がサンプル中の特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的で
ある配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的分析物と特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が１つまたは複数の特定の標的分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の抗体の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の抗体に対するハプテンが結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特定の抗体に対するハプテンが結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的抗体に関する識別子とし
ての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部およびハプテンが結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的抗体と特定の標的抗体に対するハプテンが結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的抗体に対するハプテンが結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が１つまたは複数の特定の標的抗体の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が特定の標的抗体の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、標的分析物検出のためのキットも提供する。本発明の一実施形態では、サンプル中の標的分析物を検出するためのキットであって、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブ、ならびに検出可能な変化を観察するための任意選択の基材を含む、少なくとも１つの容器からなるキットを提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物を検出するための、少なくとも１つまたは複数の容器からなるキットであって、該容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなるあるタイプの粒子複合体プローブであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たす配列を有する粒子複合体プローブが含まれるキットであり、検出可能な変化を観察するための基材が場合により含まれるキットを提供する。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも１対の容器および検出可能な変化を観察するための任意選択の基材を含む、標的分析物を検出するためのキットであって、
対の第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子と少なくとも２つの部分のある配列を有するＤＮＡバーコードとからなる粒子プローブが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれるキット、を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも２対以上の容器を含む、サンプル中の複数の標的分析物を検出するためのキットであって、
各対の第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくとも２つの部分のある配列を有するＤＮＡバーコードを有する粒子複合体プローブが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、少なくとも２つの部分を有するＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
各対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれ、
粒子複合体プローブのタイプに対するＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有し、検出可能な変化を観察するための基材が任意選択で含まれるキット、を提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態では、第１の容器および少なくとも２対以上の容器を含む、サンプル中の複数の標的分析物を検出するためのキットであって、
第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子を有する粒子複合体プローブが含まれ、
対の第１の容器には、少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
各対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれ、
各対の容器のうち第１の容器中に存在するＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての役割を果たし、容器の別の対におけるＤＮＡバーコードとは異なる配列を有し、検出可能な変化を観察するための基材が場合により含まれるキット、を提供する。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態では、上記のいずれのキットの粒子も、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなり、金ナノ粒子であることが好ましい。
また、本発明には、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物を検出するためのシステムであって、
１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブであって、各粒子複合体プローブが、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブと、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有することと、からなるシステムも含まれる。
【００３０】
このシステムにおける粒子は、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなることが好ましく、金ナノ粒子であることが好ましい。
また、本発明には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズされる粒子複合体プローブ、も含まれる。このプローブにおける粒子は、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなることが好ましく、金ナノ粒子であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明には、標的分析物に対して特異的な標的相補体が結合したオリゴヌクレオチド配列も含まれる。
また、本発明には、特定の標的分析物の存在に関する識別子としての役割を果たすオリゴヌクレオチド配列からなるＤＮＡバーコードも含まれる。
【００３２】
また、本発明には、オリゴヌクレオチド配列からなる２つ以上のＤＮＡバーコードも含まれ、各ＤＮＡバーコードは、異なるオリゴヌクレオチド配列を有し、特定の標的分析物の存在に関する識別子としての役割を果たす。
【００３３】
本願明細書で使用する、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、複合物、粒子、ラテックス・ミクロスフェアなどの「タイプ」とは、それらに結合されたオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のタイプが同じである複数の品目を指す。また、「オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子」または「オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子」は、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物」、または本発明の検出方法の場合には、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・プローブ」、「ナノ粒子プローブ」、もしくは単に「プローブ」とも呼ばれることがある。
【００３４】
用語「ナノ粒子複合体」または「ナノ粒子複合体プローブ」は、ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる複合物を指す。
【００３５】
用語「分析物」は、検出すべき化合物または組成物を指し、薬剤、代謝物、殺虫剤、汚染物質などが含まれる。分析物は、特異結合性ペア（ｓｂｐ）のメンバーからなることが可能であり、一価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））もしくは多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の、通常抗原もしくはハプテンの、少なくとも１つの共通エピトープ部位もしくは決定基を共有する単一化合物もしくは複数の化合物であるリガンドであってもよい。分析物は、細菌などの細胞もしくはＡ、Ｂ、Ｄなどの血液型抗原もしくはＨＬＡ抗原を有する細胞の一部、または微生物、たとえば、細菌、真菌、原生動物、もしくはウイルスであることが可能である。
【００３６】
多価リガンド分析物は、通常ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチドおよびタンパク質、多糖、核酸、およびそれらの組合せである。このような組合せには、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が含まれる。
【００３７】
主として、本発明を適用することが可能であるポリエピトープのリガンド分析物は、少なくとも約５，０００、通常少なくとも約１０，０００の分子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）の範疇では、当該ポリ（アミノ酸）は一般に約５，０００から５，０００，０００までの分子量、より一般的には約２０，０００から１，０００，０００までの分子量のはずである。当該ホルモンの中では、分子量は、通常約５，０００から６０，０００までの分子量に及ぶであろう。
【００３８】
類似の構造的特徴を有するタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物、特に病原微生物に関係するタンパク質などのファミリーに関しては多種多様なタンパク質が考えられる。このようなタンパク質には、たとえば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、がん抗原、栄養マーカー、組織特異抗原などが含まれる。
【００３９】
本発明において注目するタンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン、抗原性多糖、微生物及び他の病原体のタイプは、その開示内容が本願明細書に援用される特許文献１に具体的に開示されている。
【００４０】
モノエピトープのリガンド分析物は、一般に約１００〜２，０００の分子量、より一般的には１２５〜１，０００の分子量であろう。
分析物は、宿主由来の体液などのサンプル中に直接見いだされる分子であってもよい。サンプルを直接検査することが可能であり、分析物をより容易に検出可能とするために前処理をしてもよい。さらに、当該分析物がサンプル中に存在する場合にのみ存在が検出されるはずの、当該分析物と相補的な特異結合性ペアのメンバーなどの当該分析物を証明することができる試剤を検出することによって、当該分析物を測定してもよい。したがって、分析物を証明することができる試剤は、アッセイにおいて検出される分析物になる。体液は、たとえば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、汗、粘液などであることが可能である。
【００４１】
用語「特異結合性ペア（ｓｂｐ）のメンバー」は、２つの異なる分子の一方であって、他の分子の特定の空間的かつ中心的な構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に関して特異的に結合し、それによって同構成に関して相補的であると定義される、表面上または空洞内の領域を有するものを指す。特異結合性ペアのメンバーは、リガンドおよびレセプター（アンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ））と呼ばれる。これらは、通常は抗原‐抗体などの免疫学的ペアのメンバーと思われるが、ビオチン‐アビジン、ホルモン‐ホルモンレセプター、核酸二重鎖、ＩｇＧ‐プロテインＡ、ポリヌクレオチド対（ＤＮＡ‐ＤＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡなど）などの他の特異結合性ペアは免疫学的ペアではないが本発明およびｓｂｐメンバーの定義に含まれる。
【００４２】
用語「リガンド」は、それに対するレセプターが自然に存在するか、または調製することが可能である、任意の有機化合物を指す。また、リガンドという用語にはリガンド類似体が含まれ、該リガンド類似体は、通常は有機ラジカルまたは分析物類似体で、分子量は通常１００を超え、レセプターに関して類似のリガンドと競合することが可能な修飾リガンドであり、この修飾により別の分子に該リガンド類似体を結び付ける手段が提供される。リガンド類似体は、リガンド類似体をハブまたは標識に連結するが必要ではない結合によって水素が置換されていることだけでなく、リガンドとは一般に異なるものである。リガンド類似体は、リガンドと同様にレセプターに結合することが可能である。類似体は、たとえば、リガンドに対する抗体のイディオタイプを対象とする抗体であることもありうる。
【００４３】
用語「レセプター」または「アンチリガンド」は、分子の特定の空間的かつ中心的な構成、たとえばエピトープ部位または決定基を認識する能力のある任意の化合物または組成物を指す。例示的なレセプターには、天然に存在するレセプター、たとえば、サイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、アビジン、プロテインＡ、バルスター（ｂａｒｓｔａｒ）、補体成分Ｃ１ｑなどが含まれる。アビジンには、卵白アビジン、およびストレプトアビジンなどの他の供給源に由来するビオチン結合タンパク質が含まれることを意図している。
【００４４】
用語「特異的結合（特異結合）」は、他の分子の認識が実質的に低いのに比べ、２つの異なる分子のうち一方を他方に関して特異的に認識することを指す。一般に、分子は、２分子間の特異的認識を生じさせる表面上または空洞内の領域を有している。典型的な特異的結合は、抗体‐抗原相互作用、酵素‐基質相互作用、ポリヌクレオチドの相互作用などである。
【００４５】
用語「非特異的結合」は、特異的表面構造と比較的無関係な分子間の非共有結合を指す。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用を含むいくつかの因子により生じうる。
用語「抗体」は、他の分子の特定の空間的かつ中心的な構成に特異的に結合し、それによって該構成に関して相補的であると定義される免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが可能であり、宿主の免疫および血清の採集などの当技術分野で良く知られている技法により（ポリクローナル）、または継続的なハイブリッド細胞系を調製し分泌タンパク質を採集することにより（モノクローナル）、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはそれらの変異誘発物をクローニングし発現させることによって調製することが可能である。抗体には、完全長の免疫グロブリンまたはそれらの断片が含まれ、免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどのさまざまなクラスおよびアイソタイプが含まれる。それらの断片には、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが含まれる。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限りは、必要に応じて免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマー、および複合物を用いることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する（図１）。この手法は、オリゴヌクレオチド鎖によって機能化されたタンパク質認識要素、および金ナノ粒子の凝集をもたらすハイブリダイゼーションなる事象は、金ナノ粒子の物理的性質（たとえば、光学的、電気的、機械的）を著しく変化させることが可能であるというこれまでの知見をうまく利用している８〜１２。個々の調整可能なハイブリダイゼーション特性と融解特性とを有する様々なオリゴヌクレオチド配列、および、融解の際には変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化（ｄｅｃｏｄｅ）するナノ粒子に関係する物理的特徴によって、各タンパク質認識要素を符号化（ｅｎｃｏｄｅ）することが可能である、というのが概略的な構想である。したがって、ＤＮＡ結合凝集体の融解温度と、融解の際に変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化するナノ粒子に関係する物理的特性とを使用することが一般的に可能である。本願明細書におけるバーコードは、脱符号化される情報が、あらかじめ設計されたオリゴヌクレオチド配列中に保存された化学的情報の形態であるという点で、ナノロッド２３、フルオロフォア標識ビーズ２４および量子ドット２５などの物理的診断マーカーに基づくバーコードとは異なっている。
【００４７】
本発明の一態様では、サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するための方法を提供する。下記実施例に示す免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）などの抗体は、適切なハプテン（ＩｇＧ１の場合にはビオチン、ＩｇＥの場合にはジニトロフェニル（ＤＮＰ）；図１（Ａ））で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖で予めハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド修飾プローブにより検出することが可能である１３，１４。下記実施例に示す概念実証アッセイにおけるＤＮＡ配列は、ＩｇＧ１およびＩｇＥとのプローブ反応から生成する２つの異なる凝集体が異なる温度で融解することが確実と思われる方法で設計した（図１（Ｂ））。ＩｇＧ１用プローブは、ＩｇＥ用プローブよりも長い配列を有し、Ｇ、Ｃ塩基含有量も高い。したがって、前者の配列は、後者の配列よりも高い温度で融解する。このような配列による違いにより、プローブと反応してナノ粒子凝集体を生成したのがどの標的であったかを同定するための符号として使用可能な異なる融解特性を有するプローブを調製することができる。３つの異なるシステム、すなわち（１）１つの標的抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＥ）が存在する２つのプローブ；（２）２つの異なる標的抗体が存在する２つのプローブ；および（３）標的抗体が存在しない対照について検討した。
【００４８】
本発明のこの態様では、サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するため
の方法であって、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子プローブを、標的分析物を含有する可能性のあるサンプルと接触させることからなる方法を提供する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果として、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と結合する。リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分は、ハイブリダイゼーションの結果として、分析物に対する特異結合性相補体（たとえば、抗原）が結合したオリゴヌクレオチドと結合する。接触は、分析物とナノ粒子プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で行う。標的分析物の存在下では、ナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体は、任意の好適な手段によって検出することができる。
【００４９】
本発明を実施する際には、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を、標的分析物に対する特異結合性相補体で修飾されたオリゴヌクレオチド、およびリポーター・オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによってナノ粒子複合体プローブを調製する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と相補的である配列を有する。特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的である配列を有する。成分間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、リポーター・オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ナノ粒子複合体プローブを生成する。成分の十分なハイブリダイゼーションを可能にするナノ粒子複合体溶液を調製する際には、任意の好適な溶媒およびハイブリダイゼーション条件を用いることができる。成分を、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなるリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で室温において約２〜３時間ハイブリダイズさせることが好ましい。ハイブリダイゼーション混合物中のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物の濃度は、約２〜約５０ｎＭであり、約１３ｎＭであることが好ましい。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの濃度は、一般に約５０〜約９００ｎＭであり、約３００ｎＭであることが好ましい。リポーター・オリゴヌクレオチドの濃度は、一般に約５０〜約９００ｎＭであり、約３００ｎＭであることが好ましい。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびリポーター・オリゴヌクレオチドは、任意の好適な手段、好ましくはハイブリダイゼーション混合物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）した後に上清をデカンテーションによって任意で除去してもよく、除去することが好ましい。調製した複合体は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）、０．０１％アジド溶液中で４〜６℃において保存した。
【００５０】
サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するための典型的アッセイは以下の通りである。オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体を有するオリゴヌクレオチドからなるナノ粒子複合体プローブを含有する溶液を、標的タンパク質を含有すると考えられる水性サンプル溶液と混合する。水性サンプル溶液中の総タンパク質含有量は、一般に約５〜約１００ｕｇ／ｍｌであり、通常は約４３ｕｇ／ｍｌである。反応混合物中のナノ粒子の濃度は、一般に約２〜約２０ｎＭであり、通常は約〜１３ｎＭである。得られる混合物の総容積は、一般に約１００〜約１０００ｕＬであり、約４００ｕＬであることが好ましい。標的分析物を含有すると考えられる水性サンプル溶液を調製する際には任意の好適な溶媒を用いることができ、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）からなるＰＢＳが好ましい。
【００５１】
次いで、得られたアッセイ混合物を、特異結合性ペア、たとえばタンパク質‐ハプテンの複合体生成を容易にするのに十分な、約３５〜約４０℃の温度、好ましくは３７℃において、約３０〜約６０分の間、好ましくは約５０分間インキュベートする。標的タンパク質が存在する場合には、粒子の凝集が起き、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドの
シフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（たとえば、３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析に先立ってデカンテーションにより除去する。
【００５２】
望ましい場合には、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、およびハプテン修飾オリゴヌクレオチドの全てを、標的分析物を含有すると考えられるサンプルと混合することにより、アッセイ混合物内でｉｎ ｓｉｔｕでナノ粒子複合体プローブを調製してもよい。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全なハイブリダイゼーションを確実にするため、アッセイ混合物を−１５℃において２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進させ（ベケル社（Ｂｏｅｋｅｌ）製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄブロックインキュベータ）、４℃において２４時間保存する。しかしながら、本発明を実施する際には、アッセイ反応を実施する前にナノ粒子複合体プローブを調製し、ナノ粒子複合体プローブ内のＤＮＡバーコードの量を増加させることが好ましい。
【００５３】
どのタンパク質が存在するかを決定するため、温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする凝集体の融解分析を溶液中で行うことができる。たとえば、１つまたは２つの既知の標的分析物：ＩｇＧ１およびＩｇＥを含有するサンプルの分析について説明する実施例３の図２を参照のこと。実施例３で述べるように、前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理する場合、溶液はピンクがかった青色に変化し、ナノ粒子凝集体の生成を示す。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析は、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位を示している。これは、ＩｇＧ１標的について予想された相転位である（図２Ａ（破線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析からは、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。注目すべきことに、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析は、２つの明確なトランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）を示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つの別個の会合体が生成し、オリゴヌクレオチド・バーコードに由来するそれらの融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを示している。
【００５４】
本発明の別の態様では、上記の凝集法戦略の変形形態を用い、前述のシステムの感度を高め、１溶液中で調べることが可能な標的数を増加させることが可能である。たとえば、実施例４の図３を参照のこと。この戦略により、特定の標的分析物に割り当てられたＤＮＡバイオバーコードまたは独自のリポーター・オリゴヌクレオチドにより、タンパク質標的を間接的に検出することが可能である。一般に、標的分析物用のリポーター・オリゴヌクレオチドの好適な長さ、ＧＣ含量、および配列、ならびに選択は、アッセイの前にあらかじめ定められる。たとえば、１２量体オリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、それらの多くを用いて図１Ａに示すように目的の多価タンパク質用のバーコードを調製することが可能である。アッセイのこの変形形態では、生成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（たとえば、３０００ｒｐｍで２分間）により、未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のリポーター・オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、任意の好適な手段によって、たとえば溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、リポーター・オリゴヌクレオチドまたはバーコードを遊離させる。リポーター・オリゴヌクレオチドが少量である場合には、当技術分野で知られている方法によって増幅することができる。たとえば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅が好ましい。粒子およびタンパク質を、任意の好適な手段、たとえば遠心濾過装置（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ‐１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によ
ってリポーター・オリゴヌクレオチドから分離することが可能である。リポーター・オリゴヌクレオチドを単離したら、オリゴヌクレオチド・アレイ上に捕捉し、多くの好適なＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。ＩｇＧ１およびＩｇＥに関する本願明細書に記載の実施例の場合には、対象のバーコード（図１のＡ３およびＢ３）の半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にリポーター・オリゴヌクレオチドを捕捉する。バーコードがオリゴヌクレオチド・アレイによって捕捉されれば、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることが可能である（実験の項を参照）。標準的なスキャン測定の手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）により現像されれば、フラットベッド・スキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合には、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが存在する唯一のタンパク質である場合には、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合には、両スポットが強いシグナルを示す。
【００５５】
本発明は、１溶液中で単一または複数の多価タンパク質を検出するために、オリゴヌクレオチドにより大きく機能化されたナノ粒子プローブ（好ましくは金ナノ粒子プローブ）を使用するための２つの戦略を提供するという理由から重要である。実際、１サンプル中の複数のタンパク質の検出は面倒で、時間がかかり、高額な費用を要するプロトコルが必要である。この点で、他の研究者は最近、１溶液中で複数のタンパク質標的を認識するためにフルオロフォア標識ペプチド核酸およびＤＮＡマイクロアレイを用いている１５〜１７。しかしながら、この方法は、オリゴヌクレオチドで標識したタンパク質のマイクロアレイ表面への結合に依存する。本願明細書に記載の方法の最終工程は、通常のＤＮＡの表面化学反応にのみ基づいている。したがって、前記工程に最新のナノ粒子ＤＮＡ検出法９、１１の多くの高感度の態様を援用することは可能であるが、同工程は検出の際に存在するタンパク質を得ることなく、ＤＮＡではなくタンパク質を検出することができる。表面アッセイの場合、タンパク質は短いオリゴヌクレオチドに比べて扱いがより困難である。なぜなら、タンパク質は、より非特異的に固体支持体へ結合する傾向があり、大きなバックグラウンド・シグナルにつながることが多いためである。最後に、均一系アッセイの場合には、これらのナノ粒子構造に関係する非常に鋭敏な融解プロファイルにより、通常の幅広いＤＮＡ融解挙動を示すプローブによって可能と思われるよりも多くのバイオバーコードを設計することができるはずである。
【００５６】
本発明は、検出アッセイにおける使用に適した、オリゴヌクレオチドを結合した任意の好適な粒子の使用法を企図している。しかしながら、本発明を実施する際にはナノ粒子が好ましい。粒子のサイズ、形および化学組成は、ＤＮＡバーコードを含んで得られるプローブの特性に寄与するはずである。これらの特性には、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液における安定性、孔およびチャネルのサイズの違い、フィルタとしての役割を果たす際の生理活性分子の分離能などが含まれる。さまざまなサイズ、形および／または化学組成を有する粒子の混合物の使用法、ならびに均一なサイズ、形および／または化学組成を有するナノ粒子の使用法が企図されている。好適な粒子の例には、ナノサイズおよびミクロサイズの（ｎａｎｏ− ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｉｚｅｄ）コア粒子、凝集体粒子、等方性粒子（球状粒子など）および異方性粒子（非球状ロッド、４面体、プリズムなど）ならびに本願明細書に援用する特許文献２および特許文献３に記載の粒子などのコア‐シェル粒子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の実施に有用なナノ粒子には、金属（たとえば、金、銀、銅および白金）、半導体（たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコーティングされたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）および磁性（たとえば、フェロマグネタイト（ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｔｅ））コロイド材料が含まれる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔ
ｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが含まれる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）まで、より好ましくは約５から約５０ｎｍまで、最も好ましくは約１０から約３０ｎｍまでである。ナノ粒子は、ロッド、プリズム、または４面体であってもよい。
【００５８】
金属、半導体および磁性ナノ粒子を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。たとえば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８を参照のこと。
【００５９】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓナノ粒子を製造する方法も、当技術分野で知られている。たとえば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６を参照のこと。
【００６０】
また、好適なナノ粒子は、たとえば、テッド・ペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．）（金）、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）およびナノプローブス社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）（金）から市販されている。
【００６１】
現在は、核酸を検出するのに金ナノ粒子を用いることが好ましい。金コロイド粒子は、それらの美しい色を生み出す帯域（バンド）に関して高い吸光係数を有する。これらの強い色は、粒径、濃度、粒子間距離、ならびに凝集の程度および凝集体の形（幾何学的形状）によって変化し、これらの材料を比色アッセイにとって特に魅力的にしている。たとえば、金ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドおよび核酸とハイブリダイゼーションさせると、肉眼で見ることができる迅速な変色をもたらす（たとえば、実施例を参照のこと）。
【００６２】
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために、ナノ粒子、オリゴヌクレオチドまたは双方を官能基化する。そのような方法は当技術分野で知られている。たとえば、３’末端または５’末端においてアルカンチオールにより官能基化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子と容易に結合する。非特許文献１７を参照のこと。また、非特許文献１８（３’チオールＤＮＡを平らな金表面に結合する方法について記載している；この方法を用いてオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合することが可能である）を参照のこと。また、アルカンチオール法を用い、他の金属、半導体および磁性コロイドならびに上記に列挙した他のナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合することが可能である。オリゴヌクレオチドを固体表面に接続するための他の官能基には、ホスホロチオエート基（オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面との結合については特許文献４を参照）、置換アルキルシロキサン（オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面との結合については非特許文献１９および非特許文献２０を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合については非特許文献２１を参照）が含まれる。また、末端が５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に結合するのに使用することができる。以下の参照文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するのに用いることができる他の方法について記載している：非特許文献２２（金上のジスルフィド）、非特許文献２３（アルミニウム上のカルボン酸）、非特許文献２４（銅上のカルボン酸）、非特許文献２５（シリカ上のカルボン酸）、非特許文献２６（白金上のカルボン酸）、非特許文献２７（白金上の芳香環化合物）、非特許文献２８（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能基化された溶媒）、非特許文献２９（白金上のイソニトリル）、非特許文献３０（シリカ上のシラン）、非特許文献３１（シリカ上のシラン）、非特許文献３２（シリカ上のシラン）、非特許
文献３３（二酸化チタン上およびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）、非特許文献３４（金属上のリジッドなホスフェート）。
【００６３】
特許文献５〜８は、本発明を実施する際に有用である環状ジスルフィドで官能基化されたオリゴヌクレオチドについて記載している。環状ジスルフィドは、それらの環内に、２個のイオウ原子を含む５または６個の原子を有することが好ましい。好適な環状ジスルフィドは市販されているが周知の方法によって合成してもよい。還元型の環状ジスルフィドも使用可能である。
【００６４】
リンカーは、環状ジスルフィドに結合された炭化水素部分からさらになることが好ましい。好適な炭化水素は市販されており、環状ジスルフィドに結合される。炭化水素部分は、ステロイド残基であることが好ましい。環状ジスルフィドに結合されたステロイド残基からなるリンカーを用いて調製されたオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物は、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを用いて調製された複合物に比べ、チオール（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液中で使用されるジチオスレイトール）に対して著しく安定であることが予想外に見いだされた。実際、本発明のオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物は、３００倍以上安定であることが分かった。この予想外の安定性は、おそらく各オリゴヌクレオチドが単一のイオウ原子ではなく２個のイオウ原子を介してナノ粒子にしっかり固定されていることに起因している。特に、環状ジスルフィドの隣接する２個のイオウ原子は、オリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物を安定化するのに有利であろうキレート化効果を有すると考えられる。また、リンカーの大きな疎水性ステロイド残基も、水溶性分子のナノ粒子表面への接近からナノ粒子を守ることによって複合物の安定性に寄与しているように見える。
【００６５】
上記に鑑み、環状ジスルフィドの２個のイオウ原子は、双方のイオウ原子がナノ粒子と同時に結合することが可能であるように互いに十分近接していることが好ましい。２個のイオウ原子は、互いに隣接していることが最も好ましい。また、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を守る大きな疎水表面をもたらすように大きくなければならない。
【００６６】
環状ジスルフィド・リンカーが用いられたオリゴヌクレオチド‐環状ナノ粒子複合物は、特許文献５〜８に記載のように、サンプル中の標的分析物を検出するための診断アッセイにおけるプローブとして用いることができる。これらの複合物は、それらが使用される診断アッセイの感度を向上させることが分かった。特に、環状ジスルフィドに結合されたステロイド残基からなるリンカーを用いて調製されたオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物を用いるアッセイは、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを用いて調製された複合物を用いるアッセイよりも約１０倍以上感度が良いことが分かった。
【００６７】
各ナノ粒子は、複数個のオリゴヌクレオチドが結合したものとする。結果として、各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物は、相補的配列を有する複数個のオリゴヌクレオチドまたは核酸と結合することが可能である。
【００６８】
規定の配列のオリゴヌクレオチドは、本発明の実施におけるさまざまな目的で使用される。あらかじめ定められた配列のオリゴヌクレオチドを製造する方法はよく知られている。たとえば、非特許文献１および非特許文献３５を参照のこと。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの双方にとって固相合成法が好ましい（ＤＮＡを合成するよく知られた方法は、ＲＮＡを合成するためにも有用である）。また、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することも可能である。標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドの場合には、タンパク質などの特異結合性相補体をオリゴヌクレオチドに結合するのに適した任意の方法を使用してよい。
【００６９】
ナノスフェア表面上にオリゴヌクレオチドを結合するのに適した任意の方法を使用可能である。表面上にオリゴヌクレオチドを接続するための特に好ましい方法は、本願明細書に援用する特許文献７〜１５に記載のエージング工程に基づいている。エージング工程は、安定性および選択性が予想外に強化されたナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を提供する。この方法は、好ましくはナノ粒子に結合可能な官能基からなる部分が共有結合しているオリゴヌクレオチドを提供することからなる。それらの部分および官能基は、オリゴヌクレオチドのナノ粒子との結合（すなわち、化学吸着または共有結合による）を可能にする部分であり官能基である。たとえば、５’または３’末端に共有結合したアルカンチオール、アルカンジスルフィドまたは環状ジスルフィドを有するオリゴヌクレオチドを用い、金ナノ粒子を含むさまざまなナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合させることが可能である。
【００７０】
官能基によってオリゴヌクレオチドの少なくとも一部をナノ粒子と結合させるのに十分な時間、水中でオリゴヌクレオチドをナノ粒子と接触させる。このような時間は実験的に決定することが可能である。たとえば、約１２〜２４時間で良好な結果を得られることが分かった。オリゴヌクレオチドを結合させるための他の好適な条件も実験的に決定することが可能である。たとえば、約１０〜２０ｎＭのナノ粒子濃度および室温におけるインキュベーションは良好な結果をもたらす。
【００７１】
次に、少なくとも１種類の塩を水に加えて塩溶液を生成する。塩は、任意の好適な水溶性塩でよい。たとえば、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、２種類以上のこれらの塩の組合せ、またはリン酸緩衝液に溶かしたこれらの塩の１つであってもよい。塩は、濃溶液として加えることが好ましいが、固体として加えてもよい。塩を水に全て一度に加えることは可能であり、または塩を徐々に時間をかけて加える。「徐々に時間をかけて」とは、一定時間の間隔をおいて少なくとも二分して塩を加えることを意味する。好適な時間間隔は実験的に決定することが可能である。
【００７２】
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド相互の少なくとも一部の静電気斥力、および、負の電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの正の電荷を帯びたナノ粒子に対する静電気引力、または負の電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの負の電荷を帯びたナノ粒子からの静電気斥力のいずれかに打ち勝つのに十分でなければならない。徐々に時間をかけて塩を加えることによって静電気引力および斥力を徐々に減らすことは、ナノ粒子上にオリゴヌクレオチドの最大の表面密度をもたらすことが分かった。各塩または塩の組合せについての好適なイオン強度は、実験的に決定することが可能である。リン酸緩衝液に溶かして塩化ナトリウムの終濃度を約０．１Ｍから約１．０Ｍとすると（塩化ナトリウムの濃度を徐々に時間をかけて高めることが好ましい）、良好な結果をもたらすことが分かった。
【００７３】
塩を加えた後、十分に加えたオリゴヌクレオチドをナノ粒子と結合させて安定なナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を生成するのに十分な時間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドおよびナノ粒子をインキュベートする。以下で詳細に説明するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度の増加は、複合物を安定化することが分かった。このインキュベーション時間は、実験的に決定することが可能である。約２４〜４８、好ましくは４０時間の総インキュベーション時間は、良好な結果をもたらすことが分かった（これはインキュベーションの合計時間である；上記のように塩濃度は、この合計時間をかけて徐々に増加させることが可能である）。本願明細書においては、塩溶液におけるこの第２のインキュベーション時間を「エージング」工程と呼ぶ。この「エージング」工程に好適な他の条件も、実験的に決定することが可能である。たとえば、室温およびｐＨ７．０におけるインキュベーションは良好な結果をもたらす。
【００７４】
「エージング」工程を使用することによって生成される複合物は、「エージング」工程なしに生成される複合物よりもかなり安定であることが見出されている。前述のように、この安定性の増大は、「エージング」工程によって得られる、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増大によるものである。「エージング」工程によって得られる表面密度は、ナノ粒子のサイズおよびタイプならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に左右されるはずである。ナノ粒子を安定にするのに十分な表面密度ならびにナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの望ましい組合せについてそのような表面密度を得るのに必要な条件は、実験的に決定することが可能である。一般に、安定なナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を提供するには少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度で十分であろう。表面密度は、少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２であることが好ましい。表面密度があまりに大きい場合に、複合物のオリゴヌクレオチドが核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力が減少することがあるため、表面密度は約３５〜４０ピコモル／ｃｍ２以下であることが好ましい。
【００７５】
本願明細書で使用する「安定（な）」とは、複合物が製造されてから少なくとも６ヶ月間、大部分のオリゴヌクレオチドはナノ粒子との結合を維持し、そのオリゴヌクレオチドは、核酸を検出する方法およびナノファブリケーションの方法において遭遇する標準的条件下で核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズすることができることを意味する。
【００７６】
認識部分およびスペーサー部分からなる認識オリゴヌクレオチドを使用することにより、ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物のハイブリダイゼーション効率を劇的に向上させうることが分かった。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部分およびスペーサー部分からなり、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズするのは認識部分である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、ナノ粒子と結合可能なように設計される。たとえば、スペーサー部分は、それと共有結合された部分を有し、その部分は、ナノ粒子と結合可能な官能基からなる。これらは、前述のような部分および官能基である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分がナノ粒子と結合する結果、認識部分はナノ粒子の表面から間隔をおいて配置され、その標的とのハイブリダイゼーションにとってより好都合である。認識部分のナノ粒子からの良好な間隔を提供するスペーサー部分の長さおよび配列は、実験的に決定することが可能である。少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ましくは１０〜３０個のヌクレオチドからなるスペーサー部分が良好な結果をもたらすことが分かった。スペーサー部分は、ナノ粒子または核酸標的もしくはオリゴヌクレオチド標的と結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を妨害しない任意の配列を有しうる。たとえば、スペーサー部分は、相互に、認識オリゴヌクレオチドの配列と、または認識オリゴヌクレオチドの核酸標的もしくはオリゴヌクレオチド標的と相補的な配列であってはならない。スペーサー部分のヌクレオチドの塩基は、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンであることが好ましく、さもないと今述べた問題点の１つの原因となるであろう。塩基はすべてアデニンまたはすべてチミンであることがより好ましい。塩基はすべてチミンであることが最も好ましい。
【００７７】
認識オリゴヌクレオチドの他に希釈オリゴヌクレオチドを使用することが、複合物を調整して生成する手段を提供し、望ましいレベルのハイブリダイゼーションをもたらすことがさらに分かった。希釈および認識オリゴヌクレオチドは、複合物を調製するためにナノ粒子と接触させる溶液中のそれらの比とほぼ同じ比率でナノ粒子に結合することが分かった。したがって、ナノ粒子に結合した希釈オリゴヌクレオチドと認識オリゴヌクレオチドの比を、複合物が望ましい数のハイブリダイゼーション事象に関与するように制御するこ
とが可能である。希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合され、または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的と結合する能力を妨害しない任意の配列を有しうる。たとえば、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列と相補的な配列を有してはならない。また、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがそれらの核酸またはオリゴヌクレオチド標的と結合することが可能であるように、認識オリゴヌクレオチドよりも長さが短いことが好ましい。認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分を有する場合には、希釈オリゴヌクレオチドは、スペーサー部分とほぼ同じ長さであることが最も好ましい。このように、希釈オリゴヌクレオチドは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする認識オリゴヌクレオチドの認識部分の能力を妨害しない。希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同様の配列を有することがより好ましい。
【００７８】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するには、粒子複合体プローブ、好ましくはナノ粒子複合体プローブを用いる。これらの粒子複合体は、実際のアッセイ行う前、またはアッセイを行う間にｉｎ ｓｉｔｕで生成することができる。これらの複合体は、オリゴヌクレオチドを結合した粒子、好ましくはナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる。ＤＮＡバーコードすなわちリポーター・オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを介して結びつく。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの一部およびリポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的である配列を有し特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを介して結びつく。標的分析物を含有するサンプル中で用いられた場合、ナノ粒子複合体は標的分析物と結合し、凝集が起きる。前述のように複数の標的が存在する場合、凝集体を単離し、さらに融解分析にかけて特定の標的分析物を同定することができる。代替例として、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離させることが可能である。次いで、これらのリポーター・オリゴヌクレオチドを、任意の好適な検出プローブを用いる任意の好適なＤＮＡ検出システムによって検出することが可能である。
【００７９】
本発明の別の態様では、凝集体の脱ハイブリダイゼーションによって遊離されたリポーター・オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドが結合した基材を用いて検出することが可能である。前記オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドを検出する方法の一部の実施形態は、リポーター・オリゴヌクレオチドを捕捉するために相補的オリゴヌクレオチドが結合された基材を利用する。次いで、これらの捕捉されたリポーター・オリゴヌクレオチドを任意の好適な手段によって検出する。基材を用いることにより、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイの感度を向上させることが可能である。
【００８０】
検出可能な変化の観察を可能にする任意の基材を使用しうる。好適な基材には、透明な固体表面（たとえば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）、不透明な固体表面（たとえば、ＴＬＣシリカ・プレート、濾紙、ガラス繊維フィルタ、硝酸セルロース膜、ナイロン膜などの白色個体表面）、および導電性固体表面（たとえば、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ））が含まれる。基質は任意の形または厚さでよいが、一般には平坦で薄いであろう。ガラス（たとえば、スライド・ガラス）またはプラスチック（たとえば、マイクロタイター・プレートのウエル）などの透明な基材が好ましい。
【００８１】
オリゴヌクレオチドを基材に結合させるのに適したいずれの方法も使用することができる。例を挙げれば、オリゴヌクレオチドを、たとえば非特許文献３６〜４０および非特許文献１８に記載のようにして基材に結合することが可能である。
【００８２】
基材に接続されたオリゴヌクレオチドは、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第１の部分と相補的な配列を有する。基材上のオリゴヌクレオチドのリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下でリポーター・オリゴヌクレオチドを基材と接触させる。このようにしてリポーター・オリゴヌクレオチドが基材と結合する。ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物などの検出プローブを加える前に、結合していないリポーター・オリゴヌクレオチドをすべて基材から洗浄することが好ましい。
【００８３】
本発明の一態様では、基材上のオリゴヌクレオチドと結合したリポーター・オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを結合した第１のタイプのナノ粒子と接触させる。オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第２の部分と相補的な配列を有し、接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で行う。このようにして第１のタイプのナノ粒子が基材と結合する。ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を基材と結合させた後、基材を洗浄し、結合していないナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物をすべて除去する。
【００８４】
第１のタイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、すべて同じ配列を有しても、または検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの別の部分とハイブリダイズする、異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子は、その異なるオリゴヌクレオチドすべてを結合してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドは異なるナノ粒子に接続していることが好ましい。あるいは、第１のタイプの各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが複数の異なる配列を有し、それらのうちの少なくとも１つは、検出すべきリポーター・オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズしなければならない。
【００８５】
場合により、基材に結合した第１のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を、オリゴヌクレオチドが結合した第２のタイプのナノ粒子と接触させる。これらのオリゴヌクレオチドは、第１のタイプのナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、接触は、第１のタイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが第２タイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするのを可能にするのに有効な条件下で行う。ナノ粒子が結合した後で、基材を洗浄し、結合していないナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物をすべて除去することが好ましい。
【００８６】
ハイブリダイゼーションの組合せにより検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は、複数のハイブリダイゼーションの結果検出可能な変化が増幅されることを除いて、前述の変化と同様である。特に、第１のタイプの各ナノ粒子は、複数のオリゴヌクレオチド（同一または異なる配列を有する）が接続されているので、第１のタイプの各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物は、複数の第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物とハイブリダイズすることが可能である。また、第１のタイプのナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合物は、検出すべきリポーター・オリゴヌクレオチドの２つ以上の部分とハイブリダイズさせることができる。複数のハイブリダイゼーションによってもたらされる増幅は、変化を初めて検出可能にし、または検出可能な変化の大きさを増大させることができる。この増幅は、アッセイの感度を高め、少量のリポーター・オリゴヌクレオチドの検出を可能にする。
【００８７】
望ましい場合には、第１および第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物の逐次追加によってナノ粒子の付加的層を積み上げることが可能である。このように、標的核酸１分子当たり固定化されるナノ粒子数をさらに増加させ、これに応じたシグナルの強度を増大させることが可能である。
【００８８】
また、相互に直接ハイブリダイズするように設計された第１および第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を用いる代わりに、結合しているオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を一緒に結合させることに役立つと思われるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子が使用できると考えられる。
【００８９】
基材を用いる場合には、標的リポーター・オリゴヌクレオチドの複数の部分を検出するため、複数の異なるリポーター・オリゴヌクレオチドを検出するため、または双方を検出するために、アレイ中の基材に複数の初期タイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物またはオリゴヌクレオチドを結合することが可能である。たとえば、基材にスポットの列を備え、各スポットは、標的リポーター・オリゴヌクレオチドの部分と結合するように設計されたさまざまなタイプのオリゴヌクレオチドを含める。１つまたは複数のリポーター・オリゴヌクレオチドを含有するサンプルを各スポットに供し、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合物を用いて前述の方法のうちの１つで残りのアッセイを行う。
【００９０】
最後に、基材を用いる場合には、銀染色によって検出可能な変化を生成し、またはさらに増強することが可能である。銀染色は、銀の還元を触媒する任意のタイプのナノ粒子について用いることが可能である。貴金属（たとえば、金および銀）でできたナノ粒子が好ましい。非特許文献４１および４２を参照のこと。核酸の検出に用いられているナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合には、銀イオンを核酸と複合体形成させ、還元を触媒することが可能である。非特許文献４３を参照のこと。また、核酸上のリン酸基と反応させることが可能な銀染色も知られている。
【００９１】
銀染色を用い、前述のアッセイを含む基材上で行われる任意のアッセイにおいて検出可能な変化を生成または増強することが可能である。特に、銀染色は、ナノ粒子の層の使用を多くの場合に省略することが可能であるように、単一タイプのナノ粒子を用いるアッセイの感度を非常に増大させることが分かった。
【００９２】
基材上で行われるリポーター・オリゴヌクレオチドを検出するためのアッセイでは、検出可能な変化をオプティカル・スキャナで観察することが可能である。好適なスキャナには、コンピュータに文書を取り込むために用いられる反射モードで操作する可能なスキャナ（たとえば、フラットベッド・スキャナ）、この機能を実行する能力があり、または同タイプの光学系を利用する他の装置、任意のタイプのグレースケール感応性測定装置、および本発明に従って基材をスキャンするように改変された標準的スキャナ（たとえば、基材のホルダーを備えるように改変されたフラットベッド・スキャナ）が含まれる（現時点では、透過モードで動作するスキャナを用いることが可能かどうかは分かっていない）。スキャナの解像度は、基材上の反応領域がスキャナの単一画素より大きいように十分でなければならない。任意の基材にスキャナを使用することが可能であるが、ただしアッセイによって生みだされる検出可能な変化は基材を背景にして観察が可能でなければならない（たとえば、銀染色によって生成されるスポットなどの灰色のスポットは、白色の背景では観察することが可能であるが、灰色の背景で観察することは不可能である）。スキャナは、白黒スキャナであることが可能であり、カラー・スキャナであることが好ましい。スキャナは、コンピュータに文書を取り込むのに使用されるタイプの標準的カラー・スキャナであることが最も好ましい。このようなスキャナは、安価で容易に入手が可能である。たとえば、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ Ａｓｔｒａ１２００（３００×３００ｄｐｉ）、Ｍｉｃｒｏｔｅｃ１６００（１６０
０×１６００ｄｐｉ）を使用することが可能である。基材をスキャンすることによって得られる画像を処理するためのソフトウェアが搭載されたコンピュータにスキャナを連結する。ソフトウェアは、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．２およびＣｏｒｅｌ Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ８．０などの容易に入手が可能である標準的ソフトウェアであることが可能である。グレースケール測定を計算するためのソフトウェアの使用は、アッセイの結果を定量する手段を提供する。また、ソフトウェアは、着色スポットの色数を提供することが可能であり、核酸の存在の定性的な判定、核酸の量、またはその双方を提供するように再検討することが可能であるスキャン画像（たとえば、プリントアウト）を作製することが可能である。コンピュータは、容易に入手が可能である標準的パーソナル・コンピュータであることが可能である。したがって、標準的ソフトウェアが搭載された標準的コンピュータに連結された標準的スキャナの使用は、アッセイを基材上で行った場合に核酸を検出および定量する便利かつ容易で安価な手段を提供することが可能である。また、スキャンをコンピュータに保存し、さらに参照または使用するために結果の記録を保存することが可能である。勿論、望ましい場合には、より高性能な機器およびソフトウェアを使用することが可能である。
【００９３】
任意の標的リポーター・オリゴヌクレオチドのアッセイでは、ユニバーサルなナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を使用することができる。この「ユニバーサル・プローブ」は、単一配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、リポーター・オリゴヌクレオチドの一部と相補的である。ユニバーサル・プローブに結合されたオリゴヌクレオチドは、支持体に結合されたリポーター・オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズすることが可能である。第１の部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的である。第２の部分は、検出すべき核酸の配列の一部と相補的である。結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に、検出すべき核酸の複数部分または異なる核酸標的に「ユニバーサル・プローブ」が結合することが可能である場合には、同一の第１の部分および異なる第２の部分を有する複数の結合オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【００９４】
用語「ある（ａまたはａｎ）」ものは、１つまたは複数のものを指すことに注意すべきである。たとえば、「ある特徴」は、１つまたは複数の特徴または少なくとも１つの特徴を指す。したがって、用語「ある（ａまたはａｎ）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は本願明細書では互換的に用いられる。また、用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」を互換的に用いてきたことにも注意すべきである。
【実施例１】
【００９５】
（オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製）
Ａ．金（ｇｏｌｄ）ナノ粒子の調製
オリゴヌクレオチド修飾した１３ｎｍの金（Ａｕ）粒子を、文献の方法によって調製した（〜１１０個のオリゴヌクレオチド／粒子）１８〜２０。金コロイド（直径１３ｎｍ）は、非特許文献４４および４５に記載のように、ＨＡｕＣｌ４のクエン酸塩の還元によって調製した。簡潔に説明すると、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌを３部、ＨＮＯ３を１部）で洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）Ｈ２Ｏですすぎ、次いで使用前にオーブンで乾燥した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムは、アルドリッチケミカルカンパニー社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４の水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を撹拌しながら還流させ、次いで３８．８ｍＭクエン酸３ナトリウム溶液５０ｍＬを素早く加えると、溶液の色が淡黄色から深赤色に変化した。変色後、溶液をさらに１５分還流し、室温まで冷却させ、続いてマイクロンセパレーションインコーポレイティッド社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）の０．４５μｍナイロン・フィルタで濾過した。金コロイドの特徴は、ヒューレット・
パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計を用いる紫外可視分光法、および日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いる透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって明らかにした。直径１３ｎｍの金粒子の典型的な溶液は、５１８〜５２０ｎｍに中心がある特徴的な表面プラズモンバンドを示した。直径１３ｎｍの金粒子は、１０〜７２ヌクレオチドの範囲の標的およびプローブ・オリゴヌクレオチド配列と凝集した場合に目に見える変色を生じるであろう。
【００９６】
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト化学反応を用いる単一カラム式のＭｉｌｌｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置を用い、１マイクロモルのスケールで合成した（非特許文献４６）。すべての溶液はミリジーン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）から購入した（ＤＮＡ合成用）。平均カップリング効率は９８から９９．８％まで変化し、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基はオリゴヌクレオチドから切断せず、精製に役立てた。
【００９７】
３’チオール‐オリゴヌクレオチドの場合には、Ｔｈｉｏｌ‐Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３
Ｓ‐Ｓ ＣＰＧ支持体をグレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入し、自動合成装置で使用した。最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は除去せず、精製に役立てた。合成後、担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。
【００９８】
アンモニアを蒸発させた後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いた分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴ保護された１２塩基の修飾オリゴマーの保持時間は３０分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチド（１０ＯＤ）を５０℃において一晩、０．０４Ｍ ＤＴＴ、０．１７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）溶液１００μＬ中に再分散させ３’ジスルフィドを切断した。この溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を脱塩用ＮＡＰ‐５カラムにより精製した。オリゴヌクレオチドの量は、２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。純度は、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）および１０ｍＭ ＮａＯＨの２％／分グラジエントによるＤｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ（登録商標）ＰＡ‐１００カラム（２５０×４ｍｍ）を用いるイオン交換ＨＰＬＣによって評価した。保持時間（Ｔｒ）が１８．５、１８．９および２２分である３本のピークが観察された。Ｔｒ＝２２．０分の主要な単一ピークはジスルフィドによるものとされ、面積は７９％であった。より短い１８．５および１８．９分という保持時間の２本のピークは、面積がそれぞれ〜９％および１２％であり、酸化された不純物および残留チオール・オリゴヌクレオチドによるものとされた。
【００９９】
５’アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した。１）ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した；２）ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した；３）５‐Ｔｈｉｏｌ‐Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６‐ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））２０μｍｏｌｅを含有する乾燥アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混合し、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオチド‐ＣＰ
Ｇが入ったカートリッジ中に導入した；４）同溶液を、カートリッジ内をゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した；５）ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄した。次いで、３’‐アルキルチオール・オリゴヌクレオチドで記載したように、トリチルオリゴヌクレオチド誘導体を単離し精製した。次いで、乾燥オリゴヌクレオチドサンプルに５０ｍＭ ＡｇＮＯ３溶液１５μＬ（１０ＯＤの場合）を加えることによって（２０分間）トリチル保護基を切断すると、乳白色の懸濁液が得られた。ＤＴＴの１０ｍｇ／ｍＬ溶液２０μＬを加えることによって過剰の硝酸銀を除去すると（５分の反応時間）、直ちに黄色の沈殿を生成し、これを遠心分離によって除去した。次いで、オリゴヌクレオチド溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を精製のために脱塩用ＮＡＰ‐５カラムに移した。得られた５’アルキルチオール・オリゴヌクレオチドの最終的な量および純度は、３’アルキルチオール・オリゴヌクレオチドについて前述した技法を用いて評価した。イオン交換ＨＰＬＣによって２本の主要ピークが観察され、保持時間は１９．８分（チオールのピーク、面積で１６％）および２３．５分（ジスルフィドのピーク、面積で８２％）であった。
【０１００】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金粒子への接続
金コロイドの水溶液１ｍＬ（１７ｎＭ）を、水に溶かした過剰（３．６８υＭ）のチオール‐オリゴヌクレオチド（長さ２２塩基）と混合し、混合物を室温に１２〜２４時間放置した。次いで、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）とし、４０時間放置した。この「エージング」工程は、チオール‐オリゴヌクレオチドによる表面被覆率を増大させ、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を解離させるために設計された。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１４において１４，０００ｒｐｍで約２５分間溶液を遠心分離すると、（２６０ｎｍにおける吸光度が示すように）大部分のオリゴヌクレオチドを含有する極めて淡いピンク色の上清が（５２０ｎｍにおける吸光度が示すように）７〜１０％のコロイド状の金と共に、およびチューブの底には堅くしまり暗色のゼラチン状の残渣が得られた。上清を除去し、緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ）約２００μＬ中に残渣を再懸濁し、再度遠心分離した。上清溶液を除去後、残渣を緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ＮａＮ３）１．０ｍＬ中に入れた。得られた赤色のマスター溶液は、室温で数ヶ月の放置、シリカ薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート上へのスポッティング（実施例４を参照のこと）、および１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡを含有する溶液への添加に際して安定であった（すなわち、赤色のままで凝集しなかった）。
【実施例２】
【０１０１】
（ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの調製）
ハプテン修飾オリゴヌクレオチドは、標準的な固相ＤＮＡ合成手順を用い、Ａ１の場合にはビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４‐ジニトロフェニル−トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ））で調製した２１。
【０１０２】
ビオチン修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した：ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順２１を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した。次いで、ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した。ビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホルアミダイト２０μｍｏｌｅを含有する乾燥アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混ぜ、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオチド‐ＣＰＧが入ったカートリッジに導入した。同溶液を、カートリッジ内をゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で
洗浄した。その後、ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄し、続いて窒素流でカラムを乾燥した。トリチル保護基は除去せず、精製に役立てた。担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。アンモニアを蒸発後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いる分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴで保護されたオリゴヌクレオチドの保持時間は〜３２分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出し乾燥した。同様のプロトコルを用い、２，４‐ジニトロフェニル‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトを用いてＤＮＰ修飾オリゴヌクレオチドを合成した。
【実施例３】
【０１０３】
（ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ）
オリゴヌクレオチドで修飾した１３ｎｍの金粒子を、実施例１に記載のように調製した。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドを、標準的な固相ＤＮＡ合成手順２１を用い、Ａ１の場合にはビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４‐ジニトロフェニル‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ））で実施例２に記載のように調製した。本研究で用いるＰＢＳ緩衝溶液は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなる。ＩｇＥおよびＩｇＧ１は、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）［米国ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）所在］から購入し、使用前に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびバックグラウンドタンパク質（１０ｕｇ／ｍｌリゾチーム、１％ウシ血清アルブミン、および５．３ｕｇ／ｍｌ抗ジゴキシン；各１０ｕＬ）を含む０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液に溶かした（最終濃度：４．３×１０−８ｂ／μｌ）。
【０１０４】
プローブを調製するため、オリゴヌクレオチド修飾粒子（１３ｎＭ、３００μＬ）を、図１に配列を示すハプテン修飾相補オリゴヌクレオチド（１０μＭを１０μＬ）およびバイオバーコードＤＮＡ（１０μＭを１０μＬ）と室温で２〜３時間ハイブリダイズさせた。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびバイオバーコードを、ナノ粒子プローブの遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）および続く上清のデカンテーションによって除去した。
【０１０５】
ＩｇＥおよび／またはＩｇＧ１の典型的なアッセイでは、プローブ（〜１３ｎＭ）を含有する溶液に標的タンパク質（各々４３μｇ／ｍｌを４０μｌ）を加え、混合物を３７℃で５０分間インキュベートしてタンパク質‐ハプテン複合体形成を促進した。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全な反応を確実にするため、溶液を−１５℃で２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進し（ベケル社（Ｂｏｅｋｅｌ）製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄブロックインキュベータ）、４℃で２４時間保存した。標的タンパク質が存在する場合には、粒子凝集が起こり、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析に先立ってデカンテーションにより除去した。どのタンパク質が存在するかを決定するため、温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする融解分析を溶液中で行う（図２）。前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理する場合、溶液はピンク
がかった青色に変化し、ナノ粒子凝集体の生成を示す。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析は、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位を示している。これは、ＩｇＧ１標的についての予想相転位である（図２Ａ（点線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析からは、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。注目すべきことに、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析は、２つの明確なトランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）を示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つの別個の会合体が生成し、オリゴヌクレオチド・バーコードに由来するそれらの融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを示している。
【実施例４】
【０１０６】
（ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ）
この戦略の変形形態を用い、前述のシステムの感度を増加させ、１溶液中で調べることが可能である標的数を増やすことが可能である（図３）。この戦略により、ＤＮＡバイオバーコードを用いてタンパク質標的を間接的に検出することが可能である。１２量体オリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、それらの多くを用いて図１Ａに示すように目的の多価タンパク質用のバーコードを調製することが可能である。アッセイのこの変形形態では、生成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（３０００ｒｐｍで２分間）により未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、複合体形成したＤＮＡを遊離させる。粒子およびタンパク質は、遠心濾過装置（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ‐１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によってＤＮＡバーコードから分離することが可能である。ＤＮＡバーコードを単離したら、それらをオリゴヌクレオチド・アレイ上に捕捉し、多くのＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。本願明細書に記載のＩｇＧ１およびＩｇＥに関する実施例の場合には、該バーコードの半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にバーコードを捕捉する（図１のＡ３およびＢ３）。バーコードがオリゴヌクレオチド・アレイによって捕捉されると、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることが可能である（実験の項を参照）。標準的なスキャン測定の手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）により現像されれば、フラットベッド・スキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合には、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが存在する唯一のタンパク質である場合には、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合には、両スポットが強いシグナルを示す。
【０１０７】
スキャン法によるＤＮＡバイオバーコード検出の場合には、ＤＮＡ／金ナノ粒子会合体をポリスチレンの１．５ｍＬバイアル中で遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、上清を除去した。凝集体にＰＢＳ緩衝溶液（７００μｌ）を加え、この手順を繰り返して未反応タンパク質およびアッセイ成分から凝集体を確実に単離した。次いで、凝集体の入ったバイアルに水５００μｌを加えて凝集体を変性させた。マイクロアレイを用意し、文献の方法に従ってＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いた１１、２２。単離したＤＮＡバイオバーコードを、Ａ２修飾ナノ粒子またはＢ２修飾ナノ粒子（２ｎＭ）とあらかじめ混合し、ＤＮＡマイクロアレイに曝露し、ハイブリダイゼーション用チャンバ（グレイスバイオラボ社（ＧＲＡＣＥ ＢＩＯ‐ＬＡＢＳ））中で室温で３時間インキュベートした。次いで、０．３Ｍ ＮａＮＯ３および１０ｎＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（
ｐＨ４）でアレイを洗浄し、室温で３分間Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））中に浸した。スライドを水で洗浄し、次いでフラットベッド・スキャナで分析した。
【０１０８】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＤＮＡ／金ナノ粒子をベースとするタンパク質検出スキームを示す図。（Ａ）ハプテン修飾ナノ粒子プローブの調製。（Ｂ）タンパク質結合プローブを用いるタンパク質検出。配列Ａには９個のＧ、Ｃ対が存在するが、配列Ｂに存在するのはわずか２個のＧ、Ｃ対であることに注意。
【図２】ＤＮＡおよびタンパク質によって連結された金ナノ粒子凝集体についての熱変性プロファイルを示す図。２６０ｎｍにおける吸光度を上昇する温度（毎分１℃、１分の保持時間）の関数としてモニターした。各紫外可視スペクトルを、凝集体を浮遊させるために絶え間なく撹拌しながら測定した。融解分析を行う前に、すべての凝集体を０．３Ｍ ＰＢＳ１ｍｌに懸濁した。Ａ）１つの標的抗体を含む２つのプローブは、ＩｇＥ（実線）、ＩｇＧ１（点線）を示す；すべてのデータは正規化されている；（Ｂ）両標的抗体を含む２つのプローブを示す。挿入図；熱変性曲線の一次導関数。
【図３】タンパク質のバイオバーコードとしてＤＮＡを用いる、アレイをベースとするタンパク質検出スキームを示す図。
【図４】ＤＮＡバイオバーコードのスキャン測定によるＤＮＡアレイ検出を示す図。左のカラムはＩｇＧ１に関するバイオバーコードの検出用であり、右のカラムはＩｇＥに関するバイオバーコード用である。捕捉オリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ１システムの場合には５’チオール修飾‐ＡＴＡＡＣＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡであり、ＩｇＥシステムの場合には５’チオール修飾‐ＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴである。各スポットは直径が約２５０ｕｍであり、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １６４０ＸＬフラットベッド・スキャナ（米国エプソン社（Ｅｐｓｏｎ Ａｍｅｒｉｃａ）［米国カリフォルニア州ロングビーチ（Ｌｏｎｇｂｅａｃｈ）所在］）でグレースケールにより読み取る。これらのアッセイについて検討したが、同アッセイは２０ｎＭから７００ｎＭの標的濃度範囲にわたって有効である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の１つまたは複数のタンパク質、たとえば抗体の有無を検出するためのスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年３月２８日出願の米国特許出願第０９／８２０，２７９号の一部継続であり、本願明細書に援用する２０００年３月２８日出願の米国仮特許出願第６０／１９２，６９９号、および２００１年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６０／３５０，５６０号の恩典を主張する。本出願で報告される研究は、ＮＳＦ、ＡＲＯ、およびＮＩＨの助成金によって一部資金を得ている。したがって、米国政府は、本出願に記載の発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
タンパク質の検出は、分子生物学の研究と医学的用途の双方にとって重要である。現在、蛍光、質量分析法、ゲル電気泳動、レーザー・スキャニングおよび電気化学をベースとする診断法が、さまざまなタンパク質構造を同定するために利用可能である１〜４。血液細胞の遺伝学的なタンパク質変異体を同定し、疾患を診断し、組織中で分子プローブを突き止め、分子を精製し、または分離工程を行うため、抗体を用いた反応が広く用いられる５。医学的診断用途（たとえば、マラリアおよびＨＩＶ）の場合、エライザ、ウエスタンブロッティングなどの抗体検査、および間接的蛍光抗体検査は、単一の標的タンパク質構造を同定するために極めて有用である６、７。複数の抗体の存在について迅速かつ同時にサンプルをスクリーニングすることは、研究と臨床応用のいずれにおいても有益と思われる。しかしながら、前述の関連プロトコルを用いる均一系アッセイ条件下で１溶液中のいくつかのタンパク質構造を同時に検出することは困難で費用がかかり、多大な時間を必要とする。
【特許文献１】米国特許第４，６５０，７７０号
【特許文献２】２００２年１２月２８日出願の米国特許出願第１０／０３４，４５１号
【特許文献３】２００２年１２月２８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号
【特許文献４】米国特許第５，４７２，８８１号
【特許文献５】米国特許出願第０９／７６０，５００号
【特許文献６】米国特許出願第０９／８２０，２７９号
【特許文献７】２００１年１月１２日出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号
【特許文献８】２００１年３月２８日出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号
【特許文献９】１９９９年６月２５日出願の米国特許出願第０９／３４４，６６７号
【特許文献１０】２０００年６月２６日出願の米国特許出願第０９／６０３，８３０号
【特許文献１１】２００１年１月１２日出願の米国特許出願第０９／７６０，５００号
【特許文献１２】２００１年３月２８日出願の米国特許出願第０９／８２０，２７９号
【特許文献１３】２００１年８月１０日出願の米国特許出願第０９／９２７，７７７号
【特許文献１４】１９９７年７月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号
【特許文献１５】２０００年６月２６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号
【非特許文献１】サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（第２版、１９８９年）
【非特許文献２】ビー ディー ヘームスおよびエス ジェー ヒギンス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年）
【非特許文献３】シュミット ジー（Ｓｃｈｍｉｄ、Ｇ．）（編）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４年）
【非特許文献４】ハヤット エム エー（Ｈａｙａｔ、Ｍ．Ａ．）（編）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９１年）
【非特許文献５】マサール アール（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥ Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、１２４７ページ（１９８１年）
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【非特許文献１９】バーウェル（Ｂｕｒｗｅｌｌ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４巻、３７０〜３７７ページ（１９７４年）
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【非特許文献２１】グラバールら（Ｇｒａｂａｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５〜７４３ページ
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【非特許文献２３】アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびヌッゾ（Ｎｕｚｚｏ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１巻、４５ページ（１９８５年）
【非特許文献２４】アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびトンプキンス（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ）、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、第４９巻、４１０〜４２１ページ（１９７４年）
【非特許文献２５】イラー（Ｉｌｅｒ）、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ、第６章、（Ｗｉｌｅｙ、１９７９年）
【非特許文献２６】ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）およびズィスマン（Ｚｉｓｍａｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第６９巻、９８４〜９９０ページ（１９６５年）
【非特許文献２７】ソリアガ（Ｓｏｒｉａｇａ）およびハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０４巻、３９３７ページ（１９８２年）
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【非特許文献２９】ヒックマンら（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１１巻、７２７１ページ（１９８９年）
【非特許文献３０】マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギフ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、１０４５ページ（１９８７年）
【非特許文献３１】マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギフ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、１０３４ページ（１９８７年）
【非特許文献３２】ワッセルマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第５巻、１０７４ページ（１９８９年）
【非特許文献３３】エルテコバ（Ｅｌｔｅｋｏｖａ）およびエルテコフ（Ｅｌｔｅｋｏｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻、９５１ページ（１９８７年）
【非特許文献３４】レックら（Ｌｅｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第９２巻、２５９７ページ（１９８８年）
【非特許文献３５】エフ エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）
【非特許文献３６】クリセイら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、３０３１〜３０３９ページ（１９９６年）
【非特許文献３７】クリセイら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、３０４０〜３０４７ページ（１９９６年）
【非特許文献３８】ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）およびコクス（Ｃｏｘ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２２巻、４９２ページ（１９９４年）
【非特許文献３９】ボトムリーら（Ｂｏｔｔｏｍｌｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ、第１０巻、５９１ぺージ（１９９２年）
【非特許文献４０】ヘグナーら（Ｈｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第３３６巻、４５２ページ（１９９３年）
【非特許文献４１】バッセルら（Ｂａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１２６巻、８６３〜８７６ページ（１９９４年）
【非特許文献４２】ブラウン−ハウランドら（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１３巻、９２８〜９３１ページ（１９９２年）
【非特許文献４３】ブラウンら（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、７７５ページ（１９９８年）
【非特許文献４４】フレンス（Ｆｒｅｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、２０ページ（１９７３年）
【非特許文献４５】グラバール（Ｇｒａｂａｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５ページ（１９９５年）
【非特許文献４６】エクスタイン エフ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、サンプル中の１つまたは複数のタンパク質、たとえば抗体の有無を検出するためのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部および該特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズして該ＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に該凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を要旨とする。
【０００６】
請求項２に記載の発明は、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を要旨とする。
【０００７】
請求項３に記載の発明は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブを要旨とする。
【０００８】
請求項４に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子がナノ粒子からなることを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子が金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子であることを要旨とする。
【０００９】
請求項６に記載の発明は、請求項３の記載の発明において、粒子が金ナノ粒子であることを要旨とする。
本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法、組成物およびキットに関する。この手法は、オリゴヌクレオチド鎖によって機能化されたタンパク質認識要素と、金ナノ粒子の凝集をもたらすハイブリダイゼーション事象により金ナノ粒子の物理的性質（たとえば、光学的、電気的、機械的）を著しく変化させうるというこれまでの知見とを、うまく利用している８〜１２。個々の調整可能なハイブリダイゼーション特性と融解特性とを有する様々なオリゴヌクレオチド配列、および、融解の際には変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化（ｄｅｃｏｄｅ）するナノ粒子に関係する物理的特徴によって、各タンパク質認識要素を符号化（ｅｎｃｏｄｅ）することが可能である、というのが概略的な構想である。
【００１０】
本発明の一実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対し特異的に結合する相補体（特異結合性相補体）が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部はＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；および
凝集体生成が起きたか否かを観察するステップ、からなる方法を提供する。
【００１１】
標的分析物の存在下では、粒子複合体プローブと標的分析物との間の結合性相互作用の結果として凝集体が生成する。この凝集体は、任意の好適な手段によって検出することができる。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離するステップ；および
凝集性複合体を分析し、異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判定するステップ、からなる方法を提供する。
【００１３】
各タイプの粒子複合体プローブは、特定の標的分析物のためにあらかじめ定められたリポーター・オリゴヌクレオチドすなわちバーコードを含む。標的分析物の存在下では、ナノ粒子複合体と標的分析物との間の結合性相互作用の結果としてナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体を、任意の好適な手段、たとえば熱変性によって単離し分析し、１つまたは複数の異なるタイプのリポーター・オリゴヌクレオチドの存在を検出することが可能である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を提供する。
【００１５】
標的分析物の存在下では、ナノ粒子複合体と標的分析物との間の結合性相互作用の結果としてナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体を単離し、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離するのに有効な条件下に供する。次いで、リポーター・オリゴヌクレオチドを単離する。望ましい場合には、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドを増幅することができる。分析物の検出は、ＤＮＡチップなどの任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドすなわちバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行なわれる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
分析物と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、１つまたは複数の分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定がサンプル中の特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００１７】
１つまたは複数の標的分析物の存在下では、粒子複合体プローブと標的分析物との間の結合性相互作用の結果として凝集体が生成される。これらの凝集体を単離し、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離するのに有効な条件下に供する。次いで、リポーター・オリゴヌクレオチドを単離する。望ましい場合には、ＰＣＲ増幅を含む任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドを増幅することができる。分析物検出は、ＤＮＡチップなどの任意の好適な手段によってリポーター・オリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在を確認することにより間接的に行われる。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の抗体の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的抗体に対するハプテンが結合したオリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブを提供するステップであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特定の標的抗体に対するハプテンが結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的抗体の識別子としての役割を果たす配列を有するステップ；
抗体と粒子複合体プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にし、１つまたは複数の標的抗体の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が、特定の標的抗体の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕで粒子複合体プローブを生成する必要のあるサンプル中で標的分析物の存在を検出するための方法も提供する。本発明の一実施形態では、標的分析物の存在を検出するための方法は、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；および
凝集体生成が起きたか否かを観察するステップ、からなる。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的分析物と特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が、１つまたは複数の特定の標的分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離するステップ；および
凝集性複合体を分析し、１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を判定するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの存在がサンプル中の特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的で
ある配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下でサンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的分析物と特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が１つまたは複数の特定の標的分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が特定の標的分析物の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の抗体の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の抗体に対するハプテンが結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）各タイプのＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特定の抗体に対するハプテンが結合した各タイプのオリゴヌクレオチドは、あるタイプのＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプのＤＮＡバーコードは、特定の標的抗体に関する識別子とし
ての役割を果たし、別のタイプのＤＮＡバーコードとは異なる配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部およびハプテンが結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドに対する各タイプのＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、特定の標的抗体と特定の標的抗体に対するハプテンが結合したあるタイプのオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドが結合した１つまたは複数のタイプの粒子、１つまたは複数のタイプのＤＮＡバーコード、および特定の標的抗体に対するハプテンが結合した１つまたは複数のタイプのオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が１つまたは複数の特定の標的抗体の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
さまざまな配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出するステップであって、特定のＤＮＡバーコードの同定が特定の標的抗体の存在を示すステップ、からなる方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、標的分析物検出のためのキットも提供する。本発明の一実施形態では、サンプル中の標的分析物を検出するためのキットであって、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブ、ならびに検出可能な変化を観察するための任意選択の基材を含む、少なくとも１つの容器からなるキットを提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物を検出するための、少なくとも１つまたは複数の容器からなるキットであって、該容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなるあるタイプの粒子複合体プローブであって、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物に関する識別子としての役割を果たす配列を有する粒子複合体プローブが含まれるキットであり、検出可能な変化を観察するための基材が場合により含まれるキットを提供する。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも１対の容器および検出可能な変化を観察するための任意選択の基材を含む、標的分析物を検出するためのキットであって、
対の第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子と少なくとも２つの部分のある配列を有するＤＮＡバーコードとからなる粒子プローブが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれるキット、を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも２対以上の容器を含む、サンプル中の複数の標的分析物を検出するためのキットであって、
各対の第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくとも２つの部分のある配列を有するＤＮＡバーコードを有する粒子複合体プローブが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、少なくとも２つの部分を有するＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
各対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれ、
粒子複合体プローブのタイプに対するＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有し、検出可能な変化を観察するための基材が任意選択で含まれるキット、を提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態では、第１の容器および少なくとも２対以上の容器を含む、サンプル中の複数の標的分析物を検出するためのキットであって、
第１の容器には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子を有する粒子複合体プローブが含まれ、
対の第１の容器には、少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードが含まれ、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、
各対の第２の容器には、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、標的分析物の特異結合性ペア相補体と共有結合させるのに用いることが可能な部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれ、
各対の容器のうち第１の容器中に存在するＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての役割を果たし、容器の別の対におけるＤＮＡバーコードとは異なる配列を有し、検出可能な変化を観察するための基材が場合により含まれるキット、を提供する。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態では、上記のいずれのキットの粒子も、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなり、金ナノ粒子であることが好ましい。
また、本発明には、サンプル中の１つまたは複数の標的分析物を検出するためのシステムであって、
１つまたは複数のタイプの粒子複合体プローブであって、各粒子複合体プローブが、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特定の標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブと、（ｉ）ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、（ｉｉｉ）特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、（ｉｖ）各タイプの粒子複合体プローブ中のＤＮＡバーコードは、異なっており、かつ特定の標的分析物の識別子としての役割を果たす配列を有することと、からなるシステムも含まれる。
【００３０】
このシステムにおける粒子は、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなることが好ましく、金ナノ粒子であることが好ましい。
また、本発明には、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズされる粒子複合体プローブ、も含まれる。このプローブにおける粒子は、金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子などのナノ粒子からなることが好ましく、金ナノ粒子であることが好ましい。
【００３１】
また、本発明には、標的分析物に対して特異的な標的相補体が結合したオリゴヌクレオチド配列も含まれる。
また、本発明には、特定の標的分析物の存在に関する識別子としての役割を果たすオリゴヌクレオチド配列からなるＤＮＡバーコードも含まれる。
【００３２】
また、本発明には、オリゴヌクレオチド配列からなる２つ以上のＤＮＡバーコードも含まれ、各ＤＮＡバーコードは、異なるオリゴヌクレオチド配列を有し、特定の標的分析物の存在に関する識別子としての役割を果たす。
【００３３】
本願明細書で使用する、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、複合物、粒子、ラテックス・ミクロスフェアなどの「タイプ」とは、それらに結合されたオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のタイプが同じである複数の品目を指す。また、「オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子」または「オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子」は、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物」、または本発明の検出方法の場合には、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・プローブ」、「ナノ粒子プローブ」、もしくは単に「プローブ」とも呼ばれることがある。
【００３４】
用語「ナノ粒子複合体」または「ナノ粒子複合体プローブ」は、ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる複合物を指す。
【００３５】
用語「分析物」は、検出すべき化合物または組成物を指し、薬剤、代謝物、殺虫剤、汚染物質などが含まれる。分析物は、特異結合性ペア（ｓｂｐ）のメンバーからなることが可能であり、一価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））もしくは多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の、通常抗原もしくはハプテンの、少なくとも１つの共通エピトープ部位もしくは決定基を共有する単一化合物もしくは複数の化合物であるリガンドであってもよい。分析物は、細菌などの細胞もしくはＡ、Ｂ、Ｄなどの血液型抗原もしくはＨＬＡ抗原を有する細胞の一部、または微生物、たとえば、細菌、真菌、原生動物、もしくはウイルスであることが可能である。
【００３６】
多価リガンド分析物は、通常ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチドおよびタンパク質、多糖、核酸、およびそれらの組合せである。このような組合せには、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が含まれる。
【００３７】
主として、本発明を適用することが可能であるポリエピトープのリガンド分析物は、少なくとも約５，０００、通常少なくとも約１０，０００の分子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）の範疇では、当該ポリ（アミノ酸）は一般に約５，０００から５，０００，０００までの分子量、より一般的には約２０，０００から１，０００，０００までの分子量のはずである。当該ホルモンの中では、分子量は、通常約５，０００から６０，０００までの分子量に及ぶであろう。
【００３８】
類似の構造的特徴を有するタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物、特に病原微生物に関係するタンパク質などのファミリーに関しては多種多様なタンパク質が考えられる。このようなタンパク質には、たとえば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、がん抗原、栄養マーカー、組織特異抗原などが含まれる。
【００３９】
本発明において注目するタンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン、抗原性多糖、微生物及び他の病原体のタイプは、その開示内容が本願明細書に援用される特許文献１に具体的に開示されている。
【００４０】
モノエピトープのリガンド分析物は、一般に約１００〜２，０００の分子量、より一般的には１２５〜１，０００の分子量であろう。
分析物は、宿主由来の体液などのサンプル中に直接見いだされる分子であってもよい。サンプルを直接検査することが可能であり、分析物をより容易に検出可能とするために前処理をしてもよい。さらに、当該分析物がサンプル中に存在する場合にのみ存在が検出されるはずの、当該分析物と相補的な特異結合性ペアのメンバーなどの当該分析物を証明することができる試剤を検出することによって、当該分析物を測定してもよい。したがって、分析物を証明することができる試剤は、アッセイにおいて検出される分析物になる。体液は、たとえば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、汗、粘液などであることが可能である。
【００４１】
用語「特異結合性ペア（ｓｂｐ）のメンバー」は、２つの異なる分子の一方であって、他の分子の特定の空間的かつ中心的な構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に関して特異的に結合し、それによって同構成に関して相補的であると定義される、表面上または空洞内の領域を有するものを指す。特異結合性ペアのメンバーは、リガンドおよびレセプター（アンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ））と呼ばれる。これらは、通常は抗原‐抗体などの免疫学的ペアのメンバーと思われるが、ビオチン‐アビジン、ホルモン‐ホルモンレセプター、核酸二重鎖、ＩｇＧ‐プロテインＡ、ポリヌクレオチド対（ＤＮＡ‐ＤＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡなど）などの他の特異結合性ペアは免疫学的ペアではないが本発明およびｓｂｐメンバーの定義に含まれる。
【００４２】
用語「リガンド」は、それに対するレセプターが自然に存在するか、または調製することが可能である、任意の有機化合物を指す。また、リガンドという用語にはリガンド類似体が含まれ、該リガンド類似体は、通常は有機ラジカルまたは分析物類似体で、分子量は通常１００を超え、レセプターに関して類似のリガンドと競合することが可能な修飾リガンドであり、この修飾により別の分子に該リガンド類似体を結び付ける手段が提供される。リガンド類似体は、リガンド類似体をハブまたは標識に連結するが必要ではない結合によって水素が置換されていることだけでなく、リガンドとは一般に異なるものである。リガンド類似体は、リガンドと同様にレセプターに結合することが可能である。類似体は、たとえば、リガンドに対する抗体のイディオタイプを対象とする抗体であることもありうる。
【００４３】
用語「レセプター」または「アンチリガンド」は、分子の特定の空間的かつ中心的な構成、たとえばエピトープ部位または決定基を認識する能力のある任意の化合物または組成物を指す。例示的なレセプターには、天然に存在するレセプター、たとえば、サイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、アビジン、プロテインＡ、バルスター（ｂａｒｓｔａｒ）、補体成分Ｃ１ｑなどが含まれる。アビジンには、卵白アビジン、およびストレプトアビジンなどの他の供給源に由来するビオチン結合タンパク質が含まれることを意図している。
【００４４】
用語「特異的結合（特異結合）」は、他の分子の認識が実質的に低いのに比べ、２つの異なる分子のうち一方を他方に関して特異的に認識することを指す。一般に、分子は、２分子間の特異的認識を生じさせる表面上または空洞内の領域を有している。典型的な特異的結合は、抗体‐抗原相互作用、酵素‐基質相互作用、ポリヌクレオチドの相互作用などである。
【００４５】
用語「非特異的結合」は、特異的表面構造と比較的無関係な分子間の非共有結合を指す。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用を含むいくつかの因子により生じうる。
用語「抗体」は、他の分子の特定の空間的かつ中心的な構成に特異的に結合し、それによって該構成に関して相補的であると定義される免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが可能であり、宿主の免疫および血清の採集などの当技術分野で良く知られている技法により（ポリクローナル）、または継続的なハイブリッド細胞系を調製し分泌タンパク質を採集することにより（モノクローナル）、または天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはそれらの変異誘発物をクローニングし発現させることによって調製することが可能である。抗体には、完全長の免疫グロブリンまたはそれらの断片が含まれ、免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどのさまざまなクラスおよびアイソタイプが含まれる。それらの断片には、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが含まれる。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限りは、必要に応じて免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマー、および複合物を用いることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、１溶液中で複数のタンパク質構造を検出するために生化学的バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する（図１）。この手法は、オリゴヌクレオチド鎖によって機能化されたタンパク質認識要素、および金ナノ粒子の凝集をもたらすハイブリダイゼーションなる事象は、金ナノ粒子の物理的性質（たとえば、光学的、電気的、機械的）を著しく変化させることが可能であるというこれまでの知見をうまく利用している８〜１２。個々の調整可能なハイブリダイゼーション特性と融解特性とを有する様々なオリゴヌクレオチド配列、および、融解の際には変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化（ｄｅｃｏｄｅ）するナノ粒子に関係する物理的特徴によって、各タンパク質認識要素を符号化（ｅｎｃｏｄｅ）することが可能である、というのが概略的な構想である。したがって、ＤＮＡ結合凝集体の融解温度と、融解の際に変化して多重分析物アッセイにおける一連の分析物を脱符号化するナノ粒子に関係する物理的特性とを使用することが一般的に可能である。本願明細書におけるバーコードは、脱符号化される情報が、あらかじめ設計されたオリゴヌクレオチド配列中に保存された化学的情報の形態であるという点で、ナノロッド２３、フルオロフォア標識ビーズ２４および量子ドット２５などの物理的診断マーカーに基づくバーコードとは異なっている。
【００４７】
本発明の一態様では、サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するための方法を提供する。下記実施例に示す免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）などの抗体は、適切なハプテン（ＩｇＧ１の場合にはビオチン、ＩｇＥの場合にはジニトロフェニル（ＤＮＰ）；図１（Ａ））で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖で予めハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド修飾プローブにより検出することが可能である１３，１４。下記実施例に示す概念実証アッセイにおけるＤＮＡ配列は、ＩｇＧ１およびＩｇＥとのプローブ反応から生成する２つの異なる凝集体が異なる温度で融解することが確実と思われる方法で設計した（図１（Ｂ））。ＩｇＧ１用プローブは、ＩｇＥ用プローブよりも長い配列を有し、Ｇ、Ｃ塩基含有量も高い。したがって、前者の配列は、後者の配列よりも高い温度で融解する。このような配列による違いにより、プローブと反応してナノ粒子凝集体を生成したのがどの標的であったかを同定するための符号として使用可能な異なる融解特性を有するプローブを調製することができる。３つの異なるシステム、すなわち（１）１つの標的抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＥ）が存在する２つのプローブ；（２）２つの異なる標的抗体が存在する２つのプローブ；および（３）標的抗体が存在しない対照について検討した。
【００４８】
本発明のこの態様では、サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するため
の方法であって、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子プローブを、標的分析物を含有する可能性のあるサンプルと接触させることからなる方法を提供する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果として、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と結合する。リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分は、ハイブリダイゼーションの結果として、分析物に対する特異結合性相補体（たとえば、抗原）が結合したオリゴヌクレオチドと結合する。接触は、分析物とナノ粒子プローブとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で行う。標的分析物の存在下では、ナノ粒子凝集体が生成される。これらの凝集体は、任意の好適な手段によって検出することができる。
【００４９】
本発明を実施する際には、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を、標的分析物に対する特異結合性相補体で修飾されたオリゴヌクレオチド、およびリポーター・オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによってナノ粒子複合体プローブを調製する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と相補的である配列を有する。特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的である配列を有する。成分間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、リポーター・オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ナノ粒子複合体プローブを生成する。成分の十分なハイブリダイゼーションを可能にするナノ粒子複合体溶液を調製する際には、任意の好適な溶媒およびハイブリダイゼーション条件を用いることができる。成分を、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなるリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で室温において約２〜３時間ハイブリダイズさせることが好ましい。ハイブリダイゼーション混合物中のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物の濃度は、約２〜約５０ｎＭであり、約１３ｎＭであることが好ましい。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの濃度は、一般に約５０〜約９００ｎＭであり、約３００ｎＭであることが好ましい。リポーター・オリゴヌクレオチドの濃度は、一般に約５０〜約９００ｎＭであり、約３００ｎＭであることが好ましい。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびリポーター・オリゴヌクレオチドは、任意の好適な手段、好ましくはハイブリダイゼーション混合物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）した後に上清をデカンテーションによって任意で除去してもよく、除去することが好ましい。調製した複合体は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）、０．０１％アジド溶液中で４〜６℃において保存した。
【００５０】
サンプル中の標的分析物、たとえば抗体の存在を検出するための典型的アッセイは以下の通りである。オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体を有するオリゴヌクレオチドからなるナノ粒子複合体プローブを含有する溶液を、標的タンパク質を含有すると考えられる水性サンプル溶液と混合する。水性サンプル溶液中の総タンパク質含有量は、一般に約５〜約１００ｕｇ／ｍｌであり、通常は約４３ｕｇ／ｍｌである。反応混合物中のナノ粒子の濃度は、一般に約２〜約２０ｎＭであり、通常は約〜１３ｎＭである。得られる混合物の総容積は、一般に約１００〜約１０００ｕＬであり、約４００ｕＬであることが好ましい。標的分析物を含有すると考えられる水性サンプル溶液を調製する際には任意の好適な溶媒を用いることができ、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）からなるＰＢＳが好ましい。
【００５１】
次いで、得られたアッセイ混合物を、特異結合性ペア、たとえばタンパク質‐ハプテンの複合体生成を容易にするのに十分な、約３５〜約４０℃の温度、好ましくは３７℃において、約３０〜約６０分の間、好ましくは約５０分間インキュベートする。標的タンパク質が存在する場合には、粒子の凝集が起き、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドの
シフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（たとえば、３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析に先立ってデカンテーションにより除去する。
【００５２】
望ましい場合には、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、およびハプテン修飾オリゴヌクレオチドの全てを、標的分析物を含有すると考えられるサンプルと混合することにより、アッセイ混合物内でｉｎ ｓｉｔｕでナノ粒子複合体プローブを調製してもよい。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全なハイブリダイゼーションを確実にするため、アッセイ混合物を−１５℃において２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進させ（ベケル社（Ｂｏｅｋｅｌ）製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄブロックインキュベータ）、４℃において２４時間保存する。しかしながら、本発明を実施する際には、アッセイ反応を実施する前にナノ粒子複合体プローブを調製し、ナノ粒子複合体プローブ内のＤＮＡバーコードの量を増加させることが好ましい。
【００５３】
どのタンパク質が存在するかを決定するため、温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする凝集体の融解分析を溶液中で行うことができる。たとえば、１つまたは２つの既知の標的分析物：ＩｇＧ１およびＩｇＥを含有するサンプルの分析について説明する実施例３の図２を参照のこと。実施例３で述べるように、前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理する場合、溶液はピンクがかった青色に変化し、ナノ粒子凝集体の生成を示す。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析は、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位を示している。これは、ＩｇＧ１標的について予想された相転位である（図２Ａ（破線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析からは、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。注目すべきことに、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析は、２つの明確なトランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）を示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つの別個の会合体が生成し、オリゴヌクレオチド・バーコードに由来するそれらの融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを示している。
【００５４】
本発明の別の態様では、上記の凝集法戦略の変形形態を用い、前述のシステムの感度を高め、１溶液中で調べることが可能な標的数を増加させることが可能である。たとえば、実施例４の図３を参照のこと。この戦略により、特定の標的分析物に割り当てられたＤＮＡバイオバーコードまたは独自のリポーター・オリゴヌクレオチドにより、タンパク質標的を間接的に検出することが可能である。一般に、標的分析物用のリポーター・オリゴヌクレオチドの好適な長さ、ＧＣ含量、および配列、ならびに選択は、アッセイの前にあらかじめ定められる。たとえば、１２量体オリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、それらの多くを用いて図１Ａに示すように目的の多価タンパク質用のバーコードを調製することが可能である。アッセイのこの変形形態では、生成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（たとえば、３０００ｒｐｍで２分間）により、未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のリポーター・オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、任意の好適な手段によって、たとえば溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、リポーター・オリゴヌクレオチドまたはバーコードを遊離させる。リポーター・オリゴヌクレオチドが少量である場合には、当技術分野で知られている方法によって増幅することができる。たとえば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅が好ましい。粒子およびタンパク質を、任意の好適な手段、たとえば遠心濾過装置（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ‐１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によ
ってリポーター・オリゴヌクレオチドから分離することが可能である。リポーター・オリゴヌクレオチドを単離したら、オリゴヌクレオチド・アレイ上に捕捉し、多くの好適なＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。ＩｇＧ１およびＩｇＥに関する本願明細書に記載の実施例の場合には、対象のバーコード（図１のＡ３およびＢ３）の半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にリポーター・オリゴヌクレオチドを捕捉する。バーコードがオリゴヌクレオチド・アレイによって捕捉されれば、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることが可能である（実験の項を参照）。標準的なスキャン測定の手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）により現像されれば、フラットベッド・スキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合には、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが存在する唯一のタンパク質である場合には、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合には、両スポットが強いシグナルを示す。
【００５５】
本発明は、１溶液中で単一または複数の多価タンパク質を検出するために、オリゴヌクレオチドにより大きく機能化されたナノ粒子プローブ（好ましくは金ナノ粒子プローブ）を使用するための２つの戦略を提供するという理由から重要である。実際、１サンプル中の複数のタンパク質の検出は面倒で、時間がかかり、高額な費用を要するプロトコルが必要である。この点で、他の研究者は最近、１溶液中で複数のタンパク質標的を認識するためにフルオロフォア標識ペプチド核酸およびＤＮＡマイクロアレイを用いている１５〜１７。しかしながら、この方法は、オリゴヌクレオチドで標識したタンパク質のマイクロアレイ表面への結合に依存する。本願明細書に記載の方法の最終工程は、通常のＤＮＡの表面化学反応にのみ基づいている。したがって、前記工程に最新のナノ粒子ＤＮＡ検出法９、１１の多くの高感度の態様を援用することは可能であるが、同工程は検出の際に存在するタンパク質を得ることなく、ＤＮＡではなくタンパク質を検出することができる。表面アッセイの場合、タンパク質は短いオリゴヌクレオチドに比べて扱いがより困難である。なぜなら、タンパク質は、より非特異的に固体支持体へ結合する傾向があり、大きなバックグラウンド・シグナルにつながることが多いためである。最後に、均一系アッセイの場合には、これらのナノ粒子構造に関係する非常に鋭敏な融解プロファイルにより、通常の幅広いＤＮＡ融解挙動を示すプローブによって可能と思われるよりも多くのバイオバーコードを設計することができるはずである。
【００５６】
本発明は、検出アッセイにおける使用に適した、オリゴヌクレオチドを結合した任意の好適な粒子の使用法を企図している。しかしながら、本発明を実施する際にはナノ粒子が好ましい。粒子のサイズ、形および化学組成は、ＤＮＡバーコードを含んで得られるプローブの特性に寄与するはずである。これらの特性には、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液における安定性、孔およびチャネルのサイズの違い、フィルタとしての役割を果たす際の生理活性分子の分離能などが含まれる。さまざまなサイズ、形および／または化学組成を有する粒子の混合物の使用法、ならびに均一なサイズ、形および／または化学組成を有するナノ粒子の使用法が企図されている。好適な粒子の例には、ナノサイズおよびミクロサイズの（ｎａｎｏ− ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｉｚｅｄ）コア粒子、凝集体粒子、等方性粒子（球状粒子など）および異方性粒子（非球状ロッド、４面体、プリズムなど）ならびに本願明細書に援用する特許文献２および特許文献３に記載の粒子などのコア‐シェル粒子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の実施に有用なナノ粒子には、金属（たとえば、金、銀、銅および白金）、半導体（たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコーティングされたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）および磁性（たとえば、フェロマグネタイト（ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｔｅ））コロイド材料が含まれる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔ
ｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが含まれる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）まで、より好ましくは約５から約５０ｎｍまで、最も好ましくは約１０から約３０ｎｍまでである。ナノ粒子は、ロッド、プリズム、または４面体であってもよい。
【００５８】
金属、半導体および磁性ナノ粒子を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。たとえば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８を参照のこと。
【００５９】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓナノ粒子を製造する方法も、当技術分野で知られている。たとえば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６を参照のこと。
【００６０】
また、好適なナノ粒子は、たとえば、テッド・ペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．）（金）、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）およびナノプローブス社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）（金）から市販されている。
【００６１】
現在は、核酸を検出するのに金ナノ粒子を用いることが好ましい。金コロイド粒子は、それらの美しい色を生み出す帯域（バンド）に関して高い吸光係数を有する。これらの強い色は、粒径、濃度、粒子間距離、ならびに凝集の程度および凝集体の形（幾何学的形状）によって変化し、これらの材料を比色アッセイにとって特に魅力的にしている。たとえば、金ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドおよび核酸とハイブリダイゼーションさせると、肉眼で見ることができる迅速な変色をもたらす（たとえば、実施例を参照のこと）。
【００６２】
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために、ナノ粒子、オリゴヌクレオチドまたは双方を官能基化する。そのような方法は当技術分野で知られている。たとえば、３’末端または５’末端においてアルカンチオールにより官能基化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子と容易に結合する。非特許文献１７を参照のこと。また、非特許文献１８（３’チオールＤＮＡを平らな金表面に結合する方法について記載している；この方法を用いてオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合することが可能である）を参照のこと。また、アルカンチオール法を用い、他の金属、半導体および磁性コロイドならびに上記に列挙した他のナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合することが可能である。オリゴヌクレオチドを固体表面に接続するための他の官能基には、ホスホロチオエート基（オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面との結合については特許文献４を参照）、置換アルキルシロキサン（オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面との結合については非特許文献１９および非特許文献２０を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合については非特許文献２１を参照）が含まれる。また、末端が５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に結合するのに使用することができる。以下の参照文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するのに用いることができる他の方法について記載している：非特許文献２２（金上のジスルフィド）、非特許文献２３（アルミニウム上のカルボン酸）、非特許文献２４（銅上のカルボン酸）、非特許文献２５（シリカ上のカルボン酸）、非特許文献２６（白金上のカルボン酸）、非特許文献２７（白金上の芳香環化合物）、非特許文献２８（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能基化された溶媒）、非特許文献２９（白金上のイソニトリル）、非特許文献３０（シリカ上のシラン）、非特許文献３１（シリカ上のシラン）、非特許文献３２（シリカ上のシラン）、非特許
文献３３（二酸化チタン上およびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）、非特許文献３４（金属上のリジッドなホスフェート）。
【００６３】
特許文献５〜８は、本発明を実施する際に有用である環状ジスルフィドで官能基化されたオリゴヌクレオチドについて記載している。環状ジスルフィドは、それらの環内に、２個のイオウ原子を含む５または６個の原子を有することが好ましい。好適な環状ジスルフィドは市販されているが周知の方法によって合成してもよい。還元型の環状ジスルフィドも使用可能である。
【００６４】
リンカーは、環状ジスルフィドに結合された炭化水素部分からさらになることが好ましい。好適な炭化水素は市販されており、環状ジスルフィドに結合される。炭化水素部分は、ステロイド残基であることが好ましい。環状ジスルフィドに結合されたステロイド残基からなるリンカーを用いて調製されたオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物は、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを用いて調製された複合物に比べ、チオール（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液中で使用されるジチオスレイトール）に対して著しく安定であることが予想外に見いだされた。実際、本発明のオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物は、３００倍以上安定であることが分かった。この予想外の安定性は、おそらく各オリゴヌクレオチドが単一のイオウ原子ではなく２個のイオウ原子を介してナノ粒子にしっかり固定されていることに起因している。特に、環状ジスルフィドの隣接する２個のイオウ原子は、オリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物を安定化するのに有利であろうキレート化効果を有すると考えられる。また、リンカーの大きな疎水性ステロイド残基も、水溶性分子のナノ粒子表面への接近からナノ粒子を守ることによって複合物の安定性に寄与しているように見える。
【００６５】
上記に鑑み、環状ジスルフィドの２個のイオウ原子は、双方のイオウ原子がナノ粒子と同時に結合することが可能であるように互いに十分近接していることが好ましい。２個のイオウ原子は、互いに隣接していることが最も好ましい。また、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を守る大きな疎水表面をもたらすように大きくなければならない。
【００６６】
環状ジスルフィド・リンカーが用いられたオリゴヌクレオチド‐環状ナノ粒子複合物は、特許文献５〜８に記載のように、サンプル中の標的分析物を検出するための診断アッセイにおけるプローブとして用いることができる。これらの複合物は、それらが使用される診断アッセイの感度を向上させることが分かった。特に、環状ジスルフィドに結合されたステロイド残基からなるリンカーを用いて調製されたオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子複合物を用いるアッセイは、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを用いて調製された複合物を用いるアッセイよりも約１０倍以上感度が良いことが分かった。
【００６７】
各ナノ粒子は、複数個のオリゴヌクレオチドが結合したものとする。結果として、各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物は、相補的配列を有する複数個のオリゴヌクレオチドまたは核酸と結合することが可能である。
【００６８】
規定の配列のオリゴヌクレオチドは、本発明の実施におけるさまざまな目的で使用される。あらかじめ定められた配列のオリゴヌクレオチドを製造する方法はよく知られている。たとえば、非特許文献１および非特許文献３５を参照のこと。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの双方にとって固相合成法が好ましい（ＤＮＡを合成するよく知られた方法は、ＲＮＡを合成するためにも有用である）。また、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することも可能である。標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドの場合には、タンパク質などの特異結合性相補体をオリゴヌクレオチドに結合するのに適した任意の方法を使用してよい。
【００６９】
ナノスフェア表面上にオリゴヌクレオチドを結合するのに適した任意の方法を使用可能である。表面上にオリゴヌクレオチドを接続するための特に好ましい方法は、本願明細書に援用する特許文献７〜１５に記載のエージング工程に基づいている。エージング工程は、安定性および選択性が予想外に強化されたナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を提供する。この方法は、好ましくはナノ粒子に結合可能な官能基からなる部分が共有結合しているオリゴヌクレオチドを提供することからなる。それらの部分および官能基は、オリゴヌクレオチドのナノ粒子との結合（すなわち、化学吸着または共有結合による）を可能にする部分であり官能基である。たとえば、５’または３’末端に共有結合したアルカンチオール、アルカンジスルフィドまたは環状ジスルフィドを有するオリゴヌクレオチドを用い、金ナノ粒子を含むさまざまなナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合させることが可能である。
【００７０】
官能基によってオリゴヌクレオチドの少なくとも一部をナノ粒子と結合させるのに十分な時間、水中でオリゴヌクレオチドをナノ粒子と接触させる。このような時間は実験的に決定することが可能である。たとえば、約１２〜２４時間で良好な結果を得られることが分かった。オリゴヌクレオチドを結合させるための他の好適な条件も実験的に決定することが可能である。たとえば、約１０〜２０ｎＭのナノ粒子濃度および室温におけるインキュベーションは良好な結果をもたらす。
【００７１】
次に、少なくとも１種類の塩を水に加えて塩溶液を生成する。塩は、任意の好適な水溶性塩でよい。たとえば、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、２種類以上のこれらの塩の組合せ、またはリン酸緩衝液に溶かしたこれらの塩の１つであってもよい。塩は、濃溶液として加えることが好ましいが、固体として加えてもよい。塩を水に全て一度に加えることは可能であり、または塩を徐々に時間をかけて加える。「徐々に時間をかけて」とは、一定時間の間隔をおいて少なくとも二分して塩を加えることを意味する。好適な時間間隔は実験的に決定することが可能である。
【００７２】
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド相互の少なくとも一部の静電気斥力、および、負の電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの正の電荷を帯びたナノ粒子に対する静電気引力、または負の電荷を帯びたオリゴヌクレオチドの負の電荷を帯びたナノ粒子からの静電気斥力のいずれかに打ち勝つのに十分でなければならない。徐々に時間をかけて塩を加えることによって静電気引力および斥力を徐々に減らすことは、ナノ粒子上にオリゴヌクレオチドの最大の表面密度をもたらすことが分かった。各塩または塩の組合せについての好適なイオン強度は、実験的に決定することが可能である。リン酸緩衝液に溶かして塩化ナトリウムの終濃度を約０．１Ｍから約１．０Ｍとすると（塩化ナトリウムの濃度を徐々に時間をかけて高めることが好ましい）、良好な結果をもたらすことが分かった。
【００７３】
塩を加えた後、十分に加えたオリゴヌクレオチドをナノ粒子と結合させて安定なナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を生成するのに十分な時間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドおよびナノ粒子をインキュベートする。以下で詳細に説明するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度の増加は、複合物を安定化することが分かった。このインキュベーション時間は、実験的に決定することが可能である。約２４〜４８、好ましくは４０時間の総インキュベーション時間は、良好な結果をもたらすことが分かった（これはインキュベーションの合計時間である；上記のように塩濃度は、この合計時間をかけて徐々に増加させることが可能である）。本願明細書においては、塩溶液におけるこの第２のインキュベーション時間を「エージング」工程と呼ぶ。この「エージング」工程に好適な他の条件も、実験的に決定することが可能である。たとえば、室温およびｐＨ７．０におけるインキュベーションは良好な結果をもたらす。
【００７４】
「エージング」工程を使用することによって生成される複合物は、「エージング」工程なしに生成される複合物よりもかなり安定であることが見出されている。前述のように、この安定性の増大は、「エージング」工程によって得られる、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増大によるものである。「エージング」工程によって得られる表面密度は、ナノ粒子のサイズおよびタイプならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に左右されるはずである。ナノ粒子を安定にするのに十分な表面密度ならびにナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの望ましい組合せについてそのような表面密度を得るのに必要な条件は、実験的に決定することが可能である。一般に、安定なナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を提供するには少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度で十分であろう。表面密度は、少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２であることが好ましい。表面密度があまりに大きい場合に、複合物のオリゴヌクレオチドが核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力が減少することがあるため、表面密度は約３５〜４０ピコモル／ｃｍ２以下であることが好ましい。
【００７５】
本願明細書で使用する「安定（な）」とは、複合物が製造されてから少なくとも６ヶ月間、大部分のオリゴヌクレオチドはナノ粒子との結合を維持し、そのオリゴヌクレオチドは、核酸を検出する方法およびナノファブリケーションの方法において遭遇する標準的条件下で核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズすることができることを意味する。
【００７６】
認識部分およびスペーサー部分からなる認識オリゴヌクレオチドを使用することにより、ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物のハイブリダイゼーション効率を劇的に向上させうることが分かった。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部分およびスペーサー部分からなり、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズするのは認識部分である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、ナノ粒子と結合可能なように設計される。たとえば、スペーサー部分は、それと共有結合された部分を有し、その部分は、ナノ粒子と結合可能な官能基からなる。これらは、前述のような部分および官能基である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分がナノ粒子と結合する結果、認識部分はナノ粒子の表面から間隔をおいて配置され、その標的とのハイブリダイゼーションにとってより好都合である。認識部分のナノ粒子からの良好な間隔を提供するスペーサー部分の長さおよび配列は、実験的に決定することが可能である。少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ましくは１０〜３０個のヌクレオチドからなるスペーサー部分が良好な結果をもたらすことが分かった。スペーサー部分は、ナノ粒子または核酸標的もしくはオリゴヌクレオチド標的と結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を妨害しない任意の配列を有しうる。たとえば、スペーサー部分は、相互に、認識オリゴヌクレオチドの配列と、または認識オリゴヌクレオチドの核酸標的もしくはオリゴヌクレオチド標的と相補的な配列であってはならない。スペーサー部分のヌクレオチドの塩基は、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンであることが好ましく、さもないと今述べた問題点の１つの原因となるであろう。塩基はすべてアデニンまたはすべてチミンであることがより好ましい。塩基はすべてチミンであることが最も好ましい。
【００７７】
認識オリゴヌクレオチドの他に希釈オリゴヌクレオチドを使用することが、複合物を調整して生成する手段を提供し、望ましいレベルのハイブリダイゼーションをもたらすことがさらに分かった。希釈および認識オリゴヌクレオチドは、複合物を調製するためにナノ粒子と接触させる溶液中のそれらの比とほぼ同じ比率でナノ粒子に結合することが分かった。したがって、ナノ粒子に結合した希釈オリゴヌクレオチドと認識オリゴヌクレオチドの比を、複合物が望ましい数のハイブリダイゼーション事象に関与するように制御するこ
とが可能である。希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合され、または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的と結合する能力を妨害しない任意の配列を有しうる。たとえば、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列と相補的な配列を有してはならない。また、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがそれらの核酸またはオリゴヌクレオチド標的と結合することが可能であるように、認識オリゴヌクレオチドよりも長さが短いことが好ましい。認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分を有する場合には、希釈オリゴヌクレオチドは、スペーサー部分とほぼ同じ長さであることが最も好ましい。このように、希釈オリゴヌクレオチドは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする認識オリゴヌクレオチドの認識部分の能力を妨害しない。希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同様の配列を有することがより好ましい。
【００７８】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するには、粒子複合体プローブ、好ましくはナノ粒子複合体プローブを用いる。これらの粒子複合体は、実際のアッセイ行う前、またはアッセイを行う間にｉｎ ｓｉｔｕで生成することができる。これらの複合体は、オリゴヌクレオチドを結合した粒子、好ましくはナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる。ＤＮＡバーコードすなわちリポーター・オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有する配列を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを介して結びつく。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの一部およびリポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的である配列を有し特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを介して結びつく。標的分析物を含有するサンプル中で用いられた場合、ナノ粒子複合体は標的分析物と結合し、凝集が起きる。前述のように複数の標的が存在する場合、凝集体を単離し、さらに融解分析にかけて特定の標的分析物を同定することができる。代替例として、凝集体を脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを遊離させることが可能である。次いで、これらのリポーター・オリゴヌクレオチドを、任意の好適な検出プローブを用いる任意の好適なＤＮＡ検出システムによって検出することが可能である。
【００７９】
本発明の別の態様では、凝集体の脱ハイブリダイゼーションによって遊離されたリポーター・オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドが結合した基材を用いて検出することが可能である。前記オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドを検出する方法の一部の実施形態は、リポーター・オリゴヌクレオチドを捕捉するために相補的オリゴヌクレオチドが結合された基材を利用する。次いで、これらの捕捉されたリポーター・オリゴヌクレオチドを任意の好適な手段によって検出する。基材を用いることにより、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイの感度を向上させることが可能である。
【００８０】
検出可能な変化の観察を可能にする任意の基材を使用しうる。好適な基材には、透明な固体表面（たとえば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）、不透明な固体表面（たとえば、ＴＬＣシリカ・プレート、濾紙、ガラス繊維フィルタ、硝酸セルロース膜、ナイロン膜などの白色個体表面）、および導電性固体表面（たとえば、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ））が含まれる。基質は任意の形または厚さでよいが、一般には平坦で薄いであろう。ガラス（たとえば、スライド・ガラス）またはプラスチック（たとえば、マイクロタイター・プレートのウエル）などの透明な基材が好ましい。
【００８１】
オリゴヌクレオチドを基材に結合させるのに適したいずれの方法も使用することができる。例を挙げれば、オリゴヌクレオチドを、たとえば非特許文献３６〜４０および非特許文献１８に記載のようにして基材に結合することが可能である。
【００８２】
基材に接続されたオリゴヌクレオチドは、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第１の部分と相補的な配列を有する。基材上のオリゴヌクレオチドのリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下でリポーター・オリゴヌクレオチドを基材と接触させる。このようにしてリポーター・オリゴヌクレオチドが基材と結合する。ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物などの検出プローブを加える前に、結合していないリポーター・オリゴヌクレオチドをすべて基材から洗浄することが好ましい。
【００８３】
本発明の一態様では、基材上のオリゴヌクレオチドと結合したリポーター・オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを結合した第１のタイプのナノ粒子と接触させる。オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第２の部分と相補的な配列を有し、接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で行う。このようにして第１のタイプのナノ粒子が基材と結合する。ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を基材と結合させた後、基材を洗浄し、結合していないナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物をすべて除去する。
【００８４】
第１のタイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、すべて同じ配列を有しても、または検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの別の部分とハイブリダイズする、異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子は、その異なるオリゴヌクレオチドすべてを結合してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドは異なるナノ粒子に接続していることが好ましい。あるいは、第１のタイプの各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが複数の異なる配列を有し、それらのうちの少なくとも１つは、検出すべきリポーター・オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズしなければならない。
【００８５】
場合により、基材に結合した第１のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を、オリゴヌクレオチドが結合した第２のタイプのナノ粒子と接触させる。これらのオリゴヌクレオチドは、第１のタイプのナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、接触は、第１のタイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが第２タイプのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするのを可能にするのに有効な条件下で行う。ナノ粒子が結合した後で、基材を洗浄し、結合していないナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物をすべて除去することが好ましい。
【００８６】
ハイブリダイゼーションの組合せにより検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は、複数のハイブリダイゼーションの結果検出可能な変化が増幅されることを除いて、前述の変化と同様である。特に、第１のタイプの各ナノ粒子は、複数のオリゴヌクレオチド（同一または異なる配列を有する）が接続されているので、第１のタイプの各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物は、複数の第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物とハイブリダイズすることが可能である。また、第１のタイプのナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合物は、検出すべきリポーター・オリゴヌクレオチドの２つ以上の部分とハイブリダイズさせることができる。複数のハイブリダイゼーションによってもたらされる増幅は、変化を初めて検出可能にし、または検出可能な変化の大きさを増大させることができる。この増幅は、アッセイの感度を高め、少量のリポーター・オリゴヌクレオチドの検出を可能にする。
【００８７】
望ましい場合には、第１および第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物の逐次追加によってナノ粒子の付加的層を積み上げることが可能である。このように、標的核酸１分子当たり固定化されるナノ粒子数をさらに増加させ、これに応じたシグナルの強度を増大させることが可能である。
【００８８】
また、相互に直接ハイブリダイズするように設計された第１および第２のタイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を用いる代わりに、結合しているオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を一緒に結合させることに役立つと思われるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子が使用できると考えられる。
【００８９】
基材を用いる場合には、標的リポーター・オリゴヌクレオチドの複数の部分を検出するため、複数の異なるリポーター・オリゴヌクレオチドを検出するため、または双方を検出するために、アレイ中の基材に複数の初期タイプのナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物またはオリゴヌクレオチドを結合することが可能である。たとえば、基材にスポットの列を備え、各スポットは、標的リポーター・オリゴヌクレオチドの部分と結合するように設計されたさまざまなタイプのオリゴヌクレオチドを含める。１つまたは複数のリポーター・オリゴヌクレオチドを含有するサンプルを各スポットに供し、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合物を用いて前述の方法のうちの１つで残りのアッセイを行う。
【００９０】
最後に、基材を用いる場合には、銀染色によって検出可能な変化を生成し、またはさらに増強することが可能である。銀染色は、銀の還元を触媒する任意のタイプのナノ粒子について用いることが可能である。貴金属（たとえば、金および銀）でできたナノ粒子が好ましい。非特許文献４１および４２を参照のこと。核酸の検出に用いられているナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合には、銀イオンを核酸と複合体形成させ、還元を触媒することが可能である。非特許文献４３を参照のこと。また、核酸上のリン酸基と反応させることが可能な銀染色も知られている。
【００９１】
銀染色を用い、前述のアッセイを含む基材上で行われる任意のアッセイにおいて検出可能な変化を生成または増強することが可能である。特に、銀染色は、ナノ粒子の層の使用を多くの場合に省略することが可能であるように、単一タイプのナノ粒子を用いるアッセイの感度を非常に増大させることが分かった。
【００９２】
基材上で行われるリポーター・オリゴヌクレオチドを検出するためのアッセイでは、検出可能な変化をオプティカル・スキャナで観察することが可能である。好適なスキャナには、コンピュータに文書を取り込むために用いられる反射モードで操作する可能なスキャナ（たとえば、フラットベッド・スキャナ）、この機能を実行する能力があり、または同タイプの光学系を利用する他の装置、任意のタイプのグレースケール感応性測定装置、および本発明に従って基材をスキャンするように改変された標準的スキャナ（たとえば、基材のホルダーを備えるように改変されたフラットベッド・スキャナ）が含まれる（現時点では、透過モードで動作するスキャナを用いることが可能かどうかは分かっていない）。スキャナの解像度は、基材上の反応領域がスキャナの単一画素より大きいように十分でなければならない。任意の基材にスキャナを使用することが可能であるが、ただしアッセイによって生みだされる検出可能な変化は基材を背景にして観察が可能でなければならない（たとえば、銀染色によって生成されるスポットなどの灰色のスポットは、白色の背景では観察することが可能であるが、灰色の背景で観察することは不可能である）。スキャナは、白黒スキャナであることが可能であり、カラー・スキャナであることが好ましい。スキャナは、コンピュータに文書を取り込むのに使用されるタイプの標準的カラー・スキャナであることが最も好ましい。このようなスキャナは、安価で容易に入手が可能である。たとえば、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ Ａｓｔｒａ１２００（３００×３００ｄｐｉ）、Ｍｉｃｒｏｔｅｃ１６００（１６０
０×１６００ｄｐｉ）を使用することが可能である。基材をスキャンすることによって得られる画像を処理するためのソフトウェアが搭載されたコンピュータにスキャナを連結する。ソフトウェアは、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．２およびＣｏｒｅｌ Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ８．０などの容易に入手が可能である標準的ソフトウェアであることが可能である。グレースケール測定を計算するためのソフトウェアの使用は、アッセイの結果を定量する手段を提供する。また、ソフトウェアは、着色スポットの色数を提供することが可能であり、核酸の存在の定性的な判定、核酸の量、またはその双方を提供するように再検討することが可能であるスキャン画像（たとえば、プリントアウト）を作製することが可能である。コンピュータは、容易に入手が可能である標準的パーソナル・コンピュータであることが可能である。したがって、標準的ソフトウェアが搭載された標準的コンピュータに連結された標準的スキャナの使用は、アッセイを基材上で行った場合に核酸を検出および定量する便利かつ容易で安価な手段を提供することが可能である。また、スキャンをコンピュータに保存し、さらに参照または使用するために結果の記録を保存することが可能である。勿論、望ましい場合には、より高性能な機器およびソフトウェアを使用することが可能である。
【００９３】
任意の標的リポーター・オリゴヌクレオチドのアッセイでは、ユニバーサルなナノ粒子‐オリゴヌクレオチド複合物を使用することができる。この「ユニバーサル・プローブ」は、単一配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、リポーター・オリゴヌクレオチドの一部と相補的である。ユニバーサル・プローブに結合されたオリゴヌクレオチドは、支持体に結合されたリポーター・オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズすることが可能である。第１の部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的である。第２の部分は、検出すべき核酸の配列の一部と相補的である。結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に、検出すべき核酸の複数部分または異なる核酸標的に「ユニバーサル・プローブ」が結合することが可能である場合には、同一の第１の部分および異なる第２の部分を有する複数の結合オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【００９４】
用語「ある（ａまたはａｎ）」ものは、１つまたは複数のものを指すことに注意すべきである。たとえば、「ある特徴」は、１つまたは複数の特徴または少なくとも１つの特徴を指す。したがって、用語「ある（ａまたはａｎ）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は本願明細書では互換的に用いられる。また、用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」を互換的に用いてきたことにも注意すべきである。
【実施例１】
【００９５】
（オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製）
Ａ．金（ｇｏｌｄ）ナノ粒子の調製
オリゴヌクレオチド修飾した１３ｎｍの金（Ａｕ）粒子を、文献の方法によって調製した（〜１１０個のオリゴヌクレオチド／粒子）１８〜２０。金コロイド（直径１３ｎｍ）は、非特許文献４４および４５に記載のように、ＨＡｕＣｌ４のクエン酸塩の還元によって調製した。簡潔に説明すると、すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌを３部、ＨＮＯ３を１部）で洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）Ｈ２Ｏですすぎ、次いで使用前にオーブンで乾燥した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムは、アルドリッチケミカルカンパニー社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４の水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を撹拌しながら還流させ、次いで３８．８ｍＭクエン酸３ナトリウム溶液５０ｍＬを素早く加えると、溶液の色が淡黄色から深赤色に変化した。変色後、溶液をさらに１５分還流し、室温まで冷却させ、続いてマイクロンセパレーションインコーポレイティッド社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）の０．４５μｍナイロン・フィルタで濾過した。金コロイドの特徴は、ヒューレット・
パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計を用いる紫外可視分光法、および日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いる透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって明らかにした。直径１３ｎｍの金粒子の典型的な溶液は、５１８〜５２０ｎｍに中心がある特徴的な表面プラズモンバンドを示した。直径１３ｎｍの金粒子は、１０〜７２ヌクレオチドの範囲の標的およびプローブ・オリゴヌクレオチド配列と凝集した場合に目に見える変色を生じるであろう。
【００９６】
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト化学反応を用いる単一カラム式のＭｉｌｌｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置を用い、１マイクロモルのスケールで合成した（非特許文献４６）。すべての溶液はミリジーン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）から購入した（ＤＮＡ合成用）。平均カップリング効率は９８から９９．８％まで変化し、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基はオリゴヌクレオチドから切断せず、精製に役立てた。
【００９７】
３’チオール‐オリゴヌクレオチドの場合には、Ｔｈｉｏｌ‐Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３
Ｓ‐Ｓ ＣＰＧ支持体をグレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入し、自動合成装置で使用した。最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は除去せず、精製に役立てた。合成後、担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。
【００９８】
アンモニアを蒸発させた後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いた分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴ保護された１２塩基の修飾オリゴマーの保持時間は３０分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチド（１０ＯＤ）を５０℃において一晩、０．０４Ｍ ＤＴＴ、０．１７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）溶液１００μＬ中に再分散させ３’ジスルフィドを切断した。この溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を脱塩用ＮＡＰ‐５カラムにより精製した。オリゴヌクレオチドの量は、２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。純度は、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）および１０ｍＭ ＮａＯＨの２％／分グラジエントによるＤｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ（登録商標）ＰＡ‐１００カラム（２５０×４ｍｍ）を用いるイオン交換ＨＰＬＣによって評価した。保持時間（Ｔｒ）が１８．５、１８．９および２２分である３本のピークが観察された。Ｔｒ＝２２．０分の主要な単一ピークはジスルフィドによるものとされ、面積は７９％であった。より短い１８．５および１８．９分という保持時間の２本のピークは、面積がそれぞれ〜９％および１２％であり、酸化された不純物および残留チオール・オリゴヌクレオチドによるものとされた。
【００９９】
５’アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した。１）ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した；２）ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した；３）５‐Ｔｈｉｏｌ‐Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６‐ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））２０μｍｏｌｅを含有する乾燥アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混合し、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオチド‐ＣＰ
Ｇが入ったカートリッジ中に導入した；４）同溶液を、カートリッジ内をゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した；５）ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄した。次いで、３’‐アルキルチオール・オリゴヌクレオチドで記載したように、トリチルオリゴヌクレオチド誘導体を単離し精製した。次いで、乾燥オリゴヌクレオチドサンプルに５０ｍＭ ＡｇＮＯ３溶液１５μＬ（１０ＯＤの場合）を加えることによって（２０分間）トリチル保護基を切断すると、乳白色の懸濁液が得られた。ＤＴＴの１０ｍｇ／ｍＬ溶液２０μＬを加えることによって過剰の硝酸銀を除去すると（５分の反応時間）、直ちに黄色の沈殿を生成し、これを遠心分離によって除去した。次いで、オリゴヌクレオチド溶液（＜１０ＯＤ）の一定量を精製のために脱塩用ＮＡＰ‐５カラムに移した。得られた５’アルキルチオール・オリゴヌクレオチドの最終的な量および純度は、３’アルキルチオール・オリゴヌクレオチドについて前述した技法を用いて評価した。イオン交換ＨＰＬＣによって２本の主要ピークが観察され、保持時間は１９．８分（チオールのピーク、面積で１６％）および２３．５分（ジスルフィドのピーク、面積で８２％）であった。
【０１００】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金粒子への接続
金コロイドの水溶液１ｍＬ（１７ｎＭ）を、水に溶かした過剰（３．６８υＭ）のチオール‐オリゴヌクレオチド（長さ２２塩基）と混合し、混合物を室温に１２〜２４時間放置した。次いで、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）とし、４０時間放置した。この「エージング」工程は、チオール‐オリゴヌクレオチドによる表面被覆率を増大させ、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を解離させるために設計された。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１４において１４，０００ｒｐｍで約２５分間溶液を遠心分離すると、（２６０ｎｍにおける吸光度が示すように）大部分のオリゴヌクレオチドを含有する極めて淡いピンク色の上清が（５２０ｎｍにおける吸光度が示すように）７〜１０％のコロイド状の金と共に、およびチューブの底には堅くしまり暗色のゼラチン状の残渣が得られた。上清を除去し、緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ）約２００μＬ中に残渣を再懸濁し、再度遠心分離した。上清溶液を除去後、残渣を緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ＮａＮ３）１．０ｍＬ中に入れた。得られた赤色のマスター溶液は、室温で数ヶ月の放置、シリカ薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート上へのスポッティング（実施例４を参照のこと）、および１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡを含有する溶液への添加に際して安定であった（すなわち、赤色のままで凝集しなかった）。
【実施例２】
【０１０１】
（ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの調製）
ハプテン修飾オリゴヌクレオチドは、標準的な固相ＤＮＡ合成手順を用い、Ａ１の場合にはビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４‐ジニトロフェニル−トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ））で調製した２１。
【０１０２】
ビオチン修飾オリゴヌクレオチドは、以下のプロトコルを用いて調製した：ＣＰＧに結合し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドは、標準的手順２１を用いる自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した。次いで、ＣＰＧカートリッジを取り外し、使い捨てタイプのシリンジを両端に接続した。ビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホルアミダイト２０μｍｏｌｅを含有する乾燥アセトニトリル溶液２００μＬを標準的「テトラゾール活性化剤溶液」２００μＬと混ぜ、シリンジのうち１本を経由してオリゴヌクレオチド‐ＣＰＧが入ったカートリッジに導入した。同溶液を、カートリッジ内をゆっくりと１０分間前後運動させ、次いで排出し、続いて乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で
洗浄した。その後、ＴＨＦ／ピリジン／水に溶かした０．０２Ｍヨウ素７００μＬで中間体のホスファイトを酸化し（３０秒）、続いてアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリルで洗浄し、続いて窒素流でカラムを乾燥した。トリチル保護基は除去せず、精製に役立てた。担持されたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム１ｍＬ中に５５℃で１６時間置き、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。アンモニアを蒸発後、２５４ｎｍにおけるＤＮＡの紫外シグナルをモニターしながら、流速１ｍＬ／分で０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡの１％／分グラジエントによるＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いる分取用逆相ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴで保護されたオリゴヌクレオチドの保持時間は〜３２分であった。続いて、精製オリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬することによってＤＭＴを切断し、続いて蒸発させた。オリゴヌクレオチドを水５００μＬ中に再分散させ、酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出し乾燥した。同様のプロトコルを用い、２，４‐ジニトロフェニル‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトを用いてＤＮＰ修飾オリゴヌクレオチドを合成した。
【実施例３】
【０１０３】
（ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ）
オリゴヌクレオチドで修飾した１３ｎｍの金粒子を、実施例１に記載のように調製した。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドを、標準的な固相ＤＮＡ合成手順２１を用い、Ａ１の場合にはビオチン‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイトおよびＢ１の場合には２，４‐ジニトロフェニル‐トリエチレン・グリコール・ホスホアミダイト（グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ））で実施例２に記載のように調製した。本研究で用いるＰＢＳ緩衝溶液は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなる。ＩｇＥおよびＩｇＧ１は、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）［米国ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）所在］から購入し、使用前に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびバックグラウンドタンパク質（１０ｕｇ／ｍｌリゾチーム、１％ウシ血清アルブミン、および５．３ｕｇ／ｍｌ抗ジゴキシン；各１０ｕＬ）を含む０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液に溶かした（最終濃度：４．３×１０−８ｂ／μｌ）。
【０１０４】
プローブを調製するため、オリゴヌクレオチド修飾粒子（１３ｎＭ、３００μＬ）を、図１に配列を示すハプテン修飾相補オリゴヌクレオチド（１０μＭを１０μＬ）およびバイオバーコードＤＮＡ（１０μＭを１０μＬ）と室温で２〜３時間ハイブリダイズさせた。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびバイオバーコードを、ナノ粒子プローブの遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）および続く上清のデカンテーションによって除去した。
【０１０５】
ＩｇＥおよび／またはＩｇＧ１の典型的なアッセイでは、プローブ（〜１３ｎＭ）を含有する溶液に標的タンパク質（各々４３μｇ／ｍｌを４０μｌ）を加え、混合物を３７℃で５０分間インキュベートしてタンパク質‐ハプテン複合体形成を促進した。すべての成分、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全な反応を確実にするため、溶液を−１５℃で２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを促進し（ベケル社（Ｂｏｅｋｅｌ）製Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ（登録商標）Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄブロックインキュベータ）、４℃で２４時間保存した。標的タンパク質が存在する場合には、粒子凝集が起こり、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトおよび赤色から紫色への変色をもたらす。ハイブリダイズした生成物を遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、未反応成分を含有する上清を分析に先立ってデカンテーションにより除去した。どのタンパク質が存在するかを決定するため、温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度をモニターする融解分析を溶液中で行う（図２）。前述のプロトコルによりＩｇＧ１をプローブで処理する場合、溶液はピンク
がかった青色に変化し、ナノ粒子凝集体の生成を示す。標的タンパク質は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿は認められない。溶液の融解分析は、融解温度（Ｔｍ）５５℃とともに鋭い相転位を示している。これは、ＩｇＧ１標的についての予想相転位である（図２Ａ（点線））。新たなプローブ溶液にＩｇＥを添加すると、同様の変色が観察されるが、融解分析からは、この標的について予想される相転位であるＴｍ３６℃を伴う曲線が得られる（図２Ａ（実線））。注目すべきことに、プローブ溶液に両方のタンパク質標的を添加すると、溶液は濃紫色に変化し、融解分析は、２つの明確なトランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）を示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６および５５℃に中心のある２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つの別個の会合体が生成し、オリゴヌクレオチド・バーコードに由来するそれらの融解特性を用いて２つのタンパク質標的を区別することが可能であることを示している。
【実施例４】
【０１０６】
（ナノ粒子複合体プローブを用いるアッセイ）
この戦略の変形形態を用い、前述のシステムの感度を増加させ、１溶液中で調べることが可能である標的数を増やすことが可能である（図３）。この戦略により、ＤＮＡバイオバーコードを用いてタンパク質標的を間接的に検出することが可能である。１２量体オリゴヌクレオチドは、４１２種類の異なる配列を有し、それらの多くを用いて図１Ａに示すように目的の多価タンパク質用のバーコードを調製することが可能である。アッセイのこの変形形態では、生成する凝集体の融解特性を溶液中では測定せず、遠心分離（３０００ｒｐｍで２分間）により未反応のプローブおよび標的分子から凝集体内のＤＮＡバイオバーコードを分離する。次いで、溶液に水を加えることによって凝集体を変性させ、複合体形成したＤＮＡを遊離させる。粒子およびタンパク質は、遠心濾過装置（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ‐１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によってＤＮＡバーコードから分離することが可能である。ＤＮＡバーコードを単離したら、それらをオリゴヌクレオチド・アレイ上に捕捉し、多くのＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。本願明細書に記載のＩｇＧ１およびＩｇＥに関する実施例の場合には、該バーコードの半分と相補的であるオリゴヌクレオチドで機能化された（直径２５０μｍのスポット）顕微鏡用スライド上にバーコードを捕捉する（図１のＡ３およびＢ３）。バーコードがオリゴヌクレオチド・アレイによって捕捉されると、バーコードの残りの部分と相補的であるＤＮＡ修飾粒子をアレイとハイブリダイズさせることが可能である（実験の項を参照）。標準的なスキャン測定の手法［１１］（写真現像溶液による処理を含む）により現像されれば、フラットベッド・スキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）１１。ＩｇＧ１が存在する場合には、ＩｇＧ１のために設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが存在する唯一のタンパク質である場合には、ＩｇＥのために設計されたスポットのみがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合には、両スポットが強いシグナルを示す。
【０１０７】
スキャン法によるＤＮＡバイオバーコード検出の場合には、ＤＮＡ／金ナノ粒子会合体をポリスチレンの１．５ｍＬバイアル中で遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、上清を除去した。凝集体にＰＢＳ緩衝溶液（７００μｌ）を加え、この手順を繰り返して未反応タンパク質およびアッセイ成分から凝集体を確実に単離した。次いで、凝集体の入ったバイアルに水５００μｌを加えて凝集体を変性させた。マイクロアレイを用意し、文献の方法に従ってＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いた１１、２２。単離したＤＮＡバイオバーコードを、Ａ２修飾ナノ粒子またはＢ２修飾ナノ粒子（２ｎＭ）とあらかじめ混合し、ＤＮＡマイクロアレイに曝露し、ハイブリダイゼーション用チャンバ（グレイスバイオラボ社（ＧＲＡＣＥ ＢＩＯ‐ＬＡＢＳ））中で室温で３時間インキュベートした。次いで、０．３Ｍ ＮａＮＯ３および１０ｎＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（
ｐＨ４）でアレイを洗浄し、室温で３分間Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））中に浸した。スライドを水で洗浄し、次いでフラットベッド・スキャナで分析した。
【０１０８】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＤＮＡ／金ナノ粒子をベースとするタンパク質検出スキームを示す図。（Ａ）ハプテン修飾ナノ粒子プローブの調製。（Ｂ）タンパク質結合プローブを用いるタンパク質検出。配列Ａには９個のＧ、Ｃ対が存在するが、配列Ｂに存在するのはわずか２個のＧ、Ｃ対であることに注意。
【図２】ＤＮＡおよびタンパク質によって連結された金ナノ粒子凝集体についての熱変性プロファイルを示す図。２６０ｎｍにおける吸光度を上昇する温度（毎分１℃、１分の保持時間）の関数としてモニターした。各紫外可視スペクトルを、凝集体を浮遊させるために絶え間なく撹拌しながら測定した。融解分析を行う前に、すべての凝集体を０．３Ｍ ＰＢＳ１ｍｌに懸濁した。Ａ）１つの標的抗体を含む２つのプローブは、ＩｇＥ（実線）、ＩｇＧ１（点線）を示す；すべてのデータは正規化されている；（Ｂ）両標的抗体を含む２つのプローブを示す。挿入図；熱変性曲線の一次導関数。
【図３】タンパク質のバイオバーコードとしてＤＮＡを用いる、アレイをベースとするタンパク質検出スキームを示す図。
【図４】ＤＮＡバイオバーコードのスキャン測定によるＤＮＡアレイ検出を示す図。左のカラムはＩｇＧ１に関するバイオバーコードの検出用であり、右のカラムはＩｇＥに関するバイオバーコード用である。捕捉オリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ１システムの場合には５’チオール修飾‐ＡＴＡＡＣＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡであり、ＩｇＥシステムの場合には５’チオール修飾‐ＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴである。各スポットは直径が約２５０ｕｍであり、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １６４０ＸＬフラットベッド・スキャナ（米国エプソン社（Ｅｐｓｏｎ Ａｍｅｒｉｃａ）［米国カリフォルニア州ロングビーチ（Ｌｏｎｇｂｅａｃｈ）所在］）でグレースケールにより読み取る。これらのアッセイについて検討したが、同アッセイは２０ｎＭから７００ｎＭの標的濃度範囲にわたって有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部および該特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズして該ＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に該凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法。
【請求項２】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブ。
【請求項４】
粒子がナノ粒子からなる、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
粒子が金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
粒子が金ナノ粒子である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項１】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部および該特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるステップ；
分析物と粒子複合体プローブ間の特異結合性相互作用を可能にし、分析物の存在下で凝集性複合体を生成するのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズして該ＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に該凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法。
【請求項２】
サンプル中の標的分析物の存在を検出するための方法であって、
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有するステップ；
粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡバーコードのハイブリダイゼーションを可能にし、分析物と分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとの間の特異結合性相互作用を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを粒子複合体プローブと接触させるステップであって、前記接触が分析物の存在下で凝集性複合体の生成をもたらすステップ；
凝集性複合体を単離し、該凝集性複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを遊離するのに有効な条件下に凝集性複合体を供するステップ；
ＤＮＡバーコードを単離するステップ；および
ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップ、からなる方法
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドからなる粒子複合体プローブであって、ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的である配列を有し、特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的である配列を有し、ＤＮＡバーコードは、粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部および特異結合性相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる粒子複合体プローブ。
【請求項４】
粒子がナノ粒子からなる、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
粒子が金属、半導体、絶縁体、または磁性ナノ粒子である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
粒子が金ナノ粒子である、請求項３に記載のプローブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１４３（Ｐ２００８−１４３Ａ）
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３１５８８（Ｐ２００７−２３１５８８）
【出願日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【分割の表示】特願２００２−５７８４９１（Ｐ２００２−５７８４９１）の分割
【原出願日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）
【出願人】（５０１２１６０１２）ナノスフェアー インコーポレイテッド (15)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【分割の表示】特願２００２−５７８４９１（Ｐ２００２−５７８４９１）の分割
【原出願日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）
【出願人】（５０１２１６０１２）ナノスフェアー インコーポレイテッド (15)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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