カルバメートを用いる赤血球のための多機能試薬及びその適用
【課題】より迅速かつより完全な作用を伴う赤血球のための新規試薬及び溶解法を提供すること。
【解決手段】赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出及び計数できるような赤血球の溶解又は球状化を形成するのに十分な量の、カルバメート、又は、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤、を含むことを特徴とする多機能試薬、赤血球を溶解又は球状化するための方法、および、白血球の調製方法。
【解決手段】赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出及び計数できるような赤血球の溶解又は球状化を形成するのに十分な量の、カルバメート、又は、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤、を含むことを特徴とする多機能試薬、赤血球を溶解又は球状化するための方法、および、白血球の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処理、特に赤血球の溶解のための新規試薬及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
赤血球は、白血球より約１０００倍多数であり、それらは血液の白血球画分の分析の障壁となる溶解剤での血液の処理はそれらの含有物の赤血球を空にし、その分析からこれらの細胞を単離することを可能にする。理想的な溶解法は、白血球の形態及び生存能にわずかな効果も与えることなく、全ての赤血球要素の完全な溶解を行うことを含む。
【０００３】
多数の溶解試薬及び方法の中で低浸透圧溶解が知られているが、白血球の変形が観察される。
【０００４】
界面活性剤も知られているが、これらは白血球の膜を悪化させ、それゆえ誤ってカウントされる。
【０００５】
小さな中性の、一般に脂溶性の分子、例えばアルコール又はアルデヒドも用いられるが、これらは白血球に毒性である欠点を有する。
【０００６】
実際、アミンを含む試薬は理想的な溶解過程に近い能力価値を有する。アミンを含む溶解試薬は、その使用が広範囲にわたる塩化アンモニウム試薬、及びＦＲ−Ａ−２７７８４１３に記載されるような窒素化ヘテロ環に基づく試薬を含む。塩化アンモニウムを伴う溶解試薬は１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭのＫＨＣＯ３を含み、時折、０．１ｍＭのＥＤＴＡも含む。
【０００７】
しかしながら、ＦＲ−Ａ−２７７８４１３に記載されるように、塩化アンモニウム溶解試薬は迅速かつ完全な溶解効果を有するので、それは白血球に毒性効果を有する。塩化アンモニウムの非特異的毒性の問題はおそらく、溶解混合物中の約１ｍＭのアンモニア濃度の存在に関連している。約１０μＭの遊離塩基濃度でのより強い塩基、例えばピロリジン及びピペリジンの使用は非特異的毒性の問題を解決するが、よりゆっくりとした溶解反応を与え、これは慣用的な研究での使用についての欠点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、より迅速かつより完全な作用を伴う赤血球のための利用できる新しい試薬及び溶解方法を有することが要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
多くの調査の後、出願人は驚くことに、溶解試薬、特にカルバメートの、及び／又は赤血球によるＣＯ２の吸収の間のカルバメートの形成に関連する２つの反応である反応：
【００１０】
【化２】
【００１１】
及び／又は反応：
【００１２】
【化３】
【００１３】
の触媒の存在下でのアミンを含有する試薬が、これらの試薬の欠如下での赤血球のより迅速かつより完全な溶解をもたらすことを発見した。
【００１４】
溶解の速度への溶解試薬中のカルバメートの存在の影響は以下の実験部に示す。
【００１５】
これは、本願の対象が、赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出及び計数できるような赤血球の溶解又は球状化を形成するのに十分な量の、
−窒素化ヘテロ環もしくはハライド、例えば塩化アンモニウムのカルバメート、
又は
−赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤
を含むことを特徴とする多機能試薬であるからである。
【００１６】
本発明による多機能試薬は、赤血球の有効な溶解、又は必要に応じてそれらの単純な球状化の生産を許容する。
【００１７】
本発明を行うための有利な条件においてカルバメートは、０．０００００１Ｍ〜０．１Ｍ、特に０．００００１Ｍ〜０．１Ｍ、特に０．０００１Ｍ〜０．００５Ｍのモル濃度で用いることができる。上述の溶解試薬の操作のための完全に有利な条件において、０．０００４Ｍの濃度が用いられる。
【００１８】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤は、反応
【００１９】
【化４】
【００２０】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素、例えば炭酸脱水酵素Ｉ又は炭酸脱水酵素ＩＩである。その酵素は多様な等電点を有し得、それらの起源として多様なソースを有し得る。その酵素の能力はＷｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ単位で表される。炭酸脱水酵素は、１Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜１，０００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター、特に１０Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜５００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター、特に１００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜１００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッターの濃度で存在し得る。上述の溶解試薬の操作のための完全に有利な条件において、約５０，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッターの濃度が用いられる。
【００２１】
本願及び以下において、カルバメートを部分的に構成する窒素化へテロ環は、例えば２環及び好ましくは単環であり得る。それは不飽和であり得、この場合、例えば５、好ましくは４、特に３、特に２の二重結合を含み、それは好ましくは飽和されている。それは、例えば、３〜８、特に３〜６、特に３〜５、特に４又は５の炭素原子を含む。それは、２、特に１の１つの窒素原子を含む。
【００２２】
飽和窒素化ヘテロ環としては、例えばピラゾリジン、イミダゾリジン、イミダゾリン及びピペラジン、特にモルホリン及び特にピペリジン又はピロリジンを言及することができる。
【００２３】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球のための多機能試薬は、更に、窒素化ヘテロ環又はアンモニウム塩、例えばクロライドのようなハライドを含む。
【００２４】
窒素化ヘテロ環は上述のもののうちの１つであり得る。
【００２５】
本発明による多機能試薬において、窒素化ヘテロ環は、０．０１〜０．２５０Ｍ、特に０．０８〜０．１９Ｍ、特に０．１２〜０．１８Ｍのモル濃度で存在し得る。上述の多機能試薬の操作のための全体的に有利な条件において、０．１７Ｍの濃度が用いられる。
【００２６】
赤血球溶解の間に反応媒体（多機能試薬＋血液サンプル）に関する化合物の濃度は、好ましくは０．０１〜０．２２５Ｍ、特に０．０７２〜０．１７Ｍ、特に０．１１〜０．１７Ｍである。
【００２７】
炭酸脱水酵素を用いる本発明による多機能試薬において、カーボネート又は炭酸水素塩は、血清が天然にそれらを含むので、一緒に分散させることができる。本発明を行うための他の有利な条件において、例えば溶解を加速させるために、赤血球のための多機能試薬は更に、カーボネート又は炭酸水素塩を含む。
【００２８】
例えば炭酸ナトリウムもしくはカリウム又は炭酸水素塩を言及することができる。
【００２９】
本発明による多機能試薬において、カーボネート又は炭酸水素塩は、０．１Ｍのモル濃度まで、特に０．０１Ｍまで、特に０．００５Ｍまでで存在し得る。上述の多機能試薬の操作のための極めて有利な条件において、０．００２５Ｍの濃度が用いられる。
【００３０】
赤血球溶解のための反応媒体（多機能試薬＋血液サンプル）に関する化合物の濃度は、好ましくは０．０００１〜０．１Ｍ、特に０．００１〜０．０１Ｍ、特に０．００１〜０．００５Ｍである。
【００３１】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球のための多機能試薬は、更に、白血球の劣化に対する保護剤、例えば固定剤、特に脂肪族アルデヒド、例えばＣ１−Ｃ５のもの、例えばパラホルムアルデヒド及び特にホルムアルデヒドを含む。
【００３２】
脂肪族アルデヒドは０．０１％〜５％、特に０．１４％〜１％、特に０．１％〜０．５％の濃度で存在し得る。
【００３３】
本発明を行うためのなお更に有利な条件において、本発明の多機能試薬は、有効量の抗凝固剤も含む。
【００３４】
ヘパリン、特にシトレートイオン、ＥＧＴＡ及び特にＥＤＴＡを、例えば抗凝固剤として言及することができる。
【００３５】
溶解の間及び後に中性ｐＨで緩衝液なしでのその混合物のｐＨは増加する傾向にあり、これにより細胞分解を誘発する。それゆえほぼ中性のｐＨの緩衝液の使用が要求される。緩衝液が溶解を阻害する傾向があるという事実にかかわらず、触媒、例えば炭酸脱水酵素の加速効果のおかげで、少量の緩衝液（例えば１〜２０ｍＭ）を用いることができる。本発明によるカルバメートの使用はほぼ中性のｐＨの緩衝液の使用を許容する。
【００３６】
これは、本発明を行うための他の有利な条件において、本発明の多機能試薬は有効量の緩衝剤、特にｐＨ６．５〜７．５のものも含むからである。例えば、緩衝剤として、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、特にＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）及び特にＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））及び特に緩衝剤ＤＩＰＳＯｐＨ７．５を言及することができる。
【００３７】
本発明による多機能試薬において、緩衝剤は、０．０００１〜０．０５０Ｍ、特に０．０００５〜０．０３Ｍ、特に０．００１〜０．０１０Ｍのモル濃度で存在し得る。
【００３８】
固定剤なしでの上述の多機能試薬の形成のための有利な条件において、０．１７Ｍのピロリジンヒドロクロライド、２．５ｍＭの炭酸水素カリウム、３ｍＭのＤＩＰＳＯ緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍｇ／Ｌの炭酸脱水酵素及び０．１ｍＭのＥＤＴＡが用いられる。
【００３９】
固定剤を伴う上述の多機能試薬の形成のための極めて有利な条件において、０．３％のホルムアルデヒドも用いられる。
【００４０】
上述のように、反応：
【００４１】
【化５】
【００４２】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素は、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせて、カーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する窒素化ヘテロ環のカルバメートは、赤血球の溶解を行うために直接、用いることもできる。これらのいくつかは新規生成物である。
【００４３】
これは、本発明の対象が、
−ピロリジンカルバメート
−ピペリジンカルバメート
から選択されるカルバメートでもあるからである。
【００４４】
本発明の対象である試薬は、極めて有利な特性を有する。それらは、赤血球に関して溶解性である顕著な特性を有する。
【００４５】
これらの特性は、以下の実験部に詳述される。それらは赤血球の溶解又は球状化のための方法において上述の試薬の使用を正当化する。赤血球の溶解は、白血球及びそれらの副次集団、血小板、溶解後の赤血球残留物、又はいずれかの他の細胞性の又は懸濁された、添加された又はそうでない要素、例えば小球体のフローサイトメーターを用いる分析及び／又はトリアージを許容する。
【００４６】
それらは、白血球の調製のための方法において、上述の試薬の使用を正当化する。
【００４７】
それゆえ、本発明の対象は、赤血球の溶解の方法であって、抗凝固剤、例えばＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで処理した全血のサンプルを上述の溶解試薬の作用にかけて、３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を行う方法でもある。
【００４８】
白血球細胞のラベリングを行うために、モノクローナル抗体の欠如又は存在下で作業を行うことが可能である。これらの抗体は、蛍光化合物、例えば後述のものに結合させてもさせなくてもよい。操作の有利な条件において、これらの抗体は蛍光化合物に結合される。
【００４９】
上述の多機能試薬は次の通り用いることができる：
抗凝固剤で処理し、モノクローナル抗体で、もしくは蛍光マーカーと組み合わせてモノクローナル抗体で、又は蛍光マーカーと組み合わせたモノクローナル抗体の混合物で処理した血液の０．１ｍＬのサンプルを上述の２ｍＬの多機能試薬に接触させ、溶解を終える間の１０分間、放置した。このようなマーカーは、例えばＣＤ４５−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネートと組み合わせたＣＤ４５）又はフイコエソトリンと組み合わせたＣＤ１４であり、例えばＤＡＫＯ，ＢＥＣＴＯＮ ａｎｄ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ又はＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社により市販される。次に、例えばＢＥＣＴＯＮ ａｎｄ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ Ｆａｃｓｃａｎ又はＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬタイプのサイトメーターの読み取りを、溶解直後又はその後３日までに行う。
【００５０】
本発明による溶解の方法を行うための有利な条件において、多機能試薬のための上述の有利な条件が選択される。
【００５１】
本発明により包含される溶解のシステムは、浸透剤、例えば脂肪族アルコール又は界面活性剤の存在下でも用いることができる。触媒、例えば炭酸脱水酵素又はカルバメートを含む細胞内免疫標識化を許容する浸透触媒も本発明の一部である。このような溶解及び浸透段階は、任意に脂肪族アルデヒドによる固定化の後に行うことができる。
【００５２】
上述の方法を行うための有利な条件において全血のサンプルは１０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を行うのに十分な量の試薬に接触させる。
【００５３】
上述の方法を行うための他の有利な条件において試薬及びサンプルの混合物のｐＨは４〜９である。
【００５４】
しかしながら、本発明により多機能試薬は、赤血球の単純な球状化の生産も許容する。
【００５５】
これは、本発明の対象が赤血球の球状化の方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、自動計数装置によるそれらの分析を許容するように、赤血球の球状化（膨潤）を誘発するのに十分な量の上述の試薬に接触させることを特徴とする方法でもあるからである。
【００５６】
赤血球の球状化のための有利な条件において血液のサンプルは１０秒〜４００秒の間隔で球状化を行うのに十分な球状化試薬の量に接触させる。時間間隔での赤血球の溶解を避けるため及び球状化の速度を制御するため、本発明による多機能試薬は好ましくは等張溶液に希釈させることができる。同量の０〜１０倍、好ましくは０．５〜５倍、特に１〜３倍の希釈剤を例えば加えることができる。特に有利な条件において、等張溶液の選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＩｓｏ Ｆｌｏｗ（登録商標）であり、それは、ＮａＣｌ：７．９２ｇ／Ｌ，ＫＣｌ：０．４ｇ／Ｌ，ＮａＨ２ＰＯ４：０．１９ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４：１．９５ｇ／Ｌ，ＥＤＴＡ：０．３８ｇ／Ｌ，２−フェノキシエタノール：３ｇ／Ｌ、及びＮａＦ：０．３ｇ／Ｌを含む。
【００５７】
他の有利な条件において、１又は複数のアジュバント、例えば固定化剤、核酸の着色剤、及び／又はイソフフィアリング（ｉｓｏｓｐｈｅｒｉｎｇ）剤、例えばマルトンド（Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏ，ＵＳ−Ａ−５１９４９０９）が球状化試薬に添加される。
【００５８】
先に見られるように、本発明の多機能試薬は、白血球について攻撃的でなく、それゆえそれらの調製に関して用いることができる。それゆえ、本発明により包含される溶解システムは、生存可能な白血球細胞の調製のための道具でもあり、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに基づく細胞調製の技術におきかわることができる。血液、骨髄及びいずれかの他の体液の溶解後の生存可能細胞の調製は、例えば機能的細胞テストのための調査、細胞の凍結及び保存等の目的のための適用を有する。細胞生存能の制御が考慮される限り、その溶解法は、生存能着色剤、例えばエオシン、ブルートリプタン、７−ＡＡＤ，ＬＤＳ７５１等と一緒に用いられる。最後に、本出願人の研究による溶解は赤血球がＣＯ２を吸収する能力の関数であるので、溶解のシステムは、赤血球の機能的パラメーターとして用いることができる。
【００５９】
これは、本発明の対象が白血球の調製のための方法であって、上述のような多機能試薬を用いる赤血球の溶解の段階を含むことを特徴とする方法でもあるからである。
上述の方法を行うための有利な条件は上述の本発明の他の対象にも適用される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出することができるような赤血球の溶解又は赤血球の球状化を形成するのに十分な量の、カルバメート、又は赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤を含むことを特徴とする多機能試薬。
（項目２）前記赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤が、反応：
【化１】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素であることを特徴とする項目１に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目３）窒素化ヘテロ環又はアンモニウム塩も含むことを特徴とする項目１又は２に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目４）カーボネート又は炭酸水素塩も含むことを特徴とする項目１〜３のいずれか一に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目５）白血球の劣化に対して保護する剤、例えば脂肪族アルデヒドも含むことを特徴とする項目１〜４のいずれか一に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目６）ピロリジンカルバメート、
ピペリジンカルバメート
から選択されるカルバメート。
（項目７）赤血球の溶解又は球状化のための方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を導くか、又は自動計数装置による分析を許容するように球状化を誘発するのに十分な量の、項目１〜５のいずれか一に記載の試薬に接触させることを特徴とする方法。
（項目８）全血のサンプルを３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を導くのに十分な量の試薬に接触させることを特徴とする項目７に記載の方法。
（項目９）前記試薬及び前記サンプルの混合物のｐＨが４〜９であることを特徴とする項目７又は８に記載の方法。
（項目１０）赤血球の球状化のための方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、自動計数装置による分析を許容するように球状化を誘発するのに十分な量の、項目１〜５のいずれか一に記載の試薬に接触させることを特徴とする方法。
（項目１１）白血球の調製のための方法であって、項目１〜５のいずれか一に記載の多機能試薬を用いる、赤血球の溶解の段階を含むことを特徴とする方法。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１による溶解後のフローサイトメトリー（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬ）を用いて分析した血液サンプルのサイズ−構造拡散ダイアグラムを示す。領域Ａはリンパ球に相当し、領域Ｂは単球に相当し、そして領域Ｃは顆粒球に相当する。
【図２】実施例６による球状化後のフローサイトメトリー（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬ）を用いて分析した血液サンプルのサイズ−構造拡散ダイアグラムを示す。実施例６に記載される球状化剤との赤血球の接触後の、赤血球のサイズ−構造の存在を１００秒の４間隔で示す（図２（Ａ））。経時的に生じる赤血球の球状化及び均質化をサイズ−構造ダイアグラムに示す；図２（Ｂ），１００秒後；図２（Ｃ），２００秒後；図２（Ｄ），３００秒後；図２（Ｅ），４００秒後。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は本願を詳述する。
【００６２】
実施例１：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピロリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例２：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピロリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ホルムアルデヒド ０．１％
ｐＨ７．３
実施例３：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピペリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例４：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
塩化アンモニウム １５５ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例５：溶解の能力
全血１００μＬを実施例１の溶解剤１ｍＬと混合する。その溶液を環境温度で１０分、放置し、白血球をサイトメトリーにより計数する。
【００６３】
実施例６〜８：ピロリジン、ピペリジン及びモルホリンカルバメートの調製
重炭酸ナトリウム及び所定量の各々の化合物の混合物（モル比１：２）を撹拌しながら１００℃に加熱した。その反応は、約１時間後におこる混合物の固体化を特徴とする。求めるカルバメートをメタノールでの抽出後に回収した。これらの合成した化合物の分子構造を２００ＭＨｚでＮＭＲ分光測定13Ｃにより確認した。
【００６４】
これらの分析（ジエーテリオメタノール）は以下の化学シフトを得るのを可能にする（δ：ｐｐｍ)：
１／ピロリジンカルバメート：２６．４４；２７．２４；４７．３２；４７．６３（ＣＨ２；１６５．０２（Ｃ＝Ｏ）
２／ピペリジンカルバメート：２５．６９；２６．５８；２７．３９；２８．７１；４７．６５（ＣＨ２；１６２．７６（Ｃ＝Ｏ）
３／モルホリンカルバメート：４７．１４；６８．４２（ＣＨ２；１６２．８１（Ｃ＝Ｏ）
実施例９：球状化剤の調製
球状化剤を、実施例１により試薬及びＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲにより市販される等張組成物、所定容量のＩｓｏｆｌｏｗ（登録商標）を混合することにより調製した。
【００６５】
実施例１０：球状化後のサイトメトリー
４マイクロリッターの容量の血液を１ｍＬの実施例９の球状化剤に接触させた。球状化の過程を、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＰ ＸＬサイトメーターで時間の関数としてサイトメトリーにより追跡した。結果を上述の図２に示す。
【００６６】
実験１：
ＫＨＣＯ３(１０ｍＭ）の存在下又は各々のカルバメート誘導体（０．４ｍＭ）の存在下でのアンモニウムイオンによる及び窒素化ヘテロ環による溶解の速度を研究した。抗凝固剤（ＥＤＴＡ）で処理した０．１ｍＬの容量の全血のために２ｍＬの容量の試薬を用いた。ｐＨのバリエーションは、カルバメートの添加前にＨＣｌの１Ｍ水溶液を加えることにより得た。カルバメート（メタノール中１００ｍＭ）を反応の開始時にその混合物に加えた。その反応混合物のｐＨを測定した。その溶解過程を、分光光度測定（７００ｎｍでの光学密度の測定）により追跡した。その溶解時間は、最小レベルを得るために必要な時間により決定する。
【００６７】
得られた結果は次の通りである：
【００６８】
【表１】
【００６９】
結論：アンモニウムイオンへ及び窒素化ヘテロ環への異なるカルバメートの添加は、カルバメートの濃度の２５倍の濃度で炭酸水素塩を加えることにより得られるよりかなり速い速度の溶解を誘導するのが見られよう。表に示すように、カルバメートの溶解効果はｐＨに依存しない。
【００７０】
実験２：
反応：
【００７１】
【化６】
【００７２】
における炭酸脱水酵素の触媒の役割の証明。
【００７３】
反応：
【００７４】
【化７】
【００７５】
を、カルバメートでなくカーボネートが沈殿する８５％のアセトンの水溶液中の溶解度の差により測定して、アンモニウムカルバメートのアンモニウムカーボネートへの変換を介して研究した。
【００７６】
【表２】
【００７７】
結論：結果は、炭酸脱水酵素は、公知である変換：
【００７８】
【化８】
【００７９】
を触媒することに加えて、変換：
【００８０】
【化９】
【００８１】
も触媒することを示す。
【００８２】
実験３：
異なるソースから得られた炭酸脱水酵素の溶解の速度への効果の証明
実施例１による溶解反応において、５０，０００Ｗ−Ａ Ｕ／Ｉでの成分炭酸脱水酵素を各々５０００Ｗ−Ａ Ｕ／Ｉで表に示すような炭酸脱水酵素の調製物に置きかえた。その溶解過程を分光光度測定（７００ｎｍでのＯＤの測定）により追跡した。溶解の持続時間を、最小レベルを達成するのに必要な時間により決定する。
【００８３】
【表３】
【００８４】
結論：炭酸脱水酵素の異なる調製物は全て溶解の速度を増加させる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処理、特に赤血球の溶解のための新規試薬及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
赤血球は、白血球より約１０００倍多数であり、それらは血液の白血球画分の分析の障壁となる溶解剤での血液の処理はそれらの含有物の赤血球を空にし、その分析からこれらの細胞を単離することを可能にする。理想的な溶解法は、白血球の形態及び生存能にわずかな効果も与えることなく、全ての赤血球要素の完全な溶解を行うことを含む。
【０００３】
多数の溶解試薬及び方法の中で低浸透圧溶解が知られているが、白血球の変形が観察される。
【０００４】
界面活性剤も知られているが、これらは白血球の膜を悪化させ、それゆえ誤ってカウントされる。
【０００５】
小さな中性の、一般に脂溶性の分子、例えばアルコール又はアルデヒドも用いられるが、これらは白血球に毒性である欠点を有する。
【０００６】
実際、アミンを含む試薬は理想的な溶解過程に近い能力価値を有する。アミンを含む溶解試薬は、その使用が広範囲にわたる塩化アンモニウム試薬、及びＦＲ−Ａ−２７７８４１３に記載されるような窒素化ヘテロ環に基づく試薬を含む。塩化アンモニウムを伴う溶解試薬は１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭのＫＨＣＯ３を含み、時折、０．１ｍＭのＥＤＴＡも含む。
【０００７】
しかしながら、ＦＲ−Ａ−２７７８４１３に記載されるように、塩化アンモニウム溶解試薬は迅速かつ完全な溶解効果を有するので、それは白血球に毒性効果を有する。塩化アンモニウムの非特異的毒性の問題はおそらく、溶解混合物中の約１ｍＭのアンモニア濃度の存在に関連している。約１０μＭの遊離塩基濃度でのより強い塩基、例えばピロリジン及びピペリジンの使用は非特異的毒性の問題を解決するが、よりゆっくりとした溶解反応を与え、これは慣用的な研究での使用についての欠点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、より迅速かつより完全な作用を伴う赤血球のための利用できる新しい試薬及び溶解方法を有することが要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
多くの調査の後、出願人は驚くことに、溶解試薬、特にカルバメートの、及び／又は赤血球によるＣＯ２の吸収の間のカルバメートの形成に関連する２つの反応である反応：
【００１０】
【化２】
【００１１】
及び／又は反応：
【００１２】
【化３】
【００１３】
の触媒の存在下でのアミンを含有する試薬が、これらの試薬の欠如下での赤血球のより迅速かつより完全な溶解をもたらすことを発見した。
【００１４】
溶解の速度への溶解試薬中のカルバメートの存在の影響は以下の実験部に示す。
【００１５】
これは、本願の対象が、赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出及び計数できるような赤血球の溶解又は球状化を形成するのに十分な量の、
−窒素化ヘテロ環もしくはハライド、例えば塩化アンモニウムのカルバメート、
又は
−赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤
を含むことを特徴とする多機能試薬であるからである。
【００１６】
本発明による多機能試薬は、赤血球の有効な溶解、又は必要に応じてそれらの単純な球状化の生産を許容する。
【００１７】
本発明を行うための有利な条件においてカルバメートは、０．０００００１Ｍ〜０．１Ｍ、特に０．００００１Ｍ〜０．１Ｍ、特に０．０００１Ｍ〜０．００５Ｍのモル濃度で用いることができる。上述の溶解試薬の操作のための完全に有利な条件において、０．０００４Ｍの濃度が用いられる。
【００１８】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤は、反応
【００１９】
【化４】
【００２０】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素、例えば炭酸脱水酵素Ｉ又は炭酸脱水酵素ＩＩである。その酵素は多様な等電点を有し得、それらの起源として多様なソースを有し得る。その酵素の能力はＷｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ単位で表される。炭酸脱水酵素は、１Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜１，０００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター、特に１０Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜５００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター、特に１００Ｗ−Ａ Ｕ／リッター〜１００，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッターの濃度で存在し得る。上述の溶解試薬の操作のための完全に有利な条件において、約５０，０００Ｗ−Ａ Ｕ／リッターの濃度が用いられる。
【００２１】
本願及び以下において、カルバメートを部分的に構成する窒素化へテロ環は、例えば２環及び好ましくは単環であり得る。それは不飽和であり得、この場合、例えば５、好ましくは４、特に３、特に２の二重結合を含み、それは好ましくは飽和されている。それは、例えば、３〜８、特に３〜６、特に３〜５、特に４又は５の炭素原子を含む。それは、２、特に１の１つの窒素原子を含む。
【００２２】
飽和窒素化ヘテロ環としては、例えばピラゾリジン、イミダゾリジン、イミダゾリン及びピペラジン、特にモルホリン及び特にピペリジン又はピロリジンを言及することができる。
【００２３】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球のための多機能試薬は、更に、窒素化ヘテロ環又はアンモニウム塩、例えばクロライドのようなハライドを含む。
【００２４】
窒素化ヘテロ環は上述のもののうちの１つであり得る。
【００２５】
本発明による多機能試薬において、窒素化ヘテロ環は、０．０１〜０．２５０Ｍ、特に０．０８〜０．１９Ｍ、特に０．１２〜０．１８Ｍのモル濃度で存在し得る。上述の多機能試薬の操作のための全体的に有利な条件において、０．１７Ｍの濃度が用いられる。
【００２６】
赤血球溶解の間に反応媒体（多機能試薬＋血液サンプル）に関する化合物の濃度は、好ましくは０．０１〜０．２２５Ｍ、特に０．０７２〜０．１７Ｍ、特に０．１１〜０．１７Ｍである。
【００２７】
炭酸脱水酵素を用いる本発明による多機能試薬において、カーボネート又は炭酸水素塩は、血清が天然にそれらを含むので、一緒に分散させることができる。本発明を行うための他の有利な条件において、例えば溶解を加速させるために、赤血球のための多機能試薬は更に、カーボネート又は炭酸水素塩を含む。
【００２８】
例えば炭酸ナトリウムもしくはカリウム又は炭酸水素塩を言及することができる。
【００２９】
本発明による多機能試薬において、カーボネート又は炭酸水素塩は、０．１Ｍのモル濃度まで、特に０．０１Ｍまで、特に０．００５Ｍまでで存在し得る。上述の多機能試薬の操作のための極めて有利な条件において、０．００２５Ｍの濃度が用いられる。
【００３０】
赤血球溶解のための反応媒体（多機能試薬＋血液サンプル）に関する化合物の濃度は、好ましくは０．０００１〜０．１Ｍ、特に０．００１〜０．０１Ｍ、特に０．００１〜０．００５Ｍである。
【００３１】
本発明を行うための他の有利な条件において、赤血球のための多機能試薬は、更に、白血球の劣化に対する保護剤、例えば固定剤、特に脂肪族アルデヒド、例えばＣ１−Ｃ５のもの、例えばパラホルムアルデヒド及び特にホルムアルデヒドを含む。
【００３２】
脂肪族アルデヒドは０．０１％〜５％、特に０．１４％〜１％、特に０．１％〜０．５％の濃度で存在し得る。
【００３３】
本発明を行うためのなお更に有利な条件において、本発明の多機能試薬は、有効量の抗凝固剤も含む。
【００３４】
ヘパリン、特にシトレートイオン、ＥＧＴＡ及び特にＥＤＴＡを、例えば抗凝固剤として言及することができる。
【００３５】
溶解の間及び後に中性ｐＨで緩衝液なしでのその混合物のｐＨは増加する傾向にあり、これにより細胞分解を誘発する。それゆえほぼ中性のｐＨの緩衝液の使用が要求される。緩衝液が溶解を阻害する傾向があるという事実にかかわらず、触媒、例えば炭酸脱水酵素の加速効果のおかげで、少量の緩衝液（例えば１〜２０ｍＭ）を用いることができる。本発明によるカルバメートの使用はほぼ中性のｐＨの緩衝液の使用を許容する。
【００３６】
これは、本発明を行うための他の有利な条件において、本発明の多機能試薬は有効量の緩衝剤、特にｐＨ６．５〜７．５のものも含むからである。例えば、緩衝剤として、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、特にＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）及び特にＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））及び特に緩衝剤ＤＩＰＳＯｐＨ７．５を言及することができる。
【００３７】
本発明による多機能試薬において、緩衝剤は、０．０００１〜０．０５０Ｍ、特に０．０００５〜０．０３Ｍ、特に０．００１〜０．０１０Ｍのモル濃度で存在し得る。
【００３８】
固定剤なしでの上述の多機能試薬の形成のための有利な条件において、０．１７Ｍのピロリジンヒドロクロライド、２．５ｍＭの炭酸水素カリウム、３ｍＭのＤＩＰＳＯ緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍｇ／Ｌの炭酸脱水酵素及び０．１ｍＭのＥＤＴＡが用いられる。
【００３９】
固定剤を伴う上述の多機能試薬の形成のための極めて有利な条件において、０．３％のホルムアルデヒドも用いられる。
【００４０】
上述のように、反応：
【００４１】
【化５】
【００４２】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素は、赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせて、カーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する窒素化ヘテロ環のカルバメートは、赤血球の溶解を行うために直接、用いることもできる。これらのいくつかは新規生成物である。
【００４３】
これは、本発明の対象が、
−ピロリジンカルバメート
−ピペリジンカルバメート
から選択されるカルバメートでもあるからである。
【００４４】
本発明の対象である試薬は、極めて有利な特性を有する。それらは、赤血球に関して溶解性である顕著な特性を有する。
【００４５】
これらの特性は、以下の実験部に詳述される。それらは赤血球の溶解又は球状化のための方法において上述の試薬の使用を正当化する。赤血球の溶解は、白血球及びそれらの副次集団、血小板、溶解後の赤血球残留物、又はいずれかの他の細胞性の又は懸濁された、添加された又はそうでない要素、例えば小球体のフローサイトメーターを用いる分析及び／又はトリアージを許容する。
【００４６】
それらは、白血球の調製のための方法において、上述の試薬の使用を正当化する。
【００４７】
それゆえ、本発明の対象は、赤血球の溶解の方法であって、抗凝固剤、例えばＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで処理した全血のサンプルを上述の溶解試薬の作用にかけて、３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を行う方法でもある。
【００４８】
白血球細胞のラベリングを行うために、モノクローナル抗体の欠如又は存在下で作業を行うことが可能である。これらの抗体は、蛍光化合物、例えば後述のものに結合させてもさせなくてもよい。操作の有利な条件において、これらの抗体は蛍光化合物に結合される。
【００４９】
上述の多機能試薬は次の通り用いることができる：
抗凝固剤で処理し、モノクローナル抗体で、もしくは蛍光マーカーと組み合わせてモノクローナル抗体で、又は蛍光マーカーと組み合わせたモノクローナル抗体の混合物で処理した血液の０．１ｍＬのサンプルを上述の２ｍＬの多機能試薬に接触させ、溶解を終える間の１０分間、放置した。このようなマーカーは、例えばＣＤ４５−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネートと組み合わせたＣＤ４５）又はフイコエソトリンと組み合わせたＣＤ１４であり、例えばＤＡＫＯ，ＢＥＣＴＯＮ ａｎｄ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ又はＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社により市販される。次に、例えばＢＥＣＴＯＮ ａｎｄ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ Ｆａｃｓｃａｎ又はＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬタイプのサイトメーターの読み取りを、溶解直後又はその後３日までに行う。
【００５０】
本発明による溶解の方法を行うための有利な条件において、多機能試薬のための上述の有利な条件が選択される。
【００５１】
本発明により包含される溶解のシステムは、浸透剤、例えば脂肪族アルコール又は界面活性剤の存在下でも用いることができる。触媒、例えば炭酸脱水酵素又はカルバメートを含む細胞内免疫標識化を許容する浸透触媒も本発明の一部である。このような溶解及び浸透段階は、任意に脂肪族アルデヒドによる固定化の後に行うことができる。
【００５２】
上述の方法を行うための有利な条件において全血のサンプルは１０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を行うのに十分な量の試薬に接触させる。
【００５３】
上述の方法を行うための他の有利な条件において試薬及びサンプルの混合物のｐＨは４〜９である。
【００５４】
しかしながら、本発明により多機能試薬は、赤血球の単純な球状化の生産も許容する。
【００５５】
これは、本発明の対象が赤血球の球状化の方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、自動計数装置によるそれらの分析を許容するように、赤血球の球状化（膨潤）を誘発するのに十分な量の上述の試薬に接触させることを特徴とする方法でもあるからである。
【００５６】
赤血球の球状化のための有利な条件において血液のサンプルは１０秒〜４００秒の間隔で球状化を行うのに十分な球状化試薬の量に接触させる。時間間隔での赤血球の溶解を避けるため及び球状化の速度を制御するため、本発明による多機能試薬は好ましくは等張溶液に希釈させることができる。同量の０〜１０倍、好ましくは０．５〜５倍、特に１〜３倍の希釈剤を例えば加えることができる。特に有利な条件において、等張溶液の選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＩｓｏ Ｆｌｏｗ（登録商標）であり、それは、ＮａＣｌ：７．９２ｇ／Ｌ，ＫＣｌ：０．４ｇ／Ｌ，ＮａＨ２ＰＯ４：０．１９ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４：１．９５ｇ／Ｌ，ＥＤＴＡ：０．３８ｇ／Ｌ，２−フェノキシエタノール：３ｇ／Ｌ、及びＮａＦ：０．３ｇ／Ｌを含む。
【００５７】
他の有利な条件において、１又は複数のアジュバント、例えば固定化剤、核酸の着色剤、及び／又はイソフフィアリング（ｉｓｏｓｐｈｅｒｉｎｇ）剤、例えばマルトンド（Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏ，ＵＳ−Ａ−５１９４９０９）が球状化試薬に添加される。
【００５８】
先に見られるように、本発明の多機能試薬は、白血球について攻撃的でなく、それゆえそれらの調製に関して用いることができる。それゆえ、本発明により包含される溶解システムは、生存可能な白血球細胞の調製のための道具でもあり、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに基づく細胞調製の技術におきかわることができる。血液、骨髄及びいずれかの他の体液の溶解後の生存可能細胞の調製は、例えば機能的細胞テストのための調査、細胞の凍結及び保存等の目的のための適用を有する。細胞生存能の制御が考慮される限り、その溶解法は、生存能着色剤、例えばエオシン、ブルートリプタン、７−ＡＡＤ，ＬＤＳ７５１等と一緒に用いられる。最後に、本出願人の研究による溶解は赤血球がＣＯ２を吸収する能力の関数であるので、溶解のシステムは、赤血球の機能的パラメーターとして用いることができる。
【００５９】
これは、本発明の対象が白血球の調製のための方法であって、上述のような多機能試薬を用いる赤血球の溶解の段階を含むことを特徴とする方法でもあるからである。
上述の方法を行うための有利な条件は上述の本発明の他の対象にも適用される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）赤血球のための多機能試薬であって、サイトメーター又は自動計数装置により検出することができるような赤血球の溶解又は赤血球の球状化を形成するのに十分な量の、カルバメート、又は赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート及び窒素化ヘテロ環もしくはアンモニウムイオンからの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤を含むことを特徴とする多機能試薬。
（項目２）前記赤血球によるＣＯ２の吸収と組み合わせてカーボネート又はアミン塩基からの赤血球によるカルバメートの形成を誘導する剤が、反応：
【化１】
の触媒剤、例えば炭酸脱水酵素であることを特徴とする項目１に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目３）窒素化ヘテロ環又はアンモニウム塩も含むことを特徴とする項目１又は２に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目４）カーボネート又は炭酸水素塩も含むことを特徴とする項目１〜３のいずれか一に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目５）白血球の劣化に対して保護する剤、例えば脂肪族アルデヒドも含むことを特徴とする項目１〜４のいずれか一に記載の赤血球のための多機能試薬。
（項目６）ピロリジンカルバメート、
ピペリジンカルバメート
から選択されるカルバメート。
（項目７）赤血球の溶解又は球状化のための方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を導くか、又は自動計数装置による分析を許容するように球状化を誘発するのに十分な量の、項目１〜５のいずれか一に記載の試薬に接触させることを特徴とする方法。
（項目８）全血のサンプルを３０分未満で赤血球の少なくとも９５％の溶解を導くのに十分な量の試薬に接触させることを特徴とする項目７に記載の方法。
（項目９）前記試薬及び前記サンプルの混合物のｐＨが４〜９であることを特徴とする項目７又は８に記載の方法。
（項目１０）赤血球の球状化のための方法であって、抗凝固剤で処理した全血のサンプルを、自動計数装置による分析を許容するように球状化を誘発するのに十分な量の、項目１〜５のいずれか一に記載の試薬に接触させることを特徴とする方法。
（項目１１）白血球の調製のための方法であって、項目１〜５のいずれか一に記載の多機能試薬を用いる、赤血球の溶解の段階を含むことを特徴とする方法。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１による溶解後のフローサイトメトリー（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬ）を用いて分析した血液サンプルのサイズ−構造拡散ダイアグラムを示す。領域Ａはリンパ球に相当し、領域Ｂは単球に相当し、そして領域Ｃは顆粒球に相当する。
【図２】実施例６による球状化後のフローサイトメトリー（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＸＬ）を用いて分析した血液サンプルのサイズ−構造拡散ダイアグラムを示す。実施例６に記載される球状化剤との赤血球の接触後の、赤血球のサイズ−構造の存在を１００秒の４間隔で示す（図２（Ａ））。経時的に生じる赤血球の球状化及び均質化をサイズ−構造ダイアグラムに示す；図２（Ｂ），１００秒後；図２（Ｃ），２００秒後；図２（Ｄ），３００秒後；図２（Ｅ），４００秒後。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は本願を詳述する。
【００６２】
実施例１：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピロリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例２：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピロリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ホルムアルデヒド ０．１％
ｐＨ７．３
実施例３：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
ピペリジンクロライド １７０ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例４：
以下の組成を有する赤血球のための多機能試薬を調製した：
塩化アンモニウム １５５ｍＭ
炭酸水素カリウム ２．５ｍＭ
ＤＩＰＳＯ緩衝液 ｐＨ７．５ ３ｍＭ
ウシ炭酸脱水酵素（ＳＩＧＭＡ） １０ｍｇ／Ｌ
（５００００Ｗ−Ａユニット）
ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ
ｐＨ７．３
実施例５：溶解の能力
全血１００μＬを実施例１の溶解剤１ｍＬと混合する。その溶液を環境温度で１０分、放置し、白血球をサイトメトリーにより計数する。
【００６３】
実施例６〜８：ピロリジン、ピペリジン及びモルホリンカルバメートの調製
重炭酸ナトリウム及び所定量の各々の化合物の混合物（モル比１：２）を撹拌しながら１００℃に加熱した。その反応は、約１時間後におこる混合物の固体化を特徴とする。求めるカルバメートをメタノールでの抽出後に回収した。これらの合成した化合物の分子構造を２００ＭＨｚでＮＭＲ分光測定13Ｃにより確認した。
【００６４】
これらの分析（ジエーテリオメタノール）は以下の化学シフトを得るのを可能にする（δ：ｐｐｍ)：
１／ピロリジンカルバメート：２６．４４；２７．２４；４７．３２；４７．６３（ＣＨ２；１６５．０２（Ｃ＝Ｏ）
２／ピペリジンカルバメート：２５．６９；２６．５８；２７．３９；２８．７１；４７．６５（ＣＨ２；１６２．７６（Ｃ＝Ｏ）
３／モルホリンカルバメート：４７．１４；６８．４２（ＣＨ２；１６２．８１（Ｃ＝Ｏ）
実施例９：球状化剤の調製
球状化剤を、実施例１により試薬及びＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲにより市販される等張組成物、所定容量のＩｓｏｆｌｏｗ（登録商標）を混合することにより調製した。
【００６５】
実施例１０：球状化後のサイトメトリー
４マイクロリッターの容量の血液を１ｍＬの実施例９の球状化剤に接触させた。球状化の過程を、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＰ ＸＬサイトメーターで時間の関数としてサイトメトリーにより追跡した。結果を上述の図２に示す。
【００６６】
実験１：
ＫＨＣＯ３(１０ｍＭ）の存在下又は各々のカルバメート誘導体（０．４ｍＭ）の存在下でのアンモニウムイオンによる及び窒素化ヘテロ環による溶解の速度を研究した。抗凝固剤（ＥＤＴＡ）で処理した０．１ｍＬの容量の全血のために２ｍＬの容量の試薬を用いた。ｐＨのバリエーションは、カルバメートの添加前にＨＣｌの１Ｍ水溶液を加えることにより得た。カルバメート（メタノール中１００ｍＭ）を反応の開始時にその混合物に加えた。その反応混合物のｐＨを測定した。その溶解過程を、分光光度測定（７００ｎｍでの光学密度の測定）により追跡した。その溶解時間は、最小レベルを得るために必要な時間により決定する。
【００６７】
得られた結果は次の通りである：
【００６８】
【表１】
【００６９】
結論：アンモニウムイオンへ及び窒素化ヘテロ環への異なるカルバメートの添加は、カルバメートの濃度の２５倍の濃度で炭酸水素塩を加えることにより得られるよりかなり速い速度の溶解を誘導するのが見られよう。表に示すように、カルバメートの溶解効果はｐＨに依存しない。
【００７０】
実験２：
反応：
【００７１】
【化６】
【００７２】
における炭酸脱水酵素の触媒の役割の証明。
【００７３】
反応：
【００７４】
【化７】
【００７５】
を、カルバメートでなくカーボネートが沈殿する８５％のアセトンの水溶液中の溶解度の差により測定して、アンモニウムカルバメートのアンモニウムカーボネートへの変換を介して研究した。
【００７６】
【表２】
【００７７】
結論：結果は、炭酸脱水酵素は、公知である変換：
【００７８】
【化８】
【００７９】
を触媒することに加えて、変換：
【００８０】
【化９】
【００８１】
も触媒することを示す。
【００８２】
実験３：
異なるソースから得られた炭酸脱水酵素の溶解の速度への効果の証明
実施例１による溶解反応において、５０，０００Ｗ−Ａ Ｕ／Ｉでの成分炭酸脱水酵素を各々５０００Ｗ−Ａ Ｕ／Ｉで表に示すような炭酸脱水酵素の調製物に置きかえた。その溶解過程を分光光度測定（７００ｎｍでのＯＤの測定）により追跡した。溶解の持続時間を、最小レベルを達成するのに必要な時間により決定する。
【００８３】
【表３】
【００８４】
結論：炭酸脱水酵素の異なる調製物は全て溶解の速度を増加させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーを用いて白血球を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）全血サンプルを、炭酸脱水酵素と、アンモニウム塩またはヘテロ環アミンもしくはその塩とを含む溶解試薬と混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ）該混合物中の白血球を保持し、かつ、該白血球の形態および生存能を維持しつつ、赤血球を溶解するのに十分な所定の時間にわたり該混合物をインキュベートする工程；ならびに
（ｃ）該混合物中の該白血球をフロサイトメーター上で分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
フローサイトメトリーを用いて白血球を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）全血サンプルを、アンモニウム塩またはヘテロ環アミンもしくはその塩と、赤血球の存在下でカルバメートの形成を誘導可能な触媒剤とを含む溶解試薬と混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ）所定の時間にわたり該混合物をインキュベートする工程であって、ここで、該触媒剤が、該混合物中のカルバメートの形成を誘導し、それによって、該混合物中の白血球を保持し、かつ、該白血球の形態および生存能を維持しつつ、赤血球の十分な溶解を引き起こす、工程；ならびに
（ｃ）該混合物中の該白血球をフローサイトメーター上で分析する工程
を包含する、方法。
【請求項１】
フローサイトメトリーを用いて白血球を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）全血サンプルを、炭酸脱水酵素と、アンモニウム塩またはヘテロ環アミンもしくはその塩とを含む溶解試薬と混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ）該混合物中の白血球を保持し、かつ、該白血球の形態および生存能を維持しつつ、赤血球を溶解するのに十分な所定の時間にわたり該混合物をインキュベートする工程；ならびに
（ｃ）該混合物中の該白血球をフロサイトメーター上で分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
フローサイトメトリーを用いて白血球を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）全血サンプルを、アンモニウム塩またはヘテロ環アミンもしくはその塩と、赤血球の存在下でカルバメートの形成を誘導可能な触媒剤とを含む溶解試薬と混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ）所定の時間にわたり該混合物をインキュベートする工程であって、ここで、該触媒剤が、該混合物中のカルバメートの形成を誘導し、それによって、該混合物中の白血球を保持し、かつ、該白血球の形態および生存能を維持しつつ、赤血球の十分な溶解を引き起こす、工程；ならびに
（ｃ）該混合物中の該白血球をフローサイトメーター上で分析する工程
を包含する、方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１７４９４７（Ｐ２０１１−１７４９４７Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１２９３５４（Ｐ２０１１−１２９３５４）
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【分割の表示】特願２００１−２７９３０４（Ｐ２００１−２７９３０４）の分割
【原出願日】平成１３年９月１４日（２００１．９．１４）
【出願人】（５９１０６９２３７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２９３５４（Ｐ２０１１−１２９３５４）
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【分割の表示】特願２００１−２７９３０４（Ｐ２００１−２７９３０４）の分割
【原出願日】平成１３年９月１４日（２００１．９．１４）
【出願人】（５９１０６９２３７）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]